biotransformaÇÃo de compostos orgÂnicos · 1.5.2. classificação e nomenclatura de enzimas ......
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Universidade Federal do Paraná Departamento de Química
BIOTRANSFORMAÇÃO
DE COMPOSTOS ORGÂNICOS
Brás H. de Oliveira ([email protected])
2017
ii
1. Introdução ...................................................................................................................... 11.1. Aspectos gerais ...................................................................................................... 11.2. Exemplos industriais ............................................................................................. 11.3. Aspectos químicos e de bioatividade ..................................................................... 31.4. Vantagens e Desvantagens de Biocatalisadores .................................................... 4
1.4.1. Vantagens de uso de enzimas ........................................................................ 41.4.2. Desvantagens do uso de enzimas .................................................................. 5
1.5. Propriedades Enzimáticas ...................................................................................... 51.5.1. Aspectos Mecanísticos .................................................................................. 61.5.2. Classificação e nomenclatura de enzimas ..................................................... 81.5.3. Coenzimas ..................................................................................................... 91.5.4. Fontes de Enzimas ......................................................................................... 9
2. Descoberta de Novas Enzimas para Biocatálise .......................................................... 102.1. Introdução ............................................................................................................ 102.2. Triagem ................................................................................................................ 102.3. Metodologia analítica .......................................................................................... 112.4. Exemplo ............................................................................................................... 11
3. Aplicações Biocatalíticas ............................................................................................. 133.1. Reações de hidrólise ............................................................................................ 13
3.1.1. Hidrólise de amida ....................................................................................... 133.1.2. Hidrólise de ésteres ...................................................................................... 143.1.3. Hidrólise de Epóxidos ................................................................................. 183.1.4. Hidrólise de Nitrilas .................................................................................... 21
3.2. Reações de Redução ............................................................................................ 233.2.1. Redução de Aldeídos e Cetonas (Enzimas Isoladas) ................................... 253.2.2. Redução de Aldeído e Cetonas com Células ............................................... 273.2.3. Redução de C=C por Células ...................................................................... 27
3.3. Reações de Oxidação ........................................................................................... 293.3.1. Oxidação de Álcoois .................................................................................... 293.3.2. Reações de Oxigenação ............................................................................... 31
3.4. Formação de Ligações C-C ................................................................................. 403.5. Adição e Eliminação ............................................................................................ 42
3.5.1. Formação de Cianidrina ............................................................................... 423.5.2. Adição de Água e Amônia ........................................................................... 433.5.3. Reações tipo aciloína ................................................................................... 43
3.6. Transglicosilação ................................................................................................. 433.6.1. Glicosiltransferases ...................................................................................... 443.6.2. Glicosidases ................................................................................................. 44
3.7. Halogenação e Desalogenação ............................................................................ 474. Técnicas Especiais ....................................................................................................... 50
4.1. Imobilização ........................................................................................................ 504.2. Enzimas modificadas e artificiais ........................................................................ 51 enzimas artificiais (Nature Chemistry | vol 8 | september 2016, DOI: 10.1038/NCHEM.2555) .................................................................................................. 52
5. Outras Aplicações ........................................................................................................ 525.1. Metabolismo de drogas ........................................................................................ 525.2. Bioativação .......................................................................................................... 525.3. Modelos microbianos de metabolismo de mamíferos ......................................... 535.4. Derivados ativos de drogas .................................................................................. 53
1
BIOTRANSFORMAÇÃO DE COMPOSTOS ORGÂNICOS
1. Introdução
Este resumo se refere à disciplina de Biotransformação de Compostos Orgânicos.
Ele foi preparado devido à ausência de textos em Português nesse assunto. Seu conteúdo se
baseia na bibliografia recomendada e em informações de várias outras fontes. Ele pretende
apenas ser um guia para o estudante e mais informações serão fornecidas durante as aulas.
