biotransformación de limoneno a a-terpineol por medio del penicillium digitatum
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BIOTRANSFORMACIÓN
MICROBIAL BIOTRANSFORMATION OF (R)-(+)- LIMONENE BY
PENICILLIUM DIGITATUM DSM 62840 FOR PRODUCING (R)-(+)-
TERPINEOL
PRESENTADO POR:
JUAN RICARDO RINCÓN
CHRISTIAN SUAREZ
MAYRA ALEJANDRA URIBE
UNIVERSIDAD INDUSTRIAL DE SANTANDER
FACULTAD DE INGENIERÍAS FÍSICO – QUÍMICAS
ESCUELA DE INGENIERÍA QUÍMICA2016
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BIOTRANSFORMACIÓN
MICROBIAL BIOTRANSFORMATION OF (R)-(+)- LIMONENE BY
PENICILLIUM DIGITATUM DSM 62840 FOR PRODUCING (R)-(+)-
TERPINEOL
PRESENTADO A:
MICROBIOL. MABEL JULIANA QUINTERO
PRESENTADO POR:
JUAN RICARDO RINCÓN
CHRISTIAN SUAREZ
MAYRA ALEJANDRA URIBE
UNIVERSIDAD INDUSTRIAL DE SANTANDER
FACULTAD DE INGENIERÍAS FÍSICO – QUÍMICAS
ESCUELA DE INGENIERÍA QUÍMICA2016
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1 INTRODUCCIÓN
En los últimos años los procesos de biotransformación han adquirido una
importancia creciente a nivel mundial, debido a la posibilidad de obtener un
producto natural de alto valor agregado y de forma inocua para el medio
ambiente (Castellanos, 2007). Actualmente la generación de productos
aromáticos a través de procesos biotecnológicos ha aumentado
considerablemente, debido a que las legislaciones de USA y Europa han
definido como “sustancias naturales” únicamente a las que pueden producirse
por procesos físicos, enzimáticos o microbianos a partir de precursores
aislados de la naturaleza. Esta clasificación ha originado una competencia en
el mercado, ya que los compuestos etiquetados como “naturales” presentan
alta demanda, mientras que otros compuestos producidos por métodos
químicos, a pesar ser denominados como “idénticos al natural” son menos
apreciados por los consumidores. Mundialmente numerosos procesos
comerciales emplean enzimas o microorganismos como catalizadores, lo que
demuestra la importancia de las reacciones de biotransformación aplicadas a la
industria (Maróstica & Pastore, 2006)
La biotransformación implica una serie de reacciones limitadas, que se pueden
llevar a cabo por medio de sistemas biológicos, denominados biocatalizadores,
en donde una molécula precursora es convertida en otra diferente (Garcia , et
al., 2004). Los biocatalizadores, en la mayoría de los casos, funcionan
correctamente bajo condiciones suaves de reacción, poseen alta actividad
catalítica y permiten una mayor regio y estereoselectividad. Cuando se utilizan
con microorganismos completos puede haber una menor selectividad, debido a
que las células contienen diferentes grupos de enzimas capaces de transformar
el sustrato, sin embargo la selectividad puede ser alterada variando el medio,
adicionando solventes orgánicos o inhibidores de enzimas no deseadas, entre
otros. La quiralidad también es importante en perfumería ya que el olor y el
sabor dependen de la conformación absoluta del estereoisómero presente
(Castellanos, 2007) Los terpenos representan un grupo abundante de
sustancias quirales que pueden ser transformadas en componentes bioactivos
de gran valor tales como saborizantes, fragancias y fármacos el R-(+)-
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limoneno es el monoterpeno monocíclico que se encuentra más ampliamente
distribuido en la naturaleza (de Caravalho & da Fonseca, 2006), constituyendo
cerca de un 90% del aceite de la cascara de naranja, lo que lo convierten en un
precursor abundante y barato para la síntesis de productos químicos finos; el
α-terpineol, uno de los derivados oxigenados del R-(+)-limoneno, es un alcohol
estable y es aplicado principalmente en productos para el hogar, cosméticos,
pesticidas y como parte de productos aromatizantes (Lemos, et al., 2010). En
este trabajo se profundizara en los temas relacionados con la
biotransformación por medio de un análisis al artículo Microbial
Biotransformation of (R)-(+)-Limonene by Penicillium digitatum DSM 62840 for
Producyng (R)-(+)-α-Terpineol (Prieto, et al., 2011)
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TABLA DE CONTENIDO
1 Introducción ................................................................................................. 3
2 Fundamentación ......................................................................................... 5
3 objetivos en la investigación ........................................................................ 7
3.1 Objetivo general .................................................................................... 7
3.2 Objetivos específicos ............................................................................ 7
4 Estudios relacionados ................................................................................. 9
5 Marco teórico ............................................................................................ 10
5.1 BIOTRANSFORMACIÓN .................................................................... 10
5.2 LIMONENO ......................................................................................... 11
5.3 Penicillium digitatum............................................................................ 12
5.4
Terpineol ............................................................................................. 13
6 MATERIALES Y MÉTODOS USADOS ..................................................... 15
6.1 Microorganismo, medio de cultivo y reactivos ..................................... 15
6.2 Crecimiento microbiano de Penicillium digitatum DSM 62840 en medio
sólido 15
6.3 Evaluación de la actividad antifúngica del sustrato ............................. 16
6.4 Preparación de la suspensión de esporas .......................................... 17
6.5 Cinética de crecimiento microbiano de Penicillium digitatum DSM
62840 en medio líquido ................................................................................ 17
6.6 Proceso general de biotransformación de (R)-(+)-limoneno a escala de
laboratorio ..................................................................................................... 18
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6.6.1 Efecto del tipo de medio de cultivo .............................................. 18
6.6.2 Efecto del pH ................................................................................ 19
6.6.3
Evaluación de las fases de crecimiento durante labiotransformación del limoneno ................................................................ 19
6.6.4 Efecto de la concentración del sustrato ........................................ 19
6.6.5 Efecto inductivo de (R)-(+)-limoneno ............................................ 20
6.6.6 Extracción, identificación y cuantificación de (R)-(+)-limoneno y α-
terpineol durante la biotransformación del limoneno ................................. 20
7 ANÁLISIS E INTERPRETACIÓN DE RESULTADOS ............................... 22
7.1 Crecimiento microbiano de Penicillium digitatum DSM 62840 en medio
sólido 22
7.2 Evaluación de la actividad antifúngica del sustrato ............................. 23
7.3 EVALUACIÓN DEL PROCESO DE BIOTRANSFORMACIÓN DEL (R)-
(+)-LIMONENO ............................................................................................. 25
7.3.1 Efecto del tipo de cultivo ............................................................... 25
7.3.2 Efecto del pH ................................................................................ 26
7.3.3 Evaluación de las fases de crecimiento ........................................ 29
7.3.4 Efecto de la concentración del sustrato ........................................ 30
7.3.5 Efecto inductivo del (R)-(+)-limoneno en la capacidad de
biotransformación ...................................................................................... 32
8 CONCLUSIONES ..................................................................................... 35
9 Bibliografía ................................................................................................ 36
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2 FUNDAMENTACIÓN
La implementación de biotransformación en procesos industriales representa
una alternativa económica, con una buena fuente de disponibilidad y de fácil
obtención en materias primas, requisitos necesarios para asegurar la
rentabilidad de los productos procesados, además los productos obtenidos a
través de la bioconversion de sustratos por microorganismos pueden ser
clasificados como naturales, condición que se está imponiendo cada vez más
entre los consumidores (Schrader, et al., 2004); sin embargo, las bajas tasas
de producción hacen que no se haya materializado en una opción aceptable a
escala industrial, y por esto es conveniente profundizar la investigación en este
tópico.
