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Bioquímica – L. Stryer, J.M. Berg y J.L. Tymoczko.
Quinta Edición, Editorial Reverté, S.A., Barcelona,
2003.
Página web del IIB: http://www.iib.unsam.edu.ar
Usuario: iib Contraseña: unsam
Clases teóricas: Lunes de 17 a 19 hs. y Martes de 15 a 17
hs., Aula 14, Corona del Tornavías, o en el Auditorio del IIB.
Ejercicios y Problemas: Martes de 17 a 21. 30 hs, Aula 14.
Trabajos Prácticos: Martes de 17 a 21. 30 hs, Salones de
TPs del IIB.
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En esta asignatura les daremos un panorama general de cómo
se llevan a cabo los procesos químicos que transcurren en una célula
viva. Veremos las enzimas, catalizadores biológicos que permiten que
muchas reacciones químicas se lleven a cabo al mismo tiempo, sin
producir productos secundarios. Estudiaremos los carbohidratos y el
metabolismo energético, comenzando por la glucólisis, siguiendo con el
ciclo de los ácidos tricarboxílicos y la cadena respiratoria. Veremos los
lípidos y su metabolismo, lo mismo que la síntesis y degradación de los
aminoácidos; la fotosíntesis y otros procesos biosintéticos, como la
síntesis y luego la degradación del glucógeno en los animales.
Finalmente, estudiaremos los ácidos nucleicos y su papel fundamental en
la conservación de la información genética y en la traducción de esa
información al nivel de las proteínas.
Dado que la inmensa mayoría de los procesos que ocurren en la
célula son ejecutados por las proteínas, empezaremos con el estudio de
estas moléculas, iniciándolo con las unidades que las forman, los
aminoácidos.
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LOS AMINOACIDOSUn aminoácido, como su nombre lo indica, es una molécula orgánica pequeña
que contiene un grupo amino y un grupo carboxilo. Todos los aminoácidos
presentes en las proteínas tienen ambos grupos unidos al mismo átomo de C y,
con una excepción, todos presentan isomería óptica y pertenecen a la serie L.
Son L-a-aminoácidos.
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Aminoácidos con cadenas laterales alifáticas
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Prolina
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Aminoácidos aromáticos
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Aminoácidos con oxhidrilos alcohólicos y la cisteína con -SH
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Aminoácidos básicos
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Aminoácidos ácidos y sus amidas en el carboxilo distal
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Formas ionicas de la L-
alanina.
Los aminoacidos se
encuentran realmente en
la forma de zwitterion
(Bjerrum, 1923)
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Formas iónicas y
curva de
titulación de la
glicina.
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Grupos
ionizables
de las
proteínas y
sus valores
de pKa
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LAS PROTEINAS:
ESTRUCTURA Y
PLEGAMIENTO
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ESTRUCTURA Y FUNCION DE LAS PROTEINAS.
Las proteínas son polímeros de aminoácidos unidos por uniones
amida, llamadas uniones peptídicas.
La cadena polipéptídica constituye la estructura primaria de la
proteína, dada por la secuencia de los residuos de aminoácidos.
Para ser funcional, una proteína globular requiere niveles
superiores de estructura, que la llevan a su forma
tridimensional, esencial para su función. Esos niveles
estructurales son las estructuras secundaria, terciaria y,
eventualmente, cuaternaria (si se trata de un oligómero con
subunidades iguales o diferentes).
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NIVELES ESTRUCTURALES EN LAS PROTEÍNAS.
1) Estructura primaria: Secuencia de aminoácidos.
Unión peptídica exclusivamente.
N-terminal C-terminal
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Angulos de rotacion del
carbono alfa.
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2) Estructura secundaria: Disposición espacial de
residuos de aminoácidos cercanos en la secuencia.
Unión hidrógeno involucrando el N y el O de las
uniones peptídicas exclusivamente. Tres
elementos principales de estructura secundaria:
a-hélice, estructura b (hoja plegada) y giros b.
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1 residuo: 1.5 Ǻ, rotación 100º. 3.6 residuos por vuelta de la hélice. Paso de la hélice: 1.5 x
3.6 = 5.4 Ǻ. La hélice forma un cilindro compacto, y los R se disponen hacia afuera.
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Las cadenas están extendidas, y la distancia entre residuos contiguos es de 3.5 Ǻ. Los grupos R
van hacia arriba y hacia abajo, alternativamente.
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Hojas b paralela y anti-paralela
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3) Estructuras supersecundarias: motivos y
dominios.
