biologie cellulaire biologie moléculaire - accueilbiochimie.univ-tours.fr/cours7_8_2014.pdf ·...
TRANSCRIPT
183
Biologie Cellulaire &
Biologie Moléculaire
L3 UE 5.2 EP1 2014-2015
Cours n° 7-8 : mardi 30 septembre et mardi 7 octobre 14h-16h Chap. IV Cycle cellulaire
Cycle cellulaire
184
Go Différenciation
Quiescence
Reproduction effectuée par l’Université François Rabelais de Tours Avec l’autorisation du C.F.C - 20, rue des Grands Augustins –75006 Paris
Technique 5 : Analyse des phases du cycle cellulaire par Cytométrie
Cytométrie
1 Incubation des cellules avec un fluorophore (intercalant de l’ADN) 2 Analyse de l’intensité de fluorescence émise par cellule (proportionnelle à
la quantité d’ADN) 3 Représentation nombre de cellules en fonction de l’intensité de
fluorescence 4 Détermination du pourcentage de cellules en fonction des phases du cycle
185 Reproduction effectuée par l’Université François Rabelais de Tours Avec l’autorisation du C.F.C - 20, rue des Grands Augustins –75006 Paris
Objectif : connaître le « statut prolifératif » d’une population cellulaire ou la proportion des cellules dans chacune des phases du cycle.
Analyse du cycle cellulaire et synchronisation
186
Quantité d’ADN par cellule
2N
4N
1 2
Régulation du cycle cellulaire
• Epigénétique (état de méthylation de H4K20) • Organisation génomique Histones • Régulation de l’expression PCNA, Orc1 • Phosphorylation/déphosphorylation cdk-cyc • Interactions protéine/protéine cdk-cyc, p53 • Intégration (molécules, complexes) p53
187
Cell cycle regulated establishment of the different H4K20 methylation states.
Jørgensen S et al. Nucl. Acids Res. 2013;nar.gkt012
© The Author(s) 2013. Published by Oxford University Press. 188
H4K20me3 H4K20me2
Peu de H4K20me1 sur nouvelles histones
H4K20me1 sur nouvelles histones
Protection des H4K20me1 SUV4-20H1 SUV4-20H2
Reproduction effectuée par l’Université François Rabelais de Tours Avec l’autorisation du C.F.C - 20, rue des Grands Augustins –75006 Paris
HMT
HMT
Technique 6 : Northern blot
Northern blot analyse des ARN (principalement les ARN messagers)
1 Purification d’ARN totaux ou d’ARN polyadénylés 2 Dénaturation 3 Electrophorèse (dénaturante) en gel d’agarose 4 Transfert sur membrane 5 Hybridation avec une sonde nucléotidique marquée (radioactive, …) 6 Révélation (autoradiographique, …)
Contrôles • Coloration bromure d’éthydium du gel d’agarose
(vérification de l’état des ARN et normalisation des quantités déposées)
• Hybridation avec un gène de ménage (validation de l’expérience)
189
Régulation de l’expression de Orc1
190
Northern blot
Sonde Orc1
Sonde GAPDH
Heures après induction de la prolifération cellulaire
Reproduction effectuée par l’Université François Rabelais de Tours Avec l’autorisation du C.F.C - 20, rue des Grands Augustins –75006 Paris
Contrôle : Dépôts des ARN totaux
ARNr 28S
ARNr 18S
+
migration
Northern blot
Phosphorylation/déphosphorylation Un facteur universel : le MPF
191
Cycline B P34 Cdc2 cdk1
Site actif
M-Phase promoting factor
Deux familles : eucaryotes supérieurs
Cdk 1 à 20 Cyclines A – L , O, T, Y
Cdk : « Cycline dependant kinase »
Phosphoryle sérine et thréonine
Jeux de régulations multiples
Cycline
Régulation du cycle cellulaire par les complexes hétérodimériques cdk-cyclines
192
c-fos, c-jun
• Régulation de l’activité des complexes cdk-cyclines – Localisation – Phosphorylation – Inhibiteur
• Substrats – Lamine – Origines de réplication – pRb
193
Régulation par localisation : Cycline B
194
S
G2/M
Accumulation cellulaire Localisation : cytoplasme puis noyau Activité MPF
G1
P
Régulation du MPF
195
cdk7-cycline H
kinase du système de contrôle de l’intégrité de l’ADN
Réponse aux lésions ADN et
au stress environnemental
Site de fixation de la protéine 14-3-3
CDKI
P
Substrat du MPF : division cellulaire
196
Enveloppe nucléaire Membrane interne Lamina nucléaire Lamines A, B et C Chromosome (interphasique) Séquence de 10 000 pb Domaines régulateurs Matrice nucléaire Séquences d’insertion de 140 pb (dans la matrice nucléaire ex. boucle 1 : )
1
2
3
4
5
Lamines : substrat du MPF cdk1-cycB dissociation de la lamina nucléaire destruction de l’enveloppe nucléaire nécessaire pour la division cellulaire
Phosphatase
Régulation du cycle cellulaire par les complexes hétérodimériques cdk-cyclines
197
Ex. Désactivation des origines de réplication : phosphorylation de cdt1 par cdk2-cyc A pour induire sa dégradation et cdc6 pour induire sa relocalisation cytoplasmique.