3 OBJETIVOS EN LA INVESTIGACIÓN
3.1 Objetivo general
Determinar las características químicas que optimizaran la producción de α-
terpineol en un cultivo de Penicillium digitatum DSM 62840 teniendo como
sustrato el (R)-(+)-limoneno.
3.2 Objetivos específicos
Determinar el medio de cultivo sólido que permita la mayor tasa de
crecimiento para la pre-incubación de la solución de esporas de P.
digitatum DSM 62840.
Determinar la concentración del sustrato que permita una mayor
producción de α-terpineol, y que a su vez presente un efecto inhibitorio
mínimo en el crecimiento de Penicillium digitatum DSM 62840.
Evaluar el medio de cultivo liquido de P. digitatum DSM 62840 en la
producción de α-terpineol.
Evaluar el pH del medio de cultivo para optimizar la producción de α-
terpineol.
Determinar la fase de crecimiento del cultivo de P. digitatum DSM 62840
en la que se presente la mayor tasa de producción de α-terpineol.
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Analizar el posible efecto inductor del (R)-(+)-limoneno en el P.
digitatum DSM 62840.
Cuantificar la biotransformación obtenida en la investigación.
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4 ESTUDIOS RELACIONADOS
Aunque no se tiene una evidencia clara en todos los casos, las
biotransformaciones de R-(+)-limoneno en las que intervienen hongos y
levaduras al parecer inician por la acción de la P-450 monooxigenasa. En la
bioconversión de R-(+)-limoneno a α-terpineol realizada por Penicillium
digitatum DSM 62840 primero se pensó en una hidratasa como catalizador, lo
cual hubiese favorecido un proceso biocatalítico ya que no habría sido
necesario ningún cofactor. Sin embargo más adelante se encontró que el
primer paso de la reacción era la epoxidación del doble enlace presente en los
carbonos C8-C9, luego se afirmó que la reacción debía implicar un
“rompimiento reductor del epóxido, pero no se proporcionaron mayores detallessobre las enzimas implicadas (Duetz, et al., 2003). La formación de un
terpineol se informó por primera vez en un resumen de un simposio realizado
por Kraidman en 1969. La cepa utilizada fue Cladosporium sp. T12, pero no se
compartieron mayores detalles experimentales (Duetz, et al., 2003) y no parece
haberse realizado un seguimiento de esta cepa. Desde el 2001 en trabajos
realizados por Demyttenarae, et al., 2001 se comenzó a utilizar cepas de P.
digitatum DSM 62840, encontrando que estas transformaban el R-(+)-limonenoprincipalmente, per o no exclusivamente a α-terpineol. Un trabajo interesante
fue el realizado por Demyttenaere et al. 2001 con más de 60 cepas de hongos
que produjo la formación de 1,2-dioles y R-(+)-limoneno en donde una de las
cepas usada para la obtención de α-terpineol fue el P. digitatum con la cual
obtuvo un rendimiento del 100% luego de ocho horas. En los últimos años se
han estudiado otros microorganismos para la producción de α-terpineol tales
como: Fusarium oxysporum 152B, con el cual se obtuvo una concentración decerca de 4(g/L) en un tiempo de 48 horas y con una eficiencia de extracción del
36% (Molina, et al., 2015), además se puede encontrar la literatura
correspondiente con la optimización de ciertos parámetros, tales como: efectos
de la composición del medio, la presencia de un co-sustrato y la concentración
del sustrato (Lemos, et al., 2008); también se han utilizado células de
Sphingobium sp. Obteniendo una producción de aproximadamente 10-12(g/L)
luego de 72 horas, con una selectividad de cerca del 80% y con una tasa
máxima de producción cercana a 0.25(gh-1/L) (Lemos, et al., 2010), entre otros.
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5 MARCO TEÓRICO
5.1 BIOTRANSFORMACIÓN
Según Mariano García en su libro biotecnología alimentaria, unabiotransformación se puede llevar a cabo por cualquiera de los siguientes
métodos:
Mediante el uso de células en crecimiento. En este caso la molécula
precursora se incorpora al medio de cultivo desde la inoculación o bien
durante el transcurso de etapas posteriores en donde el crecimiento
celular aún no ha terminado.