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ESTRUCTURA DE LA CITRATO SINTASA
Está formada por dos subunidades; cada una de ellas presenta dos
dominios: uno chico, en amarillo, y uno grande en azul. El sitio activo está
en una hendidura entre ambos dominios y queda junto a la interfase entre
las subunidades. Al unirse el oxaloacetato, el amarillo se desplaza y se
aproxima al azul de la otra subunidad. Este cambio conformacional permite
la unión de la acetil-CoA.
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4) Estructura terciaria: Disposición espacial de
residuos de aminoácidos lejanos en la secuencia.
Interacciones hidrofóbicas, fuerzas de Van der
Waals, puentes de hidrógeno entre restos laterales o
entre ellos y la cadena peptídica, uniones salinas,
puentes disulfuro.
5) Estructura cuaternaria: Disposición espacial de
las subunidades en proteínas oligoméricas.
Interacciones hidrofóbicas, uniones puente
hidrógeno y salinas.
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PUENTE DISULFURO: SOLO EN ESTRUCTURA TERCIARIA
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DISTRIBUCION DE LOS RESIDUOS DE AMINOACIDOS EN LA MIOGLOBINA.
Residuos hidrofobicos en amarillo, cargados en azul y el resto en blanco. (B): corte de la
molecula, mostrando que los residuos hidrofobicos se encuentran en buen parte en su interior
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MODIFICACION POST-TRADUCCIONAL DE PROTEINAS.
Muchas proteínas no están “terminadas” cuando se completa la traducción,
y requieren “madurar”, a través de modificaciones post-traduccionales.
Estas modificaciones pueden consistir en:
Modificación covalente de residuos de aminoácidos (más de 200).
Proteólisis parcial.
Las modificaciones pueden ser:
Reversibles o irreversibles.
Presentes en todas las moléculas o sólo en algunas.
Enzimáticas o no enzimáticas.
Co-traduccionales, post-traduccionales inmediatas, o post-traduccionales tardías.
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Modificacion post-traduccional de las proteinas.
Algunos ejemplos:
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PROTEINAS INTRINSECAMENTE DESORDENADAS
(PROTEINAS INTRINSECAMENTE NO ESTRUCTURADAS)
• Desde comienzos del Siglo XXI se han descripto numerosasproteínas que presentan una estructura flexible o un plegamientoazaroso en la mayor parte de su extensión.
• De acuerdo al concepto clásico, estas proteínas no seríanfuncionales; sin embargo, se ha demostrado que proteínas coneste tipo de plegamiento están involucradas en diferentes vías deseñalización, algunas son factores transcripcionales, receptores demembrana, o bien son proteínas abundantes en algunos tejidos dediferentes organismos.
• Los proyectos genoma de eucariotes permiten predecir quealrededor de un 30 % de las proteínas codificadas serían proteínasparcial o totalmente desordenadas.
• Es posible que la flexibilidad estructural no se dé o se dé muchomenos en el ambiente intracelular, comparado con lo que seobserva en solución acuosa.
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• A: Ribulosa 1,5-bisfosfato carboxilasa-oxigenasa de espinaca, proteínaglobular
• B: Factor de inicio de la traducción (eIF1A) humano, la mayor parte decuya estructura es desordenada.
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En general estas proteínas presentan una composición de
aminoácidos particular. Son proteínas de baja complejidad que
tienen una baja abundancia o carecen de aminoácidos
hidrofóbicos y/o voluminosos (Val, Ile, Met, Phe, Trp, Tyr), que
promueven el plegamiento espontáneo de las proteínas
globulares, y poseen una alta proporción de aminoácidos
cargados o polares (Gln, Ser, Pro, Glu, Lys, Arg) y en algunos
casos tienen una alta abundancia de aminoácidos pequeños (Gly,
Ala).
Se sabe que estas proteínas tienen la capacidad de fluctuar
entre diferentes estados conformacionales en una escala de nano
a micro-segundos. Esta alta flexibilidad por unidad de tiempo les
da la habilidad de interaccionar con distintas moléculas, o de
modos diferentes con la misma molécula. Por ejemplo, las
proteínas p21 y p27 actuando sobre quinasas dependientes de
ciclinas (CDKs), pueden actuar como activadoras o inhibidoras
de las mismas.
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PROTEINAS FIBROSAS
Las proteínas fibrosas se dividen en general en tres grupos, dependiendo
de la estructura secundaria de las moléculas individuales: las a-hélices
super-enrrolladas, la triple hélice del colágeno, y las hojas b en las fibras
amiloides y las sedas.
