biologie molÉculaire (cours de 1Ère annÉe). plan du cours introduction gÉnÉrale - définition :...
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BIOLOGIE MOLÉCULAIRE
(COURS DE 1ÈRE ANNÉE)
PLAN DU COURSINTRODUCTION GÉNÉRALE
- Définition : biologie moléculaire
STRUCTURE ET PROPRIÉTÉS GÉNÉRALES DES ACIDES NUCLÉIQUES
- Structure : ADN et ARN
- Propriétés biologiques et chimiques du DNA
ORGANISATION DES GÈNES ET RÉPLICATION DU DNA
- Comparaison cellules procaryotes et eucaryotes
FLUX DE L ’INFORMATION GÉNÉTIQUE : MÉCANISMES MOLÉCULAIRES DE L ’EXPRESSION DES GÈNES
- TRANSCRIPTION DU DNA OU BIOSYNTHÈSE DU mRNA
- TRADUCTION OU BIOSYNTHÉSE DES PROTÉINES
EXPLORATION ET MANIPULATION DES GÈNES : BIOTECHNOLOGIE DE L ’ADN RECOMBINANT
- Clonage des gènes
- Transgénèse
NOTIONS SUR LA PATHOLOGIE DU DNA
- Mutation
- notion de thérapie génique (gène médicament)
INTRODUCTION GÉNÉRALE
Définition de la biologie moléculaire = étude de la vie à l ’échelon moléculaire : domaine très vaste (trop?) de la biologie.
= commande, mise en œuvre et régulation des fonctions moléculaires (cellule, tissu, organisme)
S1
S2
Survit
division
S3
différenciation
Mort cellulaire physiologique
(apoptose)
S4
Biologie du gène = biochimie génomique
(Réplication de l ’ADN)
Biosynthèse des protéines = traduction
Expression de gènes spécifiques
Fragmentation de l ’ADN
ADN = molécule universelle de l ’hérédité chromosomique (excepté certains virus)
n=23Cellules germinales
= gamètes
n=23
2n=46
méiose
fécondationmâle femelle
Cellules haploides
Cellule diploide
Transmission de l ’ADN = caractères génétiques d ’un individu
Transmission d ’une altération de l ’ADN = pathologies moléculaires (mucoviscidose, drépanocytose, myopathies …)
-développement
-différenciation
-métabolisme ...
Flux de l ’information génétique
Gènes = ADN ARN m protéines
réplication
transcription traduction
ARN tEffets biologiques
Régulation : activation ou répression
ADN et ARN = commande la vie cellulaire Protéines = effecteurs
Altération de l ’ADN ou ARN protéine défectueuse situation pathologique (ex. cancer)
Grandes étapes des avancées en biologie moléculaire
1865 : Travaux de Mendel : (publiés par De Vris en 1900) théorie de l ’hérédité particulaire
1880-1920 : hérédité chromosomique (travaux de Morgan sur la drosophile)
Naissance du concept de gène
Évolution du concept de gène : hérédité moléculaire
Gène = élément sur chromosome, responsable d ’un caractère
1944 et 1952 : Travaux de Avery (pneumocoques) et Hershey et Chase (bactériophages) : ADN = support physique et chimique des gène
1953 : Watson et Crick : double hélice de l ’ADN
1957 : gène et structure primaire d ’une protéine
1961 : Concept de l ’ARN messager “ un gène -une enzyme ” (Jacob et Monod)
1963 : découverte du code génétique (Niremberg, Ochoa et Khoranea)
Gène = segment d ’ADN codant une protéine
Naissance de la Biologie
moléculaire
- Techniques de Séquençage des gènes (application au génome humain)
- Clonage moléculaire des gènes (≠ clonage organismes)
- Trans-genèse animal (souris KO) et végétal (OGM)
- Usine cellulaire : production de protéines recombinantes (depuis 1980)
- Identification de gènes responsables de maladies (mutations : diagnostic)
- Traitement des maladies du gène : thérapie génique (maladies génétiques, cancers)- Thérapie cellulaire
Depuis 1970 : développement techniques : la révolution génomique (gène =outil = entité manipulable)
découverte : - des enzymes de restriction
- la transcriptase inverse (ARN ADN)
STRUCTURE ET PROPRIÉTÉS DES ACIDES NUCLÉIQUES
ADN = Acide désoxyribonucléique
ARN = Acide ribonucléiqueAcide nucléique (noyau) (+ mitochondries, chloroplastes, procaryotes)
Nucléotide = base azotée + sucre (pentose) + acide phosphorique
nucléoside
Purine
Bases
Pyrimidine
Adénine (A) Guanine (G) Thymine (T)
(ADN)
Cytosine (C) Uracile (U)
(ARN)
Bases puriques Bases pyrimidiques
= polymères de nucléotides
pentose pentose
Les différents nucléotidesBase purique ou
pyrimidique
N9 : base purique
N1 : base pyrimidique
= liaison N-glycosidique
Pentose
- ribose (RNA) OH en 2 ’
- désoxyribose (DNA) H en 2 ’
Groupement phosphate