Mediante el uso de células cosechadas. La primera etapa de este
método consiste en permitir un crecimiento celular abundante en un
medio de cultivo especial, llamado de crecimiento. Después estas
células se separan por centrifugación o filtración para incorporarlas a un
segundo medio; el de biotransformación, que contiene los precursores.
Un ejemplo de este tipo de procesos es el uso de esporas microbianas
como biocatalizadores.
Mediante el uso de células inmovilizadas. Aquí es necesario producir lascélulas en un medio apropiado, para después separarlas e
inmovilizarlas. Esto último puede realizarse con el uso de cualquiera de
las siguientes técnicas: atrapamiento en polímeros porosos, adsorbiendo
a los microorganismos sobre la superficie de soportes insolubles,
induciendo ligaduras covalentes a los soportes o bien induciendo una
agregación física o química.
Mediante el uso de enzimas purificadas. En algunos casos es necesarioemplear enzimas con un alto nivel de purificación, esto puede deberse a
que o bien hay una buena difusión, apropiada de las moléculas
precursoras a través de la membrana microbiana, o que el producto de
la transformación no se difunda una vez producido. Una condición
indispensable para recurrir a este tipo de método es que la enzima debe
separarse y purificarse con cierta facilidad o bien estar disponible en
forma comercial. El uso de estas enzimas debe puede ser en su formalibre o también inmovilizada.
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Mediante el uso de sistemas multifase. En el caso de los precursores y
productos, al menos uno de ellos, insoluble en agua pero lipofílicos, por
lo general se trabaja en dos fases, una acuosa que contiene la enzima o
los microorganismos y un solvente no miscible en agua.
Mediante el uso de sistemas de multiconversión. Para el caso en el que
la biotransformación requiera de dos o más pasos secuenciales.
5.2 LIMONENO
El limoneno posee una estructura química similar a los principales compuestos
oxigenados usados en la industria de los biosabores (carveol, carvona, alcohol
perílico, terpineol, etc.) En su estructura presenta un centro quiral y diez
átomos de carbono, de los cuales seis pertenecen a un ciclo, lo que lo clasifica
como un monoterpeno monocíclico (Bicas , et al., 2010). La presencia de
enlaces dobles entre los carbonos C1-C2 y C8-C9, lo que hace más probable la
oxidación (hidroxilación) en las posiciones alílicas (C3, C6) y la epoxidación en
los dobles enlaces por razones de estabilidad y reactividad química, sin
embargo puede oxidarse en carbonos menos reactivos. Debido a que la
reactividad en los metilos y metilenos alílicos es muy similar, se pefiere el uso
de biocatalizadores, ya que estos no see ven afectados por la selectividad
(Castellanos, 2007). En la Figura 1. Se indican los posibles sitios de oxidación
y algunos de los compuestos oxidados más importantes.
Como se ha indicado anteriormente la mayor parte de los aceites esenciales de
la naranja están constituidos por limoneno (Tackenberg, et al., 2014), lo que
hace del limoneno, gracias a su amplia distribución en la naturaleza, un
precursor abundante y económico en la síntesis de productos de químicos
finos. (Castellanos, 2007) Uno de los principales productos obtenidos luego de
su biotransformación es el α-terpineol, el cual es un monoterpeno oxigenado de
importante uso comercial, sin embargo la biotransformación de limoneno a α-
terpineol como producto principal presenta algunos inconvenientes tales como:
inestabilidad química, alta volatilidad y alta citotoxidad tanto de los precursores
como de los productos, además de baja tasa de solubilidad de los solutos y
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bajas tasas de transformación (Schewe, et al., 2006). El uso de sistemas
bifásicos ha demostrado ser una excelente técnica, ya que aumenta los
rendimientos de la recuperación de productos y disminuye las perdidas por
volatilización mediante la reducción del sustrato. (Lemos, et al., 2010)
Figura 1. Principales compuestos derivados del (R)-(+)-limoneno
5.3 Penicillium digitatum
Es un hongo mesófilo causante de cerca del 90% de las cosechas de cítricos,
hiere la superficie de los cítricos y crece en forma de filamentos (Shukui, et al.,
2016), se clasifica como un hongo necrotrófico patógeno (Marcet-Hauben, et
al., 2012), se reproduce asexualmente por la producción de conidias, además
tiene un gran parecido morfológico con el P. itallicum, pero se diferencian por la
forma cilíndrico-elíptica en las conidias del P. digitatum (Stolk, et al., 1990), tal
como se ve en la Figura 1.
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Figura 2. Naranja en descomposición debido a Penicillium digitatum(izquierda) y conidias del P. digitatum vistas desde el microscopioelectrónico de barrido (derecha)
Tomada de: http://img.interempresas.net/fotos/446212.jpeg
Desde hace varios años se tiene conocimiento que el P. digitatum DSM 62840
que se encuentra en la cáscara de naranjas descompuestas tiene la capacidadde transformar el (R)-(+)-limoneno rápidamente a α-terpineol (Yoshiaki &
Yoshinori, 2016),como se ve en la , además se sabe de la formación de
epóxidos como sustancias intermedias en las reacciones de biotransformación
por especies de Penicillium (Borges, et al., 2009).
Figura 3. Biotransformación de (R)-(+)-limoneno a α-terpineol por P.digi tatum
5.4 Terpineol
El terpineol es el monoterpeno que constituye una gran parte de los aceitesesenciales de las plantas (Maróstica & Pastore, 2007), en la industria es usado
principalmente en perfumería, productos de limpieza, productos cosméticos,
como saborizante y como fungicida (Bathia, et al., 2008). Sus propiedades
quirales se traducen sobre todo es sus características aromáticas: el (R)-(+)-α-
terpineol tiene un olor típicamente floral, mientras que el (S)-(-)-α-tiene el olor
característico de las coníferas (Maróstica & Pastore, 2007). Como fungicida
tiene efecto en una amplia variedad de especies de hongos, entre las que se
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incluye Penicillium (Pinto, et al., 2014). Algunos estudios han reportado que el
terpineol puede inducir cambios morfológicos importantes en el Penicillium
digitatum que pueden inhibir el crecimiento micelar (Guo-xing, et al., 2015)
Figura 4. Aplicaciones del α-terpineol en la industria
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6 MATERIALES Y MÉTODOS USADOS
6.1 Microorganismo, medio de cultivo y reactivos
Penicillium digitatum DMS 62840 se obtuvo de la colección demicroorganismos y cultivos de células (DSMZ) en Alemania (Braunschweig).
