Testing of the Efficiency of Some Enzymatic Mixtures, Concerning the Conversion of Glucide Polymers from Sweetpotato to Reducing

Sugars, as a Notable Source to Produce Bioethanol

Radiana Tamba-Berehoiua, Nicolae-Ciprian Popab, Ana Rosua, Stefana Jurcoaneb, Camelia Digutab

aUniversity of Agronomic Sciences and Vet. Med. of Bucharest, Faculty of Biotechnology (radianatamba@yahoo.com, anabiotech@yahoo.com)bMicrobial Biotechnology Center, Bucharest, Romania

Abstract

Batatul (Ipomoea batatas) reprezinta o sursa alimentara importanta, dar poate constitui si o sursa notabila de bioetanol, datorita cantitatilor mari de polimeri glucidici si randamentelor mari de transformare ale acestora in glucide fermentescibile. Glucidele reprezinta 80-90 % din substanta uscata a radacinilor tuberizate de batat, d in care: 2-5 % este celuloză, 3-4% hemiceluloză, 70% amidon si 2,5-3 % substanţe pectice (acizi pectici, galactani şi arabani uniţi prin legături glicozidice). Monoglucidele şi oligoglucidele au un conţinut de circa 10 ori mai redus decât acela de amidon. In consecinta, hidroliza amidonului, celulozei si hemicelulozei din batat, se poate face cu amestecuri enzimatice avand specificitate pentru substraturile amintite. În lucrarea de fata sunt comparate anumite preparate enzimatice si amestecuri intre acestea, privind randamentul hidrolizei poliglucidelor din batat (varietate de culoare portocalie), la glucide rducatoare. S-au utilizat: Amylex 3 T (-amilaza), Laminex 440 (glucanaza, pentozanaza), Diazyme X4 si Diazyme X5 (amiloglucozidaze), MethaPlus (-glucanază, xilanază, celulază), Veron M4 (-amilaza) si BG -malt (-amilaza). Deosebit de activ a fost amestecul de Diazyme X4 si Laminex 440 (glucoza 78,71 % la SU), Diazyme X4 (glucoza 75, 81 % la SU), urmate de amestecul Amylex 3T+Laminex 440 (glucoza 64,92 % la SU) si MethaPlus (glucoza 59,70 % la SU). Celelalte enzime au prezentat randamente modeste privind transformarea poliglucidelor in glucide reducatoare. Cresterile continutului de glucide reducatoare, comparativ cu martorul, au variat intre 32.69-328.23 % functie de enzima utilizata la hidroliza. Ulterior hidrolizei enzimatice, sucul glucidic a fost fermentat cu specii de Saccharomyces, distilat şi rectificat pentru a fi purificat, în vederea obtinerii bioetanolului. Vitalitatea drojdiei a fost marita prin adaosul unor proteaze fungice. Anhidrizarea bioetanolului s-a facut eficient pe site moleculare.

Key words: sweetpotato, enzymatic hydrolysis, reducing sugars, fermentation, bioethanol

Introduction

The increased dependence on fossil fuel, in meeting the energy demands of the modern society, results in elevated CO2 levels in the atmosphere, linked to global warming. As fossil energy supplies will no longer be adequate and affordable in the near future, the attention is driven to industrial biotechnology, able to develop biofuels from renewable energy sources [8].

Different types of plant biomass sources are already assessed for their potential to produce biofuels. Among these, some starch crops, like sweetpotato, represent attractive candidates to be used as renewable biomass sources to produce ethanol, as an unconventional fuel. Considered of being one of the most competitive vegetable, due to the high production/ha and to the exquisite nutritive qualities, the sweetpotato cultivation is more and more extended in the temperate zones. Apart from its value as food for humans and animals, sweetpotato biomass is highly appreciated as an important raw material for the starch and alcohol industry [3, 4].

The important quantities of glucide polymers and the high randament of their transformation in fermentable glucides, recommend sweetpotato as a notable source to produce bioethanol. The glucides represent 80-90% of the total dry substance. Of the total polyglucides, 2-5% is represented by cellulose, 3-4% by hemicellulose, 70% by starch and 2.5-3% by pectins. The mono and oligoglucides are present in concentrations of 10 times lower compared to the starch ones, the reducing glucides are present as traces, while the dextrines are missing [5]. Conclusively, sweetpotato starch, cellulose and hemicellulose hydrolysis, can be performed by using enzyme mixtures, having specificity for the respective substrates [2, 6, 7].

