Bioqumica de Harperndice de CaptulosCaptulo 1: Bioqumica y medicina Captulo 2: Biomolculas y mtodos bioqumicos Captulo 3: Agua y pH

Seccin I

Estructura y funciones de protenas y enzimasCapitulo 4: Aminocidos Captulo 5: Pptidos Captulo 6: Protenas. Estructura y funcin Captulo 7: Protenas. Mioglobina y Hemoglobina Captulo 8: Enzimas. Propiedades generales Captulo 9: Enzimas. Cintica Captulo 10: Enzimas. Mecanismos de accin Captulo 11: Enzimas. Regulacin de la actividad enzimtica

Seccin II

Bioenergtica y el metabolismo de carbohidratos y lpidosCaptulo 12: Bioenergentica. La funcin del ATP Captulo 13: Oxidacin biolgica Captulo 14: Cadena respiratoria y fosforilacin oxidativa Captulo 15: Carbohidratos de importancia fisiolgica Captulo 16: Lpidos de importancia fisiolgica Captulo 17: Panorama del metabolismo intermediario Captulo 18: El ciclo del cido ctrico. Catabolismo de la acetil-CoA Captulo 19: Gluclisis y oxidacin del piruvato Captulo 20: Metabolismo del glucgeno Captulo 21: Gluconeognesis y control de la glucosa sangunea Captulo 22: Va de la pentosa fosfato y otras vas del metabolismo de las hexosas Captulo 23: Biosntesis de cidos grasos Captulo 24: Oxidacin de los cidos grasos. Cetognesis Captulo 25: Metabolismo de cidos grasos insaturados y de los eicosanoides Captulo 26: Metabolismo de acilgliceroles y esfingolpidos Captulo 27: Transporte y almacenamiento de lpidos Captulo 28: Sntesis, transporte y excrecin del colesterol Captulo 29: Integracin del metabolismo y el suministro de energticos tisulares

Seccin III

Metabolismo de protenas y aminocidos

Captulo 30: Biosntesis de aminocidos no esenciales en la nutricin Captulo 31: Catabolismo de protenas y del nitrgeno de aminocidos Captulo 32: Catabolismo de los esqueletos de carbono de aminocidos Captulo 33: Conversin de aminocidos en productos especializados Captulo 34: Porfirinas y pigmentos biliares

Seccin IV

Estructura, funcin y replicacin de las macromolculas informativasCaptulo 35: Nucletidos Captulo 36: Metabolismo de los nucletidos de purina y pirimidina Captulo 37: Estructura y funcin de los cidos nucleicos Captulo 38: Organizacin y replicacin del DNA Captulo 39: Sntesis, procesamiento y metabolismo del RNA Captulo 40: Sntesis de protenas y el cdigo gentico Captulo 41: Regulacin de la expresin gentica Captulo 42: Tecnologa del DNA recombinante

Seccin V

Bioqumica de la comunicacin extracelular e intracelularCaptulo 44: Accin de las hormonas Captulo 45: Hormonas de hipfisis e hipotlamo Captulo 46: Hormonas tiroideas

Captulo 43: Membranas. Estructura, ensamble y funcin

Captulo 47: Hormonas que regulan el metabolismo del calcio Captulo 48: Hormonas de la corteza suprarrenal Captulo 49: Hormonas de la mdula suprarrenal Captulo 50: Hormonas de las gnadas Captulo 51: Hormonas del pncreas y vas gastrointestinales

Seccin VI

Tpicos especiales

Captulo 52: Estructura y funcin de las vitaminas hidrosolubles Captulo 53: Estructura y funcin de las vitaminas liposolubles Captulo 54: Nutricin Captulo 55: Digestin y absorcin Captulo 56: Glucoprotenas Captulo 57: Matriz extracelular Captulo 58: Msculo Captulo 59: Protenas plasmticas, inmunoglobulinas y coagulacin sangunea Captulo 60: Eritrocitos y leucocitos Captulo 61: Metabolismo de xenobiticos Captulo 62: Cncer, oncogenes y factores de crecimiento

Bioqumica y medicinaRoberf K. Murray, MD, PhD

INTRODUCCINLa bioquirnica es la ciencia que estudia las diversas moliculas que ce presentan en las clulas y organismos vivos, asi como las reacciones quimicas que tienen lugar en los mismos. Una comprensibn ms completa de todas 1% manifestaciones de la vida, demanda el conocimiento de la bioqumica. AdemBs, los estudiantes de que adquieren una base siilida de la bioquimica estarhn en una posicin firme para enfrentarse, en la prctica y la investigacin, a los dos intereses centrales de las ciencias de la salud: 1 ) la comprensin y conservacin de la salud y 2) la apreciacin y tratamiento eficaz de la enfermedad.

La bioqumica es la qumica de la vidaLa bioquimica puede definirse de manera ms forma1como la ciencia que se ocupa de la base qumica de la vida (del griego, bios: vida). La cblula es la unidad estructural de los sistemas vivientes. La concfderaci0n de este concepto conduce

a una definicion funcional de la bioqumica como la ciencia que se ocupa de los constituyentes qumicos de las clulas vivas y de las reacciones y procesos que experimentan. Con esta definicin, la bioquimica abarca extensas heac de la biologa celular, la biologa molecular y la genkitica moIecular.

El objetivo de la bioqumica es describir y explicar, en trminos moleculares, todos los procesos qumicos de las clulas vivasEl inters principal de la bioquimica es la comprensin completa a nivel rnolecular de todos los procesos

qumicos relacionados con las clulas vivas. Para lograr este objetivo, los bioquimicos han necesitado aislar las numerosa molculas de que se componen las c1u]a1 determinar sus e s t ~ - ~ c t u Y a analizar la r forma en que funcionan. Para dar un e j e m ~ l o ~ 10s e~ferms numerosos bioqumicos Para comprender de la base mOlecular de la -proceso quc acompaiia de preferencia, pero no de manera exclusiva, a las clulas musculares- han emprendido la purificacin de muchas molculas, siniples y complejas, seguida por detallados estudios de esh-uctura-funcibn. A iraves de estos esfuerzos, se han encontrado algunas de los fundamentos muleculares de la contraccin muscular. Un obietivo adicional de la bioqlimica es intentar la comprensin del origen de la vida; este fascinante tema an se encuentra en la etapa embrionaria. El campo de la bioquimica es tan amplio como la vida misma. Dondequiera que hay vida, se prodiicm procesos quimicos. Los bioquimicos los estudian en microorganismos, vegetales, insectos, peces, aves, mamferos y en el ser humano. Es lbgico que los estudiantes de ciencias biomdicas centren su interes en la bioquimica de los dos ltimos grupos. No obstante, una apreciaci6n respecto a formas de vida menos complejas tiene a menudo relevancia directa con la bioquimica humana. Por ejemplo, las teoras contemporaneas sobre la regulacin de las actividades de genes y enzima5 en el ser humano provienen de estiidios pioneros en pan enmohecido y bacterias. El campo del DNA recombinante surgi de estudios en bacterias y sus virus; su rapidez para la multiplicacibn y la facilidad para extraer su material gentico los hace adecuados para anlisis y manipulaciones gentticas. El cor,ocimiento logrado por el estudio de genes virales causantes de ciertos tipos de cncer en animales (oncogenes viraIes) ha permitido avanzar profundamente-en el modo en que la clula humana se torna cancerosa.

2

Bioquim icu d~ JIarper

(Capitulo I )

El: conocimiento de la bioqumica es esencial en todas las ciencias de la vida, incluyendo la medicinaLos fundamentos de la gentica se apoyan en la bloqumica de los cidos nucleicos; a su vez, los enfoques geneticos han dilucidado numerosas reas de la bioqumica. La fisiologia, estudio de la funcin corporal, se traslapa casi por completo con la bioquimica. La inmunoIoga, por su parte, emplea numerosas tcnicas bioquimicas y muchos de los aspectos inmunol0gicos han encontrado uso extenso eiitre bioquimicos. Asimismo, la farmacologia y la farmacia se apoyan en un co~iocimiento sblido dc bioquimica y Ilsiologia; en particular, la mayora de los firmacos son metabolizados por reacciones catalizadas por enzimas y las comple,jas interacciones entre frmacos se comprenden mejor desdc el punto de vista bioquimico. Tambin los venenos actan por medio de rcaccjones o procesos bioquimicos y este es el terna de la toxicologia. Cada vez ms se emplean enfoques bioquimicos en el estudio de aspectos bsicos de la patologa (estudio de la enfermedad}, como inflamacin, lesin celular y cancer. Muchos profesionales en rnicrobiologia, 7001oga y botanica emplean mtodos bioqumicos casi de manera exclusiva. Estas relaciones 1 0 sorprenden, debido a que la vida como se conoce 1 dcpende de reacciones y procesos bioquirnicos. De hecho, han cado las viejas barreras entre las ciencias de la vida y la bioquirnica se toma cada vez mas su lenguaje comn.

Una relacin recproca entre la bioqumica y la medicina ha estimulado adelantos mutuosComo se estableciii al principio de este captulo, las dos preocupaciones principales de los estudiosos de

las ciencias de la salud, en particular mdicos, son la comprensin y mnservacibn de la salud y la comprensin y tratamiento eficaz de las enfcmedades. !,a hioquimica tiene un impacto tremendo en ambos. De hecho, la interrelacin entre bioquimica y medicina es un amplio camino de doble sentido. Los estudios bioquimicos han ilurriinado numerosos aspectos de salud y enfermedad y, de manera inversa, cl estudio de stas ha abierto areas nuevas en bioquimica. En la figura 1-1 se muestran algunos casos de esta via de doble direccin. Por ejemplo, fue necesario el conocimiento de la estructura y Ilincin de las proteinas para dilucidar la sencilla diferencia bioquimica entre la hcmoglnbina normal y la de las clulas falcifonnes. Por otra parte, el analisis de esta ltima ha conwibuido de mancra significativa a la comprensibn de la estructura y funcin dc la hemoglobina normal y de otras protenas. Podrian citarsc ejemplos anlogos del beneficio reciproco entre bioquimica y medicina para los demhs pares de conceptos mostrados en la figura 1 -1 . Otro ejemplo es el trabajo pionero de Garrod, mkdico inglCs, a principios de este siglo. Estudi pacientes con cierto nmero de trastornos relativamente raros (alcaptonuria. alhinismo, pentosuria y cistinuria; descritos en loc ltimos captulos) y estableci que su origen era genciico. Garrod designb a estas enfemcdades como errores congdnitos del metabolismo. Sus punros de vista proporcionaron una base importante para el desarrollo del campo de la genktica bioqumica humana. La relacin entre medicina y bioqumica tiene implicaciones filosficas importantes para la primera. Hasta donde el tratamiento medjco se asiente en el conocimiento de la bioquimica y otras ciencias bsicas pertinentes (como fisiologa, microbiologia y nutricibn), la prctica de la medicina tendr una base racional que puede acomodar nuevos conocimientos. Esto contrasta con culros de saliid no ortodoxos, que a menudo se elevan a poco ms que un mito sin fundamento intelectual alguno.

