BIOLOGIA MOLECULAR Blga. Olga Libia Cjuno Huanca

Universidad Nacional de San Antonio Abad del Cusco

Facultad de Ciencias Biologicas

CARRERA PROFESIONAL DE FARMACIA Y BIOQUIMICA

Unidad Académica N° 1: ESTRUCTURA Y FUNCION DEL ADN

ACIDOS NUCLEICOS

• Son macromoléculas formadas por la polimerización

de unidades monoméricas llamadas NUCLEÓTIDOS,

enlazados entre si por el grupo fosfato.

• El grado de polimerización puede llegar a ser altísimo,

siendo las moléculas más grandes que se conocen,

con moléculas constituídas por centenares de

millones de nucleótidos en una sola estructura

covalente.

• La aperiodicidad de la secuencia de nucleótidos

implica la existencia de información.

ACIDOS NUCLEICOS

• Constituyen el depósito de

información de todas las secuencias

de aminoácidos de todas las proteínas

de la célula.

• Por tanto estas Biomoléculas son

encargadas de ALMACENAR,

TRANSMITIR y EXPRESAR la

información genética

• De acuerdo a la composición química,

los ácidos nucleicos se clasifican en:

Ácidos Desoxirribonucleicos (ADN)

que se encuentran residiendo en el

núcleo celular y algunos organelos, y

en

Ácidos Ribonucleicos (ARN) que

actúan en el citoplasma.

COMPOSICION DE LOS ACIDOS NUCLEICOS

Los ácidos nucleicos: son la unión de varios componentes: • Una base nitrogenada, que se une al C1 del azúcar, puede ser:

– Purinas: adenina o guanina. – Pirimidinas: timina, citosina o uracilo.

• Un azúcar, que puede ser: – Ribosa: en el ARN. – Desoxirribosa: en el ADN.

• Grupo fosfato que se une al C5 de su azúcar y al C3 del siguiente nucleótido.

Los nucleósidos son la unión de la base nitrogenada y del azúcar pentosa . Los trifosfatos son los precursores del ADN y dan energía para hacer posible infinidad de reacciones metabólicas: ATP, GTP, CTP, TTP, UTP.

Nucleótidos Están constituidos por una base nitrogenada, un azúcar de 5 carbonos (pentosa), que puede ser una ribosa o desoxirribosa, y un grupo fosfato. Los carbonos de la pentosa se designan con un signo prima ( ‘ ) para diferenciarlos de los de las bases nitrogenadas, Siendo el carbono 1’ (C1’) el unido a la base nitrogenada. Nucleósido: pentosa + base nitrogenada C’1

C’5

NUCLEÓTIDOS (base nitrogenada + azúcar pentosa + ácido fosfórico)

Azúcar pentosa

MONOSACÁRIDOS: PENTOSAS

PIRIMIDÍNICAS (derivan de la pirimidina compuesto orgánico con 2 átomos de N que sustituyen al C en 1 y 3)

PÚRICAS

(derivan de la purina compuesto orgánico formado por 2 anillos fusionados con 4 átomos de N en los C 1, 3, 7 y 9)

Citosina (C) Timina (T)

(exclusiva del ADN) Uracilo (U)

(exclusiva del ARN)

Adenina (A) Guanina (G)

BASES NITROGENADAS: compuestos formados por C y N

ÁCIDO FOSFÓRICO

• Se encuentra en los nucleótidos en forma de IÓN FOSFATO

H2O

BASE NITROGENADA

(Adenina)

PENTOSA (Ribosa)

NUCLEÓSIDO (Adenosina)

ION FOSFATO

Enlace

N-glucosídico

NUCLEÓTIDO

(Adenosín 5’-monofosfato)

Enlace éster

H2O

FORMACIÓN DE UN NUCLEÓTIDO

Enlace N-glucosídico

• Nucleósido: base nitrogenada + pentosa mediante enlace N-glucosídico • Nucleótido: nucleósido + ión fosfato mediante enlace éster

(-OH + compuesto aminado)

DNA RNA Bases Nucleósidos Nucleótidos Bases Nucleósidos Nucleótidos

Adenina A Guanina G Citosina C Timina T

Desoxi-adenosina Desoxi-guanosina Desoxi–citidina Desoxi–timidina

Ácido d- adenílico Ácido d–guanílico Acido d–citidílico Ácido d–timidilico

Adenina A Guanina G Citosina C Uracilo U

Adenosina Guanosina Citidina Uridina

Ácido adenilico Ácido guanilico Ácido citidilico Ácido uridilico

NOMENCLATURA DE NUCLEOSIDOS Y NUCLEOTIDOS

• NUCLEÓTIDOS NO NUCLEICOS: ATP Y ADP

Son moléculas transportadoras de energía.

