BIOLOGIA MOLECOLARE

Trascrizione delle lezioni dei giorni 13/10; 20/10; 27/10; 17/11; 24/11; 26/11.

Lavoro a cura di:

Francesco Tinelli

Alessio Rivolta

Giovanni Carnevale Miacca

Gabriele Colombo

Andrea Mereghetti

Martina Gambelunghe

Andrea Provera

Pietro Salmoirago

Studia responsabilmente! Non studiare se devi guidare.

INTRODUZIONE

•GENOTIPO= DNA; FENOTIPO= ciò che appare: siamo diversi ognuno dall'altro fenotipicamente ma possiamo avere parte del genotipo simile

Ormai la biologia molecolare è una disciplina che si interseca moltissimo con altre discipline come la biologia cellulare, la genetica, l'epigenetica --> condivisione in più discipline di concetti comuni. La biologia molecolare è entrata a far parte di molte discipline che un tempo erano tutte separate tra di loro: questo lo dobbiamo all'avvento della genomica (branca della biologia molecolare che si occupa dello studio del genoma degli organismi viventi). Attualmente siamo nel momento storico POST-GENOMICA: stanno sequenziando DNA e noi conosciamo tutte le basi nucleotidiche del DNA di varie specie viventi. Ciò ha permesso di creare un'altra modalità di approccio allo studio alla biologia. Anche la modalità di cura del paziente è cambiata: vivendo nella post-genomica possiamo fare diagnosi di malattia e curare in maniera più orientata al paziente.

CELLULA

Tutte le forme di vita condividono la stessa unità funzionale, nonostante la varietà dei genotipi. Le cellule sono le unità fondamentali della vita. Gli organismi viventi si riproducono trasmettendo informazione genetica alla loro progenie: tra un organismo vivente e l'altro trasmettiamo DNA. Nonostante la varietà dei fenotipi tutte le forme di vita condividono gli stessi meccanismi essenziali a livello della trasmissione e dell'espressione del fenotipo.

DOGMA CENTRALEPrima dell'era genomica il dogma centrale della biologia molecolare è stato questo:

DNA-->RNA-->PROTEINA (Watson e Crick hanno stabilito questo dogma).

Quello che si è sempre pensato in biologia molecolare è che dal DNA si passa al RNA e a ogni RNA corrisponde una proteina.Un'altra scoperta importante ha permesso di elaborare questa freccia tratteggiata e non continua tra RNA e DNA (figura 1). L'esistenza dell'enzima TRASCRITTASI INVERSA che è capace di passare da RNA a DNA. C'è anche una freccia tratteggiata che passa dal DNA alle proteine.

Questo dogma è stato rivisto: non sempre dal RNA si passa alla proteina: esistono degli RNA, che sono funzionalmente importanti ma non codificano proteine (miRNA, snRNA...)

GENE

Il Gene è una sequenza di DNA che codifica per una proteina e/o un RNA. Noi sappiamo che un gene può anche codificare un RNA che non dà luogo a una proteina:

quindi questa definizione di gene non è del tutto corretta.

Anche la definizione di gene è stata rivista: L'avvento della genomica ha messo in crisi la tradizionale definizione di gene, che è molto dibattuta.

DEFINIZIONE 1 LEWIN B. II Gene VIII (nome del libro) Segmento di DNA coinvolto nella produzione di una catena polipeptidica,

comprende regioni (leader e coda) che precedono e seguono la regione codificante, oltre alle sequenze intercalate (introni) tra i singoli elementi codificanti (esoni)

DEFINIZIONE 2 BROWN T.A. GENOMI 2 (altro libro) Segmento di DNA contenente informazioni biologiche, che codifica per una molecola di RNA e/o proteina: non si parla necessariamente della produzione di una proteina

Ambedue queste definizioni non possono essere considerate corrette alla luce delle attuali conoscenze. Ovviamente, se non ci si accorda sulla definizione di gene non è possibile determinarne il numero, anche assumendo di disporre della annotazione completa del genoma.

GENOMA

Il genoma è una lunga sequenza di DNA che

fornisce tutte le informazioni ereditarie dell’organismo. Fisicamente il genoma può essere diviso in un numero distinto di molecole di DNA, i cromosomi. Il genoma puo’ essere definito come la sequenza d i DNA contenuta in ciascun cromosoma. Funzionalmente il DNA è diviso in geni: ogni gene e’ una sequenza di DNA che codifica un solo tipo di RNA o di polipeptide/proteina. (definizione dal libro GENE X)

Tenendo conto delle definizioni di geni e genoma sin qui affrontate, in che maniera possiamo decidere se un fungo e’ parente più stretto di un vegetale o di un animale? In base a quale parametro cioè, siamo in grado di spiegare perchè siamo organismi più complessi di altri? L’analisi del genoma ci ha dato un mezzo più semplice, più diretto per determinare relazioni evolutive tra microrganismi. La sequenza completa del DNA di un organismo definisce la specie con alta precisione e con un dettaglio esauriente: tramite questa sequenza possiamo risolvere molte domande.

FILOGENESI DEI GENOMI ASSEMBLATI

L’analisi comparata dei genomi dei diversi organismi in corso di sequenziamento sta permettendo di comprendere meglio l’organizzazione e la funzione dei genomi. Si vede un allineamento e paragone delle sequenze dei diversi genomi: il paragone della sequenza di vari genomi che appartengono a specie diverse si chiama 'FILOGENESI DEI GENOMI ASSEMBLATI' . Un antenato comune si è separato, si è biforcato nei vari altri organismi: il verme/ moscerino della frutta e zanzara/ ascidia/ pesce palla/ uomo e topo; è sorprendente ad esempio che il pesce palla sia abbastanza simile all'uomo e al topo; il pesce palla è più simile all'uomo e al topo di quanto sia la scimmia, il verme o il moscerino; inoltre il verme e il moscerino sono simili tra loroQuesta filogenesi è stata possibile proprio perché noi conosciamo esattamente la sequenza di questi genomi: è quindi possibile allineare la sequenza dei genomi di questi microorganismi e scoprire quale è l'antenato comune e come le specie si sono evolute.

E' possibile, inoltre, misurare il grado di identità (omologia) dei geni dei diversi genomi, e estrapolare da quanti anni le due specie si sono separate dall’antenato comune.

I DOMINI DELLA VITA SONO Ci sono i PROCARIOTI (batteri), gli EUCARIOTI e gli ARCHEI. E' stato possibile distinguere questi 3 domini tramite l'allineamento/ confronto delle sequenze dell' rRNA: nel 1977 Woese e i suoi collaboratori scoprirono che i procarioti comprendono 2 gruppi molto

lontani tra di loro e quindi scoprirono l'esistenza degli ARCHEI. Gli ARCHEI hanno alcune caratteristiche comuni con i PROCARIOTI e altre con gli EUCARIOTI.

ARCHEOBATTERI Gli archeobatteri presentano una serie di caratteristiche e proprieta’ che li differenziano dagli eubatteri:

•Rna polimerasi simile a quella eucariotica

•Posseggono proteine simili agli istoni

•Struttura del promotore simile a quella degli eucarioti

•Traduzione inizia con una metionina

•Alcuni geni per tRNA e rRNA possono contenere introni

CHE SIGNIFICA ALLINEARE E CONFRONTARE DELLE SEQUENZE DI DNA DIVERSE TRA LORO? Prendendo le sequenze di uccello, topo e uomo e allineando le sequenze si vedono delle regioni che non sono simili tra loro e altre che invece sono molto simili. I puntini indicano le zone simili, omologhe

QUALI SONO LE BASI GENOMICHE DELLA CRESCENTE COMPLESSITA' DELLE SPECIE CHE SI SONO EVOLUTE SULLA TERRA E QUINDI DELL'UOMO?

Siamo degli organismi complessi; come si misura la complessità? Per complessità si intende:

•N° di tipi cellulari distinti in un dato organismo, ovvero la molteplicità di destini differenziativi

•La complessità delle funzioni (in particolare le funzioni cognitive): memoria, funzioni cognitive, espressione simbolica, linguaggio ecc...

•Siamo più complessi del batterio, dell'organismo unicellulare perchè siamo fatti da particelle e perchè ogni tessuto ha una funzione diversa; perchè

le cellule di quel tessuto si sono differenziate per dare una funzione diversa.

CURIOSITA': degli specialisti studiando la complessità hanno scoperto che dall'inizio del cambriano (1miliardo di anni fa) sono comparse forme di vita a complessità crescente Inoltre l'evoluzione delle forme di vita a maggiore complessità è stata assai rapida, relativamente alla storia della vita sulla terra

COSA INTENDO PER BASI GENOMICHE??

Quali sono le basi genomiche della crescente complessità delle specie che si sono evolute sulla terra? E quindi dell'uomo? Sulla base di cosa misuriamo la nostra complessità? Sulle dimensioni del genoma(più grande del topo o della pianta)? Sull'organizzazione del genoma? Sul numero e sulla funzione dei geni?

IL SEQUENZIAMENTO COMPLETO DI UN GRAN NUMERO DI GENOMI EUCARIOTICI HA PERMESSO DI OTTENERE UN QUADRO ABBASTANZA DETTAGLIATO CIRCA LA LORO STRUTTURA E ORGANIZZAZIONE

1° domanda: La complessità fenotipica riflette un maggiore contenuto di DNA?

Non sembrerebbe: se esaminiamo l’ immagine (figura 2) le dimensioni del genoma sono diverse: il virus ha un genoma di dimensione minore di un mammifero o di un batterio. Tuttavia le piante e le alghe hanno delle dimensioni maggiori delle dimensioni del nostro genoma.

Se osserviamo il grafico all'interno di alcune categorie (piante, alghe o anfibi) c'è un'eterogeneità di dimensione: nei mammiferi la colonna è stretta: questo significa che le dimensioni del genoma all'interno delle varie speci di piante, alghe o anfibi hanno dimensioni variabiliNON VI E' ALCUNA CORRELAZIONE TRA LE DIMENSIONI DEL GENOMA E LA COMPLESSITA' DELL'ORGANISMOLe dimensioni minime del genoma aumentano con la complessità del phylum (gruppo tassonomico gerarchicamente inferiore al regno e superiore alla classe), ma nelle piante le cose si complicano e quindi non può esserci correlazione diretta tra dimensioni del genoma e complessità

Gamma delle dimensioni dei genomi virali, procariotici ed eucariotici Per alcune classi di organismi (alghe e piante) lo spettro di variabilità delle dimensioni del genoma e’ molto ampio (dovuto prevalentemente alla frazione non codificante del

Figura 2

DNA). Non vi e’ correlazione tra le dimensioni del genoma e il numero dei cromosomi o tra il numero dei cromosomi e la complessità dell’organismo (Saccharomyces 13Mpb e 16 cromosomi, Drosophila 180 Mpb e 4 cromosomi: il secondo ha un genoma più grande ma meno cromosomi)

2°A) domanda: La complessità dipende dal numero di geni? No! La complessità non dipende dal numero di geni: sequenziando il DNA di specie diverse sappiamo che il riso ha circa 30.000 geni, mentre l'Homo Sapiens ne ha circa 25.000. Infatti per esempio anche il topo ha un numero leggermente superiore di geni rispetto all'uomo

2°B) domanda: la complessità dipende dalla funzione di geni? Durante l'evoluzione nuovi geni sono stati 'inventati', ciascuno portatore di nuove funzioni; se noi guardiamo lo schema per esempio tra gli eucarioti e i procarioti il 21% dei geni sono conservati: noi abbiamo acquisito nuovi geni, ma tanti geni sono conservati in varie specie. Il 21% dei geni umani (e in generale dei vertebrati) sono condivisi con organismi 'inferiori' fino agli organismi monocellulari eucarioti. Il 32% sono condivisi con tutti gli altri metazoi (organismi pluricellulari). Inoltre c'è un 24% di geni condiviso solo da vertebrati e animali . Un 22% infine è condiviso solo fra i vertebrati. Mano a mano che la complessità cresce si sono aggiunti dei geni con nuove funzioni durante l'evoluzione.

Certamente la complessità dei metazoi prima e quindi dei vertebrati poi, correla con la comparsa di nuovi geni e nuove funzioni (C'è un 20% comune a tutti gli eucarioti; un 10% addizionali negli eucarioti multicellulari e un 70% specifici nel genere).

3° domanda in che modo durante l’ evoluzione si sono generati nuovi geni e nuove funzioni?Come è stato possibile che si siano generati geni nuovi appartenenti solo a quella specie?

Il genoma è organizzato in maniera diversa: i geni occupano circa il 25% del genoma (per gene intendiamo la definizione solita: quel pezzo di DNA che dà forma al mRNA e quindi a una proteina). Le sequenze codificanti proteina però sono circa l'1% del genoma. Abbiamo un 45% che sono i trasposoni (elementi nuovi del genoma con la proprietà di potersi spostare in posizioni diverse del genoma) Gli pseudogeni sono lo 0.1%; Sequenze semplici ripetute sono circa il 3%; Duplicazioni di segmenti sono circa il 5%.

4° domanda : La complessità è in funzione delle dimensioni di genoma utile, ovvero codificante proteine?? Se noi andiamo a controllare la porzione codificante e quella non codificante del genoma nelle diverse specie vediamo che la maggior parte del genoma umano non è codificante; invece nell'E.Coli, un procariote, solo il 10% non è codificante ma la maggior parte è codificante. Le dimensioni del genoma utile- codificante proteine: il mammifero e l'anfibio hanno una dimensione della parte codificante maggiore. I geni occupano circa il 25% del genoma, ma le sequenze codificanti solo l'1-2% totale del

genoma nell'uomo (geni codificanti per proteine, tRNA e rRNA). La porzione non codificante è costituita da sequenze uniche e sequenze ripetute; queste si dividono in:

•Ripetizioni intersperse

•Ripetizioni in tandem

GENE = INTRONE + ESONE (codificante)

I GENOMI CONTENGONO FAMIGLIE DI GENI OMOLOGHI FRA LORO

Ad es. la famiglia delle globine in cui i vari membri di quella famiglia sono diversi, perchè dentro la proteina ci sono degli amminoacidi diversi e quindi della basi diverse nel DNA. Nell'ambito dei geni totali ci sono delle famiglie geniche. Il n° di geni per ogni singola famiglia genica aumenta all'aumentare della complessità degli organismi; se noi passiamo dal batterio e arriviamo all'uomo aumenta la complessità del numero di geni da famiglia a famiglia genica.FAMIGLIA GENICA(Wikipedia): gruppo di geni che mostrano una certa similarità di sequenza di DNA e derivano tutti da una gene ancestrale comune. Tra queste famiglie quella più studiata è quella delle globine (emoglobina, mioglobina..) i cui geni codificano per le catene polipeptidiche delle emoglobine fetali e adulte .

