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Biofisicoquímica
Estudio de estructura nativa de proteínas
INSTITUTO DE CIENCIAS DE LA SALUDUNIVERSIDAD NACIONAL ARTURO JAURETCHE
Av. Lope de Vega 106, Florencio Varela – Buenos Aires – Argentina
Dr. Eduardo Prieto [email protected] Dr. Ariel [email protected]
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Estructura de proteínas
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N Ia Ib In U
Agg
[Urea]
[Urea]
Cuerpos de inclusión (expresión in vivo en E. coli)
Ic
· El estado nativo es metaestable.· El estado conformacional predominante está en equilibrio
con los otros estados.
• Nativo (N)• Desplegado (U o D)• Parcialmente plegado (MG, I)
Degradación
¿Cuáles son las posibles conformaciones de una proteína?
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La conformación nativa es la más estable
La proteína adquiere esta conformación como resultado de restricciones conformacionales impuestas por la cadena principal y por otras características físicas y químicas de los aminoácidos
Anfinsen desplegó a la RNasa bajo condiciones extremas y observó que la estructura de la enzima SE REPLIEGA ESPONTÁNEAMENTE en ausencia de otros factores biológicos externos.
N U
Hipótesis termodinámica del plegado proteico
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En 1972 mientras recibe el Nobel
"The native conformation is determined by the totality of interatomic interactions and hence by the amino acid
sequence, in a given environment."
NC
N
C
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MTEMKDDFAKLEEQFDAKLGIFALDTGTNRTVAYRPDERFAFASTIKALTVGVLLQQKSIEDLNQRITYTRDDLVNYNPITEKHVDTGMTLKELADASLRYSDNAAQNLILKQIGGPESLKKELRKIGDEVTNPERFEPELNEVNPGETQDTSTARALVTSLRAFALEDKLPSEKRELLIDWMKRNTTGDALIRAGVPDGWEVADKTGAASYGTRNDIAIIWPPKGDPVVLAVLSSRDKKDAKYDDKLIAEATKVVMKALNMNGDKLPSE
?
La secuencia de las proteínas o alguna propiedad relacionada con la secuencia determina la estructura 3D
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La secuencia de las proteínas o alguna propiedad relacionada con la secuencia determina la estructura 3D
MTEMKDDFAKLEEQFDAKLGIFALDTGTNRTVAYRPDERFAFASTIKALTVGVLLQQKSIEDLNQRITYTRDDLVNYNPITEKHVDTGMTLKELADASLRYSDNAAQNLILKQIGGPESLKKELRKIGDEVTNPERFEPELNEVNPGETQDTSTARALVTSLRAFALEDKLPSEKRELLIDWMKRNTTGDALIRAGVPDGWEVADKTGAASYGTRNDIAIIWPPKGDPVVLAVLSSRDKKDAKYDDKLIAEATKVVMKALNMNGDKLPSE
-lactamasa
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• Compactación óptima• Grupos polares en el exterior• Mínima superficie expuesta• Actividad biológica• Interacciones terciarias fijas• Resistente a la acción de proteasas
Caracteristicas del Estado nativo (N)
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Ala237: posicionamiento de grupo carbonilo del anillo ‑lactámico.
Asn132, Arg244: interacción con sustrato.
Glu166: Activación de ser70 para ataque nucleofílico.
Ser70: ataque nuclofílico al grupo carbonilo del anillo ‑lactámico.
Lys73 y Ser130: participan en la formación del intermediario acil‑enzima.
Lys73
Arg244
Glu166
Ala273Ser70
Asn132
Ser130
4
3
loop
14
5
El sitio activo de la -lactamasa es una exquisita sonda conformacional, involucra residuos distantes en secuencia y que adquieren su ubicación espacial con el correcto plegado 3D.
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Human Aldose reductase at 0.66 Å E. Howard
Interacciones del solvente con la estructura nativa
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•Máxima expansión (aumenta el radio hidrodinámico promedio)
•Exposición al solvente máxima de las cadenas laterales. Máxima superficie expuesta
•En teoría infinitas conformaciones (random coil)
•Clusters apolares fluctuantes en teoría sin interacciones preferenciales
•Alta sensibilidad a proteasas
Características del Estado desplegado (U)
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Expansión
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•Grupo heterogéneo de conformaciones no nativas
•Estructura residual secundaria, nativa o no nativa
•Sin estructura terciaria rígida•Topología variable•Tendencia a la agregación•Sensibilidad a proteólisis
Características de los Estados parcialmente plegados (MG, I)
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• La diferencia enorme entre el número de conformaciones permitidas a U y N
•El ordenamiento de las moléculas de agua sobre la superficie accesible
• La expulsión de moléculas de agua en el plegado
Las contribuciones entrópicas
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• Las interacciones intramoleculares• Las interacciones con el solvente• Las interacciones entre moléculas del solvente.
Las contribuciones entalpicas
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Entropía conformacional
Entropía del solvente
Entalpía de solvatación
Entalpía del solvente
N U
• La diferencia enorme entre el número de conformaciones permitidas a U y N• El ordenamiento de las moléculas de agua sobre la superficie accesible
• Interacciones de van der Waals• Puentes de hidrógeno• Puentes salinos
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Cinética del plegado proteico
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Escala de tiempoSide-chain rotations
Loop closure
Helix formation Folding of b--hairpins
Protein folding
Protein aggregation
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demostró mediante algunos cálculos que si la búsqueda de la conformación plegada fuera al azar cada molécula debería atravesar por un número astronómico de conformaciones desde el estado desplegado.