La energía que se necesita para las reacciones endergónicas

(que absorben energía) se obtiene de la hidrólisis del ATP.

Cuando las reacciones son exergónicas

(liberan energía), la energía se emplea en

la formación de ATP.

ATP ADP

Desfosforilación

Fosforilación

Además del ATP y el ADP también

existen los nucleótidos de guanina

GTP y GDP con función similar.

NUCLEÓTIDOS NO NUCLEICOS

• NUCLEÓTIDOS NO NUCLEICOS: FAD, NAD, NADP Y CoA

NUCLEÓTIDOS DE FLAVINA

NUCLEÓTIDOS DE PIRIDINA

FLAVINA

(base nitrogenada)

RIBITOL

(pentosa) + RIBOFLAVINA

(nucleósido)

FMN ( flavín-mononucleótido)

FOSFATO +

FAD ( flavín-adenín-dinucleótido)

AMP +

NUCLEÓTIDO DE

NICOTINAMIDA + NUCLEÓTIDO

DE ADENINA

NAD ( nicotín-adenín

-dinucleótido)

+ FOSFATO

NADP ( nicotín-adenín

-dinucleótido

fosfato)

COENZIMA -A

-mercaptoetilamina Ácido pantoténico ADP

Catalizan reacciones de oxidación-reducción

Intervienen en la respiración celular

Interviene en reacciones enzimáticas del metabolismo celular

TIPOS DE ACIDOS NUCLEICOS

LOCALIZACION DE LOS ACIDOS NUCLEICOS:

DNA No asociado a Histonas RNA en el citoplasma

DNA Asociado a Histonas

ADN mitocondrial no asociado a histonas

ADN cloroplastal en cel. vegetal

ARN

ARN

EL ÁCIDO DESOXIRRIBONUCLEICO (ADN)

ESTRUCTURA 1aria : es la secuencia de nucleótidos

ESTRUCTURA 2aria : es la estructura espacial que adoptan los nucleótidos

El ADN es un polímero lineal formado por desoxirribonucleótidos de A, G, C, T, idénticas entre si, excepto en cada una posee una base nitrogenada diferente

ESTRUCTURA PRIMARIA DEL ADN

• Es la secuencia de nucleótidos, unidos por

enlaces fosfodiéster en sentido 5’-3’.

Adenina

Citosina

Timina

Guanina

Extremo 3’

• La cadena presenta dos extremos libres:

el 5’ unido al grupo fosfato y el 3’ unido a un

hidroxilo.

• Cada cadena se diferencia de otra por:

> Su tamaño

> Su composición.

> Su secuencia de bases.

• La secuencia se nombra con la inicial de la

base que contiene cada nucleótido:

Extremo 5’

ACGT

• GEN: información contenida en una porción

de ADN que lleva la información necesaria

para que los aminoácidos se unan en un

determinado orden formando la estructura

1aria de una proteína.

ESTRUCTURA SECUNDARIA DEL ADN

MODELO DE ESTRUCTURA SECUNDARIA DEL ADN

• James Watson y Francis Crick en 1953 demostraron que la estructura del ADN consiste en una doble hélice este modelo

• Explicar la transmisión de información genética de unas células a otras.

• Explicar como se producen variaciones genéticas que dan lugar a la variación de las especies.

ANTECEDENTES DEL MODELO DE LA DOBLE HELICE

Watson y Crick se basaron en: 1. Análisis de la composición de las bases de los ácidos nucleicos. En 1944-53 Chargaff investiga sobre los ácidos nucleicos de varios organismos, y de ellas resultan unas reglas: • A=T y G=C

• Nº de purinas = Nº de pirimidinas, • A + G / C + T = 1. • Nº de A + T no tiene que ser necesariamente = Nº

de C + G; y además es distinto para cada especie.