GENI CODIFICANTI PER LE PROTEINE

Esistono:

•Geni presenti in un'unica copia (single-copy genes)

•Geni omologhi presenti in copie multiple ed organizzati in famiglie geniche

I membri di una stessa famiglia genica possono essere localizzati in un unico cluster, possono essere dispersi oppure possono essere localizzati su più cluster. Per esempio i geni dell'alfa globulina sono presenti in cluster, cioè in raggruppamenti genici; altri geni come la piruvato deidrogenasi o l'aldolasi sono dispersi in zone diverse del genoma oppure ci sono dei geni come gli HOX, molto importanti per lo sviluppo dei microorganismi che sono localizzati in più raggruppamenti, in più cluster.

PERCHE' ESISTONO DELLE FAMIGLIE GENICHE?

Perché delle tubuline esistono più famiglie, e non esiste solo un tipo di tubulina ma esiste sia l'alfa che la beta tubulina? Queste proteine hanno funzioni diverse; perché nell'organismo è stato necessario, da un punto di vista evoluzionistico sviluppare un'alfa e una beta tubulina? L'evoluzione ha un senso logico: esse hanno funzioni diverse perché nella cellula è difficile pensare che ci sia una RIDONDANZA di funzione(vuol dire che quel microrganismo aveva bisogno di avere sia una alfa che una beta tubulina; serviva quella funzione particolare). Sempre c'è un certo differenziamento nelle proteine, tra diverse isoformeNella cellula ancestrale, tanti miliardi di anni fa esisteva soltanto la tubulina; poi il gene

si è duplicato formando alfa tubulina e beta tubulina e poi si è avuta una divergenza: esse hanno sequenze amminoacidiche diverse e quindi si è introdotta una diversità dovuta a differenti sequenze amminoacidiche.

GENI PARALOGHI

L'alfa tubulina e la sua beta tubulina umana si definiscono PARALOGHI.Due geni si definiscono paraloghi tra loro quando, derivando da un gene comune, subiscono un evento di duplicazione (alpha e beta globina nell’uomo). Due o più geni paraloghi, dunque, si possono trovare in differenti microrganismi, anche filogeneticamente lontani tra loro.

GENI ORTOLOGHI

I geni ORTOLOGHI sono invece ad esempio all'alfa tubulina umana e l'alfa tubulina del C-elegans, della Drosophila che sono simili.Geni ortologhi sono i geni che, in organismi differenti(es. uomo e topo), codificano per le stesse proteine. (Alfa tubulina umana e alfa tubulina del C.Elegans).

Affinché un gene possa essere definito ortologo, convenzionalmente, si considera la percentuale di analogia delle sequenze nucleotidiche. Una percentuale di analogia pari o superiori all'80% definisce due o più geni ortologhi tra loro (cioè sono simili all'80%). I geni ortologhi, dal punto di vista evolutivo, derivano da linee ancestrali comuni (b-globina in uomo e topo).

FGF (Fibroblasts Growth Factor) (altro esempio) Il genoma di un'ascidia (Ciona Intestinalis) contiene 6 geni per FGF; questi geni poi si diversificano nell'ambito delle varie specie. Possiamo quindi identificare 6 famiglie.La duplicazione genica, generando diversità biologica, è uno dei principali meccanismi evolutivi. La maggior parte degli animali possiede essenzialmente gli stessi geni: in questo caso le diverse copie di FGF degli invertebrati sono derivate per duplicazione genica dei 6 geni codificanti per FGF dell'antenato comune (cioè dei 6 ortologhi).

DUPLICAZIONE GENICA

Abbiamo detto che uno dei principali meccanismi che ha sostenuto e sostiene l'evoluzione dei genomi è la duplicazione genica: COME PUO' LA DUPLICAZIONE DEI GENI GENERARE DIVERSITA' BIOLOGICA?? 1)Le regioni codificanti i geni duplicati subiscono nuove mutazioni generando nuove funzioni: ad esempio il gene alfa globina nell'uomo è simili al quello del topo per l'80% (quando si parla di queste percentuali di similitudine ci si riferisce alla sequenza delle

proteine e non alla sequenza del DNA che in realtà è molto più diversa); la diversità quindi è dovuta, dopo l'evento di duplicazione a mutazioni che hanno prodotto il cambiamento della sequenza di amminoacidi nelle proteine corrispondenti (MUTAZIONI IN FATTORI DI TRASCRIZIONE). 2)I geni duplicati acquisiscono nuove sequenze regolatrici di DNA, permettendo alle diverse copie duplicate di un gene di essere differenzialmente espresse all'interno dell'organismo durante lo sviluppo: la diversità può quindi derivare anche dalla modificazione dei regolatori del DNA (il promotore o delle sequenze regolatrici) che regolano ad esempio l'espressione di un gene a valle.

LA DUPLICAZIONE DEI GENI DELLE GLOBINE HA PRODOTTO NUOVI SCHEMI DI ESPRESSIONE E FUNZIONI PROTEICHE DIVERSE (due famiglie: alfa e beta globine) Queste diverse emoglobine hanno diverse caratteristiche funzionali come ad esempio l'affinità per l'ossigeno: perchè è stato necessario generare un'alfa e una beta globina? Perchè poi sono state generate delle globine che hanno attività diversa e quindi delle funzioni dentro la cellula diversificate tra di loro (rispetto all'emoglobina e alla mioglobina). Questo è avvenuto nel corso dell'evoluzione, in milioni di anni.Altro esempio: nei primati ad esempio esistono 5 diverse beta globine: la diversificazione ha comportato dei vantaggi selettivi durante le divisioni

Le diverse globine, ottenute per duplicazione genica durante l’evoluzione hanno acquisito:

•Proprietà diverse (Hb fetale γ conferisce una maggiore affinità per l’ ossigeno)

•Sequenze promotore diverse che ne permettono una conferiscono una distinta regolazione della trascrizione (i regolatori hanno fatto sì ad esempio che Hb gamma è espressa solo nella vita fetale; Hb beta è espressa solo dopo la nascita).

Si vede quindi che la duplicazione di geni, l'acquisizione di mutazioni, l'acquisizione di modifiche all'interno di sequenze regolatrici hanno permesso durante la scala evolutiva di diversificare funzionalmente le diverse proteine e quindi di acquisire delle funzioni diverse che si sono selezionate in maniera diversa nei diversi organismi.

Se la duplicazione genica interessa un fattore di trascrizione, quale può essere l'impatto sull'evoluzione, ovvero sull'acquisizione di nuove funzioni?? Un fattore di trascrizione può regolare positivamente o negativamente l'espressione genica. Quindi l'acquisizione di una mutazione in un fattore di trascrizione potrebbe comportare che quel fattore diventi attivatore di trascrizione in una specie o repressore di trascrizione in un'altra specie (regolazione positiva o negativa: in questa maniera possiamo avere la funzione di un gene accesa in una specie o in un tessuto oppure spenta in un'altra/o.

NUOVI GENI SONO GENERATI DA GENI PREESISTENTI, NESSUN GENE E' INTERAMENTE NUOVO: E' un concetto fondamentale ed un meccanismo importante di generazione di diversità è la duplicazione genica; inoltre i nuovi geni non sono generati ex novo ma derivano sempre da geni preesistenti che si sono duplicati o si sono modificati durante la divisione. L’innovazione puo’ verificarsi per: 1)  Mutazione intragenica (soprattutto per errori durante il processo di reduplicazione del DNA) 2) Duplicazione genica 3) Rimescolamento di segmenti 4) Trasferimento orizzontale (intercellulare)

3)Il genoma è un genoma attivo e quindi dei pezzi di DNA possono anche rimescolarsi tra di loro: la nostra diversità nella meiosi si ha nel crossing-over ad esempio e questo permette la ricombinazione e la diversificazione dell'inidividuo che viene generato rispetto agli individui parentali4)Trasferimento di materiale genico tra cellula e cellula

IL DNA in ogni cellula è identico: tutte le cellule contengono l'intera informazione; ciò che si modifica è la regolazione del DNA, tutto ciò che si esprime, che viene trascritto ad esempio tra una cellula del tessuto muscolare e una cellula nervosa.Ogni cellula, in una data circostanza utilizza solo una parte del suo genoma, ovvero trascrive e quindi traduce solo una quota dei suoi geni. Il genoma è composto di circa 30.000 geni e solo l'1% è codificante: solo una piccolissima parte del genoma è attiva.Piccole mutazioni in fattori di trascrizione e/o in elementi delle sequenze di DNA regolatrici (promoters, enhancers,...) possono causare cambiamenti di espressione genica e fenotipici anche drammatici.

RIASSUNTO con riferimento all'inizio: allineando le sequenze dei singoli geni all’interno dei genomi delle diverse specie, è possibile misurare il loro grado di identità (omologia) e estrapolare da quanti anni le due specie si sono separate dall’antenato comune. Da 400 milioni di anni (antenato comune fra pesce palla e uomo) il genoma è variato pochissimo: oltre il 75% dei geni sono facilmente allineabili. Da 50 milioni di anni (antenato comune fra topo e uomo) nessun nuovo gene è stato inventato: tutti i geni dell'uomo hanno un omologo nel topo

Quesito irrisolto: perche' ad un certo punto dell'evoluzione c'è stata la necessità nel topo di duplicare per mutazione un gene preesistente che poi si conservasse nell'uomo e che se espresso in eccesso fosse responsabile della formazione di un tumore?

DALL'ANALISI COMPARATA DEL GENOMA EMERGE CHE LA COMPLESSITA' DEGLI ORGANISMI NON E' COLLEGATA CON IL NUMERO DI GENI, MA CON IL NUMERO DEGLI SCHEMI DI ESPRESSIONI (COMBINAZIONI DI GENI DIVERSI). Non siamo più intelligenti rispetto agli altri organismi perchè c'è più DNA ma perchè la regolazione genica di questo DNA è diversa.

ALCUNE NOZIONI

•Il C. Elegans è il verme ed è studiato perchè i meccanismi al suo interno sono meno complessi; il C.Elegans ha 20.000 geni, la Drosophila 14.000 ma quest'ultima ha un fenotipo più complesso del C.Elegans

•1 gene di Drosophila può essere regolato da 3-4 enhancer distinti, generando ca 50.00 schemi di espressione diversi;

•1 gene di C.Elegans è regolato da 1,2 enhancer distinti generando 30.00 schemi di espressione diversi--> quindi è un organismo che presenta complessità inferiore

•I vertebrati superiori hanno dei meccanismi sofisticati di regolazione genica in grado di produrre molti schemi di espressione genica

•L’uomo ha un numero sorprendentemente basso di geni: 25-30.000. Le stime prevedevano almeno 100.000 geni .

•L'uomo rispetto al topo, che contiene all'incirca lo stesso numero di geni, ha degli schemi di espressione completamente diversi e molto più numerosi

UOMO E TOPO -Circa 25-28.00 geni -L'80% di questi geni sono perfettamente allineabili tra topo e uomo-Il 20% derivano da eventi di duplicazione discendenza specifici UOMO E SCIMPANZE' -98% dei geni sono conservati; per es. se si prendono 2 ascidie (animale marino) della stessa popolazione i loro geni differiscono dell' 1.5%, in due popolazioni diverse del 2.5%-Uomo, scimpanzè e topo: elevata sintenia (associazione di due o più geni in uno stesso cromosoma)

STUDIO SCIENTIFICO SU NATURE: livelli di mRNA nel fegato dell'uomo, nello scimpanzè e nell'orangotango: non hanno fatto un confronto sul genoma ma sull'espressione dei geni: hanno trovato che la diversità tra la scimmia e l'uomo è nell'espressione di mRNA rappresentativi di fattori di trascrizione. La diversità sta nell'espressione di questi fattori di trascrizione che è diversa tra uomo e scimpanzé.

CROMATINA

Trascrizione: procarioti ed eucarioti

Due differenze principali della trascrizione negli eucarioti e nei procarioti: nei procarioti la trascrizione avviene su un filamento di dna stampo, negli eucarioti avviene su uno stampo di cromatina. Questa è una prima differenza fondamentale.

Ma cosa si intende per cromatina e cosa significa che la trascrizione negli eucarioti è più complessa e ha bisogno di un sistema più elaborato che nei procarioti?

Il fattore sigma della RNA polimerasi batterica legge il dna per trovare il suo promotore, non ha bisogno di altre proteine. È sufficiente che trovi il promotore per iniziare a trascrivere. La RNA polimerasi degli eucarioti non legge il dna, per cui l’ inizio della trascrizione coinvolge numerose altre proteine che si devono pre-legare al dna per reclutare in un secondo momento la RNA polimerasi.

Che cosa è la cromatina?

All’ interno della cellula il dna è associato con proteine in un complesso chiamato cromosoma. Parliamo di cromosoma perché ci troviamo in un momento particolare, la metafase del ciclo cellulare. La metafase è tra l’ altro il momento in cui in citogenetica è possibile fare un cariotipo. Il cromosoma rappresenta un sistema particolare di condensazione del dna. I bastoncelli che vediamo in metafase esistono perché in quel momento il dna è ripiegato in una struttura particolare. Nelle cellule eucariotiche l’ associazione del DNA più proteina forma una struttura chiamata cromatina. La cromatina sottintende che non stiamo parlando solo di DNA, ma di DNA complessato con proteine.

