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Revista Brasileira de Produtos Agroindustriais, Campina Grande, v.20, n.1, p.19-31, 2018 19 ISSN: 1517-8595
BIOTRANSFORMAÇÃO DE CHÁ VERDE POR TANASE PRODUZIDA POR
Colletotrichum gloeosporioides URM 7130
Lucas Carlos de Souza Santos1, Tonny Cley Campos Leite2, Marcelo Rodrigues Figueira de
Mello3, Amanda Reges de Sena4
RESUMO
Tanino acil hidrolase (TAH), é uma enzima que hidrolisa ligações ésteres e depsídica de taninos
hidrolisáveis, conhecida como tanase. Elas são extensamente utilizadas nas indústrias de alimentos e bebidas,
farmacêutica e química. O objetivo neste trabalho foi avaliar a produção de tanase e ácido gálico a partir de
Colletotrichum gloeosporioides URM 7130, utilizando fermentação em estado submerso. Esta enzima foi
aplicada ao chá verde e o seu efeito avaliado. As análises seguiram desenhos estatísticos de Plackett-Burman
e Doehlert. A quantidade total de proteína foi determinada pelo método de Bradford, a atividade antioxidante
foi avaliada pelo método de DPPH, os teores totais de taninos foram obtidos pela precipitação proteica, e a
quantidade de ácidos fenólicos pelo método de Folin Ciocalteau. Os resultados da curva de biomassa, pH e
atividade enzimática indicaram que a melhor atividade foi encontrada depois de 168 h de fermentação,
quando foi obtido valores de 79,39 ± 0,33 U/mL da atividade volumétrica e 552,73 U/mg da atividade
específica. A produção de ácido gálico em 168 horas de fermentação foi de 0,17 ± 0,00069 mg/mL. Foi
verificada uma redução de 12,75% do teor de taninos e foi possível aumentar em 24,87% os compostos
fenólicos e 4,45 % a atividade antioxidante. A superfície de resposta mostra que a melhor resposta pode ser
obtida quando o extrato enzimático for aplicado numa concentração de 6,93% durante 141,30 minutos,
quando poderá ser obtida 83,04% de atividade antioxidante total. Os resultados sugerem que o chá verde
pode ser utilizado como alternativa a alimentos funcionais, pois aumentou sua atividade antioxidante.
Palavras-chave: ácido gálico; chá verde; atividade antioxidante; biotransformação; tanase.
BIOTRANSFORMATION OF GREEN TEA BY TANNASE PRODUCED BY
Colletotrichum gloeosporioides URM 7130
ABSTRACT
Tannin acyl hydrolase (TAH), is an enzyme that hydrolyzes esters and depsidic bonds of hydrolysable
tannins, known as tannase. They are widely used in the food and beverage, pharmaceutical and chemical
industries. The objective of this work was to evaluate the production of tannase and gallic acid from
Colletotrichum gloeosporioides URM 7130, using submerged fermentation. This enzyme was applied to
green tea and its effect evaluated. The statistical analyzes followed designs of Plackett-Burman and Doehlert
were used. The total amount of protein was determined by the Bradford method, the antioxidant activity was
evaluated by the DPPH method, total tannin contents were obtained by protein precipitation and the amount
of phenolic acids by the Folin Ciocalteau method. The results of the biomass, pH and enzymatic activity
curve indicated that the best activity was found after 168 h of fermentation, when the values of the
volumetric activity were 79.39 ± 0.33 U/mL and the specific activity was 552,73 U/mg. The production of
gallic acid in 168 hours of fermentation was 0.17 ± 0.00069 mg/mL. A reduction of 12.75% in the tannin
content was observed and it was possible to increase phenolic compounds by 24.87% and antioxidant activity
by 4.45%. The response surface shows that the best response can be obtained when the enzyme extract is
applied at a concentration of 6.93% for 141.30 minutes, when 83.04% of total antioxidant activity can be
obtained. The results suggest that green tea can be used as alternative to functional foods as it increased its
antioxidant activity.
Keywords: gallic acid; green tea; antioxidant activity; biotransformation; tannase.
Protocolo 19-2017-24 de 20/12/2017 1 Discente do Curso de Licenciatura em Química. Instituto Federal de Educação, Ciência e Tecnologia de Pernambuco, Campus Barreiros.
Fazenda Sapé, S/N, Zona Rural. Barreiros. Cep: 55560-000. E-mail: [email protected]. Tel.: 81 – 982527300. 2 Técnico em Química. Instituto Federal de Educação, Ciência e Tecnologia de Pernambuco, Campus Barreiros. Fazenda Sapé, S/N, Zona Rural.
Barreiros. Cep: 55560-000. E-mail: [email protected]. Tel.: 81 – 998207698. 3 Docente do Curso Tecnólogo em Agroecologia. Instituto Federal de Educação, Ciência e Tecnologia de Pernambuco, Campus Barreiros.