A T G C

Sp 1 35% 35% 15% 15%

Sp 2 20% 20% 30% 30%

La proporción de Adenina es igual a la de Timina

A = T

La proporción de Guanina es igual a la de Citosina

G = C

La proporción de bases púricas (A+G) es igual a la de bases pirimidínicas (T+C)

(A+G) = (T+C) LEY DE CHARGAFF

La proporción entre (A+T) y (G+C) es característica de cada organismo, tomando valores diferentes según la especie

Estudios de Erwin Chargaff

Estudios de DIFRACCIÓN DE RAYOS X (Maurice Wilkins Rosalind Franklin)

• Las bases púricas y pirimidínicas se encuentran unas sobre otras, apiladas a lo largo del eje del polinucleótido a una distancia de 3,4 Å. Las bases son estructuras planas orientadas de forma perpendicular al eje (Astbury, 1947).

• El diámetro del polinucleótido es de 20 Å y está enrollado helicoidalmente alrededor de su eje. Cada 34 Å se produce una vuelta completa de la hélice.

•Existe más de una cadena polinucleotídica enrollada helicoidalmente (Wilkins et el. 1953, Frankling y Gosling, 1953).

2. Análisis de la difracción de los rayos X de moléculas de ácidos nucleicos dada por Pauling:

R.Franklin y Wilkins: con experimentos de difracción de rayos X concluyeron que el ADN era una molécula larga y rígida. Existían 2 periodicidades (detalles estructurales repetidos) a 0.34 y a 3.4 nm

CARACTERISTICAS DEL MODELO DE LA DOBLE HELICE PROPUESTA POR WATSON Y CRICK CARACTERISTICAS: - Son dos cadenas de

polinucleótidos con giro a la Derecha y forman una doble helice alrededor de un eje central.

- Enrollamiento de tipo plectonémico: para separar las dos hélices es necesario girarlas como si fuera un sacacorchos.

- Las dos cadenas son antiparalelas:

1. 5´ -- 3´ 2. 3´ -- 5´ - Son complementarias unidas por

puentes de hidrógeno: A=T, G≡C.

La orientación de estas hebras es antiparalela: sus direcciones 5’ 3’ son opuestas. Las bases adyacentes se aparean de forma complementaria: A está unida a T a través de dos enlaces de hidrógeno, mientras que G se une a C por tres enlaces de hidrógeno. La complementariedad entre bases está dada por el tamaño, forma y composición química de ellas.

DNA: DOBLE HÉLICE

- En el modelo la distancia entre bases es de 3.4A° y por vuelta existen 10 nucleótidos = 34A°.

- Distancia de diámetro son 20 A°.

- Giro en cada ácido: 36°.

- Giro entre cada vuelta: 360°.

Surco mayor

Surco menor

1.9nm

• Además se genera en la molécula dos surcos como consecuencia de la disposición de las bases dentro de la molécula:

• el surco mayor y el surco menor; su importancia es de expresión genética.

• El surco mayor: más cantidad de uniones de proteínas.

• El surco menor: determinadas proteínas reconocen determinadas bases.

• 1m = 10-9nm = 10-10A° • 1nm = 10A° • 1pb = 650da • 1Kda = 103da • 1Mb = 106pb = 103Kda • Distancia entre 2pb = 3.4A° = 0.34nm • Distancia de una vuelta = 34A° = 34nm • Pb por vuelta = 10 • Diámetro de ADN 1.9=2.0nm

Antiparalelismo de las hebras

Adenina Timina

Guanina Citosina

Tres enlaces

puentes de

hidrógeno

Dos enlaces

puentes de

hidrógeno

El número de

enlaces de

hidrógeno

depende de la

complementarieda

d de las bases

Complementariedad de bases por puentes de hidrógeno

A = T G ≡ C

FUERZAS QUE MANTIENEN LA ESTRUCTURA DEL ADN

1. Puentes de H: • Son muy numerosos, debido a que se dan entre los pares de bases

de los distintos nucleótidos que se van uniendo; son fuerzas débiles, que ayudan a mantener la estructura de doble hélice de la molécula, pero interaccionan de forma distinta dependiendo de las bases que se unan de la siguiente manera: A=T, G≡C

• La región que se antepone a la de codificación de un gen, y a partir de la cual se realiza la trascripción, se denomina la caja TATA, o promotor.

