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BIOLOGIA MOLECULAR
Prof. Dr. José Luis da C. SilvaProf. Dr. José Luis da C. Silva
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A Biologia Molecular é o estudo da Biologia em nível molecular, com
especial foco no estudo da estrutura e função do material genético e
seus produtos de expressão, as proteínas. Mais concretamente, a
Biologia Molecular investiga as interações entre os diversos sistemas
celulares, incluindo a relação entre DNA, RNA e síntese protéica.
Relação com outras ciências biológicas de nível molecular.
BIOLOGIA MOLECULAR
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Programa (Ementa)
Visão histórica do gene – 11/06Estrutura e função do DNA e RNA – 11/06Replicação, transcrição e tradução – 11/06Regulação da Expressão gênica – 12/06Tecnologia do DNA recombinante – 12/06
Genômica e Bioinformática – 09/07PCR e Marcadores moleculares – 09/07Aplicações da Biologia molecular – 10/07 (Seminários)Eletroforese em gel – 10/07 (prática)
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Evolução do conceito de geneEvolução do conceito de gene
“O conceito de gene não é estático, ele se desenvolveu através de várias fases, desde que Wilhelm Johansen criou o termo em 1909, e
continua evoluindo”
1866 – Mendel definiu como “caráter ou fator unitário” que controlava uma característica fenotípica, tal como a cor das flor em ervilhas.
1900 – Garrod definiu como “um gene mutante-um bloqueio metabólico”
1939 – Beadle e Tatum definiram como “um gene – uma enzima”
1960 – Yanofsky e Brenner redefiniram “um gene – um polipeptídeo”
Refinando o conceito:
“ O gene é uma unidade de informação genética que controla a síntese de um polipeptídeo ou uma molécula de RNA estrutural”
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Do gene ao efeito no organismo
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Estrutura e função dos ácidos nucléicos
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Nucleotídeos
Ribonucleotídeo
Estrutura dos ácidos nucléicos
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Estrutura dos ácidos nucléicos
Bases Nitrogenadas
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Estrutura dos ácidos nucléicos
Polímero de nucleotídeos
Estrutura 1ária covalente
Fosfato 5’
3’ OH
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Estrutura dos ácidos nucléicos
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As cadeias polinucleotídicas adotam estruturas em Hélice
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Dupla hélice do DNA – Watson e Crick (1953)
Estrutura dos ácidos nucléicos
DNA B é a forma mais estável em condições fisiológicas
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Formas de DNAEstrutura dos ácidos nucléicos
Formas A e Z são encontradas
em cristais de DNA. A forma A
é favorecida em soluções mais
concentradas.
A forma Z pode estar
associada com a regulação da
expressão gênica e
recombinação in vivo.
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Dogma central da Biologia molecular
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A replicação é semiconservativa
Processo semiconservativo:
Durante a replicação, as duas fitas do DNA parenteral são copiados, originando moléculas filhas com somente uma das fitas novas sintetizadas. (Meselson e Stahl, 1958)
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Replicação do DNA
O mecanismo de replicação está baseado no pareamento das bases da dupla hélice do DNA.
A estrutura do DNA contém a informação necessária para perpetuar sua sequência de bases
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Genoma procariótico
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O genoma bacteriano circular constitue um único replicon
Um única origem de replicação em E.coli (OriC, 245 pb)
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DNA-POLIMERASES DNA-polimerase é a enzima que faz a síntese de uma nova fita de DNA.
Possui a capacidade de adicionar nucleotídeos na extremidade 3’OH de uma região pareada do DNA 5’ → 3’.
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Movimento da forquilha de replicação:A partir da origem, a replicação prossegue ao longo da fita de DNA, em uma ou ambas as direções, seqüencialmente até o termino.
Direção da replicaçãoA adição dos nucleotídeos para o crescimento da cadeia é sempre no sentido 5’ → 3’.
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Fita contínua (líder)
Fita descontínua
Forquilha de replicação
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DNA polimerases de E. coli
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PROTEÍNAS NA FORQUILHA DE REPLICAÇÃO DA E. coli
Animação replicação
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Transcrição A transcrição é realizada por um sistema enzimático que converte a informação genética de um segmento de DNA (gene) em uma fita de RNA complementar à fita molde.
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Fita molde (anti-senso) e codificadora (senso)
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A transcrição de procariotos e de eucariotos possui três eventos principais:
Iniciação - A RNA polimerase se liga a dupla fita do DNA na região denominada promotor. A iniciação é um passo muito importante na expressão gênica!!!
Elongamento - adição covalente de nucleotídeos a extremidade 3' da cadeia polinucleotídica crescente; isto envolve o desenvolvimento transitório de um curto trecho de DNA fita simples.