Las fibras en a-hélice de la lana son flexibles, pueden ser estiradas hasta
el doble de su longitud, y son elásticas, retornando a su longitud inicial
cuando se libera la tensión. Las fibras del colágeno son fuertes,
resistentes al alargamiento y relativamente rígidas. Las fibras con hojas b
son fuertes y muy flexibles. Las fibras de la seda de araña son mas
resistentes que un hilo de acero de las mismas dimensiones, pero son
muy flexibles.
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PROTEINAS FIBROSAS
Dos o mas a-helices pueden enrrollarse sobre si mismas para formar
“superhélices” muy estables de hasta 1000 Ǻ de longitud. Estas
estructuras se encuentran en proteínas fibrosas como la miosina y la
tropomiosina del músculo, la fibrina de los coágulos sanguíneos y la
keratina del pelo. La interacción entre las a-hélices se hace habitualmente
por interacciones hidrofóbicas, a menudo mediadas por Leu o Ileu.
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El colágeno es muy rico en prolina, hidroxiprolina y glicina. Uno de cada
tres residuos es Gly.
El colágeno es una molécula en forma de bastón, de hasta 3000 Ǻ de largo
y sólo 15 Ǻ de diámetro. Es la proteína mas abundante en los mamíferos,
siendo el componente fibroso principal de la piel, los huesos, los cartílagos
los tendones y los dientes. Está formado por una triple hélice, diferente de
la a-hélice (no se mantiene cada hebra por puentes de hidrógeno internos,
sino por la repulsión estérica de Pro y HyPro). Cada hebra de procolágeno
tiene dos “cabezas” globulares, una en cada extremo, necesaria para el
ensamblado de la fibra, que luego se elimina. Por eso al desnaturalizarlo,
no se renaturaliza, y forma gelatina.
EL COLAGENO
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LA TRIPLE
HELICE DEL
COLAGENOEn el interior de la triple
hélice no queda espacio
para un aminoácido de
mayor tamaño que la gly.
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PROTEINAS DE
MEMBRANA
A diferencia de las proteínas globulares solubles, que concentran
sus residuos hidrofóbicos en su interior, resguardándolos del
agua, las proteínas integrales de membrana tienen la mayoría de
sus residuos hidrofóbicos en su superficie, interaccionando con
los lípidos de la membrana.
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PROTEINAS DE MEMBRANA.
Proteínas integrales y Proteínas periféricas
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Prostaglandina H2 sintasa-1. Sintetiza la prostaglandina H2 a
partir de ácido araquidónico proveniente de lípidos de la
membrana, en dos etapas.
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La aspirina inhibe la síntesis de la prostaglandina H2, acetilando
la Ser 530, lo que bloquea el conducto hidrofóbico e inhibe la
actividad de ciclooxigenasa.
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PLEGAMIENTO DE LAS
PROTEINAS.
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LA RIBONUCLEASA: EL EXPERIMENTO DE ANFINSEN.
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REDUCCION DE LOS PUENTES DISULFURO
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La urea desnaturaliza a la ribonucleasa (es decir, deja solo su
estructura primaria) y el b-mercaptoetanol reduce los puentes
disulfuro.
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Si se elimina la urea y luego se deja
que los puentes disulfuro vuelvan a
formarse por oxidacion con el aire,
se recupera la estructura nativa. Si
se oxida en presencia de urea, se
obtiene una “ribonucleasa
revuelta”, inactiva, pero esta
recupera su actividad en presencia
de trazas de b-mercapto-etanol.
Hay 105 modos diferentes de
aparear 8 Cys para formar 4
puentes disulfuro, y sólo 1 es el
correcto.
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LA PARADOJA DE LEVINTHAL.
Para una proteína pequeña, de 100 residuos de
amino ácidos:
Si cada residuo puede asumir 3 posiciones, el
número total de estructuras posibles será igual a 3100,
lo que es igual a 5 x 1047
Si toma 10-13 seg para convertir una estructura
en otra el tiempo total requerido para el plegamiento
correcto será
5 x 1047 x 10-13 seg = 5 x 1034 seg = 1.6 x 1027
años.
(Paradoja de Levinthal)
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El plegamiento puede
pasar a traves de un
intermediario que ya
tiene practicamente
completa la estructura
secundaria (el globulo
fundido). Puede tener un
camino unico o tener
caminos alternativos.
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AGENTES DESNATURALIZANTES.
