biohemizmi stanicne transdukcije signala

BIOHEMIZMI STANIČNE TRANSDUKCIJE SIGNALA


Autori: Dr.sc. Zlata Mujagić, vanredni profesor, Farmaceutski fakultet Univerziteta u Tuzli Dr.sc. Hamza Mujagić, redovni profesor, Medicinski fakultet Univeziteta u Tuzli;

Gostujući profesor hematologije i onkologije, Medicinski fakultet Harvard Univerziteta, MGH, Boston, USA

Izdavači: Zlata Mujagić

Hamza Mujagić

Recenzenti: Dr. sc. Jasminka Nikolić, redovni profesor, uža naučna oblast Medicinska

biohemija Dr. sc. Lejla Begić, redovni profesor, uža naučna oblast Biohemija

Tehnička pripema i dizajn: Mr. sc. Damir Alihodžić,

Naslovna strana modificirana prema Koolman J, Röhm K-H. Taschenatlas der Biochemie. Georg Thieme Verlag Stuttgart, New York, 1998.

Odlukom Senata Univerziteta u Tuzli br. 03-3070-14.3/12 od 18.04.2012. godine odobrava se upotreba u nastavi.

CIP - Katalogizacija u publikaciji Nacionalna i univerzitetska biblioteka Bosne i Hercegovine, Sarajevo 577(075.8) MUJAGIĆ, Zlata Biohemizmi stanične transdukcije [Elektronski izvor] / Zlata Mujagić, Hamza Mujagić. - Elektronski tekstualni podaci. - Tuzla : autori, 2012. - 1 elektronski zapis : tekst, slike, animacije Tekst s nasl. ekrana. ISBN 978-9958-865-88-6 1. Mujagić, Hamza COBISS.BH-ID 19905798

Zlata Mujagić • Hamza Mujagić


Tuzla, 2012. god.

Predgovor Naše dugogodišnje iskustvo u radu na univerzitetu, kao i istraživačko iskustvo, te objavljeni rezultati našeg zajedničkog znanstvenog rada bili su razlogom zašto smo se odlučiti napisati ovu naučnu Monografiju. Odluku o pisanju ove knjige smo donijeli mnogo ranije i veoma smo sretni da smo dio tog posla na ovaj način i završili. U Prvom poglavlju Monografije se govori o temeljnim principima signalizacije u stanicama. U Drugom poglavlju se razmatraju opći i specijalni putevi prijenosa signala u stanici. U Trećem poglavlju se govori o prolaktinu kao prvom glasniku i o biohemizmima transdukcije signala uz pomoć prolaktina. Treće poglavlje je obogaćeno i nekim našim naučnim rezultatima a koji su objavljeni u relevantnim časopisima i na naučnim skupovima. Namjera nam je bila istaknuti biohemijske osnove složenih procesa stanične signalizacije i povezati ih sa biohemizmima nekih bolesti i djelovanja nekih lijekova. S obzirom da je riječ o veoma složenom i specifičnom aspektu biohemije, ovom knjigom smo željeli pomoći i studentima farmacije i srodnih fakulteta, te studentima doktorskih studija iz područja biomedicine, u savladavanju zadanog gradiva. Želimo se posebno zahvaliti recenzentima ove knjige: dr sc Jasminki Nikolić, redovnom profesoru i dr sc Lejli Begić, redovnom profesoru na njihovim korisnim i dobrodošlim sugestijama. Tuzla, mart, 2012. godine

Autori

SADRŽAJ

1. TRANSDUKCIJA SIGNALA - TEMELJNI PRINCIPI 2

1.1. OPĆA SHEMA TRANSDUKCIJE SIGNALA 2 1.2. TIPOVI RECEPTORA UKLJUČENIH U SIGNALNU TRANSDUKCIJU 6 1.3. G PROTEINI 24 1.4. DRUGI GLASNICI 28

2. BIOHEMIZMI PRIJENOSA SIGNALA U STANICI 38

2.1. G-PROTEIN SIGNALIZACIJA 38 2.2. SIGNALIZACIJA UZ POMOĆ RECEPTORA SA ENZIMATSKOM AKTIVNOŠĆU 42 2.3. SIGNALIZACIJA UZ POMOĆ UNUTARSTANIČNIH RECEPTORA 50

3. SIGNALIZACIJA UZ POMOĆ PROLAKTINA 56

3.1. PROLAKTIN KAO PRVI GLASNIK 56 3.2. PROLAKTIN I RAK DOJKE 61

POPIS I OBJAŠNJENJE SKRAĆENICA 91

INDEKS POJMOVA 95

LITERATURA 97

TRANSDUKCIJA SIGNALA - TEMELJNI PRINCIPI

1

POGLAVLJE 1

1. Transdukcija signala-temeljni principi

1.1. Opća shema transdukcije signala 1.2. Tipovi receptora

1.3. G-regulacijski proteini 1.4. Drugi glasnici


2

1. Transdukcija signala - temeljni principi 1.1. Opća shema transdukcije signala Signalna transdukcija je proces prenošenja informacije iz spoljšnosti stanice u njenu unutrašnjost. To je, zapravo, proces putem kojega stanice donose odluke na koji način će odgovoriti na svoje okruženje. Većina gena humanog genoma kodira proteine koji igraju određenu ulogu u procesu donošenja odluka. Veliki broj fatalnih oboljenja proizilazi iz pogrešnih odluka koje stanica donosi. Neki najočitiji primjeri su: maligna oboljenja i ateroskleroza, dijabetes, te autoimune bolesti. Geni koji kontroliraju ove puteve su visoko konzervirani, te su mnoga fundamentalna pravila signaliziranja održana u istovjetnome obliku u eukariontskom svijetu. Čak i relativno jednostavne eukariontske stanice (poput kvasca) imaju veliki broj puteva signalne transdukcije koji im omogućavaju da sazrijevaju, odgovaraju na nutrijente, oksidativni stres, agense koji oštećuju DNK molekulu, mikroorganizme i promjene u osmotskom pritisku. Stanični proteini koji su bitni u donošenju odluka su: proteini intermedijernog metabolizma, sinteze membrana, kompartmentacije, DNK sinteze i staničnog ciklusa. Stanica može proizvesti aditivni, sekvencijski, sinergistički ili inhibicijski odgovor. Iznenađujuća i zadivljujuća je činjenica da je relativno mali broj struktura i biohemizama od fundamentalnog značaja u putevima stanične signalizacije i nastajanja odgovarajućeg odgovora stanice na primljenu informaciju. Opća shema signalne transdukcije podrazumijeva kroz tri osnovna koraka:

- Interakcija prvi glasnik-specifični receptor - Okidanje kompleksnog i koordiniranog seta događaja

unutar stanice - Konačni rezultat.


3

Interakcija prvi glasnik-specifični receptor Prvi glasnici su molekule koje dolaze iz ekstracelularne sredine, a nastaju pod uticajem različitih stimulusa kao što su: kontakt sa drugom stanicom, toksini bakterija i virusa, agensi oksidativnog stresa, mutageni. Prvi glasnici mogu biti: faktori rasta, diferencijacijski faktori, faktori preživljavanja, faktori smrti, limfokini/citokini, hormoni, interferoni, antitijela, neurotransmiteri. Fiziološki receptori Fiziološki receptori predstavljaju proteine koji normalno služe kao receptori za endogene regulacijske ligande. Specifični receptori mogu biti smješteni u staničnoj membrani, citosolu i jedru. Fiziološki receptori imaju barem dvije glavne funkcije: vezivanje liganda, i propagacija poruke (ovaj proces se naziva signaliziranje). Da bi izvršili ove svoje zadatke, receptori moraju u svojoj strukturi imati barem dvije funkcionalne domene: ekstracelularnu ligand-vezujuću domenu, i intracelularnu efektorsku domenu. Utvrđena je struktura i funkcija ovih domena za mnoge familije fizioloških receptora, pri čemu su visoko rezolutne kristalne strukture receptorskih proteina i/ili analize ponašanja namjerno mutiranih receptora bile od značajne pomoći. Mnogi lijekovi za svoju metu imaju ekstarcelularne ligand-vezujuće domene fizioloških receptora. Takav primjer su β-adrenergički antagonisti koji su u širokoj upotrebi. Lijekovi mogu uticati na bilo koju od ovih domena. Regulacijsko djelovanje receptora može biti ispoljeno:

- direktno na njegovu celularnu metu(e) - na efektorski protein(e) ili - djelovanje receptora može se prenijeti dalje pomoću

staničnih intermedijernih signalnih molekula koje se zovu transdjuseri.

Receptor, njegova intracelularna meta i intermedijerne molekule koje su uključene u dalji prijenos signala čine sistem koji se naziva receptor-efektor sistem ili put transdukcije signala. Često, proksimalni stanični efektorski protein nije i konačna fiziološka meta, nego je to odgovarajući enzim, jonski kanal ili transportni protein koji pak, stvaraju, pomjeraju ili degradiraju male molekule


4

(npr. ciklični nukleotidi, inozitol trifosfat, ili NO) ili jone (npr. joni Ca2+), a koji se nazivaju drugi glasnici (second messengers). Ukoliko je efektor jonski kanal ili pumpa, efekat vezivanja liganda će biti promjena membranskog potencijala koji će, opet, dovesti do promjene u ekcitabilnosti stanice. Drugi glasnici mogu difundirati u blizini njihove sinteze ili biti oslobođeni i prenijeti informaciju dalje do različitih ciljeva (meta) koji, opet, mogu integrirati multiple signale. Difuzija i intracelularno djelovanje drugih glasnika ograničeno je kompartmentacijom unutar stanice tj. selektivnom lokalizacijom kompleksa receptor-transdjuser-efektor-signal terminacija, a što se uspostavlja protein-lipid i protein-protein interakcijama. Sve stanice eksprimiraju multiple forme proteina koji su dizajnirani sa namjerom da lokaliziraju signalne puteve uz pomoć protein-protein interakcija. Ovi proteini se nazivaju skele ili sidra. Takav primjer su AKAP proteini (A-kinase anchoring proteins) koji vežu regulacijsku podjedinicu cAMP-ovisne protein kinaze (PKA) u različitim subcelularnim kompartimentima. Okidanje kompleksnog i koordiniranog seta događaja unutar stanice U ovome koraku procesa transdukcije signala uključeni su različiti putevi i milioni molekula, a u cilju nastajanja željenog odgovora stanice. Razlikujemo mehanizme prenošenja i mehanizme pojačavanja signala. Aktivacija enzima u signalnim kompleksima koji proizvode druge glasnike i/ili aktivacija kaskada protein kinaza su osnovni biohemizmi prenošenja i amplifikacije signala unutar stanice. Intergacija i amplifikacija signala Važno svojstvo fizioloških receptora jeste da oni, zajedno sa efektorskim i transdjuser proteinima, djeluju kao integratori informacija budući da koordiniraju signale koji pristižu od različitih liganada jedne sa drugima, kao i sa različitim aktivnostima ciljne stanice. Npr. sistemi transdukcije signala koji su regulirani promjenama u intracelularnoj koncentraciji cAMP i Ca2+ jona integrirani su u mnogim ekscitabilnim tkivima. cAMP i Ca2+ joni su


5

pozitivni kontraktilni signali u miocitima miokarda (aktivacija β-adrenergičkih receptora dovodi do porasta intracelularne koncentracije cAMP u kardiocitima, što rezultira povećanom kontraktilnošću usljed povećanja količine i brzine dotoka Ca2+ jona kontraktilnom aparatu). Suprotno ovome, cAMP i Ca2+ joni izazivaju obrnute efekte na kontraktilnost glatkih mišića: aktivacija β-adrenergičkih receptora aktivira cAMP-PKA put koji vodi do relaksacije putem fosforilacije proteina koji posreduju u Ca2+ signalizaciji. Na taj način, različiti načini integracije sistema transdukcije signala unutar ciljnih tkiva mogu dovesti do različitih farmakodinamijskih efekata, a koji su rezultat funkcionalnih interakcija unutar stanice nizvodno od receptora. Ove funkcionalne interakcije mogu biti: sinergističke, aditivne i antagonističke. Drugo važno svojstvo fizioloških receptora jeste njihov kapacitet da značajno pojačavaju (amplificiraju) fiziološke signale, što ih čini izvrsnim metama za prirodne ligande i mnoge lijekove. Neurotransmiteri, hormoni, i drugi ekstracelularni ligandi su obično prisutni u veoma niskim koncentacijama na ligand-vezujućoj domeni receptora (nM ili μM nivoi). Međutim, efektorska domena ili signalni put često sadržavaju enzime i enzimske kaskade koji katalitički amplificiraju dati signal. Npr. ukoliko se veže jedna molekula agonista za receptor-jonski kanal, poteći će stotine i hiljade miliona jona kroz kanal svake sekunde; ili, vezivanje jednog fotona na cis-retinal u strukturi fotoreceptora rodopsina, dovešće do njegove amplifikacije od 1 x 106 puta; vezivanje jedne molekule steroidnog hormona za njegov nuklearni receptor iniciraće transkripciju mnogih kopija specifične mRNK, što će, potom, rezultirati nastankom multiplih kopija jednog proteina. Konačni rezultat Konačni događaj je aktivacija jedne ili više protein kinaza, bilo da je uključen drugi glasnik ili ne. Konačni rezultat u biohemijskom smislu je promjena aktivnosti određenog fiziološki aktivnog proteina (najčešće se radi o enzimu) i/ili biosinteza fiziološki aktivnog proteina (enzima; transkripcijskog faktora). Do danas je opisano više od 100 različitih protein kinaza koje su uključene u puteve transdukcije signala. Važnost fosforilacije proteina su prepoznali Krebs i Fisher, za što su 1992. dobili Nobelovu nagradu iz područja medicine i fiziologije.


6

1.2. Tipovi receptora uključenih u signalnu transdukciju

Postoje četiri strukturalne familije fizioloških receptora uključenih u procese stanične signalizacije:

‐ Receptori povezani sa G-proteinima, ‐ Jonski kanali, ‐ Receptori koji penetriraju plazma membranu i imaju

unutarnju (intrinzičku) enzimatsku aktivnost (transmembranski enzimi i ne-enzimi) i

‐ Receptori koji su smješteni unutar stanice (nuklearni i intracelularni enzimi).

Slika 1-1. Tipovi receptora uključenih u procese stanične signalizacije.


7

Tabela 1-1. Strukturalne i odgovarajuće funkcionalne familije fizioloških receptora. Strukturalna familija

Funkcionalna familija

Fiziološki ligand

Transdjuseri i efektori

GCPR

β-Adrenergički receptori Muskarinski receptori Holinergički receptori Eikosanoidni receptori Trombin receptori

Ne, Epi, DA, ACh, PG, receptor peptidi

Gs, Gi, Gq, PLC, GEF

Jonski kanali

Ligandom regulirani receptori Voltažom-regulirani receptori

ACh, GABA, 5-HT

Na+, K+, Ca2+ i Cl-

Transmembranski enzimi

Receptor tirozin kinaze Membranske GC Tirozin fosfataze

Inzulin, faktori rasta, natriuretski peptidi

SH2 domena, PTB-sadržavajući proteini, cGMP

Transmembranski ne-enzimi

Citokinski receptoriTLR

Interleukini i citokini

Jak/STAT, solubilne tirozin kinaze

Nuklearni receptori

Steroidni rceptori Receptori za tiroidne hormone PPAR

Spolni hormoni, tiroidni hormoni, PPAR

MyD88, IARK, NF-κB, ko-aktivatori

Intracelularni enzimi Solubilna GC NO, Ca2+ cGMP GC-gvanilil ciklaza; PPAr- peroksizom proliferator-aktivirani receptor NE-norepinefrin (noradrenalin); Epi-epinefrin(adrenalin); DA-dopamin; Ach-acetilholin; PG-prostaglandin; GABA-γ aminobuterna kiselina; PPAR-peroksisomproliferator-aktivirani receptor, PTB-fosfotirozin vezujuća domena; PLC-fosfolipaza C Receptori povezani sa G proteinima (GCPRs: G protein-coupled receptors) Transmembranska domena GCPR receptora je najčešće građena od sedam α-heliksa, skoro paralelno poredanih u membrani, pa se još nazivaju i serpentinski receptori (Slika 1-2).


8

Slika 1-2. Receptori povezani sa G-proteinima. (Modificirano prema David L. Nelson, Michael M. Cox, Lehninger. Principles of Biochemistry, Worth Publishers, New York, 2005) U čovjeka je poznato više od 800 GCPR receptora, od čega skoro polovina sudjeluje u senzorskoj percepciji, a preostali dio je uključen u regulaciju impresivnog broja fizioloških funkcija, uključujući nervnu aktivnost, tenziju glatkih mišića, metabolizam, brzinu i snagu srčane kontrakcije, sekreciju mnogih žlijezda u tijelu.

Ligandi za GCPR receptore su brojni i različiti: neurotransmiteri, poput acetilholina; biogeni amini, kao što je noradrenalin; svi eikosanoidi i druge lipidne signalne molekule; peptidni hormoni; opoidi, aminokiseline, poput GABA, i mnogi drugi peptidni i proteinski ligandi.

Zahvaljujući svome velikom broju i velikoj fiziološkoj važnosti, GCPR receptori su meta za mnoge lijekove, i barem polovina od svih ne-antibiotskih lijekova djeluje putem ovih receptora.

Ligand-vezujuće studije i molekularno kloniranje su ukazali na postojanje različitih klasa, subtipova i izoformi unutar familije


9

GCPR receptora, pri čemu pojedini receptori pokazuju značajno različitu selektivnost prema agonistima ili antagonistima. Ukolikonije poznat selektivni ligand za dati receptor, tada je prikladnije koristiti termin izoforma negoli termin subtip receptora. Npr. α i β adrenergički receptori predstavljaju klase unutar familije GCPR receptora, a α1 i α2 su subtipovi, dok su α1A, α1B i α1C izoforme. Pojedini subtipovi i pojedine izoforme se mogu međusobno razlikovati u svojim biohemijskim svojstvima, tkivnoj distribuciji, selektivnosti prema vezivanju G proteina i u načinu regulacije svoje aktivnosti.

Dalje, GCPR receptori podliježu homo- i heterodimerizaciji, a moguća je i oligomerizacija, što sve može uticati na afinitet i specifičnost kompleksa prema G proteinima, te na regulaciju senzitivnosti ovih receptora prema fosforilaciji uz pomoć receptor kinaza, i na vezivanje arestina, a što su sve važni događaji u terminaciji djelovanja agonista i uklanjanju receptora sa stanične površine.

Jonski kanali Plazma membrana stanica je nepropusna za anjone i katjone, pa su promjene u protoku jona kroz membranu kritični regulacijski događaji i u ekscitabilnim i u neekscitabilnim stanicama. U cilju uspostavljanja elektrohemijskih gradijenata neophodnih za održavanje membranskog potencijala, sve stanice eksprimiraju jonske transportere za jone Na+, K+, Ca2+ i Cl-. Pasivni protok jona niz stanične elektrohemijske gradijente reguliran je od strane velke familije jonskih kanala lociranih u staničnoj membrani. Čovjek eksprimira oko 232 različita jonska kanala koji sudjeluju u preciznoj regulaciji protoka jona Na+, K+, Ca2+ i Cl- kroz staničnu membranu. S obzirom na njihovu važnu ulogu kao regulatora stanične funkcije, ovi proteini su važne mete za neke lijekove. Velika i raznovrsna familija jonskih kanala može se dalje podijeliti na subfamilije na osnovu različitih kriterija (mehanizama njihovog otvaranja; njihova strukture; jona koje provode). U putevima transdukcije signala značajni su:

- voltažom-aktivirani jonski kanali; - ligandom-aktivirani jonski kanali; - kanali sa tranzitornim receptorskim potencijalom (TRP).


10

Jonski kanali regulirani voltažom Primjer ovoga tipa jonskih kanala jesu Na+ kanali u nervnom i mišićnom tkivu koji su odgovorni za nastajanje robustnog akcionog potencijala koji depolarizira membranu u samo nekoliko milisekundi (od potencijala mirovanja od -70 mV do potencijala višeg od +20 mV). Sastoje se od tri podjedinice: α podjedinice koja formira poru i dvije regulacijske β podjedinice. Voltažom-aktivirani Na+ kanali, locirani u neuronima odgovornim za senzaciju bola, mete su za lokalne anestetike, kao što su lidokain i tetrakain koji blokiraju pore, inhibiraju depolarizaciju i na taj način blokiraju senzaciju bola. Ovaj tip receptora je meta i za toksine prisutne u prirodi: tetrodotoksin i saksitoksin. Voltažom-aktivirani Na+kanali su meta i za mnoge lijekove koji se koriste u liječenje aritmija. Ca2+ kanali imaju sličnu prostornu strukturu kao i Na+ kanali, sa velikom α-podjedinicom (4 domene i 6 transmembranskih heliksa) i sa tri regulacijske podjedinice (β, δ i γ). Postoje multiple izoforme ovih kanala koji se eksprimiraju u nervnom tkivu, srcu i glatkoj muskulaturi. Antagonisti Ca2+ kanala, kao što su lijekovi nifedipin, diltiazem i verapamil, su efektivni vazodilatatori i široko se primjenjuju u liječenju angine pektoris, srčanih aritmija i hipertenzije. K+ kanali su najbrojniji i strukturalno najrazličitiji u okviru familije voltažom-aktiviranih jonskih kanala. Oko 78 različitih K+ kanala se eksprimira u čovjeka. Najčešće se sastoje od četiri odvojene podjedinice, a svaka od njih uključuje šest transmembranskih domena. Široko su zastupljeni u različitim tkivima i eksprimiraju se i u ekscitabilnim (nervno tkivo, miokard, skeletni i glatki mišići) i u neekscitabilnim tkivima. Lijekovi iz grupe općih anestetika i anti-aritmika djeluju na ovu vrstu jonskih kanala. Jonski kanali regulirani ligandom Ovaj tip jonskih kanala pokazuju različitu strukturu i na njih se mogu vezati različiti ligandi. Najvažniji kanali ovoga tipa u nervnom sistemu su oni koji odgovaraju na ekscitatorne neurotransmitere, kao što su acetilholin i glutamat, i na inhibitorne neurotransmitere kao što su glicin i γ-aminobuterna kiselina (GABA). Aktivacija ovih kanala je odgovorna za većinu sinaptičkih neuronalnih transmisija i u centralnom i u perifernom nervnom sistemu. U ovoj skupini se nalaze i posebna vrsta jonskih kanala koji se aktiviraju pod uticajem malih intracelularnih molekula i strukturalno


11

se razlikuju od konvencionalnih liganom-aktiviranih jonskih kanala. Ovoj vrsti jonskih kanala pripadaju hiperpolarizacijom i cAMP-aktivirani kanali (HCN kanali) koji su prisutni u srcu i odgovorni za polaganu depolarizaciju; cikličnim nukleotidima-aktivirani kanali (CNG) važni u procesu vida; IP3-senzitivni Ca2+ kanali odgovorni za oslobađanje Ca2+ iz endoplatmatskog retikuluma (ER); sulfonilurea“receptor“ (SUR1) koji sudjeluju u regulaciji ATP-ovisnih K+ kanala (KATP) u β-stanicama pankreasa. KATP kanali su meta za oralne antidiabetike tipa sulfoniluree i meglitinida koji stimuliraju oslobađanje inzulina iz β stanica pankreasa i koriste se u liječenju tipa2 dijabetesa. 5-HT3-regulirani kanali (5-hidroksi triptamin) su specijalizirani tip jonskih kanala koji se eksprimiraju na aferntnim nervima vagusa koji stimuliraju emezu. Ondansetron je važan antagonist ovih kanala i koristi se kao antiemetik. Nikotinski acetilholinski receptori su instruktivan primjer ligandom reguliranih receptora - jonskih kanala. Njegove izoforme su prisutne u CNS, autonomnim ganglijama i u neuromuskularnim pločama (slika 1-3).

Slika 1-3. Struktura acetilholinskih receptora. Nakon vezivanja dviju molekula acetilholina, nastaje konformacijska promjena α-podjedinica koja dovodi do otvaranja kanala u centru receptora, nakon čega slijedi izlazak K+ jona, a ulazak u stanicu Na+ jona. (Modificirano prema David L. Nelson, Michael M. Cox, Lehninger. Principles of Biochemistry, Worth Publishers, New York, 2005)


12

Acetilholinski receptori locirani u neuromuskularnim vezama posjeduju pentamernu strukturu sa četiri različite podjedinice (2α, β, δ, γ), a oni u autonomnim ganglijama su građeni od dvije različite podjedinice (2α, 3β). Svaka α-podjedinica posjeduje identično vezujuće mjesto za acetilholin; različita kompozicija ostale tri podjedinice u strukturi autonomnih ganglija i neuromuskularnih veza su razlogom zašto kompetitivni antagonisti, kao što je rokuronium, inhibiraju receptore na neuromuskularnim vezama, a nemaju efekta na ganglijske receptore. Ovo svojstvo se koristi u hirurgiji tokom operacija da bi se postigla mišićna relaksacija uz minimalne popratne efekte na autonomni nervni sistem. Svaka podjedinica receptora sadrži veliku ekstracelularnu N-terminalnu domenu, četiri heliksa unutar membrane (jedan od njih oblaže poru kompleksa) i internu petlju između trećeg i četvrtog heliksa koja formira intracelularnu domenu kanala. Promjer pore kada je kanal otvoren iznosi oko 3nm, a dijametar Na+ ili K+ jona iznosi oko 0,3nm ili manje. Na taj način, ligandom aktivirani jonski kanali ne posjeduju jonsku selektivnost koja je uočena u mnogih voltažom-aktiviranih kanala. Aktivacija nikotinskih acetilholinskih receptora uvijek rezultira prolaskom i Na+ i K+ jona. Myasthenia gravis je autoimuna bolest uzrokovana produkcijom autoantitijela usmjerenih protiv acetilholinskih receptora lociranih u skeletnoj muskulaturi. B i T limfociti kooperativno proizvode antitijela usmjerena protiv acetilholinskih receptora koja se, potom, vezuju na različite lokacije na receptoru, unakrsno ih povezuju i dovode do stvaranja multireceptor-antitijelo kompleksa. Kompleks se putem endocitoze unosi u lizozome i degradira. Glavni ekscitatorni transmiter na sinapsama u CNS je glutamat. Postoje tri tipa jonotropnih glutamat receptora (AMPA, NMDA i kainate) nazvanih prema ligandima koji ih selektivno aktiviraju. Njihova topologija je slična onoj kod nikotinskih acetilholinskih receptora: kanal je građen od pet podjedinica, organiziran u veliku ekstracelularnu regiju, poru i malu intracelularnu domenu. Aktivacija ovih kanala sa glutamatom značajno povećava provodljivost Na+ i K+ jona, što dovodi do depolarizacije. Više od jedne trećine sinapsi u mozgu su inhibitorne. Glavni inhibitorni transmiteri su glicin i γ-aminobuterna kiselina (GABA). Glicin i jonotropni GABAA receptori imaju sličnu topologiju sa glutamat i nikotinskim acetilholinskim receptorima: sa pet podjedinica (α, β, γ, δ, ρ), sa ligand-vezujućom domenom i heliksima koji formiraju poru. Aktivacija ovih receptora povećava protok Cl- jona, dovodeći do hiperpolarizacije stanične membrane i inhibicije njene ekscitabilnosti. GABAA receptori su mete za važne


13

sedative-hipnotike, kao što su benzodiazepini i barbiturati, a važni su i u biohemizmu djelovanja etanola i generalnih anestetika. Kanali sa tranzitornim receptorskim potencijalom (TRP kanali) TRP kanali čine superfamiliju jonskih kanala koji se ubikvitarno eksprimiraju i koji se međusobno razlikuju po svojoj strukturi. U čovjeka postoji 27 gena koji kodiraju za članove šest različitih TRP familija. TRP kanali sadrže šest transmembranskih segmenata i funkcionalne jonske kanale koji se sastoje od tetramernih kompleksa. Strukturalno slični TRP kanali mogu stvarati heterotetramere. TRP kanali su katjonski kanali, a kao heteromultimeri mogu posjedovati i jonsku selektivnost i aktivacijska svojstva. Intracelularna domena TRP kanala može uključivati: ankirin domene, protein kinaza domene, ADP-riboza pirofosfataza domene. Mada TRP receptori nisu mete za do sada poznate lijekove, postoji veliki interes za razvoj lijekova koji bi mijenjali funkciju ovih kanala, ponajviše zbog njihove uloge u različitim senzornim fenomenima kao što su bol, temperatura, osmolarnost, dodir, olfakcija, vid i sluh. S obzirom da u svojoj strukturi imaju multiple domene, ovi receptori bi mogli djelovati kao signalni integratori, a mogli bi biti aktivirani putem različitih biohemizama. Poznato je da mutacije u TRP receptorima uzrokuju više bolesti uključujući hipomagnezijemiju, hipokalcijemiju i različite bubrežne i neurodegenerativne bolesti. Receptori koji penetriraju plazma membranu i imaju unutarnju enzimatsku aktivnost (transmembranski enzimi i ne-enzimi) Stanice sisara eksprimiraju raznoliku grupu fizioloških receptora-transmembranskih enzima koji u svojoj strukturi imaju ekstracelularnu ligand-vezujuću domenu i intrinzičku enzimatsku aktivnost koja je locirana na citoplazmatskoj strani stanične membrane. Ovom tipu receptora pripadaju:

- receptori tirozin kinaze (RTK), kao što su epidermalni faktor rasta (EGF) i inzulinski receptori čije citoplazmatske domene pokazuju tirozin kinaznu aktivnost;

- tirozin kinaza-asocirani receptori bez enzimatske aktivnosti, kao što su receptori za γ-interferon, koji se povezuju sa citoplazmatskim Janus tirozin kinazama (JAK);


14

- receptori serin-treonin kinaze, kao što je TGF-β receptor; i - receptori koji posjeduju enzimatske aktivnosti drugačije od

kinaznih, kao što su receptori za natriuretske peptide, koji imaju citoplazmatsku aktivnost gvanilat ciklaze i proizvode solubilni drugi glasnik cGMP;

- u ovoj skupini su i receptori odgovorni za urođeni imunitet, nazvani TLR receptori (zvonu slični receptori, toll-like receptori); i receptori za faktore tumorske nekroze (TNF), s obzirom da imaju mnogo zajedničkih karakteristika sa JAK-STAT receptorima.