Fazenda Sapé, S/N, Zona Rural. Barreiros. Cep: 55560-000. E-mail: [email protected]. Tel.: 81 – 992098087. 4 Docente do Curso Técnico em Alimentos. Instituto Federal de Educação, Ciência e Tecnologia de Pernambuco, Campus Barreiros. Fazenda
Sapé, S/N, Zona Rural. Barreiros. Cep: 55560-000. E-mail: [email protected]. Tel.: 81 – 996275043.
20 Biotransformação de chá verde por tanase produzida por Colletotrichum gloeosporioides URM 7130 Santos et al.
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INTRODUÇÃO
A enzima Tanino acil hidrolase (TAH)
conhecida como tanase (E.C: 3.1.1.20) são
enzimas que hidrolisam ésteres e ligações
laterais de taninos hidrolisáveis como o ácido
tânico, em glicose e ácido gálico (Belur &
Mugeraya, 2011).
A tanase apresenta uma vasta aplicação
na indústria de alimentos, sucos, cervejas,
cosméticos, farmacêutica e indústria química.
Ela é utilizada na estabilização da cor do vinho,
refrigerantes a base de café, para tratamento de
efluentes na indústria de couros e na produção
de ácido gálico (Battestin et al, 2004; Belur &
Mugeraya, 2011).
O ácido gálico tem uma vasta aplicação
nas indústrias químicas e farmacêuticas. É
extraído através da hidrólise de ácido tânico e
empregado para sínteses do trimetropim,
pirogalol e propil-galato. O trimetropim é uma
droga muito utilizada na indústria farmacêutica
como agente antibacteriano, o pirogalol é
utilizado como agente conservante na indústria
de alimentos e o propil-galato tem função de
agente antioxidante em produtos que
contenham ácidos graxos e óleos, e (Beena et
al., 2011; Aithal & Belur, 2013). Outra grande
aplicação é no preparo dos chás instantâneos,
pois a adição de tanase em diferentes etapas do
processo industrial diminui a turbidez e leva ao
aumento da capacidade antioxidante presente
no mesmo (Pinto et, al., 2005).
Nos organismos vivos, a função dos
antioxidantes é impedir que radicais danifiquem
tecidos e auxilie a saúde celular, inibindo a
instalação de patogenias ligadas ao stress
oxidativo (Santos et al., 2011).
Certos organismos têm a capacidade de
efetuar modificações químicas em compostos,
denominando-se este processo de
biotransformação. No caso dos fungos
filamentosos, pode ocorrer utilizando a
totalidade do organismo (várias transformações
sintéticas sequenciais) ou através de biocatálise
(reduzido número de passos sintéticos) (Hüttel
& Hoffmeister, 2011).
Atualmente a maior utilização das
biotransformações verifica-se no sector
farmacêutico, pois promove a descoberta e a
investigação de novos fármacos (Pollard &
Woodley, 2007; Severiano et al., 2013).
A partir do exposto, o objetivo do
presente plano de trabalho foi produzir tanase e
ácido gálico a partir de Colletotrichum
gloeosporioides URM 7130, utilizando
fermentação em estado submerso. Ao mesmo
tempo, foi feita a aplicação enzimática no chá
verde e avaliou seu efeito.
METODOLOGIA
O projeto foi realizado no Instituto
Federal de Educação, Ciência e
Tecnologia/Campus Barreiros. O fungo
Colletotrichum gloeosporioides URM 7130
encontra-se incorporado à Coleção de Culturas
Micoteca URM, Departamento de Micologia do
Centro de Ciências Biológicas, Universidade
Federal de Pernambuco e no Campus Barreiros,
preservado em água destilada esterilizada em
frascos de penicilina (Castellani, 1939).
Preparação do inóculo
Inicialmente foi realizado um teste com o
micro-organismo no intuito de identificar
melhores meios de cultura para o crescimento e
esporulação do mesmo, os meios de cultura
utilizados na análise foram: Aveia (Aveia-
Ágar); Czapek (Ágar sais); BDA (Batata-
Dextrose-Ágar); seguido por 12 horas luz e 12
horas de escuridão.
Para ativá-los foram feitos repique nos
meios, com o pH 6,8 e foram incubado em
B.O.D (Solab, SL-200/364,Piracicaba, Brasil )
a 28 ºC durante 10 dias.
Curva de Biomassa e pH
Com a finalidade de avaliar o comporta-
mento microbiano antes da sua utilização no
processo fermentativo foi construído uma curva
de biomassa, no qual, foi utilizado discos de 1,3
cm de diâmetro de micélios em frascos
Erlenmeyers e a fermentação ocorreu por 7
dias, sendo paralisada a cada 24 horas. O
material residual contido no papel filtro, após
filtragem, foi levado à estufa por 24 horas a 90
ºC e a matéria seca avaliada ao final do
experimento por pesagem. O estudo da variação
do pH no processo fermentativo foi
desenvolvido através do método
potenciométrico (MS Tecnopon, mPA210,
Piracicaba, Brasil).