• Para que la ADN-polimerasa pueda comenzar a transcribir, las cadenas deben ser separadas, por lo que estas zonas tendrán uniones A=T(más fáciles de separar ya que se encuentran unidas por dos puentes de H, y no tres, como en el caso de , G≡C).

Complementariedad de bases nitrogenadas por puentes de H

Esta mal

2. Fuerzas de Wander Wals, Se dan entre cada peldaño de la hélice, gracias a que los fosfatos que están cargados negativamente. 3.Interacciones hidrofóbicas: Entre bases adyacentes (hidrofobicas) de la misma cadena polinucleótidica. Es una Fuerza potente que favorece la cohesión, ya que excluye a las moléculas del agua de su interior. La que proporciona mejor estabilización a la estructura. 4. Interacciones electrostáticas: De los grupos fosfato con el agua y contraponen (Mg++). Los fosfatos (P-) se estabilizan con iones + de la solución acuosa que impiden la repulsión entre estos (P-). Estabiliza el ADN en el entorno en que se encuentra.

ADN- POLIANIONICO

ORGANIZACIÓN MOLECULAR DEL ADN

EN PROCARIONTES: E. coli • DNA : Circular de 4.2 x 106pb • Codifica varios miles de proteinas diferentes • Contiene entre 3,000-4,000 genes = 1Kb. • La mayor parte del ADN es ADN codificantes. EN EUCARIONTES: • ADN : Es > 1.3x107pb = levadura en

humanos es de 3.0 x 109pb

• Codifica entre 30,000-40,000 genes. • Codifica miles de proteinas. • En el humano del ADN total solo 2% es codificador.

TIPOS DE ESTRUCTURAS DEL ADN: . ADN-B: (Del modelo de la doble hélice) ADN más abundante en las células vivas se caracteriza por presentar giros a la derecha de 3,4nm, 10pb por vuelta y un diámetro helicoidal de 2,0nm, se encuentra en soluciones con baja fuerza iónica (condiciones fisiológicas) • ADN-A: Resulta de la modificación de ADN-B en un medio rico en Na+, K+ y un entorno menos hidratado presenta 11 pares de bases por vuelta y es más ancho (2,3nm de diámetro helicoidal). Es interesante por presentar una estructura parecida a la de los híbridos ADN-ARN y a las regiones de autoapareamiento ARN-ARN. • ADN-Z: Descubierto por Rich de doble hélice sinistrorsa (enrollamiento a izquierdas), 12 pb por vuelta, se llama Z porque el esqueleto fosfodiéster zigzagea a lo largo de la molécula. Es más delgado con 1,8nm de diámetro Presente con secuencia alternante de bases púricas y pirimidínicas (GCGCGC), debido a la conformación alternante de los residuos azúcar-fosfato sigue un curso en zig-zag.

• ADN DE TRIPLE HELICE o ADN-H: "In vitro" es posible obtener tramos de triple Hélice intercalando oligonucleótidos cortos constituidos solamente por pirimidinas (timinas y citosinas) en el surco mayor de una doble hélice. Este oligonucleótido se une a pares de bases A-T y G-C mediante enlaces de hidrógeno tipo Hoogsteen que se establecen entre la T o la C del oligonucleótido y los pares A-T y G-C de la doble hélice. No se sabe la función biológica del ADN-H aunque se ha detectado en cromosomas eucarióticos. Para que se forme la triple hélice se tiene que separar las dos hebras y se integra otra cadena. Dos iguales y una complementaria.

• ADN-C: ADN con 66% de humedad, se obtiene en presencia de iones Li, muestra 9+1/3 pares de bases por giro completo y 19 Å de diámetro.

• ADN DE CUATRO HELICES: Estructura cruciforme que aparece en zonas palindrómicas. "In vitro" se han obtenido cuartetos de Guanina (ADN cuadruplexo) unidas mediante enlaces tipo Hoogsteen, empleando polinucleótidos que solamente contienen Guanina (G).

• TETRAPLEX : Presentes en los telómeros (en forma de silla), tienen una estructura especial con un extremo 3' OH de cadena sencilla (monocatenario) en el que se repite muchas veces en tandem una secuencia rica en Guaninas. Se piensa que el ADN cuadruplexo telomérico serviría para proteger los extremos cromosómicos de la degradación enzimática. Ejemplo de secuencia telomérica rica en guaninas (G): 5´P TTGGGTTGGGGTTGGGG...............TTGGGG 3'OH

PROPIEDADES FISICOQUIMICAS DEL ADN Densidad: existe una relación lineal entre el contenido en G+C y la densidad del ADN determinada en un gradiente de densidad. A mayor contenido en G+C mayor densidad posee el ADN.