1.1. Aspectos gerais
conceito
importância: alternativa/auxiliar à síntese orgânica; obtenção de moléculas
quirais;
aplicação industrial: > 200 processos (ca. 2% do total de US$ 25 bilhões)
número de processos ao longo do tempo (gráfico)
1.2. Exemplos industriais (Ref. Industrial Biotransformations)
Produto Biocatalisador Desde Empresa Vinagre Bacteria 1823 Varias L-2-metilamino-1-fenilpropan-1-ol
Levedura 1930 Knoll AG, Alemanha
L-sorbose Acetobacter suboxydans
1934 Varias
Prednisolona Arthrobacter simplex 1955 Schering AG, Alemanha
Ác. L-aspártico Escherichia coli 1958 Tanabe Seiyaku Co., Japão
Ác. 7-aminodesace
toxicefalosporanico
(7-ADCA)
Bacillus megaterium 1970 Asahi Chemical Industry, Japão
Ác. L-málico Brevibacterium ammoniagenes
1974 Tanabe Seiyaku Co., Japão
D-p-hidroxifenilglicina Pseudomonas striata 1983 Kanegafuchi Chemical Co, Japão
Acrilamida Rhodococcus sp 1985 Nitto Chemical Ltda, Japão
Ác D-aspártico e L-alanina
Pseudomonas dacunhae
1988 Tanabe Seiyaku Co., Japão
L-carnitina Agrobacterium sp 1993 Lonza, Rep Checa Ác 2-ceto-L-gulonico Acetobacter sp 1999 BASF, Merck,
Cerestar, Alemanha
2
Ácido 6-aminopenicilânico (6-APA)
N
N
S
CO2H
O
O
H
CO2H
H2N
N
S
CO2HO
+
penicilina Gácido 6-aminopenicilânico
(6-APA)
penicilinaacilase
Usos: síntese de penicilinas semissintéticas
Condições da reação:
• C: 0.24 M, 80 g/ L [334.39 g/mol]
• pH: 8.0
• T: 30-35 oC
• Meio: aquoso
• Reação: hidrólise de amida
• Catalisador: enzima imobilizada
• Enzima: penicilina amidoidrolase (penicilina acilase, penicilina amidase)
• Cepa: Escherichia coli e outras (e.g. Bacillus megaterium)
• CAS (enzima): [9014-06±6]
3
Parâmetros do processo:
• conversão: 98%
• rendimento: 86% (reação: 97%); seletividade: > 99%; pureza: 99%
• tipo de reator: repetitive batch; volume: 3.000 L
• capacidade: 300 t/ano
• tempo de residencia: 1.5 h (average over 800 cycles; initial: 1 h)
• rendimento tempo-espaço: 445 g/L/dia
• down stream processing: extração, cristalização
• atividade da enzima: 22 M U, correspondente a aprox. 100 Kg de
biocatalizador úmido (27.5 Kg de Eupergit-C seco)
• consumo da enzima: 345 U/Kg (6-APA)
• início produção: 1973
• empresa: Unifar, Turkey (e outras: Fujisawa Pharmaceutical Co., Japan,
Gist-Brocades/DSM, The Netherlands, Novo-Nordisk, Denmark, Pfizer,
USA)
1.3. Aspectos químicos e de bioatividade
a) Esteróides
b) Aromas (patchouli)
O
O
O
OH
OH
O
O
O
OHO
progesterona
cortisona
11α-hidroxiprogesterona
R. arrhizus
P. rubrumHO
CH2OH
HO HO
álcool patchouli nor-pathcoulenol
4
c) Medicamentos (talidomida)
(R :sedativo; S : teratogênico)
d) Outros
1.4. Vantagens e Desvantagens de Biocatalisadores
1.4.1. Vantagens de uso de enzimas
são catalizadores eficientes
são aceitáveis ecológicamente
atuam em condições brandas
são mutualmente compatíveis
não estão limitadas ao papel natural
podem catalizar um grande espectro de reações
seletividade
quimioseletividade,
regioseletividade
enantioseletividade: feitas de L-aa
N
O
ONH
O
O
HO2CC
NH2
C
H
H3C CH3
SH HO2CC
H
C
H2N
H3C CH3
SH
HO2CC
HH2N
NH2
O
HO2CC
NH2H
NH2
O
R-penicilamina toxico
S-penicilamina antiartrítico
R-asparagina doce
S-asparagina amarga
5
1.4.2. Desvantagens do uso de enzimas
ocorrem em apenas uma forma enantiomérica
requerem parâmetros restritos (pH, temp.)
mostram maior atividade catalítica em água
são propensas à inibição
podem causar alergias
Enzimas Isoladas X Células Inteiras
Biocatalizador Forma Pros Contras
Enzima isolada Qualquer ap. Simples, elab. Simples, melhor produtividade
reciclagem de co-fator
dissolvida em água
alta atividade enzimática reações colaterais, subst. lipofil. insolúveis, elab. requer extração
suspensa em solv. Orgânico
fácil de realizar, elab. fácil, subst. lipofílicos solúveis, fácil rec. da enzima
baixa atividade
Imobilizada fácil recuperação da enzima
perda de atividade durante a imobilização
células inteiras Qualquer desnecessário reciclar co-fatores
equip. caro, elaboração tediosa, baixa produt. (menor tolerância à concentração), baixa tolerância a solv. org., reações colaterais
cultura em crescimento
maiores atividades mais biomassa, mais sub-produtos, processo difícil de controlar
células em repouso
elaboração mais fácil, menos sub-produtos
menores atividades
células imobilizadas
células reutilisáveis menores atividades
1.5. Propriedades Enzimáticas grupos hidrofílicos externos (-COOH, -OH, -NH2, -SH, -CONH2)
grupos lipofílicos internos
pontes disulfeto
6
inativação:
rearranjo da cadeia peptídica (começa a 40-50 oC); reversível
hidrólise; irreversível
troca de pontes disulfeto
reações de eliminação e oxidação
enzimas termoestáveis (microorganismos termofílicos)
1.5.1. Aspectos Mecanísticos
a) Mecanismo “Chave e Fechadura” (Fisher, 1894)
Problemas: substratos de pequeno volume; substratos não-naturais
7
b) Mecanismo do encaixe induzido (Koshland Jr., 1960’s)
c) Teoria de desolvatação e solvatação-substituição
Desolvatação (Dewar,1986)
substrato substitui água no sítio ativo
reação tipo “fase gasosa”
Solvatação-substituição
água de solvatação do substrato substituida pelo sítio ativo
d) Regra de atracagem de três pontos
8
e) Razões cinéticas da seletividade
1.5.2. Classificação e nomenclatura de enzimas
IUB: 3.000 enzimas (de 25.000)
atividade catalítica: 1 U.I. = 1 µmol de substrato transformado/min.
