biología del desarrollo
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Biología del Desarrollo
María Eugenia Cabrejos, PhDAño 2006
• Aristóteles (350 a.C.):– Analiza embriones de pollos de distintos estadíos de
gestación• Marcelo Marphigi (1672)::
– Descubrimiento de microscopios e inicio de observaciones en pollo.
• Nace gran controversia:– Epigénesis vs Preformación• Wolff KF (1767):“fuerza esencial, como la garvedad, que guía la orgnización del desarrollo embrionario”
Orígenes de la Biología del Desarrollo como Ciencia
Pander Ch • describe las tres capas germinales• indicios acerca del proceso de inducción• sustenta la epigénesis
von Baer (1828)– describes notocorda– describes similitudes en el desarrollo
temprano de vertebrados
Principio de von Baer
• Las características generaizadas de un amplio grupo de animales (phylum, clase) se forman al comienzo, mientras que las especies se van diferenciando más tarde con la aparición de otras estructuras más complejas.
• Carácter del desarrollo: generalizado específico.
• Los embriones de distintas especies son similares al de otras especies, no así los adutos.
• Un embrión “no pasa” por las etapas adultas de animales menores: ontogenia no recapitula a la filogenia.
Modelos de la Biología del Desarrollo
D.melanogaster D.rerio X.laevis
C.elegansG.gallusM.musculus
Métodos Moleculares
•Knock-out•Integrational mutagenesis•Classic geneticsTransgenics
•(microinjection)•Electroporation, •lipofection, •transgenics
•Reporter genes
DNA (gen)
•RNAi & •siRNA•Morpholinos
•microinjection•Northern Blot•RNase protection assays•microarrays•RT-PCR•in situ Hibrydisation
RNA
•pharmacological inhibitors, •dominant-negative proteins, • protein depletion using antibodies
•(adding proteins to in vitro reactions)
•Western Blot•Proteomics•immuno-histochemisty•protein chimera
Protein
III. InhibitionII. OverexpressionI. Analysis
I. Determinación de mapas de Destino.
• Estudio global de la expresión génica: gen A es expresado de forma adeucada en un tejido y en una etapa adecuada para mediar el proceso B.
III. Experimentos de ganancia de función: el producto génico del gen A es suficiente para mediar el proceso B.
IV. Experimentos de pérdida de función: el producto génico del gen A es normalmente requerido para mediar el proceso B.
V. Análisis del experimento: evidenciar el fenotipo o expresión del marcador génico.
¿Cómo estudiar la relación: expresión génica en tiempo y espacio vs. respuesta morfogenética?
Base experimental de la Embriología
Mapa de Destino
de diferentes clases
de vertebrados
en etapade gástrula
temprana.
Mapa de Destino
de un embrión tunicato.
Observación de embriones “vivos”
Marcadores vitales
Marcación fluorescente o radioactiva(Transgénicos)
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Marcadores genéticos como trazadores de linaje celular
(Transplante)
DesarrolloInductivo vs Autónomo
Generación de sondas antisentido
Clonamiento cDNA flanqueado por promotores de RNA polimerasas virales - ensayo de run off -uso de ribonucleótidos modificados para facilitar la detección
Detección de mRNA en tejidos: Hibridación in situ
Whole-mount
in situ hybridisation
in X.laevis
Ganancia de función
•Inyección mRNA
•Inyección dsDNA(con un promotor inducible)
•Electroporación de mRNA, dsDNA
Ganancia de función
•Implantación microesferas embebidas con proteínas
Ensayo de Western blot
Microscopía y reconstrucciones 3D
Base experimental de la Embriología
c)
e)
Biología del Desarrollo
Objetivos Generales
•Crear diversidad celuar y orden entre cada generación
•Asegurar continuidad de la vida entre una generación y otra
Desarrollo Temprano en D.rerioMorfogénesis:
Proceso por el cual las células embrionarias hacen uso de una variedad de comportamientos para generar un tejido nuevo en respuesta a señales inductivas.La inducción y la morfogénesis son eventos mutuamente dependientes.
Aspectos relevantes:
1. Procesos morfogenéticos en el desarrollo
2. Comportamientos celulares en la morfogénesis
3. Desarrollo embrionario temprano en modelos invertebrados y vertebrados
* Clivaje* Gastrulación
4. Aproximación al proceso de neurulación
Proceso Ejemplos
Distintas tasas de proliferación Crecimiento selectivo de primordios(extremidades vertebrados).
Posicionamiento alternativo y/oorientación del uso mitótico
Distintos patrones de clivaje. Divisiones celularesestereotipadas (nemátodos).
Cambio de tamaño celular Expansión celular durante epibolia.
Cambio de forma celular Cambio de columnar a cuña durante cierre tuboneural (aves y mamíferos).
Fusión celular Formación trofoblasto y miotúbulos (mamíferos).
Muerte celular Separación de dígitos (extremidades vertebrados)
Ganancia adhesión célula-célula Condensación del mesénquima cartilaginoso(extremidades verteb.).
Pérdida adhesión célula-célula Delaminación de células del epiblasto(gastrulación mamíferos).
Interacción célula-matriz Migración: células cresta neural y germinales, axón.
Pérdida adhesión célula-matriz Delaminación de células desde lámina basal deepidermis.