1

One of the main goals of this research is the testing of the efficiency of some enzymes and enzymatic mixtures, used for the hydrolysis of polyglucides, from the sweetpotato storage roots, to reducing glucides. Another goal is reffering to fermentation of the reducing sugars to bioethanol, followed by its purification and anhydrization.

Materials and Methods

We used conditioned orange variety sweetpotato storage roots (pre-dried and crumbled). The first step which has been performed, was the laboratory analysis concerning the % moisture content of the substrate, at 60 and 1050 C (The Practical Reference Method, SR ISO 712/1999).

After that, the polyglucide substrate was hydrolysed using some commercial fungal or bacterial enzyme products (according to the technical specifications), from different sources (DANISCO, GENECOR): Amylex 3 T (-amylase), Laminex 440 (glucanase, pentosanase), Diazyme X4 (amyloglucosidase), Diazyme X5 (amyloglucosidase), MethaPlus (-glucanase, xylanase, cellulase), Veron M4 (-amylase) and BG -malt (-amylase). Enzymatic hydrolysis was performed at 600 C, during 20 h period, on a rotary shaker at 200 rpm, pH=5,8. The efficiency of hydrolysis was estimated by quantifying the amount of reducing sugars. The reducing sugars were recorded as glucose content, by reading the absorption at 640 nm, using 3,5-dinitrosalicilic acid (Peterson and Porath modified method) [1].

After enzymatic hydrolysis, the glucide juice was fermented with some Saccharomyces species (Ethanol Red dry alcool yeast LESAFFRE), inoculata in proportie de 5 %. Anaerobic fermentation was performed 24 and 48 hours, at 280 C, without shaking. Yeast vitality was enhanced by adding some fungal proteases from Aspergillus niger, namely Diazyme FP and Alphalase FP2. The fermented juice was distilled. We also performed the rectification of the distilate, so as to purify the bioethanol. Total anhydrization was efficiently performed on a 3 A0 molecular sieve (15 % molecular sieve to the whole mixture).

Results and Discussions

In urma conditionarii batatului s-au determinat: substanta uscata relativa (relative dry matter), substanta uscata absoluta si substanta uscata totala, a caror valori sunt urmatoarele: SU relativa % = 20.395; SU absoluta % = 86, 48; SU totala % = 17.63. Valorile glucidelor reducatoare obtinute in urma hidrolizei enzimatice sunt exprimate in procente, raportate la substanta uscata (calculated on dry matter basis). Continutul de glucide reducatoare, exprimat in g glucoza % s-a calculat dupa o ecuatie de regresie corespunzatoare curbei etalon. De asemenea, s-a calculat randamentul de crestere a titrului de glucide reducatoare, comparativ cu martorul (tabelul 1).

Table 1Glucide reducatoare obtinute la hidroliza enzimatica a batatului

No. Enzime g % glucoza la SU%

Procent crestere fata de martor %

Control 18.38 -1 Amylex 3 T 56.53 207.56

2 Amylex 3T +Laminex 440 64.92 251.57

3 Diazyme X4 75.81 312.45

4 Diazyme X4 +Laminex440

78.71 328.23

5 Laminex 440 33.92 84.54

6 MethaPlus 59.70 224.80

7 Veron M4 45.92 149.83

8 BG -malt 45.56 147.87

2

Amestecul Diazyme X4 + Laminex 440 a fost deosebit de eficient (78.71 %), fiind o combinatie intre o amiloglucozidaza si o glucanaza, hidrolizand atat legaturile 1,4- cat si 1,6-alfa glucozidice din amidon, precum si glucanii celulozici. Hidroliza doar cu Diazyme X4 a fost de asemenea, eficienta (75.81 %). In cazul in care preparatul Laminex 440 (glucanaza, pentozanaza) actioneaza singur, concentratia glucidelor reducatoare scade la 33.92 %. In schimb, amestecul de Laminex 440 cu o -amilaza, anume Amylex 3T, imbunatateste rezultatul hidrolizei la 64.92 % glucide reducatoare. De altfel, Amylex 3T singur, hidrolizeaza amidonul din batat in proportie de 56.53 %, apropiat de valorile obtinute cu MethaPlus 59.70 %.