Receptori tirozin kinaze (RTK) U skupini receptora tirozin kinaza se nalaze:

- Receptori za hormone, kao što je inzulin; - Receptori za brojne faktore rasta kao što su:

EGF(epidermalni faktor rasta, epidermal growth factor), PDGF (faktor rasta koji potiče iz trombocita, plated derived growth factor), NGF (nervni faktor rasta, nerve growth factor), FGF (faktor rasta fibroblasta, fibroblaste growth factor), VEGF (vaskularni endotelijalni faktor rasta, vascular endothelial growth factor), i efrini.

Sa izuzetkom inzulinskog receptora, koji je građen od α i β lanaca, ove makromolekule se sastoje od jednog polipeptidnog lanca sa velikom cistein-bogatom ekstracelularnom domenom, sa kratkom transmembranskom domenom i sa intracelularnom regijom koja sadrži jednu ili dvije domene koje pokazuju tirozin kinaznu aktivnost. Aktivacija receptora faktora rasta vodi ka preživljavanju stanice, njenoj proliferaciji i diferencijaciji. Aktivacija efrin receptora rezultira neuronalnom angiogenezom, aksonalnom migracijom i navođenjem. Receptori za faktore rasta su u inaktivnom stanju monomerni. Vezivanje liganda inducira dimerizaciju receptora i autotransfosforilaciju njegovih kinaznih domena na brojnim ostacima tirozina. Fosforilacijom tirozinskih ostataka receptora, stvaraju se mjesta pristajanja (docking sites) za SH2 domene koje su u strukturi mnogih signalnih proteina. Postoji više od 100 proteina kodiranih od strane humanog genoma, a koji sadrže SH2 domene, i koji nakon aktivacije ovih receptora sudjeluju u stvaranju velikih signalnih kompleksa na njihovim citoplazmatskim regijama. Osim regrutacije enzima, fosfotirozin-prezentirajući proteini mogu privuči i SH2 sadržavajuće molekule koje imaju ulogu adaptera, a


15

takva molekula je Grb2(vezujući protein za receptor faktora rasta, growth factor receptor-binding protein), koja zauzvrat veže faktore izmjene gvanin nukleotida (GEF-guanine nucleotide exchange factors) kao što je Sos protein, koji potom aktivira mali G-protein nazvan Ras. Aktivacija proteina članova Ras familije vodi ka aktivaciji kaskade protein kinaza, nazvane putem mitogen-aktivirajuće protein kinaze (MAP kinaza kaskada ili MAPK put). Aktivacija MAPK puta je glavna ruta koju koriste faktori rasta u usmjeravanju signala u nukleus i posljedičnoj stimulaciji staničnog rasta.

Slika 1-4. A. Aktivacija EGF receptora. Ekstracelularna domena sadrži 4 domene koje mijenjaju konformaciju nakon vezivanja dva liganda. Adapter molekula Grb2 se veže na fosforilirane tirozinske ostatke i aktivira Ras-MAP kinaza kaskadu. B. Aktivacija citokin receptora. Vezivanjem citokina za receptor, dimerizacija receptora i regrutacija Janus Kinaza (JAKs); JAKs trans-fosforilacija; fosforilacija signalnih transdjusera STAT (signal transducers and activators of transcription -STATs) i translokacija u nukleus; regulacija transkripcije.Supresori citokin signalizacije (SOCS) inhibiraju JAK-STAT put. (Modificirano prema Brunton L, Chabner B, Knollman B (Eds.). Goodman&Gilman's the Pharmacological basis of Therapeutics, McGrawHill Medical, 2011)


16

Lijekovi koji djeluju na receptore iz ove velike i raznolike familije su: inzulin, koji se koristi u liječenju diabetes mellitus-a; i imatinib, mala molekula inhibitor protein kinaze, dizajnirana tako da može inhibirati i recepror i ne-receptor tirozin kinaze. Imatinib se primjenjuje u liječenju hroničnih mijelogenih leukemija i nekoliko solidnih tumora u kojih je nastupila disregulacija protein kinaza.

Receptori tirozin kinaze su građeni od četiri glavne domene:

- ekstracelularna ligand-vezujuća domena, - intracelularna tirozinkinaza domena, - intracelularna regulacijska domena i - transmembranska domena.

Aminokiselinska sekvenca intracelularnih tirozinkinaza domena je visoko konzervirana, dok se struktura ekstracelularne ligand-vezujuće domene odlikuje višim stepenom heterogenosti.

Na osnovu strukture različitih ekstracelularnih domena, RTKs se dijele na barem 14 različitih familija. Tabela 1-2. Karakteristike čestih klasa receptora tirozin kinaza (RTK).

KLASA PRIMJER STRUKTURALNE KARAKTERISTIKE

I EGF receptor, NEU/HER2, HER3 Cistein-bogate sekvence

II Inzulin-receptor, IGF-1 receptor

Cistein-bogate sekvence,heterotetrameri povezani S-S mostovima

III PDGF receptori, c-Kit Sadrže 5 imunoglobulinu sličnih domena i kinaza inserte

IV FGF receptori Sadrže 3 imunoglobulinu slične domene, kinaza inserte i kiselu domenu

V

Vaskularni endotelijalni faktor rasta receptor (VEGFR)

Sadrži 7 imunoglobulinu-sličnih domena i kinaza inserte

VI Hepatocitni faktor rasta (HGF)

Heterodimeri, jedna od dvije podjedinice je potpuno ekstracelularna. HGF je proto-onkogen identificiran kao Met onkogen

VII Neurotrofin receptor familija i NGF receptor

Ne sadrže cistein domene, NGF ima leucin-bogate domene

Nakon stimulacije sa specifičnim efektorom (faktor rasta, hormon), dešava se autofosforilacija domene tirozin kinaze, što omogućava interakciju sa drugim proteinima signalne kaskade koji sadrže tzv. SH2 i SH3 domene. SH2 domene (Src homologne domene 2) su domene čija aminokiselinska sekvenca je visoko homologna domenama prvi put identificiranim u c-Src protoonkogenu (celularna forma


17

protoonkogena prvi put identificirana u transformirajućem retrovirusu).

Interakcija RTK–SH2sadržavajući protein rezultira tirozin fosforilacijom SH2 proteina, čija se enzimatska aktivnost tada mijenja.

Neki SH2-sadržavajući proteini sa unutarnjom enzimatskom aktivnošću su: PLC-γ, rasGAP, PI-3K, protein fosfataza-1 C (PTP1C), članovi Src familije protein tirozin kinaza (PTKs). Ne-receptor protein tirozin kinaze (PTK; citosolni tip TK) Ovom tipu receptora pripadaju brojne intracelularne PTKs koje su odgovorne za fosforilaciju različitih intracelularnih proteina na njihovim tirozinskim ostacima nakon aktivacije signala rasta u stanici. Poznate su dvije različite familije PTKs:

‐ familija koja se odnosi na Src protein tj. tirozin kinazu koja je prvi put identificirana kao transformirajući protein u Rous sarkoma virusu (sadrže SH2 domene) i

‐ familija koja se odnosi na Janus kinazu (Jak). Većina proteina iz obje familije povezuje se na stanične membranske receptore koji nemaju enzimatsku aktivnost (npr. receptori citokina).

Receptori JAK-STAT puta Receptori JAK-STAT putasumembranski receptori koji nemaju unutarnju enzimatsku aktivnost, nego posjeduju intracelularne domene koje se mogu povezati sa odvojenim intracelularnim tirozin kinazama nazvanim Janus kinaze (JAK). S ovim tipom receptora reagiraju pojedini citokini (npr. γ-interferon), kao i neki hormoni (hormon rasta, prolaktin). Nakon dimerizacije receptora uzrokovane vezivanjem liganda, JAK kinaze fosforiliraju proteine nazvane STAT (signal transducers and activators of transcription-signalni transdjuseri i aktivatori transkripcije), koji se, potom, translociraju u nukleus i reguliraju proces transkripcije. Cijeli put transdukcije signala nazvan je JAK-STAT put. Receptori serin-treonin kinaze Određeni proteinski ligandi, poput TGF-β (transformirajući faktor rasta, transforming growth factor), aktiviraju familiju receptora

nazvastruktcitosoosnovnakonkinazndaljemregula Recep

TLR rmonohemaimunopolipeligandcitoplaenzimligandhemijsPretpotoplotneke bolest

Slika 1(http:// TNF-α Biohe(TNF-

anih recepuru sa re

olna domenvnom oblikun vezivanjanu domenum toku prijeatorni protei

ptori slični

receptori premerni transtopoetskim

om sistemeptidnog land-vezujuća azmatska r

matsku aktivdi su najčeskom smiostavlja senoga šoka endogene

tima.

1-5. TLR3 izo/en.wikipedia

α receptori

emizmi sign-α) su veo

TRANS

tori serin-teceptorima a pokazujeu ovi protea liganda, u (autofosfoenosa signin nazvan S

zvonu (TL

edstavljaju smembrans

stanicamau. Ovaj tnca u koje

domena, regija nazv

vnost. TLR ešće različitslu lipidi,

e da su e(HSP, heatligande s

oforma recepa.org/wiki/To

nalizacije uzoma slični

SDUKCIJA S

18

treonin kintirozin kin

aktivnost seini postoje

oni dimerorilacija) i nala aktivira

Smad.

LR receptor

familiju sa vki receptoria i igraju tip receptoemu su loc

mala travana TIR mogu vezati patogeni

lipopeptidndogeni akt shock prote smatra d

ptora bogata ll-like_recept

z pomoć faonima z

IGNALA - TE

naze, koji nazama, oserin-treonine u monomriziraju i fna taj načinani receptor

ri, Toll-like

više od des. Značajno ključnu ulo

ora je grairane velikansmembrandomena koti različite lproizvodi

di, virusi ktivatori fibteins) i DNKda sudjeluj

aminokiselintor)

aktora tuma TLR i

EMELJNI PR

imaju anaosim što nn kinaze. U

mernom obfosforiliraju n se aktivirr fosforilira

receptors)

set članova se eksprim

ogu u urođađen od ja ekstracelnska domoja ne poigande. Egzkoji mogu i neki lij

brinogen, pK domaćinaju u autoim

nom leucinom

orske nekruključuju

RINCIPI

alognu njihova

U svom liku, a

svoju raju. U

gen -

)

koji su miraju u đenom jednog lularna ena i kazuje zogeni biti u

jekovi. proteini a, a za munim

m.

roze α NF-κB


19

transkripcijske faktore.TNF-α je građen od jednog polipeptidnog lanca sa velikom ekstracelularnom ligand-vezujućom domenom, transmembranskom domenom i citoplazmatskom domenom koja ima enzimatsku aktivnost i koja se naziva domena smrti. TNF-α veže kompleks koji se sastoji od TNF-receptora1 i TNF-receptora2. Nakon trimerizacije, domena smrti se veže za adaptor protein TRADD, koji regrutira receptor interreagirajući protein 1 (RIP1) kako bi se formirao receptor-adaptor kompleks u staničnoj membrani. Zadnji događaji su translokacija p50/p65 heterodimer-kompleksa u nukleus i posljedična aktivacija transkripcije gena odgovornih za procese inflamacije. Kako još uvijek ne postoje lijekovi koji bi se ispriječili citoplazmatskim komponentama TNF-α signalnog puta, to se humanizirana monoklonalna antitijela na sam TNF-α primjenjuju u liječenju reumatoidnog artritisa i Crohn-ove bolesti (infiximab; adalimumab). Receptori za natriuretske peptide Klasa transmembranskih receptora sa unutarnjom enzimatskom aktivnošću čiji ligandi su tri mala peptida koji se stvaraju i oslobađaju u tkivu miokarda i vaskularnog sistema. To su:

- atrijalni natriuretski peptid (ANP; atrial natriuretic peptide), koji se oslobađa iz skladišnih granula atrija miokarda nakon ekspanzije intravaskularnog volumena ili nakon stimulacije sa presornim hormonima

- moždani natriuretski peptid (BNP, brain natriuretic peptide) koji se stvara i oslobađa iz ventrikula miokarda (uprkos svoga naziva) kao odgovor na povećanje volumena i dotoka krvi u miokard

- C-tip natriuretski peptid (CNP) koji se stvara u mozgu i endotelijalnim stanicama. Kao BNP, ni CNP nije uskladišten u granulama, nego se stvara i oslobađa pod uticajem faktora rasta i jakoga stresa na vaskularne endotelijalne stanice.

Glavni fiziološki efekti ovih hormona su: - sniženje krvnog pritiska (ANP, BNP) - redukcija srčane hipertrofije i fibroze (BNP) - stimulacija rasta dugih kostiju (CNP)


20

ANP, BNP i CNP su ligandi za transmembranske receptore-gvanilat ciklaze. Struktura ANP i BNP receptora je bolje proučena. Sastoje se od tri domene:

- ekstracelularna domena, koja se sastoji od oko 450 aminokiselina i koja stupa u interakciju sa ligandom

- transmembranska domena, koja je mala i sastoji se od 20 aminokiselina i

- velika intracelularna domena, koja se dalje sastoji od tri funkcionalne domene: kinaza domena, na kojoj se vrši fosforilacija serinskih ostataka, što je važno za aktivnost; dimerizacijska domena i C-terminalna domena sa aktivnošću gvanilat ciklaze. Defosforilacija serinskih ostataka vodi ka desenzitaciji receptora.

Slika 1-6. Struktura receptora koji posjeduju aktivnost gvanilat ciklaze. Dva tipa (izoenzima) gvanilat ciklaze proizvode c-GMP: receptori za natriuretske peptide i cisolni (solubilni) tip gvanilat ciklaze. (Modificirano prema David L. Nelson, Michael M. Cox, Lehninger. Principles of Biochemistry, Worth Publishers, New York, 2005) Lijek nesiritid (terapija kongestivne slabosti srca) je sintetički BNP agonist i koristi se u terapiji akutne dekompenzirane srčane slabosti. BNP receptor (NPR-B) je prisutan uglavnom u kostima, mozgu, srcu, plućima, jetri, bubrezima, glatkim mišićima krvnih sudova. Na njega se može vezati i CNP.


21

S obzirom da ne posjeduju enzimatsku aktivnost, CNP receptori najvjerovatnije djeluju kao „clearance“ receptori i uklanjaju višak natriuretskih peptida iz cirkulacije. Unutarstanični receptori Receptori locirani u unutrašnjosti stanice obuhvataju nuklearne receptore i intracelularne enzime. Nuklearni receptori Ovaj tip receptora je lociran u nukleusu stanice i odgovara na različite ligande. U toku prijenosa signala nastaju proteini koji su transkripcijski faktori i koji dalje reguliraju ekspresiju specifičnih gena uključenih u različite fiziološke procese kao što su reprodukcija, razvoj i metabolizam. Receptori za androgene, estrogene, tiroidne hormone i vitamin D su članovi ove velike familije i dobro su proučeni. U ovoj familiji su i receptori koji su bitni u indukciji enzima u metabolizmu lijekova kao što su receptori za retinoičnu kiselinu (RXR); jetreni X receptor (LXR), čiji ligand je 22-OH holesterol; farnezoil X receptor (FXR) čiji ligand je henodeoksiholna kiselina; peroksizom proliferator-aktivirani receptori (PPAR α, β i γ), 15-deoksi prostaglandinJ2 je jedan od mogućih liganada PPAR, a holesterol-snižavajuća vlakna se vežu i reguliraju PPARγ. Neki od ovih receptora se nalaze u citoplazmi stanice u neaktivnom stanju (npr. receptori za glukokortikoide), a nakon što se veže ligand, bivaju translocirani u nukleus. Drugi članovi ove familije (LXL i FXL receptori) se već nalaze u nukleusu i aktiviraju se nakon što nastanu promjene u koncentraciji određenih hidrofobnih lipidnih molekula. Vezivanje liganda inducira konformacijske promjene receptora, od kojih su najvažnije one u heliksu 12 ligand-vezujuće domene (LBD). Ove nastale konformacijske promjene utiču na vezivanje ko-regulacijskih proteina koji su esencijalni za aktivaciju receptor-DNK kompleksa (slika 1-7).


22

Slika 1-7. Aktivacija nuklearnih receptora. OR je nuklearni hormonski receptor, a u kompleksu je sa receptorom za retinoičnu kiselinu (RXR). Nakon što se vežu agonist i ko-aktivator, dešavaju se konformacijske promjene u LBD domeni i započinje transkripcija gena. Ukoliko se veže ko-represor, neće se dogoditi aktivacija. (Modificirano prema Brunton L, Chabner B, Knollman B (Eds.). Goodman&Gilman's the Pharmacological basis of Therapeutics, McGrawHill Medical, 2011) Da bi se vezali na DNK, većina nuklearnih receptora mora prijeći u stanje dimera, neki postaju homodimeri, a neki heterodimeri. Receptori za steroidne hormone su najčešće homodimeri, dok su oni za lipide heterodimeri sa RXR receptorom. Kada je riječ o biohemizmu djelovanja nuklearnih receptora, njihovo važno svojstvo je da moraju vezati svoj ligand, odgovarajući hormon odgovorni element (HRE) i ko-regulator da bi sudjelovali u regulaciji svojih ciljnih gena. Aktivnost nuklearnog hormonskog receptora u datom tkivu ne ovisi samo o ligandu, već i o odnosu između ko-aktivatora i ko-represora koji su regrutirani od strane kompleksa. Ko-aktivatori regrutiraju enzime koji se vežu za transkripcijski kompleks i koji modificiraju hromatin (npr. histon acetilaza). Ko-represori regrutiraju proteine koji drže DNK molekulu tijesno upakiranu i inhibiraju transkripciju (npr. histon deacetilaza). Ovisno o hemijskoj strukturi vezanog liganda, te o kombinaciji ko-aktivatora i ko-represora koji su regrutirani na kompleks, nuklearni receptori mogu različito regulirati svoje ciljne gene. Ovo njihovo svojstvo objašnjava sposobnost određenih lijekova da djeluju kao selektivni modulatori receptora i ekspresije gena. Takav primjer su tamoksifen i raloksifen koji se nazivaju selektivnim modulatorima estrogenskih receptora (SERM, selective estrogen receptor modulators). Tamoksifen i raloksifen su parcijalni agonisti estrogenskih receptora izazivajući unikatne konformacijske promjene na ligand-vezujućoj domeni nakon što se vežu. Ovisno o specifičnom tkivu, različite kombinacije ko-aktivatora i ko-represora se vežu na receptor-DNK kompleks, doprinoseći gen-selektivnim funkcijama. Npr. tamoksifen je antagonist u tkivu dojke jer regrutira


23

korepresore na transkripcijski kompleks, ali je agonist u endometriju jer regrutira ko-aktivatore.

Slika 1-8. Dva tipa receptora: na membranu vezani receptor (lijeva strana slike) i nuklearni receptor (desna strana slike). (Modificirano prema David L. Nelson, Michael M. Cox, Lehninger. Principles of Biochemistry, Worth Publishers, New York, 2005) Intracelularni (solubilni) tip gvanilat ciklaze Ovaj tip receptora ne pripada tipu transmembranskih enzima, budućije prisutan u citosolu određenih stanica. U hemijskom smislu pripada skupini hem-proteina, a u funkcionalnom smislu radi se o intracelularnom enzimu koji katalizira stvaranje cGMP iz GTP. Nastali cGMP se uključuje u dalje puteve signalizacije na isti način kao i cGMP nastao pod uticajem transmembranske gvanilat ciklaze. Nitrogen oksid (NO) se veže za solubilnu gvanilat ciklazu i stimulira je na proizvodnju cGMP. Endogeni NO se stvara u nekim tkivima ljudskog organizma u reakciji koju katalizira enzim NO sintaza (NOS). Postoje tri forme NOS:

- neuronalna NOS (nNOS ili NOS1), - endotelijalna NOS (eNOS ili NOS3) i


24

- inducibilna NOS (iNOS ili NOS2). Sve forme NOS se široko eksprimiraju u tijelu, ali je njihovo prisustvo značajno u kardio-vaskularnom sistemu (miociti, endotelijalne stanice, hematopoetske stanice, trombociti).

Slika 1-9. Reakcija stvaranja NO u ljudskom organizmu. (Modificirano prema David L. Nelson, Michael M. Cox, Lehninger Principles of Biochemistry, Worth Publishers, New York, 2005) NOS katalizira oksidaciju gvanidino nitrogena iz arginina stvarajući NO i citrulin. Enzim traži kofaktore tetrahidrobiopterin i kalmodulin. Sistem Ca2+/kalmodulin aktivira nNOs i eNOS forme enzima, dok je iNOS forma manje osjetljiva prema Ca2+ jonima. Solubilna gvanilat ciklaza je heterodimer i sastoji se od α i β podjedinice (vidi slika 2-10, poglavlje 2). Na N terminusu molekule je vezan protoporfirin-IX hem na koji se veže NO i pri njegovim veoma niskim koncentracijama (nM), povećavajući vmax gvanilat ciklaze i do 400 puta, što sve rezultira značajnim povećanjem nivoa cGMP u stanici. 1.3. G proteini Struktura G proteina G proteini su regulacijski proteini koji su sposobni da vezuju gvanin nukleotide (GTP, GDP). U svom inaktivnom obliku vezuju GDP, a u aktivnom GTP; posjeduju i GTP-aznu aktivnost.


25

S obzirom na svoju prostornu strukturu, postoje dva tipa G proteina:

- Heterotrimerni G-proteini i - Monomerni G-proteini (mali G-proteini).

Slika 1-10. Prostorna struktura heterotrimernog G proteina. Svaka od 3 podjedinice je označena različitom bojom. (Modificirano prema David L. Nelson, Michael M. Cox, Lehninger. Principles of Biochemistry, Worth Publishers, New York, 2005).

GCPR receptori su povezani sa familijom heterotrimernih GTP-vezujućih regulacijskih proteina. G proteini su signalni transdjuseri (prenosioci signala) koji prenose informaciju sa kompleksa receptor-agonist na efektorski protein. Efektori u GCPR signalizaciji su: enzimi adenilil ciklaza (AC), fosfolipaza C (PLC), cGMP fosfodiesteraza (PDE6) i membranski jonski kanali selektivni za Ca2+ i K+ jone. Heterotrimerni G proteini se sastoje od tri različite podjedinice, označene kao α, β i γ podjedinica. α subjedinica vezuje gvanin nukleotide i odgovorna je za specifično prepoznavanje i receptora i efektora, a asocirani βγ dimer pomaže u pravilnoj lokalizaciji G heterotrimera u membrani, pri čemu je prenilacija γ subjedinice od značaja. U bazalnom stanju receptor-heterotrimer kompleksa (na receptor nije vezanligand), α podjedinica sadrži vezan GDP, a α-GDP:βγ kompleks je vezan na receptor bez liganda.


26

Familija G proteina obuvata 23 α podjedinice (koje su produkt 17 gena), 7 β podjedinica i 12 γ podjedinica. α podjedinice se dijele na četiri familije: Gs, Gi, Gq i G12/13 i odgovorne su za vezivanje GPCR receptora za različite efektore. Gs α podjedinica aktivira adenilil ciklazu; Gi α podjedinica može inhibirati određene izoforme adenilil ciklaze; Gq α podjedinica aktivira sve forme fosfolipaze Cβ; G12/13 α podjedinica se vezuje na pojedine faktore izmjene gvanin nukleotida (GEFs: guanine nucleotide exchange factors), kao što je p115RhoGEF za male GTP-vezujuće proteine Rho i Rac. Signalna specifičnost za brojne moguće βγ kombinacije nije dovoljno jasna, ali se zna da su K+ kanali, Ca2+ kanali i PI-3 kinaza (PI3K) neki od efektora slobodnog βγ dimera. G protein aktivacija Nakonšto se veže agonist za GPCR receptor, dešava se konformacijska promjena receptora koja se, potom, prenosi iz njegovog ligand-vezujućeg džepa na drugu i treću intracelularnu petlju receptora koja je povezana sa G protein heterotrimerom. Ova nastala konformacijska promjena dovodi do zamjene vezanog GDP na α podjedinici sa GTP (GDP-GTP izmjena). Vezivanje GTP aktivira α podjedinicu i uzrokuje njeno odvajanje od βγ dimera i od samog receptora. Ujedno i α GTP podjedinica i βγ heterodimer postaju aktivne signalne molekule. Interakcija kompleksa agonist-GPCR sa G proteinom je prolazna: nakon aktivacije G proteina, receptor je slobodan i može interreagirati sa drugom molekulom G proteina. Ovisno o prirodi α podjedinice, njena aktivirana GTP-vezana forma vezuje se i regulira različite efektore kao što su adenilil ciklaza (preko Gs α), ili fosfolipaza Cβ (preko Gq α). I βγ podjedinica može regulirati mnoge efektore, uključujući jonske kanale i enzime kao što je PI3-K. G protein ostaje aktivan sve dok se ne hidrolizira GTP vezan na α podjedinici i prijeđe u GDP. Sama α podjedinica posjeduje slabu unutarnju sposobnost hidrolize GTP koja je modulirana od stane familije proteina nazvanih regulatori G protein signalizacije (RGSs: regulators of G protein signaling). RGS proteini značajno ubrzavaju hidrolizu GTP i veoma su atraktivni kao potencijalne mete za lijekove. Nakon što se dogodi hidroliza GTP u GDP, βγ podjedinica, receptor i α podjedinica se rekombiniraju i nastaje inaktivni receptor-G protein heterotrimer bazalni kompleks koji može biti reaktiviran nakon ponovnog vezivanja liganda (slika 1-11).