La búsqueda le tomaría tanto tiempo a la cadena polipeptídica que haría del plegado un proceso muy poco probable
Cada aminoácido posee dos posibles conformaciones El polipéptido (100 residuos) entonces posee 2100 posibles conformaciones.· Damos 1 picosegundo para cada transición entre estados
conformacionales,
El tiempo requerido para el proceso de plegado sería de 1018 segundos o 1010 años.
Cyrus Levinthal (1968-69)
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Sin embargo las proteínas en condiciones adecuadas se pliegan rápida, espontáneamente y en forma reversible.
Paradoja de Levinthal
N U
Anfinsen (experimentos con la ribonucleasa)
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Depende solo de la estructura primaria de la proteína y de las interacciones con el solvente.
Ene
rgía
Coordenada de reacción
TS
UN
El plegado es un proceso espontáneo.
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Osmolitos Caotropos
● Sulfato de sodio
● TMAO
● Urea
● Cloruro de guanidinio
● Tiocianato de guanidinio
¿Como se puede desplazar el equilibrio?
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Ene
rgía Estado desplegado
Estado nativo
[D]
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¿Como hacemos para determinar la cantidad de proteína nativa?
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=[U] k u
[N] k f
= K NUG NU = - RTln K NU
[GdmHCl] (M)
[GdmHCl] (M)1 2 3 4 5 6
0UNΔG
0
Cm
m
m[D] ΔGΔG 0UNUN
]m[C ΔG m0
UN 0
][CmΔG m0
UN /
Desplegado en el equilibrio[G
dm
HC
l]
N Uk u
k f
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N
UK UN ff 1
N
U
f
f
N
UK
[D] = CmUN ff 5.0
KRTG NU ln
U
NRTG NU ln
DmGG NUNUOHNU 2
KRT
G NU ln Ke RT
G NU
Ke RT
DmGNUOH
2
N Uk u
k f
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K
KSSS UN
total
1
Ke RT
DmGNUOH
2
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Estructura terciaria: CD en el UV cercano, fluorescencia, actividad enzimática
Estructura secundaria: CD en el UV lejano
Compactación: SEC-FPLC, DLS (RS)
¿Como nos damos cuenta de equilibrios intermedios?
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Estados parcialmente plegados en equilibrio con la forma nativa
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El plegado es un proceso espontáneo.
![Page 35: Biofisicoquímica Estudio de estructura nativa de proteínas I NSTITUTO DE C IENCIAS DE LA S ALUD U NIVERSIDAD N ACIONAL A RTURO J AURETCHE Av. Lope de Vega](https://reader036.vdocuments.site/reader036/viewer/2022062323/5665b4931a28abb57c9254a4/html5/thumbnails/35.jpg)
Modelos de plegado: Nucleación
![Page 36: Biofisicoquímica Estudio de estructura nativa de proteínas I NSTITUTO DE C IENCIAS DE LA S ALUD U NIVERSIDAD N ACIONAL A RTURO J AURETCHE Av. Lope de Vega](https://reader036.vdocuments.site/reader036/viewer/2022062323/5665b4931a28abb57c9254a4/html5/thumbnails/36.jpg)
Modelos de plegado: Difusión, colisión y coalescencia
![Page 37: Biofisicoquímica Estudio de estructura nativa de proteínas I NSTITUTO DE C IENCIAS DE LA S ALUD U NIVERSIDAD N ACIONAL A RTURO J AURETCHE Av. Lope de Vega](https://reader036.vdocuments.site/reader036/viewer/2022062323/5665b4931a28abb57c9254a4/html5/thumbnails/37.jpg)
Modelos de plegado: El modelo jerárquico
![Page 38: Biofisicoquímica Estudio de estructura nativa de proteínas I NSTITUTO DE C IENCIAS DE LA S ALUD U NIVERSIDAD N ACIONAL A RTURO J AURETCHE Av. Lope de Vega](https://reader036.vdocuments.site/reader036/viewer/2022062323/5665b4931a28abb57c9254a4/html5/thumbnails/38.jpg)
Modelos de plegado: El modelo del rompecabezas.
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Modelos de plegado: El colapso hidrofóbico
![Page 40: Biofisicoquímica Estudio de estructura nativa de proteínas I NSTITUTO DE C IENCIAS DE LA S ALUD U NIVERSIDAD N ACIONAL A RTURO J AURETCHE Av. Lope de Vega](https://reader036.vdocuments.site/reader036/viewer/2022062323/5665b4931a28abb57c9254a4/html5/thumbnails/40.jpg)
Embudos conformacionales y paisajes energéticos.
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Cinética de plegado
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Ene
rgía
100.00
200.00
300.00
400.00
500.00
600.00
0 100 200 300 400 500 600
Flu
ore
scen
cia
(U.A
.)
Tiempo (S)
A
B
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50.05 M GdmCl, 20 C
Actividad -lactamasa
t1/2(ES‑LC9) = 408 min
t1/2(ES‑L) = 1.2 min
SEC-FPLC
t1/2(ES‑LC9) = 398.5 min
Replegado 6 M GdmCl → 0.05 M GdmCl
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Lisozima -lactalbumina
Dos proteínas con el mismo fold. Una dos estados y otra tres estados?