Actdos nucEelc05

Protena

tI tMEDICINA

Lpidos

Carbohidratos

geneticas

Anemia de clulasfalciforme5

Aterosclerosis

Diabetes

sacarina

Figura 1-1. Ejemplos de la via de doble direccin (interrelacin) que existe entre la bioqumica y medicina. El conocimiento de los Compuestosmostradosen la porci6n superior del diagrama ha esclarecido las enfermedades mencionadas en la porcion inferior; de manera inversa, anlisis de los trastornos mostrados abajo han despejado numerosas reas de la bioquimica Debe aclararse que la anemia de cklulas falciformes es una enfermedad genetica y que tanto la aterosclerosiscomo la diabetes sacarina tienen componentes geneticos

Bioqumicuy medicina

3

LOS PROCESOS BIOQU~MICOS NORMALES SON LA BASE DE LA SALUDLa Organizacin Mundial de la Salud (OMS) define a la salud como un estado de "bienestar fisico, mental y social completo y no unicamente fa ausencia de enferrnedad o dolencia". Desde un punto de vista bioquimico estricto, puede considerarse a la salud como la situacin en donde las miles de reaccioiies intra y extracelulares que tienen lugar en el cuerpo proceden a velocidades adecuadas a su supervivencia mxima en el estado fisialogico. Sin embargo, este es un concepto sumamente reduccionista; es necesario enfatizar que atender la salud de los pacientes no slo requiere de un extenso conocimiento de los fundamentos biolgicos sino tambien de principios sociales y psicolbgicos.

Cuadro 1-1. Principales causas de enfermedad. Tcd a s las cairsiisenunieradas actiian bajo tia dt! varios rnecanisnl o s bioqurnicos t la o t:n el cuerpo*. .

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2.3.4.

5.

6.

7.

Agcnt cs f i s i c o s - ~ r a i i a t i s m or n e c n i c o ~ tcinper aturas extremas, cambios repentinos cn la prcsiri atmosfrica, radiacibn, choque elkctrico Aeente quirnicos y famacos: Ciertos comnuestos tvxicoc,, agentes teraputica: ; etctera , Agente hiolgicos: Vinis. ri ckettsias, b lngos, fo rmas superiores de p! :~rsilos . ~ 5 i i c n c i de o~igeno: a Falta de Tumrnlsrro sangulneo, deficiencia en la capacidad sanpiiinea para t~mspori :ar oxigeno, intouicaciiin de las enzimns oxidativas Gen6tica: Alteraciones congenita~ r,,, on ~ oiies ininuiioliigicas: Anafilaxia nd nunolgic; 1 iilihrio nut riconal: D:ficiencia r :S,

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La investigacin bioquimica tiene impacto en la nutricin y la medicina preventivaUn prerrequisito importante en la conservaci6n dc la salud es la ingestin ptima de cierto numero de compuestos qufmicos; de entre ellos los principales son vitaminas, varios aminoficidos, &cidos grasos, minerales y agua. Dado que el objeto de la bioquimica y la nutricin es precisamente el estudio de los diversos aspectos de estos compuestos, hay una selaci~n estrecha entre las dos ciencias. AdemBs, con la intenci6n de restringir 30s costos en aumento del cuidado mdico, se enfatizan los esfiierzos sistemticos para conservar la salud y anticiparse a la enfermedad, es decir, la medicina preventiva. Por tanto, cada vez tiende a considermsc m6s el aspecto nutricional, por ejemplo, en la prevencin de aterosclerosis y c h c e r . El conocimiento de la nutricibn depende en alto grado de la bioquimica.

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Dtsequilibrio en docrino: 1 >eficiencias o excesos hurmonates -* i\dapiado con autori7acion ae KObblnS SL,Colram RS,Kizmm

8.

V Tlie Pafhologic Rasis ojDtseasr, 3rd ed. Saunders, 19R4

a Io Eargo del libro. N o obstante, aqu se presentan s61o siete ejemplos breves para ilustrar la envergadura del tema y estimular e1 inters del lector. I) Los seres humanos deben ingerir cierto numero de rnol&culasorgnicas comple,ja~ llamadas vitaminas para conservar la salud. Si en la dieta hay deficiencia de determinada vitamina, se comprometen las reacciones en que participan. Esta situacin puede manifestarse como una enfermedad por deficiencia como escorbuto o raquitismo (resultado de Ingestidn insufciente de vitamina C y D, respectivamente). Dilucidar la actividad de las vitaminas o sus derivados con accin biolbgica ha sido una inquietud constante de bioquimicos y nutri6logos desde el principio del siglo. Una vez que el estado patologico por deficiencia de una vitamina se estableci, es racional tratarla mediante la administracidn de la vitamina apropiada. 2) El hecho de que numerosos vegetales en frica son deficientes en uno o ms aminohcidos esenciales (es decir, aminoacidos que deben ingerirse con los alimentos para conservar la salud) ayuda a explicar la desnutricin debilitante (kwashiorkor) que padecen quienes dependen de esos vegetales como fuente principal de protenas. El tratamiento de deficiencias de aminocidos esenciales es racional pero, desafortunadamente, n o siempre es posible. Consiste en proporcionar una alimentacibn balanceada que contenga cantidades suficientes de tales aminocidos.

Todas las enfermedades tienen una base bioqumica Las enfermedades son manifestaciones de anorrnatidades de molcu tas, reacciones quimicas o procesos. En el cuadro 1-1 se enumeran tos principales factores como causa de padecimientos en el ser humano y los animales. Todos ellos afectan a una o ms reacciones quimicas criticas Q rnaleculas del cuerpo.

Los estudios bioquimicos contribuyen al diagnstico, pronstico y trataltiientoExiste un caudal de informacin respecto al uso de la b i a q u i m i c a e n la prevencin, d i a g n s t i c o y tratamiento de la enfermedad; muchos casos se citarhn

3) Los esquimales Tnuit de Gruenlandia consumen cantidades abundantes de aceites de pescado ricos en ciertos acidos grasos poliinsaturadosy se sabe que su concentracin plasrntica de colesterol es baja, lo mismo que la frecuencia de aterosclerocis. Estas observaciones han estimulado el inters en el uso de esos Bcidos para reducir los valores plasrn~icos colesteral. de Las enfermedades por deficiencia vitamnica o de aminocidos esenciales son ejemplos de desequi librios nutricionales (cuadro 1 -1 ). La aterosclerosis puedc considerar~eun desequilibrio de la nutricjon, pero tambikn intervienen otros factores (corno el gentico). 4) El estado conocido como fcnilcetonuria si no se trata, puede cotiducir en la infancia a retraso mental grave. Desdc 1953, se conoce la base bioquimica de este trastorno, el cual est. detcrminado gencticarnente y se debe a la actividad escasa o nula de la enzima que convierte el aminocido fenilalanina en tirosina. Esto, a su vez, eleva la concentracin sangunea de fenilalanina, lo que dafia al sistema nervioso central en desmollo. Cuando se descubri la naturaleza del daAo bioqumico, se trat la enfermedad haciendo que los lactantes afectados ingirieran una alimentacin pobre en fenilalanina. Una vez que se dispuso de pruebas bioquimicas selectivas para diagnosticar feni lcetonuria al nacimiento, pudo instituirse el tratamiento desde el principio en el nio afectado. 5 ) La fibrosis quistica es una enfermedad genMica comn de las glindulas exocrinas y las glhndtilas sudorparas ecrinas. Se caracteriza por secseciones anomalmente viscosas que obstruyen los conductos secretores del phncreas y los bronquiolos. Ademhs. los pacientes con esta afeccin muestran una concentracin elevada de cloruro en el sudor. A menudo, las vctimas mueren a temprana edad por infecciones pulmonares. En 1989, se inform6 sohrc el aislamiento y la secuencia completa del gen causante de esta enfermedad. El gen normal codifica una protena transrnembrana (regulador de la conductancia transmembrana en la fibrosis qusticaj formada de 1480 arninoacidos, la cual funciona como un conducto del cloruro. En 70% de los pacientes con la enfermedad se ha observado una delecin de tres bases en el gen, lo cual hace que en la proteina transmembrana falte el aminoacido 508, un residuo de fenilalanina. Se esth determinando la forma en que esta omisin altera la hncin de la protena transmembrana con produccion de moco demasiado denso. Este importante estudio facilitarii la identificacion de portadores del gen de la fibrosis quistica y se espera que conducir a un tratamiento rns racional dc la enfermedad que el existente hasta ahora, Por ejemplo, quizfi ser posible desarrollar fhrrnacos que corrijan la anor-

malidad en la proteina transmembrana; de igual modo, podra introducirse un gen normal en las clulas pulmonares por manipulaciiin gentica. Ida fenilcetonuria y la fibrosis quistica son ejemplos de enfermedades g e i a i c a s (cuadro 1-1 ). 6) El anlisis del mecanismo de accihn de la toxina bacteriana que causa el clera ha proporcionado infonacibn importante sobre el modo en que ocurren las manifestaciones clnicas de la enfermedad (diarrea copiosa y prdida de sal y agua). 7) El hallazgo de que los mosquitos transmisores de parsitos (plasmodios) que causan el paludismo pueden desarrollar resistencia bioqumica a la accin de insecticidas, tiene consecuenciac importantes s o b r e los intentos para erradicar esta enfermedad. Este caso y el anterior, son ejemplos de enfermedades causadas por agentes bioliigicos (cuadro 1-1).

Muchos estudios bioquirnicos aclaran mecanismos patolgicos y, a su ver, las enfermedades inspiran estudios en reas especificas de la bioqumicaLas observaciones iniciales reali~adas el mhdico por ingls Archibald Garrod en un grupo pequeo de errores congknitos del metabolismo al principio del decenio de 1900, estimulb la investigacin de las vias hiliqiiimicas afectadas en estas alteraciones. Los esfuerzos para comprender la base de la enfermedad genktica conocida como hipercolesterr)lemia familiar, que lleva a aterosclerosis grave a edad temprana, condujeron al notable progreso en el conocimiento de los receptores celulares de los mecanismos de captacin ddel colesterol por las clulas. Los estudios actuales de los onrogenes en clulas cancerosas han dirigido la atencin a mecanismos moleculares que interv-ncn en el control de la inultiplicacibn celular normal. Estos y otros numerosos ejemplos posibles ilustran la forma en que el estudio de la enfermedad puede abrir areas enteras de la funci6n celular para la investigacin bioquimica bhsica.

ESTE TEXTO AYUDAR A RELACIONAR CONOCIMIENTOS BIOQUMICOS CON PROBLEMAS CL~NICOSEn cl texto se encuentran dispersas, breves descripciones de los mecanismos bioqumicos en que sc basan muchas enfermedades. En particular, las captulos 63, 64 y 65 se refieren a las bases bioquimicas de varias enfermedades importantes. En el apcndice se analizan brevemente algunos conceptos basicos para interprctar los resultados de las pruebas bioquimicas de labo-

Bioyuimicu y medicina

5

Cuadro 1-2. Algunas investigaciones bialhgicas y pruebas de laboratorio aplicadas al estudio de las enfermedadi--- - .-.. . - -

-

2 -

-L.u-

1. Revelar, ;I ,, ,, u Au,,uu,,,L,,,ules y los mccanicmos dc la enfermedad 2. Sugerir tratamientos racionales de las enfi con base en las causas mencionadas antes ( 3. Ayudar al diagnstico de enfermedades especirlcas 4 , Actuar colmo pruebas para deteccibn y dlagnstid:O tcmpranci dc ciertas cnfemedades 5 . Ayudar ein la vigilancia de le. evolucifin (por qemp,lo 111 ,,,,,,,,,cien, empeoramiento. remisibn o recaid,, de ciertas en remidades 6. Ay udar a evaluar la respuesta dc las cnfcrmedad"PrllnP-rl

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I isis quistic: ileo de una dieta baja en fenilalanina para e i fenilcetuiiiui-iac.