27

Cholera i pertussis toksini kataliziraju kovalentnu adiciju ADP-riboze na specifična mjesta na α- podjedinici Gs i Gi. Ova modifikacija inhibira GTP-aznu aktivnost α podjedinice. α podjedinice postaju ireverzibilni aktivatori adenilil ciklaze. Akumulacija cAMP u tankom crijevu dovodi do nekontrolirane sekrecije vode i Na+ (ozbiljna dijareja).

Slika 1-11. G protein ciklus. GEF=faktor izmjene gvanin nukleotida;GAP=GTP-aza aktivirajući protein. (Modificirano prema Mathews CK, Van Holde KE, Ahern KG. Biochemistry, Benjamin Cummings, San Francisco, 2000)


28

1.4. Drugi glasnici Drugi glasnici (second messengers) su molekule koje nastaju u stanici nakon što glasnička (signalna) molekula (prvi glasnik, ligand) ostvari kontakt sa svojim specifičnim receptorom. Ovako aktivirani receptor dalje modulira aktivnost specifičnog enzima koji katalizira nastajanje drugog glasnika. Drugi glasnici sudjeluju u putevima transdukcije signala u stanici. Ciklični AMP (cAMP) cAMP je drugi glasnik koji se sintetizira pod djelovanjem enzima adenilil ciklaze (adenilat ciklaze, AC), a koja je pod kontrolom mnogih GPCR receptora: stimulacija je posredovana sa Gs α podjedinicom, a inhibicija sa Gi α subjedinicom. cAMP put je veoma dobra osnova za razumijevanje arhitekture i regulacije signalnih sistema u kojima učestvuju drugi glasnici. Postoji devet izoformi adenilil ciklaze koje su vezane za membranu i jedna njena solubilna forma u sisara. Izoforme AC koje su vezane za membranu su glikoproteini od oko 120 kDa sa izraženom homologijom u aminokiselinskoj sekvenciji: mala citoplazmatska domena; dvije hidrofobne transmembranske domene, svaka sa šest heliksa koji prožimaju membranu; i dvije velike citoplazmatske domene. Na membranu vezane AC pokazuju osnovnu enzimatsku aktivnost koja može biti modulirana nakon što se na AC veže GTP-α podjedinica Gs ili Gi proteina. Moguće su i brojne druge interakcije, pa su izoforme AC katalogizirane na osnovu njihove strukturne homologije i na osnovu različitih regulacijskih mehanizama kojima podliježu (djelovanje α i βγ podjedinica, Ca2+joni, protein kinaza, diterpen forskolin). cAMP ima tri glavna cilja u mnogim stanicama:

- cAMP ovisna protein kinaza (PKA), - cAMP regulirani faktori izmjene gvanin nukleotida označeni

kao EPACs (exchange factors directly activated by cAMP) i - transkripcijski faktor označen kao CREB (cAMP response

element binding protein), čija aktivnost se modulira pod djelovanjem PKA fosforilacije.

U stanicama sa specijaliziranim funkcijama, cAMP može imati i dodatne mete kao što su jonski kanali čije otvaranje i zatvaranje

regulicikličnMRP5 PKA jdvije regulakomppodjedAktivirčetiri mdvije promjC poSloboserinssupstr

Slika 1

Slika prema

raju cikličnnih nukleoti5) za koje je

je najbolje pkatalitičke

acijski podjleks (R2C2)dinice inhibranjem AC,molekule cAvežu za ene R podjodjedinicam

odne C poskih i treonrata.

1-12. Hemijs

1-13. Biohema www.biocar

TRANS

i nukleotidida (PDEs)

e cAMP sup

proučena mpodjedinicejedinični d). Pri niskimbiraju C po povećava AMP vežu zsvaku R pedinica, što

ma. Ovaj odjedinice inskih osta

ka struktura

mizam aktivrta.)

SDUKCIJA S

29

, fosfodiesti nekoliko

pstrat.

meta za cAMe (C) koje imer (R) fm koncentrodjedinice, se koncentza R2C2 kompodjedinicuo značajno s

proces psu aktivne

ataka u stru

3'5'-cAMP i

acije PKA u

IGNALA - TE

teraze reguABC trans

MP. Holoensu reverz

formirajući racijama cApa je holo

tracija cAMmpleks na t uzrokujućsnižava njihredstavlja e i katalizukturi speci

3'5'-cGMP.

uz pomoć cA

EMELJNI PR

ulirane uz psportera (M

nzim se sasibilno vezaheterotetra

AMP u stanoenzim inaP u stanici,taj način daći konformahov afinitet

aktivaciju ziraju fosfoifičnih prote

AMP. (Modif

RINCIPI

pomoć MRP4 i

stoji od ane za amerni nici, R ktivan. pa se

a se po acijske prema PKA.

rilaciju einskih

ficirano


30

PKA Postoji više izoformi PKA. Metodom molekularnog kloniranja otkrivene su α i β izoforme obiju R podjedinica (RI i RII), kao i tri izoforme C podjedinica: Cα, Cβ i Cγ. Izoforme R podjedinica pokazuju različitu subcelularnu lokalizaciju i različit afinitet prema cAMP, što dovodi do postojanja holoenzima PKA sa različitom aktivošću. I R i C podjedinice stupaju u interakciju i sa drugim proteinima unutar stanice, naročito R podjedinice, i ove interakcije mogu biti izoformno-specifične. Npr. RII se koncentrira u blizini svojih supstrata putem interakcija sa različitim A kinaza proteinskim sidrima (AKAPs: A kinase anchoring proteins). PKA može fosforilirati različite fiziološke mete kao što su metabolički enzimi; transportni proteini; brojni regulacijski proteini kao što su druge protein kinaze, jonski kanali i transkripcijski faktori. Npr., fosforilacija CREB proteina na serinu 133, vodi ka regrutaciji CREB-vezujućeg proteina (CBP), histon acetiltransferaze koja stupa u interakciju sa RNK polimerazom II i dovodi do transkripcije oko 105 gena koji u svojoj promotorskoj regiji imaju CRE motiv (motiv cAMP odgovornog elementa). Produkti ovih gena su npr. tirozin hidroksilaza, acetilholinski receptor, angiotenzinogen, inzulin, glukokortikoidni receptor, iNOS itd. Faktori izmjene gvanin nukleotida Faktori izmjene gvanin nukleotida (GEFs: guanine exchange factors) sudjeluju u regulaciji aktivnosti malih GTP-vezujućih proteina u stanici, a koji su zapravo monomerne GTP-aze. Ove male GTP-aze su ključni regulatori stanične funkcije koji djeluju po principu binarnih prekidača (skretnica) koji egzistiraju u GTP- i GDP-vezanim konformacijama. One integriraju ekstracelularne signale, koji dolaze sa membranskih receptora, sa promjenama citoskeleta i sa aktivacijom različitih signalnih puteva, i na taj način sudjeluju u regulaciji staničnih procesa kao što su fagocitoza, progresija staničnog ciklusa, stanična adhezija, genska ekspresija i apoptoza. GEF faktori djeluju na taj način da se vezuju za GDP-vezane GTP-aze i kataliziraju izmjenu GDP sa GTP. cAMP sudjeluje u regulaciji pojedinih GEF. Takav primjer su faktori EPAC-1 i EPAC-2 (exchange proteins activated by cAMP: proteini izmjene aktivirani pomoću cAMP). EPAC-1 i EPAC-2 aktiviraju Rap1 i Rap2 proteine koji su GTP-vezujući proteini i pripadaju Ras familiji malih GTP-aza. EPAC put obezbjeđuje dodatni efektorski sistem za cAMP


31

signalizaciju i za djelovanje lijekova koji mogu djelovati neovisno od PKA ili kooperativno sa njom. Ciklični GMP (cGMP) kao drugi glasnik Dva tipa (izoenzima) gvanilil ciklaze (gvanilat ciklaze) proizvode c-GMP:

- Receptori za natriuretske peptide, a koji posjeduju unutarnju enzimatsku aktivnost i

- Intracelularna gvanilat ciklaza (solubilni tip). Atrijalni natriuretski faktor (ANF) i bakterijski endotoksin su ekstracelularni ligandi za prvi tip receptora, a NO se vezuje za solubilni intracelularni tip receptora – gvanilat ciklaze. cGMP nastao pod uticajem membranske gvanilil ciklaze mijenja aktivnost protein kinaze G (PKG). Protein kinaza G (PKG) je građena od katalitičkih i regulacijskih podjedinica. NO se sintetizira iz arginina, uz katalitičko djelovanje NO sintaze (Ca-ovisna multifunkcionalna oksidaza) (slika 1-9). Ovako stvoreni c-GMP stimulira jonske pumpe koje održavaju niske koncentracije jona Ca2+ u stanici, što rezultira relaksacijom srčanog mišića (biohemijska osnova djelovanja nitroglicerina kao koronarnog vazodilatatora).

PKG je cGMP-ovisna protein kinaza koja fosforilira neke od supstrata specifičnih za PKA, a i njoj specifične supstarte. Porast intracelularne koncentracije cGMP, što nastaje kao rezultat stimulacije specifičnih receptora u stanici, dovodi do aktivacije PKG. U nekim tkivima PKG može biti aktivirana i od strane cAMP. Katalitička domena PKG i domene koje vezuju ciklične nukleotide najprije se eksprimiraju kao jedan polipeptidni lanac koji, potom, dimerizira i formira PKG holoenzim. PKG postoji u dvije homologne forme: PKG-I i PKG-II. PKG-I ima acetilirani N-terminus, nalazi se u citoplazmi i ima dvije izoforme: Iα i Iβ, koje nastaju usljed alternativnog „splicing“-a. PKG-II ima miristilirani N-terminus, vezana je za staničnu membranu uz pomoć PKG-proteina sidra, slično kao PKA, mada su dok domene (pristaništa) PKA i PKG strukturalno veoma različite. Modulacija aktivacije trombocita i relaksacija glatkih mišića su farmakološki važni efekti povišene intracelularne koncentracije cGMP.


32

Fosfodiesteraze regulirane uz pomoć cikličnih nukleotida (PDEs) PDE su enzimi koji kataliziraju hidrolizu ciklične 3'5'-fosfodiestarske veze u strukturi i cAMP i cGMP i na taj način završavaju njihovo djelovanje u stanici. Radi se o važnim signalnim proteinima čija aktivnost može biti regulirana na nivou transkripcije gena, ili pomoću drugih glasnika (ciklični nukleotidi ili joni Ca2+), ili putem interakcije sa drugim signalnim proteinima kao što su β-arestin i protein kinaze. Superfamilija PDE obuhvata više od 50 različitih PDE proteina koji se na osnovu aminokiselinske sekvencije, supstratne specifičnosti, farmakoloških svojstava i alosteričke regulacije dalje dijele na 11 subfamilija. PDE pokazuju konzerviranu katalitičku domenu na C-terminusu, kao i regulacijske domene i domene-mete koje lokaliziraju dati PDE enzim u specifični celularni odjeljak. Supstratna specifičnost različitih PDE uključuje one koje djeluju na cAMP, na cGMP i one koje hidroliziraju oba nukleotida. Pojedine PDE, naročito PDE3, su mete za lijekove koji se koriste u tretmanu astme, nekih kardiovaskularnih bolesti (slabost srca, aterosklerotična koronarna bolest, periferna arterijska bolest) i nekih neuroloških bolesti. PDE5 inhibitori (npr. sildenafil) se koriste u liječenju hronične opstriktivne plućne bolesti i erektilne disfunkcije. Putem inhibicije PDE5, ovi lijekovi povećavaju intracelularnu koncentraciju cGMP u glatkim mišićima corpus caverosum-a i na taj način povećvaju relaksaciju i poboljšavaju kapacitet udisaja. Ostali drugi glasnici: Ca2+joni, inozitol-1,4,5-trisfosfat (IP3) i diacilglicerol (DAG) Joni kalcija (Ca2+) Kalcijum je važan stanični glasnik i može učestvovati u različtim odgovorima kao što su genska ekspresija, kontrakcija, sekrecija, metabolizam i električna aktivnost. Ca2+ joni mogu uću u stanicu kroz Ca2+ kanale locirane u plazma membrani, ili mogu biti oslobođeni iz svojih intracelularnih skladišta pod uticajem hormona i faktora rasta. S obzirom na njegovu važnu ulogu kao glasnika, bazalni intracelularni nivoi Ca2+ jona se održavaju u uskim granicama (100 nM) zahvaljujući djelovanju membranskih Ca2+ pumpi koje izbacuju Ca2+ izvan stanice, i specifične Ca2+-ATPaze


33

(SERCA) koja se nalazi u membrani edoplazmatskog (ER) i sarkoplazmatskog retikuluma (SR) i koja akumulira Ca2+ jone u njegovim skladištima u stanici (endoplazmatski retikulum, ER i sarkoplazmatski retikulum, SR). Hormoni i faktori rasta oslobađaju Ca2+ jone iz njegovih intracelularnih depoa, ER i SR, preko signalnog puta koji započinje aktivacijom enzima fosfolipaze C (PLC). PLC je smještena u plazma membrani gdje postoje njene dvije primarne forme: PLCβ i PLCγ. GPCR receptori povezani sa Gq ili sa Gi aktiviraju PLCβ. Nastale i Gq-GTP αpopodjedinica i βγ dimer mogu aktivirati određene izoforme enzima PLCβ. PLCγ izoforme bivaju aktivirane pomoću tirozin fosforilacije, uključujući i receptor i ne-receptor tirozin kinaze. Npr. receptori za faktore rasta, kao što je receptor za epidermalni faktor rasta (EGFR: epidermal growth factor receptor), pripadaju receptorima tirozin kinazama (RTK), na kojima se dešava proces autotransfosforilacije nakon što se veže faktor rasta. Na taj način, na citoplazmatskoj domeni RTK nastaje fosfotirozin koji postaje vezujuće mjesto za signalne proteine koji sadržavaju u svojoj strukturi tzv. SH2 domene (Src homologne), a takva je i PLCγ. Nakon vezivanja preko svoje SH2 domene za RTK, PLCγ biva fosforilirana i aktivirana od strane RTK. PLC su citosolni enzimi koji bivaju translocirani u plazma membranu nakon stimulacije specifičnog receptora. Nakon svoje aktivacije, PLC hidrolizira mali membranski fosfolipid, fosfatidilinozitol-4,5-bisfosfat (PIP2), pa nastaju dva intracelularna druga glasnika (signala): inozitol-1,4,5-trisfosfat (IP3) i lipid diacilglicerol (DAG). Oba nastala druga glasnika se dalje uključuju u prijenos signala putem aktiviranja odgovarajućih familija protein kinaza. DAG direktno aktivira članove familije protein kinaze C (PKC). IP3 difundira u ER gdje aktivira IP3 receptore u ER membrani, uzrokujući oslobađanje Ca2+ iz ER u citosol. U samo nekoliko sekundi se višestruko povećavaju nivoi Ca2+ u citoplazmi, što dalje aktivira kalmodulin-senzitivne enzime kao što su cAMP, PDE i familija Ca2+/kalmodulin-senzitivnih protein kinaza (npr. fosforilaza kinaza, kinaza lahkih lanaca miozina, i CaM kinaze II i IV). Ovisno o tipu stanice i njenoj diferenciranoj funkciji, Ca2+/kalmodulin kinaze i PKC mogu regulirati mnoštvo daljih događaja u aktiviranoj stanici. Npr. oslobađeni simpatički transmiter noradrenalin na vaskularne glatke mišiće stimulirat će α adrenergičke receptore u njima, što će dovesti do aktivacije Gq-PLC-IP3 puta, okidajući oslobađanje jona Ca2+ i dovodeći do


34

kontrakcije pomoću stimulacije Ca2+/kalmodulin-senzitivne kinaze lahkih lanaca miozina koja će, opet, fosforilirati regulacijsku podjedinicu kontraktilnog proteina miozina. IP3 stimulira oslobađanje jona Ca2+ iz ER, ali i njegovo ponovno vraćanje u ER, a što je regulirano putem Ca2+ kanala. IP3 receptori su specifični Ca2+ jonski kanali smješteni u membrani ER i regulirani od stane posebnog liganda. To je veliki protein od oko 2700 aminokiselina, sa tri glavne domene: N-terminalna regija sadrži IP3-vezujuće mjesto; srednja regija sadrži regulacijsku domenu koja može biti fosforilirana od strane brojnih protein kinaza, uključujući PKA i PKG; C-terminalna regija sadrži šest transmembranskih heliksa koji formiraju Ca2+ pore. Funkcionalni kanal se sastoji od četiri podjedinice aranžirane kao tetramer. IP3 stimulita fluks Ca2+ jona, a IP3 kanal je reguliran od strane Ca2+ jona i aktiviranih enzima PKA i PKG. Intracelularne koncentracije Ca2+ jona u opsegu 100-300 nM povećavaju oslobađanje Ca2+ jona iz njegovih staničnih depoa, dok koncentracije od oko 1 μM inhibiraju njihovo oslobađanje. Fosforilacija IP3 receptora pomoću PKA povećava oslobađanje Ca2+ jona, dok fosfoliracija akcesornog proteina IRAG pomoću PKG inhibira oslobađanje Ca2+ jona. U glatkim mišićima ovakav efekat PKG predstavlja dio biohemizma pomoću kojega cGMP relaksira tonus krvnih sudova. U skeletnim mišićima i u miokardu oslobađanje Ca2+ jona iz njihovih intracelularnih depoa (SR) odigrava se u okviru procesa koji se naziva Ca2+-inducirano oslobađanje Ca2+ jona i prvenstveno je posredovano pomoću rianodin receptora (RyR: ryanodine receptor): Ca2+ joni ulaze u miocit kroz L-tip Ca2+ kanala uzrokujući konformacijske promjene na RyR, što inducira oslobađanje velike količine Ca2+ jona u sarkoplazmu. U grupi lijekova koji aktiviraju RyR je kofein, a u grupi koja inhibira RyR je lijek dantrolen. Ca2+ joni koji su oslobođeni u citoplazmu iz ER brzo se povlače i izbacuju iz stanice pomoću Ca2+ pumpi lociranih u plazma membrani, a ER „pool“ Ca2+ jona se ponovno puni sa ekstracelularnim Ca2+ jonima koji sada protiču kroz posebne Ca2+ kanale u plazma membrani (SOC kanali: store-operated Ca2+ channels). Ova strujanja su označena kao Icrac (Ca2+ release/activated currents). Pražnjenje ER depoa Ca2+ jona otvara SOC kanale u plazma membrani, a u datom mehanizmu sudjeluju i dva proteina: sam kanal, nazvan kao Orai1, i ER senzor nazvan STIM1. Orai1 kanal je 33-kDa protein sa četiri transmembranska heliksa i veoma je selektivan za Ca2+ jone. Smatra se da C-terminalna domena stupa u interakciju sa STIM 1 proteinom-senzorom. STIM1 je 77 kDa protein koji na N-terminusu sadrži Ca2+senzor domenu nazvanu EF ruka. Dijelovi transmembranske domene STIM1 proteina posjeduju strukture koje interreagiraju sa

Orai1 raspodepoaplazmklusteponov

Slika 1

kanalom. ređen na E

a rezultira dma membraere (nakupinvno puneći d

1-14. Hidroliz

TRANS

U stanju mR membrandimerizacijo

ani gdje STna, svežanjdepoe Ca2+

za PIP2 pod d

SDUKCIJA S

35

mirovanja Sni. Oslobađom STIM1 TIM1 i Ora, blok), otv

+ u ER.

djelovanjem

IGNALA - TE

STIM1 protanje Ca2+ joi njihovim ai1 interreaarajući Ca2

enzima PLC

EMELJNI PR

tein je unifona iz njihovkretanjem

agiraju i st2+ pore na O

C.

RINCIPI

formno vih ER prema tvaraju Orai1 i


36

BIOHEMIZMI PRIJENOSA SIGNALA U STANICI

37

POGLAVLJE 2

2. Biohemizmi prijenosa signala u stanici

2.1. G-protein signalizacija 2.2. Signalizacija uz pomoć receptora sa

enzimatskom aktivnošću 2.3. Signalizacija uz pomoć unutarstaničnih

receptora


38

2. Biohemizmi prijenosa signala u stanici 2.1. G-protein signalizacija G-protein signalizacija: glavni koraci Glavni koraci u signalnom putu u kojemu sudjeluju G regulacijski proteini su:

- Vezivanje ekstracelularnog agonista na GPCR receptor: konformacijska promjena receptora stimulira ga na interakciju sa susjednom molekulom G-proteina

- Izmjena GDP sa GTP: klasa proteinskih faktora nazvanih faktori izmjene gvaninskih nukleotida (GEF) pomažu u ovoj izmjeni

- Aktivirani G protein: aktivirani G protein mijenja aktivnost odgovarajućeg membranskog enzima (npr. adenilil ciklaze), koji predstavlja efektorski protein i kao rezultat stvara se drugi glasnik

- Fosforilacija ciljnog proteina (najčešće je to enzim) - Stimulacija ili inhibicija metaboličkih reakcija

U odsustvu liganda, receptor i G heterotrimerni protein stvaraju kompleks u membrani pri čemu je njegova Gα podjedinica vezana sa molekulom GDP. Nakon vezivanja liganda, nastaju konformacijske promjene u strukturi receptora i Gα podjedinice, što dovodi do oslobađanja GDP, a vezanja GTP na α podjedinicu i nakon toga, disocijacije kompleksa. Aktivirana α podjedinicu (vezana sa GTP) i βγ dimer se, potom, vezuju na odgovarajuće efektore i reguliraju njihovu aktivnost. Sistem se vraća u bazalno stanje nakon hidrolize GTP na α podjedinici, a ova reakcija je stimulirana od strane GAP proteina (GTP-aza aktivirajući proteini). Prolongirana stimulacija receptora može dovesti do inhibicije receptora („down regulation“, nizvodna regulacija). Ovaj događaj započinje djelovanjem G protein receptor kinaza (GRK) koje fosforiliraju C terminus receptora, što regrutira proteine nazvane arestini. Arestini se vežu na citosolnu stranu receptora, uklanjaju GTP i inhibiraju dalju signalizaciju.


39

Slika 2-1. A. Stimulacija GPCR receptora sa ligandom. B. Glavni koraci u toku G signalizacije. (Modificirano prema Brunton L, Chabner B, Knollman B (Eds.). Goodman&Gilman's the Pharmacological basis of Therapeutics, McGrawHillMedical, 2011) G signalizacija: cAMP kao drugi glasnik

Enzim adenilil ciklaza (adenilat ciklaza, AC) je efektorska molekula u G protein signalizaciji. Smještena je na citosolnoj strani stanične membrane ciljnoga tkiva.

Aktivirani G protein (α podjedinica na koju je vezana molekula GTP) stimulira aktivnost AC, koja, potom, djeluje na svoj supstrat-ATP u citoplazmi i prevodi da u 3'5'-cAMP, a u reakciji nastaje i PP (pirofosfat).

Ovakosignalaktivasupstrnpr. tr

Konačbiohepromj

Slika 2http://b

o nastali clizacije. cA

ator) proteinrat (najčešćranskripcijsk

čni rezultat mizam je ena aktivno

2-2. cAMP kabiocarta.com

BIOH

cAMP djeluMP se ponn kinaze A će enzim, aki faktor) i m

je promjenkovalentna

osti određen

ao drugi glasm)

HEMIZMI PR

40

uje kao drnaša kao a

(PKA). Akali i neki dmijenja njeg

na aktivnosta modifikacnog gena.

snik u G sign

IJENOSA SI

rugi glasnikalosterički ektivirana PKrugi fiziološ

govu aktivno

ti datog procija određe

alizaciji. (Mo

GNALA U S

k u daljemefektor (naj

KA fosforilirški aktivni post.

oteina, a naenog prote

odificirano pre

TANICI

m toku jčešće

ra svoj protein

ajčešći eina ili

ema .


41

G signalizacija: Inozitol 1,4,5-trisfosfat (InsP3) i diacilglicerol (DAG) kao drugi glasnici

Slika 2-3. Glavni koraci u toku G signalizacije u kojoj sudjeluju IP3 i DAG kao drugi glasnici. (Modificirano prema Mathews CK, Van Holde KE, Ahern KG. Biochemistry, Benjamin Cummings, San Francisco, 2000) Glavni koraci u toku G signalizacije u kojoj učestvuju inozitol 1,4,5-trisfosfat (InsP3 i IP3) i diacilglicerol (DAG) kao drugi glasnici su:

- Vezivanje agonista (liganda) na membranski receptor koji pripada GPCR tipu

- Aktivacija G-proteina (GDP/GTP izmjena) - Aktivirana α podjedinica aktivira svoga efektora: fosfolipazu

C (PLC) u plazma membrani - PLC stimulira cijepanje membranskog fosfolipida

fosfatidilinozitol 4,5-bisfosfata (PIP2) i nastajanje InsP3 i DAG, koji se ponašaju kao drugi glasnici

- InsP3 stimulira oslobadjanje Ca2+ jona iz endoplazmatskog retikuluma, štoima različite efekte na intermedijerni metabolizam

- DAG stimulita membranski enzim protein kinazu C (PKC) povećavajući njegov afinitet prema jonima Ca2+


42

- PKC fosforilira specifične serinske i treoninske ostatke u ciljnim proteinima

- Konverzija InsP3 u inozitol: u tri uzastopna hidrolitička koraka InsP3 se vraća u inozitol, koji se reinkorporira u fosfatidilinozitol. Joni litijuma su specifični inhibitori hidrolize inozitol monofosfata u inozitol, dovodeći do značajnog sniženja koncentracije inozitola (molekularni biohemizam djelovanja litija u liječenju manično-depresivnog poremećaja budući je fosfoinozitid sistem aktivan u CNS)

2.2. Signalizacija uz pomoć receptora sa

enzimatskom aktivnošću Receptori koji sudjeluju u ovim putevima prijenosa signala smješteni su u staničnoj membrani i posjeduju intrinzičku enzimatsku aktivnost ili su, pak, povezani putem svoje intracelularne domene sa određenim enzimom koji se nalazi u unutrašnjosti stanice. Ovaj tip receptora se još nazivaju i receptori transmembranski enzimi i receptori transmembranski ne-enzimi. Inzulinski receptori u staničnoj signalizaciji Inzulinski receptori pripadaju receptorima tirozin kinazama. To su transmembranski receptori čija unutarstanična domena (citosolna domena) posjeduje aktivnost enzima tirozin kinaze. Inzulinski receptori su u strukturalnom smislu glikoproteini sa α2β2 tetramernom strukturom, koja se stabilizira disulfidnim vezama.α-lanac ne prožima membranu i vezuje inzulin blizu svoga C-terminusa.β-lanac ima transmembransku domenu sa C-terminusom unutar stanice. C-terminalna regija β-lanca je mjesto aktivnosti tirozin kinaze, koja je stimulirana vezivanjem inzulina na ekstracelularni dio receptora. Kinazna aktivnost inzulinskog receptora je esencijalna za njegovu biološku aktivnost.