cdk-cycline : phosphorylation de Rb
198
(Lysine ou) Histone Méthyl Transférase : HMT
cdk1 cyclines A, D et E ADN polymérase α histone H2A PCNA Rb Topoisomérase II MSH2
(Lysine ou) Histone Méthyl Transférase HMT
Régulation : phosphorylation + méthylation
Phosphatase
Intégration des régulations
199
Phosphorylation/Méthylation pour pRb Méthylation : Histone/non histone
HMT : SET7 Méthylation 1• de protéines non-histone (contrôle de l’expression génique) 2• des histones (H3K4: activation)
Contrôle de l’activité de E2F Reproduction effectuée par l’Université François Rabelais de Tours Avec l’autorisation du C.F.C - 20, rue des Grands Augustins –75006 Paris
Substrats de méthylation non histones de la HMT : SET7
200
HMT SET7 monométhyle H3K4 : chromatine active
mais aussi des protéines non-histone pour le contrôle de l’expression génique :
SET7 méthyle p53 (sur K372) entrainant sa stabilisation et sa localisation nucléaire
SET7 méthyle (sur K142) DNMT1 (DNA cytosine-5 methyltransferase 1) entrainant sa dégradation.
SET7 méthyle le récepteur des estrogènes (sur K302) favorisant son action.
Action contrebalancée par la « Lysine-Spécifique Déméthylase » (LSD).
Reproduction effectuée par l’Université François Rabelais de Tours Avec l’autorisation du C.F.C - 20, rue des Grands Augustins –75006 Paris
HDM HDM
HAT
Intégration miARN et cycle cellulaire bis
201
SWI/SNF-like complex
HAT
C-myc : Facteur de Transcription pour un nombre important de gènes : exemples EF2 et miR-17
Régulation précise de la synthèse de E2F pour éviter l’accumulation de « Double Strand Breaks » suivi d’un blocage du cycle cellulaire
Hypothèse : miRNAs (miR-17) coordonnent la progression dans le cycle cellulaire
C-myc peut recruter Sur les promoteurs :
ARNm protéine
Reproduction effectuée par l’Université François Rabelais de Tours Avec l’autorisation du C.F.C - 20, rue des Grands Augustins –75006 Paris
Molécule intégrative : p53
202
Lésion ADN
p53 p53
Transcription Interactions complémentaires
Apoptose
Répresseur de nombreux gènes Complexes avec TF IID
(p53-TBP, p53-TAF)
Facteur de transcription Fixe module p53 Induit expression : p21 un inhibiteur de cdk Inhibiteuer de cdk4-cycD, cdk2-cycE Ne reconnaît pas cdk7-cycH et peu MPF Induit inhibition de la phosphorylation de Rb Arrêt du cycle cellulaire en G1
P53-RP-A
P53-ADNlésé
P
Médiator
Molécule intégrative : p53
203
Méthylation
Acétylation
K372
interactions
interactions
HMT : SET7/9
Phosphorylation
K382ac
HDAC : SIRT1
LSD
Cartographie des « MPT » de p53
204 Reproduction effectuée par l’Université François Rabelais de Tours Avec l’autorisation du C.F.C - 20, rue des Grands Augustins –75006 Paris
Organisation génomique : gènes des histones
• Domaine • Amas ou cluster • Répétition • Extrémité 3’ non codante des messagers
205
Synthèse des histones nécessaire en phase S
Domaine régulateur : « Histone »
206
207
Page 32
P
Flêches : sites hypersensibles à la Dnase I Reproduction effectuée par l’Université François Rabelais de Tours Avec l’autorisation du C.F.C - 20, rue des Grands Augustins –75006 Paris
Répétition en tandem des domaines « histones »
208 Reproduction effectuée par l’Université François Rabelais de Tours Avec l’autorisation du C.F.C - 20, rue des Grands Augustins –75006 Paris
Structure des ARNm « histones »
209
5’ non codant partie codante 3’ non codant
Séquence 3’ non-codante régulatrice de la stabilité de l’ARNm « histone »
Pas de d’extension poly-adénylée
AAAA
Couplage avec la réplication
©