Se utilizaron tres medios de cultivo solidos: PDA, agar papa dextrosa; MEA,
agar extracto de malta; y se usaron materiales puros para preparar algunos de
los medios de cultivo complejos. Medio de cultivo YGA, el cual contenía 3.0 g/L
de extracto de levadura, 20 g/L de extracto de malta, 20 g/L de glucosa, 1.0 g/L
de peptona bacteriológica y 20 g/L de agar; además se usaron tres medios de
cultivo en estado líquido: YMPG, que contenía 5.0 g/L de extracto de levadura,
10 g/L de extracto de malta, 10 g/L de glucosa y 5.0 g/L de peptona
bacteriológica; MYB, que contenía 3.0 g/L de extracto de levadura, 20 g/L de
extracto de malta, 10 g/L de glucosa y 10 g/L de peptona bacteriológica y el
medio YG, que contenía 3.0 g/L de extracto de levadura, 20 g/L de extracto de
malta, 20 g/L de glucosa y 1.0 g/L de peptona bacteriológica. Los medios de
cultivo se compraron en OXOID (Hampshire, Inglaterra), mientras que el (R)-
(+)-limoneno (98%) y α-terpineol (98%) se compraron en Merck (Darmstadt,
Alemania).
6.2 Crecimiento microbiano de Penici l l ium digi tatum DSM 62840 en
medio sólido
Penicillium digitatum DSM 62840 creció en los medios de cultivo PDA, MEA y
YGA, los cuales fueron descritos anteriormente, a una temperatura de 23°Cdurante 10 días, en los tres casos el diámetro de la colonia fue medido en
orden con el fin de determinar la cinética de crecimiento de los
microorganismos. La tasa de crecimiento radial (mm/h) se determinó según el
método descrito por (Trinci, 1969), el cual consiste en hacer un seguimiento de
las etapas de crecimiento de la colonia y la germinación de esporas con el fin
de fotografiar el crecimiento del cultivo en una cámara de cultivo o portaobjetos
bajo el microscopio (Figura 5 y Figura 6) en intervalos de 15 minutos y a
temperatura constante, para después registrar el diámetro de las colonias en
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dos direcciones separadas por ángulos rectos con un ShadowMaster tomando
la media de por lo menos seis repeticiones, las tasas de crecimiento se
calculan con las medidas realizadas en intervalos de nueve horas, mientras
que las colonias crecen a un ritmo constante. El mayor tamaño de crecimiento
del cultivo microbiano fue seleccionado de acuerdo a los valores para las tasas
de crecimiento radial y este valor fue usado para el mantenimiento del
microorganismo. Todas las pruebas fueron realizadas tres veces.
6.3 Evaluación de la actividad antifúngica del sustrato
Diferentes concentraciones (0 a 280 mM) de (R)-(+)-limoneno se añadieron enel medio PDA antes de realizar la gelificación, en todos los casos la dispersión
de (R)-(+)-limoneno fue llevada a cabo por medio de agitación. Después los
medios de cultivo se inocularon con 20 μL de esporas en suspensión (1 x 107
esporas/mL). El crecimiento microbiano (a una temperatura de 23°C) se
controló por medio de la medición del cambio en el diámetro de las colonias
luego de 8 días. Los porcentajes de inhibición se calcularon usando la
ecuación 1, donde Dt es el diámetro medio de la colonia de hongos usadacomo testigo y Dp es el diámetro promedio de las colonias de hongos de
prueba. Los resultados fueron usados para realizar graficas de inhibición. La
concentración más pequeña del (R)-(+)-limoneno que inhibía el crecimiento del
P. digitatum fue llamada concentración de mínima inhibición (CIM), y la
concentración que inhibía el 100% de crecimiento fue llamada concentración
letal (CL)
Figura 5. Crecimiento del cultivo en cámara
ℎó (%) = −
∗ 100
1
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Tomada de (Trinci, 1969) modificada
Figura 6. Crecimiento del cultivo en portaobjetos para observarse bajo elmicroscopio
Tomada de (Trinci, 1969) modificada
6.4 Preparación de la suspensión de esporas
Las esporas que habían sido previamente seleccionadas en medio sólido de
nuevo se suspendieron en 10 mL de solución salina con 0.85% NaCl y 0.1%
Tween 80 (por lo general las superficies de las placas son limpiadas de forma
periódica con detergentes y/o desinfectantes, los cuales tienen actividad
antimicrobiana y pueden inhibir el crecimiento del cultivo, para lo cual es
necesario usar un medio de cultivo que contenga Tween 80, el cual neutraliza
compuesto fenólicos, aldehídos y amonios cuaternarios, así se evitaninterferencias en la lectura e interpretación de resultados), se hizo un recuento
del número de células (N) por mL en una cámara de Neubauer obteniéndose
que la concentración inicial fue de 1x107 esporas/ml
6.5 Cinética de crecimiento microbiano de Penici l l ium d igi tatum DSM
62840 en medio líquido
El Penicillium digitatum DSM 62840 creció en frascos equipados con tapones
de teflón de 22 mL que contenían 5 mL de YMPG, MYB o YG, según fuese el
caso, en medio líquido a una temperatura de 27°C y agitación de 150 rpm
usando un agitador orbital (Heidolph, Vibramax 100, Schwabach, Alemania). El
medio fue inoculado con 50 µL de esporas en suspensión. La concentración
de la biomasa fue determinada a través del método de células en peso seco,
tomando muestras cada 24 h durante 15 días.