...

.

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ca alaninaiminotransferasa /AI,l')

al tratamiento

ucibn de laihepatitis i nfrcciosa -r,irilileo de mrurL1uiie.i de anti~eiiu~a~iriuernbrionario (CEA) sanguneo en cierta s tratados por cncer de

ratorio y se presenta una lista de las mas empleadas junto con el intervalo en el cual varian sus valores normales. El propbsito global es animar at lector a dar a SU ~0nocitTlient0de bioquimica U n USO ~ l i n i c 0 eficaz.

Las inve~tigaciones bioquimicas en relacion conlas enfermedades se resumen en el cuadro 1-2. En

varias secciones de este libro se presentan ejemplos de muchos de estos usos.

RESUMENLa bioquimica es la ciencia que se ocupa del estudio de las diversas molkculas que componen las clulas y organismos vivos as c o n o de sus reacciones quimicas, Debido a que la vida depende de estas reacciones, la bioquimica se ha convertido en el lenguaje b;isico de todas las ciencias biolgicas. bioqumica se interesa en la totalidad de las forma? vivientes, desde virus y bacterias, relativamente simples, hasta les cornpIejos seres humanos.

La bioquimica y la medicina tienen una relacion estrecha. La salud depende del equilibrio armonioso de [as reacciones bioquimicas que tienen lugar en cl ,,,mo,. y la enfermedad en biornold~ulas, reacciones bioquimicas o procesos biolgicos, Los adelantos en el conocimiento bioquirnico han iluminado numerosas reas de la medicina. De modo inverso, a menudo el estudio de las enfermedades ha revelado aspectos previamente no sospechados de la bioquimica. Con frecuencia, un enfoque bioqumico es fundamental para aclarar las caus& de Ias enfermedades e idear teraputicas E uso racional de varias pruebas bioquimicas de E laboratorio es un componente integral del diagnhstico Y vigilmcia Un conocimiento slido de la bioquimica y de otras disciplinas bQsicasrelacionadas es esencial para la practica racional de la medicina y ciencias de la salud afines. I+sadaiporpa

REFERENCIASGarrod AE: Inhorn errors of metabolism (Croonian Lec-

tures). Lance[ 1908;2: 1.73, 142,2 14. Kornberg A: Basic rssearch: The lireline of medicineFASBB J 1992:6:3143.

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RiornoAculas y mtodos bioqumicos

Este capitulo tiene cinca objetivos. El primero se refiere a la camposici6n del cuerpo y a las principales clases de molculas que se encuentran en 61. El estudio de estas mol&culasconfonnagrnn parte de este texto. La ctluIa es la principal unidad estructural y funcional de la biologa. La mayor parte de las reacciones qumicas dentro del cuerpo tienen lugar en las c6lulas. Por tanta, el segundo objetivo es dar una descripci6n concisa de los componentes de las c&lulas y de la forma en que pueden aislarse; los detalles de las funciones de estos componentes constituyen gran parte de la estructura del libro. El tercer objetivo concierne al hecho de que la biquimica es una ciencia experimental. Es importante comprender y apreciar el enfoque experimental y los mbtodos usados en bioquimica, para permitir que su estudio se convierta en un ejercicio rutinario del aprendizaje. Ms an, la bioqumica no es un cuerpo inmutable de conocimiento, sino un campo en evolucin constante. Los adelantos, como en otras lireas de la bioqumica, dependen de la innovacin en el enfoque experimental y tecnolgico. El cuarto objetivo consiste en resumir de manera breve los principales logros obtenidos en bioqumica. La visibn concisa de la ciencia, que se presentad aqu, ayudar a impartir en el lector un sentido de la direccibn global del resto del texto. El quinto objetiva se dirige a destacar lo poco que conocemos en ciertas Areas, por ejemplo, sobre el desarrollo, la di ferenciacidn y funcibn cerebral, el cncer y muchas otras enfermedades humanas. Quiz esto sirva de estimulo a algunos lectores para contribuir a la investigacibn de estas Areas.

EL CUERPO HUMANO SE COMPONE DE UNOS CUANTOS ELEMENTOS QUE COMBINADOS FORMAN UNA EXTENSA VARIEDAD DE MOLCULASLos principales elementos san carbono, hidrgeno, oxgeno y nitrgenoSe ha determinado la composicin elemental del cuerpo humano y en el cuadro 2-1 se muestran los principales resultados. El carbono, oxgeno, hidrbgeno y nitrgeno son los constituyentes principales de casi todas las biomol&culas.El fosfato es un componente de los Iicidos nucleicos as1 como de otras molculas y tambikn se distribuye ampliamente en su forma ionizada en el cuerpo humana. Por su parte el calcio tiene una funci6n importante en innumerables procesos biolbgicos y sobre l esta enfocada buena parte de la investigacibn. Los elementos enumerados en la tercera columna desempefan diversas funciones. Muchos de ellos se manejan casi diariamente en la prhctica mkdica al atender a pacientes con desequilibrios electroliticos (K', Na', C1- y Mg2+},anemia por deficiencia de hierro (Fe2+) y enfermedades de la tiroides (1-1.

Las cinco principales biomolcufas complejas son DNA, RNA, protenas, polisacarridos y Ipidos complejosComo se muestra en el cuadro 2-2, las principales biomol~culas complejas encontradas en las clulas y tejidos de los animales superiores (incluyendo al ser humano) son DNA, RNA, protenas, polisacfiridos

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Biuqriim ica de Hrrrper

Cuadro 2-1. Composicin ekemental aproximada del cuerpo humano (con base en peso seco)*-

Carbono

50Azufre

Ovigeno I lidrgeno N itrgcnoalcio F.cjsforo

-- 0.00005 * Reproducido con autorizacibn de West ES. l o d d WR. T?xzbookofRiochcmist~. e d . Macmillan, 1961. 3rd

ques estructurales de los Iipidos, aunque stos no son polimeros de acidos grasos. Al DNA, RNA, proteinas y polisacaridos se les conoce como hiopolimeros debido a que esthn compuestos de unidades repetidas de sus bloques estructurales (los mon6meros). Las rnol~culasantes mencionadas constituyen esencialmente el "ingrediente vital" de este texto; la rnayor parte se ocupa de describir sus caractersticas bioqumicas y las de sus bloques estructurales. Por lo general se encuentran las mismas moleculas complejas en los organismos inferiores, pero pueden diferir de los que se muestran en el cuadro 2-2. Por ejemplo, las bacterias no contienen giucogeno o triaci!gliceroles, pero poseen otros polisacaridos y Ipidos.

y lipidos. Lac moiculac complejas se construyen a partir de biomoMculas simples, tainbien enumeradas. Los bloques estructurales del DNA y el RNA (Ilarnados colectivamente cidos nucleicoc) son los desoxinucletidos y los ribonucle6tidos, respcctivamente. Por su parte, las bases estructurales de las protehas con los arninoitcidos, mientras que los polisacaridos estan constituidos por carbohidratos simples; en el caso del glucgeno (polisacrido principal de los tejidos humanos), el carbohidrato es la glucosa. Los cidos grasos pueden considerarse como los bloCuadro 2-2. Biomol&culas orghnicas comptejas principales de clulas y tejidos. Los &cidos nucleicos, proteinas y plisadridos son biopolimems, constrriidm a partir de las bases estructurales mostradas. Por lo general, tos lipidos no son biopolimaros y no todos tienen cidos grasos como bases estructurates -. -. .. ..

Protenas, I pidos, carbohid ratos, agua y minerales son los principales componentes del cuerpo humanoYa se mencionb cual es la composici6n elemental del cuerpo humano. Su composicin quimica se muestra en el cuadro 2-3; proteina, grasa, carbohidrato, agua y minerales son los elementos principales. E1 agua coristituye la proporcin mayor, aunque su cantidad varia ampliamente en los difcrentes tejidos. Su naturaleza polar y su propiedad de formar puentes de hidrogeno hacen al agua idealmente adecuada para su funcin como solvente en el cuerpo. En el captulo 3 se presentan con mayor detalle las propiedades del agua.

LA CLULA ES LA UNIDAD BSICA DE LA BIOLOG~ALa clula fue reconocida como la unidad fundamental de la actividad biolgica por Schleidcn y Schwann y por otros pioneros como Virchow en el sigloXIX. Sin embargo, en los aRos posteriores a la Segunda Guerra

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--L ipidosbranas y almaccnaje por tiempo prolongado dc energa como triacil-

Milierales * Reproducido con

4. I i 51 - i SD, Parsmore R,- s .- ' I acin de D avidson : autor17

1

aliccroles

Hrock JF: Iiuman ,l'uiri rion and Di ererrcs, 5th ed. Churchill Livingstone, 1973. El valor para el agua pucdc variar ampliamente entre los riircrentes tejidos, siendo tan bajo como 22 5% para e l hueso sin mtdula Adems, el porcentaje dcf agua tiende a disminuir confunnc alimenta 13 grasa curpura)

Biomolculas y mtodos hioqumrcos * 9

Mundial, tres sucesos ayudaron al inicio de un periodo de actividad sin paralelo en la bioquimica y la biologia celular. Fueron: 1 ) la disponibilidad creciente del microscopio electrnico; 2) la introducci~n rnktodos de que permiten separar las clulas bajo condiciones relativamente poco agresivas de modo que se preserve su funcin: 3) el desarrollo y disponibilidad de una ultracentrifuga refrigerada de alta velocidad, capaz de generar fuerzas centrfugas suficientes para aislar los constituyentes de las celuias separadas sin sobrecalentarlos y, por tanto, sin desnaturali7arlos. El uso del microscopio electrnico reve16 muchos de los componentes ce!ularec que hasta entonces eran desconocidos o deficientemente observados, en tanto que la rotura de las clulas y la ultracentrifugacin permiti su aislamiento y anhlisis in vitro.

Retculo endopllrsmico

h

Citoesqueleto

El hepatocito de rata muestra caractersticas comunes a muchas clulas eucariotasEn la figura 2-1 se muestra un diagrama de la estrucmra de una ckIuEa hepatica (hepatocito) de rata; es

probabEe que sta sea la clula m8s estudiada desde el punto de vista bioqumico, en parte por su disponibilidad en cantidades relativamente grandes, por su facilidad para fraccionarse y por la diversidad de siis funciones. El hepatocito contiene todos los organelos principales que se encuentran en [as clulas eucariotas (cuadro 2 4 ) ; es decir, niicleo, mitocondrias. retculo endoplsmico, ribosomas libres, aparato de Golgi, lisosomas, peroxisornas, membrana plasrnatica y ciertos elementos citotsque2eticos.

Membrana plasmalica

Peruxisoma

citoso1

Lisosoma

Figura 2-1. Representacibn esquematica d e una d l u l a hep8tica d e rata, con sus organefos principales

Para disgregar clulas y aislar molculas intracelulares y organelos subcelulares se usan tcnicas fsicasPara estudiar con profundidad la funcidn de cualquier organelo, es necesario primero aislarlo en forma relativamente pura, sin contaminacion importante de otros organelos. El proceso habitual para conseguirlo se llama fraccionamiento subcelular y, por lo general, comprende tres procedimientos: extraccibn, homogeneizacin y centrifugaci6n. Gran parte de los trabajos iniciales en esta irea utilizaron higado de rata.

