biomarcadores en suero candidatos para adenocarcinoma en próstata identificados por diferencias del...
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Biomarcadores en Suero Candidatos para Adenocarcinoma en Próstata Identificados por Diferencias del ARNm en Tejido Prostático y Verificados con Mediciones de Proteínas en Tejido y Sangre
E.W. Klee, O.P. Bondar, M.K. Goodmanson, R.B. Dyer, S. Erdogan, E.J. Bergstralh, H.R. Bergen III, T.J. Sebo y G.G. Klee
Marzo 2012
www.clinchem.org/content/article/58/3/599.full
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AntecedentesAntecedentes
Se necesitan pruebas mejoradas para la detección y manejo de cáncer de próstata
Se plantea la hipótesis de que: La expresión genética diferencial en tejido
prostático podría ayudar a identificar biomarcadores en sangre candidatos para cáncer de próstata
Podría utilizarse la sangre de varones con enfermedad prostática avanzada para verificar la presencia de biomarcadores en la circulación
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MétodosMétodos Marcadores candidatos identificados usando patrones de expresión de ARNm de tejido prostático microdiseccionado capturado por laser
Expresión del tejido confirmada usando inmunohistoquímica (IHC) para el subconjunto de candidatos que tienen antisuero comercial
Extractos de tejido analizado con espectrometría de masa en tandem (MS/MS)
Concentraciones de sangre medidas usando: Inmunoensayos MS/MS de tripsina asimilada, péptidos
inmunoestractados
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Figura 1. Procesos usados para identificar nuevos biomarcadores candidatos y medir proteínas en tejido y sangre. LCM, Microdisección capturada por laser.
Diseño del Diseño del EstudioEstudio
Medición de expresiones de ARNm en tejido
LCM PCa
Uso de bioinformática para predecir biomarcadores
secretados
35 nuevos candidatos
Búsqueda con MS/MS para estos biomarcadores
previstos en extractos de tejido PCa
5 biomarcadores
Péptidos sintetizados e isótopos estables
Hacer antisuero anti-péptido de conejo
Uso de bioinformática para predecir la asimilación de péptidos de tripsina para
estos biomarcadores
24 biomarcadores
¿Biomarcador Glicosilado?
Albúmina agotada y proteínas abundantes
del suero
Asimilación de tripsina de extractos de suero
Extracción del suero con concanavalina A
7 biomarcadores
Si
MS/MS dirigido a la medición de
péptidos
Concentrado usando antisuero antipéptido
11 biomarcadores
Asimilación de tripsina
No
¿ELISA disponible?
¿Antisuero IHC
Disponible?
Fin
Inmunohistoquímica de tejido normal y con PCa
13 biomarcadores
ELISA de suero PCa y controles
8 biomarcadores
Si
No
No
11 biomarcadores diferentes
Si
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Evaluación de Proteína en TejidoEvaluación de Proteína en Tejido
Inmunohistoquímica
Muestras
Tejido FFPE (N=20 pares)10 muestras, Gleason 5 o 610 muestras, Gleason 8 o 9Muestras de tumor han empatado con tejido benigno adyacente
QTOF MS
Muestras
Tejido PCa Congelado (N=2 pares)Gleason 9, T3aN0+ tumorGleason 7, T3aN0-
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Análisis MS/MS de Extractos de TejidoAnálisis MS/MS de Extractos de TejidoMuestras por electroforesis en gel de SDS-PAGE y proteínas asimiladas in-situ.
Identificación de Péptido por espectrometría de masas usando Espectrómetro de Masas Híbrido LTQ OrbitrapResultados: Se identificaron 5 marcadores candidatos, 3 con concentración elevada en muestras de tumor:
ASPN PGLS RPL22L1
Prostate= PróstataControl= ControlProtein= Proteína
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Tabla 1. Inmunohistoquímica (13 marcadores).C, tejido de cáncer de próstata; N, tejido normal adyacente; 0, sin tinción; 1, tinción débil; 2, tinción moderada; 3, tinción fuerte. P-valores de prueba de signo de una cola.