enzimas disponíveis comercialmente
EC A.B.C.D
A: principal tipo de reação
B: subtipo indicando tipo de substrato
C: natureza do co-substrato
D: número da enzima específica
Ex.: β-glucosidase (EC 3.2.1.21) de amêndoa; 20-40 unidades/ mg de
sólido
9
Classe Número Tipo de reação Utilidade* classific. dispon. 1. oxidoredutases 650 90 oxidação-redução +++
25% 2. transferases 720 90 transferência de grupos +
5% 3. hidrolases 636 125 hidrólise/formação de
várias funções +++ 65%
4. liases 255 35 adição/eliminação de pequenas moléculas
++ 5%
5. isomerases 120 6 isomerização ± 5%
6. ligases 80 5 formação/clivagem de C-O, C-S, C-N, C-C
± 1%
(*) +++: muito útil; ± = pouco uso; %: percentagem de pesquisa no período 1987-96
1.5.3. Coenzimas
NAD/NADH; NADP/NADPH; ATP; acetil-CoA
1.5.4. Fontes de Enzimas
indústria de detergentes e alimentos: proteases e lipases
fontes animais: rins, fígado, pâncreas
fontes microbianas: coleções de cultura; natureza
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2. Descoberta de Novas Enzimas para Biocatálise
2.1. Introdução necessidade de novas enzimas
novas moléculas quirais
substituição de processos químicos
processos ecológicamente corretos
2.2. Triagem fontes de enzimas
solo: 109 células/g
água
vegetais (endofíticos): ex. GA3
isolamento não seletivo: solo seco, abs esponja, agar, incubação (temp
variadas).
isolamento seletivo: pré-tratamento do solo; ad antibiótico; meio seletivo.
11
2.3. Metodologia analítica Importância
Métodos físico-químicos: ccd, clae, cg
Bioensaios (células animais, microbianas, enzimáticos)
HTS (“high-throuput screening”)
2.4. Exemplo
Biotransformação de Esteróis. Brás H. de Oliveira e Deise D. Bueno,
Química Nova 19 (3), 233-6 (1996).
Importância de substâncias esteroidais: hormônios, antiinflamatórios,
anticoncepcionais, etc.
Matérias-primas; intermediários
O
O
AndrostenodionaHO
β-Sitosterol
O
O
HO
Diosgenina
O
O
Progesterona
amostras de solo e de sementes de soja em meio líquido contendo colesterol
como única fonte de C; 7 dias
alíquota para novo frasco contendo o mesmo meio; processo executado por
um total de 15 vezes.
Crescimento microbiano em todos os frascos
Seleção: meio c/ colesterol dosagem
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TABELA 1- Degradação de Colesterol por Microorganismos Provenientes da
Amostragem 1. (S = amostra de semente; So= amostra de solo). Concentração
inicial de colesterol = 200 mg%
Amostra Colesterol Degradado
(%) 10 (S)(*) 53,02
25 (S) 50,92 8 (So) 48,82 14 (S) 47,98 7 (S) 38,76 ……. …….
(*) amostra utilizada nos experimentos de degradação do β-sitosterol
Transferência p/ meio sólido
Isolamento: bactéria Gram +
Experimento preparativo com sitosterol
Extração com solvente
Isolamento cromatográfico de androst-4-eno-3,17-diona
O
O
androst-4-eno-3,17-diona
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3. Aplicações Biocatalíticas
3.1. Reações de hidrólise
Hidrólise química: mecanismo
2/3 do total
aspectos mecanísticos: serina hidrolases
tríade catalítica: importância
C OR2
R1
ON
N
H
His
R2OHO O-
Asp
OH
Ser
O OH
Asp
N
NH
His
OC
O
R1
Ser
C OHR1
O
O HH
enzimaacilada
3.1.1. Hidrólise de amida
Ligação amida
Importância: química de aa e peptídeos
Mercado de aa: > 0,5 milhão toneladas/ano (US$ 2 bilhões)
Adoçantes não-calóricos: aspartame (Asp, Phe)
Rotas enzimáticas p/ aa enantioméricamente puros:
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R CO2R'
NH2
R CO2H
NH2
hidrolase
desidrogenaseamin. redutiva
R CO2H
O
CO2H
R
liase
Resol por hidrolases: proteases, esterases ou lipases
3.1.2. Hidrólise de ésteres
Ligação éster: hidrólise
Esterases, proteases e lipases
3.1.2.1. PLE (“Pig Liver Esterase”)
versátil, substrato-tolerante, barata
Ex.: prostaglandinas
CO2Me
CO2Me
OHPLE
CO2Me
CO2H
OH
e.e. 98%
O
COOMe
OH
HO
O
COOH
OH
HO
PLE
15
3.1.2.2. Esterases microbianas
S
S
CO2
OAc
t-Bu
S
S
CO2
OH
t-Bu
S
S
CO2
OAc
t-Bu
Bacillus sp e.e. 94%
+
CO2MeR
carboxilesteraseNP
Bacillus subtilis
R= Aril-
R= Aril-O-
CO2HAr
CO2HArO
CO2MeAr
CO2MeArO
+
+
e.e. > 95%
e.e.> 87% Ex.: analgésicos, antiinflamatórios
CO2H CO2H
MeOIbuprofeno Naproxeno
Otimização da seletividade
Modificação do substrato
Variação do sistema de solvente
Variação do pH
OAc
OAcOH
OAc
PLE
Meio e.e. (%)
H2O 55H2O/DMSO 6:4 72H2O/DMF 8:2 84H2O/t-BuOH 9:1 96
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3.1.2.3. Lipases
Hidrólise de triglicerídeos
Importante em: processamento de alimentos e prep de intermediários quirais
Pode hidrolisar e formar lig éster
Diferença lipase X esterase: interação c/ substrato
Mecanismo: α-hélice (“tampa”) é aberta quando em contato c/ bifase óleo-
água
Lipase pancreática de porco (PPL)
A mais barata
Preparação bruta (pacreatina, esteapsina)
Outras hidrolases presentes (α-quimotripsina, colesterol esterase,
fosfolipases, etc.)