43

Slika 2-3. Prostorna struktura inzulinskih receptora i biohemizam njihovog djelovanja. Nakon stimulacije inzulinom, dešava se aktivacija receptora mehanizmom autotransfosforilacije. (Modificirano prema David L. Nelson, Michael M. Cox, Lehninger. Principles of Biochemistry, Worth Publishers, New York, 2005) Glavni koraci u toku signalizacije uz pomoć inzulinskih receptora: brzi učinci inzulina Brzi učinci inzulina se ostvaruju preko drugog glasnika, a dolazi do promjene aktivnosti specifičnog enzima po principu fosforilacije i defosforilacije. Najvažniji brzi učinci inzulina su: translokacija GLUT4 transportera u perifernim tkivima i biosinteza glikogena. Glavni koraci inzulin-receptor signalizacije u nastajanju brzih efekata inzulina su:

- Nakon stimulacije inzulin receptora, dešava se autotransfosforilacija i aktivacija tirozin-kinazne domene koja se, potom, povezuje sa proteinom nazvanim IRS-1(inzulin-receptor supstrat 1)


44

- IRS-1 sadrži više motiva koji se mogu povezivati sa SH2 domenama (Src homologne domene 2) katalitički aktivnih proteina unutar stanice

- Nakon fosforilacije IRS-1 od strane inzulinskih receptora, aktivirani IRS-1 aktivira enzim fosfatidilinozitol-3 kinazu (PI-3K) vezujući se na njenu SH2 domenu

- PI-3K konvertira fosfatidilinozitol bisfosfat (PIP2) u fosfatidilinozitol trisfosfat (PIP3)

- PIP3 se vezuje na enzim protein kinazu B (PKB) i sudjeluje u njenoj aktivaciji (fosforilacija PKB)

- Aktivirana PKB katalizira fosforilaciju enzima kinaza glikogen sintaze 3 (GSK3) na njenim serinskim ostacima, što rezultira inaktivacijom GSK3

- Inaktivirana GSK3 ne može katalizirati reakciju fosforilacije enzima glikogen sintaze (GS) i njeno prevođenje u inaktivni oblik, pa GS ostaje aktivna i katalizira biosintezu glikogena u ciljnim stanicama

- Aktivirana PKB vjerovatno sudjeluje i u translokaciji unutarstaničnih receptora za glukozu - GLUT4 koji se na taj način premještaju u staničnu membranu, što značajno doprinosi ulasku glukoze u ciljna tkiva (periferna tkiva).

Slika 2-4. Glavni koraci u toku signalizacije uz pomoć inzulinskih receptora: brzi učinci inzulina. (Modificirano prema David L. Nelson, Michael M. Cox, Lehninger. Principles of Biochemistry, Worth Publishers, New York, 2005)


45

Glavni koraci u toku signalizacije uz pomoć inzulinskih receptora: spori učinci inzulina Identificiran je i drugi adapterski protein koji sudjeluje u transdukciji signala uz pomoć inzulinskih receptora. To je Grb2 protein (growth factor receptor-binding protein). Njegova uloga je veoma važna u nastajanju tzv. sporih učinaka inzulina. Spori učinci inzulina nastaju usljed stimulacije ekspresije određenih gena, a što za posljedicu ima biosintezu specifičnog proteina.

Slika 2-5. Glavni koraci u toku signalizacije uz pomoć inzulinskih receptora: spori učinci inzulina. (Modificirano prema David L. Nelson, Michael M. Cox, Lehninger. Principles of Biochemistry, Worth Publishers, New York, 2005) Konačni rezultat jeste biosinteza određenog fiziološki aktivnog proteina (enzim, transkripcijski faktor) i/ili promjena u ukupnoj


46

količini datog proteina, što sve za posljedicu ima promjenu u metabolizmu ciljne stanice. Spori učinci inzulina nastaju za nekoliko sati (za razliku od brzih koji nastaju u dijelovima sekunde, a ogledaju se u promjeni aktivnosti specifičnog proteina), a ovo vrijeme je potrebno kako bi se izvršila biosinteza specifičnog proteina. Najčešće se radi o biosintezi određenih enzima koji se, potom, uključuju u određene metaboličke puteve. Npr., rezultat sporih učinaka inzulina u jetri je stimulacija biosinteze nekih glikolitičkih enzima. Spori učinci inzulina se ostvaruju na nivou jedra, pri čemu dolazi do fosforilacije specifičnih transkripcijskih faktora, što dalje rezultira promjenama u ekspresiji gena i/ili replikaciji DNK molekule. Najvažniji koraci u inzulin-receptor signalizaciji i nastajanju sporih učinaka inzulina su:

- Specifično vezivanje inzulina za svoje receptore u ciljnom

tkivu, što dovodi do autotransfosforilacije i na taj način aktivacije inzulinskog receptora

- Fosforilacija IRS-1 adapterske molekule na njenim tirozinskim ostacima

- Vezivanje SH2 domene Grb2 molekule na fosfotirozin IRS-1 molekule, što dalje omogućava vezivanje specifičnog protein, nazvanog Sos, na Grb molekulu

- Sos je, zapravo, faktor izmjene gvanin nukleotida, i sudjeluje u aktivaciji specifičnog proteina označenog kao Ras protein na taj način što uzrokuje oslobađanje GDP, a vezanje GTP na Ras protein (izmjena gvanin nukleotida). Ras protein (rat sarcoma protein) je mali monomerni G regulacijski protein koji ima centralnu regulacijsku ulogu u signalizaciji uz pomoć inzulinskih receptora i receptora za faktore rasta, a povezuje tirozinsku fosforilaciju sa serin-treonin fosforilacijom

- Aktivirani Ras protein dalje u toku signalizacije aktivira kaskadu serin-treonin fosforilacija nazvanu MAPK kaskada (kaskada mitogenaktivirajuće protein kinaze)

- Prvi član MAPK kaskade je protein označen kao Raf-1, koji fosforilira sljedeći protein u kaskadi, označen kao MEK

- MEK fosforilira MAPK na njenim treoninskim i tirozinskim ostacima i na taj način je aktivira


47

- Aktivirana MAPK prelazi iz citosola u nukleus gdje katalizira fosforilaciju i aktivaciju transkripcijskog faktora nazvanog Elk1

- Fosforilirani (aktivirani) Elk1 se povezuje sa drugim faktorom označenim kao SRF i na taj način stimulira transkripciju seta gena odgovornih za diobu stanice

Faktori rasta: glavni koraci u toku transdukcije signala Receptori za različite faktore rasta posjeduju aktivnost tirozin kinaza i pripadaju receptorima tirozin kinazama.

Slika 2-6. Faktori rasta kao prvi glasnici: glavni koraci u toku stanične signalizacije. (Modificirano prema Mathews CK, Van Holde KE, Ahern KG. Biochemistry, Benjamin Cummings, San Francisco, 2000) Glavni koraci u toku signalizacije su:

- Nakon autofosforilacije, receptori interreagiraju sa jednim ili više proteina-faktora izmjene (korak 1 i 2 na sl. 2-6), koji, potom, aktiviraju Ras protein putem stimulacije GDP-GTP izmjene (korak 3 na sl. 2-6)

-

-

-

Odgovkaska Blokastanicsignal Onko Procesljedetačkashromo

Slika 2(http://

Proteini također reaktivnost Ras aktivkinaza kaaktiviranjaKonačni potom, znputeve u

vor staniceada proteisk

da Ras GTce i nastalnog puta st

ogeni i sig

es aktivacijeće biohemste mutacozomalnu tr

2-7. Sekunda/en.wikipedia

BIOH

nazvani Geagiraju sa

vira kaskaaskada) (ka transkripcrezultat je

načajno utičciljnoj stani

e na stimulakih fosforilac

TP-azne aktnka maligntalno uključ

gnalna tran

e proto-onmizme: retije, inserciranslokaciju

arna struktura.org/wiki/ras

HEMIZMI PR

48

GAPs (GT Ras prote

du daljnjihkorak 4 nacijskih faktor

biosintezače na određci

aciju nekim cija.

tivnosti dovne stanicečenim.

nsdukcija

nkogena u troviralnu tijske mutau i/ili protein

a HRAS prots_(protein))

IJENOSA SI

P-aza aktiinom i ogra

protein-foa sl. 2-6), ra (korak 5 a specifičnođene metab

faktorom r

odi do neko biohemizm

onkogentransdukciju

acije, gensn-protein inte

teina.

GNALA U S

ivirajući praničavaju nj

osforilacija koje dovona sl. 2-6) og proteinaoličke reakc

rasta je, za

ontroliranogmom održa

može uklju ili integsku amplifierakcije.

TANICI

roteini) jegovu

(MAP-de do

a koji, cije i/ili

apravo,

g rasta avanja

učivati graciju, kaciju,


49

Oštećenja proto-onkogena koji kodiraju za faktore rasta, receptore faktora rasta i/ili proteine različitih kaskada signalnih puteva vode staničnoj transformaciji. Ras protein ima centralnu ulogu u usmjeravanju ekstracelularnih signala prema nukleusu nakon stimulacije različitim faktorima rasta i diferencijacijskim faktorima. Ras protein pripada tipu malih monomernih G regulacijskih proteina (mali G-proteini). JAK-STAT signalni put Receptori JAK-STAT puta su membranski receptori koji nemaju unutarnju enzimatsku aktivnost, nego posjeduju intracelularne domene koje se mogu povezivati sa odvojenim intracelularnim tirozin kinazama nazvanim Janus kinaze (JAK). Sa ovim tipom receptora reagiraju pojedini citokini (npr. γ-interferon), kao i neki hormoni (hormon rasta, prolaktin). Nakon dimerizacije receptora uzrokovane vezivanjem liganda, JAK kinaze fosforiliraju proteine nazvane STAT (signal transducers and activators of transcription-signalni transdjuseri i aktivatori transkripcije), koji se, potom, translociraju u nukleus i reguliraju proces transkripcije. Cijeli put transdukcije signala nazvan je JAK-STAT put. Transmembranski receptori-gvanilat ciklaze: koraci u signalizaciji Klasa transmembranskih receptora sa unutarnjom enzimatskom aktivnošću koja je locirana u citosolnoj domeni receptora. Ligandi ovih receptora su tri mala peptida koji se stvaraju i oslobađaju u tkivu miokarda i vaskularnog sistema. To su: atrijalni natriuretski peptid (ANP; atrial natriuretic peptide), koji se oslobađa iz skladišnih granula atrija miokarda nakon ekspanzije intravaskularnog volumena ili nakon stimulacije sa presornim hormonima; moždani natriuretski peptid (BNP, brain natriuretic peptide) koji se stvara i oslobađa iz ventrikula miokarda (uprkos svoga naziva) kao odgovor na povećanje volumena i dotoka krvi u miokard; i C-tip natriuretski peptid (CNP) koji se stvara u mozgu i endotelijalnim stanicama. Glavni koraci u toku prijenosa signala uz pomoć transmembranskih receptora-gvanilat ciklaza su (slika 2-10):


50

- Specifični kontakt receptora i liganda - Aktivacija receptora: konformacijska promjena receptora

izazvana vezivanjem liganda čiji rezultat jeste stimulacija aktivnosti enzima gvanilil ciklaze na intracelularnoj (citosolnoj) domeni receptora

- Aktivirana gvanilil ciklaza katalizira reakciju pretvaranja GTP i cGMP (njen supstrat je citosolni GTP)

- cGTP se ponaša kao drugi glasnik i djeluje kao alosterički modulator na enzim protein kinazu G (PKG). Protein kinaza G je tetramer građen od dvije katalitičke i dvije regulacijske podjedinice. Vezivanjem cGMP na regulacijske podjedinice, dolazi do njihove disocijacije od katalitičkih podjedinica koje na taj način postaju aktivne

- Altivirana PKG fosforilira svoj supstrat (specifični protein, npr. enzim) i mijenja njegovu aktivnost

- Konačni odgovor u signalizaciji je promjena u metabolizmu ciljne stanice usljed promjene u aktivnosti ili količini specifičnog proteina. Promjena aktivnosti ciljnog proteina je najčešće rezultat njegove kovalentne modifikacije po principu fosforilacije

2.3. Signalizacija uz pomoć unutarstaničnih

receptora Unutarstanični receptori značajni u procesima stanične transdukcije signala obuhvataju receptore koji su locirani u nukleusu (nuklearni receptori) i receptore koji su smješteni u citoplazmi (citosolni receptori, solubilni enzimi). Nuklearni receptori Steroidni hormoni kao prvi glasnici: putevi prijenosa signala Steroidni hormoni su, zahvaljujući svojoj hemijskoj strukturi, relativno male i liposolubilne molekule. To je objašnjenje za njihovo svojstva da uspijevaju savladati barijeru stanične membrane i ući u unutrašnjost ciljne stanice gdje su locirani njihovi specifični receptori.


51

Glavni koraci u toku signalizacije uz pomoć steroidnih hormona kao prvih glasnika (kortikosteroidi; spolni hormoni) su:

- Vezivanje steroidnog hormona za svoje specifične receptore koji su locirani u nukleusu, što rezultira konformacijskim promjenama na receptoru

- Nastaju homo ili heterodimeri sa drugim hormon-receptor kompleksom (aktivacija receptora)

- Interakcija kompleksa (aktivirani receptor) sa specifičnim DNK sekvencijama koje se zovu hormon odgovorni elementi (HRE) i koje se nalaze u susjedstvu specifičnih gena

- Povećanje ili smanjenje brzine transkripcije specifičnig gena, što se odražava na biosintezu specifične mRNK

- Specifična mRNK izlazi iz jedra u citoplazmu i uključuje se u biosintezu specifičnog proteina

- Promjenjeni nivoi specifičnog proteina u ciljnoj stanici rezultiraju staničnim odgovorom na hormon

Slika 2-8. Glavni koraci u toku signalizacije uz pomoć nuklearnih receptora. (Modificirano prema David L. Nelson, Michael M. Cox, Lehninger. Principles of Biochemistry, Worth Publishers, New York, 2005)


52

Slika 2-9. Detaljnija struktura aktiviranog receptora za steroidne hormone. Karakteristično je prisustvo motiva prostorne strukture nazvanog „cinkovi prsti“. Zn prsti su esencijalni za vezivanje receptora na specifične regije DNK. Zn atomi se kompleksno vežu za sumpor cisteina u strukturi receptora stvarajući strukturni motiv " zinc finger" . (Modificirano prema Mathews CK, Van Holde KE, Ahern KG. Biochemistry, Benjamin Cummings, San Francisco, 2000) Na veoma sličan način se odvija i signalizacija uz pomoć hormona (liganada) čiji specifični receptori su locirani u citoplazmi. Takav primjer su hormoni štitne žlijezde. Koraci u toku prijenosa signala uz pomoć intracelularnih receptora za odgovarajuće hormone (ligande) a koji su locirani u citoplazmi su, zapravo, isti kao i u slučaju nuklearnih receptora, s tim da se aktivirani hormon-receptor kompleks mora najprije translocirati iz citoplazme u nukleus, nakon čega se vezuje za specifične HRE regije i modificira transkripciju specifičnih gena. Intracelularni (solubilni) tip gvanilil ciklaze: glavni koraci u toku prijenosa signala Dva tipa (izoenzima) gvanilil (gvanilat) ciklaze proizvode c-GMP: prvi tip je receptor sa unutarnjom enzimatskom aktivnošću gvanilil ciklaze, a drugi tip je intracelularni (solubilni) tip gvanilil ciklaze. Solubilna gvanilil ciklaza u hemijskom smislu je hem-protein.


53

Slika 2-10. Putevi prijenosa signala uz pomoć cGMP. Stvaranje cGMP je regulirano od strane transmembranskih receptora sa ligand-aktiviranom aktivnošću gvanilil ciklaze (GC) koji vežu natriuretske peptide, i od strane receptora sa unutarnjom enzimatskom aktivnošću gvanilil ciklaze koji odgovaraju na NO. NO se stvara iz L-arginina pod katalitičkim djelovanjem NO sintaze (NOS) (na ovoj slici u endotelijalnim stanicama djelovanjem Ca2+/kalmodulin-ovisne NOS). (Modificirano prema Brunton L, Chabner B, Knollman B (Eds.). Goodman&Gilman's the Pharmacological basis of Therapeutics, McGrawHill Medical, 2011)

U putevima signalizacije u kojima sudjeluje cGMP značajna uloga pripada alosteričkom enzimu protein kinazi G (PKG). Celularni efekti cGMP se ostvaruju preko protein kinaze G (PKG) i cGMP-reguliranih fosfodiesteraza (PDE). Glavni koraci u toku signalizacije u kojima sudjeluje solubilna gvanilil ciklaza su:

- cGMP nastao pod uticajem membranske gvanilat ciklaze ili solubilne (intracelularne) gvanilil ciklaze se ponaša kao alosterički efektor i mijenja aktivnost enzima protein kinaze G (PKG)

- Protein kinaza G (PKG) je građena od katalitičke i regulacijske podjedinice, a nakon vezivanja cGMP na regulacijske podjedinice, dolazi do disocijacije regulacijskih od katalitičkih podjedinica


54

- Slobodne katalitičke podjedinice PKG predstavljaju aktiviranu PKG

- Konačni celularni efekat nastaje kao rezultat djelovanja aktivirane PKG, a biohemizam se ogleda u fosforilaciji specifičnog proteina

- Celularni efekat može nastati i kao rezultat promjene aktivnosti staničnih cGMP- reguliranih fosfodiesteraza

Dobar primjer značaja signalizacije uz pomoć solubilne gvanilat ciklaze su glatki mišići krvnih sudova kao ciljno tkivo, gdje aktivacija PKG rezultira vazodilatacijom. Mogući biohemizmi nastale vazodilatacije su:

- Inhibicija IP3-posredovanog oslobađanja jona Ca2+ iz njihovih intracelularnih depoa

- Fosforilacija naponom-reguliranih Ca2+ kanala i inhibicija Ca2+ influksa

- Fosforilacija fosfolambana, modulatora sarkoplazmatske Ca2+ pumpe, što rezultira bržim reprihvatom (reuptake) jona Ca2+ u njihove intracelularne depoe

- Fosforilacija i otvaranje Ca2+aktiviranih K+ kanala, što dovodi do hiperpolarizacije stanične membrane i zatvaranja specifičnih Ca2+ kanala i redukcije fluksa jona Ca2+ u stanicu

Lijek nitroglicerin djeluje kao koronarni vazodilatator. Biohemijska osnova njegovog djelovanja je u njegovom postepenom prevođenju u NO, što rezultira dugotrajnom relaksacijom srčanog mišića.

SIGNALIZACIJA UZ POMOĆ PROLAKTINA

55

POGLAVLJE 3

3. Signalizacija uz pomoć prolaktina 3.1. Prolaktin kao prvi glasnik

3.2. Prolaktin i rak dojke


56

3. Signalizacija uz pomoć prolaktina 3.1. Prolaktin kao prvi glasnik Receptori za prolaktin (PRLR) Prolaktinski receptori (PRLR) pripadaju citokinskoj hematopoetskoj familiji receptora. Članovi ove familije su jednomembranski receptori sa tri domene: domenom koja vezuje izvanstanični ligand, hidrofobnom transmembranskom domenom i unutarstaničnom domenom bogatom aminokiselinom prolinom. Postoje barem tri različita izooblika PRLR koji se uglavnom razlikuju po svojoj citoplazmatskoj domeni: dugi (90 kDa), srednji i kratki (40 kDa) izooblik PRLR. Dugi i kratki izooblici PRLR stvoreni su alternativnim cijepanjem mRNK jednog gena i razlikuju se samo po dužini citoplazmatske domene. Srednji oblik je delecijski mutant dugog oblika kojem nedostaje 198 aminokiselina u njegovoj citoplazmatskoj domeni. Najkraći izooblik PRLR identificiran je u ljudslom serumu i predstavlja slobodno-cirkulirajuću ekstracelularnu domenu PRLR. PRL/PRLR signalni putevi Nakon PRL-inducirane dimerizacije prolaktinskih receptora, dolazi do aktivacije više različitih kinaza koje dalje sudjeluju u procesima transdukcije signala. Prijenos signala iniciraju tri tirozin kinaze: Jak2 (Janus-kinaza), Src (sarkoma) i Tec (proteinska tirozin kinaza). Ove kinaze pripadaju porodici Janus kinaza. U signalni put PRL uključeni su višestruki nizvodni putevi kao što su Src-porodica kinaza, Ras-MAPK i PIK3 kinaza. Jak2 –Stat kinaza put Jak2 fosforilira multiple supstrate, uključujući PRLR i samu Jak2. Na taj način stvaraju se mjesta pristajanja u strukturi PRLR na koja se dalje u signalizaciji vezuju proteini sa SH2 domenama u svojoj strukturi, uključujući i STAT familiju proteina (STAT-signal


57

transducers and activators of transcription, signalni transdjuseri i aktivatori transkripcije). Budući da PRL-receptori nemaju unutarnju enzimatsku aktivnost, moraju kontaktirati sa više različitih kinaza unutar ciljne stanice kako bi se signal dalje prenio. JAK1 i JAK2 su članovi familije Janus kinaza i koje su konstitutivno povezane sa PRL receptorima. Glavni koraci u signalizaciji su:

- Nakon vezivanja PRL za svoj receptor dešava se autofosforilacija receptora i fosforilacija i aktivacija JAK kinaza

- JAK 2 se nakon fosforilacije vezuje na SHC protein, koji se, potom, vezuje na Grb 2 protein

- Sljedeći događaj je fosforilacija citoplazmatskih transkripcijskih faktora: STAT-1, STAT-3 i STAT-5

- Aktivacija STAT proteina rezultira translokacijom transkripcijskih faktora u nukleus i aktivacijom transkripcije specifičnih gena

- Konačni odgovor je biosinteza specifičnog proteina koji ima značajan uticaj na stanični metabolizam

Ras-Raf-MAPK signalni put Raf-1 protein je MAPKKK sa regulacijskom ulogom indukcije mitoze uz pomoć PRL u ovome putu. Signalni put Ras-Raf-MAPK je mehanizam koji posreduje kod proliferacijske aktivnosti čitavog niza faktora rasta i citokina. Raf1 (mitogenski aktivirana proteinska kinaza-kinaza-kinaza), MEK (mitogenski aktivirana proteinska kinaza-kinaza) i MAP (mitogenski aktivirana proteinska kinaza) su nizvodne kinaze na tom signalnom putu. Prijenos signala pomoću puta SHC/GRB2/Ras/Raf/MEK/MAPK (SHC-adapterski protein; GRB2-receptor faktora rasta-vezni protein2; Ras-štakorski sarkom) također izravno potiču proliferaciju i moduliraju aktivnost STAT faktora. O komunikaciji između puteva STAT i MAPK na drugim tačkama objavljeno je dovoljno podataka za mnoge citokine, uključujući i hormon PRL. MAPK mogu fosforilizirati STAT-proteine na serinskim i treoninskim ostacima, čime se pojačavaju aktivnosti proteina STAT 1 i STAT 3.


58

PKC put signalne transdukcije može biti uključen u PRL-izazvanu proliferaciju stanica. Aktivacija PKC i MAPK i njihova translokacija u nukleus su uočeni za vrijeme PRL-izazvane proliferacije Nb2 stanica in vitro.

PI-3K (fosfoinozitid 3 kinaza) signalni putevi

Kompleks između Tec tirosin kinaze i Vav familije faktora izmjene gvanin nukleotida također se inducirano povezuje sa PRLR vezanim za ligand. To rezultira izmjenom GDP i GTP na malom G proteinu nazvanom Ras protein, što dovodi do njegove aktivacije i poticanja stanične pokretnosti.

Aktivacija tirozin kinaza Tec i Akt (PKB) izravno je vezana za aktivaciju PI-3K koju izaziva PRL.

SHP-2-fosfataza je takođe povezana sa PRLR i pojačava njegovu aktivnost.

Aktivacija PI-3K stvara fosfoinozitide koji služe kao drugi glasnici, te mogu regulirati višestruke puteve signalizacije kako u normalnim, tako i u maligno promijenjenim stanicama, uključujući proliferaciju i citoskeletnu preraspodjelu, kao i sprječavanje apoptoze i angiogeneze.

Aktivacija ciklusa fosfoinozitida rezultira stimulacijom puta PKC. PI-3K bi mogla biti ciljna destinacija za Ras protein, a pokazano je da se regulacijska podjedinica p85 povezuje sa nekoliko nizvodnih efektora i adaptora citokina i receptora faktora rasta uključujući STAT5, STAT3, IRS1 (inzulinski receptor supstrat 1), Gab1 (vezujući protein 1 povezan s GRB2) i Gab2 (vezujući protein 2 povezan s GRB2), te SHP-2 (Src homologija-2 domena koja sadrži protein tirozin fosfatazu). Aspekti PRL/PRLR signalizacije u mliječnoj žlijezdi PRL-izazvana dimerizacija PRLR inducira asocijaciju Jak2 kinase, rezultirajući u aktivaciji Jak2, PRLR fosforilaciji, i asocijaciji i fosforilaciji STAT5 proteina. Okida se STAT5 dimerizacija i nuklearna translokacija, događaji neophodni za PRL-stimuliranu diferencijaciju mliječne žlijezde. Signalizacija kroz SHC/GRB2/Ras/Raf/MEK/MAPK put, također, direktno stimulira proliferaciju i modulira STAT aktivnost. Dalje, kompleks između Tec tirosin kinase i Vav familije faktora izmjene gvanin nukleotida također je povezan sa PRLR i rezultira


59

GDP/GTP izmjenom na malom G proteinu Rac, rezultirajući u njegovoj aktivaciji i stimulaciji celularnog motiliteta. Aktivacija Tec i kinaze Akt su direktno povezani sa PRL-induciranom aktivacijom PI-3K. Fosfataza SHP-2 je također povezana sa PRLR i povećava njihovu aktivnost.

Slika 3-1. Aspekti PRLR signalizacije u mliječnoj žlijezdi. (Modificirano prema Clevenger et. al. Endocr Rev 2003;24:1-27).