• En la replicación y transcripción del DNA, las hebras de la doble hélice deben separarse para que las bases puedan formar pares con los nucleótidos de las nuevas cadenas a sintetizar.

• Desnaturalización: proceso de desenrollar y separar las hebras de DNA. Puede inducirse in vitro aumentando la temperatura de una solución con DNA provocando ruptura enlaces de hidrógeno y otras fuerzas estabilizadoras.

La temperatura (Tm) a la cual ocurre depende de:

• Proporción de pares G-C: requieren Tm más alto al unirse a través de 3 enlaces de hidrógeno.

• Concentración iónica: si es baja disminuye la Tm

• Extremos de pH: desnaturalizan el DNA a baja temperatura.

• La desnaturalización y renaturación del DNA son la base de la hibridación de ácidos nucleicos, técnica que permite detectar y aislar una secuencia específica de DNA dentro de una solución con diferentes secuencias.

Perdida de la estructura secundaria, separación de las dos hebras

La desnaturalización es reversi le con muchas aplicaciones practicas Ej. Sotherm bloting

Desnaturalización: la proporción A+T/C+G está relacionada en primer lugar con la estabilidad de la molécula de ADN de doble hélice. Cuanto mayor es el contenido en G+C de una molécula, mayor cantidad de pares G-C presentará, como consecuencia tendrá una mayor cantidad de triples enlaces y, por consiguiente, será necesario suministrar una mayor cantidad de energía a esa doble hélice para separar sus dos hebras (desnaturalización o fusión del ADN). Cuanto mayor es el contenido en G+C mayor cantidad de calor que hay que suministrar a un ADN de doble hélice para desnaturalizarlo. La temperatura de fusión (Tm) o temperatura de desnaturalización, necesaria para desnaturalizar la mitad del ADN de una mezcla (punto medio de la reacción ADN doble hélice ADN hélice sencilla) esta directamente relacionada con el contenido en G+C, a mayor contenido en G+C mayor temperatura de fusión (Tm).

Para determinar el valor de Tm del ADN de E. coli, se extrae y purifica el ADN de E. coli, luego el ADN en buffer, se añade alícuotas a un gradiente de temperatura , luego se realiza la lectura a 260 nm T°C absorvancia (OD) 0 a 1 b 2 c . . . . . . 100°

10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 °C T°

OD

0%

50%

100%

El Tm = 56°C

El ADN de E. coli tolera de 0-40°c. 40°C >40°C 55°C 70°C ADN 100%duplex 50% duplex 100% cadenas simples. 50% c.simple El valor de Tm es específico para cada especie.

Absorbancia a 2.600 Å: El estado físico de los ácidos nucleicos está relacionado con su capacidad de absorción de la luz ultravioleta (UV) a 2.600 Å. • El menor grado de absorción se produce en estado de doble hélice, la absorción

aumenta cuando se • produce la desnaturalización pasando a estado de hélice sencilla (efecto

hipercrómico, aumento de la absorbancia) y, por último, si degradamos este ADN de hélice sencilla a nivel de nucleótidos libres, de nuevo aumenta la absorbancia. Por tanto, la absorbancia a 2.600 Å se puede utilizar como una medida del estado físico de la molécula de ADN. Las curvas de fusión tienen forma de S observándose un aumento brusco de la absorbancia al llegar a una temperatura determinada, la temperatura de fusión.

Reabsorción: emparejamiento de las cadenas tras quitar el calor al que son sometidas para la desnaturalización. Hibridación: emparejamiento entre cadenas complementarias de origen diferente.