La componente proteica svolge la funzione di condensazione del DNA che deve stare in uno spazio molto piccolo, 10/15 micron. Per questo per stare in uno spazio così piccolo deve essere compattato. Le proteine istoniche servono a far ripiegare il DNA e formare la cromatina. La cromatina appare al microscopio come un filo di perle e consiste in una serie compatta di particelle discrete, che si possono osservare all’ esame microscopico, hanno una dimensione all’ incirca nell’ ordine dei 10 nanometri, e vengono chiamate nucleosomi.

Ma cosa sono i nucleosomi?

Si tratta di granuli con diametro di circa 10 nanometri: la cromatina digerita con nucleasi micrococcica aspecifica ( digerisce indipendentemente dalla sequenza di DNA, ovunque il DNA sia libero e accessibile) taglia nel DNA linker e rilascia gruppi di particelle, e alla fine, singoli nucleosomi di 10 nm di diametro.

La conformazione della cromatina può essere più complessa con fibra di 30 nm o meno complessa con fibra di 10 nm. Il DNA non è normalmente coerente con la cellula perché deve essere contenuto in un nucleo molto piccolo, a meno che non venga compattato. questo compattamento è il risultato dell’ associazione del dna con istoni per formare la struttura nucleosomica. Se noi digeriamo questo nucleo che contiene cromatina con una dnasi micrococcica: la nucleasi digerisce la cromatina in tanti pezzi. Se si fa poi un’ elettroforesi, il dna si separa sulla base della sua carica elettrica e va verso il polo positivo (è carico negativamente) e sulle dimensioni del frammento. Questo significa che il frammento più piccolo migrerà più velocemente e percorrerà più spazio, mentre i frammenti più grossi migreranno più lentamente percorrendo meno spazio. Scindendo quindi la cromatina con la dnasi che digerisce solo nei punti in cui non sono presenti proteine, si creano dei frammenti discreti che solitamente sono dei multipli di 200bp. Questo dimostra che il nucleosoma ha in qualche modo una dimensione

intorno alle 200bp. Inoltre è fondamentale sapere che la dnasi può agire solamente su quelle porzioni di dna libere da proteine, il dna-linker che è la porzione di DNA tra un nucleosoma e l’ altro. A seconda di quanta dnasi abbiamo utilizzato, avremo dei monomeri o dei dimeri con una lunghezza multipla di un complesso standard grande all’ incirca 200bp. In questo modo si comprende che il dna non è una molecola lineare di esoni e introni, ma ha una struttura con collana a filo di perle costituito interamente da nucleosomi. In conclusione: il nucleosoma monomerico contiene il dna corrispondente ad un unità di lunghezza (200bp), il dimero a due unità di lunghezza e così via.

Più del 95% della cromatina è ritrovato in forma di scala di 200 bp. Tutto il dna è quindi organizzato in nucleosomi. Il core dei nucleosomi è però di 146bp: inizialmente la dnasi micrococcica taglia tra i nucleosomi, e alla fine si ottiene l’ unità minima: il core di 146bp. Il dna microsomico non è facilmente accessibile alla dnasi micrococcica, che può solo digerire a livello del dna-linker. È però in grado di idrolizzarlo in alcune regioni ipersensibili e queste regioni rendono possibile mapparlo.

Da che cosa è costituito il nucleosoma?

Approssimativamente esso è costituito da uguali masse di dna e istoni, compreso H1, che è disposto in maniera diversa e ha una funzione diversa dagli altro quattro tipi di istoni, H2A, H2B, H3, H4, che a coppie costituiscono l’ ottamero istonico. La massa di dna e istoni è simile per tutti i nucleosomi, ed è di circa 262 KDa. Il DNA occupa la

maggior parte della superficie esterna del nucleosoma , che ha la forma di un cilindro piatto con altezza di 6nm, di cui 4nm sono occupati da due giri di dna. La parte interna è invece costituita dalla proteine istoniche organizzate in ottamero (figura 3). Importante è quindi sottolineare che il dna nella sua organizzazione compie 1,7 giri attorno all’ ottamero istonico. In virtù dell’ avvolgimento del dna attorno al nucleosoma, dei siti che sarebbero situati molto lontani fra di loro da un punto di vista di sequenza, possono trovarsi vicini, e quindi accessibili. È un tipo di struttura che spiega come sia possibile che una molecola di dna molto grande, sia contenuta in un nucleo tanto piccolo. Inoltre, dal momento che il nucleosoma è caratterizzato da una spazialità sua tutta particolare, dovrà esistere un meccanismo, molto fine, che fa si che questo dna da trascrivere ad un certo momento venga liberato dalle proteine e possa essere trascritto e tradotto, cioè un sistema

che permetta la regolazione della trascrizione.

A questo punto si deve tenere in conto che sul dna troviamo anche proteine diverse da quelle istoniche, che si attaccano e si staccano e fanno si che il gene venga trascritto.

Importante sapere è anche che gli istoni interagiscono a due a due formando degli etero dimeri : H3 con H4 e H2A con H2B per formare dimeri e tetrameri istonici. L’ interazione tra l’ istone H1 e l’ ottamero non è ancora ben chiara, si sa tuttavia che H1 può essere rimosso senza influenzare la struttura del nucleosoma, a causa della sua posizione esterna.

Approfondiamo ora il discorso sugli istoni.

Gli istoni sono delle proteine e come tutte le proteine possiedono dei domini proteici, che servono per interagire con un substrato. Per dominio proteico si intende una porzione di proteina simile, che si conserva tra quelle proteine che hanno una stessa funzione ( es: proteina SRC con dimini SH2, SH3, dominio con attività chinasica..ecc.) Le proteine istoniche sono delle proteine che regolano la trascrizione, legandosi al dna per formare il nucleosoma. Queste hanno anch’esse dei domini conservati , tra loro simili (con sequenza simile).

Questi domini sono: 1) Dominio “Histone Fold” che serve proprio per ripiegare il dna ed è importante per la formazione dei complessi intermedi (dimeri e tetrameri); 2) la porzione N-terminale.

L’ assemblaggio di un nucleosoma prevede l’ associazione ordinata delle proteine con il dna. In particolare l’ “Histone Fold” permette l’ associazione tra gli istoni H2A e H2B a formare i dimeri e degli istoni H3 e H4 a formare il tetramero.

Il processo di assemblaggio del nucleosoma prevede alcune tappe fondamentali (figura 4):

1.Formazione di dimeri e tetrameri;

2.Associazione del tetramero con il DNA;

3.Reclutamento del dimero.

Le code degli istoni sono prive di ordine e fuoriescono da entrambe le faccie del nucleosoma (come anche si vede in figura 2) e fra i due avvolgimenti del DNA e sono accessibili da parte delle proteasi e alle modifiche trascrizionali. L’ istone viene infatti modificato da alcuni enzimi, estremamente importanti nelle mutazioni (es: nella leucemia si è identificata un’ anomalia in un enzima che modifica le code degli istoni).

Figura 4: processo di associazione del nucleosoma.

Queste code sono quindi libere e modificabili. A seconda di dove viene modificata la coda istonica e a seconda del tipo di modificazione, il gene può essere acceso o spento. Può quindi essere una modificazione che regola la trascrizione del gene, in modo positivo o negativo.

Quali sono le modificazioni possibili?

Le code degli istoni possono subire:

•Acetilazione: generalmente coinvolge i residui di lisina (neutralizza la sua carica positiva);

•Metilazione: generalmente coinvolge i residui di lisina o arginina;

•Fosforilazione: a carico di serina o treonina;

•Ubiquitinazione: a carico di lisina.

Una particolarità ad esempio è che gli istoni del core appena sintetizzati hanno uno specifico schema di acetilazione che viene rimosso dopo che gli istoni sono assemblati nella cromatina (figura 5). Queste modificazioni sono aggiunte o rimosse dai nucleosomi incorporati nella cromatina per regolare la trascrizione: quando i residui degli istoni

sono acetilati il gene è attivo; quando sono deacetilati il gene è inattivo.

Ogni modificazione svolge una funzione ben precisa. Esiste un codice istonico che può essere letto da proteine coinvolte nell’ espressione genica, regolando in senso positivo o negativo la trascrizione.

Le code degli istoni modificati possono anche servire a reclutare sulla cromatina specifiche proteine (acetilasi, metilasi, demetilasi ecc.). Le proteine che vengono reclutati possiedono ulteriori domini proteici (bromodomini, cromodomini, domini TUDOR e PHD) riconoscono specifiche forme modificate e specifiche delle code istoniche. In altre parole, la proteina che ad esempio possiede un bromodominio, è quella che riconosce una coda acetilata, e fa si che possa essere regolata la trascrizione eliminando quelle proteine che invece la impediscono. In genere l’ acetilazione

aumenta la trascrizione mentre la metilazione inibisce la trascrizione. Oltre agli eventuali bromodomini, cromodomini, domini TUDOR o PHD, le proteine reclutate possiedono anche altri domini: ad esempio la proteina Snf2 oltre ad un bromodominio possiede anche un dominio di “Elicasi C”.

Esistono anche varianti istoniche che possono alterare la funzione del nucleosoma e queste variaanti sono:

•H2A.X variante di H2A largamente distribuita nelle cellue eucaristiche; quando il dna subisce una rottura (ad esempio se colpito

da radiazioni ionizzanti) proprio questa variante istonica adiacente alla rottura viene fosforilato e riconosciuto da enzimi che riparano il DNA.

Figura 5

•Esistono anche altre varianti che però non è importante ricordare, ma esistono.

Esistono quindi varianti istoniche che attivano importani funzioni.

Ma come sono organizzati i nucleosomi nella fibra di cromatina? Parliamo di eucromatina e eterocromatina. La differenza tra le due strutture è data dalla modalità con cui i nucleosomi in queste diverse regioni cromosomiche sono o non sono assemblati in complessi di dimensioni maggiori. Avremo l’ eterocromatina che è inattiva trascrizionalmente, mentre l’ eucromatina è trascrizionalmente attiva. Nell’ eterocromatina i nuclesomi sono compattati per inibire la trascrizione, mentre nell’ eucromatina i nucleosomi sono assemblati in modo più lasso (figura 6).

La cromatina può dunque attraversare diversi livelli di condensazione:

•La fibra da 10 nm parzialmente svolta è costituita da una stringa di nucleosomi e rappresenta il livello meno condensato della struttura della cromatina (eucromatina);

•La fibra da 30 nm è un’ elica doppia formata da due file di nucleosomi avvolte in solenoide o a zig-zag (eterocromatina). L’ istone H1 non fa parte del core del nucleosoma, ma si può legare esternamente al nucleosoma promuovendo la formazione della fibra da 30nm (folded chromatin).

La struttura a diversi livelli di condensazione (figura 5) della cromatina permette di comprendere meglio anche la struttura e la funzione dei cromosomi.

Ricordiamoci inoltre che sulla superficie del nucleosoma la struttura del DNA varia:

•È avvolto 1,67 volte attorno all’ ottamero;

•Il DNA nucleosomale mostra regioni in cui è curvato in modo regolare e regioni con piegature;

•Sulla superficie del nucleosoma il DNA è avvolto a 10,2 bp/giro invece che 10,5 bp/giro in soluzione acquosa (è meno avvolto).

Ci sono delle sequenze di DNA su cui gli istoni si assemblano preferenzialmente per formare i nucleosomi?

Ovviamente non tutte le regioni genomiche sono uguali, in alcune c’è un forte posizionamento (regioni genomiche dove è più facile posizionarsi ed assemblarsi con altre proteine istoniche), in altre la posizione dei nucleosomi è molto più indeterminata (si potrebbero formare ovunque). Si parla dunque di un posizionamento intrinseco e di un posizionamento estrinseco:

•Intrinseco: per qualche motivo strutturale, quel DNA tende

Figura 6

a catturare l’ ottamero in una precisa regione;

•Estrinseco: posizionamento indotto da qualche altro fattore, ad esempio la presenza di una proteina legata ad una specifica sequenza di DNA.

L’ unità più piccola del nucleosoma è di 146 basi. Un nucleosoma non si può quindi posizionare se si hanno a disposizione ad esempio 50 basi. Lo spazio minimo di posizionamento dei nucleosomi è di 146 basi.

Esiste inoltre la possibilità per alcune proteine di legarsi al nucleosoma. Una volta legate al DNA facilitano la deposizione del nucleosoma in posizione adiacente alle proteine stesse. In nucleosomi si formano di preferenza sul DNA curvo e le sequenze A-T sono più inclini ad avvolgersi in un nucleosoma.

I nucleosomi sono quindi strutture molto dinamiche: si svolge e riavvolge attorno al nucleo del nucleosoma.

Ma come è possibile replicare da una cellula madre ad una cellula figlia un particolare nucleosoma?

La replicazione della cromatina, ad esempio, richiede l’ assemblaggio dei nucleosomi e una loro certa dinamicità:

1.La replicazione separa i filamenti di DNA e quindi inevitabilmente, porta alla distruzione della struttura del nucleosoma, anche se è limitata alle immediate vicinanze della forcella re plicativa;

2.Una volta che il DNA è stato replicato, i nucleosomi si formano velocemente su entrambi i duplicati;

3.Gli ottameri istonici non sono mantenuti durante la replicazione mentre sono conservati i tetrameri e i dimeri.

La replicazione della cromatina, in ogni caso, non vede alcun LUNGO periodo in cui il DNA è privo di istoni, poiché è estremamente rapida. Il passaggio della forca re plicativa rimuove gli ottameri istonici del DNA e questi si dissociano nei tetrameri H3/H4. I tetrameri e i dimeri sono trasferiti dietro le forche di replicazione e quindi reinseriti nel nuovo DNA (figura 7).

Dal momento che lo stampo di DNA è incorporato nei nucleosomi, anche l’ allungamento come l’ inizio della trascrizione avviene in presenza degli istoni.