60

Mujagić Z. i sur. Uloga prolaktina kod raka dojke

61

3.2. Prolaktin i rak dojke

Uloga prolaktina kod raka dojke Zlata Mujagić1, Nahida Srabović1, Hamza Mujagić2

1Katedra za biokemiju, Farmaceutski fakultet, Sveučilište u Tuzli, Bosna i Hercegovina 2Opća bolnica i Sveučilište Harvard u Massachusettsu, Boston, SAD Sažetak Mnogi su objavljeni podaci o raku dojke i prolaktinu (PRL) proturječni. PRL je prvo bio prepoznat kao hormon koji ima važnu ulogu u inicijaciji i napredovanju raka dojke kod glodavaca i barem djelomično kod ljudi. Ljudske stanice raka dojke u kulturi sintetiziraju biološki aktivni PRL te on djeluje u autokrinoj/ parakrinoj stimulacijskoj petlji (engl. autocrine/paracrine stimulatory loop) unutar tkiva dojke. Aktivnošću tog liganda posreduje izooblik prolaktinskog receptora (receptor prolaktina, PRLR) koji se nalazi na epitelu, odnosno kojeg luči epitel dojke kod ljudi. Kompleks PRL/PRLR se povezuje te aktivira nekoliko signalnih putova koje dijeli s drugim članovima nadskupine receptora citokina. Prijenos signala PRLR započinje s tri tirozin-kinaze, odnosno Jak2, Src i Tec. U nedavno objavljenim podacima upućuje se na funkcionalnu ulogu PRL unutar jezgre gdje on djeluje zajedno s ciklofilinom B kao pobuđivačem transkripcije. Nekoliko epidemioloških istraživanja ukazalo je na moguću funkciju PRL kao čimbenika napredovanja raka dojke kod ljudi. PRL bi mogao biti važan lokalni promotor rasta uključen u patogenezu raka dojke kod žena. Hiperprolaktinemija bi mogla biti pokazateljem napredovanja bolesti i nepovoljne prognoze. U kliničke pristupe kontroliranju bolesti trebalo bi uključiti antagoniste interakcije PRL/PRLR ili signalnu transdukciju povezanu s receptorom PRL. Ključne riječi: prolaktin; rak dojke; receptori prolaktina; signalni putevi prolaktina; hiperprolaktinemija

Pristiglo: 7. travnja 2009 Prihvaćeno: 3. srpnja 2009.

Pregledni Članak


62

Uvod Čini se da je sve više podataka o ulozi prolaktina (PRL) kod raka dojke proturječno; stoga je teško ustanoviti ulogu PRL u raku dojke kod žena. PRL je prvo bio prepoznat kao hormon koji ima važnu ulogu u pokretanju i napredovanju raka dojke kod glodavaca (1,2) te barem djelomično kod žena. Postoji i čvrst dokaz izravne stimulirajuće uloge PRL na epitelne stanice tkiva dojke (3,4) i stanice raka doj ke u kulturi (5,6). Postoje i neka epidemiološka istraživanja koja pokazuju značajno povišenje koncentracije PRL u serumu kod određenih podskupina bolesnica oboljelih od raka dojke (7-10) i kod žena s rizikom od raka dojke zbog povijesti raka dojke u obitelji (9,11). Ovaj članak ispituje ima li osnove za tvrdnju kako PRL ima ulogu koja doprinosi onkogenezi tumora dojke. Aktivnost PRL u tkivu dojke – istraživanja in vitro Sinteza i izlučivanje PRL iz stanica ra ka dojke Danas je već poznato da kod sisavaca postoje endokrini i autokrini/parakrini izvori PRL. Godinama su objavljivani radovi u kojima se nagađalo o mogućim drugim izvorima PRL osim hipofize. Podaci iz 1970. pokazuju da su kod bolesnika s rakom dojke koji su prošli hipofizektomiju koncentracije PRL bile približne normalnim koncentracijama (12,13), dok su imunohistokemijska istraživanja otkrila izražaj ekspresiju imunoreaktivnog proteina PRL u epitelu dojke (14). Uz to je niska koncentracija cirkulirajućeg PRL prevladala kod bolesnika na terapiji kojom se potiskuje djelovanje hormona hipofize (engl. pituita ry hormone suppression therapy) (15). Istraživanja iz ranih 1990. ukazala su da mRNA za PRL može biti prisutna u normalnom i neop lastičnom epi telu doj ke kod žena (16–18) i epi telu tkiva dojke kod skotnih ženki glodavaca (19,20). PRL stvaraju tumori kao i razna zdrava tkiva. Posteljica je najbogatiji izvor PRL kojeg ne luči hipofiza (21) i odgovorna je za njegovu visoku koncentraciju u plodnoj vodi kod žena. Imunološki sustav, maternica, te moždani i kožni fibroblasti također proizvode PRL (21–24). Ti su rezultati doveli laboratorije Vonderhaar i Clevenger (17,18) do postavljanja hipoteze i naposljetku do dokaza da se PRL sintetizira i izlučuje u tkivu i stanicama dojke kod žena. Biološki aktivan PRL sintetiziraju stanice raka dojke u kulturi te on djeluje kao autokrina/parakrina stimulacijska petlja u tkivu dojke, što ukazuje na ulogu ovog hormona u patogenezi raka dojke (17,18). Rast dviju vrsti stanica raka dojke kod žena, tj. T47Dco (negativne na estrogenski receptor, ER-negativno) i MCF–7 (pozitivne na estrogenski receptor, ER-pozitivno), spriječen je nakon liječenja monoklonskim protutijelima usmjerenima na ljudski PRL iz hipofize (17). Uz to, protusmislena (engl. antisense) RNA


63

usmjerena na gen za PRL iz hipofize znatno je pojačala rast stanica T47Dco (25). Prisutnost mRNA za PRL u stanicama T47Dco i MCF-7 potvrđena je metodom lančane reakcije polime-razom na kon reverzne transkripcije (ob r nu tog pre pisivanja) (engl. reverse transcription polymerase chain reaction, RT-PRC) (17) te je mRNA za PRL bila prisutna kod 82% ispitanih linija stanica raka dojke (25). Nadalje, velika većina, odnosno 98% raka dojke kod žena sintetizira PRL mRNA, kao što je otkriveno hibridizacijom in situ (26). Neka is traživanja otkrila su da je mRNA za PRL također bila prisutna kod više od 75% primarnih kirurških uzoraka raka dojke te da je u većini slučajeva koncentracija mRNA za PRL i njegove receptore bila značajno povišena kod malignih tkiva u odnosu na okolna, nemaligna tkiva kod is-tog bolesnika (16,25,27). Receptori prolaktina (PRLR) Aktivnost PRL u mliječnoj žlijezdi zahtijeva prisutnost površinskog receptora njegove srodne stanice, PRLR. PRLR pripada citokinskoj hematopoetskoj obitelji receptora (28,29). Članovi te nadskupine su jednomembranski receptori s tri domene: domenom koja veže izvanstanični ligand, hidrofobnom transmembranskom domenom i unutarstaničnom domenom bogatom prolinom. Postoje barem tri različita izooblika PRLR koji se uglavnom razlikuju po svojoj citoplazmatskoj domeni: dugi (90 kDa), srednji i kratki (40 kDa). Dugi i kratki izooblici PRLR stvoreni su alternativnim cijepanjem mRNA jednog gena i razlikuju se samo po du lji ni ci top laz matske do me ne (30). Srednji oblik je delecijski mutant dugog oblika kojem nedostaje 198 aminokiselina u svojoj citoplazmatskoj domeni. Najkraći izooblik PRLR, PRL-vezni protein (engl. PRL binding protein, PRLBP) identificiran je u ljudskom serumu (31) i predstavlja slobodno cirkulirajuću izvanstaničnu domenu PRLR (32). Sva tri izooblika pospješuju mitozu (33). I zdrave i maligne stanice raka dojke sadržavaju kratke i duge oblike PRLR (34,35), dok je srednji oblik nađen kod stanica Nb2 limfoma te je osjetljiviji na PRL u usporedbi s druga dva ob li ka PRLR (36). Srednji ob lik PRLR bio je ot kri ven u uzorcima tkiva dojke (37), što je suprotno rezultatima nekih drugih istraživanja (18). Prednosti imunohistokemije, hibridizacije in situ i RT-PCR jesu da omogućuju bolju procjenu koncentracije PRLR kod raka dojke kod žena, te su re zul tati ne kih istraživa nja provede nih tim me todama (26,35,37,38) otkrila da je hPRLR izražen kod 98% svih slučajeva raka dojke kod žena. Istraživanja koja istražuju iz ražaj PRLR na razi ni mRNA ukazuju na vezu ili s iz ražajem ER/PR (estrogenskim /progesteronskim receptorima) (38) ili neoplazijom (37); međutim, istraživanja na razini proteina nisu potvrdila ta promatranja (26). PRLR se obično stabilizira kod raka dojke zbog


64

smanjene fosforilacije ostatka Ser349 koji, kada je fosforiliziran, koristi beta Trcp E3 ubikvitin-ligazu te pomaže pri razgradnji PRLR (39). Neoplastični razvoj i napredovanje bolesti zahtijevaju dereguliranu proliferaciju stanice, povećano preživljavanje stanica, dobivanje odgovarajuće vaskularne opskrbe i neograničavanje pokretnosti. Iako postoje dokazi da PRL može inicirati rast i pokretnost stanica raka dojke kod žena, njegova nesposobnost kod iniciranja diferencijacije i dalje ostaje nerazjašnjena. Potencijalni mehanizmi za to uključuju promjene u koncentraciji Stat5 (prenositelja signala i aktivatora transkripcije) (engl. signal transducer and activator of transcription, STAT) ili fosforilaciji, kvantitativne promjene u ekspresiji raznih izooblika hPRLR ili promjeni reakcije malignih epitelnih stanica na bazalnu membranu, što bi moglo izravno utjecati na prijenos signala PRLR (32). Budući da je poboljšana pokretnost jedan od aspekata metastatskog procesa, postavlja se pitanje može li PRL služiti kao kemoatraktant za rak dojke kod žena in vitro (40). PRL stimulira citoskeletnu reorganizaciju i pokretnost stanica raka dojke. Tijekom prijenosa signa-la PRLR Vav2 (čimbenik izmjene gvanin-nukleotida) (engl. guanine nucleotide exchange factor, GEF) postaje fosforiliziran i aktivira se, što regulira serin/treonin-kinaza Nek3 (engl. never in mitosis ge ne a-related kinase 3), a što pak doprinosi širenju raka dojke preko PRL mehanizama koji uključuju aktivaciju Rac1 (čimbenik izmjene gvanin-nukleotida) i fosforilaciju paksilina (41). Također je moguće da PRL utječe na karcinogenezu raka dojke na način da modulira vaskularizaciju. Pokazano je da sam hPRL, isto kao i ljud ski GH (en gl. growth hormone, GH) i pla cental ni hor mo ni, može sti mu li rati stva ra nje kapilara kod CAM-testa (engl. chicken chorioallantoic membrane assay, CAM) (42). Suprotno tome, produkt proteolitičkog cijepanja PRL, 16K-PRL, jest snažan antiangiogenski agens in vivo i in vitro (42-44). Taj je N-terminalni produkt cijepanja PRL spriječio proliferaciju endotelnih stanica kao odgovor na čimbenik rasta endotelnih stanica (engl. vascular endothelial growth factor, VEGF) i čimbenik rasta osnovnog fibroblasta (engl. basic fibroblast growth factor, BFGF) na način da je zap riječio sig nal ni put Ras-Raf1MAPK i pojačao ekspresiju inhibitora aktivacije plazminogena tipa 1 (engl. type 1 plasminogen activator inhibitor) (42,45,46). Čini se da tim aktivnostima posreduje neki receptor koji nije PRL (47). Indukcija VEGF prolaktinom bila je ovisna o PRLR, Jak2 i MAP-kinazi. PRL potiče ekspresiju VEGF preko Erg-1 (engl. ether-a-go-go-related gene 1 encoded K

+ channels) i koristi VEGF kao posrednika angiogeneze

koju regulira PRL (48). Uloga PRL kod ra ka doj ke je kom pli ci ra na, čemu poseb no pridonosi činjenica da je sam PRL angiogeničan, a proteaze cijepaju PRL kako bi stvorile vazoinhibine (engl. vasoinhibins), obitelj peptida koji djeluju na endotelnim stanicama kako bi potisnuli angiogenezu i vazodilaciju


65

te potakli vaskularnu regresiju kojoj posreduje apoptoza (49). Signalni putovi PRL/PRLR Nakon dimerizacije receptora potaknute PRL, aktivira se nekoliko različitih kinaza kako bi prenijele hormonski signal. Prijenos signala PRLR iniciraju tri tirozin-kinaze: Jak2 (Janus-kinaza), Src (sarkoma) i Tec (proteinska tirozin-kinaza) (32). Te kinaze pripadaju Janus-obitelji kinaza (Jak skupina). U signalni put PRL uključeni su i višestruki dodatni nizvodni putevi kao što su Src-obitelj kinaza, Ras-MAPKs (štakorske sarkoma-mitogenski aktivirane proteinske kinaze) i PI3K (fosfoinozitid-tri-kinaza) (50) (Slika 1).

Slika 1.Aspekti signalnih puteva receptora prolaktina (PRLR). Dimerizacija potaknuta receptorom PRL pokreće povezanost s Jak2-kinazom te rezultira aktivacijom Jak2, fosforilacijom PRLR, te vezanjem i fosforilacijom proteina Stat5. Prijenos signala kroz put SHC/GRB2/Ras/Raf/ MEK/MAPK također izravno potiče proliferaciju i modulira aktivnost Stat-proteina. Kompleks između Tec tirozin-kinaze i Vav obitelji čimbenika izmjene gvanin-nukleotida također je povezan s PRLR vezanim za ligand, što rezultira njegovom aktivnošću i stimulacijom stanične pokretnosti (modificirano prema popisu literature, br. 32). Iako nije do kraja razjašnjeno da svi signalni putovi PRL zahtijevaju Jak2 kao bliskog posrednika (50,51), mnogo dokaza iz različitih tipova stanica podržava ključnu ulogu te kinaze kod mnogih aktivnosti PRL (52,53). Jak2 fosforilira višestruke supstrate


66

uključujući PRLR i sam Jak2. Time se osiguravaju mjesta molekularnog modeliranja (engl. docking sites) proteina s domenom SH2 (engl. src homology2, SH2) uključujući i Stat-proteine. Vezanje PRL za svoje receptore vodi ka tirozinskoj fosforilaciji citoplazmatskih transkripcijskih čimbenika, uglavnom članova obitelji Stat (32,54). Aktivacija Stat-proteina rezultira njihovom translokacijom u jezgri, nakon čega slijedi aktivacija prepisivanja transkripcije gena (32,55). Stat1, Stat3 i Stat5 aktiviraju se u stanicama T47D nakon 15-minutne izloženosti PRL (56). Nekoliko je istraživanja pokazalo povećanje koncentracije proteina Stat1 i 3 kod primarnih tumora dojke (57,58). Međutim, njihovi ciljni geni u procesu onkogeneze, relativna važnost PRL u njihovoj regulaciji te razlike u odnosu na zdrave mliječne žlijezde nisu još objašnjeni u dovoljnoj mjeri. Proteini Stat 3 i 5 sudjeluju u prolaktinskoj aktivaciji promotora ciklina D1 (59) te ukazuju na barem jedan cilj PRL na tom putu koji bi mogao doprinijeti stvaranju tu-mora. Pokazano je (60) da je Stat5b, a ne Stat5a, mogući posrednik stvaranja tumora pobuđenog sa Src. U skladu s prethodno iznesenim, fosforilacija tirozina Jak2-kinazom povezanom s receptorom rezultira dimerizacijom/multi merizacijom i nuklearnom retrotranslokacijom kompleksa Stat uz zahvaćanje njegove srodne vezne sekvence DNA, što rezul ti ra transakti va cijom pro mo tora pod određenim uvjetima (32,61). Dok je PRL stimulirao tirozinsku fosforilaciju kod Stat 5a i 5b, aktivacija Src je rezultirala tirozinskom fosforilacijom Stat 5a i 5b i nuklearnom tran-slokacijom, ali samo Stat 5b (62). Pokazano je da PRL aktivira Src u nizu različitih tipova stanica uključujući i stanice jetre štakora (63). Rezultati nekih nedavno provedenih istraživanja ukazuju da protoonkogen c-Myc, koji možda funkcionira kao koaktivator Stat 5a, pojačava izražaj gena koji uzrokuje Stat5a, kod raka dojke kod žena (54,64). Nadalje, PRL stimulira ubikvitinaciju, internalizaciju i razgradnju njegovih receptora pomoću katalitičke aktivacije Jak2 (65) te se čini da je fosforilacija PRLR pomoću Ser349 ključni događaj u tom složenom provođenju signala kojem posreduje Jak2. Signalni put Ras-Raf-MAPK Signalni put Ras-Raf-MAPK je mehanizam koji posreduje kod proliferacijske aktivnosti čitavog niza čimbenika rasta i citokina. Raf1 (mitogenski aktivirana proteinska kinaza-kinaza-kinaza), MEK (mitogenski aktivirana proteinska kinaza-kinaza) i MAP (mitogenski aktivirana proteinska kinaza) su nizvodne kinaze na tom signalnom putu. Prijenos signala pomoću puta SHC/GRB2/Ras/Raf/MEK /MAPK (SHC-adap terski pro tein; GRB2-recep tor faktora rasta-vezni protein2; Ras-štakorski sarkom) također izravno potiču proliferaciju i moduliraju aktivnost Stat. Pokazano je da PRL aktivira taj put u velikom broju modela ovisnim o PRL (66) i


67

staničnim linijama raka dojke (67-69) kao i kod zdravih mišjih epitelnih stanica dojke (68,69). PRL također može sinergijski aktivirati taj put preko komunikacije s drugim čimbenicima rasta ovisno o fenotipu tumorskih stanica. Aktivacija Jak2 koju pobuđuje PRL rezultirala je tirozinskom fosforilacijom erbB2, pritom povećavajući povezanost s Grb2 i aktivirajući put Ras-MAPK (70) te uključujući fosforilaciju nekih transkripcijskih čimbenika i na taj način povećavajući sintezu produkata gena obitelji fos. O komunikaciji između putova Stat i MAPK na drugim točkama objavljeno je dovoljno podataka za mnoge citokine, uključujući i PRL (71). MAPK mogu fosforilizirati Statproteine na serinskim i treoninskim ostacima, čime se pojačavaju aktivnosti proteina Stat 1 i 3 (72). Aktivnost PRL unutar jezgre Kompleks između Tec tirozin-kinaze i Vav obitelji čimbenika izmjene gvanin-nukleotida također se inducirano povezuje s PRLR vezanim za ligand. To rezultira izmjenom GDP i GTP na malom G-proteinu Ras, što dovodi do njegove aktivacije i poticanja stanične pokretnosti. Aktivacija tirozin-kinaze Tec i Akt (PKB -proteinska kinaza B) izravno je vezana za aktivaciju PI3K koju izaziva PRL. SHP-2-fosfataza je također povezana s PRLR te pojačava njegovu ak tivnost. Aktivacija PI3K stvara fosfoinozitide koji služe kao sekundarni glasnici te mogu regulirati višestruke puteve važne u onkogenezi, uključujući proliferaciju i citoskeletnu preraspodjelu, kao i sprječavanje apoptoze i angiogeneze (73-75). Aktivacija ciklusa fosfoinozitida rezultira stimulacijom puta PKC (proteinske kinaze C). Moguće je da bi PRL mogao aktivirati PI3K preko višestrukih dodatnih puteva. PI3K bi mogla biti ciljna destinacija za Ras (76), a pokazano je da se regulacijska podjedinica p85 povezuje s nekoliko nizvodnih efektora i adaptora citokina i recep-tora čimbenika rasta uključujući Stat5, Stat3, IRS1 (inzulinski receptor-supstrat 1), Gab1 (vezujući protein 1 povezan s GRB2) i Gab2 (vezujući protein 2 povezan s GRB2), te SHP-2 (Src homologija-2 domena koja sadrži protein-tirozin-fosfatazu) (77,78). Fosfoinozitidi koje stvara PI3K stvaraju mjesta molekularnog modeliranja za Akt kao i njegove uzvodne kinaze. Metaboliti fosfoinozitida se možda također vežu za čimbenike izmjene gvanin-nukleotida uključujući i Vav, kao i za Tec, člana veće obitelji tirozin-kinaze. Konsti tu tivni kom ple ks Tec i Vav (79) povezuje se s PRLR u stanica raka T47D koje stimulira ligand (80). Aktivnost PRL unutar jezgre Neki podaci iz literature ukazuju na funkcionalnu ulogu PRL unutar


68

jezgre (81,82). Ti su podaci proturječni klasičnoj teoriji koja tvrdi da aktivnošću peptidnih hormona posreduju samo receptori na površini stanice. Međutim, podaci nedavno provedenih istraživanja otkrili su ulogu peptidil-prolil-izomeraze ciklofilina B (CypB) u nuklearnom transportu i funkciji PRL (82). Kompleks između PRL i CypB postoji u ljud skom se ru mu, veže se za PRLR i en-docitoziran je tijekom receptorske internalizacije. Unutar jezgre kompleks PRL/CypB djeluje kao transkripcijski pobuđivač na način da uključuje interakciju Stat5 s DNA tako da pokreće oslobađanje represora Stat5, odnosno PIAS3 (83). Aktivnost PRL kod modela glodavaca Uloga prolaktina kod raka dojke u glodavaca potkrijepljena je dokumentiranim podacima (1,84). Postoji izravna korelacija između hiperprolaktinemije uzrokovane lijekovima i pojačanog rasta tumora te hipoprolaktinemije i usporenog rasta tumora (1,85). Izloženost PRL poboljšava razvoj kemijski uzrokovanog raka dojke kod glodavaca (1,86,87). Prevelika ekspresija PRL kod transgenskih miševa s povećanom aktivacijom PRLR dovoljna je da uzrokuje stvaranje raka dojke kod starosti od 11-15 mjeseci (88,89). Izloženost estrogenu sa sekundarnim povećanjem koncentracije cirkulirajućeg PRL može prouzročiti ponovnu podložnost kemijskim kancerogenim tvarima kod već ranije skotnih ženki miševa (90). Možemo zaključiti da brojna istraživa nja pokazuju ulogu PRL u pojačava nju prihvaćanja kemijskih kancerogenih tvari kod mliječnih žlijezda glodavaca. Rak dojke kod žena i PRL – istraživanja in vivo Epidemiologija PRL i rak dojke kod žena Nekoliko epidemioloških istraživanja upućuju na to da PRL može također funkcionirati kao progresijski čimbenik raka dojke kod žena (8,91-93). U velikom se broju istraživanja proučavala povezanost između koncentracije PRL i nekoliko čvrsto potvrđenih čimbenika rizika oboljenja od raka dojke kao što su paritet i dob prilikom prvog poroda, dob kod prve menstruacije i menopauze, povijest raka doj ke u obi telji, ma mog rafska gustoća tki va, et ničke raz like, prehrambene navike, uzimanje lijekova i prolaktinomi. Čini se da se koncentracija PRL snižava sa svakom sljedećom trudnoćom (94,95). Također nije primijećena nezavisna povezanost između dobi kod prvog poroda i koncentra cije PRL (94). Nije se izvještava lo ni ti o značajnoj povezanosti između koncentracije PRL i dobi kod prve menstruacije, odnosno dobi kod nastupa menopauze (94,96). U podskupini s rizikom zbog obiteljske povijesti raka dojke,


69

bazalna koncentracija PRL u serumu bila je statistički značajno povišena (11). Međutim, u nekoliko drugih istraživanja (9496) jako je malo podataka pronađeno o povezanosti koncentracije PRL s poviješću raka dojke u obitelji. Više koncentracije PRL primijećene kod žena u menopauzi s većom gustoćom tkiva dojke (94,97) upućuju na mjerljiv utjecaj PRL na epitel dojke i/ili stromalnu proliferaciju. Nekoliko je istraživanja proučavalo koncentracije PRL i prehrambene navike (95,98), no još se čekaju sukladni rezultati. Poznato je da velik broj lijekova povećava (oralna kontracepcija, rezerpin, haldol, cimetidin i fenotiazini) ili smanjuje (levodop) koncentraciju PRL u plazmi. Dugoročna primjena oralne kontracepcije povećava rizik od raka dojke (99). Ci me ti din također povisuje kon centra ciju PRL, no neka objavljena istraživanja nisu ukazala na povezanost s rakom dojke (100). Kod žena s prolaktinomom je koncentracija PRL bila jako povišena. Međutim, samo je nekoliko prijavljenih slučajeva raka dojke kod žena ili muškaraca s prolaktinomom (101,102). Do sada je provedeno samo jedno manje kohortno istraživanje sa 67 ispitanica s prolaktinomom (103). Podaci jednog nedavno objavljenog istraživanja ukazali su na umjerenu pozitivnu povezanost između prolaktina i rizika od raka dojke među ženama od kojih je većina bila u menopauzi; međutim, potrebni su daljnji kontrolni pregledi kako bi se pojačala statistička snaga testa za analize u podskupinama (104). Nedavno su u jednom velikom višeetničkom kohortnom ispitivanju procijenjene genetičke varijacije u genima PRL i receptora PRL (PRLR) kao predskazateljima koncentracije PRL u plazmi i rizika od raka dojke među populacijom američkih crnkinja, rođenih Havajćanki, američkih Japanki, latinoamerikanki i bjelkinja (105). U toj opsežnoj analizi, koja je pokri va la 59 kb lo ku sa PRL i 210 kb lo ku sa PRLR, nije bilo statistički značajne povezanosti između uobičajene varijacije tih genskih kandidata i rizika od raka dojke ili koncentracije PRL u plazmi. Neravnoteža povezanosti (engl. linkage disequilibrium, LD) između PRL i PRLR u toj višeetničkoj populaciji ponudila je okvir za istraživanje tih gena u odnosu na ishode ostalih bolesti koje su povezivane s PRL kao i za opsežnija istraživanja koncentracije PRL u plazmi. Klinički podaci o povezanosti između PRL i raka dojke Fun kcija PRL u etio logiji i nap redova nju ra ka doj ke kod ljudi nije još sasvim razjašnjena. Podaci iz objavljene literature nisu sukladni, čak su i proturječni. Međutim, postoje značajni dokazi da bi PRL mogao imati određenu ulogu u raku dojke kod ljudi. Incidencija hiperprolaktinemije bila je značajno viša kod bolesnika s metastatskim rakom dojke nego kod bolesnika s nemetastatskim rakom ili s mastopatijom ili s uznapredovalim solidnim tumorom različite histologije (106). Hiperprolaktinemija je gotovo jedino bila