Produção enzimática e do ácido gálico
A produção enzimática ocorreu em
frascos Erlenmeyers de 125 mL contendo 25
mL de meio de fermentação (0,3 % NaNO3; 0,1
% K2HPO4; 0,05 % MgSO4; 0,05 % KCl;
0,0001 % FeSO4; 1 % ácido tânico; 0,1 %
extrato de levedura; pH 4,0). Devido à uma
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quantidade inadequada de esporos, a
fermentação acorreu após inoculação de discos
de 1,3 cm de diâmetro de micélios do micro-
organismo, removidos das placas de petri
previamente esterilizadas. O ácido tânico foi
acrescentado ao meio após ser passado em
membrana de 0,45 μm. Após a inoculação os
meios foram incubados a 40 °C em shaker
(Solab, Refrigerada SL-221, Piracicaba, Brasil)
por 168 h/100 rpm.
Após fermentação, as soluções foram
filtradas e centrifugadas (Thermo Electron Led
GMBH, Multifuge X1R, Kalkberg, Alemanha),
a 10000 rpm por 15 minutos a 4ºC e o
sobrenadante, considerado extrato enzimático,
congelado para posterior atividade enzimática e
quantificação de ácido gálico. Todos os testes
foram realizados em duplicata.
Determinação da atividade enzimática
A atividade da tanase foi estimada pelo
método de Sharma et al. (2000) modificado por
Pinto el al. (2006).
Quantificação de ácido gálico
A estimação da produção de ácido gálico
foi realizada por meio da reação entre 0,5 mL
do caldo de fermentação e 0,3 mL de rodanina
etanólica (0,667%, m/v). Após 5 minutos foi
adicionado 0,2 mL de hidróxido de potássio a
0,5 N e feita a leitura em espectrofotômetro a
520 nm. Uma curva-padrão de ácido gálico (10
a 100 mg/L) foi utilizada.
2.6 Dosagem do conteúdo de proteína
A proteína total foi determinada pelo
método de Bradford (1976) utilizando-se soro
albumina bovina como padrão. A atividade
específica da tanase foi então calculada pela
razão: AE=UA/mg proteína.
Aplicação enzimática
Preparo do chá verde
Incialmente foi adicionado 25g de folhas
completamente oxidadas (chá verde) em 200
mL de água destilada em ebulição e
posteriormente foi deixado em repouso durante
20 minutos e filtrado através de papel Whatman
Nº 1 (Selwal, et al., 2011).
Tratamento do chá verde com tanase
Para verificar uma melhor condição para
a diminuição do teor de taninos, aumento do
teor de compostos fenólicos e capacidade
antioxidante, foi proposto um planejamento
estatístico de Doehlert utilizando duas
variáveis: concentração de extrato enzimático
(%, v/v) e tempo de aplicação enzimática
(minutos). A concentração de extrato
enzimático foi avaliada em três níveis (2,0, 4,0
e 6,0 %) e o tempo de aplicação em cinco níveis
(140, 150, 160, 170 e 180 minutos), os quais
são apresentados em seus valores reais e
codificados na Tabela 1. Para cada porcentagem
de extrato enzimático utilizado foi feito um
controle, trocando-o por água destilada.
O comportamento do sistema foi
explicado pela seguinte equação quadrática (Eq.
(1)) cuja forma geral é:
Y = β0 + β1A + β2B + β11A2 + β22B2 +
β12AB + ε (Eq. 1)
Onde Y é a resposta predita, β0 é o
intercepto, β1e β2 são os coeficientes lineares,
β11, β22 os coeficientes quadráticos, β12 o
coeficiente de interação e A, B, A2, B2, AB são
as variáveis independentes e ε o erro
experimental.
Para cada 10 mL de chá em frascos
Erlenmeyers foi aplicada tanase com atividade
enzimática em torno de 79,39 U/mL nas
proporções citadas na Tabela 1, incubados em
shaker a 120 ± 1 rpm, 40 ºC. Logo após a
aplicação enzimática, segundo tempo pré-
estabelecido, a enzima foi desnaturada a 70 ºC
por 10 minutos.
Após a obtenção das condições preditas,
as mesmas foram submetidas a avaliações de
taninos totais, compostos fenólicos e atividade
antioxidante.