Alta seletividade pode ser devida às impurezas
AcO HO OAc
+hidrolase
rac
Enzima V Reação Seletividade
(razão enantiomérica)
PPL bruta Boa >300
PPL pura Não reage -
α-quimotripsina Não reage -
Colesterol esterase Rápida 17
Hidrolase nova Boa 210
17
Lipases de Candida sp
C. lipolytica, C. antartica (CAL), C. rugosa (CRL)
C. rugosa: aceita ésteres volumosos (p.ex. de álcoois sec. cíclicos)
OAc
CO2Et
OH
CO2Et
OAcCO2Et
O
CO2Et
O
CO2Et
CRL
principal
e.e.= 77%
e.e. > 99% traços
Lípases de Pseudomonas sp (PSL)
P. fluorescens, P. aeruginosa, P. cepaceae , P. glumae
Não aceitam ésteres volumosos
Ar
SS(CH2)n (CH2)n
CO2MeMeO2C
Ar
SS(CH2)n (CH2)n
CO2HMeO2C
PSL
n e.e. (%)
1 482 >983 79
Lípases de Mucor sp (MSL)
M. miehei, M. javanicus
M. miehei : operador químico Asp-His-Ser (similar outras lípases)
O
RO
O
RO
OO
ROH
RO
O
lipase
Lipase R Solvente e.e. (%)
CRL H tampão 12 PSL H tampão 81 MSL H tampão >99 MSL Me tampão >99 PPL Me tampão 20 PPL Me tampão/hexano 85
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Outras Lipases: microbianas
3.1.3. Hidrólise de Epóxidos
Epóxidos: estrutura, preparação, importância (intermediários p/ síntese de
compostos bioativos)
Síntese assimétrica/resolução: não disponível (exceto método Sharpless –
álcoois alílicos)
Epoxidação microbiológica: possível mas técnicamente difícil (eng. Processo)
Hidrólise química: mecanismo cat ácida e básica
Epóxido Hidrolases (EH): mais úteis que epoxidases; metabolismo de
alquenos e aromáticos
O
procariotas
eucariotas
di-oxigenase
mono-oxigenase
dioxetano
epóxido
redutase
EH
R
R
O
O
ROH
OH
R
OH
OH
R
Epóxidos como agentes alquilantes: tóxicos, cancerígenos, teratogênicos
Epóxido Hidrolases Hepáticas: CEH (citosólica); MEH (microsomal)
MEH
mais ativa e seletiva com epóxidos não-naturais
fígado de porco, coelho, rato, camundongo, etc.
Sobrenadante 9000 g de homogenato de fígado
AcO
OMe
O
Me
OH
OMe
O
Me
AcO
OMe
O
Me
+lipase
Aspergillus sp.
19
Mecanismo da reação
Asp
O O
Asp
O O
Asp
O O
O
OH
Tir
OH
N
N
H
His
O
HH OH
HO
N
N
H
HisH
O Tir
Influência pH?
Mutação: e.g. substituição Asp por Ser; consequências.
resolução cinética de epóxidos assimétricos
O
R
OH-
HO
R
OHretenção
O
ROH-
R
H
HO
inversão
H OH
O
HOH-
R
H
HO
inversão
R OH
Rac
20
Exemplo: esteroides (influência da EN)
R
X
MEH
tampão
R
HO
HX
X V reação O Rápida
NH, N-CH3 Lenta S Não ocorre
Ex.: hormônio juvenil (insetos)
OHO
OOH
OH
OH
OH
Helmintosporiumsativum +
Ex.: derracemização de óxido de estireno
O
O
O
O
CH2OH
OH
CH2OH
OH
CH2OH
OH
B.s
A.n.
A. niger
B. sulfurescens
+
+
(ret.)
(inv.)
A. niger +
B. sulfurescens
98 % e.e. 83 % e.e.
89 % e.e., 92 % rend.
96 % e.e. 51 % e.e.
21
3.1.4. Hidrólise de Nitrilas
R-CN; H-CN
Nitrilas naturais: reserva de N; defesa
N
N N
NH2 CN
ribose
CN
O
R1
R2 glucoseN
OMe
CN
O
toiocamicina(antibiot.)
glicosídeos cianogênicos(mandioca)
ricinina(mamona)
Hidrólise química: mecanismo
Caminhos possíveis p/ hidrólise enzimática
R C N R CO
OH+ NH3
R CO
NH2
nitrila hidratase amidase
nitrilase
RCO2H e NH3: alvos para triagem
Nitrilase: mecanismo
R C N R CNH
S Enz+ Enz-SH
H2O
R C
NH2
S Enz
OH
R CO
S Enz
H2O
R C
O
S Enz
OH
R CO
OH
NH3
+ Enz-SH
AA contendo –SH:
Exemplo:
ONH2
NN
CN
Rhodococcus rhodochrouso-: picolinamida (977 g/l)m-: nicotinamida (1465 g/l)p-: isonicotinamida (1099 g/(nitrila hidratase)
22
Importância da nicotinamida: NAD, etc.