Término - Reconhecimento da sequência de término e liberação da RNA polimerase. Embora a transcrição seja realizada pela RNA polimerase, outras enzimas são necessárias para produzir o transcrito, além de outras proteínas. Estes fatores ou se associam diretamente com a RNA polimerase ou auxiliam na formação do aparato transcricional. O termo utilizado para descrever estas proteínas é fatores de Transcrição.
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Iniciação: Reconhecimento dos promotoresReconhecimento dos promotores pela subunidade σ70 da RNA polimerase em E. coli. Em condições fisiológicas a RNA pol está provavelmente ligada ao DNA, mas o reconhecimento depende da subunidade sigma.
Extremidade 5’ do gene (Montante)
ATG
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Sequências consensoRegiões -35 e -10 (TATA box ou Pribnow box)
Essas sequências são reconhecidas pela subunidade sigma70. Outros promotores apresentam alguma variação nas sequências consenso.
Após a ligação ao promotor e início da síntese, a subunidade sigma é liberada e funciona como um catalisador para outra RNAP ligada à um outro promotor ou ao mesmo promotor.
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O reconhecimento do promotor depende de seqüências consensuais.
Um promotor típico possui três componentes, sendo formado pelas seqüências consensuais em –10 e –35 e pelo sítio de início da transcrição.
A comparação com mais de 100 genes de E. coli, chegou-se as seguintes conclusões:
1) O primeiro nucleotídeo a ser transcrito (+1) é geralmente uma purina (A ou G).
2) Duas seqüências são altamente conservada nos genes comparados: uma localizada na região –10, que tem como consenso a seqüência TATAAT (TATA box ou Pribnow box), e outra localizada na região –35, que tem como consenso a seqüência TTGACA,
3) Que as regiões –10 e –35 são separados por 17±1 nucleotídeos (equivale a duas voltas da hélice).
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Os fatores sigma de E. coli reconhecem promotores com diferentes seqüências consensuais
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Complexo de Iniciação
Complexo fechado
Complexo aberto e iniciação
Liberação do sigma
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Complexo aberto – bolha de transcrição
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Fase: Alongamento
Após o desligamento da subunidade sigma ocorre uma alteração conformacional na RNAP tornando-a mais esférica e ativa durante o processo de alongamento.
O processo não é contínuo em algumas regiões, principalmente porque ocorre tradução simultânea do mRNA em bactérias. Ocorrem paradas rápidas e retomadas da transcrição.
A processividade é alta e a transcrição tem um índice de erro de 10-5.
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Ação da toposiomerases no relaxamento dos supercoil positivo
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Fase: Término da transcrição O RNA sintetizado participa ativamente do término de sua síntese, formando estruturas secundárias ou ligando-se a outros fatores.
Em E. coli: Terminação dependente de rho (ρ) Terminação independente de rho (ρ)
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Terminação independente de rho (ρ)Este tipo de terminação é responsável pelo término da transcrição de 90% dos genes bacterianos.
Uma sequência na região 3’ do gene, sinaliza o final da síntese do RNA.
É uma sequência repetida de As na fita molde (Us no RNA) que ocasiona uma longa pausa no alongamento da cadeia.
Nessa pausa ocorre o pareamento A:U entre a fita molde e o RNA desestabilizando o híbrido RNA/DNA. Este processo é auxiliado por uma proteína denominada NusA.
15-20 nucleotídeos antes do término rico em As é formado por sequências autocomplematares que formarão grampo de RNA.
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Terminação dependente de rho (ρ)
Não existem sequências ricas em As específicas, mas podem haver sequências autocomplementares.
A proteína Rho migra até encontrar a RNA pol parada e sua atividade helicase DNA/RNA dependente de ATP auxilia no desligamento do RNA sintetizado.
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Transcrição em Eucariotos RNA - POLIMERASES
RNA - Polimerase I: rRNA
RNA - Polimerase II: mRNA
RNA - Polimerase III: tRNA e outros RNAs nucleares
pequenos
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Um gene tipo transcrito pela RNA-polimerase II possui um promotor que se estende a montante a partir do sítio onde a transcrição é iniciada. O promotor contém vários elemento de seqüências curtos (<10pb), aos quais se ligam os fatores de transcrição, espalhados por >200pb. Um reforçador (enhancer),contendo elementos mais compactamente organizados, ao qual também se ligam fatores de transcrição, freqüentemente são alvos para a regulação tecido-específica ou temporal.
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Etapas são similares na transcrição,
contudo o processo é muito mais complexo e
regulado
Animação da transcrição
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Código Genético
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Tradução - poliribossomos
Animação da tradução