Come può l’ RNA polimerasi trascrivere attraverso queste potenziali barriere?

Figura 7

Esiste una proteina , la proteina FACT che è capace di smantellare i nucleosomi rimuovendo un dimero e riassemblarli nuovamente dietro l’ RNA polimerasi permettendo la trascrizione (figura 8).

Figura 8

L’ RNA polimerasi è più grande del nucleosoma e per questo deve esistere questo meccanismo perché potesse accedere al DNA e attivare la trascrizione.

La struttura della cromatina è stabile, è necessario che si modifichi per la replicazione e la trascrizione del DNA, ma nelle cellule figlie ritorna stabile. La maggior parte dei geni trascritti mantiene una struttura nucleosomica anche se l’ organizzazione cambia durante la trascrizione. L’ RNA polimerasi rimuove gli ottameri istonici durante la trascrizione in vitro ma gli ottameri si riassociano al DNA non appena la polimerasi è passata.

NUCLEOSOMI

I nucleosomi sono strutture che si modificano durante la replicazione e si devono modificare affinchè il DNA venga duplicato e trascritto. Il DNA in seguito alla presenza di questo complesso proteico non sarebbe accessibile (l'unica parte accessibile sarebbe il DNA-linker presente tra un nucleosoma e l'altro). I nucleosomi vengono dunque rimossi e riassemblati durante la replicazione.RNA polimerasi non può accedere al DNA anche perchè più grande del nucleosoma stesso (500 KDa RNA pol vs 300 Kda nucleosomi). Dopo la replicazione le cellule si dividono generando cellule figlie, dunque la struttura deve ricomporsi come nella cellula madre. Si deve dunque ereditare non solo l'informazione genetica ma anche quella epigenetica. Per EPIGENETICA si intende tutto ciò che regola la funzione di un gene.

CONCETTI: 1) La maggior parte dei geni trascritti mantiene organizzazione nucleosomica anche se l'organizzazione della cromatina cambia durante la trascrizione.2) RNA pol rimuove gli ottameri istonici durante la trascrizione, ma si riassociano al DNA non appena la polimerasi è passata 3)I passaggi sono i seguenti: RNA pol lega il promotore, libera iò DNA dalla struttura del nucleosoma, passa, trascrive e poi il nucleosoma si riforma in una nuova posizione.

RIMODELLAMENTO DELLA CROMATINANel nucleo eucariotico il meccanismo è più complesso perchè si necessita di un complesso proteico per disassemblare il nucleosoma. Il rimodellamento della cromatina è un processo attivo: per cambiare il posizionamento dei nucleosomi sono necessari rimodellatori della cromatina (complesso di proteine). Il loro funzionamento è associato a meccanismi ATP dipendenti, quindi in queste proteine si può riscontrare la presenza di domini ATPasici. Quando l'ottamero è rilasciato dal DNA, altre proteine come fattori di trascrizione, RNA POL e altri partner importanti possono legarsi.Esistono diversi meccanismi di rimodellamento della cromatina (vedi immagine a lato). Es: per scivolamento, espulsione del nucleosoma, espulsione di parte del nucleosoma oppure possono partecipare delle varianti istoniche che facilitano il rimodellamento stesso. Si può anche avere modificazione della spaziatura tra un nucleosoma e l'altro, cosicché il DNA o RNA pol possono entrare e associarsi al DNA.

Lo scopo del rimodellamento è dunque liberare il DNA avvolto sul nucleosoma, modificando anche l'organizzazione del nucleosoma stesso. Il rimodellamento della cromatina può anche servire ad impedire la trascrizione, spostando i nucleosomi sulle sequenze essenziali del promotore invece che rimodellarli; detto in parole povere: il nucleosoma si sposta sul promotore così che l'RNA polimerasi non si possa legare al promotore stesso, non attuando di conseguenza la trascrizione.Ad es: immagine qui sotto.In questo caso si ha spostamento dei nucleosomi in maniera dinamica che permette al gene di essere trascritto. Quando la cromatina è attiva i nucleosomi si spostano in tutte le direzioni per permettere la trascrizione del gene, dato

che vi sarà una carenza di Istidina 3 ed è quindi necessario produrla

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COMPLESSI PER IL RIMODELLAMENTOPer rimodellare la cromatina sono necessari dei complessi che sono classificati in base alla sottofamiglia di ATPasi utilizzata come subunità catalitica. Ricordiamo che la subunità catalitica è quella parte che contraddistingue la funzione stessa dell'enzima. Questi complessi enzimatici di rimodellamento sono dunque diversi perchè nelle loro subunità catalitiche contengono amminoacidi diversi. CI SONO QUATTRO FAMIGLIE PRINCIPALI DI RIMODELLATORI (vedi immagine a lato): la parte viola rappresenta il dominio ATPasico; la parte gialla il bromodominio; la parte rossa il cromodominio.

Un rimodellatore presenta tante subunità con funzioni diverse, che possono a loro volta regolare geni particolari o positivamente o negativamente regolandone la funzione. Es: regolazione di visione cellulare, regolazione degli oncogeni, regolazione di vie di segnalazione...ecc. Queste proteine dunque favoriscono o meno il sito di inizio di geni diversi che hanno funzione diverse.

MODIFICATORI

I modificatori hanno funzioni importanti, quali la regolazione della trascrizione

attraverso modificazione della cromatina. Per fare questo è necessario modificare le proteine istoniche che fanno parte dei nucleosomi e che poi dicono ai geni se cominciare o inibire la trascrizione. Due modificazioni importante sono l' ACETILAZIONE o DEACETILAZIONE, ad opera di due enzimi:

•ISTONE ACETIL TRANSFERASI (HAT) per l'acetilazione

•ISTONE DEACETILASI (HDAC) per la deacetilazione

Si può avere in clinica un utilizzo pratico di inibitori per HAT per la cura della leucemia promielocitica o per la cura di linfomi.

IMPORTANTE: HAT acetila e attiva l'espressione genica; HDAC toglie residui acetilati dagli istoni e inibisce la trascrizione HAT acetila sui residui di Lisina.

Esistono diversi tipi dell'enzimi acetiltransferasi, gruppo A e B che permettono di agire su istoni della cromatina o nel citosol. Altro concetto è il fatto che alcune acetiltransferasi contengono bromodomini: quindi sono reclutate da istoni acetilati.

APPLICAZIONE CLINICA: vi sono delle proteine oncogeniche appartenenti ad un adenovirus che legano una proteina P300 impedendo l'attività di HAT e quindi impedendo la trascrizione di geni che regolano negativamente la proliferazione cellulare; la cellula prolifera secondo un processo tumorigenico. Quindi possiamo dire che la regolazione dell'attività delle HAT è importante per lo sviluppo di alcune patologie tumorali.

CONCETTO: HAT non solo acetila ma si può legare ai residui acetilati degli istoni.

HDAC sono parte di complessi di repressioneI complessi di repressione sono costituiti da: 1-Una subunità di legame al DNA in elementi repressori (URS1)2-Un corepressore/adattore (SIN3): il corepressore aiuta l'attività del repressore 3-Un istone deacetilasi (RPD3)

I complessi di repressione sono composti da varie unità, quindi da varie proteine che interagiscono tra loro. RPD3 e SIN3 e i loro omologhi costituiscono grossi complessi multimolecoari di repressione trascrizionale, fra cui MAD/MAX della famiglia dei MYC. Sono importanti perchè regolano la proliferazione cellulare.

SITI IPERSENSIBILI DELLA CROMATINA Esistono anche dei siti ipersensibili che rappresentano zone della cromatina in cui il DNA non è organizzato nella solita struttura nucleosomica. A livello dei promotori dei geni espressi, così come nelle origini di replicazione e nei centromeri si trovano siti ipersensibili. Questi sono regolati dal legame di proteine regolatrici che escludono gli ottameri istonici. Un dominio contenente un gene trascritto è definito da un'aumentata sensibilità alla degradazione da parte della DNAasi (enzima che digerisce DNA e come tale deve essere accessibile al DNA). Si può misurare la sensibilità delle DNAasi determinando la velocità con cui scompare una banda di DNA contraddistinta con sonde specifiche. Se un gene è trascritto vuol dire che il DNA è libero e quindi accessibile alle DNAasi; se non è trascritto vuol dire che non è accessibile alle DNAasi. La sensibilità alle DNAasi rivela cambiamenti della struttura della cromatina. La struttura della cromatina a sua volta determina buona parte dei meccanismi epigenetici. La struttura della cromatina è anche importante per determinare l'accessibilità del DNA che si vuole trattare Es: vedi slide--> geni della globina in una cromatina de condensata.

EREDITA' EPIGENETICAPer eredità epigenitica si intende l'esistenza di una struttura molecolare che si autoperpetua e non dipende dalla sequenza del DNA. E' sostanzialmente il mantenimento di strutture proteiche durante la replicazione. Questo concetto è diverso dall'eredità intesa in senso generale, la quale è definibile come DNA che si trasmette da una cellula madre alle cellule figlie.Per avere la giusta eredità epigenitica bisogna ritornare ad una situazione nella cellula figlia identica a quella della cellula madre. Così facendo non si ha l'eredità della sola struttura del DNA ma anche dell'eterocromatina (le proteine associate al DNA)--> questa è l'eredità epigenetica.

Se così non fosse infatti si avrebbero delle cellule figlie diverse dalla cellula madre, quindi in sostanza la regolazione epigenetica del genoma consiste nella trasmissione di specifiche strutture della cromatina, che è conservata come informazione epigenetica e trasmessa durante la mitosi.

L'eredità epigenetica è anche la capacità di diverse condizioni, che possono avere diverse conseguenze fenotipiche, di essere ereditate senza alcuna modifica della sequenza di DNA. Due individui con la stessa sequenza di DNA in un determinato locus possono mostrare diversi fenotipi. Un CARATTERE EPIGENETICO è un fenotipo stabilmente ereditato.

L'eredità epigenetica è l'eredità di un apparato di proteine che però può modificare la funzione di quella determinata cellula. E' un fenotipo dunque che risulta da

modificazione di un cromosoma in assenza di alterazione nella sequenza del DNA. Una condizione epigenetica stabilmente ereditabile può dipendere da un fattore: EPIGENETOR--> segnali dell'ambiente extracellulare.

I fattori che possono modificare l'ereditarietà epigenetica possono dunque essere fattori ambientali, stress ossidativo, radiazioni UV, ipossia, tutto ciò che proviene dall'esterno. Il microambiente in cui viviamo quindi può non solo provocare modificazioni a carico del DNA (mutazioni) ma possono anche provocare delle mutazioni epigenetiche che poi possono essere trasmesse e possono determinare malattie

Una condizione epigenetica stabile dipende da: 1) Iniziatori epigenetici: fattori che legano il DNA (DNA binding factor); possono modificare l'apporto epigenetico2)MicroRNA: causano modificazione epigenetica 3)Mantenitori: meccanismi molecolari che mantengono condizioni epigenetiche nella prima e nelle successive generazioni.

I modificatori epigenetici sono tutti quei modificatori e rimodellatori della cromatina di cui si è parlato. Lavoro scientifico di NATURE in cui si dimostra che la deficienza in un'enzima importante per modificazioni epigenetiche provoca modificazioni nell'espressione genica coinvolgendo modificatori della cromatina Altro lavoro: 'Analisi sui campioni di sangue di 40 persone nate nel 1958'--> si sono analizzate 6000 regioni di DNA che includevano più di 1000 promotori che mostravano differenze significative della metilazione del DNA. Si è visto che gli schemi di metilazione variavano a seconda di dove vivevano queste persone, quindi questo dimostra come l'ambiente esterno possa influire sulla modificazione epigenetica

Esiste un'altra modificazione del DNA che è la METILAZIONE Essa può regolare la trascrizione di un gene. La cromatina attiva è acetilata e può essere inattivata non solo perchè non è acetilata, ma anche perchè il DNA è metilato. La metilazione del DNA è un meccanismo di inattivazione e HP1 è un'istone metiltransferasi; dunque non solo il DNA può essere metilato ma anche gli istoni, in corrispondenza della coda da parte dell'istone metiltransferasi. Tutto questo processo inattiva la trascrizione

MECCANISMO CHE SPIEGA L'INATTIVAZIONE DELLA TRASCRIZIONE ATTRAVERSO METILAZIONE DEGLI ISTONI Gli istoni sono metilati su Arg 9; in seguito interagiscono con il cromodominio di proteine che hanno attività di repressione trascrizionale tra cui rimodellatori (es. HP1); gli istoni metilati interagiscono in particolare, come già detto, con il cromodominio che è intrinseco al repressore stesso. L'eterocromatina diffonde nel cromosoma finchè non è fermata da un isolatore.

L'isolatore è una 'barriera' che impedisce la diffusione di eterocromatina e quindi impedisce che le zone di eucromatina si uniscano a zone di eterocromatina e quindi impediscano che una diventi trascrizionale e l'altra no.

ISOLE CpG Le modificazioni trascrizionali possono influenzarsi reciprocamente. Gli istoni infatti, come già detto, possono essere metilati o acetilati e la metilazione può influenzare l'acetilazione e a loro volta possono interagire con la metilazione del DNA.Il DNA è metilato in Citosina ed in particolare ci sono zone dette CpG Island in cui il dinucleotide Citosina-Guanina è presente con una frequenza del 20%; in realtà questa frequenza è minore di quella attesa, sulla base di quante coppie di guanina e citosina sono presenti nel genoma. La frequenza è minore appunto perchè molte di queste coppie CG sono metilate. (immagine in basso)

In seguito a metilazione la Citosina diventa metil-citosina e quello che si può verificare è una mutazione: la metilCitosina può essere deamminata e trasformata in Timina. Le isole CPG sono regioni in cui la densità è circa 5 volte maggiore rispetto al resto del genoma e il contenuto medio di GC del 50%. Nel genoma umano ci sono circa 45.000 CpG Island, concentrate generalmente a 5' di un promotore e spesso metilate in modo regolare. Esse regolano la conformazione delle cromatina; la trascrizione di molti geni mostra uno schema di metilazione costante. La metilazione di un'isola impedisce l'attivazione di un promotore al suo interno impedendo la trascrizione di un gene.METILAZIONE: evento epigenetico che serve ad evidenziare l'inattivazione di uno dei due alleli del cromosoma X.