P O
O
O
O
P
O
O
OOO
NN
HO
OHHO
OH
N
N
N
H2N
NH2
O
23
3.2. Reações de Redução
Reciclagem
Substrato Substrato-H2
Desidrogenase
NAD(P)H NAD(P)H
conceito
redução química: NaBH4; LiAlH4; produtos racêmicos
desidrogenases
co-fatores: NAD(H); NADP(H)
P O
O
O
O
P
O
O
OOO
NN
HO
OHHO
OH
N
N
N
H2NH
P O
O
O
O
P
O
O
OOO
NN
HO
OHHO
OH
N
N
N
H2N
H
NADH
NAD+
NH2
O
NH2
O
H
24
RN
H
C O
R
R
H A
H
H2N O
RN
C OH
R
R
A-
H
H2N O
H
reciclagem de co-fatores: química, eletroquímica, fotoquímica, enzimática
reciclagem enzimática
mesma enzima
Substrato Substrato-H2
Substratoauxiliar-H2
Substratoauxiliar
EnzimaNAD(P)H NAD(P)H
outra enzima
Substrato Substrato-H2
Substratoauxiliar-H2
Substratoauxiliar
Enzima 2
NAD(P)H NAD(P)H
Enzima 1
exemplos
25
NAD(P)+ NAD(P)H
Desidrogenasede formato
HCO2- CO2
NAD(P)+ NAD(P)H
GlucosedesidrogenaseO
HOHO
OH
OH
OHO
HOHO
OH
OH
O
CO2H
OHHO
HO
OH
OH
ácidoglucônico
enzimas isoladas X células inteiras
3.2.1. Redução de Aldeídos e Cetonas (Enzimas Isoladas) desidrogenase álcool de levedura (YADH)
desidrogenase álcool de fígado de cavalo (HLADH)
Regra de Prelog
O
P G
OH
P G
[H-]
NAD(P)H NAD(P)
desidrogenase
YADH: muito específica; aldeídos ou metilcetonas; prep álcoois quirais
secundários
HLADH (fígado de cavalo):
baixa especificidade
estrutura conhecida; R-X; dímero
red. De cetonas cíclicas (4-9C)
Ex.:
26
TBADH (Thermoanaerobium brockii)
Termoestável ( 85 oC)
Tolera solventes orgânicos
Ex.:
R1 R2
O
R1 R2
OH
R1 R2
OHTBADH
rec. NADPHou
HSDH (Hidroxiesteroid)
Substrato natural: esteróides
Ex.:
OR1
R2 HOR1
R2
OOH
OR1
R2
+
rec. NAD(P)H
R1=R2=H
TBADH ou HSDH
HSDH
R1,R2=Me, Cl+
R1 R2 Enzima e.e. álcool (%)
H H HSDH < 10 H H TBADH > 95 H Cl HSDH > 90 Cl Cl HSDH > 95 Me Cl HSDH > 98 Me Me HSDH > 95
O
O
H
H
136 O
O
H
H
136 + O
HO
H
H
136HLADH
recicl.NHADH
27
3.2.2. Redução de Aldeído e Cetonas com Células Vantagens: co-fator
Desvantagens: baixa produtividade (transporte, rec produto, instabilidade
genética do microorganismo)
Saccharomyces cerevisae
O mais usado; facilidade de manuseio
Primeira revisão: 1949!
Cetonas alifáticas e aromáticas simples: Prelog
Cadeias longas ou volumosas: não aceita
Comportamento divergente: diferentes DHs com preferências
estereoquímicas opostas.
Ex.:
Outros microorganismos redutores de cetonas
Geotrichum candidum
Sporotrichum exile
Mucor ambiguus
3.2.3. Redução de C=C por Células
Hidrogenação química
Enoato redutases: Clostridia, Proteus, S. cerevisae, Beauveria sulfurescens
Adição trans de H
Ativação: facilitar ataque de H-
Ativadores: ácidos, ésteres, lactonas, cetonas, aldeídos α,β- insaturados
Ex.:
R1 OR2
O O
R1 OR2
OH OS. cerevisae
R1 OR2
OH Oou
28
RCO2H
Cl
R
Cl
CO2H enoato redutaseS. cerevisae
Cl
CO2H
R
enoato redutaseS. cerevisae
RCO2H
Cl
R
Cl
O
R
Cl
O
S. cerevisaerápida
S. cerevisaelenta
R
Cl
OH
R
Cl
OH
+
major.
29
3.3. Reações de Oxidação
Importância
Problemas de métodos químicos: metais, inespecificidade (régio, estéreo)
3.3.1. Oxidação de Álcoois
Métodos químicos: exemplos
Métodos enzimáticos: pouco usados
Termodinâmicamente desfavorável, recicl cofator dificultada
Inibição pelo produto (- polar)
pH ótimo 8-9: co-fator e produtos instáveis
oxid álcool secundário: destruição de quiralidade
Oxidação regiosseletiva de polióis
Carboidratos
Ex.:
O O
OHOH
HO
OH
CH2OH
C
C
C
C
CH2OH
O
HHO
OHH
HHO
Acetobactersuboxidans
CH2OH
C
C
C
C
CH2OH
OHH
HHO
OHH
OHH
CHO
C
C
C
C
CH2OH
OHH
HHO
OHH
OHH
Sorbitol Sorbose Ácido L-ascórbicoGlicose
HO O
CO
C
C
C
C
CH2OH
HO
H
HHO
30
Assimetrização de dióis proquirais ou meso
OH
OHR
R
OHR
RH
O
HLADHrecicl NAD+
O
R
ROH
O
R
RO
HLADHrecicl NAD+
exp.
meso
HLADHrecicl NAD+
HLADHrecicl NAD+
exp.