Enzima Amylex 3T, o -amilaza, este frecvent utilizata in industria bioetanolului, avand actiune de starch liquefaction. Cu toate ca Veron M4 si BG -malt sunt tot -amilaze, actiunea lor hidrolitica este oarecum limitata (45.92 %, respectiv 45.56 %) in cazul amidonului din batat, fiind specifice pentru induatria panificatiei (hidroliza amidonului din grau).

Procentele de crestere a glucidelor reducatoare, comparativ cu martorul, in urma actiunii enzimatice, s-au plasat intre 84.54 % si 328.23 %, ceea ce demonstreaza randamentele foarte bune de hidroliza a poliglucidelor din batat (figure 1).

Figure 1. Procentele de crestere a glucidelor reducatoare, comparativ cu martorul

Prin utilizarea -amilazei Amylex 3T (7 repetitii) pentru hidroliza amidonului din batat, se obtine o medie si o deviatie standard de: 44.674 ± 8.485, cu o varianta de 72.004 si un coeficient de variabilitate de 18.993 %. Variabilitatea este relativ crescuta, ceea ce implica conditii stricte de control al parametrilor tehnologici ai procesului, mai ales la scara industriala. Valorile pH-ului dupa hidroliza enzimatica, la probele hidrolizate cu Amylex (7 repetitii) au fost de: 5.664 ± 0.253, cu varianta de 0.055 si un coeficient de variabilitate de 4.467 %. Putem spune ca pH-ul a variat putin, ramanand relativ constant pe parcursul hidrolizei.

Sucul hidrolizat a fost fermentat cu drojdia alcooligena Ethanol Red, timp de 24 si respectiv 48 ore. Valorile glucidelor reducatoare la 24 si 48 h de fermentare, alaturi de valorile martor (glucide dupa hidroliza enzimatica) sunt prezentate in tabelul 2.

Table 2Glucide reducatoare dupa fermentare 24 si 48 h (n=7)

Parameter X±s s CV %Glucide reducatoare dupa

hidroliza % (a)44.674 ± 8.485 72.004 18.993

Glucide reducatoare dupa 24 h de fermentare % (b)

13.843 ± 6.249 39.056 45.142

Glucide reducatoare dupa 48 h de fermentare % (c)

7.404 ± 1.955 3.824 26.405

3

Glucidele reducatoare, la 24 ore de fermentare, prezinta un coeficient de variabilitate foarte crescut (45.142 %), care scade dupa 48 h, aproape la jumatate (26.405 %). Semnificatia scaderii concentratiei glucidelor reducatoare prin fermentare (test F si test t) este evidentiata in tabelul 3.

Table 3Semnificatia diferentelor intre glucidele reducatoare dupa hidroliza

si dupa 24 sau 48 h de fermentareParameter Average Average F t

Glucide reducatoare %, diferenta (a)-(b)

44.674 13.843 0.542 ns. 7.740 ***

Glucide reducatoare %, diferenta (b)-(c)

13.843 7.404 10.213 * 2.601 *

ns nesemnifictiv, * significant different, ** distinctly significant different , *** very significant different

Se observa ca la 24 ore de fermentare, concentratia glucidelor reducatoare a scazut foarte semnificativ si a continuat sa scada semnificativ pana la 48 h.

Valorile pH-ului au suferit de asemenea modificari, pe masura ce concentratia glucidelor reducatoare a scazut si s-a acumulat bioetanol (table 4).