L'AZACITIDINA, analogo non metilabile della citidina, viene utilizzata in alcune terapie incorporata al posto della citidina e impedisce la metilazione della citidina stessa, promuovendo cambiamenti dello stato differenziativo della cellula attivando dei geni del cromosoma X che era silente.

L'enzima che metila è la DNMT. Se si genera un Knock-out, ovvero un topo costruito con meccanismi di ricombinazione genica, in modo tale che le cellule del topo in questione non abbiano più un determinato gene, si può eliminare la funzione di quel gene e quella proteina. L'eliminazione del gene che codifica per la DNMT è incompatibile con la vita. Nell'umano mutazioni per il gene che codifica DNMT impediscono la metilazione con conseguente instabilità cromosomica e sviluppo di patologie.N.B. Quando il DNA si duplica, deve essere mantenuto anche lo stato di metilazione. Il DNA delle cellule figlie deve essere metilato. Tutto ciò è permesso da delle metilasi di mantenimento: si associano al DNA mantenendo lo stato di metilazione. La metilazione è un'eredità epigenetica.

METILASI DE-NOVO Metila a vari livelli, per metilare hanno bisogno di altre proteine, esempio EZH2; la DNA metil-transferasi è reclutata contestualmente ad un istone metil-transferasi, che metilando gli istoni recluta proteina HP1 che è inibitoria per la trascrizione. La metilazione del DNA può reclutare al DNA metilato proteine specifiche come il

repressore MeCp2 che possono a loro volta reclutare altri repressori come le deacetilasi.IN SOSTANZA la metilazione del DNA recluta altri complessi di rimodellamento della cromatina. In sintesi il procedimento è il seguente: iston- metil-transferasi metila l'istone--> recluta HP1 (inibitore della trascrizione)--> HP1 recluta DNMT1--> DNMT1 metila il DNA--> DNMT1 recluta altre proteine inibitorie come MECP2

APPLICAZIONE CLINICA Esistono patologie legate a mutazioni dei rimodellatori della cromatina. Es: RETT syndrom (vedi slide) malattia che si sviluppa nelle bambine con conseguenti effetti neurologici causati da mutazioni di questa metilasi.La metilazione del DNA è responsabile di un imprinting epigenetico. Nelle cellule germinali primordiali vi erano metilasi e quindi geni non espressi. Queste metilasi e le loro metilazioni sono state rimosse durante la gametogenesi, avviando un nuovo schema di metilazione specifico per ciascun sesso. Per cui nei gameti femminili alcune metilasi sono state attivate, mentre altre nei gameti maschili no. Questo processo, tra la fecondazione e la blastocisti, si verifica negli embrioni a carico delle XEN-Cells che vanno incontro a demetilazione eccetto per alcuni geni. Se si alterano questi processi si hanno conseguenze negli individui che si formano.

Nei diversi stadi si hanno quindi attivazioni ed inattivazioni diverse a seconda delle metilasi o delle demetilasi determinando così differenziamento.

RICORDARE EZH1 componente di un particolare complesso che metila l'Arginina 27 sull'istone H3.

TECNICA CROMATIN IMMUNOPRECIPITATIONServe per studiare il complesso proteico che regola la trascrizione, utilizzando degli anticorpi che legano gli istoni, isolano il DNA legato a queste proteine e lo sequenziano sapendo se il DNA corrispondente è metilato o no.

Epigenetica: modificazioni fenotipiche che sono ereditarie ma che non sono dovute alla comparsa di mutazioni nella sequenza di DNA.

Differenze nei pattern di metilazione del DNA. C’è un enzima che è in grado di acetilare il DNA di cellule normali a cellule tumorali. Nelle cellule tumorali il DNA può essere metilato con una deacetilasi e quindi se la regolazione è negativa potremo abolire la trascrizione dei geni che servono a inibire la proliferazione tumorale.

Possiamo avere un silenziamento genetico che comporta ad una modificazione genetica. Si sviluppa così un clone tumorale. Il silenziamento epigenetico contribuisce per determinare lo stesso fenotipo, noi abbiamo la metilazione o acetilazione della proteina che comporta lo sviluppo del clone tumorale. Quindi è importante sia la mutazione genetica da traslocazione che va ad interessare la struttura del gene e sia la modificazione epigenetica.

Esistono dei geni che sono frequentemente mutati o ipermetilati nel cancro.

Esempio: leucemia. Ora è possibile curare la leucemia acuta promielocitica. La modificazione genetica di questa malattia è una traslocazione. Si forma un nuovo gene. E’ un recettore per l’acido ialuronico. Traslocazione nei geni tra 15 e 17 con proteina con nuova funzione. Se viene aggiunto l’acido retinoico, che è un ligando, si lega al suo recettore e il complesso recluta un enzima AT e si trascrive la proteina giusta. Questo procedimento appena descritto avviene normalmente nei soggetti sani, ma può essere indotto terapicamente.

Nella leucemia acuta, nel complesso viene reclutato l’enzima deacetilasi, la traslocazione causa repressione trascrizionale. Viene reclutata la deamilasi con blocco della differenziazione. Nelle leucemie ci sono tante cellule immature. Questo è dovuto al reclutamento sbagliato di proteine che inibiscono i geni per il giusto differenziamento cellulare. Normalmente se aggiungiamo l’acido retinoico, si lega a RAR e fa trascrivere i geni importanti per il differenziamento. La terapia è l’aggiunta di acido retinoico per eliminare il blocco di differenziazione.

Strategie per la terapia epigenetica:”ansa acitidina” funziona come inibitore della DNA Metil-trasferasi.

TRASCRIZIONE

Due differenze principali tra la trascrizione degli eucarioti e quella dei procarioti. Nei procarioti la trascrizione avviene su un filamento di DNA stampo. Mentre negli eucarioti avviene su uno stampo di cromatina. Affinchè la trascrizione di un gene avvenga, questo deve essere in una conformazione cromatinica precisa. L’RNA polimerasi dei procarioti non riconosce il DNA, l’inizio della trascrizione coinvolge altre proteine che si devono attaccare al DNA per poi reclutare la RNA polimerasi. Le RNA polimerasi sono diverse e dipendono da altri cofattori. I promotori dei geni si possono trovare in vari tipi di configurazione cromatinica. Possono essere chiusi o aperti. Esistono 3 RNA polimerasi 1-2-3. Noi parliamo della 2 che codifica Mrna, smRNA, miRNA.

La RNA polimerasi 2 è costituita da 12 subunità. Alcune sono condivise da tutte e 3 le polimerasi. Sono complessi grossi, circa 500 kDa. La maggiore subunità ha un domino che si chiama CTD( carbossi-terminal-domain), che è costituito da diverse ripetizioni di un tetramero.

Altra differenza: i procarioti hanno numerosi fattori di inizio della trascrizione; mentre gli eucarioti esiste solo il fattore SIGMA. RNA polimerasi deve riconoscere la sequenza di DNA che deve trascrivere. E’ importante sapere cosa è un promotore.

Enhancers

Regione di circa 100 basi, contiene parecchi siti di legame. Abbiamo il promotore dove inizia la trascrizione. La separazione può essere di 100 basi(vicino) o migliaia di basi(lontano) dove si inseriscono proteine per la loro regolazione. Un gene per essere trascritto ha bisogno di un promotore, con sequenza nucleotidica posta a monte o a valle del sito di trascrizione. Tale sequenza di 40-60 basi è sovrapposta al sito di inizio della trascrizione e serve da sito di riconoscimento per l’RNA polimerasi.

Le RNA polimerasi richiedono i fattori basali per iniziare la trascrizione. Questi fattori sono trascriction factor. I promotori riconosciuti dalla RNA-polimerasi 2 è costituito dalla combinazione di almeno 4 elementi a cui si legano diversi fattori generali di trascrizione. Ogni fattore generale di trascrizione va a legarsi alle sequenze consensus, gli elementi prendono nomi diversi (TATA BOX).

TBP è una proteina importante che si lega al segmento TATA, questa proteina chiamata “tata binding protein”, è un componente di fattore di posizionamento necessario ad ogni tipo di RNA polimerasi per legarsi al promotore così da iniziare la trascrizione del gene.

La TATA box binding protein è un fattore universale che permette alla RNA polimerasi di legare il proprio promotore. Il DNA ha delle curvature che permettono il posizionamento delle proteine.

TATA binding protein è 800 KDa,costituito da 14 fattori che si associano a TBP. Il nucleo soma deve disassemblarsi permettere la trascrizione.

TAF1 è una proteina che contiene 2 bromodomini: permettono l’interazione con lisine istoniche acetilate e partecipa all’ attivazione del promotore. Colabora con TF2A e TF2B (TATA BINDING ASSOCIATED FACTORS). La cromatina deve essere eucromatina. I geni quindi devono essere trascrivibili. Ogni fattore di trascrizione deve essere reclutato ed agire con un altro.

TF2B lega il DNA (immagine a lato), stabilisce contatti con l’RNA polimerasi, vicino al sito dell’RNA e al sito catalitico. Sono meccanismi molto rapidi di interazione e regolazione per permettere lo scivolamento del DNA o dell’RNA polimerasi. Anche l’RNA polimerasi deve muoversi perché deve liberare contemporaneamente il DNA, deve rilasciare mRNA che è stato sintetizzato e deve attaccarsi ad un altro promotore. Tutto questo complesso, il promotore, la TGB, fattori di trascrizione fanno si che l’RNA polimerasi si attacchi. E’ importante che questo dominio venga fosforilato. Si chiama complesso di pre-inizio dell’RNA polimerasi 1. Sono importanti le interazioni proteina-proteina o DNA-proteina per riconoscere il sito di inizio. E’ importante che intervenga la TBP legante la TATA box. In vitro è sufficiente l’interazione proteina-proteina così che la polimerasi possa trascrivere. In vivo devono intervenire molte altre proteine.

Il rilascio del promotore è il segnale dell’evento che possa essere trascritto. Il fattore energia scompone la catena del DNA. I fattori possono non essere saputi. Hanno delle sub unità con attività DNA elica e ATP-asica, così da esporre il filamento stampo.

Gli activator factors ricordano gli istoni. Legano il DNA. La TATA binding protein è costituita da un complesso di proteine. I fattori di trascrizione sono necessari per denaturare il DNA e permettere il movimento della polimerasi. Si ha la fosforilazione della coda della DNA polimerasi 2. La fosforilazione è necessaria per l’inizio della fase di allungamento. Complesso di pre-inizio, ATP e fosforilazione vengono rilasciati tutti tranne la TBP. L’evento determinante per determinare se un gene sarà espresso è il rilascio del promotore. Transizione verso la fase di allungamento. Il complesso di

trascrizione è costituito da RNA polimerasi 2, fattori basali e fattori di allungamento. Fosforilazione della coda nell’RNA polimerasi fa si che la polimerasi 2 si sistemi qui. Gli enhancers contengono degli elementi bidirezionali. Anche loro intervengono nella sequenza di inizio. Sono importanti per regolare la trascrizione. Sono legati al 5’ del gene della trascrizione e anche al 3’.

Proteine chiamate co-regolatori: sono co-attivatori o co-repressori.

I fattori di trascrizione hanno un dominio che si lega al DNA e un dominio che attiva la trascrizione del DNA. Di solito questi domini sono conservati. Ci sono sequenze consensus con diversi fattori. La trascrizione di un gene dipende dall’interazione di attivatori e repressori della trascrizione. I fattori di trascrizione possono agire in maniera sinergica, quindi regolano l’effetto della trascrizione. Alcuni fattori di trascrizione sono ubiquitari, cioè sono espressi in tutte le cellule dell’organismo, altri solo in alcuni tipi cellulari. Complesso di pre-inizio della trascrizione è costituito da 20 subunità, più di 7 sono conservate. Fa da ponte il mediatore tra il fattore di trascrizione e RNA polimerasi. Complesso formato da tante sub unità proteiche. (immagine in basso)

TRASCRIZIONE

La trascrizione è assistita da un complesso costituito da tante sub unità proteiche (circa 20)(oleoenzima) detto mediatore che interviene per facilitare l’interazione dell’RNA polimerasi con gli altri componenti che regolano la trascrizione (acetilasi, deacetilasi, metilasi, modificatori di metilazione degli istoni ecc..).

Non esiste soltanto la malattia genetica ma anche quella epigenetica, in questo periodo sono stati identificati dei fattori che rappresentano la malattia epigenetica coinvolti nella trascrizione e regolazione di RNA. Queste proteine regolano negativamente un tratto di DNA che codifica per proteine convolte nei processi di proliferazione, dato che queste proteine sono modificate il fenomeno di proliferazione è molto aumentato (situazione tumorale).

Il complesso del mediatore mette in comunicazione altre proteine (regolatrici) con l’RNA polimerasi. Il DNA si può ripiegare, grazie a ciò il mediatore è in grado di mettere in comunicazione anche proteine a grande distanza (il mediatore fa da ponte molecolare tra fattori e RNA polimerasi). Le varie subunità del mediatore possono avere anche funzioni diverse, ad esempio alcune possono avere funzione chinasica.

Un esempio di mediatore è il TATA binding box. Una proteina gestita da questo mediatore può essere ad esempio un enhancer che regolerà in modo positivo la funzione di RNA polimerasi.

(guardare tabella che riassume tutti i fattori generali di trascrizione).

Esistono proteine che vengono chiamate proteine architettoniche proprio perché controllano la struttura del DNA ( HMG). HMG legano il DNA permettendo la formazione di anse/ripiegature cosicché componenti distanti tra loro possano comunicare. Queste proteine intervengono per far si che altri componenti possono interagire tra di loro. (immagine sotto)

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I fattori di trascrizione reclutano e regolano i rimodellatori della cromatina e i modificatori degli istoni. Il complesso di rimodellamento è reclutato dai fattori di trascrizione e rimodellando la cromatina ne permette l’accesso ai fattori basali della trascrizione. La struttura dei nucleosomi deve essere distrutta se il dna è associato ai nucleosomi e per poter essere trascritto.