R
OH
OH
R
OH
O
H
OR
OH
OR
O
31
3.3.2. Reações de Oxigenação
Oxidação química de HC: ativados (ex. oxid alílica por SeO2) e não-ativados
(difícil, não-específica)
Importância
Oxigenases
Mono-oxigenases
Sub + DoadorH2 + O2 SubO + Doador + H2O
rec. co-fator
Dioxigenases
Sub + O2 SubO2
Oxidases
O2 + 2e- O22- H2O2
+ 2H+
2H2O2O22-O2 + 4e- + 4H+
32
Mono-oxigenases
Maioria ligada a membrana
Ativação do O2: comum a todas
Tipos de substratos/produtos
Sub + O2 + H+ + NAD(P)H SubO + H2O + NAD(P)+mono-oxigenase
C H C OH
R R
O
Rn-X Rn-X=O X= N, S, Se, P
H OH
R1 R2
O
R1 O
O
R2
Citocromo P-450: grupo + comum de MO; hemeproteina; detoxificação;
mesma seq 26 aa prox heme
Ciclo catalítico: ~ oxid química com metais
N
N
N
N
CO2H
HO2C
Fe
Citocromo P-450: mecanismo
33
Fe3+
S
ON
N
N
N
H He-
O2
Fe3+
S
N
N
N
N
OO
Sub
e-
Sub
Fe3+
S
N
N
N
N
OO
H2O 2H+
Fe4+
S
N
N
N
N
OSub
Sub
Fe5+
S
N
N
N
N
O
H2O
SubO
Sub H2O Sub
Fe2+
S
N
N
N
NFe3+
S
N
N
N
N
Sub
1. Acoplamento do substrato ao sítio ativo
2. Red Fe3+ > Fe2+ (e- de NADP[H] ou outro co-fator (Fe2+ mais reativo)
3. Ligação de O2
4. Recep e- > enfraquecimento de ligação O-O
5. Saída de O na forma de água: formação de nucleófilo forte
6. Ataque do O ao Sub; subst Sub oxidado pela H2O
34
MO dependente de flavina:
Co-fator: flavina
NNH
O
N
OH
N O
PO
OHO
PO
O
HO
O
HO OH
N
N
NN
NH2
HO
O
OH
Flavina adenina dinucleotídeo(FAD)
NNH
O
N
R
N O
NNH
O
N
R
N O
2H+, 2e-
H
H
35
Substratos: aldeídos, cetonas; produtos: ésteres
Ciclo catalítico de MO: ~ oxid química com peróxidos/perácidos
HO O
R
R1 OR2
O
R1 R2
OHO OR
R1 R2
O
Bayer-Williger
O2
Sub
N
NNH
N O
O
NADPH NADP+
(Enz-FAD)
N
NNH
N O
O
H
H
(Enz-FADH2-Sub)
N
NNH
N O
OH O
HO(Enz-FAD-4a-OOH-Sub)
N
NNH
N O
OH OH
(Enz-FAD-4a-OH-SubO)
SubO + H2O
N
NNH
N O
OH O
O
O
N
NNH
N O
OH O
O
O
O
O
36
Hidroxilação de Alcanos
Funcionaliz em pos não-ativadas: poucas alternativas em Q.O.
Reativ relativa: 2o>3o>1o.
Hidroxil esteróides
F. verticilloides
CH2OH
Limoneno Álcool Perílico
R.arrhizus
CO2H
O
CO2H
O
OH
O
CO2H
OH
O
CO2HOHO
CO2H
F. verticilloides+
P. chrysogenum
CO2H
OCH2OH
CO2H
O
37
Hidroxilação de Comp Aromáticos
Hidrox regioespecífica difícil por via química
Monooxigenases: hidrox em o- e p-; via epóxido
Polifenoloxidases (tirosinase): fenol -> catecol -> o-quinona ->
polimerização
R
OH
R
OH
OH
O2 H2O
polifenoloxidase
O2 H2O
polifenoloxidase
R
O
O
Mecanismo
38
Ex.: L-dopa (3,4-diidroxifenilalanina); L-epinefrina (adrenalina)
HO
HO
OH
NHCH3
adrenalina
HO
HO
COOH
NH2H
L-3,4-diidroxifenilalanina(L-DOPA)
CO2H
HONH2
CO2H
ONH2
O
Melaninas
TirosinaseCO2H
HONH2
HO
Tirosina DOPA Dopaquinona
HONH2
HO
Dopamina
[O]
Uso de microorganismos; Ex.