70

primijećena kod bolesnika s metastatskim rakom dojke tijekom napredovanja bolesti (8,107). Primijećeno je da je hiperpro-laktinemija važan pokazatelj nepovoljne prognoze kod bolesnika oboljelih od raka dojke sa zahvaćenim čvorovima (108). Rezultati jednoga drugog istraživanja ukazuju na moguću povezanost hiperprolaktinemije i prevelike ekspresije p53 s agresivnošću tumora, ranijim pogoršanjem zdravstvenog stanja ili pojavom metastaza ili lošom ukupnom stopom preživljavanja kod bolesnika oboljelih od raka dojke bez zahvaćenih čvorova (9). Kod bolesnika s rakom dojke, odnosno s primarnim tumorima stupnja II i III se nakon povećanja broja zahvaćenih limfnih čvorova značajno povećala učestalost PRL-pozitivnih tumora (109). S povećanjem veličine tumora primijećena je statistički značajnije češća pojava hiperprolaktinemije, kod bolesnika s hiperprolaktinemijom je rizik od razvoja povratne/metastatske bolesti bio značajno veći, a što se ozbiljnosti tiče, 8% njihovih tumora pokazalo je pozitivnu imunoreaktivnost s protutijelima PRL, što je ukazalo na činjenicu da tumori dojke proizvode PRL koji bi mogao djelovati kao lokalni promotor rasta (110). Rezultati nekih drugih istraživanja slažu se s prethodno spomenutim rezultatima. Koncentracija cirkulirajućeg PRL mogla bi biti vrlo korisna kao dijagnostički i prognostički biljeg kod bolesnika s rakom dojke (111) te vrijedan parametar prosudbe uspješnosti liječenja bolesnika s rakom dojke (112). Hiperprolaktinemija je pokazatelj napredovanja bolesti i nepovoljne prognoze kod bolesnika s metastatskim oblikom raka dojke (113,114). Koncentracija PRL u serumu je vjerojatno izravno ovisna o veličini primarnog tumora kod bolesnika s rakom dojke, pogotovo kod onih s hiperprolaktinemijom, no to nije pojava koja je ovisna o diferencijaciji (115). Međutim, suprotno tome, povišenje koncentracije cirkulirajućeg PRL uvjetovano operacijom bilo je povezano s duljim razdobljem preživljavanja bez bolesti kod opera-bilnih slučajeva raka dojke kod bolesnika s metastazama ili onih bez metastaza u pazušnoj jami (92,116). Konstitutivni onkogenski nizvodni prijenos signala ErbB2 i Ras stabilizira PRLR preko inhibicijske fosforilacije glikogenske sintaze-kinaze-3-beta (GSK3 beta) na Ser9. Važno je da inaktivacija GSK3-beta korelira s povišenom koncentracijom proteina PRLR u kliničkim uzorcima tkiva raka dojke kod ljudi (39). Povišena koncentracija prolaktina često se povezuje sa smanjenom koncentracijom spolnih hormona. Povezanost hiperprolaktinemije s reproduktivnim poremećajima, amenorejom i neredovitim menstrualnim ciklusima već je poznata od prije. Hiperprolaktinemija kod žena prije menopauze uzrokuje hipogonadizam koji se manifestira neplodnošću, oligomenorejom ili amenorejom i rjeđe galaktorejom (117). Kod bolesnica s menstrualnim problemima koncentracija PRL je viša nego kod žena s normalnom menstrual nom fun kcijom (118). Međutim, re zul tati jed nog nedavno provedenog istraživanja pokazuju da kod žena s hi per pro lakti ne


71

mijom i seksual nom disfun kcijom nije bilo hormonskih promjena u koncentraciji spolnih hormona (119). Nadalje, postoji mnogo proturječnosti s obzirom na povezanost ženskih spolnih steroida i raka. Ponovna procjena rezultata ranijih istraživanja koja podržavaju kancerogeni kapacitet estrogena otkrila je mnogo nedostataka i proturječnosti. Nedavno su klinička istraživanja hormonske nadomjesne terapije kod žena u postmenopauzi opravdale povoljan antikancerogeni učinak na nekoliko organa, uključujući i dojke kod žena. Novootkrivena povezanost nedostatka estrogena i rizika od raka usne šupljine također proturječi tradicionalnom konceptu raka uzrokovanog estrogenom. Međutim, karcinomi organa koji u visokoj mjeri ovise o estrogenu, kao što su dojke, endometrij i jajnici pojavljuju se u razdoblju prije i poslije menopauze. Usprkos različitim epidemiološkim podacima o tim dvjema skupinama raka, mehanizam poremećaja u regulaciji gena u podlozi inicijacije tumora ne može djelovati kroz potpuno oprečne putove (120). To ukazuje da je organima koji su u blažoj mjeri ovisni o estrogenu njegov ozbiljan nedostatak dovoljan za poremećaj u regulaciji gena, dok je organima kod kojih je ta ovisnost velika za to dovoljan čak i blagi nedostatak estrogena. Ti novi rezultati o raku povezanom s pušenjem te s hormonima mogu dovesti do istog obrata; ne estrogen, nego pomanjkanje estrogena može izazvati inicijaciju raka (120). Inhibicija aktivnosti PRL Smanjenje koncentracije PRLR farmakološkim ili genetičkim sredstvima u stanicama raka dojke kod ljudi dramatično smanjuje transformaciju i kancerogena svojstva tih stanica (121). Tamoksifen (TAM), terapija prvog izbora kod bolesnika s rakom dojke pozitivnim na receptore estrogena (ER-pozitivne) u razdoblju prije ili poslije menopauze, ima također antiprolaktinsko djelovanje (122). Antilaktogenska aktivnost TAM rezultat je njegove interakcije s antilaktogenskim veznim mjestom (engl. antilactogen binding site, ALBS) (123) koje je smješteno na recep toru PRL. ALBS pripada obitelji veznih mjesta povezanih s membranama visokog afiniteta nazvanima antiestrogenska vezna mjesta (engl. antiestrogen binding sites, AEBS) (124). Djelujući preko ALBS, antiestrogeni sprječavaju rast stanica koje odgovaraju na PRL čak i u odsutnosti ER (125,126). Rezultati ovih istraživanja upućuju da je ALBS u receptoru PRL i da TAM i drugi srodni antiestrogeni mogu spriječiti rast ER-negativnih stanica ljudskog raka dojke in vitro pomoću tog mehanizma (34). Ti podaci također ukazuju da bi se TAM i drugi srodni lijekovi koji djeluju na razini ciljanog tkiva mogli klinički koristiti u liječenju bolesnika s hiperprolaktinemijskim rakom dojke. Međutim, raloksifen, selektivni modulator estrogenskog receptora i


72

time i agens za sprječavanje raka dojke, nema značajnijeg učinka na koncentraciju PRL kod žena u razdoblju prije menopauze s visokim rizikom za raka dojke (127). Zaključak PRL sintetiziraju ljudske stanice raka dojke u kulturi, a djeluje u autokrinoj/parakrinoj petlji unutar tkiva dojke. I zdrave i maligne stanice dojke sadrže duge i kratke oblike PRLR. PRL stimulira citoskeletnu reorganizaciju i pokretnost stanica raka dojke. PRL može također utjecati na stvaranje raka dojke na način da modulira vaskularizaciju. O ulozi prolaktina kod raka dojke u glodavaca postoje brojni objavljeni dokazi opširna objavljena dokumentacija. Nekoliko epidemioloških istraživanja ukazalo je da bi PRL mogao funkcionirati kao čimbenik napredovanja raka dojke kod ljudi. Hiperprolaktinemija je pronađena gotovo isključivo kod bolesnika s metastatskim rakom dojke tijekom napredovanja bolesti, te je ustanovljeno da je važan pokazatelj nepovoljne prognoze kod bolesnika s rakom dojke i zahvaćenim limfnim čvorovima. Uzimajući sve ove podatke u obzir, može se zaključiti da je i endokrini i autokrini PRL uključen u nastanak raka dojke kod ljudi. Međutim, još je potrebno mnogo rada kako bi se razumjeli signalni putovi koje koristi PRL kako bi pospješio stvaranje tumora u stanicama dojke i interakcije tih signalnih kaskada i njihovih kompleksnih regulacijskih petlji s različitim onkogenima, čimbenicima rasta i hormonima važnima za razvoj raka u tkivu dojke. Nadalje, aktualan razvoj antagonista specifičnih za PRLR može iznjedriti nove terapijske strategije u liječenju raka dojke kod ljudi koje se temelje na blokiranju aktivnosti PRL na endokrinoj i autokrinoj/ parakrinoj razini. Adresa za dopisivanje: Zlata Mujagic Katedra za biokemiju Farmaceutski fakultet, Sveučilište u Tuzli Univerzitetska 1, 75000 Tuzla Bosna i Hercegovina e-pošta: [email protected]

Mujagić Z. et al. The role of prolactin in human breast cancer

73

The role of prolactin in human breast cancer Zlata Mujagić1, Nahida Srabović1, Hamza Mujagić2

1Department of Biochemistry, Faculty of Pharmacy, University of Tuzla, Bosnia and Herzegovina 2Massachusetts General Hospital and Harvard University, Boston, USA The role of prolactin in human breast cancer Abstract Much of the literature on human breast cancer and prolactin (PRL) appears to be contradictory. PRL has been first recognized as a hormone that plays an important role in breast cancer initiation and development in rodents, and, at least partly, in humans. Bioactive PRL is synthesized by human breast cancer cells in culture and acts in an autocrine/paracrine stimulatory loop within breast tissue. The actions of this ligand are mediated by PRL receptor (PRLR) isoforms found on, or secreted by, human breast epithelium. The PRL/PRLR complex associates with, and activates, several signaling pathways that are shared with other members of the cytokine receptor superfamily. Proximal PRLR signaling is initiated by three tyrosine kinases, namely Jak2, Src, and Tec. Some recent literature data have indicated a functional role for PRL within the nucleus where it acts in a complex with cyclophilin B as a transcrip-tional inducer. Several epidemiological studies have indicated that PRL may also function as a progression factor for human breast cancer. PRL might be an important local growth promoter involved in the pathogenesis of human breast cancer. Hyperprolactinemia could be an indicator of disease progression and poor prognosis and clinical approaches to controlling this disease need to incorporate antagonists of PRL/PRLR interaction or PRL receptor-associated signal transduction. Key words: prolactin; breast cancer; prolactin receptors; prolactin signaling pathways; hyperprolactinemia

Received: April 7, 2009 Accepted: July 3, 2009

Review


74

Introduction Accumulated data about the role of prolactin (PRL) in human breast cancer appear to be controversial. Thus, it has been difficult to establish definitive involvement of PRL in human breast disease. PRL was first recognized as a hormone that plays an important role in breast cancer initiation and development in rodents (1,2) and, at least partly, in humans. There is also firm evidence of a direct stimulatory role of PRL on mammary epithelial cells (3,4), and breast cancer cells in culture (5,6). There are also some epidemiological studies showing significant increase in serum PRL concentrations in certain subpopulations of brea st can cer patients (7-10), and in women at risk of developing familial breast cancer (9,11). This paper examines the basis for a claim that PRL has a contributory role during breast oncogenesis. Actions of PRL within mammarytissues – in vitro investi gations Synthesis and secretion of PRL by breast cancer cells Both endocrine and autocrine/paracrine sources of PRL have been recognized to exist in mammals. For many years, evidence in the literature has hinted at the possibility of an extrapituitary source of PRL. Evidence from the 1970’s indicated that hypophysectomized breast cancer patients had near-normal PRL levels (12,13), whereas immunohistochemistry studies revealed the expression of immunoreactive PRL protein in human breast epithelium (14). In addition, low levels of circulating PRL were found to persist in patients under pituitary hormone suppression therapy (15). Studies in the early 1990’s indicated that the mRNA for PRL could be found in normal and neoplastic human breast epithelium (16-18), and mammary epithelium from pregnant rodents (19,20). PRL is generated by tumors as well as by a variety of normal tissues. Pla-centa is the richest source of the extrapituitary PRL (21), and is responsible for its high level in human amniotic fluid. Immune system, uterus, brain and dermal fibroblasts also produce PRL (21-24). These findings led both Vonderhaar and Clevenger laboratories (17,18) to hypothesize and subsequently prove that PRL is synthesized and secreted in human breast tissues and cells. Bioactive PRL is synthesized by human breast cancer cells in culture and acts in an autocrine/paracrine stimulatory loop within breast tissue, suggesting a role for this hormone in the pathogenesis of breast cancer (17,18). The growth of both T47Dco (ER-negative) and MCF-7 (ER-positive) human breast cancer cells was inhibited after treatment with monoclonal antibodies raised against human pituitary PRL (17). In addition, antisense RNA


75

directed against the gene encoding for pituitary PRL significantly inhibited growth of T47Dco cel ls (25). The pre sen ce of the mRNA for PRL in T47Dco and MCF-7 was confirmed by RT-PCR (reverse transcription polymerase chain reaction) (17), and 82% of all tested breast cancer cell lines contained mRNA for PRL (25). Furthermore, the vast majority, i.e. 98% of human breast cancers synthesize PRL mRNA as detected by in situ hybridization (26). In addition, some studies revealed that more than 75% of primary breast cancer surgical samples also contain mRNA for PRL, and, in the majority of cases, the amount of mRNA for PRL and its receptors is significantly elevated in malignant vs. the adjacent, nonmalignant tissue from the same patient (16,25,27). PRL receptors (PRLR) The actions of PRL in the mammary gland require the presence of its cognate cell surface receptor, the PRLR. PRLR belongs to the cytokine hematopoietic family of receptors (28,29). The members of this superfamily are single membrane-spanning receptors with three domains: an extracellular ligand binding domain, a hydrophobic transmembrane domain, and an intracellular proline-ri-ch domain. There are at least three diffe re nt isofor ms of PRLR differing mainly in their cytoplasmic domain: long (90 kDa), intermediate, and short (40kDa) isoform. Long and short isoforms of PRLR are generated by differential splicing of a single gene and differ only in the length of the cytop las mic do main (30). The inter mediate fo rm is a deletion mutant of the long form, lacking 198 aminoacids in its cytoplasmic domain. The shortest PRLR isoform, the PRL binding protein (PRLBP) was identified in human serum (31) and it represents the freely circulating extracellular domain of the PRLR (32). All three isoforms promote mitosis (33). Both normal and malignant mammary cells contain both the long and short forms of PRLR (34,35), while the intermediate form is found in Nb2 lymphoma cells and is more sensitive to PRL compared wi th the other two for ms of PRLR (36). The inter mediate form of PRLR has been detected in breast tissue samples (37), in contrast to the results from another study (18). Advances in immunohistochemistry, in situ hybridization, and RT-PCR enabled increasingly sensitive estimation of the PRLR in human breast cancer, and results of some of the studies using these tec hno logies (26,35,37,38) have revealed that the hPRLR is expressed in up to 98% of all human breast cancers. The studies examining PRLR expression at the mRNA level have suggested an associa-tion with either ER/PR (estrogen/progesterone receptors) expression (38) or neoplasia (37); however, studies at the protein level have not confirmed these observations (26). The PRLR are commonly stabilized in human breast cancer due to decreased phosphorylation of residue Ser349 which, when phosphorylated,


76

recruits the beta Trcp E3 ubiquitin ligase and facilitates PRLR degradation (39). Neoplastic development and progression require deregulated cell proliferation, increased cellular survival, acquisition of an adequate vascular supply, and escape from constraints on motility. Despite evidence that PRL can trigger the growth and motility of human breast cancer cells, the inability of PRL to trigger differentiation remains uncertain. Potential mechanisms include alterations in Stat5 (signal transducer and activator of transcription) levels or phosphorylation, quantitative changes in the expression of various hPRLR isoforms, or alteration in the malignant epithelial cell’s responsiveness to the basement membrane, which could indirectly impact PRLR signaling (32). Because enhanced motility is one aspect of the me tastatic process, it has been questio ned whether PRL could serve as a chemoattractant for human breast cancer in vitro (40). PRL stimulates the cytoskeletal r-organization and motility of breast cancer cells. During PRLR signaling, Vav2 (guanine nucleotide exchange factor) becomes phosphorylated and activated, an event regulated by the serine/threonine kinase Nek3 (never in mitosis ge-ne a-related kinase 3) which contributes to PRL-mediated breast cancer motility through mechanisms involving Rac1 (guanine nucleotide exchange factor) activation and paxillin phosphorylation (41). PRL may also influence mammary carcinogenesis by modulating vascularization. It was shown that hPRL itself, as well as human GH, and placental hormones, could also stimulate formation of capillaries in the chicken chorioallantoic membrane assay (42). In contrast, a proteolytic cleavage product of PRL, 16K-PRL, is a potent antiangiogenic agent in vivo and in vitro (42-44). This N-terminal cleavage product of PRL inhibited endothelial cell proliferation in response to vascular endothelial growth factor (VEGF) and basic fibroblast growth factor (BFGF) by inhibiting the Ras-Raf1-MAPK signaling pathway and increasing expression of type 1 plasminogen activator inhibitor (42,45,46). These activities appear to be mediated by a receptor distinct from the PRLR (47). The induction of VEGF by PRL is PRLR-, Jak2-, and MAP kinase-dependent. PRL induces VEGF expression through Erg-1 (ether-a-gogo-related gene 1 encoded K

+ channels), and implicates VEGF

as an intermediary of PRL-regulated angiogenesis (48). The role of PRL in breast cancer is complicated by the fact that PRL itself is angiogenic, but proteases cleave PRL to generate vasoinhibins, a family of peptides that act on endothelial cells to suppress angiogenesis and vasodilation and to promote apoptosis-mediated vascular regression (49). PRL/PRLR signaling pathways Upon PRL-induced receptor dimerization, several different kinases


77

are activated to transduce the hormonal signal. Proximal PRLR signaling is initiated by three tyrosine kinases, namely Jak2 (Janus kinase), Src (sarcoma), and Tec (protein tyrosine kinase) (32). These kinases belong to the Janus family of kinases (Jak family). Multiple additional downstream pathways, such as Src family kinases, Ras-MAPKs (rat sacoma-mitogen-activated protein kinases), and PI3K (phosphoinositide 3 kinase) are involved in PRL signaling (50) (Figure 1). Although it is not clear that all PRL signaling requires Jak2 as a proximal intermediate (50,51), a great deal of evidence in many cell types supports a key role for this kinase in many actions of PRL (52,53). Jak2 phosphorylates multiple substrates, including the PRLR and Jak2 themselves. This provides docking sites for proteins with SH2 (src homology2) do mains, including Stats.

FIGURE 1. Aspects of PRLR signaling pathways. PRL-induced receptor dimerization induces the association of the Jak2 kinase, resulting in the activation of Jak2, PRLR phosphorylation, and the association and phosphorylation of Stat5. Signaling through the SHC/GRB2/Ras/Raf/ MEK/MAPK pathway also directly stimulates proliferation and modulates Stat activity. The complex between the Tec tyrosine kinase and the Vav family of guanine nucleotide exchange factors also inducibly associates with ligand-bound PRLR resulting in its activation and stimulation of cellular motility (modified according to ref. 32). The binding of PRL to its receptors induces tyrosine phosphorylation of cytoplasmic transcription factors, mainly Stat family members (32,54). Activation of Stat proteins results in their translocation to the nucleus, and subsequent activation of gene transcription (32,55). Stat1, Stat3 and Stat5 are activated in T47D cells within 15 min of PRL treatment (56). Several studies have


78

demonstrated increased levels of Stats1 and 3 in primary mammary tumors (57,58). However, their target genes in oncogenic processes, the relative importance of PRL in their regulation, and differences from the normal mammary gland have not been understood. Both Stats3 and 5 are involved in PRL acti-vation of the cyclin D1 promoter (59), suggesting at least one target of PRL through this pathway that could contribute to tumorigenesis. It has been demonstrated (60) that Stat5b, rather than Stat5a, is a potent mediator of Src-induced tumorigenesis. As discussed above, tyrosine phosphorylation by a receptor-associated Jak2 kinase results in the dimerization/multimerization and nuclear retrotranslocation of the Stat complex where it engages its cognate DNA binding sequence, resulting in promoter transactivation under appropriate conditions (32,61). Whereas PRL stimulated tyrosine phosphorylation and nuclear translocation of both Stats5a and 5b, Src activation resulted in tyrosine phosphorylation of both Stats5a and 5b, but nuclear translocation of only Stat5b (62). PRL has been shown to activate Src in a variety of cell types, including rat liver (63). Results from some recent studies indicate that proto-oncogene c-Myc potentiates Stat5adriven gene expression, possibly functioning as a Stat5a coactivator in human breast cancer (54,64). Furthermore, PRL stimulates ubiquitination, internalization, and degradation of its receptors via catalytic activation of Jak2 (65), and it seems that Ser349 phosphorylation of PRLR is essential event in this complex Jak2-mediated signaling. Ras-Raf-MAPK pathway Ras-Raf-MAPK signaling pathway is a mechanism by which a varie ty of growth factors and cytokines mediate their proliferation action. Raf1 (mitogen activated protein kinase kinase kinase), MEK (mitogen activated protein kinase kinase), and MAP (mitogen activated protein kinase) are downstream kinases in this signaling pathway. Signaling through the SHC/GRB2/Ras/Raf/MEK/MAPK pathway (SHC-adaptor protein; GRB2-growth factor receptor-binding protein2; Ras-rat sarcoma) also directly stimulates proliferation and modulates Stat activity. PRL has been shown to activate this pathway in a number of PRL-dependent models (66), and mammary tumor cell lines (67-69), as well as nor mal mou se mam ma ry epit helial cells (68,69). PRL can also synergistically activate this pathway via cross-talk with other growth factors, depending on the phenotype of the tumor cell. PRL-induced activation of Jak2 resulted in tyrosine phosphorylation of erbB2, thereby increasing association wi th Grb2, and activating the Ras-MAPK pathway (70) including phosphorylation of some transcription factors and thus increasing synthesis of the products


79

of the fos gene family. Cross-talk between the Stat and MAPK pathways at other points has been well documented for many cytokines, including PRL (71). MAPKs are able to phosphorylate Stats on serine and threonine residues, which augments the activities of Stats1 and 3 (72). PI3K (phosphoinositide 3 kinase) pathways The complex between the Tec tyrosine kinase and the Vav family of guanine nucleotide exchange factors also inducibly associates with ligand-bound PRLR. This leads to the exchange of GDP for GTP on the small G protein Ras, resulting in its activation and stimulation of cellular motility. Activation of tyrosine kinases Tec and Akt (PKBprotein kinase B) is directly linked to the PRL-induced activation of PI3K. The phosphatase SHP-2 also binds to PRLR and potentiates its activity. Activation of PI3K generates phosphoinositides that serve as second messengers and can regulate multiple pathways important in onco genesis, including proliferation and cytoskeletal rearrangements, as well as inhibition of apoptosis and angiogenesis (73-75). Activation of phosphoinositide cycle results in the stimulation of PKC (protein kinase C) pathway. PI3K could potentially be activated by PRL through multiple additional pathways. It can be a target of Ras (76), and the p85 regulatory subunit has been shown to associate with several downstream effectors and adaptors of cytokine and growth factor receptors, including Stat5, Stat3, IRS1 (insulin receptor substrate 1), Gab1 (GRB2-associated binding protein 1) and Gab2 (GRB2-associated binding protein 2), and SHP-2 (Src homology-2 domain-containing protein-tyrosine phosphatase) (77,78). PI3K-generated phosphoinositides provide docking sites for Akt, as well as its upstream kinases. Phosphoinositide metabolites may also bind to guanine nucleotide exchange factors, including Vav, as well as to Tec, a member of a larger family of tyrosine kinases. A constitutive complex of Tec and Vav (79) associates with PRLR in ligand-stimulated T47D (80). Intranuclear action of PRL Some literature data have indicated a functional role for PRL within the nucleus (81,82). These data stand in contrast with the classic theory that postulates that peptide hormone action is mediated only by cell surface receptors. Recent data, however, have revealed a role for the peptidyl prolyl isomerase cyclophilin B (CypB) in the nuclear transpo rt and fun ction of PRL (82). A com plex between PRL and CypB is found in human serum, binds to the PRLR, and is endocytosed during receptor internalization. The PRL/CypB complex acts within the nucleus as a transcriptional inducer by


80

facilitating the interaction of Stat5 with DNA by inducing the release of a repressor of Stat5, namely PIAS3 (83). Rodent models of PRL action Prolactin’s role in rodent mammary cancer has been well documented (1,84). There is a direct correlation between dru g-in du ced hyper pro lacti ne mia and in crea sed tu mor growth, and hypoprolactinemia and retarded tumor growth (1,85). PRL exposure enhances the development of chemically induced mammary cancers in rodents (1,86,87). Overexpression of PRL in transgenic mice with increased activation of the PRLR is sufficient to induce the formation of mammary cancers at 11–15 months of age (88,89). Exposure to estrogen with secondary increases in circulating PRL levels is able to restore susceptibility to chemical carcinogens in parous mice (90). In summary, numerous studies point to a role for PRL in increasing receptiveness to chemical carcinogens in rodent mammary glands. Human breast cancer and PRL – in vivo investigations Epidemiology of PRL and human breast cancer Several epidemiological studies have indicated that PRL may also function as a progression factor for human breast cancer (8,91-93). A number of studies have evaluated the association between PRL levels and several well-confirmed breast cancer risk factors such as parity and age at first birth, age at menarche and menopause, family history of breast cancer, mammographic density, ethnic differences, dietary intake, medication use, and prolactinomas. PRL levels appear to decrease, at least modestly, with each additional pregnancy (94,95). Also, no independent association between age at first birth and PRL level was observed (94). Overall, no significant associations between PRL and either age at menarche or age at menopause were reported (94,96). In a subset of subjects at risk with family history of breast cancer, basal serum PRL levels were significantly elevated (11). However, several other studies (94-96) offered scanty data to support association of the family history of breast cancer with PRL concentration. Increased PRL levels were observed in postmenopausal women with increased breast tissue density (94,97), suggesting a measurable influence of PRL on breast epithelial and/or stromal proliferation. Several studies evaluated PRL levels and dietary intake (95,98) but consistent findings are yet to be reported. A number of medications are known to increase (e.g., oral contraceptives, reserpine, haldol, cimetidine, and the phenothiazines) or decrease (e.g., levodo pa) plas ma PRL levels. Long-term use of oral contraceptives


81

increases the risk of breast cancer (99). Cimetidine also increases PRL levels, but a few studies published have not shown any meaningful link with breast cancer (100). Women with prolactinomas have greatly elevated PRL levels. However, only a few case reports of breast cancer in women or men with prolactinomas (101,102) and a small cohort study of 67 women with prolactinomas (103) have been published to date. Data of one recent study suggest modest positive association between prolactin and breast cancer risk among predominately premenopausal women; however, further follow-up is needed to increase statistical test power for subgroup analyses (104). Genetic va riations in PRL and PRL recep tor (PRLR) ge nes as predictors of plasma PRL levels and breast cancer risk among African-American, native Hawaiian, Japanese-American, Latin, and white women were evaluated recently in a large multiethnic cohort study (105). In this comprehensive analysis covering 59 kb of the PRL locus and 210 kb of the PRLR locus, no significant association was fou nd between com mon va riation in the se can di da te genes and breast cancer risk or plasma PRL levels. The LD (linkage disequilibrium) characterization of PRL and PRLR in this multiethnic population provides a framework for studying these genes in relation to other disease outcomes that have been associated with PRL, as well as for larger studies of plasma PRL levels. Clinical data about the association of PRL with breast cancer The fun ction of PRL in the etio logy and progres sion of human breast cancer is not yet clear, and literature data are not consistent but, are even contra dictory. However, there is significant evidence that PRL may play a role in human breast cancer. The in ci den ce of hyper pro lacti ne mia was sig ni ficantly higher in patients with metastatic breast cancer than in patients with non-metastatic breast cancer, or with mastopathy, or with advanced solid tumors of different histology (106). Hyperprolactinemia was almost exclusively found in patients with metastatic breast cancer during the course of the disease (8,107). Hyperprolactinemia was found to be an important indicator of unfavorable prognosis in node-positive breast cancer patients (108). Results of another study indicated the possible association of hyperprolactinemia and overexpression of p53 with aggressiveness of the tumor, early disease relapse or me-tastases, and poor overall survival in node-negative breast cancer patients (9). In primary tumors of stage II and stage III breast cancer patients, there was a significant increase in the frequency of PRL-positive tumors upon increase in the number of involved


