biotechnologijos ir genetikos pasiekimai · 2013. 10. 21. · epigenetika, genomo abėcėlės...
TRANSCRIPT
Epigenetika, genomo abėcėlės diakritiniai ženklai
Saulius Klimašauskas
Vilniaus universiteto Biotechnologijos institutas
2013 m. spalio 11 d. Lietuvos mokslų akademija
BIOTECHNOLOGIJOS IR GENETIKOS PASIEKIMAI
Epigenetika
Epigenetika – (επί graik. virš) mokslas apie genų veiklos pokyčius
vykstančius be pasikeitimų pirminėje DNR sekoje.
DNR metilinimas Citozino bazių metilinimas (Me arba -CH3 grupės prijungimas) Paprastai lemia genų slopinimą
Histonų modifikacijos Histonų “uodegose” prijungtų cheminių grupių kombinacijos Lemia įvairius genų veiklos pakitimus
Chromosoma
Histonai
Histonų uodegos
Chromatinas
Nukleosoma
Nukleosomos struktūra
Kertiniai epigenetinio kodo elementai
Histonų uodegos
Histonai
DNR
DNR
Histonų kodas
Histonų kodas – histonų uodegos gali turėti skirtingus cheminių modifikacijų rinkinius
Modifikacijos įtakoja viena kitą ir vaidina svarbų vaidmenį su chromatinu susijusių procesų reguliacijoje.
5
vykdo fermentai metiltransferazės (MTases)
NNNNNXXXXXNNNNN
O
S
HO OH
N
N
N
NH2
N
CO2HH2N
H3C
NNNNNXXXXXNNNNN
CH3
AdoMet
MTase
Biopolymer
Sequence-specific methylatedbiopolymer
O
S
HO OH
N
N
N
NH2
N
CO2HH2N
AdoHcy
Taikiniai:
DNR
nukleobazės
RNR (tRNA, rRNA)
nukleobazės, ribozė
Baltymai (histonai)
Arg, Lys, His, Asp
Glikanai, lipidai ir kt.
SAM
Biopolimeras
Tikslingai metilintas biopolimeras
Biologinis metilinimas
S-Adenozil-L-metioninas
Biologinis DNR metilinimas
5-metilcitozinas (m5C)
Hotchkiss, 1948
N4-metilcitozinas (m4C)
Janulaitis ir kt., 1983
N6-metiladeninas (m6A)
Dunn ir Smith, 1956
5-metilcitozinas (m5C)
Hotchkiss, 1948
N4-metilcitozinas (m4C)
Janulaitis ir kt., 1983
N6-metiladeninas (m6A)
Dunn ir Smith, 1956
Biologinis metilinimas mikroorganizmų DNR
8
Klimašauskas, S., Kumar, S., Roberts, R. J. & Cheng, X. (1994) Cell, 76, 357-369.
DNR bazės išsukimas metiltransferazės reakcijos eigoje
Biologinis DNR metilinimas žinduolių ląstelėse
5’-CG-3’
3’-GC-5’
5’-CG-3’
3’-GC-5’
5’-CG-3’
3’-GC-5’
nemetilinta DNR
CH3
3
de novo metilinimas
DNR replikacija
Palaikantysis metilinimas
metilinta DNR hemetilinta DNR CH3
CH3
Citozino-5 metilinimas (m5C)
Paprastai randamas CG dinukleotiduose
(~70% CG sekų metilintos žmogaus DNR)
Biologinis DNR metilinimas žinduolių ląstelėse
5’-CG-3’
3’-GC-5’
CH3
CH3
Citozino-5 metilinimas (m5C)
dažniausiai slopina genų raišką
Biologinis DNR metilinimas žinduolių ląstelėse
5’-CG-3’
3’-GC-5’
CH3
CH3
Genominiai m5C profiliai
• skirtingi skirtinguose audiniuose, ląstelėse,
organizmuose
•kinta ląstelių diferenciacijos, organizmo vystymosi
eigoje, veikiant aplinkos faktoriams
•dideli pokyčiai stebimi daugelio lėtinių neinfekcinių
ligų atveju (vėžys, diabetas, psichiniai sutrikimai)
Epigenomo tyrimai svarbūs ligų diagnostikos,
prognozės ir terapijos požiūriu
5’-CG-3’
3’-GC-5’
Epigenetinė vėžio terapija
• DNR metiltransferazių inhibitoriai
5-azacitidinas
decitabinas (5-aza-2’-dezoksicitidinas)
•Histonų deacetilazės inhibitoriai
Metodai DNR metilinimo tyrimams
5-metilcitozino analizės principai:
Selektyvus cheminis nemodifikuoto citozino modifikavimas į uracilą
DNR kirpimas metilinimui jautriomis restrikcijos endonukleazėmis;
metilintos DNR praturtinimas 5mC-surišančių baltymų (pvz. antikūnių) pagalba
DNR metilinimo analizė bisulfitiniu metodu
m
3'
A-
C-
G-
C-
G-
T-
T-
5'
5'
T
G
C
G
C
A
A
3'
m
metilinta DNR
modifikacija
natrio bisulfitu
3'
A
G +
G
T
T
5'
5'
T
G
G
A
A
3'
U
U
C
Cm
AT
3’A
G
GTT5’
C->T
C(=5mC)
Paveikus bisulfitu, citozinas yra konvertuojamas į uracilą C U 5-metilcitozinas yra nejautrus šio reagento poveikiui 5mC 5mC
sekoskaita
Nauja DNR modifikacija žinduolių ląstelėse 5-hidroksimetilcitozinas
• 5-hidroksimetilcitozinas (hmC) seniai žinomas bakteriofagų DNR.