A. Extraccin Como primer paso hacia el aislamiento de un organelo (o molcula) especifico, es necesario extraerlo de las cAulas en que se localiza. La rnayoria de los organelos y muchas ~iomoleculas bastante Ihbiles y propenson sos a perder sus actividades biolbgicas. De acuerdo a ello, deben extraerse en condiciones poco agresivas

(es decir, usando soiuciones acuosas y evitando sitiiaciones extremas de pH, presibn osmtica y temperaturas altas). En realidad, muchos de los psocedimientos para aislar organelos se efectria aproximadamente entre 0 y 40 "C (por ejemplo, en un cuarto frlo o utilizando materiales conservados en hielo). A la temperatura ambiente puede haber prdida significativa de la actividad, en parte por la accin de varias enzima5 digestivas (proteasas, nucleasas, etcktera), liberadas cuando se rompen las cdlulas. Una solucin comun para la extraccion de organelos consiste en sacarosa 0.25 moVL (Esosmtica), ajustada a un pH de 7.4 con un amortiguador de hcido cIorhidrico-TRIS (tris [hidmimetil] am jnomewno), 0.05 moW, que contiene iones K' y Mg2' a concentraciones casi fisiol~gicas; esta solucin se a le conoce con las siglas STKM (del ingles, Sucrosu, Tris, Kulium y Magnesiurn). No todos los solventes usados para la extraccibn son tan suaves como el STKM ; por ejemplo, para extraer lipidos y cidos nucleicos se emplean solventes orghnicos.

10

Bioquimica de Harper

(Cupitulo 2)

imdro 2 4 porianciat

ates rgarios intrac idas con cada o q a iO

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ta se enunneran las funciones de mayt en ocurrir muchas otras vtas,procesos

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Funcio'nes princiA

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los cromo!iornas Lugar donde se desarrvl,la la sintesi . ..

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biut&nico d ~ h i d r o g ~ n ~ a Alta contenido de RNAGlucosa.

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lo c A ( t r r g osforilaci b n oxidativa-ASitio de la snitesis protte! icibn del mRNA a pro-

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Aparato de Golgi

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Cata! asa

ieshidrogenasa .. - Citosol* 1 En:zlmas-ae !a gtuco~isis, ". sntesis de:-hcidos & * Un organelo se puedc dcfinir como una entidad suba:eEulwquue est limiida oormembranav se aislarior ccntxifupaci6n a altas .. ..necesario pnr lo menos, c ierto numerci de ciclos. fracciones de citoesqueleto se pi ieden recont xer por mii:roscopia el carxteristics que contiei1P"

Oxidasa del Qido iirica e No tien! marcadc + 'OS'

LoS rihosomas unidos a la mernbrama son un tanite de sntesis proteinica Siritesis de varios Ipidas Ox idacin de n u m e ~ o s o s ~ e n ~ i 6 t i ( c ist o c m m o _ i ~ 4 ~ o ~ co io dc almacenaje de muchas hiilrolasas (e e alizan reacciones deg: radativas) . insporte dc molCculm dentro y tiuera dc las herencxa y comunicacibn interce Di:jtribucion intracelular de protein Reacciones de glucosilac:i6n Reacciones de sulfatacin gradacin iie ciertos cidos gracos y amino iduccin y degtadrtciin de peroxido de h d ! .-crofilamentos, microtibulos, filamentos intlu

D acuerdo a Ia definicihn, los r i b m a 5 , ei crioesqueieto y ei citosoi no son organclos. Sin embargo, aqui se les considera junto con e ellos dehido a que, por lo general. tambin se aislan p r centrifugacibn F'ueden ctasiiiicarse comcb entidades ci fracciones subcelulares Un organelo al sisl arse por un ciclo ii c ccetrifug aci6n diferencial rara vi2s: es puro; 1Jara obtener una fraccib n pura, habi tudmente eSpor anlisis

Laq

oforesis de

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B. HomogeneizacinPara extraer un organela (o biomolkcu1a) de las c&lulas, primero es necesario romperlas bajo condiciones suaves. Los 6rganos (hgado, rifion, cerebro) y las clulas que contienen se pueden separar de manera conveniente mediante el proceso de homogeneizacibn; ste consiste en girar manualmente o por medio de un motor, un agitador dentro de un tubo de vidrio de dimensiones adecuadas que contiene los fragmentos desmenuzados del &gano en estudio con un medio hornogeneizante apropiado como STKM. La rotacibn controlada del agitador ejerce una fuerza mechica en las dtulas y las rompe l i h d o sus constituyentes en la sacarosa. Resulta una suspensin que contiene muchos organelos intactos, la cual se conoce como homogenado.

C. Centn'fugacidnEl subfraccionamiento del contenido de un homogenada por centrifugacin diferencial ha sido una tkcnica de importancia capital en bioquimica. El mttodo

clsico utiliza una serie de tres pasos de centrifugacin diferencial, con velocidades sucesivamente mayores (figura 2-2) y cada uno produce un sedimento y un sobrenadante. El sobrenadante de cada paso es centrifugado en el siguiente. Este prmedimiento proporciona tres sedimentos, que son las fracciones nuclear, rnitocondrial y rnicrosbmica. Ninguna de las fracciones est compuestade organelos absolutamente puros. Sin embargo, se ha establecido con precisin por el uso del microscopio electrbnico y por mediciones de enzimas "marcadoras" adecuadas y de componentes qumicos (por ejemplo, DNA y RNA) que los constituyentes principales de cada 1 de las 3 fracciones son nucleos, mitocondrias y microsomas, respectivamente. Una enzima o un compuesto qumico "marcador" es aquel que esta casi exclusivamente confmado a un organelo particular, corno la fosfatasa hcida en los lisosomas y el DNA en el ncleo (cuadro 2 4 ) . Por tanto, sirve para indicar la presencia o ausencia, en una fraccin determinada, del organelo en el que esth contenido. La fraccibn microsbmica (mi-

Biomol~culus mtodos biquimicos y

JI

Sobrenadante (1)

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Sobrenadante (3)

15 o00 g x 5

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Fraccibnnuclear

Fraccibn microsbmica

Figura 2-2. Esquema de separacibn de fracciones cubceluTares por centrifugaeibn diferencial. fl tejido hornogeneuado (por ejemplo, hepfitico) se sujeta primero a centrifugacibn a bala velocidad para obtener la fraccidn nuclear (que contiene tanto ncleo como dlulas enteras) y el sobrenadante (1). Este ultimo se decanta y sujeta a centrifugacion a veloadad intermedia para producir la fraccibn mitocondr~af (que contiene rnitocondrias, lisosomas y peroxisomas) y el sobrenadante (2) este se decanta y sujeta a centrifugacibna alta velocidad para obtener la fraccin microsrnica (que contiene una mezcla de ribosomas libres y reticuio endoplAsmico liso y rugoso) y una soiucibn final clara, el sobrenadante (3). Este ltimo corresponde aproximadamente al citocol o savia celular. Modificando de varias maneras el mktodo, por lo general, es posible aislar mda organelo en forma casi pura

crosomas) contiene principalmente una mezcla de

reticulo endoplsrnico liso, retculo endopliismico rugoso (es decir, que tiene adheridos ribosomas) y rEbosornas libres. E! contenido del irltimo sobrenadante corresponde a la savia celular (citosol). Las modificaciones a este proceso bcico, que utilizan medios diferentes de homogeneizacibn o protocolos distintos de centrifugacion (por ejemplo, el uso de gradientes, continuos o discontinuos, de sacarosa), han pem itido el aislamiento, en fonna ms o menos pura, de todos los organelos ilustrados en la figura 2-1 y enumerados en el cuadro 2 4 . El esquema descrito anteriormente es aplicable en tkrminos generales a la mayora de los 6rganos y las dlulas; sin embargo, los fraccionamientos celulares de este tipo deben ser valorados con mediciones de enzimas o de compuestos qumicos marcadores y por el rnjcroscopio electrnico, hasta que el procedimiento global pueda considerarse estandarizado. La importancia de los estudios d e fraccionamiento subcelular en el desarrollo de la bioqumica y la biologia celular, no se exagera por su enfoque experimental y amplio uso, constituye una parte fundamental en el estudio de las funciones de los organelos celulares. La infomaci6n de estas funciones, resumida en el cuadro 2 4 , representa uno de los mayores logros de la investigac i 6n bioquimica (vkase despubs).

El enfoque experimental tiene tres componentesLos componentes principaEes del enfoque experimental son tres: 1) el aislamiento de biomoldculas y organelos (vdase Centrifugacin, antes) contenidos en las clulas; 2) la deteminacibn de la estructura de las biomolculas, y 3) el aniilisis, utiIizando diversas preparaciones, de la funcion y el metabolismo (es decir, sintesis y degradacibn) de las biornoltculas.

El enfoque experimental requiere del aislamiento de biomolculasComo en el caso de los organelos, conocer la funci6n de cualquier biomoidcula requiere que primero se le aisle en fonna pura. En el cuadro 2-5 se resumen los mktodos principales empleados para separar y purificar biomolkculas. Aqu no se detall&, pero algunos se explicarn de modo breve en otras partes del libro. Para purificar una biomol&culase necesita casi siempre una cornbinaci6n de mitodos hasta lograr la homogeneidad (la forma pura sin contarninacibn por cualquier otra biomolcula). Es importante apreciar que los adelantos en bioquimica dependen del desarrolIo de ttscnicas nuevas

C u a d r o 2 -5. Prin cipales nmbtodas risados p ara separar y purificar biamolc:ulas. Mu chos de e 110s son adecu:ados pari analiza t los comr)orientes i4 "e 1 -- -... 1 - v _ - ..-existen en ius extractos celulart.~ eii virus matcriales bioq uimicos. El uso en secuenciaI de varias d e estas tbcnicas permiitirA, por 1 general1, la purifca0 cihn de In mmJaJ,,s ,a de las bilirliurrcuid~.Para maY ores deta lles respt: ~ f a cadla uno de los rntodos d e investig,aci6n bioquimica, el lector d ebe dirigiirse sI los texto1 especiallimdos s . ..-

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CYuadro 2- 6. Principiales meto determinacibn de la1s estructi. .