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Tabela 1 – Matriz de planejamento estatístico de Doehlert para o tratamento enzimático do chá verde
Ensaios Extrato enzimático (%, v/v) Tempo de aplicação enzimática (minutos)
1 6,0 (0,866) 150 (-0,5)
2 6,0 (0,866) 170 (0,5)
3 4,0 (0) 140 (-1,0)
4 C 4,0 (0) 160 (0)
5 C 4,0 (0) 160 (0)
6 C 4,0 (0) 160 (0)
7 4,0 (0) 180 (1,0)
8 2,0 (- 0,866) 150 (-0,5)
9 2,0 (- 0,866) 170 (0,5)
C: Ponto central.
Determinação do teor de taninos totais
A estimativa do teor de taninos totais foi
feita pelo método de precipitação proteica
(Haggerman & Butler, 1978) utilizando o ácido
tânico como padrão. Para a análise um mL do
chá (antes e após tratamento com a enzima)
obtido foi posto em contato com 3 mL de
solução de BSA e mantida durante 15 minutos a
temperatura ambiente. Os tubos foram
centrifugados a 5500 rpm por 15 minutos, o
sobrenadante descartado e o precipitado
dissolvido em 3 mL da solução de SDS-
Trietanolamina. Um mL de solução de FeCl3
foi adicionada e mantido durante 15 minutos à
temperatura ambiente para a estabilização da
cor. Após este período procedeu-se a leitura em
espectrofotômetro a 510 nm contra um branco.
Foi feita uma curva de calibração com ácido
tânico (0,2 a 1,0 mg/mL). Todos os testes foram
realizados em duplicata. Os resultados são
apresentados em porcentagem de hidrólise.
Fenólicos Totais
Para determinar o teor de compostos
fenólicos totais no chá verde foram pipetados
para tubos de ensaio 50 µL da amostra, e em
seguida foram adicionados 125 µL do reagente
Folin Ciocalteau, diluído na proporção de 1:10.
Os tubos foram agitados e mantidos em repouso
por 3 minutos para reagir. Após, foi adicionado
1 mL de carbonato de sódio (7,5 %, m/v) e 1,35
mL de água destilada. Os tubos foram mantidos
por 2 horas ao abrigo da luz. Após o período de
reação, o espectrofotômetro foi zerado com o
controle (branco) e em seguida realizadas as
leituras à 765 nm (Singleton et al., 1999). Os
valores obtidos foram comparados com a curva
padrão de ácido gálico (10 a 500 mg/L). O
conteúdo total de fenólicos foi expresso em mg
equivalente de ácido gálico por litro de chá.
Todos os testes foram realizados em duplicata.
Atividade Antioxidante (DPPH)
Para análise de atividade antioxidante
(Brand-Williams et al., 1995) foram pipetados
em tubos 100 µL de chá e estes foram
misturados a 3,9 mL de DPPH a 60 μM
(diluídos em metanol). Os tubos foram agitados
e deixados para reagir por 20 minutos ao abrigo
da luz. Um controle negativo foi utilizado,
trocando-se a amostra por metanol. Decorrido o
tempo foram medidas as absorbâncias das
amostras a 517 nm. A capacidade de sequestro
de radical DPPH foi calculada de acordo com a
equação (Eq. (2)) abaixo:
DPPH (%) = [(A0-A1)/A0]* 100 (Eq. 2)
Onde A0 foi a absorbância do controle
negativo e A1 a absorbância na presença do
composto (amostra).
Análises estatísticas
Após obtenção dos resultados, os
mesmos foram analisados através do programa
SISVAR – Sistema de Análise de Variância
(Ferreira, 2011), realizando-se a comparação de
médias pelo teste de Scott-Knott ao nível de 5
% de probabilidade. Ademais, uma Análise de
Variância (ANOVA) através do programa
Statistica 10.0 (StatSoft, Inc., Tulsa, USA), foi
feita para indicar as variáveis com efeitos
estatisticamente significativos (p<0,1) e o ajuste
do modelo aos dados experimentais. Todos os
ensaios foram realizados aleatoriamente.
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RESULTADOS E DISCUSSÃO
Crescimento e esporulação do micro-
organismo
Colletotrichum gloeosporioides é uma
espécie de fungo, pertencente à ordem
Melanconiales da classe Coelomycetes, cujo
gênero é o Glomerella sp., são considerados os
maiores patógenos de plantas em todo o mundo
(Menezes, 2006).
A avaliação do crescimento micelial foi
realizada diariamente, mantendo um ciclo de
luz e escuridão durante alguns dias
consecutivos ou até que o micélio já tivesse
tomado por completo a superfície do meio de
cultura. Santos et al. (2005) observou que a
exposição de C. gloeosporioides a ciclo
alternado de 12 horas de luz e 12 horas de
escuridão resultou em crescimento máximo e
que a temperatura afeta quase todas as funções
do fungo, incluindo crescimento, germinação de
esporos e reprodução.