Procesos morfogenéticos en el desarrollo
Comportamientos celulares en el desarrollo
Ingresión - Egresión Movimiento de células hacia dentro o fuerade la superficie
Delaminación Salida de células de la capa epitelial(aumento número de capas)
Intercalación Movimiento de células dentro de capaepitelial (disminución número de capas)
Condensación Células dispersas se agregan para formarepitelio (transición mesenquimal – epitelial)
Dispersión Capa epitelial se desarma en célulasmesenquimáticas.
Movimiento de células individuales
Comportamientos celulares en el desarrollo
Movimiento de capas celulares en grupos
Invaginación – Evaginación Plegamiento de capas celulares para formar pliegueo protrución
Involución Curvamiento hacia adentro de capa celular enexpansión. Extensión sobre superficie interna decapa (generación de segunda capa)
Epibolia Extensión de capa celular dirigida por intercalacióno proliferación celular.
Extensión convergente Combinación de procesos que resulta enconvergencia hacia el organizador y extensión eneje A-P. Convergencia involucra epibolia (?) einvolución y e xtensión involucra intercalaciónextensiva.
Visualización movimientos capas celulares y células individuales
Desarrollo embrionario temprano
- Clivaje:Divisiones celulares del cigoto en blastómeras menores. En general divisiones rápidas y sincrónicas controladas por productos de genes maternos (excepción mamíferos).Tipos de clivaje dependen de:
- orden y orientación de las diferentes divisiones celulares- cantidad de vitelo en el ovocito
Transición de blástula media:
- activación del genoma cigótico- enlentecimiento de divisiones celulares- pérdida de sincronía
- Eventos celulares particulares en algunos modelos.
- Gastrulación: Serie compleja de movimientos celulares coordinados, que culmina con la formación de las tres hojas embrionarias y el establecimiento de los ejes corporales.
Tipos
De
Clivaje
Gastrulación zebrafish
Blastula: blastodermo con tres poblaciones celulares - YSL: ciclo cel. 9-10 celulas vegetales se fusionanan con vitelo, EVL: monocapa epitelial de cel. superficiales, cel. profundas: originarán embrión.
Clivaje meroblástico discoidal
Expresión: no tail - notocorda, snail - mesodermo paraxial
Gastrulación Pollo
Línea primitiva: Ingresión de precursores endodérmicos al blastocele y migración de células desde regiones laterales del epiblasto posterior a línea media. Extensión hasta 60-75% largo del embrión.
Nodo de Hensen: Ingresión células individuales desde extremo anterior de línea primitiva y migración hacia anterior, desplazando hipoblasto (forma media luna germinal). Ingresan células precursoras de endo (tubo digestivo) y meso (cabeza y notocorda anterior).
Surco primitivo: Ingresión de células desde regiones laterales a línea. En blatocele separación en dos poblaciones una capa profunda que desplaza al hipoblasto lateral (endodermo) y una capa intermedia de células más “sueltas” (mesodermo).
Regresión del surco primitivo: Nodo de Hensen comienza a regresar a regiones más posteriores, dejando formada la notocorda a su paso.
Existe también epibolia del ectodermo por proliferación celular.
- Embrión con desarrollo en gradiente.
Acción de moléculas de señalización - factores Paracrinos
• Factores inductores que controlan la formación de órganos.• Mitógeno que regula la proliferación celular.• Morfógeno que actúa en forma dosis-dependiente para
regular el destino celular en un campo determinado.
Establecimiento de los ejes: A/P; D/V; D/I
Paradigma de la expresión Génica Diferencial
El patrón resultante puede involucrar la interpretación de una información posicional.
Interpretación de GradientesDiseño de patrones celulares
Competencia y Diferenciación Celular
Especificación Celular
La madre aporta productos génicos localizados que establecen polaridad a lo largo de los ejes A/P y D/V del ovocito.
Esta polaridad se traduce en destinos celulares específicos
Modelo General
de Establecimiento
eje A/P
Expresión Genes
Homeóticos en
Drosophila
Interacción Homeodominio- DNA
Hox-C: genes parálogos
Determinación eje D/V
en Drosophila
Determinación neural en vertebrados
¿Qué parte del embrión se transformará en SN?¿Cómo se diferencia dorsal de ventral en el tubo neural?¿Cómo se diferencia anterior vs posterior en el tubo neural?
Especificación de ejes
Spemann, 1924
En X.laevis
En D.rerio
Diencéfalo
PLM
Tailbud spaw
cyc
lefty2
cyclefty1pitx2
pitx2
?
OepOep
lefty
1
I
A
P
D
Esquema de vía de señalización Nodal“Flujo”
B
A
Desarrollo de la médula espinal
Jessell T.M, 2000
Wnt’s
II
Fore Mid Hindbrain
III eye
Cephalic Caudal
I
A P
Especificación Antero-posterior en cerebro de vertebrados
Fore Mid Hindbrain Wt
Mutantes de la vía Wnt afectan el patrón AP
eye
Fore Mid Hindbrain mbl/axin1
Especificación neuronal en la médula espinal: una acción combinada de señales inductivas
y códigos transcripcionales
Jessell T.M, 2000
Interpretación del gradiente de Shh: El papel combinatorio de las proteínas con homeodominio de
clase I y clase II define cinco dominios de células progenitoras
Proteínas de clase I (Pax7,Dbx1, Irx3,Pax6 y Dbx2),
Proteínas de clase II (Nkx6.1 y Nkx2.2)…
Proceso en Humanos
Leonardo Da Vinci, (1452-1519)