• 2009 m. hmC rastas smegenyse (40 % nuo bendro 5mC kiekio) ir embrioninėse kamieninėse ląstelėse. Kriaučionis ir Heintz Science (2009)
Tahiliani ir kt. Science (2009)
Mokslo premijos užsienio lietuviams 2012 m.
Nauja DNR modifikacija žinduolių ląstelėse 5-hidroksimetilcitozinas
hmC susidaro TET (ten-eleven translocation) hidroksilazėm modifikuojant 5mC (antrinė epigenetinė modifikacija)
Naujos DNR modifikacijos žinduolių ląstelėse 5-hidroksimetilcitozinas, 5-formilcitozinas ir 5-karboksilcitozinas.
TET hidroksilazės modifikuoja hmC į 5-formilcitoziną (fC) ir 5-karboksilcitoziną (caC).
DNR metilinimas DNR demetilinimas oksidacinio hidroksilinimo būdu
Naujos DNR modifikacijos žinduolių ląstelėse
Biologinis 5-hidroksimetilcitozino vaidmuo: DNR demetilinimo tarpinis produktas, ar atskiras epigenetinis elementas? Dideli hmC kiekiai smegenyse netiesiogiai rodo, kad jis gali dalyvauti atminties mechanizmuose
19
Metiltransferazės – molekuliniai įrankiai tikslingai biopolimerų modifikacijai
NNNNNXXXXXNNNNN
O
S
HO OH
N
N
N
NH2
N
CO2HH2N
H3C
NNNNNXXXXXNNNNN
CH3
AdoMet
O
S
HO OH
N
N
N
NH2
N
CO2HH2N
AdoMetanalogue
NNNNNXXXXXNNNNN
MTase MTase
Biopolymer
Sequence-specific methylatedbiopolymer
Sequence-specific labelledbiopolymer
Klimašauskas & Weinhold, Trends Biotechnol (2007)
Biopolimeras
Tikslingai metilintas biopolimeras
Tikslingai žymėtas biopolimeras
mtase-directed Transfer of Activated Groups (mTAG)
20
Dviejų žingsnių sekai-specifinis DNR žymėjimas ląstelių lizate
G. Lukinavičius ir kt ACS Chem. Biol. (2013)
21
Individualių DNR molekulių genotipavimas: DNR “fluorokodas”
Bakteriofagas lambda 48502 bp = 215 GCGC taikinių
0.025 mm
1. Dviejų-žingsnių DNR žymėjimas GCGC
sekose fluoroforu
2. Fluoroforų pozicionavimas pavienėse DNR
molekulėse
1 ir 2. Eksperimentiniai fluorokodai sudaryti iš
20 individualių DNR molekulių.
3. Teoriškai apskaičiuotas fluorokodas
R. Neely ir kt., Chemical Science (2010) su Leuveno universitetu, Belgija
1
2
3
Epigenetinių profilių tyrimai žinduolių DNR: Kovalentinis nemetilintų CG sekų surišimas ir praturtinimas
E. Kriukienė et al., Nat. Commun. (2013)
Analizuojamas fragmentas
Nemetilintas fragmentas
Pašalinamas fragmentas
Metilintas fragmentas
Biotiną
surišančios
dalelės
mTAG žymėjimas
biotinu
*
Dr. Artūras Petronis
Psichinės sveikatos ir priklausomybių centras
Toronto, Kanada
Epigenetinių profilių tyrimai žinduolių DNR: Kovalentinis nemetilintų CG sekų surišimas ir praturtinimas
E. Kriukienė et al., Nat. Commun. (2013) licenzijuojama kompanijai ThermoFisher Scientific
Analizuojamas fragmentas
Nemetilintas fragmentas
Pašalinamas fragmentas
Metilintas fragmentas
Biotiną
surišančios
dalelės
05
10
15
Brain mTAG ignal s (Unmethylome)
Ave
rag
e s
ign
al
Promoter 5’ UTR Exons Introns 3’ UTR
*
0.0
0.2
0.4
0.6
H1 MethylC- eq ignal s s (Methylome)
Ave
rag
e s
ign
al
Promoter 5’ UTR Exons Introns 3’ UTR
Nemetilinti rajonai
Metilinti rajonai
mTAG žymėjimas
biotinu
Nauja DNR citozino-5 metiltransferazių katalizuojama reakcija: 5-hidroksimetilcitozino modifikacija tioliais
24 Z. Liutkevičiūtė ir kt., Angewandte Chemie (2011).
Z. Liutkevičiūtė ir kt., Nature Chemical Biology (2009)
Geriausių disertacijų apdovanojimai 2013 m.
Technnologija 5-hidroksimetilcitozino profilių tyrimui žinduolių DNR
25 Z. Liutkevičiūtė ir kt., Angewandte Chemie (2011).
hmTAG
Z. Liutkevičiūtė ir kt., Nature Chemical Biology (2009) licenzijuojama kompanijai ThermoFisher Scientific
Epigenetika
Epigenetiniai faktoriai išplečia genomo koduojamos informacijos kiekį
reguliuoja genų aktyvumą
skirtingi skirtinguose audiniuose, ląstelėse, organizmuose
kinta ląstelių diferenciacijos, organizmo vystymosi eigoje, veikiant aplinkos faktoriam
epigenetinių signalų profilis yra iš dalies paveldimas (perduodamas tarp somatinių ląstelių ir organizmo generacijų)
dideli pokyčiai stebimi daugelio lėtinių neinfekcinių ligų atveju (vėžys, diabetas, psichiniai sutrikimai)
Žmogaus epigenomo tyrimai svarbūs ligų diagnostikai, prognozei ir terapijai
I share 99.9%
of DNA as
Einstein
…but only 0.1% of my epigenetics…