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6.6 Proceso general de biotransformación de (R)-(+)-limoneno a escala
de laboratorio
Los ensayos se llevaron a cabo en de frascos equipados con tapones de teflón
de 22 mL, los cuales contenían 5 mL del medio de cultivo líquido estéril. El
medio de cultivo fue inoculado con 50 μL esporas en suspensión y se pre-
incubaron a 27 °C por 72 horas y con una agitación de 150 rpm utilizando un
agitador orbital. Después de la pre-incubación el (R)-(+)-limoneno puro se
añadió en concentraciones específicas, que fueron establecidas para cada
experimento que se iba a llevar a cabo. La biotransformación microbiana se
monitorizo durante todo el experimento. Al mismo tiempo se realizaron dos
controles: biomasa en blanco (esporas suspendidas en el medio de reacción
sin sustrato) y sustrato en blanco (medio de reacción y sustrato sin suspensión
de esporas). Los productos de la reacción y el sustrato restante fueron
extraídos y analizados por medio de cromatografía de gases y espectrometría
de masas, la bioconversion fue evaluada en todos los casos por medio de la
ecuación 2.
6.6.1 Efecto del tipo de medio de cultivo
Los experimentos de biotransformación fueron llevados a cabo en medio de
cultivo líquido, usando YMPG, YG o MYB disueltos en 0.1 M en un buffer (pH
3.5) de citrato-fosfato y bajo las condiciones ambientales que fueron descritas
anteriormente. El (R)-(+)-limoneno fue añadido con una concentración de 14.7
mM. La cinética de la transformación microbiana fue monitoreada luego de 0,
24, 48,72 y 96 h después de añadir el sustrato. El medio de cultivo con el valor
más alto en la bioconversion fue seleccionado para evaluar los parámetros debiotransformación adicionales.
(%) = − ()
()∗ 100
2
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6.6.2 Efecto del pH
El efecto del pH en la biotransformación del limoneno fue estudiado disolviendo
el medio de cultivo MYB en un buffer de citrato-fosfato de 0.1 M para los
siguientes valores de pH: 3.0, 3.5, 4.5 y 6.0. Los ensayos fueron llevados a
cabo en 22 mL de frascos equipados con tapón de teflón que contenían 5 mL
de medio líquido estéril. El medio de cultivo fue inoculado con 50 μL de
esporas en suspensión y fue pre-incubado a 27°C por 72 h con una agitación
de 150 rpm utilizando un agitador orbital. El (R)-(+)-limoneno fue añadido con
una concentración de 14.7 mM. La transformación microbiana fue monitoreada
0 y 48 h después de añadir el sustrato. El medio de cultivo con los valores más
altos en la bioconversion y concentración específica del producto deseado fueseleccionado para los parámetros adicionales de la biotransformación.
6.6.3 Evaluación de las fases de crecimiento durante la
biotransformación del limoneno
Los ensayos fueron llevados a cabo en frascos equipados con tapón de teflón
de 22 mL, que contenían 5 mL del medio liquido MYB (pH 3.5). El medio decultivo fue inoculado con 50 μL de esporas en suspensión pre-incubadas a
27°C por 24, 72, 120, 168 y 216 h de acuerdo con las fases: lag; exponencial
temprana, exponencial media y exponencial final y las fase estacionaria, con
una agitación de 150 rpm utilizando un orbital agitador, una vez el P.digitatum
alcanzaba la fase correspondiente, (R)-(+)-limoneno fue añadido al medio de
cultivo (pH 3.5) con una concentración final de 14.7mM. La cinética de la
transformación microbiana para cada bioconversión fue monitoreada 0, 24, 48 y96 h después de la reacción. La fase de crecimiento con la mayor
bioconversion fue seleccionada para evaluar parámetros adicionales.
6.6.4 Efecto de la concentración del sustrato
Diferentes concentraciones de (R)-(+)-limoneno (5-100) mM fueron usadas.
Los ensayos fueron llevados a cabo en frascos equipados con tapón de teflón
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de 22 mL en medio de cultivo líquido MYB (pH 3.5). El medio de cultivo fue
inoculado con 50 μL de esporas en solución y pre-incubadas a 27ºC durante 72
h (fase exponencial temprana) con una agitación de 150 rpm. (R)-(+)-limoneno
fue añadido con una concentración final de 5-100 mM. La transformación
microbiana fue monitoreada luego de 0 y 48 h de añadir el sustrato. La
concentración óptima fue seleccionada de acuerdo a ambos requisitos: alta
bioconversion y alta especificidad.
6.6.5 Efecto inductivo de (R)-(+)-limoneno
Con el objetivo de determinar un posible efecto inductivo del sustrato, los
experimentos de biotransformación fueron llevados a cabo inoculando el medio
MYB (pH 3.5) con 50 μL de esporas en solución las cuales fueron obtenidas
previamente de un cultivo de crecimiento en presencia del inductor ((R)-(+)-
limoneno 14.7 mM). Las biotransformaciones fueron llevadas a cabo por 72 h a
27ºC Y 150 rpm, con (R)-(+)-limoneno 14.7 mM en el medio de cultivo, y
fueron monitoreados luego de 0, 8, 24 y 48 h.
6.6.6 Extracción, identificación y cuantificación de (R)-(+)-limoneno y α-
terpineol durante la biotransformación del limoneno
Los productos y sustratos restantes de la biotransformación fueron extraídos en
dos ocasiones con acetato de etilo (2 x 2.5 mL) seguido por una centrifugación
a 4000 rpm durante 5 min. La fase orgánica fue recogida y secada con anhidrode Na2SO4 y a continuación se concentró con una corriente de N2.