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Fraccionarniento srli no (por ejemrnyilo, prec sulfato d :amonio) c Cromatogt-afia

En papel Por intercambio ibnrco (intercan Por afinidad En capa fina Gas-l1qu1 do En fase li quida a altFiltracin itn gel Electroforr:sis

Anaiisis cielncntl. .... ... Espectroscopia ultrnvioleta, visilsle, infrarr o,ja y de resonancia magntica nuclear (RMt'4 Uso de hidrlisis cida o alcalina para degrasdar la hiomolecula balo estudio en sus const,,,,,,,,,, 1 so de una serie dc enz mas de esplecificidad conocidapara 1 degradar la biornolrScula (por ejemplo, piroteasas, r1 ucleaqas o glucosidast 1s) de ~spectrometria mas: Mdtodos es[)ecificos para secuenciaci6n (por cjcmplo, de protcinas o de cido: ; nucleicos;b Cristalografiia de rayos X m m

En papel Con alto vvltaje En agarosa En acetato de cclulosa En gel de almidiin En poliacrilamida Poliacrilamida y dotI!ltracentrifugacibn

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de anliIisis, purificacibn y determinacin de estmcturas. Por ejemplo, el campo de la bioquimica de los Ipidos avanz con rapidez gracias a la introduccibn de la crornatografia en capa fina y gas-liquido. El ankliss de la membrana y de muchas protenas era extremadamente dificil hasta la introduccin de la electroforesis en gel de poliacrilamida-dodecilsulfato sdico (EGPASDS); el detergente dodecilsulfonato sdico permiti6 la "solubilizacin" para la electroforesis de muchas proteinas que antes no haban logrado disolverse. Asimismo, el desarrollo de mtodos para la secuenciacihn y clonacion del DNA ha tenido un efecto revolucionario en el estudio de los cidos nucleicos y de la biologa en general.

biornolculas. El lector con algunos conocimientos de qumica orghnica los encontrara familiares. Ciertas enzimas cuya especificidad se conoce, son medios muy poderosos para revelar estas caracteristicas estructurales. El perfeccionamiento en la resolucin respaldado por los adelantos tebricos y tecnolbgicos, est convirtiendo cada vez ms a la espectrometria de masa y a la de resonancia magnetita nuclear (RMN), en los mtodos de eleccin rutinarios para estos analisic. Las estructuras de las cadenas extremadamente complejas de los carbohidratos contenidos en ciertas biomolculas, como las glucoproteinas, se pueden ahora aclarar por la elevada resolucibn de la espectrometra RMN. Una infomacion m8s detallada se logra con la difraccibn de los rayos X y la cristalografia. Su uso fue decisivo para revelar las estructuras dctalIadas de varias protenas, enzimas y la naturaleza de la doble hlice de DNA.

El enfoque experimental requiere anlisis de la funcin y metabolismo de biomolculas, utilizando varias preparacionesLa investigacihn bioqumica inicial en el ser humano y los animales se hizo con el anima1 intacto. Son ejemplos los estudios de la respiracibn y el destino de las sustancias ingeridas. Pronto se descubri6 que el animal ntegro erademasiado complejo para permitir dar respuestas definitivas a numerosas interrogantes. En concordancia, se hicieron preparaciones ms sencillas in vitro, que eliminaron muchas de las complicaciones experimentadas con el animal intacto. El cuadro 2-7 resume los diversos tipos de preparaciones de que se dispone ahora para estudiar los procesos bioquimicos; la mayosia de tos conocimientos presentados en este texto se han obtenido gracias a su uso. El enlistado se

El enfoque experimental requiere la determinacin de la estructura de biomole~ulasUna vez que una biornoIecula ha sido purificada es necesario determinar su estnictura. De este modo puede hacerse una correlacion entre estnictura y funcin. En el cuadro 2 4 se enumeran los metodos principales en uso para analizar la estructura de las

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rueaen sc. 1. Bxtirpaci6n de un 6rgano (por ejemplo. hepatectomia) 2. Alteraciones en la alimentacin (por qjemplo, ayuno-posprandial) 3. AdministraciOn de un frmaco (por ejemplo. fenobarbital) 4. Administracihn de una toxina (por qemplo, tetracloruro dc carbono) 5. uso de iin anirrial cori una enferrned:id especific:a (por cjernplo, diabc:tes sacarina) 6. Emp leo de tecn icas sofistjcadas corrio espectri3scopia R:MN y tam ografia po:r emisibn dc nositrones .. ' Los Cstiid~ub- - .-. ~ v c sur1 a rricnriuu iibiuiugicoh, pcru uueucri x r uiliciics CYCirricruretar debido achrc n i a la intcraccin orgnich mediada por la circulacion ia . . . . -- - nervioso1 central - . En particular higado, ~oraz6n rifiiin son adecuado: y Este mtodo .. -- permite el estudio de un organo aislado de la influencia dc otros o dcl sistema nervioso Especfalnnente se ha n usado cortes de tejido hephtict) Aisli los cortes tisu1ares de otras influencias. pero lar; preparaciimes tiende o . . de alguna1s heras, cn parte debido al suministro inadecuado. . . . . . . -. . . . ac nutrientcs i . Aplicable en particular a lm clulas sangunea, que pueden ser purificad 7.En m u c h a breas de la biologa son indispensah-los culi-. -.de teji les - ivos . - . t . Asegura una prcparacibn qiie no contiene cklul;Ls .. ... :... .,. nur ui~hisisi ehrudiar sus ... 2. Pueden agregarse o removerse comnuestos esneciiiuis rnor eiemniri. v- p - .8p -

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OrganeIos cetulares - aislados . -ente usadoS, por ejemplo, en cstudios de la funcibn mitocondrial Subfraccionamiento de organelos .... ... .... Aislamiento aci=. t= rc v irni uLi aiilisis de cualquier reacciiin o va quirnica pai ri~acin :metabulidi tos - y emirnas " . Clonacidn de genes qu~ t aislamiento del gen clonado es esencial para cstudtar los detalles de su estructura y rcgulaclbn: l It la enzimia o proteinla n la que 1 codifican r t ambitn iuede revel ar b secuencia de a mA

.3. Pucdc ser subfraccionado por centrifugacibn pa.ra pproduciir orgnnelos: celulares i .- -s, para estud i la~ func ~ b de mitricondrias, r*eticuIoencloplsmico n Ampliamente usados

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presenta en orden decreciente de complejidad. Igual que el uso de animal integro tiene desventajas, las dems preparaciones tambiin tienen sus limitaciones. De los procesos usados in vitro pueden derivar resultados erroneos (artefactos); por ejemplo, E homoa geneizacin de las clulas puede liberar enzimas que digieran parcialmente a las molculas celulares.

reacciones responsables de la sntesis de un com-

puesto complejo a partir de uno o miis compuestos simples o de la degradacin de una sustancia hasta su producto final. La existencia de un proceso bioquimico complejo o de cienas vias metabhiicas puede inferirse de las observaciones a nivel del animal intacto. Por ejemplo, observaciones directas de nuestros congeneres indican que los msculos se contraen. Sabemos que la glucosa sirve como fuente de energia para el ser humano y otros animales; por tanto, podemos deducir que debe ser degradada (metabolizada) en el cuerpo para producir energia. Sin embargo, la comprensi6n total de la forma en que la glucosa se metaboliza en las cklulac humanas -su conocimiento est an lejos de ser completo- se requieren anhlisis a diferentes niveles. Lafiqura2-3 muestravarios tipos de observaciones y anhlisis utilizados en un intento por comprender los procesos bioquimicos, como la degradacin inicial de la glucosa para producir ener-

LAS ESTRATEGIAS PARA EL ESTUDIO DE REACCIONES BIOQU~M~CAS COMPLEJAS SON Y EN MLTIPLES NIVELESGran parte de esta obra se dedica a los procesos bioquimicos complejos (por ejemplo, slntesis de proteinas y contraccin muscular), incluyendo las vas rnetablicas. Una va metabhlica es una serie de

14

Bioquimiccr de Hurper

(Capituio 2)

gia (proceso conocido como glucblisis). El esquema de la figura 2-3 se aplica en un nivel general a todos los procesos bioquimicos principales por lo cual representa una estrategia global para diIucidarlos; cada uno de los procesos (glucblisis, oxidacin de los Acidos grasos, etctera) debcdn tenerse en mente al estudiar el texto, aunque no siempre encontrarn lugar todos los puntos mencionados. Algunos puntos importantes del cuadro 2-7 y de la figura 2-3 ameritan discusin. 1) A pesar de la posibilidad de artefactos, es absohtamente necesario aislar e identificar cada uno de los componentes de un proceso bioquimico en forma pura para comprenderlo a nivel molecular. Ms adelante se encontrarn numerosos ejemplos de esto. 2) Tambin es importante ~ o d e reconstituir in vitro el vroceso en estudio. mer diante el ensamblaje sistemtico de sus componentes individuales. Si el proceso no se realiza al ser reensambladas sus partes, una explicacibn puede ser que algun componente critico ha escapado a la identificaci6n y, por tanto, no se ha afiadido. 3) Los adelantos tecnologicos recientes (por ejemplo, en espectroscopia RMN y en tomografia por emisin de positrones [TEP]) han permitido la deteccin de ciertas biomolculas a nivel del &gano intacto y la vigilancia de Eos cambios en sus cantidades con e1 tiempo. Estos desarrollos indican que se esti haciendo posible efectuar anhlisis sofisticados de muchos procesos bioqumicos in vivo. 4) Cuando los resultados obtenidos con el uso de varios planteamientos a diferentes niveles son congruentes, entonces sejustifica concluir que se ha logrado un progreso real en la comprensin del proceso bioqumico en estudio. Si utilizando diversos enfoques, se obtienen incongruencias imporiantes, en toncesdekn inrestigme sus causas hastaobtener explicaciones racionales. 5 ) Las preparaciones y niveles de anhlisis delineados pueden utilizarse para estudiar alteraciones bioquimicas en animales con estados metablicos alterados (como ayuno o ingestin de alimentos) o enfermedades especificas (por ejemplo, diabetes sacarina, o cincer). 6) Muchos de los mktodos y enfoques indicados pueden aplicarse a estudios de ctlulas o tejidos humanos normales o enfermos. Sin embargo, debe tenerse cuidado de obtener material fresco y prestar atencin particular a las consideraciones tticas que se aplican a la experimentaci6n en el ser humano.

Deduccibn de la existencia del proceso bioqumico de la vla metablica por las observaciones hechas a nivel del animal intacto

&Anhlisis de sus mecanismos de control in vrtro

JAnhlisis de sus mecanismos de mntrol in vivo

.1AnBltsis de bc efectos de enfermedades especficas sobre di (por epmpio. errores cong8nitos del metahlismo. cncer)

&SU locallzaubn en uno o mas brganoc

1Su localizacibn en uno o mAs organelos celulares o fracciones sub-

celulares Determinacin del nmero de reacciones que intervienen en 81

3.