Constatou-se que os meios apresentaram
grande crescimento micelial, mas, já para
esporulação não ocorreu o mesmo, pois,
segundo Nozaki et al. (2004) nem sempre as
condições que favorecem o crescimento
micelial são as mesmas para a esporulação.
3.2 Curva de Biomassa, pH e Produção
enzimática
A curva de crescimento tem papel
significativo no intuito de avaliar o
comportamento microbiano antes da utilização
no processo fermentativo, na variação do pH
presente no meio e também a biomassa que é o
crescimento do fungo. Os resultados obtidos de
massa micelial e pH são apresentados na Tabela
2 e as atividades volumétricas e específicas na
Tabela 3.
Tabela 2 - Curva de biomassa e pH e atividade enzimática
Tempo (h) pH Biomassa (mg)
24 4,02 ± 0,014 22,60 ± 0,00
48 3,98 ± 0,028 23,15 ± 0,001
72 3,81 ± 0,099 27,70 ± 0,00
96 3,73 ± 0,049 36,40 ± 0,0017
120 3,46 ± 0,0071 23,90 ± 0,0025
144 3,43 ± 0,0071 25,75 ± 0,00
168 3,45 ± 0,0071 45,60 ± 0,0021
Tabela 3 - Atividades volumétricas e específicas
Tempo (h) Atividade
volumétrica
(U/mL)
Atividade
específica
(U/mg)
24 2,20 ± 0,45 g 9,95 ± 1,99
48 21,89 ± 0,13 f 94,66 ± 0,77
72 38,99 ± 0,32 e 160,68 ± 0,34
96 49,92 ± 0,00 d 189,018 ± 1,08
120 64,22 ± 0,52 c 296,44 ± 0,36
144 70,45 ± 1,89 b 410,78 ± 3,37
168 79,39 ± 0,33 a 552,78 ± 6,99
Pode-se observar na Tabela 3 que a
atividade volumétrica está relacionada ao pH,
pois se tem mais atividade o pH será menor
devido á formação do ácido gálico, já a
biomassa neste caso vários fatores estão
envolvidos e consequentemente pode não ter
uma relação direta com a atividade, pois se
tradando de fermentação por micélios não há
um controle da quantidade de meio de cultura
que esta sendo depositado no meio de
fermentação e até mesmo a quantidade de
esporos.
Com a obtenção dos resultados, mostra
que todos os ensaios foram estatisticamente
diferentes entre si e que a melhor atividade foi
encontrada após o tempo de 168 h de
fermentação, no qual foi obtido valores de
79,39 ± 0,33 U/mL da atividade volumétrica e
552,73 U/mg da atividade especifica que é o
número de unidade da enzima tanase por
miligrama de proteína.
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A produção da enzima esta relacionada
com a concentração de ácido tânico que é
adicionada ao meio de fermentação. Esta fonte
de carbono favorece a produção rápida de
tanase que, por sua vez, cliva os taninos
fornecendo suprimento contínuo de fonte de
carbono. De acordo com BajpaI & Patil (1997),
Lekha & Lonsane (1997) e Pinto (2003), o
ácido tânico desempenha o papel de fonte de
carbono para o micro-organismo, bem como de
indutor da síntese. Dessa maneira, a presença de
ácido tânico é imprescindível para a síntese de
tanase.
Em estudo realizado por Naidu et al.
(2008) quando se utilizou Aspergillus foetidus
(MTCC 3557) para a produção da tanase em
meio de fermentação submersa, após a
otimização da produção e o acido tânico como
fonte de carbono, obteve-se valores para a
atividade enzimática de 15 para 30 U/mL.
Através de pesquisa desenvolvida por Riul
(2011) na produção de tanases em meio de
fermentação submerso foram testados 12
fungos. Dentre os micro-organismos testados,
os que apresentaram maiores produções
enzimáticas foram Aspergillus phoenicis (0,42
U/mL), Aspergillus ochraceus (0,39 U/mL) e
Aspergillus caespitosus (0,31 U/mL),
respectivamente. Em comparação com o C.
gloeosporioides URM 7130 para a produção de
tanase, utilizando também fermentação
submersa, a atividade enzimática foi superior.
A Tabela 4 apresenta os resultados da
produção de ácido gálico com o consumo dos
taninos hidrolisáveis presente no chá verde. A
produção de ácido gálico em 168 horas de
fermentação foi de 0,17 ± 0,00069 mg/mL, o
que demonstra que o ajuste do tempo
influenciou em maiores conversões de ácido
gálico.
Tabela 4 - Produção de ácido gálico a partir de
Colletotrichum gloeosporioides URM 7130.
Tempo (h) Ácido gálico (mg/mL)
24 0,0054 ± 0,0017
48 0,047 ± 0,00028
72 0,083 ± 0,00069
96 0,11 ± 0,00
120 0,14 ± 0,0011
144 0,15 ± 0,0040
168 0,17 ± 0,00069
Esses resultados para a produção de
ácido gálico foram inferiores quando
comparados aos trabalhos desenvolvidos por
Aguila-Zárate et al. (2015) e Serra et al. (2014),
os quais encontraram valores de 52,03 mg/mL e
24,16 mg/mL, respectivamente.