N
CO2H
O N
OH Cunninghamellaechinulata
Pseudomonas sp
N
CO2H
HO
O N
OH
HO
ácido 6-hidroxinicotínico
prenalterol (>85%)
(100 %)
Epoxidação de alcenos
Epóxidos quirais: intermediários sintéticos de alto valor
Métodos químicos
Epóxidos pequenos e não-funcionalizados: obtenção difícil por via química
Monooxigenases: não usadas em escala preparativa; co-fator; natureza
complexa
Células: uso de meio bifásicos; minimização efeito tóxico do produto
39
Ex.: R1 H
R2
R1
R2
OmicroorganismoO2
Pseudomonas oleovoransCorynebacterium equiMycobacterium spXanthobacter spNocardia sp
Reações de Baeyer-Villiger
Método químico: éster ou lactona
MO dependente de flavina
Uso de células
Acinetobacter sp, Pseudomonas sp (algumas patogênicas)
Risco de hidrólise do produto: inibidores (p-nitrofenilfosfato de etila =
paraoxon); mutantes não-hidrolíticas
Ex.:
O
R
O
RO
O
R
Acinetobacter sp+
Diidroxilação de aromáticos
Importância ecológica
Obtenção de glicóis quirais
Pseudomonas sp
R
O
O
R
di-oxigenase
O2
R
OH
OH
redutaseH2
R
OH
OH
diidrodioldesidrogenase
NAD(P)H NAD(P)+
40
3.4. Formação de Ligações C-C
reações do tipo aldólicas: mecanismo
síntese de imina: mecanismo
R1 R2
NH
R1 R2
O
NH3
C
OH
NH2
R2R1
aldolases
substratos: carboidratos, aa, hidroxiácidos
adição 1, 2 ou 3C
2 grupos
Aldolase tipo I
Plantas superiores e animais
Co-fator: não requer
Mecanismo
H2O
-Enz-NH2
H
OR1
R
N
R1
X
OHEnz
R
O
R1
X
OH
RX
NEnz
H
Enz-B
Enz-NH2
-H2O RX
NEnz
H HX=H, OH, NH2
RX
O
baseSchiff
enamina
CH3CHO CH3CHCH2CHO
OHOH-, H2O
5o, 4-5 haldol
41
Aldolase tipo II
Bactérias e fungos
Dependente de Zn2+
Mecanismo
Receptor:
Doador: R
O
X
HR1
OR
O-
X
H R1
O
NN
Enz
HZn+2
R1
OH
R
X
O
Obs.: remoção inicial de H+ do doador por uma histidina
Exemplo: análogos nitrogenados de açúcar (anti-HIV)
PO OH
O
+ H
O
N3
OHaldolaseFDP
PO
O
N3
OH
OH
OH
PO
O
N3
OH
OH
OH
+
1) fosfatase2) H2/Pd
1) fosfatase2) H2/Pd
NH
OHOH
OH
HO
NHOH
OH
OH
HO
deoxinojirimicina deoximanojirimicina
42
3.5. Adição e Eliminação
Liases:
adição de H2O ou NH3 a alquenos;
adição de HCN a C=O
3.5.1. Formação de Cianidrina
Cianidrinas: estrutura; síntese química: aldeído/cetona + HCN
Importantes intermediários em química orgânica
R CN
OHvários produtos
síntese enzimática: oxinitrilases
Ex.: (prioridade R’ > R”)
R' R"
O R' R"
CNHO
R' R"
OHNC
HCN
R-oxinitrilase
S-oxinitrilase
fontes:
(R)-oxinitrilases: família Rosaceae (amêndoa, ameixa, pêssego)
(S)-oxinitrilases: Sorghum bicolor (sorgo), Hevea brasiliensis (seringueira),
Ximenia americana (sândalo), Manihot esculenta (mandioca).
Problemas: uso de HCN → transcianação (acetona cianidrina)
43
3.5.2. Adição de Água e Amônia
Fumarase: ad água a C=C
C CX
HOOC
COOH
HC C
X
HOOC
COOH
OH
HH
X= H (ac. fumárico), Cl X= H (ac. málico)
fumaraseH2O
Influência da e.n. de X.
3-metilaspartase: ad amônia a C=C
C CX
HOOC
COOH
HC C
X
HOOC
COOH
NH2
HH
X= H, Cl, Me, etc.
NH3
3-metilaspartase
3.5.3. Reações tipo aciloína
Química: mecanismo
Biocatalítica: síntese da efedrina
Ph H
O
H3C CO2H
O
Ph
OH
O+
S. cerevisae(descarboxilase
de piruvato)
CO2
aciloina
Ph
OH
NHCH3
(-)-efedrina
MeNH2
H2/Pt
3.6. Transglicosilação oligossacarídeos e polissacarídeos: migração intracelular e excreção de
glicoproteinas; interações célula-célula; oncogênese; interação da superfície
celular com patógenos
síntese química de carboidratos difícil
44
biocatálise atraente: glicosil transferases; glicosidases
3.6.1. Glicosiltransferases
requer açúcar ativado (UDP-açúcar)
3.6.2. Glicosidases
independem de co-fatores
endo e exo-glicosidases
hidrólise reversa
transglicosilação
usos: celulose > glicose > etanol
45
Exemplo glicosilação de dióis:
Exemplo hidrólise do esteviosídeo:
OGG
CO2G
OH
CO2H
esteviosídeo esteviol
pectinase
Exemplo glicosilação do esteviosídeo (veja artigo J.Biotechnology, 2006):
+
esteviosídeo
OGG
CO2G
OGG
CO2G
G
rebaudiosídeo
glicosidases deFusarium sp maior proporção
de rebaudiosídeo
46
Mecanismo lizozima (Nature Structural Biology 8, 737 - 739 (2001)
doi:10.1038/nsb0901-737): NAG= N-acetilglicosamina.