4Purificacin de sus susb-atos. productos, enzimas y uifactores individuales u otros componentes

&Establecimientode los mecanismos de control utilizados en l

.1Su reconstruccibn

LEstudios del proceso o vla a nivel genbnm por los mktodos de la tecnologa del DNA recombinante

Figura 23. Esquema de la estrategia general utilizada para analizar un proceso bioqulmim o una va metabblica. Los planteamientos enumerados no necesrtan efectuarse obligadarnente en la secuencia precisa indicada aqu Sin embargo, por lo general mediante su uso se han dilucidado los detalles de los procesos o vas bioquimicos Por tanto, &te es el esquema que se aplica de modo comn a M a s las vias rnetabblicas principales explicadas e n los captulos siguientes

Los Estopos radiactivos pesados han contribuido de manera importante en el ecclarecimienta de procesos bioqumicos

La introduccibn del uso de isbtopos en la bioquimica en el decenio de 1930 tuvo un impacto notable; en consecuencia, su uso merece discusibn especial. Antes de su empleo, era muy dificil "marcar" las biomo-

Itculas de modo que sus destinos metabblicos pudieran vigilarse de modo conveniente. Los estudios iniciales, en particular los de Schoenheimer y sus colaboradores, se aplicaron a la utilizacin de ciertos istopos estables (por ejemplo, D2 y NI5)combinados con su identificacin por espectrometra de masa, para dilucidar muchos problemas bioquimicos. Por ejemplo, pudieron sintetizarse varios arninoAcidos, azcares y iicidos gsasos que contenian un istopo estable adecuado y, entonces, administrarse a un animal o agregarse a una preparacibn in vitro para trazar su destino metablico (por ejemplo, vidas medias y conversi611 a otras biomoltculas). Los compuestos marcados con is6topos estables se utilizaron para investigar muchos aspectos del metabolismo de proteinas, carbohidratos y lipidos. De estos estudios, se dedujo que el metabolismo es un proceso muy activo, en donde E mayora de los compuestos en una cdlula a se estan sintetizando y degradando de manera continua, aunque a velocidades que difieren amplia-

mente. Schoenheimer llam6 a estos hallazgos "lanaturaleza d i n h i c a del metabolismo". La introduccin subsiguiente de los is6topos radiactivos y de instrumentos capaces de medirlos tambin fue muy importante. En el cuadro 2 4 se muestran los isdtopos principales, estables y radiactivos, usados en los sistemas biolgicos. El uso de los dos tipos de istopas es decisivo para el desarrollo de cada irea de Ia bioquimica. La investigacin de las biomolculas complejas y simples, in vivo o ipi vim, se apoya fweftemente en su empleo. El gran avance logrado en la secuenciacib de los hcidos nucleicos y en la rnedici~n de cantidades extremadamente pequeflas de compuestos que se encuentran en los sistemas biolbgims se debe a la radioinmunovaloracin que tambin utiliza isotopos.

LOGROS IMPORTANTES CARACTERIZAN LAS CONTRIBUCIONES DE L A BIOQU~MICA LA CITOLOG~A A Y A LA MEDICINALos siguientes piirrafos resumen los descubrimientos principales en el campo de la bioquimica, en particular en relacibn con la bioquimica humana. Gran parte de este texto desarrolla los temas que aquI se enumeran.

1) Se ha determinado la composicin quimica global de c&lulas,tejidos y 6rganos; los compuestos principales se han aislado y sus estructuras se hanestablecido.

2) Se comprenden, por la menos a un nivel general, las funciones de muchas biomolculas simples, lascuales se describirhn en los capitulas subsiguientes. Tambitn se han establecido las funciones de biomol&culas complejas. Es de capital interks el conocimiento actual de que el DNA es el material gendtico que transmite s informacin a un tipo de u RNA (RNA mensajero, o mRNA) y este RNA a su vez dicta la secuencia lineal de los aminocidos en

las protenas. E! flujo de 3 informacin del DNA a puede ser representado convenientemente como DNA +RNA -+ proteina. Sin embargo, se conocen excepciones importantes de algunos de los enunciados anteriores. El RNA es el material gendtico de ciertos virus. Adems, en algunas circunstancias la informacin contenida en el RNA puede transcrjbirse al DNA; este proceso se conoce como transcripcin inversa y es usado, por ejemplo, por el virus HIV-1 (virus de inrnunodeficiencia humana-1), causa posible del SIDA. 3) El desarrollo de la tecnologa del DNA recornbinante constituye un logro fundamental. Esta tecnologla revolucion6 el estudio de la estructura y funcibn de los genes y tambin tuvo un impacto revolucionario en todos los campos de la biologia, incluyendo la medicina. 4) Se han aislado los principales organelos de las clulas animales y establecido sus funciones principales. 5) Se sabe que casi todas las reacciones que tienen lugar en las clulas son catalizadas por enzimas; muchas de estas han sido purificadas y estudiadas y se han descubierto las caracteristicas generales de sus mecanismos de accin. Aunque la mayora de las enzirnas son proteinas, en la actualidad se ha establecido de manera firme que ciertas moldculas de RNA tambidn tienen actividad biocatalitica. 6) Se han delineado las vas memblicas que intervienen en la sntesis y degradacibn de numerosas biomolCculas simples y complejas. En general, se sabe que 1a va de sintesis de un compuesto es distinta de su via de degradacion. 7) Se han esclarecida algunos aspectos de la regulacidn del metabolismo, 8) Se han reconocido las caractersticas generales de la forma en que las cClulas conservan y utiIizan la energia. 9) Se comprenden muchos aspectos de la esmctura y funcion de las diversas membranas encontradas en la ctlula; sus componentes principales son protenas y lfpidos. 1(3 Se dispone de informacin importante a nivel general sobre el modo de accibn de las hormonas. 1 )Se han descubierto las bases bioqufmicas para un 1 nmero considerable de enfermedades.

g. Isatopo,S princip investigaici6n bioc. J

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1s oropos racliictivnr

QUEDA MUCHO POR APRENDERAunque es importante saber que es mucha la informacin que se ha acumulado, tiene igual relevanciaapreciar lo escaso del conocimiento en numerosas areas. Probablemente los dos problemas principales por resolverrespecto al establecimiento de sus bases bioquirnicas son el desarrollo, la diferenciacibn y la funcin cere-

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bral. Si bien est perfectamente asentada la naturaleza quimica del material gentico, casi nada se sabe acerca de los mecanismos que activan y desactivan a los genes eucariotas durante el desarrollo. Comprender la regulacin gnica es tarnbitn un &ea clave en el aprendizaje de la forma en que las clulas se diferencian y toman cancerosas. El conocimiento de la divisin y el crecimiento celular -tanto normal como malignoy su regulaci6n es muy primitivo. Virtualmente nada se sabe can respecto a las bases bioquimicac de fenmenos neurolbgicos complejos como la conciencia y la memoria. Slo se riene informacibn muy limitada de los mecanismos de la secrecion celular. A perar de cierto progreso, se desconocen los fundamentos moleculmes de la mayoria de las enfermedades genticas principales, pero las tentativas proporcionadas por la tecnologa del DNA recombinante sugieren que en los prximos afios se lograr un progreso notable en esta hrea. Es posible que en el ao 2005 o antes se logre conocer la secuencia del genoma humano; la informacihn disponible gracias a este esfuerzo masivo tendrh un impacto tremendo sobre la biologia humana y la medicina.

pueden separarse por fraccionamiento subcelular y, de este modo, estudiar sus fiinciones en detalle. El avance de la bioqumica ha dependido del aislamiento de biomolkculas celulares. de la dcterminacin de sus estructuras as como del an8lisis de su funcibn y metabolismo. Para investigar la estructura, funci6n y metabolismos d e las biomolculas se han utilizado diferentes planteamientos, desde el anima! ntegro al gen aislado. En particular, el uso de isotopos. tanto estables como radiactivos, ha tenido tremenda importancia en el adelanto del conocimiento hjoqumico. La representacihn:

Transcripcibn

Traslacin RNA-Proteina

DA N-

RESUMENEl carbono, oxgeno, hidrgeno y nitrbgeno son los constituyentes principales de gran parte de las biomolculas. Ademls el calcio, fbsforo, potasio, sodio, cloro, rnagnesio, hierro, manganeso, yodo y otros elementos tienen gran importancia biol6gica y medica. El agua, DNA, R N A , protenas, polisacaridos y lipidos son las molculas principales de clulas y tejidos. Las clulas son las unidades biolbgicas hndamentales. Contienen v e o s organelos que desempeiian numerosas funciones especializadas. Estos organelos

resume la fuerza propulsara de gran parte del esfuerzo contemporneo en boqumica. No obstante, se han hecho muchos otros avances en el conocimiento de la bioquimica, como la apreciacibn de la ~omposicibn corporal y la comprensibn parcial de estructuras y funciones de enzimac, hormonas y membranas. Se han descubierto las bases bioqumicas y genticas de numerosas enfermedades y la aplicacin reciente de la tecnologa del DNA recombinante ha acelerado enormemente el progreso en esta rea. Sin embargo, an es mucho lo que se desconoce; los retos principales para el futuro incluyen definir ("mapear") el genorna humano y proporcionar explicaciones moleculares de los mecanismos que intervienen en el desarrollo orghnico, la diferenciacibn celular y !a funcin cerebral. M

REFERENCIASFreifelder D: Phys~cal Biochemistry: Applicaiions to Rin-

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Victor W. Rodwell, PhD

Ld5 biomolecula~ polarcs orghicas e inorgnicas de 1% clulas vivienles existen y reaccionan de manera priniariri en un ambiente acuoso El agua, una molcula y notable esencial para la vida, solubiIi75~ modifica las caractersticas de biomolculas coino hcidos nucleicos, protcinas y carbohidratos al formar puentes de hidr6geno con sil? grupos fi~nciotiales.Estas interacciones mridifican las propiedades de las biomolculas y si15conformaciones en solucicin. ],os cambios le dan a las molkciilas ias propiedades esenciales para el ciclo de la vida. [,si$ biornolculas -aun aqullas relativamei1:e no pulares, tales como ciertos lipidos- tambiti inodificw las propiedades del agua La comprensin de 3us mecanismos honieostticos utilizados por los organismos para conservar un entorno intraceliilar relativamente constante debe considerar el pH y el amortiguarnierito en liquidos corporales y compartimienlos siibcelulares. Por ultimo, el comportamiento de disociacin de los gmpos funcionales de biomol~culas soJuci6n acuosa a diversos valores en de pH e? critico cn la comprensiti de sus reacciones y propiedades tanto en clulas vivas corno en el laboratorio

IMPORTANCIA B I O M ~ D I C AIda homeostasis, conservaci6n de la cornposic~n del rnedio interno que es esencial para la salud, incluye considerar la distribucihn dcl agua en el cuerpo y la preservaci~n del ptl as como de concentmciones clecirol iticas apjopiadas. Dos terceras partes del agua corporal total (55 a 65% del peso corporal eri varones y alrededor de 10% menos en mujeres) cs liquido intracelular. Del liquido extracelular remanente, el plasma sanguineo constituye cerca de 25 por ciento.