Aplicação enzimática
Taninos totais
A Tabela 5 indica o efeito de tanase, após
aplicação, nos taninos hidrolisáveis presentes
no chá verde. Foi verificada uma redução no
teor desses compostos. No campo experimental
avaliado as maiores reduções de taninos totais
foram obtidas nos ensaios 2 e 8, sendo estes
estatisticamente superiores aos demais ensaios
ao nível considerado.
Tabela 5 - Resultados obtidos da matrix de Doehlert para a aplicação de extrato enzimático, contendo
tanase de Colletotrichum gloeosporioides URM 7130, na redução de taninos do chá verde.
Ensaios Redução de taninos experimental
(%)
Redução de taninos preditos (%)
1 7,77 ± 2,14 c 6,41
2 11,40 ± 5,16 a 12,75
3 2,50 ± 1,72 e 3,85
4 C 5,30 ± 0,66 d 5,56
5 C 5,60 ± 0,59 d 5,56
6 C 5,80 ± 2,45 d 5,56
7 9,89 ± 1,14 b 8,54
8 11,08 ± 2,63 a 9,72
9 6,72 ± 0,27 c 8,07
C: Ponto central. Médias seguidas por letras distintas na vertical diferem entre si ao nível de 5 % de
probabilidade pelo Teste de Scott-Knott. C: Ponto central
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A utilização de tanase na redução de
taninos vem sendo explorada e pode minimizar
custos de produção pela indústria. No entanto,
são mais utilizadas no processamento de sucos.
A utilização em chás não foi verificada na
literatura sobre a redução destes compostos. Em
estudo realizado por Couri et al. (2002) diz que
o investimento inicial para obtenção do suco de
caju clarificado com enzima é menor que para o
suco clarificado com gelatina. Esse fato ocorre
devido à necessidade da etapa adicional de
filtração. No tratamento com enzimas há
somente uma etapa de centrifugação com
geração de resíduo sólido rico em taninos,
porém devido à ação da TAH, significativa
fração do teor de taninos totais (44,5%) foi
solubilizada. No tratamento convencional
existem duas etapas, a primeira para remoção
de material particulado já presente e a segunda
para a retirada do precipitado resultante da
complexação da gelatina com os taninos. Dessa
forma, o processo convencional apresenta
maior nível de geração de um resíduo
recalcitrante e maior custo financeiro.
Fenólicos totais
Vários estudos mostram que o chá verde
possui diversas propriedades medicinais, como
potencial anticariogênico, contra os radicais
livres, alergias, inflamações, úlceras, viroses,
tumores, para a prevenção e tratamento da
obesidade e suas co-morbidades. As ações
inibitórias podem prevenir também a agregação
plaquetária, reduzindo as doenças
cardiovasculares e trombose (German &
Dillard, 2000), Segundo Westerterp-Plantenga
et al. (2005), o chá verde também contém os
efeitos da cafeína e o possível mecanismo de
atuação na termogênese. Todas as ações
benéficas podem estar relacionadas aos
fitoquímicos presentes em todas as partes do
vegetal. Entre esses compostos podem ser
citados o ácido elágico, ácido gálico, a
quercetina, miricetina, isoquercitina, ácido
acetil oleanólico, os quais são compostos
fenólicos em diferentes concentrações e podem
estar relacionados à atividade antioxidante e
diminuição de radicais livres (Nair et al., 2013).
A Tabela 6 indica os resultados de
fenólicos totais equivalente em ácido gálico,
antes e após aplicação enzimática.
Tabela 6 - Resultados obtidos da matrix de Doehlert para a aplicação de extrato enzimático, contendo
tanase do fungo Colletotrichum gloeosporioides URM 7130, no teor de fenólicos totais do chá verde.
Ensaios Fenólicos totais experimentais
(mg de EAG/L)/Aumento de ácido
gálico (%)
Fenólicos totais preditos
(mg de EAG/L)/Aumento de
ácido gálico (%)
1 633 ± 5,77/12,43 b 648
2 703 ± 17,32/24,87 a 688
3 623 ± 23,09/11,65 c 608
4 613 ± 5,77/9,86 c 623
5 623 ± 33,05/11,65 b 623
6 633 ± 11,55/13,44 b 623
7 643 ± 0,00/15,23 d 658
8 593 ± 17,33/5,06 b 608
9 633 ± 17,33/12,43 b 618
Antes da
aplicação
C2,0 % 563 ± 17,33 e -
C4,0 % 558 ± 21,21 e -
C6,0 % 563 ± 11,55 e -
C: Controle. Médias seguidas por letras distintas na vertical diferem entre si ao nível de 5 % de
probabilidade pelo Teste de Scott-Knott.