Las 3 funciones básicas del ADN pueden resumirse en:

ALMACENAR TRANSMITIR EXPRESAR

REPLICACIÓN DEL ADN

FUNCIÓN BIOLÓGICA DEL ADN

ADN es el almacén de la información genética y la molécula encargada de transmitir a la descendencia las instrucciones necesarias para construir todas las proteínas presentes en un ser vivo

RELACIÓN ENTRE DIVERSOS ORGANISMOS Y

LA CANTIDAD DE ADN QUE CONTIENEN

1 0 5 1 0 6 1 0 7 1 0 8 1 0 9 1 0 1 0 1 0 1 1

Bacterias

Insectos

Anfibios

Peces óseos

Reptiles

Aves

Mamíferos

Moluscos

Escherichia coli

Hongos Levaduras

Judías Plantas

Drosophila melanogaster

Peces cartilaginosos Tiburones

Ranas Tritones

Humanos

Existe gran

diferencia entre

el contenido de

ADN de seres

unicelulares

primitivos y el

de organismos

pluricelulares.

Dentro de un

mismo grupo

puede haber, a

su vez, grandes

diferencias que

no parecen

guardar

relación con su

complejidad.

ORGANIZACIÓN DEL ADN EN LA CÉLULA

En VIRUS:

Tienen una molécula que puede ser de ADN o de ARN.

ADN bicatenario

lineal (virus)

ADN monocatenario

circular (virus)

ADN monocatenario

lineal (virus)

En otros organismos…

• En procariontes (así como en las mitocondrias y cloroplastos de las células eucariontas) el ADN se presenta como una doble cadena (de cerca de 1 mm de longitud), circular y cerrada, que toma el nombre de cromosoma bacteriano. Se asocia a proteínas y poliaminas de bajo peso molecular y de iones magnesio. Se encuentra altamente condensado y ordenado ("supercoiled" o superenrrollado).

Fotografía al microscopio electrónico de un DNA circular relajado y con distintos grados de superenrollamiento.

En virus, el ADN puede presentarse como una doble hélice cerrada, como una doble hélice abierta o simplemente como una única hebra lineal. Además, los virus pueden contener su información genética a través de RNA, en hebras simples o dobles.

En procariotas:

Tienen un cromosoma circular formado de ADN.

A veces pueden existir varias moléculas más pero más

pequeñas y transferibles llamadas PLÁSMIDOS

En mitocondrias y cloroplastos:

Tienen un cromosoma circular formado de ADN y

que regula parte de la estructura y de los procesos que

tienen lugar en estos orgánulos.

Dímero

concatenado

ADN bicatenario

circular

ORGANIZACIÓN DEL ADN EN LA CELULA

Cromatina

(eucariotas)

ADN asociado

a histonas

Cromosomas

EUCARIOTAS: NIVELES DE COMPLEJIDAD DEL ADN

• Todo el ADN de los 46 cromosomas humanos de una célula humana mide ≈ 2’36 m • Se estima que una persona de 70 kg tiene unos 70 billones de células (70.000.000.000.000 = 70.1012 células) • En nuestro cuerpo tenemos un total de ≈ 165.200.000.106 m de ADN

COMPACTACION DEL ADN • La forma de compactación y de controlar su expresión produce el

superenrrollamiento. • La forma superenrrollada produce la forma No relajada (son formas que tienen

tensión) • TOPOISOMEROS: Moléculas de ADN que se diferencian en el grado de

superenrrollamiento. • Del equilibrio entre las topoisomerasas se controla el estado de superenrrollamiento

del ADN. Se se bloquean las topoisomerasas con un antibiótico se puede bloquear la replicación del microorganismos y combatirlos.

En Eucariontas: • Son necearios numerosas etapas de compactacion de la cromatina.

Formacion del nucleosoma: • Unión de ADN a un agregado de un octomero de histonas, dos de cada

uno (H2A, H2B, H3 y H4) de aproximadamente 200 nucleótidos • La histona H1 mantiene la estructura del nucleosoma. • Las histonas son pequeñas y con pocos aminoácidos con gran cantidad de

residuos básicos de lisina y arginina que interaccinan con los grupos fosfato del ADN.

• Las modificaciones en las histonas (mutilación, acetilación, fosforilación, etc.) sueltan el ADN y permiten que realice sus funciones (replicación, transcripcion y otros).

APLICACIONES DE LA PURIFICACION DEL ADN

Forense Dx. de enfermedades infecciosas Dx. de enfermedades congénitas. Clonación de genes Genómica Control de calidad microbiológico Biodiversidad Identificación de especies

PURIFICACION DEL ADN: 1. Lisis celular 2. Fraccionamiento de ácidos nucleicos 3. Concentración de los ácidos nucleícos.