Table 4Valorile pH dupa fermentare 24 si 48 h (n=7)

Parameter X±s s CV %Valori pH dupa hidroliza % (d)

5.664 ± 0.253 0.055 4.467

Valori pH dupa 24 h de fermentare % (e)

3.914 ± 0.497 0.247 12.698

Valori pH dupa 48 h de fermentare % (f)

3.335 ± 0.602 0.363 18.051

Coeficientul de variabilitate a crescut peste limita, mai ales in ultimele 24 h din cele 48 h de fermentare (18.051 %), dar se mentine mare si in primele 24 ore, fapt ce denota viteze diferite de reactie enzimatica, la probele de batat supuse fermentarii. Semnificatia scaderii valorilor pH prin fermentare (test F si test t) este evidentiata in tabelul 5.

Table 5Semnificatia diferentelor intre valorile de pH dupa hidroliza

si dupa 24 sau 48 h de fermentareParameter Average Average F tValori pH

diferenta (d)-(e)5.664 3.914 1.024 ns. 8.425***

Valori pH diferenta (e)-(f)

3.914 3.335 0.680 ns 1.961 ns

Se observa ca scaderea pH dupa 24 h de fermentare este foarte semnificativa (8.425***), pe cand scaderea de pH la 48 ore nu difera semnificativ de valorile pH de la 24 ore de fermentare (1.961 ns)

In aceasta situatie se pune problema proportionalitatii dependentei dintre scaderea valorilor glucidelor reducatoare si scaderea pH-ului, pe parcursul hidrolizei si fermentatiei. Regresia glucide reducatoare-pH dupa hidroliza este prezentata in figura 2.

4

y = -0.0023x2 + 0.2324x + 0.0895

R2 = 0.9078

5.1

5.2

5.3

5.4

5.5

5.6

5.7

5.8

5.9

6

0 10 20 30 40 50 60

Reducing sugars %

pH

Figure 2. Dependenta Glucide reducatoare – pH la probele hidrolizate cu Amylex 3T

Se observa o foarte buna dependenta Glucide reducatoare-pH, exprimata de o curba polinomiala cu un coeficient de determinare R2= 0.9087.

In figura 3 este evidentiata dependenta Glucide reducatoare-pH la 24 h dupa fermentare, printr-o curba polinomiala cu un coeficient de determinare R2= 0.5771.

y = -0.0106x2 + 0.3702x + 1.2115

R2 = 0.5771

0

0.51

1.52

2.5

33.5

44.5

5

0 5 10 15 20 25 30

Reducing sugars %

pH

Figure 3. Dependenta Glucide reducatoare – pH dupa fermentare 24 h

Coeficientul de determinare s-a redus la aproape jumatate, comparativ cu coeficientul de determinare al primei curbe, totusi apreciem ca deoarece parametri glucide reducatoare si pH se influenteaza reciproc in proportie de 57 %, exista inca o interdependenta notabila intre acestia.

Regresia Glucide reducatoare-pH, la 48 h dupa fermentare (figure 4), este reprezentata de o curba polinomiala cu un coeficient de determinare foarte mic R2= 0.0039. Practic, nu se mai poate vorbi de o dependenta intre scaderea glucidelor reducatoare si pH la acest nivel.

y = -0.0097x2 + 0.1385x + 2.8737

R2 = 0.0039

0

0.5

1

1.5

2

2.5

3

3.5

4

4.5

0 2 4 6 8 10 12

Reducing sugars %

pH

Figure 4. Dependenta Glucide reducatoare – pH dupa fermentare 48 h

In vederea optimizarii procesului tehnologic de fermentare, se poate aprecia ca acidifierea mediului, exprimata pe de o parte de scaderea pH-ului si pe de alta parte de scaderea concentratiei de

5

glucide reducatoare, poate fi prevazuta statistic doar pana la 24 h de fermentare, dupa aceasta perioada proportionalitatea dintre parametri nu se mai confirma.

Fermentarea a fost favorizata, prin scaderea glucidelor reducatoare la 48 h pana la 15 %, cu adaosul unor proteaze fungice, precum Diazyme FP si Alphalase FP2, separat sau in amestec, alaturi de drojdia Ethanol Red. Se stie ca acumularea de bioetanol in mediu incetineste procesele fermentative. Dupa 48 h de fermentare s-a realizat distilarea azeotropului etanol-apa, la 78,150 C. Distilarea a fost urmata de o rectificare si o anhidrizare concomitenta a azeotropului. Anhidrizarea s-a facut prin introducerea in blazul de rectificare a unei site moleculare (Zeolit) cu dimensiunea porilor 3 A 0 (15 % raportat la intreg amestecul). Redistilarea alcoolului a marit concentratia alcoolica de la 95,5 la 99,5 %. De asemenea, metalele grele detectate la nivel de 80.38 ppb Pb si 0.955 ppb Cd, in azeotrop, nu s-au mai regasit in bioetanolul rectificat.