Pode-se verificar que todos os ensaios
apresentaram diferença estatisticamente
significativa (p<0,05) em relação aos seus
respectivos controles. No entanto, o ensaio 2 foi
o que apresentou maior conteúdo em compostos
fenólicos totais. Esses resultados estão em
acordo com aqueles apresentados na Tabela 3,
uma vez que a enzima degradou tanino
26 Biotransformação de chá verde por tanase produzida por Colletotrichum gloeosporioides URM 7130 Santos et al.
Revista Brasileira de Produtos Agroindustriais, Campina Grande, v.20, n.1, p.31, 2018
hidrolisável presente no chá verde. Após
aplicação enzimática foi possível aumentar em
24,87 % os compostos fenólicos no ensaio 2.
Bastos et. al. (2007) ao avaliarem o ter de
fenólicos totais de extratos aquosos de erva-
mate e chá verde obtiveram respectivamente
valores 7,73% e 7,15% em equivalência de
acido gálico e as análises foram feitas de acordo
com o método de Folin-Ciocalteu. A partir
destes resultados bibliográficos, pode-se
afirmar que a aplicação enzimática
proporcionou aumento significativo dos
compostos fenólicos totais presentes no chá
verde, tornando vantajosa sua utilização
industrial.
Atividade antioxidante
O chá verde tem sido extensivamente
estudado devido às suas propriedades, ligadas
principalmente à presença de seus princípios
constituintes, sendo flavonóides amplamente
reconhecidos por suas propriedades
antioxidantes (Wiseman, 1997; Croft, 1998;
Dreosti, 2000). De modo geral, a atividade
antioxidante no chá em questão está relacionada
à prevenção de várias doenças, incluindo
aterosclerose, doenças do fígado, obesidade e
vários tipos de câncer (Nanjo et al., 1996;
Langley-Evans, 2000).
Um antioxidante pode ser definido como
uma substância que, em baixas concentrações,
retarda ou previne a oxidação do substrato
(Halliwel et a., 1995). A capacidade
antioxidante pode ser expressa por meio de
vários parâmetros, incluindo a remoção de um
radical peroxil (ORAC – Oxygen radical
absorbance capacity, TRAP – Total reactive
antioxidant potential), a capacidade de redução
de metal (FRAP – ferric reducing antioxidant
power, CUPRAC – cupric íon reducing
antioxidant capacity), a capacidade de remoção
de radical orgânico (ABTS – 2,20-azino-bis
(ácido 3-ethylbenzthiazoline-6-sulfônico),
DPPH – peroxidação do 2,2-difenil-1-
picrylhydrazil) e a quantificação de produtos
formados durante a peroxidação de lipídios
(TBARS, a oxidação do LDL, co-oxidação do
β-caroteno. O ensaio com maior atividade
antioxidante total foi o de número 1, com 82,89
% (Tabela 7).
Tabela 7 - Resultados obtidos da matrix de Doehlert para a aplicação de extrato enzimático, contendo
tanase do fungo Colletotrichum gloeosporioides URM 7130, na atividade antioxidante total do chá
verde.
Ensaios Atividade antioxidante
experimental – DPPH (%)
Atividade antioxidante
predita
1 82,89 ± 0,71 a 82,83
2 81,45 ± 0,36 b 81,52
3 81,88 ± 0,24 b 81,94
4 C 81,80 ± 0,12 b 81,59
5 C 81,38 ± 0,24 b 81,59
6 79,78 ± 0,12 d 79,73
7 80,12 ± 0,83 c 80,06
8 79,11 ± 1,07 d 79,17
Antes da
aplicação
C2,0 % 80,79 ± 0,12 c -
C4,0 % 80,87 ± 0,00 c -
C6,0 % 79,36 ± 0,00 d -
Médias seguidas por letras distintas na vertical diferem entre si ao nível de 5 % de probabilidade
pelo Teste de Scott-Knott. C: Ponto central.
Os resultados obtidos experimentalmente
para a atividade antioxidante total foram
avaliados pelo Teste F e ANOVA (Tabela 8). A
regressão foi estatisticamente significativa e a
falta de ajuste indicou uma boa concordância
entre o modelo ajustado e os dados
experimentais. O coeficiente de determinação
foi de 0,99.
Biotransformação de chá verde por tanase produzida por Colletotrichum gloeosporioides URM 7130 Santos et al. 27
Revista Brasileira de Produtos Agroindustriais, Campina Grande, v.20, n.1, p.19-31, 2018
Tabela 8 - Análise de variância para os dados obtidos na Tabela 7.