Posteriormente se añadieron 3 μL de n-tetradecano (estándar interno) y se
diluyo a 1 mL. El sustrato y los productos oxigenados fueron identificados y
cuantificados con una cromatografía de gases junto a un espectrómetro de
masas. La temperatura fue programada a 45ºC y mantenida por 10 min, luego
la temperatura se aumentó a una velocidad de 3ºC/min hasta alcanzar los
220ºC, manteniendo esta temperatura final durante 30 min. La identificación de
los compuestos se llevó a cabo mediante la comparación de los espectros de
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masa de las muestras con los con los siguientes espectros de los compuestos
de la base de datos ADAMS: NSB 75K, 138K NIST 05 y Wiley. Las
concentraciones de limoneno y α-terpineol en cada extracto fueron
cuantificadas por curvas de calibración individuales, usando las relaciones de
área de picos vs relaciones de cantidades de referencia de las muestras
auténticas. La eficiencia de recuperación de producto en la extracción líquido-
líquido de acetato de etilo fue previamente determinada para cinco
extracciones diferentes con cantidades conocidas de α-terpineol y limoneno en
un medio de crecimiento celular fresco y en un caldo de cultivo envejecido. Se
extrajeron las cantidades de referencia, y las cantidades extraídas de α-
terpineol y limoneno fueron previamente determinadas. Cada prueba fue
realizada tres veces y se calculó la tasa promedio de recuperación.
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7 ANÁLISIS E INTERPRETACIÓN DE RESULTADOS
7.1 Crecimiento microbiano de Penici l l ium digi tatum DSM 62840 en
medio sólido
Se comparó el crecimiento del microorganismo en los tres medios de cultivo
mencionados anteriormente: PDA, MEA y YGA, como se puede observar en la
Figura 7. la tasa de crecimiento del P. digitatum en los medios de cultivo PDA
y YGA durante toda la evaluación fue muy parecida, mientras que la tasa de
crecimiento en el medio de cultivo de YGA, fue muy lenta en la mayoría del
tiempo monitoreado, aunque en la parte final de la evaluación el diámetro de
las colonias en los tres medios de cultivos observados fue muy similar, lo cual
hace pensar en un tiempo de fase lag bastante mayor en el medio YGA que en
los otros cultivos observados; como se mencionó en la metodología, para la
evaluación de los parámetros restantes se utilizó el medio de cultivo con el
mayor valor en la en la tasa de crecimiento del radio en la colonia del P.
digitatum DSM 62840, el cual se obtuvo en el medio PDA con una tasa de
crecimiento de (0.35 ± 0.01 mm/h).
Figura 7. Cinética de crecimiento de P. digitatum DSM 62840 endiferentes medios de cultivo en placas de agar a 23ºC
Tomada de: (Prieto, et al., 2011) modificada
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7.2 Evaluación de la actividad antifúngica del sustrato
Con el objetivo de determinar la inhibición del (R)-(+)-limoneno en el
crecimiento del cultivo de P. digitatum DSM 62840 la concentración del
sustrato vario entre 0 y 280 mM. La actividad inhibitoria del (R)-(+)-limoneno
en el cultivo de P. digitatum en medio de cultivo PDA se muestra en la Tabla 1
y como se puede observar el valor de la concentración de 0.73 mM
corresponde a la mínima concentración de inhibición (MIC), mientras que la
concentraciones por encima de 257 mM fueron consideradas como
concentraciones letales (CL). Este efecto puede ser atribuido a la toxicidad del
(R)-(+)-limoneno, además en la Figura 8 se puede observar como la relación
entre la tasa de crecimiento del cultivo y la concentración de (R)-(+)-limonenopresenta una tendencia inversamente proporcional, por lo que en la
investigación se hizo necesario el uso de la ecuación 1 para calcular el
porcentaje de inhibición. Se encontró que la concentración de (R)-(+)-
limoneno que producía una inhibición promedio correspondía a 14.7 mM,
además este valor también correspondía con un cambio abrupto en la tasa de
crecimiento del radio en el cultivo, tal como se observa en la Tabla 1.
Tabla 1 Actividad inhibitoria del (R)-(+)-limoneno en el medio de cultivoPDA para el P. digitatum DSM 62840 a 23ºC
Concentración de limoneno
(mM )
Porcentaje de
inhibición (%)TCR (mm/h)
0 0 0.47 ± 0.01
0.73 4 0.41 ± 0.02
1.46 6.7 0.41 ± 0.02
3.65 13.3 0.41 ± 0.02
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7.35 17.3 0.40 ± 0.02
14.7 22.7 0.31 ± 0.02
25 28.2 0.30 ± 0.07
36.75 30.7 0.27 ± 0.04
73.4 34.7 0.23 ± 0.05
88.08 40 0.17 ± 0.02
110.1 46.7 0.13 ± 0.03
132.12 58.7 0.12 ± 0.02
185.5 80 0.09 ± 0.03
220.2 85.3 0.08 ± 0.01
256.9 100 0.00 ± 0.00
280 100 0.00 ± 0.00
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Figura 8. Relación entre la concentración del (R)-(+)-limoneno y elcrecimiento del P. digitatum DSM 62840 en medio PDA a 23ºC
7.3 EVALUACIÓN DEL PROCESO DE BIOTRANSFORMACIÓN DEL (R)-
(+)-LIMONENO
7.3.1 Efecto del tipo de cultivo
Los medios de cultivos que fueron usados en la investigación conteníancompuestos nutritivos similares con concentraciones diferentes, para los
medios MYB y YG el (R)-(+)-limoneno era transformado solo en α-terpineol. No
obstante, luego de 48 h de reacción la concentración de (R)-α-terpineol fue
aproximadamente 3 veces más alta en el medio de cultivo MYB (1,585 ± 19,59
mg/L) que en YG, como se muestra en la Figura 9, en el medio de cultivo
YMPG los productos de la biotransformación solo aparecieron luego de 96 h y
se encontró que únicamente se había formado trans-carveol, lo que lleva aconcluir que el medio de cultivo puede afectar tanto la especificidad como la
concentración de los productos.