82

lymph nodes (109). With increasing tumor size, a significantly increased incidence of hyperprolactinemia was observed, hyperprolactinemic patients had a significantly increased risk of developing recurrent/metastatic disease, and seventy-eight per cent of their tumors showed positive immunoreactivity with PRL antibody indicating that breast tumors produce PRL which may act as a major local growth promoter (110). Results of some other studies are in agreement with those mentioned above. Circulating levels of PRL might be very useful diagnostic and prognostic marker in breast cancer patients (111), and a valuable parameter to assess treatment efficacy in breast carcinoma patients (112). Hyperprolactinemia is an indicator of disease progression and poor prognosis in metastatic breast cancer patients (113,114). Serum levels of PRL probably directly depend on the size of primary tumor in breast cancer patients, especially in those with hyperprolactinemia, but this is not a differentiation-dependent phenomenon (115). In contrast, a surgery-induced rise in circulating PRL was as sociated wi th pro lon ged disea se-free survi val in operable breast carcinoma patients with or without axillary metastases (92,116). Constitutive oncogenic signaling downstream of ErbB2 and Ras stabilizes PRLR via inhibitory phosphorylation of glycogen synthase kinase 3 beta (GSK3 beta) on Ser9. Importantly, inactivation of GSK3 beta correlates with elevated levels of PRLR protein in clinical human breast cancer specimens (39). Increased prolactin levels are often associated with decreased sexual hormone levels. Association of hyperprolactinemia with reproductive disorders, amenorrhea and irregular menstrual cycles has already been known. Hyperprolactinemia in premenopausal women causes hypogonadism manifested by infertility, oligomenorrhea or amenorrhea and less often by galactorrhea (117). Patients with menstrual disturbances had higher PRL levels than women with normal menstrual function (118). However, results of one recent study have shown that no hormonal changes in serum levels of sexual hormones were found in women with hyperprolactinemia and sexual dysfun ction (119). Further mo re, the re are ma ny contradictions concerning the association of female sexual steroids with cancer. Re-evaluation of earlier results supporting the carcinogenic capacity of estrogen has exhibited many shortcomings and controversies. Recently, clinical studies on hormone replacement therapy in postmenopausal women have justified beneficial anticancer effects in several organs, even in the female breast. The newly revealed association between estrogen deficiency and oral cancer risk also means a contradiction with regard to the traditional concept of estrogen-induced cancer. However cancers of highly estrogen dependent organs such as breast, endometrium and ovary exhibit both premenopausal and postmenopausal occurrence. In spite of different epidemiological


83

data of these two groups of cancers, the mechanism of gene regulation disorder in the background of tumor initiation cannot act through entirely opposite pathways (120). This suggests that serious estrogen deficiency in moderately estrogen sensitive organs, and even mild estrogen deficiency in highly estrogen dependent organs is enough to provoke gene regulation disorders. New findings both on smoking-and hormone related cancers might lead to the same reversal; estrogen deficiency rather than estrogen itself may provoke cancer initiation (120). Inhibition of PRL action A decrease in PRLR levels achieved by either pharmacologic or genetic means in human breast cancer cells dramatically reduced transformation and tumorigenic properties of these cells (121). Tamoxifen (TAM), the first line of therapy in pre- and postmenopausal ER (estrogen receptor)-positive breast cancer patients also has an an-ti-prolactin action (122). Antilactogenic activity of TAM results from its interaction with the antilactogen binding site (ALBS) (123) which is located on the PRL receptor. ALBS is a member of the family of high affinity membrane-associated binding sites called antiestrogen binding sites (AEBS) (124). Antiestrogens, acting through the ALBS, inhibit the growth of PRL-responsive cells even in the absence of ER (125, 126). The results of these studies indicate that ALBS is in the PRL receptor, and that TAM and other related anti-estrogens may inhibit the growth of ER-negative human breast cancer cells in vitro through this mechanism (34). These data also suggest that TAM and other related drugs that act at the level of target tissue may be clinically useful in the treatment of hyperprolactinemic breast cancer patients. However, raloxifene, a selective estrogen receptor modulator and thus a breast cancer prevention agent, had no significant effect on PRL levels in premenopausal women at high risk for developing breast cancer (127). Conclusions PRL is synthesized by human breast cancer cells in culture, and acts in an autocrine/paracrine stimulatory loop within breast tissue. Both normal and malignant mammary cells contain both long and short forms of PRLR. PRL stimulates the cytoskeletal re-organization and motility of breast cancer cells. PRL may also influence mammary carcinogenesis by modulating vascularization. Prolactin’s role in rodent mammary cancer has been well documented. Several epidemiological studies have indicated that


84

PRL may also function as a progression factor for human breast cancer. Hyperprolactinemia was almost exclusively found in patients with metastatic breast cancer during the course of the disease, and it was found to be an important indicator of unfavorable prognosis in node-positive breast cancer patients. Taking into account all these data it could be concluded that both endocrine and autocrine PRL are involved in human breast carcinogenesis. However, much more work is needed to understand the signaling pathways used by PRL to promote tumorigenesis in mammary cells, and interactions of these signaling cas ca des and their com plex regu latory loops with diffe-rent oncogenes, growth factors and hormones important in mammary carcinogenesis. Furthermore, the ongoing development of PRLR-specific antagonists may yield novel therapeutic strategies in treatment of human breast cancer based on blocking PRL actions at the endocrine and autocrine/paracrine levels. Corresponding author: Zlata Mujagic Department of Biochemistry Faculty of Pharmacy, University of Tuzla Univerzitetska 1, 75000 Tuzla Bosnia and Herzegovina e-mail: [email protected]


85

Literatura/References

1. Welsch C, Nagasawa H. Prolactin and murine mammary tumorigenesis: a review. Cancer Res 1977;37:951-63.

2. Mershon J, Sall W, Mitchner N, Ben-Jonathan N. Prolactin is a local growth factor in rat mammary tumors. Endocrinology 1995;136: 3619-23.

3. Imagawa W, Tomooka Y, Hamamoto S, Nandi S. Stimulation of mammary epithelial cell growth in vitro: interaction of epidermal growth factor and mammogenic hormones. Endocrinology 1995;116:1514-24.

4. Vonderhaar BK. Prolactin: transport, function, ad receptors in mammary gland development and differentiation. In: Neville MC, Daniel CW, eds. The mammary gland. New York (NY): Plenum Publishing Corporation; 1987;383-483.

5. Das R, Vonderhaar BK. Prolactin as a mitogen in mammary cells. J Mammary Gland Biol Neoplasia 1997;2:29-39

6. Vonderhaar BK. Prolactin: the forgotten hormone of human breast cancer. Pharmacol Ther 1998;79:169-78.

7. Bonneterre J, Peyrat JP, Beuscart R, Demaille A. Biological and clinical aspects of prolactin receptors in human breast cancer. J Steroid Biochem Mol Biol 1990;37:977-81.

8. Holtkamp W, Nagel GA, Wander HE, Rauschecker HF, von Heyden D. Hyperprolactinemia is a indicator of progressive disease and poor prognosis in advanced breast cancer. Int J Cancer 1984;34:323-8.

9. Patel DD, Bhatavdekar JM, Chikhlikar PR, Ghosh N, Suthar TP, Shah NG, et al. Node negative breast carcinoma: hyperprolactinemia and/ or overexpression of p53 as an independent predictor of poor prognosis compared to newer and established prognosticators. J Surg Oncol 1996;62:83-92.

10. Bhatavdekar JM, Patel DD, Shah NG, Vora HH, Suthar TP, Ghosh N, et al. Prolactin as a local growth promoter in patients with breast cancer: GCRI experience. Eur J Surg Oncol 2000;26:540-7.

11. Love RR, Rose DR, Surawicz TS, Newcomb PA. Prolactin and growth hormone levels in premenopausal women with breast cancer and healthy women with a strong family history of breast cancer. Cancer 1991;68:1401-5.

12. Lachelin GCL, Yen SSC, Alksne JFN. Hormonal changes following hy-pophysectomy in humans. Obstet Gynecol 1977;50:333-9.

13. Manni A, Pearson OH, Brodkey J, Marshall JS. Transsphenoidal hypophysectomy in breast cancer: evidence for an individual role of pituitary and gonadal hormones in supporting tumor growth. Cancer 1979;44:2330-7.

14. Nolin JM, Witorsch RJ. Detection of endogenous immunoreactive prolactin in rat mammary epithelial cells during lactation. Endocrinology 1976;99:949-58.

15. Anderson E, Ferguson JE, Morten H, Shalet SM, Robinson EL, Howell A. Serum immunoreactive and bioactive lactogenic hormones in advanced breast cancer patients treated with bromocriptine and octreotide. Eur J Cancer 1993;29A:209-17.

16. Fields K, Kulig E, Lloyd RV. Detection of prolactin messenger RNA in mammary and other normal and neoplastic tissues by polymerase chain reaction. Lab Invest 1993;68:354-60.

17. Ginsburg E, Vonderhaar BK. Prolactin synthesis and secretion by human breast cancer cells. Cancer Res 1995;55:2591-5.

18. Clevenger CV, Chang W-P, Ngo W, Pasha TLM, Montone KT, Tomaszewski JE. Expression of prolactin and prolactin receptor in human breast carcinoma: evidence for an autocrine/paracrine loop. Am J Pathol 1995;146:695-705.

19. Kurtz A, Bristol LA, Toth BE, Lazar-Wesley E, Takacs L, Kacsoh B. Mammary epithelial cells of lactating rats express prolactin messenger ribonucleic acid. Biol Reprod 1993;48:1095-103.

20. Steinmetz RW, Grant AL, Malven PV. Transcription of prolactin gene in milk secretory cells of the rat mammary gland. J Endocrinol 1993;136:271-6.

21. Sinha YN. Structural variants of prolactin: occurrence and physiological significance. Endocr Rev 1995;16:354-69.

22. Clevenger CV, Russell DH, Appasamy PM, Prystowsky MB. Regulation of IL-2-driven T-lymphocyte proliferation by prolactin. Proc Natl Acad Sci USA 1990;87:6460-4.

23. Gellerson R, Kempf R, Teglmann R, DiMattia GE. Nonpituitary human prolactin gene transcription is indenpendent of pit-1 and differentially controlled in lymphocytes and in endometrial stroma. Mol Endocrinol 1994;8:356-73.

24. Richards RG, Hartman SM. Human dermal fibroblast cells express prolactin in


86

vitro. J Invest Dermatol 1996;106:1250-5 25. Ginsburg E, Das R, Vonderhaar BK. Prolactin: an autocrine growth factor in the

mammary gland. In: Wilde CJ, Peaker M, Taylor E, eds. Biological Signalling in the Mammary Gland. Ayr, Scotland: Hannah Research Institute; 1997;47-58.

26. Reynolds C, Montone KT, Powell CM, Tomaszewski JE, Clevenger CV. Distribution of prolactin and its receptor in human breast carcinoma. Endocrinology 1997;138:5555-60.

27. Touraine P, Martini JF, Zafrani B, Durand JC, Labaille F, Malet C, et al. Increased expression of prolactin receptor gene assessed by quantitative polymerase chain reaction in human breast tumors versus normal breast tissue. J Clin Endocrinol Metab 1998;83:667-74.

28. Bazan JF. Structural design and molecular evolution of a cytokine receptor superfamily. Proc Natl Acad Sci USA 1990;87:6934-8.

29. Kelly PA, Djiane J, Postel-Vinay MC, Edery M. The prolactin/growth hormone receptor family. Endocr Rev 1991;12:235-51.

30. Kelly PA, Ali S, Rozakis M, Goujon L, Nagano M, Pellergini I, et al. The growth hormone/prolactin receptor family. Recent Prog Horm Res 1993;48:123-64.

31. Kline JB, Clevenger CV. Identification and characterization of the prolactin-binding protein (PRLBP) in human serum and milk. J Biol Chem 2001;276:24760-6.

32. Clevenger CV, Furth PA, Hankinson SE, Schuler LA. The role of prolactin in mammary carcinoma. Endocr Rev 2003;24:1-27.

33. Das R, Vonderhaar BK. Transduction of prolactin’s growth signal through both the long and short forms of the prolactin receptor. Mol Endocrinol 1995;9:1750-9.

34. Vanderhaar BK. Prolactin involvement in breast cancer. Endocrine-Related Cancer 1999;6:389-404.

35. Gill S, Peston D, Vonderhaar BK, Shousha S. Expression of prolactin receptors in normal, benign, and malignant breast tissue: an immunohistological study. J Clin Pathol 2001;54:956-60.

36. Ali S, Edery M, Pellegrini I, Lesueur L, Paly J, Djiane J, Kelly PA. The Nb2 form of prolactin receptor is able to activate a milk protein gene promoter. Mol Endocrinol 1992;6:1242-8.

37. Mertani HC, Garcia-Caballero T, Lambert A, Gerard F, Palayer C, Boutin JM, et al. Cellular expression of growth hormone and prolactin receptors in human breast disorders. Int J Cancer 1998;79:201-11.

38. Ormandy CJ, Hall RE, Manning DL, Robertson JFR, Blamey RW, Kelly PA, et al. Coexpression and cross-regulation of the prolactin receptor and sex steroid hormone receptors in breast cancer. J Clin Endocrinol Metab 1997;82:3692-9.

39. Plotnikov A, Li Y, Tran TH, Tang W, Palazzo JP, Rui H, Fuchs SY. Oncogene-mediated inhibition of glycogen synthase kinase 3 beta impairs degradation of prolactin receptor. Cancer Res 2008;68:1354-61.

40. Maus MV, Reilly SC, Clevenger CV. Prolactin as a chemoattractant for human breast carcinoma. Endocrinology 1999;140:5447-50.

41. Miller SL, Antico G, Raghunath PN, Tomaszewski JE, Clevenger CV. Nek3 kinase regulates prolactin-mediated cytoskeletal reorganization and motility of breast cancer cells. Oncogene 2007;26:4668-78.

42. Struman I, Bentzien F, Lee H, Mainfroid V, D’Angelo G, Goffin V, et al. Opposing actions of intact and N-terminal fragments of the human prolactin/growth hormone family members on angiogenesis: an efficient mechanism for the regulation of angiogenesis. Proc Natl Acad Sci USA 1999;96:1246-51.

43. Ferrara N, Clapp C, Weiner R. The 16K fragment of prolactin specifically inhibits basal or fibroblast growth factor stimulated growth of capillary endothelial cells. Endocrinology 1991;129:896-900.

44. Clapp C, Martial JA, Guzman RC, Rentier-Delrue F, Weiner RI. The 16-kilodalton N-terminal fragment of human prolactin is a potent inhibitor of angiogenesis. Endocrinology 1993;133:1292-9.


87

45. D’Angelo G, Martini JF, Iiri T, Fantl WJ, Martial J, Weiner RI. 16K human prolactin inhibits vascular endothelial growth factor-induced activation of Ras in capillary endothelial cells. Mol Endocrinol 1999;13: 692-704.

46. Lee H, Struman I, Clapp C, Martial J, Weiner RI. Inhibition of urokinase activity by the antiangiogenic factor 16K prolactin: activation of plasminogen activator inhibitor 1 expression. Endocrinology 1998;139:3696-703.

47. Clapp C, Weiner R. A specific, high affinity, saturable binding site for the 160 kilodalton fragment of prolactin on capillary endothelial cells. Endocrinology 1992;130:1380-6.

48. Goldhar AS, Vonderhaar BK, Trott JF, Hovey RC. Prolactin-induced expression of vascular endothelial growth factor via Erg-1. Mol Cell Endocrinol 2005;232:9-19.

49. Clapp C, Thebault S, de la Escalera GM. Role of prolactin and vasoinhibins in the regulation of vascular function in mammary gland. J Mammary Gland Biol Neoplasia 2008;13:55-67.

50. Rane SG, Reddy EP. Janus kinases: components of multiple signaling pathways. Oncogene 2000;19:5662-79.

51. Clevenger CV, Kline JB. Prolactin receptor signal transduction. Lupus 2001;10:706-18.

52. Yu-Lee LY, Luo GY, Book ML, Morris SM. Lactogenic hormone signal transduction. Biol Reprod 1998;58:295-301.

53. Bole-Feysot C, Goffin V, Edery M, Binart N, Kelly PA. Prolactin (PRL) and its receptor: actions, signal transduction pathways and phenotypes observed in PRL receptor knockout mice. Endocr Rev 1998;19:225-68.

54. Fang F, Antico G, Zheng J, Clevenger CV. Quantification of PRL/STAT 5 signaling with a novel pGL4-CISH reporter. BMC Biotechnology 2008;8:11.

55. Darnell Jr JE, Kerr IM, Stark GR. Jak-STAT pathways and transcriptional activation in response to IFNs and other extracellular signaling proteins. Science 1994;264:1415-21.

56. DaSilva L, Rui H, Erwin RA, Howard OMZ, Kirken RA, Malabarba MG, et al. Prolactin recruits STAT1, STAT3, and STAT5 independent of conserved receptor tyrosine TYR402, TYR479, TYR515 and TYR 580. Mol Cell Endocrinol 1996;117:131-40.

57. Watson CJ, Miller WR. Elevated levels of members of the STAT family of transcription factors in breast carcinoma nuclear extracts. Br J Cancer 1995;71:840-4.

58. Bowman T, Garcia R, Turkson J, Jove R. STATs in oncogenesis. Oncogene 2000;19:2474-88.

59. Brockman JL, Schroeder MD, Schuler LA. Prolactin activates the cyclin D1 promoter via the JAK2-STAT pathway. Mol Endocrinol 2002;16:774

60. Kazansky AV, Rosen JM. Signal transducers and activators of transcription 5B potentiate v-Src-mediated transformation of NIH-3T3 cells. Cell Growth Differ 2001;12:1-7.

61. Liu X, Robinson GW, Gouilleux F, Groner B, Henninghausen L. Cloning and expression of Stat5 and an additional homologue (Stat 5b) involved in prolactin signal transduction in mouse mammary tissue. Proc Natl Acad Sci USA 1995;92:8831-5

62. Kazansky AV, Kabotyanski EB, Wsyzomierski SL, Mancini MA, Rosen JM Differential effects of prolactin and src/abl kinases on the nuclear translocation of STAT5B and STAT5A. J Biol Chem 1999;274:22484-92.

63. Berlanga JJ, Vara JAF, Martín-Pérez J, García-Ruiz JP. Prolactin receptor is associated with c-src kinase in rat liver. Mol Endocrinol 1995;9:1461-7.

64. Fang F, Rycyzyn MA, Clevenger CV. Role of c-Myb during prolactin-induced signal transducer and activator of transcription 5a signaling in breast cancer cells. Endocrinology 2009;150:1597-606.

65. Swaminathan G, Varghese B, Thangavel C, Carbone CJ, Plotnikov A, Kumar KG, et al. Prolactin stimulates ubiquitination, initial internalization, and degradation of its receptor via catalytic activation of Janus kinase 2. Endocrinology 2008;196:R1-7.

66. Clevenger CV, Torigoe T, Reed JC. Prolactin induces rapid phosphorylation and activation of prolactin receptor associated Raf-1 kinase in a T-cell line. J Biol Chem 1994;269:5559-65.

67. Llovera M, Pichard C, Bernichtein S, Jeay S, Touraine P, Kelly PA, Goffin V. Human prolactin (hPRL) antagonists inhibit hPRL-activated signa ling pathways involved in breast cancer cell proliferation. Oncogene 2000;19:4695-705.

68. Das R, Vonderhaar BK. Activation of raf-1 MEK, and MAP kinase in prolactin responsive mammary cells. Breast Cancer Res Treat 1996;40:141-9.


88

69. Das R, Vonderhaar BK. Involvement of SHC, GRB2, SOS and RAS in prolactin signal transduction in mammary epithelial cells. Oncogene 1996;13:1139-45.

70. Yamauchi T, Yamauchi N, Ueki K, Sugiyama T, Waki H, Miki H, et al. Constitutive tyrosine phosphorylation of ErbB-2 via Jak2 by autocrine secretion of prolactin in human breast cancer. J Biol Chem 2000;275:33937-44. Gao J, Horseman ND. Prolactin-independent modulation of the ß-casein response element by Erk2 MAP kinase. Cell Signal 1999;11:205-10.

71. Gao J, Horseman ND. Prolactin-independent modulation of the ß-casein response element by Erk2 MAP kinase. Cell Signal 1999;11:205-10.

72. Decker T, Kovarik P. Serine phosphorylation of STATs. Oncogene 2000;19:2628-37.

73. Roymans D, Slegers H. Phosphatidylinositol 3-kinases in tumor progression. Eur J Biochem 2001;268:487-98.

74. Blume-Jensen P, Hunter T. Oncogenic kinase signalling. Nature 2001; 11:355-65. 75. Cantrell DA. Phosphoinositide 3-kinase signalling pathways. J Cell Sci

2001;114:1439-45. 76. Rodriguez-Viciana P, Marte BM, Warne PH, Downward J. Phosphatidylinositol 3’

kinase: one of the effectors of Ras. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci 1996;351:225-31.

77. Constantino S, Santos R, Lacronique V, Bouchaert I, Monni R, Bernard O, et al. Constitutively active STAT5 variants induce growth and survival of hematopoietic cells through a PI 3-kinase/Akt dependent pathway. Oncogene 2001;20:2080-90

78. Craddock BL, Hobbs J, Edmead CE, Welham MJ. Phosphoinositide 3-kinase-dependent regulation of interleukin-3-induced proliferation: involvement of mitogen-activated protein kinases, SHP2 and Gab2. J Biol Chem 2001;276:24274-83.

79. Kline JB, Moore DJ, Clevenger CV. Activation and association of the Tec tyrosine kinase with the human prolactin receptor: mapping of a Tec/ Vav1-receptor binding site. Mol Endocrinol 2001;15:832-41.

80. Clevenger CV, Ngo W, Luger SM, Gewirtz AM. Vav is necessary for prolactin-stimulated proliferation and is translocated into the nucleus of a T-cell line. J Biol Chem 1995;270:13246-53.

81. Clevenger CV, Altmann SW, Prystowsky MB. Requirement of nuclear prolactin for interleukin-2-stimulated proliferation of T lymphocytes. Science 1991;253:77-9.

82. Rycyzyn MA, Reilly SC, O’Malley K, Clevenger CV. Role of cyclophilin B in PRL signal transduction and nuclear retrotranslocation. Mol Endocrinol 2000;14:1175-86.

83. Rycyzyn MA, Clevenger CV. The intranuclear prolactin/cyclophilin B complex as a transcriptional inducer. Proc Natl Acad Sci USA 2002;99:6790-5.

84. Vonderhaar BK, Biswas R. Prolactin effects and regulation of its receptors in human mammary tumor cells. In: Medina D, Kidwell W, Hepner G, Anderson E, eds. Cellular and Molecular Biology of Mammary Cancer. New York: Plenum Publishing Corp; 1987;205-19.

85. Welsch CW, Gribler C. Prophylaxis of spontaneously developing mammary carcinoma in C3H/HeJ female mice by suppression of prolactin. Cancer Res 1973;33:2939-46.

86. Welsch CW. Prolactin and the development and progression of early neoplastic mammary gland lesions. Cancer Res 1978;38:4054-8.

87. Welsch CW, Goodrich-Smith M, Brown CK, Roth L. The prophylaxis of rat and mouse mammary gland tumorigenesis by suppression of prolactin secretion: a reappraisal. Breast Cancer Res Treat 1981;1:225-32.

88. Wennbo H, Gebre-Medhin M, Griti-Linde A, Ohlsson C, Isaksson OGP, Tornell J. Activation of the prolactin receptor but not the growth hormone receptor is important for induction of mammary tumors in transgenic mice. J Clin Invest 1997;100:2744-51.

89. Wennbo H, Tornell J. The role of prolactin and growth hormone in breast cancer. Oncogene 2000;19:1072-6.

90. Thordarson G, Van Horn K, Guzman RC, Nandi S, Talamantes F. Parous rats regain high susceptibility to chemically induced mammary cancer after treatment with various mammotropic hormones. Carcinogenesis 2001;22:1027-33.

91. Wang DY, Stepniewska KA, Allen DS, Fentiman IS, Bulbrook RD, Kwa HG, et al. Serum prolactin levels and their relationship to survival in women with operable breast cancer. J Clin Epidemiol 1995;48:959-68.

92. Lissoni P, Barni S, Cazzaniga M, Ardizzoia A, Rovelli F, Tancini G, et al. Prediction of recurrence in operable breast cancer by postoperative changes in prolactin secretion. Oncology 1995;52:439-42.


89

93. Bhatavdekar JM, Shah NG, Balar DB, Patel DD, Bhaduri A, Trivedi SN, et al. Plasma prolactin as an indicator of disease progression in advanced breast cancer. Cancer 1990;65:2028-32.

94. Wang DY, De Stavola BL, Bulbrook RD, Allen DS, Kwa HG, Verstraeten AA, et al. The permanent effect of reproductive events on blood prolactin levels and its relation to breast cancer risk: a population study of postmenopausal women. Eur J Cancer Clin Oncol 1988;24:1225-31.

95. Ingram DM, Nottage EM, Roberts AN. Prolactin and breast cancer risk. Med J Aust 1990;153:469-73.

96. Hankinson SE, Colditz GA, Hunter DJ, Manson JE, Willett WC, Stamp-fer MJ, et al. Reproductive factors and family history of breast cancer in relation to plasma estrogen and prolactin levels in postmenopausal women in the Nurses’ Health Study (United States). Cancer Causes Control 1995;6:217-24.

97. Boyd NF, Stone J, Martin L, Minkin S, Yaffe M. Mammographic densities and the growth hormone-IGF-1 prolactin axis. Sunnybrook and Women’s College Hospital, Proc 92nd Meeting of the American Association for Cancer Research, New Orleans, LA, 2001;558.

98. Martini MC, Dancisak BB, Haggans CJ, Thomas W, Slavin JL. Effects of soy intake on sex hormone metabolism in premenopausal women. Nutr Cancer 1999;34:133-9.

99. Collaborative Group on Hormonal Factors in Breast Cancer. Breast cancer and hormonal contraceptives: collaborative reanalysis of individual data on 53,297 women with breast cancer and 100,239 women without breast cancer from 54 epidemiological studies. Lancet 1996;347:3106-8.

100. Rossing MA, Scholes D, Cushing-Haugen KL, Voigt LF. Cimetidine use and risk of prostate and breast cancer. Cancer Epidemiol Biomarkers Prev 2000;9:319-23.

101. Strungs I, Gray RA, Rigby HB, Strutton G. Two case reports of breast carcinoma associated with prolactinoma. Pathology 1997;29:320-3.

102. Volm MD, Talamonti MS, Thangavelu M, Gradishar WK. Pituitary adenoma and bilateral male breast cancer: an unusual association. J Surg Oncol 1997;64:74-8.