Fonte de
variação
Soma dos
quadrados
Graus de
liberdade
Média
quadrática
Fcal Ftab
Regressão 11,02 5 2,20 40,00 5,31
Resíduo 0,11 2 0,055
Falta de
ajuste
0,019 1 0,019 0,22 8,53
Puro erro 0,088 1 0,088
Total 11,13
Fcal – F calculado; Ftab – F tabelado (Nível de confiança: 90 %). R2 = 0,99.
A partir da Figura 2 verifica-se que o
tempo e a concentração do extrato enzimático
em seus termos lineares foram estatisticamente
significativos para a atividade antioxidante
total, sendo seus efeitos negativo e positivo,
respectivamente.
Figura 2 - Gráfico de Pareto para os efeitos das variáveis na atividade antioxidante total do chá verde
de acordo com planejamento estatístico de Doehlert.
A Figura 3 ilustra a superfície de resposta
e curvas de contorno referente à relação entre
tempo de aplicação enzimática e concentração
de extrato enzimático. A figura indica que ao
diminuir os níveis do tempo de aplicação
enzimática e aumentar a concentração de
extrato enzimático, a atividade antioxidante
total aumenta. A superfície de resposta mostra
que o melhor resultado pode ser obtido quando
o extrato enzimático for aplicado numa
concentração de 6,93 % durante 141,30 minutos
obtendo 83,04% de atividade antioxidante total.
A atividade antioxidante do chá e de seus
polifenólicos tem sido avaliada por diversos
métodos (Cao et al., 1996; Langley-Evans,
2000; Miller et al., 1971). Utilizando o método
ORAC (capacidade de absorção de radicais de
oxigênio), Cao et al. (1996) constataram que o
chá verde e o chá preto possuem maior
atividade antioxidante contra radicais peróxidos
do que alguns vegetais, como alho, espinafre e
couve de Bruxelas. Utilizando o método FRAP
(poder antioxidante pela redução do íon
férrico), Langley-Evans (2000) encontrou uma
maior capacidade antioxidante total no chá
verde 92,1% quando comparado ao preto
28,8%. Giada (2006) utilizando o método
DPPH (peroxidação do 2,2-difenil-1-
picrylhydrazil) demonstraram que o chá preto
apresenta maior atividade antioxidante ex-vivo,
quando comparado ao chá verde de 91,26% e
89,91%, respectivamente. Hong et al. (2013)
observaram aumento na concentração de ácido
gálico, (-)-epilocatequina e (-)-epicatequina
após utilização de tanase em extrato de chá
verde. Em pesquisa desenvolvida por Lu &
28 Biotransformação de chá verde por tanase produzida por Colletotrichum gloeosporioides URM 7130 Santos et al.
Revista Brasileira de Produtos Agroindustriais, Campina Grande, v.20, n.1, p.31, 2018
Chen (2008), os autores verificaram um
aumento de atividade antioxidante e quelante,
quando comparado ao chá não tratado, após
utilizar tanase em chá verde.
A partir dos resultados obtidos ressalta o
tão quanto é imprescindível a aplicação da
enzima tanase no melhoramento nutricional do
chá verde.
Figura 3 - Superfície de resposta e curvas de contorno para atividade antioxidante total considerando
a interação entre o tempo de aplicação enzimática e concentração de extrato enzimático.
CONCLUSÃO
Os resultados obtidos no presente
trabalho mostram o potencial promissor da
tanase obtida a partir do fungo endofítico C.
gloeosporioides URM 7130. Verificou-se que
com a utilização da fermentação submersa por
micélios houve uma produção enzimática
adequada e que vários fatores foram
importantes durante o processo. Dentre eles, se
destaca o tempo que afetou diretamente a
produção da enzima. No caso da biomassa foi
observada grande variação à medida que o
tempo passava. No entanto, não houve uma
influência direta na produção enzimática.
A tanase produzida apresentou
características desejáveis para o emprego
industrial como, por exemplo, na produção de
ácido gálico. No entanto, novas formas de
produção devem ser estudadas. Neste trabalho
foi feita aplicação da tanase na
biotransformação do chá verde. Foi verificada
uma redução de 12,75% no teor de taninos
totais, um aumento de 24,87 % em fenólicos
totais e um aumento de 4,45 % na atividade
antioxidante total.
Verificou-se que a tanase produzida por
C. gloeosporioides URM 7130 pode ser
utilizada em aplicações biotecnológicas. O chá
verde obtido após aplicação enzimática pode
ser empregado como alternativa de consumo
como alimento funcional uma vez que teve sua
atividade antioxidante total incrementada.
AGRADECIMENTOS
Ao Instituto Federal de Educação,
Ciência e Tecnologia de Pernambuco (IFPE),
Campus Barreiros, pela bolsa concedida e ao
Conselho Nacional de Desenvolvimento
Científico e Tecnológico (CNPq) pelo apoio
financeiro (469406/2014-3).
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