1. LISIS CELULAR • Lisis enzimática de tejidos animales: x tampon de

lisis con detergente. Algunos protocolos con proteinasa K.

• Lisis de bacterias y levaduras: x lisozima (Bacterias Gram positivas) liticasa (levaduras)

• Detergente y pH alcalino para plásmidos. • Homogenizadores mecánicos: Agitador mecánico a la

muestra se adicionan esferas • Congelación y descongelación con Nitrógeno líquido.

2. FRACCIONAMIENTO DE LOS ACIDOS NUCLEICOS • Preparación de lisados crudos: no se purifica. • Salting-out: se precipitan las proteínas y

contaminantes con sales de acetato de amonio o potasio.

• Fraccionamiento con solventes orgánicos: Fenol/cloroformo/alcohol isoamílico.

3. CONCENTRACION DE ACIDOS NUCLEICOS Precipitación con: • Etanol • Isopropanol • En presencia de sales

La electroforesis en gel es una técnica sencilla empleada de forma rutinaria en laboratorio para separar moléculas biológicas especialmente ADN, ARN y proteínas. a electroforesis es una técnica que permite separar especies químicas (ácidos nucleicos o proteínas) a lo largo de un campo eléctrico en función de su tamaño y de su carga eléctrica. Los ácidos nucleicos, ADN y ARN, tienen por naturaleza carga negativa. Si ponemos fragmentos del ADN extraído de una muestra biológica sobre un soporte poroso (gel) y aplicamos un campo eléctrico, se producirá la migración diferencial de los fragmentos a través de los poros de la matriz. La tinción del gel con bromuro de etidio, que es una sustancia fluorescente que se intercala en la molécula de ADN, y la exposición con luz ultravioleta, permite observar el resultado de ésta migración. El tamaño de los fragmentos de ADN se puede estimar comparándolos con el patrón de bandas que se obtiene de marcadores comerciales de peso molecular conocido.

ELECTROFORESIS

La electroforesis de ADN es útil para comparar patrones de bandas de diferentes muestras biológicas. Así por ejemplo se puede usar para comparar muestras de individuo sano frente a individuo enfermo, para la identificación de ácidos nucleicos de agentes infecciosos o para la obtención de un fragmento determinado de ADN que, una vez localizado en el gel, puede ser extraído para análisis posteriores.

HIBRIDACION Es la unión de dos cadenas de ácidos nucleícos complementarios para formar un duplex o molécula de cadena doble Posibles hibridaciones: ADN-ADN ADN-ARN

SONDA GENETICA: Molécula de ADN o ARN homóloga a una secuencia de ARN con la que se hibrida de forma estable y específica por asociación de bases. SONDAS: Una sonda es un fragmento de ADN que: • Se puede marcar para ser identificado y medido. • Se hibrida a un ADN gracias a su

complementariedad. TIPO DE MARCAJES: • Radioactivo (32P, 35P, 14C, 3H) • Fluorescente • Biotinilación (avidina-streptavidina)

• Es un polirribonucleótido (contiene la ribosa como pentosa). Las bases nitrogenadas que lo forman son ADENINA (A), URACILO (U), CITOSINA (C) y GUANINA (G) (carece de TIMINA).

• Es MONOCATENARIO (excepto algunos virus)

• En algunas zonas se pueden establecer enlaces de H entre bases nitrogenadas complementarias HORQUILLAS

Excepto en algunos

virus, el ARN es

monocatenario.

Bases

complementarias.

Zona de doble

hélice (horquilla).

Bucle

EL ÁCIDO RIBONUCLEICO (ARN)

• FUNCION: Se relaciona principalmente con al expresión de la información genética en dirigir la síntesis de proteínas a partir de la información obtenida del ADN

• Diferencias con DNA: ribosa con grupo hidroxilo en posición C2’ y está formada por las bases A, C, G y Uracilo en vez de Timina.

• Ese grupo hidroxilo produce mayor labilidad química, ya que provee un grupo reactivo que participa en la catálisis mediada por RNA y causa la formación de mononucleótidos de RNA en solución alcalina, lo cual no ocurre en el DNA.

RNA: FORMAS

• Lineal o circular, mono o bicatenario; en hélices se dispone como en forma A de DNA.