Ci sono diverse strategie adottate per rimodellare la cromatina: scorrimento dei nucleosomi, modificazione della spaziatura e rimozione dei nucleosomi (vedi immagine a fianco).

È importante anche il reclutamento di un co-attivatore (che può essere anche un fattore di trascrizione) che va a reclutare poi il rimodellatore della cromatina che va poi a reclutare un proteina che acetila e si ha quindi un’attivazione di trascrizione.

Gli istoni acetilati interagiscono con il bromodominio di alcune sub-unità dei complessi dei fattori basali della trascrizione e del mediatore. In tutto ciò gli istoni sono deacetilati quindi non vengono trascritti.

LA TRASCRIZIONE PUO’ ANCHE ESSERE REPRESSA

Un complesso repressivo contiene tre componenti:

•Una sub unità di legame al DNA

•Un co-repressore

•Una istone deacetilasi (HDAC)

Il complesso repressorio lega il DNA e la rimozione dei gruppi acetilici dagli istoni mediante la sub unità istone deacetilasi (HDAC) reprime la trascrizione. L’ HDAC è a sua volta reclutata da un repressore (UME6) che lega il DNA in elementi repressori (URS1) e da una proteina adattatrice SIN3. (immagine sotto)

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Il meccanismo può avvenire in maniera diretta o indiretta. Quindi quando si deve bloccare la repressione possiamo bloccare a vari livelli per ottenere lo stesso effetto finale. C’è il DNA e tutte queste proteine che possono avere un’attività inibitoria nella trascrizione di un gene, facciamo finta che questo gene sia la parte di DNA che possa avere come risultato trascrizione. Se può avere trascrizione i meccanismi che dovrebbero essere coinvolti perché questo DNA non trascriva possono essere: il DNA può essere metilato (grazie a dna metil transferasi) o gli istoni legati al dna possono essere deacetilati.

Se io voglio accendere il gene che chiamo “gene A” perché io so che quando questo è spento la cellula muore. Il mio risultato è che il gene A venga trascritto così la cellula torna ad essere normale. Per far ciò posso usare più vie, il complesso è fatto da tante proteine (posso inibire l’enzima che deacetila, posso inibire dna metil transferasi, posso inibire CTK ecc..). Molto spesso bisogna intervenire inibendo più fattori (bisogna intervenire in vari punti perché tanti componenti sono simili tra loro).

NFkB è un fattore di trascrizione importante perché è coinvolto in una via di segnalazione importante nelle cellule associata a sintomi di stress, ipossia ecc.. .

Ad esempio in seguito a infezione virale/batterica o stress grazie alla subunità P65 di NFkB che è citoplasmatica e quando viene fosforilata va nel nucleo ed attiva dei geni che sono responsivi ad NFKB e che servono alla cellula per difendersi da stress e/o infezioni batteriche. Questa B65 normalmente è legata ad un’altra sub-unità che si chiama I-kB, quando P65 non ha stimolo è legata a quest’altra subunità e non viene fosforilata. Quando arriva lo stimolo I-kB si dissocia da P65, viene fosforilata e quindi degradata nei proteasomi, mentre P65 che viene fosforilata entra nel nucleo.

P65 è una componente della via di segnalazione di NFKB. P65 nel nucleo riconosce sequenze specifiche per il legame che sono sequenze NFKB responsive --> quindi si ha trascrizione del gene. (immagine a lato)

Esistono anche fattori attivanti la trascrizione, ad esempio un altro fattore di trascrizione che viene attivato da altri fattori extracellulari è STAT. STAT sono

proteine molto importanti e vengono attivate per fosforilazione da parte di una chinasi associata ad un recettore con funzioni chinasiche. STAT normalmente è presente nel citoplasma in forma inattiva, diventa attiva se fosforilata e in questo stato passa nel nucleo dove svolge la sua attività di fattore di trascrizione. La sua fosforillazione nel citoplasma è regolata da segnali extracellulari e questi segnali possono attivare dei recettori per fattori di crescita che hanno una struttura tirosino-chinasica oppure dei recettori per le citochine o dei recettori che non hanno una struttura tirosino-chinasica. Esistono varie isoforme di STAT e

queste sono diverse tra loro ma presentano omologie strutturali.

I fattori di trascrizione, solitamente, oltre ad avere un dominio legante il DNA hanno anche un dominio di trans-attivazione che serve per legare altre proteine che sono importanti per la trascrizione.

Esistono delle classi strutturali di fattori di trascrizione, cioè dei fattori di trascrizione che si possono distinguere tra di loro a seconda dell’appartenenza ad una classe su basi strutturali.

Le classi sono 4:

•elica-ansa-elica,

• elica-giro-elica,

• zink finger

• cerniere di leucina.

Alla classe elica-giro-elica appartengono delle proteine omeotiche che sono proteine molto conservate sia nel dominio dna binding che nel dominio transattivante.

Hanno questo nome in quanto hanno un particolare omeodominio di 60 amminoacidi. Queste classe di fattori regolano geni omeotici che sono quei geni espressi durante lo sviluppo embrionale.

La presenza dell’omeodominio da una struttura particolare elica-giro-elica in questa classe di fattori di trascrizione.

La funzione dei diversi fattori di trascrizione può essere costitutiva (non è regolabile, ovvero il fattore di trascrizione è sempre presente nella cellula indipendentemente da fattori esterni) oppure può più frequentemente essere regolata da diversi segnali.

Le elica-ansa elica sono una classe di fattori chiamati così proprio perché formano un’ansa tra due eliche. Esistono bHLH che presentano residui basici all’estremità n-terminale e sono in grado di legare il DNA mentre i fattori di trascrizione che appartengono a questa famiglia e sono privi di residui basici non legano DNA e sono detti HLH.

Un esempio di un fattore di trascrizione che ha questa struttura è il fattore MYO-D (è un bHLH)che è importante nelle cellule muscolari. Anche ID (è un HLH) è un fattore di trascrizione importante appartenente a questa categoria.

Questi fattori di trascrizione possono formare omodimeri (per funzionare si associano tra di loro) oppure possono formare eterodimeri (si associano tra fattori di trascrizione delle stessa famiglia simili, ad esempio un bHLH e un HLH).

La MYO-D è importante per la proliferazione muscolare, quando questo fattore di trascrizione lega ID, mioD non può più legare il DNA. In questo caso la formazione dell’eterodimero può cambiare in senso negativo la funzione del fattore.

Anche MYC appartiene a questa classe e se espressa in grande quantità funziona come oncogene: induce trasformazione cellulare. Esistono anche altre forme di MYC come MYC-N che è importante per lo sviluppo del neuroblastoma. Si esprime MYC perché le cellule passino dalla fase G1 alla fase S del ciclo cellulare. MYC può anche formare oltre omodimeri anche eterodimeri con un’altra proteina che è MAD o MNT attraverso una proteina mediatrice: MAX. Quando MYC forma eterodimeri con MAD possiamo avere come effetto biologico una diminuzione della proliferazione.

Nella classe con cerniera di leucina è presente un’ansa data dai residui di leucina. C’è un dominio che lega il DNA e uno elica-ansa-elica in estremità c-terminale. Si possono formare anche in questo caso omodimeri ed eterodimeri. A questa classe appartengono proteine quali c-jun e c-fos. C-fos è un regolatore del ciclo cellulare, la sua concentrazione aumenta quando la cellula passa dalla fase G1 alla fase S del ciclo cellulare. C-fos a differenza di Mic non fa omodimeri.

La classe dei fattori a zink finger è molto diffusa. In questo caso il dominio legante il DNA è un’alfa elica stabilizzata da interazioni con uno zinco mediante 2 istidine, gli altri legami di coordinazione dello zinco sono impegnati con due cisteine. Essi riconoscono delle sequenze contigue di 3 basi associandosi ad esse. SP1 è un esempio di zink finger protein. Gli zink finger con le alfa eliche si inseriscono nella scanalatura principale del DNA. Alcuni attivatori di zink finger protein sono recettori per gli ormoni steriodei o tiroidei.

MicroRNAs

Nell'ambito della biologia molecolare, il miRNA è una tra le scoperte più recenti (20 anni fa). I miRNA sono degli RNA importanti soprattutto a livello diagnostico, ma potrebbero essere veicolati con l'uso di particelle a livello terapeutico. Ad esempio, in patologie come tumori polmonari, sarebbe possibile fare una diagnosi precoce e vedere se un soggetto è predisposto alla comparsa di quel determinato tumore proprio dosando quel determinato miRNA (centri specializzati svolgono questo lavoro).

Esiste in biologia molecolare il dogma centrale: da un DNA passiamo a un mRNA e passiamo alla codifica di una proteina. In realtà questo dogma è vero solo parzialmente, perchè esistono nella cellula degli RNA che sono funzionali, che vengono codificati e trascritti da un gene, i quali però non portano alla sintesi di una proteina. Per cui si parla di non-coding RNA, cioè di RNA che non portano alla produzione di una proteina ma che sono molto importanti funzionalmente all'interno della cellula in quanto vanno a regolare degli mRNA che codificano per delle proteine. Questi RNA che non sono messaggeri e non portano a produzione di proteine si chiamano miRNA.

Tipi di RNA:

-Coding: mRNA (messenger)

-Non coding: rRNA (ribosomal) tRNA (transfer) snRNA (small nuclear) snoRNA (small nucleolar) siRNA (short interfering) miRNA (micro)

Gli snRNA sono importanti per lo splicing, effettuato da proteine che si servono dei piccoli RNA che sono non-coding e che aiutano in questo processo. Proteine mutate che non sono in grado di far fare lo splicing correttamente causano malattie. Gli snoRNA aiutano nella sintesi del rRNA.

La struttura di un mRNA Esiste una coding region e untraslated regions. Quando si parla di un mRNA si parla:

•di una parte di RNA che ha una sequenza 5'UTR (dove vi è CAP, modifica che subisce l'mRNA nel nucleo prima di passare nel citoplasma), •una sequenza codificante (a questa sequenza corrispondono poi le triplette e gli amminoacidi della proteina che viene codificata) •una sequenza 3' UTR (funzionalmente molto importante ma a cui non corrisponde la codifica di amminoacidi) con poly(A).

Questi piccoli RNA devono appaiarsi e modificare gli mRNA di un gene target, quindi devono cercare una sequenza a loro complementare nel 3' UTR. Per cui questi piccoli RNA funzionano senza essere tradotti in una proteina. Quando miRNA aumentano o diminuiscono molto, vi è comparsa di un tumore. Espressione dei miRNA è importante per la trasformazione della cellula in cellula tumorale.

Housekeeping ncRNA RNA non codificante espresso nello stesso modo in tutte le cellule. Ad esempio, la glucosio 6-fosfato deidrogenasi è un gene housekeeping, ovvero è una proteina-gene espressa in tutte le cellule dell'organismo e non ha un'espressione particolare in un distretto. Altro esempio: actina. Un gene housekeeping, viene espresso in tutte le cellule dell'organismo, non solo a livello muscolare.

Tra i non-coding RNA housekeeping citoplasmatici troviamo: rRNA, tRNA, snRNA, snoRNA, gRNA. Le gRNA sono guide che si usano nell'editing: processo che avviene sempre a carico del mRNA, dove alcune basi dell'mRNA stesso vengono modificate. Queste basi non sono presenti nel gene che ha codificato quell'mRNA. Tante malattie derivano da un editing alterato. L'editing avviene ad opera di piccole proteine che si servono di piccoli RNA che si chiamano gRNA) o la telomerasi (quella proteina che serve per allungare i telomeri, la quale si serve di un piccolo RNA per svolgere la sua funzione). I miRNA non sono housekeeping, sono presenti in alcuni tessuti dell'organismo e in modo diverso da tessuto a tessuto.

La prima evidenza dell'esistenza dei miRNA si è riscontrata in C elegans, nel verme. In esso è stato identificato il primo gene che non codificava per una proteina. In particolare, paper "Cell" un lavoro scientifico pubblicato nel 1993 illustra come è stato identificato lin-4, che codificava non per una proteina ma per un RNA importante per lo sviluppo del C elegans. Molte scoperte scientifiche vengono fatte per la prima volta negli organismi più semplici (come C elegans, Drosophila ecc) perché è più facile, in quanto esistono molti mutanti funzionali. Ad esempio, si sa che la larva in cui si blocca lo sviluppo in L1 ha una mutazione nel gene X. La larva, il cui sviluppo si blocca in un altro stadio, ha una mutazione del gene Y. Quindi eseguire manipolazioni genetiche in un organismo di cui si conosce già la genetica corrisponde a studi più facili.

Lin-4 è un piccolo micro RNA. Non codificava per una proteina ma per dei trascritti di 22-61 nucleotidi (RNA piccoli) e complementari all'UTR di un mRNA che produce una proteina di nome lin-14. Per cui il gene lin-4 produceva un piccolo RNA il quale si appaiava in modo complementare all'mRNA di un altro target di nome lin-14. Questo piccolo RNA, che non era né rRNA né tRNA, aveva una funzione regolatoria di un mRNA specifico. Lin-4 è il primo gene identificato in C elegans con esperimenti chiamati "transformation rescue", ovvero con utilizzo di mutanti di C elegans con alterazioni del corretto sviluppo temporale dell'embrione. Il DNA in grado di sopprimere queste mutazioni non codificava per proteine ma per trascritti di 22 e 66 nucleotidi.

Nell’ immagine in basso vengono riportati gli stadi di sviluppo dalla larva fino all'adulto, che sono L1, L2, L3, L4. Quando non c'è lin-4, non abbiamo il passaggio da L1 a L4, ma lo sviluppo è bloccato a L1. Usati mutanti in cui si era a conoscenza che lin-4 era deleto o lin-14 presente.