1) Extremos de pH. Muchas proteínas se desnaturalizan a valores de
pH < 5 o > 10. Esto puede deberse a la ionización de grupos en el
interior de la proteína (His a pH ácido, Tyr a pH alcalino); a repulsión
electrostática entre grupos de la superficie de la proteína; a la
destrucción de puentes salinos importantes en la estabilización de la
estructura nativa.
2) Agentes desnaturalizantes. Los más usados son la urea y el
clorhidrato de guanidina:
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DESNATURALIZACION DE UNA PROTEINA.
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PLEGAMIENTO DE LAS PROTEÍNAS IN VITRO E IN VIVO.
In vitro: Plegamiento espontáneo, a muy bajas concentraciones de proteína para evitar
agregados. Buffer redox (GSH/GSSG) para inducir la formación correcta de puentes
disulfuro.
In vivo: Plegamiento a altas concentraciones proteicas, asistido por otras proteínas.
1) Puentes disulfuro: proteína disulfuro isomerasa. Contiene secuencias –Cys-
Gly-His-Cys- y acelera unas 6000 veces el intercambio de puentes disulfuro.
2) Uniones peptídicas X-Pro: Peptidil prolil isomerasa. En vez de ser todas
uniones en trans, como para los demás aminoácidos, un 6 % de las con Pro es cis. La
PPI acelera 300 veces la isomerización cis-trans.
3)Prevención de la formación de agregados moleculares: chaperonas
moleculares. Se unen reversiblemente a zonas desplegadas del polipéptido naciente,
evitan su agregación y facilitan su plegamiento correcto, con consumo de ATP.
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PURIFICACION DE LAS
PROTEINAS.
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METODOS GENERALES DE PURIFICACION DE PROTEINAS.
1)Ruptura del material y obtención de un extracto libre de células.
2)Precipitación (sales, pH, alta temperatura, solventes orgánicos).
3)Diálisis o ultrafiltración. Concentración.
4)Fraccionamiento cromatográfico.
Principio de separación Tipo de cromatografía
Forma y tamaño Filtración por gel
Carga neta Cromatografía de intercambio iónico.
Punto isoeléctrico Cromatoenfocado
Hidrofobicidad Cromatografía de interacción
hidrofóbica
Cromatografía en fase reversa
Función biológica Cromatografía de afinidad
Antigenicidad Inmunoadsorción
Contenido en carbohidrato Cromatografía con lectinas
inmobilizadas
Grupos sulfhidrilos libres Cromatografía covalente
Capacidad de ligar metales Cromatografía de quelatos metálicos
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Eliminación de moléculas chicas por diálisis.
Se requiere, en general, después de una precipitación con sulfato de amonio.
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FILTRACION POR GEL
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CROMATOGRAFIA DE INTERCAMBIO IONICO.
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CROMATOGRAFÍA DE
AFINIDAD.
Se explota el hecho de que toda
proteína es capaz de
interaccionar con uno o mas
ligandos. Fijándolos a una
matriz, se puede purificar
selectivamente a la proteína en
estudio.
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Purificacion s tep TotalPr otein
Total
activity
Specific
Activity
Purification
factor
Yield
Cell-free extract
ConA- Sephar ose
Mono Q
Mono P
mg
227.5
5.6
0.67
0.36
unitsa
56.00
43.75
25.95
14.70
unitsa/mg
0.246
7.81
38.73
40.83
Fold
1
31.75
157.44
165.97
%
100
78.1
46.34
26.25
Tabla de purificacion y determinacion de
homogeneidad proteica.
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ELECTROFORESIS.
Es la migracion de una macromolecula (proteina, DNA, RNA) en un
campo electrico.
Electroforesis en gel de poliacrilamida: en condiciones nativas (PAGE) o
en presencia de SDS (SDS-PAGE).
Isoelectroenfocado (IEF): Separación por punto isoeléctrico (pI).
Electroforesis bidimensional en gel de poliacrilamida (2D -PAGE): IEF
en una primera dimensión, SDS-PAGE en la segunda.
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ISOELECTROENFOCADO: Separación por pI.
Las proteínas se corren en un gradiente de pH preformado, que se obtiene
sometiendo a electroforesis previa una mezcla de polianfolitos (polímeros
pequeños con múltiple carga) con diferentes valores de pI. En A se carga
la muestra y se aplica el voltaje, con lo cual las proteínas migrarán hasta
llegar al valor de su pI, donde, al no tener carga neta, quedarán
enfocadas, lo que se observa en B.
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Electroforesis bidimensional (2D-PAGE)