• La mayoría del RNA celular es una hebra simple con diversas conformaciones de acuerdo a su función.

RNA MENSAJERO (ARNm)

• Son copias o transcritos de secuencias (de 500-

10.000 nucleótidos) de una cadena de DNA.

• Tiene una vida muy corta (algunos minutos) ya

que es destruido rápidamente por las

ribonucleasas

• Actúa como molde de una región de ADN para

especificar la secuencia aminoacídica de un

polipéptido.

• Corresponde a una hebra simple de nucleótidos

cuya longitud depende del polipéptido que

codifique.

ADN

ARN

mensajero

• Además del molde del segmento de DNA que contiene la secuencia necesaria para la síntesis de la cadena polipeptídica (gen), el mRNA incluye secuencias que regulan la síntesis proteica.

• Una molécula de mRNA puede codificar una (monocistrónico) o varias (policistrónico) cadenas polipeptídicas.

En eucariotas porta información para

que se sintetice una proteína:

MONOCISTRÓNICO

En procariotas contiene información

separada para la síntesis de varias

proteínas distintas:

POLICISTRÓNICO

ARN de TRANSFERENCIA: ARNt • Son el diccionario por medio del cual se traduce el lenguaje de los

ácidos nucleicos al lenguaje de las proteínas.

• Contienen ≈ 80 nucleótidos.

• Su estructura 2aria es en forma de trébol con regiones de doble

cadena. (en 3D tiene forma de L)

• Actúan como moléculas adaptadoras en la síntesis proteica, al

leer la información codificada en el mRNA y transferir el

aminoácido adecuado a la cadena polipeptídica en crecimiento.

• Corresponde a una hebra simple corta de RNA con estructura

secundaria en forma de tallo-bucle, por apareamiento de bases

entre segmentos complementarios distantes de la hebra.

• El brazo del aminoácido lleva un aminoácido esterificado

• El brazo del anticodón posee una secuencia de tres bases complementaria y antiparalela a una secuencia de mRNA (codón).

3’

5’

Brazo T

Brazo A

Brazo D

Anticodón

Todos los tipos de ARNt comparten algunas características:

En el extremo 5’ hay un triplete que tiene

guanina y un ácido fosfórico libre

En el extremo 3’ tres bases (C-C-A) sin

aparear. Por este extremo se une al

aminoácido

En el brazo A hay un triplete de bases

llamado anticodón diferente para cada ARNt

en función del aminoácido que transportan

Zona de unión

al ribosoma.

Zona de unión al ARNm

ARN RIBOSÓMICO: ARNr

• Agrupa a varios ARN diferentes y constituye hasta un

80% del total de ARN de una célula.

• Se asocia a proteínas formando un ribosoma

• Son componentes estructurales de los ribosomas, los

cuales llevan a cabo la síntesis de proteínas. Allí

sirven como armazón al cual se unen las proteínas

ribosómicas.

• Las dos subunidades que conforman un ribosoma

tienen formas irregulares y encajan formando una

hendidura por la cual pasa el mRNA durante la

traducción.

Modelo de la estructura secundaria de dos rRNA de E. Coli

Estructura de un ribosoma bacteriano. La cuerda verde corresponde a mRNA

OTROS TIPOS DE ARN

ARN nucleolar (ARNn) • Se encuentran asociados a diferentes proteínas formando el

nucleólo. • Da lugar a los diferentes tipos de ARNr. ARN pequeños nucleares (ARNhn), precursor nuclear de los ARNm eucariotas. ARN pequeños citoplasmáticos (ARNsc), Ayudan a dirigir a las proteínas recién sintetizadas hacia sus destinos celulares. ARN virales (ARNs) con información genética, todos son monocatenarios. Otros tipos de ARN • Algunos se asocian con proteínas para formar

ribonucleoproteínas. • Existen algunos que pueden escindirse en varios fragmentos por

si mismos: autocatalíticos. • Algunos con función catalítica como las ribozimas

RIBOZIMAS

• ARN catalíticos que se encuentran en dominios plegados de una hebra de ARN.

• Catalizan una amplia gama de reacciones, relacionadas fundamentalmente con el metabolismo del ARN.

• Pueden catalizar la eliminación de intrones, en donde se corta una secuencia de ARN y luego se ligan los extremos resultantes. Este proceso ocurre durante la maduración del ARNm.