La regulaciiin del equilibrio hdrico depende de mecanismos hipcitalinicos para controlar la sed, de la hormona aiitidiurdtica y de la retencin o excrecion del agua por los riilones. 1.0s estados de deplecin de agua y exceso de Iqiiido corporal son bastante comunes. En inuchos casos se acompaan de deficiencia o exceso de sodio. Las causas de dealecibn hidrica son a una disminucin de la ingestin (por ejemplo, en estados de coma) e increniento de la perdida (por ejemplo, perdida renal en la diabetes sacarina, cuthnea por sudacin intensa y gastrointestinal eii diarrea intensa en lactantes y en ctilera). Las causas de exceso de agua corporal se deben al incremento en la ingertin (por ejemplo, excesiva administracin de liquidos IV) y excrecibn escasa (por ejemplo, en insuficiencia renal grave). Ciertos niecanismos osrnticos y no osmticos protegen el agua y la htirneostasis osrn0tica del liquido extracelular. Tanto la conservacibn del agua por la atitidiuresis como la ingestihn de liquido por la sed, sirven para mantener la homeostasis. Incrcmentos tan pequefios como 2% en la osmolaridad del liquido r:xtraceluIar pueden provocar sed y Iiberacihn de liorniona antidiurtica (ADH) en la hipfi~is.Un mecanismc) algo menos sensible desencadena la Iiheracin no osmlica de ADH y la sed, cuando disminuye 10nA volumen de liquido circulante extracelular. La el diabetes inspida nefrogeiia, de origen gentico, se caracteriza por sed extrema, ingest icin abundante de agua e incapacidad para concentrar la orina o para responder a cambios sutiles en la osmolaridad de liqiiido extracelular; esto se dehc a la incapacidad de los osmorreceptores de ADH en los tbulos renales para responder a la ADH. La conservacin del liquido extracelular dcntto de un p1-E entre 7.35 y 7.45, cn donde el sistema amortiguador de bicarbonato tiene una funcihn importante, es cscncial para la salud. Las alteraciones del equilibrio acidobsico se diagnostican en el labora-

torio clnico por medicibn del pH de la sangre arteria1 y el contenido de COZde la sangre venosa. Las causas de la acidosis (pH sangutneo < 7.35) incluyen cetoacidosis dabdtica y acidosis 1Actica; m e t a que las de inrs la alcalosis (gH sanguineo > 7.45) comprenden el vbmito de contenido cido gstrico o el tratamiento con ciertos diun5ticos. Un diagnstico preciso y un rpido tratamiento del desequilibrio hidrico y de las alteraciones acidobiisicas se apoyan en gran medida en la comprensi6n de los conceptos considerados en este capitulo.

de hidrgeno escasos en electrones forman una regi6n de carga positiva local. El trmino "dipoEoV se refiere a molculas como el agua que tienen carga electrica (electrones) distribuida en forma desigual alrededor de su estructura.

El amoniaco tambin es dipolar y tetradricoEn el amoniaco, los angulos de enlace entre hidrbgenos (107 grados) se aproximan al ngulo del tetraedro aun miis que en el agua (figura 3-2). Muchos compuestos qumicos son dipolos. Entre ellos se Incluyen alcoholes, fosfollpidos, aminohcidos y hcidos nucleicos.

EL AGUA ES UN SOLVENTE BIOLGICO IDEAL El agua es una molcula tetradrica ligeramente asimtricaLa molCcula del agua es un tetraedro irregular con oxgeno en el ceno (figura3-1). Los dos enlaces con hidrbgeno se dirigen hacia dos vrtices del tetraedro, en tanto que los electrones no compartidos del oxigeno en el orbital 2sp3 hbrido ocupan los dos vertices restantes. El ngulo entre los dos Atomos de hidrogeno (105 grados) es algo menor que el Angulo del tetraedro (109.5 grados), formando una figura geomdtrica ligeramente asimktrica.

LAS MOLCULAS DE AGUA FORMAN PUENTES DE HIDRGENOLos puentes de hidrogeno confieren una estructura macromolecularDebido a su caricter dipolar, las molculas de agua pueden asumir conf~rtmaciones ordenadas (considerese un copo de nieve). Al igual que el hielo, el agua liquida muestra una estructura rnacromolecular ankloga a la disposicibn ggeom&tricade las molkculas de agua en el hielo. La propiedad de las moltculas de agua de unirse unas con otras tanto en estado lquido como sblido surge del carhcter dipolar del agua. Se conserva como liquido ms que como sblido debido a la naturdeza transitoria de estos complejos macromoleculares (la vida media de asociacibn-disociacidn de las molculas de agua es de alrededor de un microsegundo). En estado sdlido, cada moltcula de agua se une con otras cuatro. En estado liquido, el nmero es algo menor (mlis o menos 3.5). Con excepcibn de

Las rnolculas de agua forman dipolosDebido a la estructura tetradrica asimktrica, la carga elctrica no se distribuye de manera uniforme alrededor de la moltcula de agua. El lado de1 oxigeno opuesto a los dos hidrbgenos muestra cierta riqueza de electrones, en tanto que del otro lado, los ncleos

Figura 3-1. Estructura tetrabdrica del agua

Flgura 3-2. Estructura tetraMrica del amoniaw

Agua y pH

a

19

la naturaleza transitoria de las interacciones intermoleculares en el agua liquida, ksta se parece al hielo en su estructura macromolecular mSis de lo que en un principio se imaginaba. El cariicter dipolar de las moldculas de agua favorece los enlaces mutuos en conformaciones ordenadas con una geometra precisa dictada por la configuracibn interna de cada molcula de agua (figura 3-3). La interaccin electrostAtica entre el nijcleo de hidrdgeno de una moldcula de agua y el par de ekctrones no compartidos de otra se denomina puente de hidrgeno. Comparados con enlaces covalentes, los puentes de hidriigeno son bastante debiles. Romper un enlace de hidrgeno en agua Iquida requiere alrededor de 4.5 kcal de energa por mot -ms o menos 4% de la energa que se requiere para romper el enlace O-H del agua ( 1 I O kcal/mol).Los puentes de hidrgeno estabiliran protenas y cidos nucleicosEn tanto que el metano (peso molecular 16) y el amoniaco (peso molecular 17) son gases a la temperatura ambiente, e l agua (peso molecular 18) es un liquido. Por quc es ast? L a respuesta se apoya en la capacidad del agua para formar puentes de hidrogeno, lo cual explica tambien su viscosidad y su tensibn superficial relativamente altas. La propiedad del agua de servir como solvente para iones y numerosas mol&culasorghnicas se debe a su carcter bipolar y a su capacidad para formar puentes de hidrhgeno. Las molCculas que pueden formar puentes de hidrgeno con el agua (por ejemplo, compuestos con radicales 4 N o S H , aminas,

esleres, aldehidos y cetonas) se sotvatan con facilidad lo que por su solubilidad en agua aumenta. As, las

proteinas solubles estn recubiertas con una capa de agua formada por intercambio de enlaces de hidrbgeno intermoleculares superfjciales por puentes de hidrgeno intramoleculares del agua, lo que incrementa la solubilidad. El carcter dipolar del agua afecta profundamente sus interacciones con las biomoltculas, En el ambiente acuoso de las cClulas vivientes se producen muchas interacciones entre cargas y grupos polares de l s biomolculas. El DNA se pliega a de modo que expone su azcar y sus grupos fosfato polares a las moiculas de agua. De manera similar, residuos polares de proteinas se presentan primariamente en la superficie biopolmera donde participan extensamente en interacciones con las molculas de agua. La figura 3 4 ilustra la formacibn de puentes de hidrgeno entre el agua y grupos funcionales repreN6tese que los alcoholes, sentativos de biomol~culas. del mismo modo que el agua, pueden participar como donadores y como aceptores de hidrgeno en la formacin de puentes de hidrdgeno con agua o con otras biomoltsculas. Grupos apolares como aquellos presentes en hidrocarburos no tienen capacidad para formar uniones hidrbgeno y, por tanto, son insolubles en agua. No obstante, estos grupos no polares pueden afectar la estructura hidrica. Cuando se aaden el agua, las molculas apolares forman gotas esfericas con una supeficie mnima expuesta al agua; este fenbmeno se ilustra con la tendencia del aceite de olivo en agua fria para formar una sola gran masa flotante. La reduccibn a mlnimo de la superficie apolar expuesta al agua es E un proceso gobernado entrpicamente. La presencia de moltculas apolares reduce el numero de posibles orientaciones (grados de libertad) de las rnol~culas

Figura 3 3 . Izquierda: Reunibn de dos mol&culasdipolares de agua. La lnea punteada representa un puente de hidrgeno. Nbtese que una mol8wla dada de agua puede actuar como donador o como aceptor de hidrbgeno, o ambas cosas a la vez Derecha: Unldn de una rnol6cula central de agua con otras cuatro mol6culas mediante puentes de hidrgeno. Esta estructura es tpica deT hielo y, en menor grado, del agua lquida.

Figura 3-4. Fomacibn de puentes de hidrbgeno entre un alcohol y agua, entre dos molbculas de etanol y entre el oxigeno carbonilo de un pbptido y el hidrbgeno del grupo amino de otro pkptido adyacente.

'

adyacentes al agua por lo que se acompafa de un incremento en la entropa. La reduccin al minimo del rea de la superficie apolar expuesta permite el m k i m o grado de libertad (por ejemplo, desorden mximo) de las mo!culas de agua cercanas y, por tanto, reduce al mnimo el incremento en entropa. En el agua. los hidrocarburos forman estructuras clatrato rgidas (semejante a cajas). De manera similar, en el ambiente acuoso de las ctlulas vivientes, las partes no polares de los biopolmeros tienden a situarse dentro de su estructura. minimirando asi su contacto con el agua.

109 molculas de agua. N o obstante, los iones hdr0geno y oxhidrilo contribuyen de modo significativo a las propiedades del agua. La disociacion del agua,

Las molculas de agua presentan una tendencia ligera a disociarse, lo cual es fisiolciqicarnente importanteLa propiedad del agua de ioni~arse, aunque de modo ligero, tiene importancia capital para la vida sobre la tierra. Dado que el agua puede actuar como un hcido o como una base, es posible representar su ionizacibn como una transferencia protnica intermolecular, que foma un ion hidronio (I.I,O&) un ion hidr6xido (OH-): y

donde los t6rminos entre parntesis representan concentraciones molares de iones hidrbgeno, iones oxhidrilo y rnolkculas de agua sin disociar*, rnlentras que la K es la constante de disociacin. Para calcular este valor, recurdese que una molkula de agua pesa 1& g. Por tanto, un litro (1 000 g) de agua contiene 1000 + I g = 55.56 moles. Asi, la concentracin del agua pura es 55.56 molar. Ya que la probabilidad de que un hidrbgeno en agua pura exista como ion H' es de 1 .S x 1 Omy, la concentracin molar de iones H' (e de iones OH-)en agua pura se calcula multiplicando la probabi tidad, 1.8 x 1 Q4, por la concentracion molar del agua, 55.56 moIL. Este resultado es 1 x 10" rnoYL. Ahora puede calcularse la K para el agua:

., En realidad, el protbn transferido est6 asociado con un racimo de: mol$culas de agua y existe en solucion, no siilo como H30- sino como algo semejante a HrOz' o H703'. Aunque para propsitos prhcticos este protbn ' al parecer 'Vesnudo" se escribe casi siempre como "H'",no debe olvidarse que de hecho esta fuertemente hidratado. Ya que los iones se recombinan de manera continua para formar rnolcu2as de agua y viceversa, no puede definirse si un hidrgeno o un oxigeno deterrninado tiene el estado de ion o de una parte de una moicula de agua En un instante estn como ion; un momento despus como una parte de una mol6cula. Por fortuna, no es necesario considerar iones o molkculas individuales. Dado que 1 g de agua contiene 3.46 x molculas, su ionizacin puede describirse por estadstica. Es suficiente conocer la probabilidad de que un hidrbgeno estC presente como ion o como parte de una molcula de agua. Establecer que la probabilidad de que un hidrbgeno exista como un ion es 0.01 significa que un tomo de hidrhgeno tiene una oportunidad en 100 de estar como ion y 99 posibilidades en 100 de estar como parte de una rno4&culade agua. La probabilidad real de que un Atorno de hidrhgeno en agua pura exista coma ion hidr6geno es alrededor de 0.0000000018 o 1.S x 104. En consecuencia, la probabilidad de estar como parte de una rnotecula es casi la unidad. Definido de otra manera, por cada ion hidrbgeno y cada ion oxhidrilo en agua pura, hay 1.S bi tlones o 1 .X x

La elevada concentracin de agua molecular (55.56 moYL) no se afecta de manera significativa por la disociacibn. Por tanto, resulta conveniente considerarla en esencia como una constante, que luego puede incorporarse a la constante de disociacin, K, para crear una nueva constante, K,, designada el producto ibnico para el agua. La relacin entre K y K se , muestra a continuacin:

Ntese que las dimensiones de K son moles por litro y las de K, molesZpor litro2.Como su nombre sugiere, el producto inico, K,, es en cifras igual al producto de las concentraciones rnolares de H ' y OH-:

* Estrictamente hablando, los tCrtninos entre parkntesis reprcsentan la actividad molar en lugar de la concentracinmolar.m

A 25 OC,K = (1 0-'j2 = I O' (molJL)'. A temperaturas , -' que a menores a 25 O C , K, es menor de 10-'"mientras superiores a 25 O C , es mayor de 1 O-". Por ejemplo, a la temperatura del cuerpo humano (37 "C),la concentracin de iones H' en agua pura es algo mayor de 1 mol/L. Dentro de las lim itaciunes establecidas por el efecto de la temperatura, K, = lW4 (mol/L)' para todas las soluciones acuosas, incluso las que contienen acidos o bases. Esta constante se usarii en el clculo de valores de pH para soluciones cidas y alcalinas.