103. Popovic V, Damjanovic S, Micic D, Nesovic M, Djurovic M, Petakov M, et al. Increased incidence of neoplasia in patients with pituitary adenomas. The Pituitary Study Group. Clin Endocrinol (Oxf) 1998;49:441-5.

104. Tworoger SS, Sluss P, Hankinson SE. Association between plasma prolactin concentrations and risk of breast cancer among predominately premenopausal women. Cancer Res 2006;66:2476-82.

105. Lee SA, Haiman CA, Burtt NP, Pooler LC, Cheng I, Kolonel LN, Pike MC, Altshuler D, Hirschhorn JN, Henderson BE, Stram DO. A comprehensive analysis of common genetic variations in prolactin (PRL) and PRL receptor (PRLR) genes in relation to plasma prolactin levels and breast cancer risk: the multiethnic cohort. BMC Med Genet 2007;8:72.

106. Holtkamp W, von Heyden D, Rauschecker H, Nagel GA. Plasma-prolactin concentrations in breast cancer at various stages, in mastopathy and other malignant tumors. Schweiz Med Wochenschr 1983;113:1513-20.

107. Holtkamp W, Wuttke W, Nagel GA, Michel U, Rauschecker H. Pathophysiology of hyperprolactinemia in breast cancer. Onkologie 1988;11:86-103.

108. Bhatavdekar JM, Patel DD, Vora HH, Ghosh N, Shah NG, Karelia NH, et al. Node-positive breast cancer: prognostic significance of the plasma prolactin compared with steroid receptors and clinicopathological features. Oncology Reports 1994;1:841-5.

109. Bhatavdekar JM, Patel DD, Shah NG, Vora HH, Suthar TP, Chikhlikar PR, et al. Prognostic significance of immunohistochemically localized biomarkers in stage II and stage III breast cancer: a multivariate analysis. Ann Surg Oncol 2000;7:305-11.

110. Bhatavdekar JM, Patel DD, Shah NG, Vora HH, Suthar TP, Ghosh N, et al. Prolactin as a local growth promoter in patients with breast cancer: GCRI experience. Eur J Surg Oncol 2000;26:540-7.

111. Mujagić Z, Mujagić H. Diagnostic and prognostic usefulness of prolactin (PRL) in breast cancer (BC). Proceedings of ASCO, San Francisco 2001;20:43b.

112. Mujagić Z, Mujagić H. Circulating levels of prolactin as an indicator of effectiveness of therapy in breast cancer patients. Int J Cancer 2002; Suppl 13:216.

113. Mujagić Z, Mujagić H. Prognostic significance of circulating levels of prolactin (PRL) in metastatic breast cancer (MBC). Proceedings of ASCO, Chicago 2003;22:49.

114. Mujagić Z, Mujagić H. Importance of serum prolactin determination in metastatic


90

breast cancer patients. Croat Med J 2004;45:176-80. 115. Mujagić Z, Mujagić H. The relationship of circulating prolactin levels to the size of

primary tumor in breast cancer patients. Turk J Bioch 2004;29:277-81. 116. Mandala M, Lissoni P, Ferretti G, Rocca A, Torri V, Moro C, et al. Postoperative

hyperprolactinemia could predict longer disease-free and overall survival in node-negative breast cancer patients. Oncology 2002;63:370.

117. Gomez F, Reyes FI, Faiman C. Nonpuerperal galactorrhea and hyper-prolactinemia. Clinical findings, endocrine features and therapeutic responses in 56 cases. Am J Med 1977;62:648-60.

118. Berinder K, Stackenäs I, Akre O, Hirschberg AL, Hulting AL. Hyperprolactinemia in 271 women: up to three decade of clinical follow-up. Clin Endocrinol (Oxf ) 2005;63:450-5.

119. Kadioglu P, Yalin AS, Tiryakioglu O, Gazioglu N, Oral G, Sanli O, Onem K, Kadioglu A. Sexual dysfunction in women with hyperprolactinemia: a pilot study report. J Urol. 2006;176:841-2.

120. Suba Z. Carcinogenesis theory based on estrogen deficiency. Orv Hetil 2009;150:1155-6.

121. Plotnikov A, Varghese B, Tran TH, Liu C, Rui H, Fuchs SY. Impaired turnover of prolactin receptor contributes to transformation of human breast cells. Cancer Res 2009;69:OF1-8.

122. Vonderhaar BK, Banerjee R. Is tamoxifene also an antilactogen? Mol Cell Endocrinol 1991;79:C159-C163.

123. Das R, Biswas R, Vonderhaar BK. Characteristics of the antilactogen binding site in mammary gland membranes. Mol Cell Endocrinol 1993;98:1-8.

124. Sutherland RL, Murphy LC, Foo MS, Green MD, Whybourne AM, Krozowski ZS. High-affinity anti-oestrogen binding sites distinct from the oestrogen receptor. Nature 1980;288:273-5.

125. Das R, Vonderhaar BK. Prolactin as a mitogen in mammary cells. J Mammary Gland Biol Neoplasia 1997;2:29-39.

126. Das R, Vonderhaar BK. Tamoxifen inhibits prolactin signal transduction in estrogen receptor negative NOG-8 mammary epihelial cells. Cancer Letters 1997;116:41-6.

127. Faupel-Badger JM, Prindiville SA, Venzon D, Vonderhaar BK, Zujewski JA, Eng-Wong J. Effects of raloxifene on circulating prolactin and estradiol levels in premenopausal women at high risk for developing breast cancer. Cancer Epidemiol Biomarkers Prev 2006;15:1153-8.

91

POPIS I OBJAŠNJENJE SKRAĆENICA

Skraćenica Objašnjenje Engleski izvornik

AKAP Proteini za sidrenje A kinaze A-kinase anchoring proteins

PKA cAMP-ovisne protein kinaze Protein kinase A

cAMP Ciklični adenozin mono fosfat

Cyclic adenosine monophosphate

GCPR Receptori povezani sa G-proteinima G protein-coupled receptors

TLR Receptori slični zvonu Toll-like receptors

GC Gvanilil ciklaza Guanylyl cyclase

PPAR Peroksizom proliferator aktivirani receptor

Peroxisome proliferator activated receptors

NE Norepinefrin (noradrenalin)

noradrenaline

Epi Epinefrin (adrenalin) Adrenaline

DA Dopamin Dopamine

Ach Acetilholin Acetilcholine

PG Prostaglandin Prostaglandine

GABA γ aminobuterna kiselina γ-aminobutyric acid

PTB Fosfotirozin vezujuća domena

Phosphotyrosine binding domena

PLC Fosfolipaza C Phospholipase C

ER Endoplatmatski retikulum Endoplasmicreticulum

TRP kanali Kanali sa tranzitornim receptorskim potencijalom

Transient receptor potential channels

RTK Receptori tirozin kinaze Receptors tyrosine kinase

92

EGF Epidermalni faktor rasta Epidermal growth factor

JAK Janus tirozin kinaze Janus tyrosine kinases

cGMP Ciklični gvanozin monofosfat

Cyclic guanosine monophosphate

TLR receptori Zvonu slični receptori Toll-like receptors

TNF Faktor tumorske nekroze Tumor necrosis factor

JAK-STAT receptori

Receptori Janus kinaza i signalnih transdjusera i aktivatora transkripcije

Janus tyrosine kinases-Signal transducers and activators of transcription receptors

EGF Epidermalni faktor rasta Epidermal growth factor

PDGF Faktor rasta koji potiče iz trombocita Plated derived growth factor

NGF Nervni faktor rasta Nerve growth factor

FGF Faktor rasta fibroblasta Fibroblaste growth factor

VEGF Vaskularni endotelijalni faktor rasta

Vascular endothelial growth factor

Grb2 Vezujući protein za receptor faktora rasta

growth factor receptor-binding protein

GEF Faktori izmjene gvanin nukleotida

Guanine nucleotide exchange factors

MAPK put Put mitogen aktivirajuće protein kinaze

Mitogen-activated protein kinases pathway

SH2 domene

Src homologne domene 2

Rat sarcoma homologous domena

PTP1C Protein fosfataza-1 C Protein phosphatase-1 C

rasGAP Ras GTPaza aktivirajući protein,

Ras GTP-ase activated protein

PI-3K Fosfatidilinozitol 3 kinaza Phosphathydyl inositol 3 kinase

93

PTK Ne-receptor protein tirozin kinaze

Non-receptor protein thyrosine kinase

TGF-β Ransformirajući faktor rasta - β

Transforming growth factor- β

HSP Proteini toplotnoga šoka Heat shock proteins

ANP Atrijalni natriuretski peptid Atrial natriuretic peptide

BNP Moždani natriuretski peptid Brain natriuretic peptide

CNP C-tip natriuretski peptid C type natriuretic peptide

RXR Receptori za retinoičnu kiselinu Retinoidxreceptor

LXR Jetreni X receptor Liverxreceptor

FXR Farnezoil X receptor Farnesoydxreceptor

HRE Hormon odgovorni element

Hormone responsive element

SERM Selektivni modulatori estrogenskih receptora

Selective estrogen receptor modulators

NOS NO sintaza NO synthase

PDE Fosfodiesteraza Phosphodiesterases

GEF Faktori izmjene gvanin nukleotida

Guanine nucleotide exchange factors

RGS Regulatori G protein signalizacije

Regulators of G protein signaling

AC Adenilat ciklaza Adenylate cyclase

EPACs Faktori izmjene direktno aktivirani pomoću cAMP

Exchange factors directly activated by cAMP

CREB cAMPodgovorni vezujući protein

cAMP response element binding protein

AKAP A kinaza proteinska sidra A kinase anchoring proteins

EPAC-1 i EPAC-2,

Proteini izmjene aktivirani pomoću cAMP

Exchange proteins activated by cAMP

94

PKG Protein kinaza G Protein kinase G

IP3 Inozitol-1,4,5-trisfosfat Inositol-1,4,5-trisphosphate

DAG Diacilglicerol Diacylglycerole

PIP2

Fosfatidilinozitol-4,5-bisfosfat

Phosphoinositole-4,5-bisphosphate

PKC Protein kinaze C Proteine kinase C

RyR Rianodin receptora Ryanodine receptor

GLUT4 transportera Glukoza transporter 4 Glucose transporter 4

IRS-1 Inzulin-receptor supstrat 1 Inzulin-receptor supstrat 1

PKB Protein kinaza B Proteine kinase B

GSK3

Kinaza glikogen sintaze 3 Kinase glycogen synthase 3

GS Glikogen sintaza, Glycogen synthase

PRLR Prolaktinski receptori Prolactin receptors

MAPKKK, Mitogenski aktivirana proteinska kinaza-kinaza-kinaza

Mitogen-activated protein kinases kinase kinase

95

INDEKS POJMOVA

A

Acetilholin, 91 Adenilil ciklaza, 25, 26, 39 Agonist, 20, 22, 23, 25, 26 Amplifikacije signala, 4 Anp, bnp i cnp, 20 Antagonisti ca2+ kanala, 10 Antitijela, 3, 12, 19 Arestin, 32 Autotransfosforilacija, 43

B

Barbiturati, 13 Benzodiazepini, 13

C

Ca2+ joni, 4, 32, 34 cAMP, 4, 11, 27, 28, 29, 30,

31, 32, 33, 39, 40, 91, 93, 97, 98

cAMP-ovisne protein kinaze, 4, 91

cGMP, 7, 14, 23, 24, 25, 29, 31, 32, 34, 50, 53, 54, 92

Ciklični AMP, 28

D

DAG, 32, 33, 41, 94 Diacilglicerol, 94 Diferencijacijski faktori, 3 Drugi glasnici, 28, 41, 58

E

Efektorska domena, 5 Efektorski protein, 3, 25, 38 EGF, 13, 14, 15, 16, 92 Epidermalni Faktor Rasta

(EGF), 13

F

Faktore izmjene gvanin nukleotida, 15, 26

Faktori preživljavanja, 3 Faktori rasta, 3, 7, 15, 33 Faktori smrti, 3 Fiziološki receptori, 3 Fosfatidilinozitol-4,5-bisfosfat,

94

G

GAP, 27, 38, 92 GEF, 7, 15, 27, 30, 38, 64,

92, 93 Glikogen sintaza, 94 GLUT4 transporter, 43, 94 Glutamat, 10, 12 G-protein, 15, 37, 38 Grb2, 15, 45, 46, 67, 78, 92 GSK3, 44, 70, 82, 94 Gvanilat ciklaza, 24, 31, 49 Gvanilat ciklaze, 14, 20, 23,

24, 31, 49, 53, 54

H

Hormoni, 3, 5, 7, 8, 17, 49, 50, 51, 52

I

Inozitol-1,4,5-trisfosfat, 94 Interferoni, 3 Intracelularni enzimi, 7 IRS-1, 43, 44, 46, 94

J

JAK, 13, 14, 15, 17, 49, 57, 92

Janus tirozin kinaze, 92 Jonski kanali, 6, 7, 9, 10

96

K

Kinaza glikogen sintaze 3, 44 Konačni odgovor, 50, 57

L

Lidokain i tetrakain, 10 Ligand-vezujuća domena, 16,

18 limfokini/citokini, 3

M

MAPK put, 15, 58, 92

N

Neurotransmiteri, 3, 8 Nikotinski acetilholinski

receptori, 11 NO sintaza, 23, 93 Noradrenalin, 7, 8, 33, 91 NOs, 24 NOS, 23, 24 Nuklearni receptori, 7, 21, 50

O

Onkogen, 16, 48

P

PI-3K, 17, 44, 58, 59, 92 PIP2, 33, 35, 41, 44, 94 PKA, 4, 5, 28, 29, 30, 31, 34,

40, 91, 98 PKB, 44, 58, 67, 94 PKC, 33, 41, 42, 58, 67, 79,

94 PKG, 31, 34, 50, 53, 54, 94 PLC-γ, 17 Prolaktin, 61 Prolaktinski receptori, 56, 94 Protein kinaza B, 94

Protein kinaza G, 31, 50, 53, 94

Protein kinaze C, 33 Prvi glasnik, 2, 3, 28, 55, 56 PTK, 17, 93

R

Rak dojke, 55, 61, 64, 68 Ras, 15, 30, 46, 47, 48, 49,

56, 57, 58 Receptor tirozin kinaze, 16,

33 Receptor-efektor sistem, 3 Receptori povezani sa G-

proteinima, 6, 8, 91 Receptori serin-treonin

kinaze, 17 Receptori tirozin kinaze

(RTK), 13 RGSs, 26 Rokuronium, 12

S

SH2 domene, 14, 16, 17, 33, 46, 92

Signalna transdukcija, 2 Specifični receptor, 2, 3

T

Tamoksifen, 22 TLR receptori, 14, 18, 92 TNF-α receptori, 18 Transdjuser, 4 Transkripcijski faktor, 28, 40,

45 Transmembranski enzimi i

ne-enzimi, 6, 13 TRP kanali, 13, 91

β

β-adrenergički antagonisti, 3

97

LITERATURA

1. Nelson DL, Cox MM. Lehninger Principles of Biochemistry, Fourth edition, W. H. Freeman and Company, New York, 2005.

2. Nelson DL, Cox MM. Lehninger Principles of Biochemistry, Fifth

edition, W. H. Freeman and Company, New York, 2009.

3. Brunton L, Chabner B, Knollman B (Eds.). Goodman & Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics, 12th edition., McGrawHill Medical, New York, 2011.

4. Mathews CK, Van Holde KE, Ahern KG. Biochemistry, Benjamin

Cummings, San Francisco, 2000.

5. Berg JM, Tymoczko JL, Stryer L. Biochemistry. Sixth edition, WH Freeman and Company, New York, 2007.

6. Devlin TM. Textbook of Biochemistry with Clinical Correlations.

Fourth dition, Wiley-Lyss, New York, 1997.

7. Lieberman M, Marks A, Smith C. Marksove osnove medicinske biohemije –klinički pristup. Data Status, Beograd, 2008.

8. Lieberman M, Marks AD. Marks’ Basic Medical Biochemistry. A

Clinical Approach. Third edition, Wolters Kluwer/Lippincott Williams & Wilkins, Philadelphia, 2009.

9. Baillie GS. Compartmentalized signalling: Spatial regulation of

cAMP by the action of compartmentalized phosphodiesterases. FEBS J,276: 1970-1977, 2009.

10. Carnegie GK, Means CK, Scott JD. A-kinase anchoring proteins:

From protein complexes to physiology and disease. IUBMB Life, 61: 394-406, 2009.

11. Jegla TJ, Zmasek CM, Batalov S, Nayak SK. Evolution of the

human ion channel set. Comb Chem High Throughput Screen, 12: 2-23, 2009.

12. Wahl-Schott C, Biel M. HCN channels: Structure, cellular

regulation and physiological function. Cell Mol Life Sci, 66: 470-494, 2009.

13. Clapham DE. TRP channels as cellular sensors. Nature, 426:

517-524, 2003.

14. Venkatachalam K, Montell C. TRP channels. Annu Rev Biochem, 76: 387-417, 2007.

98

15. Ferguson KM. Structure-based vieww of epidermal growth factor receptor regulation. Annu Rev Biophys, 37: 353-373, 2008.

16. Hubbard SR, Till JH. Protein tyrosine kinase structure and function. Annu Rev Biochem 69: 373-398, 2000.

17. Ghosh S, Hayden MS. New regulators of NFκB in inflammation.

Nat Rev Immunol, 8: 837-848, 2008.

18. Privalsky ML. The role of corepressors in transcriptional regulation by nuclear hormone receptors. Annu Rev Physiol, 66: 315-360, 2004.

19. Tontonoz P, Spiegelman BM. Far and beyond: The diverse

biology of PPARγ. Annu Rev Biochem, 77: 289-312, 2008.

20. Riggs BL, Hartmann LC. Selective estrogen-receptor modulators- mechanisms of action and application to clinical practice. N Engl J Med, 348: 618-629, 2003.

21. Tsai EJ, Kass DA. Cyclic GMP signalling in cardiovascular

pathophysiology and therapeutics. Pharmacol Ther, 122: 216-238, 2009.

22. Ross EM, Wilkie TM. GTPase-activating proteins for

heterotrimeric G proteins: Regulators of G protein signaling (RGS) and RGS-like ptoteins. Annu Rev Biochem 69: 795-827, 2000.

23. Beavo JA, Brunton LL. Cyclic nucleotide research- skill expanding

after half a century. Nat Rev Mol Cell Biol, 3: 710-718, 2002.

24. Hanoune J, Defer N. Regulation and role of adenylyl cyclase isoforms. Annu Rev Pharmacol Toxicol, 41: 145-174, 2001.

25. Wong W, Scott JD. AKAP signalling compexes: Focal points in

space and time. Nat Rev Mol Cell Biol, 5: 959-970, 2004.

26. Mayr B, Montminy M. Transcriptional regulation by the phosphorylation-dependent factor creb. Nat Rev Mol Cell Biol, 2: 599-609, 2001

27. Sands WA, Palmer TM. Regulating gene transcription in

response to cyclic AMP elevation. Cell signal, 20: 460-466, 2008.

28. Etienne-Manneville S, Hall A. Rho GTPases in cell biology. Nature, 420: 629-635, 2002.

29. Cheng X, Ji Z, Tsalkova T, Mei F. Epac i PKA: A tale of two

intracellular cAMP receptors. Acta Biochim Biophys Sin (Shanghai), 40: 651-662, 2008.

99

30. Roscioni SS, Elzinga CR, Schmidt M. Epac: Effectors and biological functions. Naunyn Schmiedebergs Arch Pharmacol, 377: 345-357, 2008.

31. Rybalkin SD, Yan C, Bornfeldt KE, Beavo JA. Cyclic GMP

phoshodiesterases and regulation of smooth muscle function. Circ Res, 93: 280-291, 2003.

32. Conti M, Beavo J. Biochemistry and physiology of cyclic

nucleotide phosphodiesterases: Essential components in cyclic nucleotide signaling. Annu Rev Biochem, 76. 481-511, 2007.

33. Hudmon A, Schulman H. Structure-function of the multifunctional

Ca2+/calmodulin-dependent protein kinase II. Biochem J, 364: 593-611, 2002.

34. Patterson RL, Boehning D, Snyder SH. Inositol 1,4,5-triphosphate

receptors as signal integrators. Annu Rev Biochem, 73: 437-465, 2004.

35. Prakriya M. The molecular physiology of CRAC channels.

Immunol Rev, 231: 88-98, 2009.

36. Clevenger CV, Furth PA, Hankinson SE,Schuler LA.The Role of Prolactin in MammaryCarcinoma.Endocrinol Rev, 24(1): 1-27, 2003

37. Mujagić Z, Srabović N, Mujagić H. The role of prolactin in human

breast cancer. Biochemia Medica, 19(3): 236-249, 2009

38. Koolman J, Röhm K-H. Taschenatlas der Biochemie. Georg Thieme Verlag Stuttgart, New York, 1998.

39. http://en.wikipedia.org/wiki

40. http://biocarta.com

41. http://en.wikipedia.org/wiki/ras_(protein)

KRATKA BIOGRAFIJA Zlata Mujagić r. Ćatić je rođena l957. godine u Zagrebu. Osnovnu školu i Gimnaziju je završila u Tuzli, a Farmaceutski fakultet u Sarajevu l980. godine, a za postignuti odlični uspjeh u toku cijelog studija je nagrađena Zlatnom značkom Univerziteta u Sarajevu. Magistrirala je l986. na Medicinskom fakultatu u Tuzli na temu “Nivo gonadotropina, ovarijalnih hormona i kateholamina u plazmi žena sa hiperprolaktinemijom”. 1998. je

odbranila doktorsku disertaciju na Farmaceutskom fakultetu u Sarajevu pod naslovom “Klinička evaluacija cirkulirajućih nivoa prolaktina, karcinoembrionalnog antigena i karcinom antigena 15-3 u bolesnica sa karcinomom dojke” i stekla pravo na naučni stepen doktora farmaceutskih nauka. Zlata Mujagić je u nastavnom procesu na univerzitetu od 1981. godine kao aistent, viši asistent, docent i vanredni profesor. Trenutno je vanredni profesor na užoj naučnoj oblasti Biohemija na Farmaceutskom fakultetu Univerziteta u Tuzli. Prodekan je za naučno-istraživački rad na Farmaceutskom fakultetu Univerziteta u Tuzli i voditelj Postdiplomskog studija. Zlata Mujagić je objavila više naučnih radova u domaćim i inozemnim časopisima, kao i na naučnim skupovima u zemlji i u inozemstvu. Citirana je više puta u Institute for Scientific Information (ISI), Philadelphia, Pennsylvania i u Science Citation Index-u. Koautor je u nekoliko stručnih knjiga. Sudjelovala je kao voditelj ili kao istraživač u nekoliko naučno-istraživački projekata. Bila je mentor nekoliko magistarskih i doktorske radnje. Uže područje njenog naučnog interesa je biohemija tumora, te biohemijska osnova bolesti i biohemija lijekova. Zlata Mujagić je uvrštena u prestižne svjetske biografske baze podataka: „Marquis Who is Who in the World“, USA; International Biographical Centre (IBC), Cambridge, England i American Biographical Institute (ABI), USA i na taj način je svrstana među istaknute znanstvenike u svijetu.

«ImunoUniverztumoreMedicinSpecijaUniverzDr MujaonkologProfesoeduciraUSA (najpresMemorčlan M„ReviewMujagićnajuticaProfesoEvropi.Philadeu pisaHarrisoWilkinsPharmai/ili člahttp://mDr Mujačlan WDobitniistraživGeneranauka.

ološka reaktivzitetu u Esen

e Sveučilišta nskom fakultealizaciju iz Inzitetsko-medicagić je specijagije i imunoloor je interne mao iz onkologiVašington, N

stižnije ustanorial Sloan-KettMassachusettsw Board of Hć je kontinuiraajnijih znanstvor Mujagić je o Citiran je

elphia, Pennsynju više stru

ons Textbook s, 2006; Bruntoacological bas

an u više znmujagich.tripodagić je aktivanorld Oncologyk je i niza zn

vački rad poal Hospital, B

vnost u bolesnu, Njemačka

u Zagrebu.tu Sveučilišta

nterne medicicinskog centraalista interne mogije. Posjedumedicine, onkije u Evropi (E

Njujork, Filadeove za rak u svtering klinika, s General Harvard Univerano citiran u „venika u svijetobjavio 105 zmnogo puta

ylvania i u Sciučnih knjiga

of Medicine,on L, Chabnesis of Therapenansveno-istrad.com/hamza_n stariji član Ay Network (WOnačajnih nagraput Ribakof Boston, USA

KRATK HamzaTešnjuškolovagodineZagrebobavio milosrdSveučiPostdipbiologijza posZagrebMagistCentrumetastproučaStručniKomisijHrvatskDoktors

snika sa kara i na Medici. Disertaciju u Zagrebu. ne završio je

a, Sarajevo, l9medicine, i subuje tri USA dologije i patolEsen, Lozanaelfija, Boston)vijetu: Naciona

za rak, Newospital, Profersity Cancer C„Marquiz Whou. nanstvenih ra

a u Institute ence Citation u zemlji i in, Harrisons O

er B, Knollmaneutics, McGrawaživačkih pro_mujagic_biogAmeričkog druON, USA). ada i priznanjnagrade, Ha

; Active seni

KA BIOGRAF

a Mujagić je r. Osmogodianje je zavr. Medicinski

bu 1968. godiu Kliničko

dnica Medlišta u Zagrebplomski studij je je upisao l9stdiplomske sbu. rirao je 197 u Zagrebu

taze fibrosarkavanje imunoloi državni ispjom Miniske 197l. godinsku disertaccinomom reknskom fakulte

je odbranio

e na Klinici 980. godine. bspecijalista iziplome iz onkoške fiziologij

a, Bukurešt, M). Po pozivu alni institut za

w York. U posesor HarvardCenter“. Od 2o is Who in th

adova, uglavnofor Scientifi

Index-u. Napnozemstvu (sOncology. Lipn B (Eds.). GowHill Medical,ojekata (detagrafija.htm). uštva kliničkih

a za svoj bogarvard Univerior member

FIJA

rođen l943. gšnje i gimnršio u Bosnifakultet je zane. Liječnički oj bolnici icinskog f

bu 1969/1970 giz eksperime

969. godine ustudije Sveuč

72. godine una temu: «

koma kao togije tumora».pit je položistarstva zdne u Zagrebu. ciju pod naktuma» uradioetu i na Inst

o 1976. god

za unutarnje

z onkologije, ukološke specije. Kontinuiran

Moskva, Marbuje radio u

rak, Bethesdasljednjih 12 go univerziteta 002. godine p

he World“ međ

om u SAD i Zaic Informatioisao je i/ili sud

sudjelovao u pincott William

oodman&Gilm 2011). Bio jeljnije informa

onkologa (AS

gati stručni i nrsity, MassacNjujorške ak

odine u nazijsko i 1963. avršio u

staž je Sestara

fakulteta godine.

e- ntalne u Centru čilišta u

u istom «Plućne test za o pred

dravstva

aslovom o je na itutu za

dine na

bolesti

urološke ijalnosti. no se je urg), i u u dvije

a, USA i odina je

i član profesor đu 2000

apadnoj n (ISI), djelovao pisanju

ms and an's the

e voditelj acije na

SCO), te

naučno-chusetts ademije

biohemizmi stanicne transdukcije signala

Documents