0
0.2
0.4
0.6
0.8
1
0 1 2 3 4 5 6
T a s a d e c r e c i m i e n t o d e l r a d i o e n l a c o l o n
i a
( m m / h )
Concentración de (R)-(+)-limoneno (mM)
Efecto de la concentración del sustrato en el cultivo de P.
digitatum DSM 62840
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Figura 9. Efecto del medio de cultivo en la producción de α-terpineol apartir de (R)-(+)-limoneno por P. digit atum DMS 62840. Condiciones delmedio de cultivo: pH 3.5, Temperatura 27ºC 150 rpm
Tomada de (Prieto, et al., 2011) modificada
En 48 h el contenido de α-terpineol fue de 880,6 ± 2,64 (mg de α -terpineol / g
de célula seca). Una posible explicación para el tiempo y el producto obtenido
en el medio de cultivo YG puede ser que la cantidad de la glucosa presente en
el medio fue suficiente para la alimentación del P. digitatum, ya que como todos
los hongos tiene como fuente de carbono la glucosa, lo que se traduciría en la
producción de trans-carveol como un metabolito secundario. Tal como se
indicó en la metodología y de acuerdo a los resultados el medio de cultivo MYB
fue utilizado para la evaluación de los parámetros adicionales.
7.3.2 Efecto del pH
El efecto del pH en la capacidad de biotransformación del P. digitatum fue
evaluado para diferentes valores de pH en el medio de cultivo MYB las células
de P. digitatum mostraron especificidad hacia la producción de (R)-(+)-
limoneno para valores de 3.0 y 3.5 en el pH, como se puede observar en la
Tabla 2, mientras que para niveles de pH mayores a 4.5 la especificidad
disminuyo debido a la formación de otros productos, sin embargo la producción
de α-terpineol fue mayor en todos los casos, valores de pH mayores a 4.5
promovían la formación de otros compuestos oxigenados por medio de
reacciones de hidroxilación, isomerización oxidación y ruptura cíclica en
diferentes carbonos de (R)-(+)-limoneno como se muestra en la Figura 10
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Tabla 2. Metabolitos producidos durante la biotransformación de (R)-(+)-limoneno por P. digitatum DSM 62840 a diferentes niveles de pH en mediode cultivo MYB luego de 48 h de reacción
Concentración (mg/L)
pH de la biotransformación
3 3.5 4.5 6
Limoneno restante
1061 ±
67.1
439.1 ±
28.2 530.6 ± 21.9
1641 ±
39.5
α-Terpineol982 ±40.5
1537 ±34.9 1352 ± 23.2
288.1 ±20.7
Linalool n.d1 n.d 27.8 ± 1.3 28.6 ± 2.0
Trans- p-menta-2,8-dien-1-ol n.d n.d 23.6 ± 1.5 23.9 ± 1.5
cis- p-menta-2,8-dien-1-ol n.d n.d 19.5 ± 0.9 42.9 ± 2.1
trans-carveol n.d 66.9 ± 3.4 20.1 ± 1.2 30.1 ± 1.9
cis-carveol n.d n.d 42.1 ± 1.9 32.2 ± 1.6
Carvona n.d n.d 27.3 ± 1.0 23.0 ± 1.2
Concentración total de
productos 98 ± 40.5
1604 ±
37.3
1512.4 ±
31.03
468.8 ±
19.7
1 n.d: no detectado
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Figura 10. Productos de la biotransformación de (R)-(+)-limoneno porPenicillium digitatum DSM 62840 obtenidos en pH 4.5 y 6.0 en medio decultivo MYB a una temperatura de 27ºC y a 150 rpm
Para valores de pH entre 4.5 y 6.0 se presentan derivados oxigenados que no
se habían encontrado durante la investigación, ni habían sido reportados en la
literatura para la biotransformación de (R)-(+)-limoneno, lo que puede sugerir
que para valores ligeramente ácidos de pH se ve favorecida la producción de
metabolitos secundarios, además del producto principal, el cual solo es posibleobtener a través del rompimiento en el enlace de los carbonos 8 y 9 del
epóxido obtenido. Tal como se muestra en la Tabla 2 y de acuerdo con la
metodología de la investigación el valor de pH con el cual se obtuvo la mayor
concentración del producto principal (α-terpineol) fue usado para la evaluación
de los parámetros adicionales.
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7.3.3 Evaluación de las fases de crecimiento
Para estos experimentos se añadió limoneno en diferentes fases de
crecimiento del cultivo, la biotransformación fue monitoreada cada 24 h durante
96 h, la tasa más alta de producción de α-terpineol (1667 ± 49,70 mg/L) fue
obtenida, tal como se esperaba en la fase temprana de crecimiento
exponencial la producción de α-terpineol fue bastante mayor que en las otras
fases de crecimiento como se muestra en la Figura 11, además durante las
primeras 48 h todas las cantidades de α-terpineol crecieron con bastante
rapidez, también en estas 48 primeras horas la producción de α-terpineol fue
muy parecida en la fase lag y en la fase estacionaria y para el final de las 48 h
las cantidades obtenidas en los productos en las fases lag, estacionaria y
exponencial final fue muy similar y luego de 48 h los productos obtenidos en
todas las fases se mantuvieron constantes
Figura 11. Efecto de la adición de limoneno en diferentes fases decrecimiento de Penicillium digitatum DSM 62840 en la concentración de α-terpineol. Condiciones del cultivo: medio de cultivo MYB, temperatura27ºC, pH 3.2 y 150 rpm
Tomada de (Prieto, et al., 2011) modificada
Es necesario señalar que si bien la biotransformación de (R)-(+)-limoneno a α-
terpineol ocurre principalmente en la fase exponencial y que en la Figura 11
se puede observar un cambio abrupto entre la fase exponencial inicial y final
(50-60%), pero no se encontraron registros en la literatura que permitieran una
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transición entre la fases de crecimiento exponencial inicial, media y final, por lo
que la fase exponencial media no fue mostrada en la Figura 11
7.3.4 Efecto de la concentración del sustrato
En la mayoría de los casos altas concentraciones de disolventes orgánicos
pueden llegar a ser tóxicos para sistemas biológicos, por lo que se probaron