47
3.7. Halogenação e Desalogenação
Introdução
Cerca de 1000 PN halogenados
Importância: diazepam, mitotano
CH
CHCl2Cl
Cl
mitotano
N
NO
CH3
Cl
diazepam Derivados de Cl (terrestres) e Br (marinhos) mais comuns
Algas marinhas: lib 107 ton bromoalcanos
Toxicidade de haloalcanos
Halogenação
Química
Haloperoxidases: único tipo isolado
Cloroperoxidase de Caldariomyces fumago; bromoperoxidase de
Pseudomonas aureofaciens; iodoperoxidase de raiz forte (Armoracia
lapathifolia)
Substrato + H2O2 + X- + H+ Produtos halogenados + 2H2O
1. Halogenação de Alquenos
X+
haloperoxidase
HOX ou X2
OH
X
Y
X
OH-
Y-
O-
OOO
Xn
48
I
OHOH
I
cloroperoxidase
I-, H2O2
+
9 : 1
Halogenação de alcinos
CHCl2
OCl
O
Cl+
1 : 2 : 0,3
CH3 C CHcloroperoxidase
Cl -, H2O2Cl
O+
Halogenação de Compostos Aromáticos
NH2
Cl
NH2
Cl
BrcloroperoxidaseBr -, H2O2
Halogenação de Grupos C-H
cloroperoxidaseCl -, H2O2
OO OO
Cl
Desalogenação
Importância ambiental: biodegradação (pesticidas, solventes, etc.)
Método químico
Halohidrina Epoxidases
Fontes: bactérias (Flavobacteria, Corynebacteria, Pseudomonas),
fungos (Caldariomyces fumago), algas (Laurencia pacifica)
XHO
haloidrina epoxidase
O+ HX
2. Desalogenases: Sn X → OH (indep de co-fator); influência da
natureza de RX (1o., 2o. 3o.)
49
O O-
Asp
C XR
H
H
O O-O O
CH2R
OHH
N
N
H
His
N
N
HN
N
H
H
RCH2OH
Asp Asp
3. Ex.: (S)-2-cloropropiônico (síntese de anti-inflamatórios e herbicidas)
CO2H
Cl
CO2H
OH
CO2H
Cldesalogenase
(P. putida)+
e.e. > 98%
50
4. Técnicas Especiais
4.1. Imobilização aderência da enzima a um suporte sólido ou confinamento
reutilização da enzima
técnicas
adsorção (van der Waals, iônica, lig. H)
ligação covalente
ligação cruzada
confinamento em géis
confinamento em membranas
51
4.2. Enzimas modificadas e artificiais
Enzima-PEG
solúveis em solventes orgânicos
redução de imunogenicidade e eliminação
“bio-imprinting”
anticorpos catalíticos
O
O
Ph
OHR
OH+
-O OPh
RO
O
R
OP
O OPh
R
+ PhOH
52
enzimas artificiais (Nature Chemistry | vol 8 | september 2016, DOI: 10.1038/NCHEM.2555)
Glu
O O
N
NHis
H
SH
Cys
C OR2
O
R1
R2OH
Cys
CS O
R1
OH
HN
NHis
Glu
O OH
H
5. Outras Aplicações
5.1. Metabolismo de drogas Importância
Exs.: paracetamol
N
OHO
H
N
OHO
H
AGlc
N
OHO
OH
N
OO
H
SO O
HO
N
OO
N
OHO
H
GSH GHS: glutationa; AGlc ácido glicurônico
5.2. Bioativação
Importância
53
Exs.: (1-metil-4-fenil-1,2,3,6-tetraidropiridina (MPTP), MPP+ e doença
Parkinson
N
CH3
N
CH3
N
CH3
MPTP MPDP MPP+
5.3. Modelos microbianos de metabolismo de mamíferos Ex.: Trimegestone (Hoechst)
O
OHCH3
O
CH3
H
H
O
OHCH3
O
CH3
H
H
HO
O
OHCH3
O
CH3
H
H
HO
O
OHCH3
O
CH3
H
H
OH
5.4. Derivados ativos de drogas
54
Ex.: antifúngicos (Merck)
O
OO
OCH3
OH
OH21
O
OO
OH
OH21
Galbanolídeo A Galbanolídeo B
Potentes antifúngicos (Merck)
Streptomyces halstedii21-OH
55
Bibliografia
K. FABER. Biotransformations in Organic Chemistry - A Textbook, 5th ed. Springer, New York, 2004. (Terceira edição disponível na Biblioteca de
Tecnologia e na de Biológicas, 660.634 B617).
A. Liese, K. Seelbach, C. Wandrey. Industrial Biotransformation, Wiley, Weihheim, 2000. (660.63 L721i). (Disponível na Biblioteca de Tecnologia).
A.L. DEMAIN and J.E. DAVIES. Manual of Industrial Microbiology and
Biotechnology, 2nd Edition, American Society for Microbiology,
Washington,1999. (660.62 M294i)
P. PRAVE, U. FAUST, W. SITTING, D.A. SUKATSCH. Fundamentals of
Biotechnology, Editora VCH, Federal Republic of Germany, 1987.
Q. H.G. Davies, R.H. Green, D.R. Kelly, S.M. Roberts. Biotransformations in
Preparative Organic Chemistry, Academic Press, New York, 1989. (547.2
B615).
R. H.-J. Rehm, G. Reed and A. Puhler (Ed.). Biotechnology, 2nd ed. Weinheim :
VCH, 1993- Biotransformations, Vol 8a, 8b (660.6 B616).