Conclusions

The most active, proved to be the mixture of Dyazime X4 and Laminex 440 (78.71% glucose on dry matter basis), Dyazime (75.81 % glucose), followed by the mixture of Amylex 3T+Laminex 440 (64.92 % glucose on dry matter basis ) and MethaPlus (64.92 % glucose on dry matter basis );

Increase in reducing sugars, comparative to control, was between 32.69-328.23 %, reported to the enzymatic mixtures used;

Coeficientii de variabilitate ai Glucidelor reducatoare dupa hidroliza si dupa fermentare la 24 si 48 h, prezinta valori mari, ceea ce implica asigurarea unui control strict al parametrilor proceselor biotehnologice, precum si a unei omogenitati crescute a materiei prime;

Concentratia glucidelor reducatoare a scazut foarte semnificativ dupa 24 h de fermentare (t=7.740***) si semnificativ de la 24 la 48 h de fermentare (2.601*);

Valoarea pH-ului scade foarte semnificativ dupa 24 h de fermentare, dar nu prezinta diferente semnificative la 48 h fat de 24 h de fermentare;

Regresiile Glucide reducatoare-pH prezinta coeficienti de determinare R2 ridicati dupa hidroliza si dupa 24 h de fermentare, dar nu si dupa 48 h de fermentare. In consecinta, acidifierea mediului, poate fi prevazuta statistic, pe baza concentratiei glucidelor reducatoare (si invers) doar pana la 24 h de fermentare, dupa aceasta perioada proportionalitatea dintre parametri nu se mai confirma;

Adaosul proteazelor fungice alaturi de drojdie, a amplificat procesul fermentativ, scazand concentratia glucidelor reducatoare cu pana la 15 % din valoarea inregistrata la martor (fara proteaze);

Rectificarea bioetanolului produce cresterea concentratiei alcoolice si elimina diferite impuritati (metale grele);

Anhidrizarea pe site moleculare, introduse direct in blazul de distilare, este eficienta si usor de realizat, nefiind necesara o instalatie separata pentru aceasta operatiune (coloane, trecerea pe sita sub forma de abur etc).

References

1. Iordachescu, D., Dumitru, I.F. Practical Biochemistry – Proteins and Enzymes, Part I, University of Bucharest Printing House, 1980.2. Fan, L.T., Gharpuray, M.M., Lee, Y.H., Cellulose hydrolysis biotechnology monographs, 3, Springer-Verlag, Berlin, 1987.3. Riese, J., Proceedings of the Third Annual World Congress on Industrial Biotechnology and Bioprocessing – Linking Biotechnology, Chemistry and Agriculture to Create New Value Chains, Toronto, ON, July 11-14, 2006.4. Rodriguez, F., Methods to evaluate culinary quality and other attributes for processing sweetpotato storage roots., International Potato Center, Training Manual, Sect.3.4, 1999.5. Rosu, A. Handbook of plant biotechnology applied in sweetpotato micropropagation. Proeditura si Tipografie, 1 - 7, Bucharest, 2006.6. Tamba-Berehoiu Radiana, Jurcoane Stefana, Popa N. C, Rosu Ana, Bagiu Liliana, Testing of the efficiency of some enzymatic mixtures, concerning the conversion of several lignocellulosic biomass’ sourses to reducing sugars, poster, Lucrări ştiinţifice Zootehnie şi Biotehnologii, vol. 41, Timişoara, 2008.7. Walker, L.P., Wilson, D.B., Enzymatic hydrolysis of cellulose: An overview, Biores. Technol, 36:3-14., 1991.

6

8. *** EUROPEAN COMMISSION- EUR 21350 – BIOMASS, Green energy for Europe, Luxembourg: Office for Official Publications of the European Communities, 2005.

7