In quest’ altra immagine analizziamo invece il comportamento dell’ espressione della proteina lin-14 in relazione al gene lin-4: quando lin-4 aumentava, lin-14 diminuiva. Per cui vi è regolazione reciproca tra lin-4 e lin-14, in quanto lin-4 provoca la degradazione dell'mRNA di lin-14.

Questo meccanismo sembrò per alcuni anni una peculiarità dello sviluppo larvale di C elegans. Fire e Mello vincitori del premio Nobel nel 2006 per "RNA interference - gene silencing by double-stranded RNA"scoprirono che il meccanismo visto in C elegans è operante anche nell'uomo. Utilizzando sempre C elegans, tramite il metodo dell'RNA interference, riuscirono a spegnere l'espressione genica. Iniettando una double-stranded RNA in C elegans, scelsero la sequenza complementare alla proteina che volevano spegnere. In questo modo provocarono lo spegnimento del gene e quindi della proteina che desideravano silenziare. Per cui era possibile adottare un sistema per spegnere l'espressione di un mRNA e quindi di una proteina utilizzando dei piccoli RNA con sequenza complementare a quella dell'mRNA stesso, che decidi tu dall'esterno. Per cui dimostrarono che era possibile utilizzando poche molecole di double-stranded RNA interferire con l'espressione di un mRNA. Fire e Mello andavano a iniettare un sense, un antisense oppure un sense + antisense (o un filamento singolo o un filamento doppio) e vedevano che il risultato (degradazione dell'mRNA target) lo ottenevano soltanto iniettando il filamento doppio.

Per RNA interferance si intende il processo attraverso il quale un RNA a doppio filamento interferisce con l'espressione genica, sia inducendo la degradazione di RNA complementare che bloccandone la traduzione (siRNA si appaia a mRNA in modo perfettamente complementare e degrada. Invece miRNA non si accoppia perfettamente a sequenza e inibisce la traduzione). E' un fenomeno comune in natura volto a proteggere l'ospite da dsRNAs estranei (virus, in quanto hanno un genoma a RNA) o endogeni (retrotrasposoni: elementi genetici mobili che si muovono all'interno del genoma e che a seconda di dove si muovono possono causare fenomeni deleteri).

Negli anni precedenti altri studiosi avevano trovato evidenze in altri organismi dell'esistenza di questo meccanismo di soppressione genetica ma queste scoperte non sono state considerate importanti. Infatti, un gruppo di ricerca di Napoli aveva scoperto nelle petunie l'esistenza di un fenomeno simile all'RNA interferance. Stavano studiando un enzima importante per la sintesi dei flavonoidi, un enzima per la colorazione delle petunie. Iniettando grosse quantità di questo enzima, in modo inaspettato si accorsero che invece di ottenere petunie viola avevano ottenuto fiori bianchi. Avevano ipotizzato che l'iniezione dell'enzima avesse ridotto l'espressione dell'enzima endogeno e quindi il suo funzionamento. Allora poteva esistere un meccanismo per cui si inoculava un

composto (che era RNA) dall'esterno e questo poteva regolare l'espressione dell'mRNA endogeno. Però erano solo teorie, non avevano capito il meccanismo di RNA interferance. Un altro gruppo dell'Università La Sapienza di Roma aveva descritto un meccanismo simile nella Neurospora. Non si era riusciti a entrare nei dettagli del meccanismo, ma si era capito che introducendo un gene dall'esterno veniva inattivato lo stesso gene endogeno. Per questo motivo si era parlato di "quelling" (spegnimento). Vengono utilizzati termini alternativi per indicare l'RNA interference proprio per queste scoperte avvenute in precedenza: silenziamento genico post-trascrizionale, cosopressione, quelling oppure silenziamento indotto da virus.

Basi molecolari del meccanismo di interferenza (biogenesi siRNA) Si parte da un double-stranded RNA lungo tot nucleotidi, interviene enzima che riduce la lunghezza del doppio filamento (per cui è una RNAsi) che si chiama Dicer. L'enzima cliva l'RNA, rimane un singolo filamento che utilizza un altro complesso proteico, RISC. In questo modo si ha l'appaiamento del singolo filamento alla sequanza sull'mRNA del taget e come risultato finale avviene la degradazione del target. (immagine sotto).

Come risultato non si ha solo RNA messaggero ma anche rimodellamento a livello cromatidico: questi piccoli RNA infatti, hanno come target mRNA, ma possono anche andare nel nucleo e regolare altri RNA e quindi altre proteine che sono importanti per il rimodellamento cromatidico.

Fu dimostrato che tale meccanismo era presente in tutti gli organismi, dagli eucarioti inferiori fino alle piante e all'uomo. Poteva inoltre essere utilizzato per spegnere l'espressione di qualunque gene endogeno mediante siRNA artificiali. La scoperta di questo meccanismo ha sconvolto il modo di fare ricerca perchè prima per studiare la funzione di un gene, ad esempio p53, all'interno di una cellula si doveva o eliminare, e quindi vedere cosa succede all'interno della cellula quando elimino la proteina corrispondente, oppure crearne molta, inducendo una situazione artificiale per cui invece di 1 kg di proteine nella cellula ce ne sono 4 kg. Queste due situazioni non fisiologiche sono state scelte e decise dallo sperimentatore. L'interesse però è sull'uomo:

è necessario riportare quella scoperta nell'ambito umano. Prima che si scoprisse l'RNA interference, la ricerca disponeva solo della possibilità di creare la seconda situazione, ovvero un aumento di quella determinata proteina nella cellula umana perchè non vi era nessuna possibilità di eliminare la funzione di un gene. Per studiare dunque l'abolizione della funzione della proteina, era necessario l'utilizzo del topo. Era solo possibile infatti la produzione di un topo knock-out di un gene. Ad esempio, il topo p53 -/- presenta un tumore (il 50% dei tumori umani ha p53 mutato, indipendentemente dal tipo). Studiando la funzione di p53 si potranno trovare cure. Con l'RNA interference, i ricercatori possono spegnere l'espressione di un gene in una cellula umana. In questo modo si può studiare quel determinato tumore partendo direttamente dal paziente. A tal proposito un lavoro pubblicato su Nature denota la possibilità di inoculare dei piccoli RNA di 21 nucleotidi per mediare la RNA interference in cellule di mammifero in coltura.

Per spegnere una proteina in laboratorio: prendo la sequenza 3' UTR della proteina, scelgo 20 nucleotidi, creo sequenza nucleotidica complementare a quei 20 nucleotidi del target, lo clono in un vettore come RISC e vedo se si è raggiunto l'effetto desiderato. Non tutto infatti potrebbe avvenire nel modo sperato: quando disegno un siRNA perfetto per eliminare un target, in natura potrebbe accadere che quel douplex si possa appaiare in maniera non perfettamente complementare con target indesiderati. Quindi esistono poi meccanismi e modalità per dimostrare che la riduzione del target è specifica e dipende da quel piccolo RNA introdotto da noi nella cellula. Un problema quindi è la specificità. Quel piccolo RNA potrebbe spegnere in questo modo anche altri target non voluti.

APPROFONDIMENTO sui micro RNA •siRNA: sono esogeni, meccanismo per cui si opera dall'esterno, sperimentalmente, ma siRNA esistono anche a livello endogeno come meccanismo antivirale. •miRNA: sono meccanismi endogeni, in quanto i geni che producono miRNA sono presenti nelle cellule.Questi meccanismi sono simili tra loro, utilizzano delle

proteine simili, hanno una biogenesi simile e si diversificano solo in alcuni punti. •dsRNA: double-stranded RNA, generalmente più lunghi di 30 nucleotidi. •RNAi: RNA interference. La scoperta nel 2001 di un secondo piccolo RNA non codificante Let-7 in C elegans fu estremamente importante. La vera scoperta non fu tanto la scoperta di Let-7 in sè ma la sua presenza anche nei mammiferi.

Biogenesi dei miRNA

Esiste un precursore composto da un singolo filamento che si ripiega assumendo una struttura a stem loop. (vs siRNA che sono douplex, non esiste questa struttura

ad ansa). Ricorda il tRNA.

Si parte dal DNA, arriva la RNA polimerasi II che sintetizza filamento con struttura a stem loop e si chiama Pri-miRNA (primary), ovvero un miRNA primario molto lungo (per esempio 80-90 basi). Poi intervento di proteine, RNAsi come Drosha, che devono degradare Pri-miRNA in un Pre-miRNA (precursor) e rimane struttura a stem loop. Siamo ancora nel nucleo, questa molecola deve passare nel citoplasma. Essendo grande, deve attraversare un poro servendosi di un sistema di nome Exportin 5 che necessita di idrolisi di GTP. Nel citoplasma viene ancora modificato da Dicer (altra RNAsi) e diventa un douplex più piccolo di 21-22 basi che è identico a quello che noi chiamiamo dsRNA. Viene reclutata una elicasi che separa i filamenti, di cui uno verrà degradato e l'altro si appaierà al 3' UTR dell'mRNA target utilizzando un altro complesso proteico di nome RISC.

Quando si parla si biogenesi di miRNA, l'appaiamento può essere non perfettamente complementare e quindi si ha inibizione della traduzione: mRNA non viene degradato ma non è più funzionale.

Meccanismi di miRNA: silenziamento gene mediato:

•inibizione della traduzione in fase iniziale

•inibizione della traduzione in fase di elongazione

•decadimento di mRNA dovuto a sequestro nelle P-bodies

•deadenilazione e decapping

•degradazione cotraduzionale della proteina

miRNA e siRNA:

Analogie di struttura e di biogenesi:

•quando sono funzionali, sono RNA di 20-24 nucleotidi, generati da enzima Dicer a partire da RNA a doppia catena (anche se una è in realtà stem loop)

•inibiscono a livello post-trascrizionale RNA messaggeri riconosciuti sulla base dell'omologia di sequenza

•molecole di siRNA sono prodotti da elementi genetici normalmente silenti o estranei alla cellula quali trasposoni (elementi genetici mobili), virus o transgeni.

•RNAi rappresenta un sistema di difesa contro l'invasione da parte di elementi genetici estranei e di conservazione della stabilità del genoma (si pensa possa trattarsi di una sorta di immunità genomica). Questo sistema è evolutivamente molto antico come è dimostrato dalla sua presenza in organismi tra loro molto distanti.

•i miRNA costituiscono una classe di geni endogeni filogenicamente conservati la cui funzione è di inibire l'espressione genica principalmente attraverso l'inibizione della traduzione.

Differenze:

•miRNA sono endogeni, siRNA principalmente esogeni anche se possono esistere come meccanismo endogeno

•target: siRNA perfetta complementarietà, miRNA non perfetta complementarietà

•meccanismo: siRNA distruzione di mRNA, miRNA repressione della traduzione

Applicazioni siRNA:

Nella ricerca:

•determinare la funzione di proteine

•più facile da usare di un knock-out

Nell'uomo e nel topo l'espressione dei miRNA è tessuto specifica, quindi è plausibile che alterazioni del loro pattern di espressione possano essere causa di patologie. A seconda del tessuto che studiamo dunque, ad esempio quello del cervello o del polmone, sono espressi determinati miRNA che non riscontriamo in altri, come cuore o reni.

Alcuni miRNA hanno determinate funzioni nel cervello che sono diverse da quelle che esplicano nel polmone. La loro diversa espressione può essere responsabile di patologie perchè, a seconda dei geni che vengono regolati, i vari miRNA possono avere funzioni diverse (miRNA che regolano geni coinvolti nell'apoptosi, nella proliferazione cellulare, nel metabolismo cellulare).

N.B: miRNA derivano da trascrizioni di geni che possono trovarsi negli introni oppure negli esoni di altri geni deputati a codifica di mRNA. Possono esistere dei cluster di miRNA, ovvero dei miRNA la cui trascrizione dipende dallo stesso promotore oppure la cui trascrizione dipende da promotori indipendenti.

Esistono dei database di miRNA, fino ad ora sono stati identificati circa 3000 miRNA negli esseri umani, 500 circa in Drosophila e circa 500 in C elegans.

TUMORI

Tumore/neoplasia/cancro: 3 parole per indicare stessa malattia.

Tumore Per tumore si intende tumefazione, venne coniata su base macroscopica in quanto veniva notata massa anomale presente in un determinato organo. E' dovuto ad una proliferazione incontrollata di cellule che porta a tumefazione.

Neoplasia Per neoplasia si prende in considerazione la composizione cellulare della massa tumorale, visione microscopica.

Cancro Il termine cancro fu coniato perché cellule formano propaggini (come il granchio), che attaccano cellule limitrofe (definizione che si tende ad eliminare).

Le caratteristiche generali sono: cellula somatica o cellula germinale che va incontro a mutazione ed in grado di trasferire tale mutazione alla progenie formando la massa tumorale.

Gli effetti delle mutazioni possono essere: 1.incontrollata capacita moltiplicativa, 2.perdita di meccanismi regolatori che riguardano la proliferazione 3.mutazioni a carico di fattori di crescita e loro recettori (IGF,EGF,PDGF) 4.mutazioni a carico di geni che codificano per fattori di trascrizione, che inducono la cellula a crescere più rapidamente 5.desensibilizzazione a segnali di inibizione 6.perdita di inibizione da contatto, vale a dire che le cellule si moltiplicano a dismisura senza tenere conto della densità cellulare che provocano (cosa che nell'organismo sano non avviene) portando ad una sovrapposizione delle cellule tumorale tra di loro con invasione di spazi riservati ad altre cellule 7.perdita della capacita di adesione (matrice extracellulare non e presente). 8.mutazioni a carico di geni che portano ad angiogenesi, in modo tale che la massa tumorale possa sopravvivere 9.perdita capacità di andare incontro a morte cellulare programmata (cellule diventano immortali).

La mutazione avviene sempre a carico della singola cellula, infatti si parla di clone neoplastico, ossia una massa cellulare (tumorale) deriva da una singola cellula mutata.