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Ensayos de Proteína en SueroEnsayos de Proteína en Suero
Los inmunoensayos estaban disponibles MS/MS
Extracción de Glicoproteínas con Lectinas Tripsina Digerida y Péptidos inmuno extracto
Muestras: Alícuotas congeladas de suero y EDTA Casos: 50 varones con cáncer de próstata
avanzado Controles: 26 varones con biopsias recientes de
próstata− 13 PCa libre de cáncer− 13 con PCa en bajo grado
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Resultados de InmunoensayoResultados de Inmunoensayo
** Rango Significativo de Sumatoria de Prueba cuando se compara con suero de cáncer de próstata avanzado y suero control (P < 0.05)
Biomarcador Vendedor Resultados
APO-C1 AssayPro 8/50 **
C4A Assay Design 4/50
CCL19 R&D Systems 2/50
COMP Immuno-Biology 0/50
CXCL11 R&D Systems 7/50 **
CCXL14 R&D Systems 2/50
CXCL9 R&D Systems 13/50 **
Factor V Aniara 8/50 **
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Método de Ensayo de Suero MS/MS (Baja Abundancia)Método de Ensayo de Suero MS/MS (Baja Abundancia)
49 Péptidos sintetizados representando a 25 biomarcadores
Conejos inmunizados con anticuerpos para péptidos
Péptidos extraídos como objetivo Primeras proteínas de alta abundancia agotadas Después sangre asimilada para hacer péptidos Finalmente uso de anticuerpos de conejo para extraer
péptidos.
Péptidos medidos usando Espectrometría de Masas (MS/MS)
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Fraccionamiento del suero antes del MS/MS
Extracción de Concanavalina-A1 mL de Suero
Asimilación de Tripsina
Arreglo B de Anticuerpos afinesOGDHL:673ASPN:153F5:2151B3GNT1:162PCSK6:597
Asimilación de tripsina
Merma de Proteína Mars-14, alta abundancia de proteínas en 1mL
de suero agotado
Arreglo C de Anticuerpos afinesCOL9A2:198OGDHL:673ALDH3B2:121PCSK6:597PGLS:214RPL22L1:15COMP:485
Arreglo A de Anticuerpos afinesCOL2A1:871PCDHGA4:265CHD7:142PCDHB10_72APOF:232
Agregar estándares Isotópicos y
cuantitativos en MS/MS
Fracción de elusión
Elude
Fluye a través
Elude
Fluye a través elusión
Elude
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Resultados del Ensayo MS/MS Resultados del Ensayo MS/MS
** Rango significativo de la suma de pruebas (P < 0.05) para la separación de cáncer avanzado de otros grupos
Biomarcador Afinidad de Col MS/MS
Resultados
APOF A 2/50
ASPN B 26/50 **
C1orf64 A 0/50
CDH7 A 11/50
COL2A1 A 5/50
Factor V B 23/50 **
PCSK6 B,C 8/50, 4/50 **
PGLS C 7/50
RPL22L1 C 11/50
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Trazos de mediciones secuenciales para el Trazos de mediciones secuenciales para el Arreglo A para A) ELISA y B) MS/MS Arreglo A para A) ELISA y B) MS/MS
Sequence analysis order= Orden de secuencia de análisisAnalysisi order on..=Orden de análisis en…Analysisi sequence order: Orden de análisis secuenciado
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Trazos de mediciones secuenciales para Trazos de mediciones secuenciales para Arreglo en cadena de MS/MS B y C Arreglo en cadena de MS/MS B y C
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ConclusionesConclusiones
Se identificaron 7 nuevos biomarcadores estadísticamente significativos en la discriminación de concentraciones de proteína en sangre de varones con cáncer de próstata comparados con los controles:
APOC1, ASPN, COMP, CXCL11, CXCL9, F5, y PCSK6
Se identificaron adicionalmente 4 nuevos biomarcadores con concentraciones elevadas en suero en al menos el 10% de muestras de cáncer de próstata avanzado comparadas con los controles:
CDH7, COL2A1, PGLS y RPL22L1
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