Los siguientes ejemplos ilustran el modo de calcular el pH de soluciones cidas y alcalinas. Ejemplo: cul es el pH de una solucin cuya concentracibn de ion hidrgeno es 3.2 x 1O-' mol/L?PH = - 109[H+] = log (3.2 x lo4) = - log (3.2) - log (104) = - 0.5 + 4.0 = 3.5

-

EL pH ES EL LOGARlTMO NEGATIVO DE LA CONCENTRACI~N DEL ION HIDR~GENOEl trmino pH fue introdiicido en 1909 por Sorensen. quien lo defini como el logaritrno negativo de l a concentraci~n iones hidrgeno: depH = - log [H']

Ejemplo: Cul es el pH de una colucihn cuya concentracion de ion oxhidrilo es 4.0 x 1O4 mol/L? Para abordar este problema, hay que definir una cantidad pOH, que sea igual a -1og [OH-] y que puede derivarse de la definiciiin de Kw:

por tanto:

Esta definicin, aunque no es rigurosa*, es adecuada para la mayor parte de los estudios bioquimicos. Para calcular el pH de una solucihn se debe: 1) Calcular la concentracin del ion hidrdgeno, 2) Calcular el logaritmo de base 10 de ['. w] 3) El pH es el negativo del valor encontrado en el paso 2. Por ejemplo, para agua pura a 25 O C :pH = -lag [HJ = - log

Para resolver el problema bajo estc enfoque:

W+l.

= - (-7) = 7.0

Ahora:

],os valores de pH bajos corresponden a concentraciones elevadas de H- y los valores de pH altos a concentraciones bajas de H'. Los cidos son donadores de protones y las bases son aceptores de pmtones. Sin embargo, se hace una distincin entre cidos fuertes (por ejemplo, HCI, H:SOd), que se disocian completamente aun en soluciones muy cidas (pH bajo) y los iicidos dbiles, que se disocian solo de manera parcial en selucones bcidas. Una distincin semejante se hace entre bases fuertes (por ejemplo, KOH, NaOH) y bases debiles (por ejemplo, Ca[OH]:). S610 las bases ruerics sc disocian a pH alto. Muchas sustancias bioquimicas son Bcidos ddbiles. Las excepciones son tos intermediarios fosforilados, que poseen el grupo acido fosfrico primario fuertemente acdico.

Ejemplo: Cuales son los valores del pH de a) 2.0 x 1OA2mol/L de KOH y de b) 2.0 x 1 Oa m o l k de KOH? Los oxhidrilos proceden de dos fuentes: KOH y agua. Dado que el pH esta determinado por el [HA] (y totai pOH por el [OH-] total), es preciso considerar los dos orgenes. En el primer caso, la contribucion del agua al [OH-] total es despreciable. No puede decirse lo mismo en el segundo caso

Molaridad di:KOH

[OH-] KC)H de[OH-1 del agua

2.0 x . -

* pH = -log (actividad dcl H +).

(Capitulo 3)

Una vez que se ha comprendido el significado de la contribucihn del agua, el pM puede calcularse como se describid. En los ejemplos anteriores, se asurni6 que la base Fuerte KOH estaba completamente disociada en la solucin y que, por tanto, la concentracion molar de iones OH-era igual a la concentracin molar de KOH. Esta aseveracin es vlida para soluciones relativamente diluidas de bases o cidos fuertes, pero no para soluciones de acidos o bases dbbiles. Dado que estos electrlitos dkbiles se disocian slo un poco en soluci6n, se debe calcular la concentracidn de H (o ' de [OH-1) producida por una molaridad dada del hcido (o base) usando la constante de disociacin antes de calcular [H'] total (o [OH-] total) y, posteriormente, calcular el pH.

Las potencias relativas de cidos y bases dkbiles se expresan de manera cuantitativa como sus constantes de disociacibn, que expresan su tendencia a ionizarse. A continuacibn se muestran las expresiones de la constante de disociacidn (K) para dos cidos dbiles representativos, R-LOOH y R-NHJ-.

Dado que los valores numricos de K para hcidos dbiles son exponentes negativos, es conveniente cxpresar a K como pK, donde:

Los grupos funcionales que son cidos dbiles tienen un gran significado fisiolgicoNumerosos compuestos bioqulmicos poseen grupos funcionales que son cidos o bases dkbiles. En todas las protenas y cidos nucleicos existen uno o ms de estos: carboxilos, aminos o fosfatos derivados de la disociacin secundaria de esteres de fosfato; tambihn los hay en la rnayoria de las coenzimas y los metabolitos intermediarios. Por tanto, el comportamiento de disociacibn (equilibrios protnicos) de grupos funcionales dbiles, hcidos o bhsicos, es fundamental -para comprender la influencia del pH intracelular en la estructiira y actividad bioquimica de estos compuestos. Su sepmtci&ne identificacin en los laboratorios clinicos y de investigacidn se facilita tambidn cuando se conoce el comportamiento de disociacibn de sus grupos funcionales. A la forma protonada de un hcido (por ejemplo, HA o RNH?') se le designa como el hcide y a la forma no protonada (por ejemplo, A- o RNH?}, base conjugada. De igual modo, es posible referirse a una base (por e.jemplo, A-o RNH2) y su hcido conjugado (HA o RNH3'); la palabra proviene del latln, cuniungre: reunirse). Los hcidos dbiles representativos (izquierda), sus bases conjugadas (centro) y tos valores de pK (derecha) incluyen lo siguiente:

Ntese que la relacibn de pK con respecto a K es igual a la de pH con la concentracion de H'. El cuadro 3-1 enumera valores de K y pK ilustrativos para un cido monocarboxlico, dicarboxlico y tricarboxlico. Observese que los grupos hcidos ms fuertes tienen los valores de pK mas bajos. De las ecuaciones anteriores que relacionan K a [ ' y a las concentraciones de un cido no disociado H] y su base conjugada, nbtese que:

o cuando:

entonces,

En otras palabras, cuando las especies asociada (protonada) y disociada (base conjugada) estn presentes

C u a d r o 3-1. Constantes de disociacibn y valores de1 pK para cidos carhoxllicos r e ~ r e s e n t a t k o s

-

.--Acktico

A

GlutdricoCitrico

(primero) 8.40 x 1 O4 (segundo) 1.80 x 1

3.08

Agua y pH

23

en concentraciones iguales, la concentracin prevalente de ion hidrgeno [H'] numh-icarnente iguat a la es constante de disociacion, K. Si se obtienen los logaritmos de los dos lados de la ecuacibn anterior y la ecuacin completa se multiplica por -1, las expresiones serfan las siguientes:

Se multiplica todo por -1 :

- 109 [HT = - lag K - toa I 4 H[A7

- log K = - iog [HTAhora, -log K se defnib como pK y -1og [H'] es la definicibn de pH. La ecuacin puede quedar como:

K = [H']

Se sustituye pM y pK en lugar de -log [Ht] y -lag K, respectivamente; luego:

es decir, el pK de un grupo 4cido es el pH al cual Ias especies protonada y no protonada esthn presentesen la misma concentracin. El pK de un &ido puede determinarse de modo experimental agregando 0.5 equivalentes de iilcali por cada equivalente de acido. El pH resultante seri igual al pK del cido.

Para eliminar el signo negativo se invierte el Itirno

El comportamiento de cidos dkbiles y de amertiguadores se expresan par la ecuacin de Henderson-HasselbalchEl pH de una solucihn que contiene un Bcido dbil se relaciona con la constante de disociaci6n de dicho acido, como se mosirb antes para el agua como Acido dbil. La relacin puede establecerse en la forma convenientede la ecuaci6n de Henderson-Hasselbalch, que se desarrolla desputs. Un acido ddbil, HA, se ioniza de la manera siguiente: HA = H+ + A-

La ecuaci6n de Henderson-Hasselbalch ha probado ser una expresin de gran valor predictivo en equilibrios protonicos. Por ejemplo:

1) Cuando un hcido se ha neutralizado exactamente a la mitad [ A 7 = [HA]. En esta situacibn,1 [HAI pH = pK + log f l = p ~ + ~ o g ~ = p ~ +

Por tanto, con 50% de neutralizacibn, pH PK.2) Cuando la proporci6n [A-JI[HA] = 100:1,

=

La constante de equilibrio para esta disociacibn se escribe:

3) Cuando la proporcin [A-]/[HA]

=

1 : 10,

Se multiplican los dos trminos entre si:pki = pK

+

log %o = PK

+ (-1)

Se dividen ambos miembros entre [A-]:

Se obtiene el logaritmo de toda la ecuacibn:log [H7 = log K

Si la ecuacin se valora en varias proporciones de [A-]/[HA] entre los limites 103 y 1O-? y los valores de pH obtenidos se grafican, el resultado describe la curva de titulacin para un a cido dbil (figura 3-5).

(E)

y

Las soluciones de cidos debiles sus sales amortiguan e pH lLas sofuciones de cidos dkbiles y sus bases conjugadas (o de bases dtbiles y sus k i d o s conjugados)

24

Bioquinaica de Harper

Figura 3-5. Forma general de una curva de tlulacibn calculada con la ecuacin de Hende~on-Hasselbalch.

Obskwese que el cambio de pH por miliequivatente de OH- agregado vara de modo notable dependiendo del pH iniciai. A valores de pH prximos al pK, la soluciOn resiste los cambios con mayor eficacia y se dice que ejerce un efecto amortiguador. Las soluciones de cidos dbiles y sus bases conjugadas amortiguan mejor en valores de pH que oscilan alrededor de pK k 2.0 unidades de pH. Ecto significa q u e para amortiguar una solucin a pH X, deberfi usarse un Acido o una base dbil cuyo pK no se separe mas de 2.0 unidades de pIJ del pH X. En la figura 3-6 se muestra la carga neta en una rnoltcula del cido como funcihn del pH. Una carga fraccionaria de -0,s no significa que una molcula individual posea una carga fraccionaria sino que 0.5 es la probabilidad estadstica de que una rnolkcula dada tenga una carga negativa. La consideracin de la c