Désoxyadénylate
Désoxyadénosine 5 ’ monophosphate (dAMP) (dGMP)
Désoxythymidilate
Désoxythymidine 5 ’monophosphate (dTMP) (dCMP)
ADN : 4 types de nucléotides
ARN
Adénylate, adénosine 5 ’monophosphate (AMP) (GMP)AMPc et GMPc
Uridylate, uridine 5 ’monophosphate (UMP)
5 ’
3 ’
ADNARN
Liaison phosphodiester
(liaison covalente)
Extrémité 5 ’ PO4 libre
Extrémité 3 ’OH libre
5 ’
3 ’
A T C G A
P P P P P OH
Extrémité 5 ’
(à gauche)Extrémité 3 ’
(à droite)
5 ’ 3 ’
p ATCGAOH ou ATCGA : ordre des bases = information génétique
Oligonucléotide ≠ polynucléotide
Union de plusieurs nucléotides : formation des polynucléotides
DNA pol RNA pol
C1 ’
C5 ’
C3 ’
Structure tridimensionnelle du DNA: la double hélice (Watson et Crick 1953 prix Nobel en 1962))
- 2 chaînes nucléotidiques (2 brins) antiparallèles
5 ’
3 ’
3 ’
5 ’
- complémentarité des bases
En face de : A on a : T
En face de : C on a : G
Appariement des bases
5 ’ A C G A . .3 ’ C
Brin 1
T 3 ’ GCT..G 5 ’
Brin 2
Raisons de cette complémentarité : 1 - encombrement stérique (purine + pyrimidine)
2 - formation de liaisons hydrogène
A T
désoxyriboseP désoxyribose P
désoxyriboseP désoxyribose P
G C
- appariement des bases (stabilité relative, possibilité de dénaturation)
- séquence des bases = information génétique
Ex : 5 ’ CTAGCGGA 3 ’3 ’ GATCGCCT 3 ’
Produit = protéine Produit = son musical
1
234
5
67
8 9
12
3 5
6
- conformation spatiale de l ’ADN
Grand sillon
Petit sillon
Paires de bases
Chaîne sucre phosphate
5 ’ 3 ’
3 ’ 5 ’
3,4 nm (10 pdb)
d entre 2 bases = 34A°
2,0 nmMise en évidence des propriétés biologiques de l ’ADN
Travaux de Morgan : hérédité chromosomique
Expérience de transformation des pneumocoques (Avery-Mc Leold-Mc Carty) (1944)
Forme S (« smooth ») Forme R (« rough »)
Capsule polyosidique
virulente Non virulente
Interaction avec des protéines (Facteurs de transcription)
Forme S
Mort de la souris
Forme R
La souris reste vivante
Forme S tuées par la chaleur
La souris reste vivante
Mélange forme R + forme S tuées par la chaleur
Mort de la souris
Conclusion : existence d ’un principe transformant R en S
Expérience complémentaire : préparation d ’extrait acellulaire de S tuées par la chaleur
Forme R
+ Protéines La souris reste vivante
Forme R+ ADN Mort de la souris
Conclusion : le principe transformant est l ’ADN
Expérience de Hershey et Chase (1952)
Bactériophage T2
Capside protéique
ADN
Problème : ADN ou Protéine qui infecte ? Utilisation de T2 marqués au 32P ou au 35S
ADN marqué au 32PProtéine
marquée au 35S
Eschérichia coli
Séparation bactérie et phages et analyse du contenu de la bactérie : présence de 32P pas de 35S
ADN pénètre dans la bactérie
Multiplication de T2 : 32P retrouvé dans la descendance
ADN = support de l ’information génétique
Structure des acides ribonucléiques (ARN ou RNA)
≠ ADN
Monocaténaire
+ courtSucre = ribose
Bases A, C, G et U (≠ T)
A U
C GAppariement possible
- épingles à cheveux (mRNA)
- tRNA
ARN ribosomial (rRNA) (80%)
Ribosomes = “ usine à protéines “ de la cellule : RNA (65%) + protéines (35%)
Procaryotes (E.coli)
70 S (S = Svedberg)
50 S
rRNA 5S et 23 S
34 protéines
30Sr RNA 16S (1542 nucléotides)
21 protéines
Eucaryotes
80 S
60S
40S
ARN messager (mRNA) (F. Jacob et J. Monod 1961)
= copie de l ’un des deux brins ADN d ’un gène (transcription)
Message = Code à trois lettres 3 nucléotides (triplet) = codon spécifique d ’un acide aminé
Décodage : grâce aux tRNA
mRNA
ARN de transfert = tRNA
mRNA
codonAA
tRNA (adaptateur)
Structure en feuille de trèfle d ’un tRNA
Bras DHU
Bras acide aminé
Bras TC
Bras anticodon
ribose
ribose
Dihydrouridine (DHU)
ribose
1-méthylguanine
Pseudouridine (
Acide aminé
Extrémité 5 ’Extrémité 3 ’
Propriétés Physico-chimiques des acides nucléiques
absorbance
220 260 300(nm)
Simple brin
Double brin
Absorbance dans l ’UV
DO ADN db [1mg.ml-1] = 20
DO ARN ou ADN monocaténaire = 25
Effet hyperchrome
Dénaturation thermique
Chaleur
Intérêt : quantification ADN et ARN
pureté des Acides nucléiques
Température de fusion
ADN dénaturé
Tm80° 100°
Absorbance 260nm
Température °CTm fonction :- de la taille de l ’ADN
- nombre GC
renaturation refroidissement