concentraciones del sustrato que variaron en un rango de 10-100 mM con el
objetivo de optimizar la bioconversion del (R)-(+)-limoneno a α-terpineol y como
se puede ver en la Tabla 3 las concentraciones entre 10 y 15 mM favorecen la
formación del producto principal mientras que concentraciones más elevadas
no solo afectan la obtención de α-terpineol, sino que también la especificidad,
lo que traduce en la aparición de otros productos que pueden observarse en la
Figura 12
Tabla 3 Producción de metabolitos durante la biotransformación de (R)-(+)-limoneno, usando P. digitatum DSM 62840, en medio MYB a 27ºC, 150rpm y pH 3.5
Concentración de (R)-(+)-limoneno (mM)
Sustrato y
productos (mg/L)10 15 30 50 75 100
Limonenorestante
964.7 ±40.70
317 ±25.50
2319 ±44. 67
4866 ±56.98
7432 ±50.82
10566 ±57.89
α-Terpineol357 ±
15.34
1537 ±
34.95
1039 ±
37.36
634 ±
26.26
697 ±
23.75
496 ±
18.84
Otros productos 067 ±
3.43
484 ±
16.26
704 ±
19.97
1477 ±
24.73
1745 ±
32.23
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Además los resultados concuerdan con el valor obtenido en la concentraciónde limoneno que permitía una tasa de crecimiento del Penicillium digitatum
DSM 62840 en el medio de cultivo PDA que a su vez producía un valor
aceptable en el porcentaje de la inhibición por parte del sustrato al P. digitatum,
por lo que se puede afirmar que en este caso la concentración del sustrato se
encuentra fuertemente relacionada con la tasa de crecimiento del cultivo y con
la biotransformación del sustrato al producto principal, además de corroborar
que el α-terpineol es un metabolito primario del P. digitatum DSM 62840
En la Figura 12 se muestran los productos de la biotransformación a una
concentración de 10 mM (B) y 100 mM (A) y se puede notar que con una
concentración de 10 mM la producción de α-terpineol es mucho mayor que una
concentración de 100 mM del sustrato, además con 10 mM no se presenta la
obtención en grandes cantidades de otros productos tales como: cis / trans
carveol, carvona, 1,2 - diol limoneno, cis- p-ment-2,8-dien-1-ol, fenil etanol
(picos 5, 6,7, 8, 9 y 12, respectivamente), β-pineno, sabineno, mirceno (picos 1,
2 y 3), y dos no identificados (Picos 11 y 14) que aparecen a una concentración
de limoneno de 100 mM, y en general luego de concentraciones del sustrato
mayores a 30 mM.
Biotransformación
total
357 ±
15.34
1604 ±
37.33
1523 ±
29.98
1338 ±
22.28
2174 ±
20.76
2241 ±
31.19
Biotransformación (%)
26.20 ±
1.13
75.21 ±
1.71
25.42 ±
0.91
9.31 ±
0.39
6.82 ±
0.23
3.64 ±
0.14
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Figura 12 Cromatograma obtenido en la biotransformación de (R)-(+)-limoneno por Penicillium digitatum DSM 62840 en medio de cultivo MYB a27ºC, 150 rpm y pH 3.5. A: limoneno 100 mM; B: limoneno 15 mM
Tomada de (Prieto, et al., 2011)
7.3.5 Efecto inductivo del (R)-(+)-limoneno en la capacidad de
biotransformación
La adición previa del (R)-(+)-limoneno al medio de cultivo utilizado en lainvestigación (MYB) produjo un aumento en la producción de α-terpineol del
14.58%, de acuerdo con el control realizado luego de 48 h (a partir de 48 h la
producción de α-terpineol decae considerablemente), como se puede observar
en la Tabla 4 y en las figuras Figura 13 y Figura 14, los resultados sugieren
que las enzimas involucradas en la biotransformación son inducidas por el (R)-
(+)-limoneno, ya que en presencia del limoneno la concentración obtenida de α-
terpineol y por tanto la bioconversion aumentan, además algunos estudios handeterminado que la enzima involucrada es una monooxigenasa cytochromo P-
450 (Tan, et al., 1998)
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Tabla 4. Biotransformación de (R)-(+)-limoneno por P. digitatum DSM62840 de acuerdo con la presencia y ausencia de un inductor
Tiempo(h)
Concentración (mg α-
terpineol/L)
Bioconversión del limoneno
(%)
sin inductor con inductor sin inductor con inductor
0 0.00 0.00 0.00 0.00
8 492 ± 10.90 763 ± 15.90 24.07 ± 0.53 37.34 ± 0.78
24 1154 ± 18.81 1308 ± 22.21 56.47 ± 0.92 64.00 ± 1.09
48 1585 ± 19.51 1835 ± 42.43 77.40 ± 1.32 89.79 ± 2.66
Figura 13. Efecto inductivo del (R)-(+)-limoneno en la producción de α-terpineol por Penici l l ium digi tatum DSM 62840
0.00
1000.00
2000.00
0 10 20 30 40 50 60 C o n c e n t r a c i ó n d e α -
t e r p i n e o l ( m g / L )
Tiempo (h)
Efecto inductivo del sustrato en en la producción de α-
terpineol
sin inductor
con inductor
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Figura 14. Efecto inductivo del (R)-(+)-limoneno en la bioconversion de(R)-(+)-limoneno por Penici l l ium digi tatum DSM 62840
0.00
20.00
40.00
60.00
80.00
100.00
0 10 20 30 40 50 60
B i o c o n v e r s i ó n ( % )
tiempo (h)
Efecto inductivo del sustrato en la bioconversión
sin inductor
con inductor
-
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8 CONCLUSIONES
Los resultados de la investigación llevados a cabo por (Prieto, et al., 2011) paraobtener la mayor cantidad de α-terpineol a partir de (R)-(+)-limoneno por
Penicillium digitatum DSM 62840 fueron: medio de cultivo líquido MYB a pH
3.5 inoculado con esporas inducidas y crecidas en el inicio de la fase
exponencial, con una concentración de limoneno de 14.7 mM, el sustrato se
transformó de manera específica a (R)-(+)-α-terpineol. La máxima
concentración alcanzada fue de 1835 (mg/L), además se determinó que el
limoneno tenía un efecto inductor en el Penicillium digitatum DSM 62840, con elque se alcanzó una tasa de biotransformación del 89.79%
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