Le cellule tumorali crescono su superficie solida ed e indipendente da siero (il quale trasporta fattori di trascrizione ecc. ma essendo la cellula in grado di produrne in grandi quantità la sua presenza non è necessaria) e sono come già detto indipendenti dalla densità. Le cellule tumorali sono sferiche poiché pure il citoscheletro è alterato (maggiore capacita di movimento), infatti una caratteristica peculiare dei tumori e dato dal fatto che le cellule sono in grado di invadere tessuti diversi dal quale hanno origine (metastasi), quindi occupano spazi sempre maggiori con l'avanzare delle replicazioni.

CAUSE TUMORALI Alterazioni genetiche sono alla base dei tumori. Sono quindi malattie a carico di geni, e che interessano il genoma ( malattia genica). Gli agenti carcinogeni, ossia coloro che possono indurre a mutazione, sono vari: raggi UV, sostanze chimiche, fibre di amianto ecc..., anche i virus (retrovirus ) sono in grado di provocare mutazione.

Mutazioni che aumentano proliferazione, oppure mutazioni che diminuiscono la stabilità del genoma, portano ad aumento tasso di mutazione complessivo (instabilità genomica); queste mutazioni, portano a alterazione della proliferazione, ed inibizione dei segnali che inducono a morte cellulare. L' instabilità genomica avviene soprattutto perché alcuni geni “guardiani del genoma” (ex P53), vengono mutati, con conseguente aumento appunto di instabilità . La maggior parte dei tumori ha origine monoclonale,ossia mutazioni che derivano da singola cellula, che dividendosi porta a formazione di clone neoplastico.

Il tumore affinché possa formarsi richiede processi di mutazione multipli (almeno 6,7,8): per questo il tumore è detto poligenico. Quindi una singola mutazione non è sufficiente per poter parlare di tumore.

Si è inoltre osservato che l'incidenza della malattia aumenta con l'avanzare dell'età; ciò può essere spiegato perché con il passare del tempo le mutazioni a carico di una singola cellula possono accumularsi, e quindi una volta che le mutazioni provocate nel genoma sono sufficienti a provocarlo ecco che si manifesta la malattia.

Proviamo ad eseguire un calcolo probabilistico sulla formazione di un tumore : 10^-7 è il tasso mutazione cellulare per ogni gene, il numero di geni per cellula è di 10^6, il numero di cellule per persona è di 10^13. Il risultato è che la probabilità di sviluppare tumore e di 1*10^12.

Quali sono i geni coinvolti nella formazione di tumore? Prima di tutto bisogna dire che se la mutazione riguarda geni delle cellule germinali il tumore sarà trasmesso ai figli ma il portatore non ne sarà coinvolto: si sviluppa quindi una malattia ereditaria. Se invece interessa una cellula somatica, allora il tumore interesserà l’ organismo in cui si trova.

Il tumore si sviluppa seguendo 3 fasi (con durata anche lunga): 1.Iniziazione; 2.Promozione; 3.Progressione.

L’ iniziazione è dovuta da azione di iniziatori (UV, virus, fumo ecc.): essi non portano obbligatoriamente a formazione di neoplasie, ma predispone le cellule a svilupparle (cellule più deboli). La promozione è dovuta all’ azione di promotori (fattori di crescita, ormoni, fattori di trascrizione) che se alterati o prodotti in eccesso inducono la cellula a trasformarsi con aumento della proliferazione per esempio. Gli iniziatori e i promotori se colpiscono una stessa cellula aumentano la probabilità di instaurare tumore. Entrambi inducono a instabilità genetica.

La progressione è la fase in cui si sommano le mutazioni indotte dai primi fattori indicati. Le mutazioni tumorali interessano soprattutto geni che controllano nascita e morte delle cellule si distinguono quindi Oncogeni e Oncosoppressori, responsabili di lesioni geniche. Un accumulo di alterazioni a carico di questi geni sono i maggiori responsabili della formazione di tumore.

Oncogeni Identificati in virus che portano a mutazione nelle cellule bersaglio; si è notato che essi avevano una loro controparte genica (Proto oncogene) ,nella stessa cellula la quale però svolgeva funzioni regolate e normali. Il proto oncogene è un gene che normalmente funziona in modo regolato; lo stesso proto oncogene è però potenzialmente un oncogene; infatti quando viene mutato il gene del proto oncogene ecco che si ha la formazione di un oncogene (MICH classico esempio) con conseguente modificazione cellulare. Per essere più chiari, un oncogene è un proto oncogene mutato.

Se questo oncogene assume un carattere dominante, ossia aumento di espressione la proteina codificata aumenta, con conseguenti danni cellulari. Mutazioni a carico di proto oncogeni nelle cellule germinali non sono compatibili con la vita, quindi l'espressione di oncogeni avviene solo a livello delle cellule somatiche. Il numero di proto oncogeni è maggiore del numero di oncogeni virali, ma generalmente ad ogni oncogene corrisponde un proto oncogene. I proto oncogeni più noti sono: SRC, RAS, ABL . (nome deriva dal virus che iniettava oncogene, che presenta nell'organismo controparte genica).

I proto oncogeni normalmente sono coinvolti nei processi di crescita e proliferazione cellulare, e possono essere classificati secondo 5 categorie: 1.Fattori di crescita che agiscono tramite via autocrina oppure paracrina. 2.Recettori di superficie. Ad esempio TRK recettoriali come MET; oppure proteine chinasi non recettoriali Abl, Src, EGF e PDGF receptors. 3.Fattori di trascrizione MICH (istone acetilasi), Jun, Fos. 4.Cicline , proteine che regolano il ciclo cellulare. L’ aumento della replicazione avviene tramite aumento della proteina stessa (ciclina maggiormente coinvolta è la ciclina D). Anche la ciclina può essere considerata un oncogene.

I meccanismi di attivazione di un proto oncogene che porta alla formazione di un oncogene può avvenire in maniera qualitativa o quantitativa. A livello qualitativo per esempio, la mutazione puntiforme RAS è coinvolta nel meccanismo di attivazione della cascata delle MAP chinasi, (le quali entrano prima nel nucleo e portano ad espressione geni coinvolti in proliferazione e sopravvivenza cellulare); A livello quantitativo parliamo per esempio dell’ amplificazione nell’ espressione di una proteina (quindi più prodotto genico: es MICH). (immagine sotto)

Un altro meccanismo di attivazione consiste nella formazione di geni chimerici dovuto a traslocazione cromosomica (o inversione cromosomica), che può portare ad alterazione nell'espressione di un determinato gene, come succede per quelli coinvolti nell'apoptosi. Come ad esempio bcl-2, che è un proto oncogene espresso nel mitocondrio con funzione anti apoptotica che in caso di tumore viene amplificato in seguito a traslocazione, trasformandosi in un oncogene: la cellula dunque non muore mai ( la funzione di bcl-2 è molto particolare; esso infatti diminuisce la permeabilità di membrana per il cit-P450 , molecola che porta a morte cellulare).

Le inversioni cromosomiche, che portano a spostamento di geni all'interno del cromosoma stesso, possono essere causa di neoplasia, dovuta all’ attivazione continua di geni. Tutto questo porta all'instabilità citata precedentemente. Ex: ABL (proto oncogene)= tirosina chinasi (TRK) citosolica che se mutata in seguito a traslocazione (diventando oncogene), porta a sua perenne attivazione fosforilando continuamente i substrati =>tumore.

Oncosoppressori Gli oncosoppressori sono identificati in seguito a mutazione o delezione cromosomica. La perdità dell’ attività di geni i cui prodotti, in condizioni normali, inibiscono la crescita cellulare, può provocare il tumore. Questo porta a concludere che esistono geni che regolano negativamente la proliferazione, e positivamente la morte cellulare; questi geni, se mutati, portano a perdita del sistema di controllo che viene utilizzato normalmente dalla cellula per rispondere alla formazione di tumore.

Come dice lo stesso termine essi sono coinvolti nella soppressione del tumore. Perchè si sviluppi il tumore la mutazione a carico di oncosoppressori deve essere presente su entrambi gli alleli, quindi in caso di omozigosi i pericoli sono maggiori( mentre in eterozigosi si è più protetti a questo livello).

Esperimenti di fusione tra cellule sane e cellule neoplastiche hanno evidenziato la presenza di oncosoppressori; infatti in seguito ad unione si è notato che la cellula risultante era completamente sana. Questo perché il genoma neoplastico veniva

“guarito” dagli oncosoppressori funzionanti della cellula sana. Anche introduzione di oncosoppressori funzionanti in cellule neoplastiche hanno evidenziato medesimo risultato => la cellula guariva!.

Gli oncosoppressori sono quindi geni la cui mancata attività nella cellula favorisce la crescita del tumore.

Molti geni oncosoppressori sono silenziati con modalità epigenetiche (metilati, deacetilati) portando alla loro perdita di attività.

Gli oncosoppressori sono anche detti geni guardiani. Essi garantiscono l'integrità del genoma P53 oncosoppressore che controlla apoptosi, proliferazione, e riparazione del DNA in seguito a mutazione. Una loro mutazione porta ad aumento instabilità genomica ossia porta ad aumento probabilità di sviluppare mutazioni multiple a carico di proto oncogeni che diventano quindi oncogeni.

GENI ONCOSOPPRESSORI: P53 e RB

P53

P53 è un oncosoppressore, riduce la proliferazione cellulare. In caso in cui la mutazione riguardi un unico allele, l’allele sano continua la produzione di p53 e ciò non causa il tumore, in caso di mutazione omozigotiche, assenza di p53, vantaggio nella crescita cellulare,sviluppo tumore, inoltre p53 esercita una funzione regolazione e riparazione del dna, la perdita di tale proteina crea quindi un doppio svantaggio. Radiazioni ionizzanti o ultraviolette mutano il dna, interviene l’oncosoppressore, rallenta il ciclo cellulare e ripara la cellula se troppo compromessa la uccide, in caso di assenza ulteriori mutazioni possono creare un protoncogene (mutazione di entrambi gli alleli) che determina instabilità genomica con tumori da 100 a 1000 volte piu frequenti. P53 è fattore di trascrizione, regolazione ciclo cellulare, morte della cellula.

P53 è un tetrametro (trascrizione su 4geni): se uno solo è difettoso impedisce la trascrizione. Nel 70% dei tumori indipendentemente dall’origine istologica si è

riscontrato una carenza di p53, le moderne terapie puntano sulla sua riattivazione. Esso regola negativamente il ciclo cellulare, p21 inibitore cellulare, l’attivazione di una chinasi fosforila p53 altrimenti inattivo, che cosi libera p21 che può iniziare a inibire il ciclo cellulare, attiva l’apoptosi, meccanismo di autoinibizione MDM2 nel proteosoma, DRCA1 DRCA2 geni mutati che indicano tumore mammella-ovaio, utilizzati nella profilassi di controllo.

Oncogeni: derivano da protoncogeni, no apoptosi, crescita folle ciclo cellulare sballato, oncosoppressori: morte programmata cellule. Le mutazioni possono essere ereditarie o somatiche (acquisite nel corso della vita)

RB

RB è responsabile del retino blastoma, controlla trascrizione geni fase s, quando RB non è fosforilata lega a se E2F responsabile dell’entrata delle cellule in fase s. Alcuni punti del ciclo cellulare sono regolati da fattori che fanno decidere alla cellula cosa fare, EF2 fa entrale la cellula in fase s, fase di sintesi dna. Quando RB è fosforilata libera E2F permettendo l’entrata in fase s della cellula. La perdita di RB lascia E2F sempre libero e le cellule in continuo stadio di riproduzione inducendo il tumore.

NON CODING RNA, micro RNA e relazione con i tumori

Poiché vi è correlazione con crescita, morte cellulare e differenziamento, possiamo indagare gli mRNA nella cellula tumorale, nella normalità essi sono all’equilibrio, in caso di aumento/diminuzione vi sono anomalie in correlazione ai geni, aumento mRNA esso degraderà e quindi tradurrà geni target diminuendo la sintesi di tale proteina, oncosoppressori quali p53 non riusciranno più ad essere sufficienti, al contrario diminuzione mRNA impedisce la degradazione dell’oncogene che va quindi fuori controllo, poiché l’mRNA non viene degradato esso sarà presente nel plasma, tramite tac spirale può essere identificato il tumore al polmone.

CELLULE STAMINALI TUMORALI

Il tumore è una popolazione eterogenea, simile ad un tessuto, solo alcune se trapiantate sono in grado di generare un nuovo tumore, esse sono chiamate cellule staminali tumorali, ciò è stato scoperto tramite trapianto seriale nel topo, inoculando concentrazioni via via inferiori di cellule tumorali si è notato una diminuzione del numero di tumori (probabilità) modello gerarchico,una cellula comanda le altre si dividono.

Una cellula staminale normale si automantiene, divisione asimmetrica, crea una cellula staminale ed un progenitore (che non si automantiene e da il via alla linea germinale) cellula staminale pull genetico invariato essa è ferma in p0, essa entra nel ciclo quando serve, la staminale tumorale fa divisione simmetrica creando due cellule staminale ed alterando il pull genetico,tumore più ricco di cellule staminale che poi generano anche cellule differenziate, i farmaci antimitotici agiscono su questi ultimi che sono in accrescimento, ma non sulle statiche staminali tumorali. La ricerca sta cercando marcatori di superficie per identificare le staminali tumorali, quali il CD133. La quiescenza della cellula staminale è dovuta al fatto che essa può dividersi 80-200 volte nell’arco della vita e non devono andare subito esaurendosi, una normale staminale può essere trapiantata 3volte mentre la staminale tumorale non esaurisce la sua capacita rigenerativa, può generare nuovi tumori e cellule aberranti cioè non in linea con l’evoluzione di una staminale normale in quel tessuto.

Xenotrapianti: l’esportazione di un tumore umano, il suo trattamento e cultura crea una proliferazione di staminali tumorali, impiantato in topi immunodeficienti, esso si svilupperà in modo identico che nell’essere umano, potendo cosi essere studiato.