bioensayos en peneaus
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Informe de Bioensayos Estudios de Inmunoestimulación
en Camarones Litopenaeus vannamei
Biodinámica S.A. (Chile) Y
Centro de Investigaciones Biológicas del Noroeste (CibNor) Unidad Hermosillo (México)
INDICE
1.- Objetivo………………………………………………...................2 2.- Introducción .............................................................2 3.- Materiales y Métodos…………………..........………............3-8 Diseño experimental Bioensayo 1 y 2 Técnicas Medición Parámetros Inmunológicos
4.- Resultados.................................................................9-12 Bioensayo Nº1 5.- Resultados.................................................................12-17 Bioensayo Nº2 6.- Conclusiones ..............................................................18 7.- Bibliografía .................................................................19
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1.- Objetivo
Determinar el efecto de dos productos inmunoestimulantes de distintas formulaciones
(suspensión y solución) inyectables sobre parámetros inmunológicos de camarón blanco L.
vannamei.
2.- Introducción:
En los últimos años, los estudios en el campo de la inmunología de crustáceos, han generado
expectativas de controlar las enfermedades a través de la activación del sistema inmune. Sin
embargo, en los inicios, la falta de metodologías para medir el estado de defensa de los
crustáceos era un problema serio (Sritunyalucksana y cols., 1999). Durante , la última década,
se han desarrollado e implementado técnicas bioquímicas, que permiten medir los parámetros
celulares y humorales de crustáceos sirviendo como indicador de la condición inmune de los
camarones. , con la intención de desarrollar criterios para la selección de organismos
resistentes a patógenos, inmunomodulación y mejoramiento sanitario de los organismos en
cultivo (Rodríguez y Le Moullac, 2000).
En camarón, como en todos los crustáceos, no un sistema de defensa especifico con memoria,
no existen las inmunoglobulinas como en los vertebrados, sin embargo, pero poseen
mecanismos de defensa que evitan el establecimiento y proliferación de patógenos. La
respuesta celular de camarón se manifiesta a través de fagocitosis, encapsulación, formación de
nódulos y citotoxicidad (Itami y cols., 1998; Chang y cols., 2000; Rengpipat y cols., 2000;
Vargas-Albores y Yepiz-Plascencia., 1998), mientras que la respuesta humoral es llevada a cabo
por aglutininas, enzimas, citoquininas y factores líticos (Vargas-Albores y cols., 1992; Vargas-
Albores y cols., 1993; Hernández-López y cols., 1996; Marques y Barracco, 2000). Algunos
componentes y/o actividades se encuentran integrados en sistemas o cascadas de reacciones,
como es el caso del sistema de la coagulación y el sistema de activación de la profenoloxidasa
(proFO).
Antecedentes previos, indican que los productos de Biodinámica S.A. tienen un fuerte actividad
inmunostimulante en peces, por lo que el presente trabajo tiene como objetivo evaluar dicho
efecto en los parámetros inmunológicos del camarón.
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2.- Materiales y Métodos
PRIMERA PARTE:
Ø Bioensayo Nº1: efecto de ADITIVO A (2x) EN SUSPENSIÓN
Organismos: Se utilizan camarones Litopenaeus vannamei, de buena condición sanitaria, de
un tamaño de 22 g, aclimatados por una semana en estanques de 50L y alimentados
diariamente con un 4% de la biomasa con un dieta comercial.
Aplicación de productos inmunoestimulantes:
Tratamiento Control : camarones inyectados con 50 uL solución salina estéril
Tratamiento 1: camarones inyectados con 50 µl del aditivo suspensión (2x).
Tiempo de Bioensayo y muestreos: El ensayo duró 24 horas desde la aplicación del aditivo
inyectable, tomándose 10 camarones por tratamientos en intervalos de tiempo desde 0,3,6,12 y
24 horas.
Producto: Inmunoestimulante en suspensión inyectable estéril aplicado en Dosis equivalente
utilizada en salmónidos.
SEGUNDA PARTE
Ø Bioensayo Nº2: efecto de ADITIVO B EN SOLUCION
Organismos: Se utilizan camarones Litopenaeus vannamei, de buena condición sanitaria, de
un tamaño promedio de 12g, aclimatados por una semana en estanques de 50L y alimentados
diariamente con un 4% de la biomasa con un dieta comercial.
Aplicación de productos inmunoestimulantes:
Tratamiento Control : camarones inyectados con 30 uL solución salina esteril.
Tratamiento Nº1: inyectados con 30 ul de Aditivo soluble (1x); DOSIS 1
Tratamiento Nº2:inyectados con 30 ul de Aditivo soluble (3x); DOSIS 2
Tratamiento Nº3:inyectados con 50 ul de Aditivo soluble (3x); DOSIS 3
Tiempo de Bioensayo y muestreos: El ensayo duró 48 horas desde la aplicación del aditivo
inyectable, tomándose 10 camarones por tratamientos en intervalos de tiempo desde 0,3,6,12,
24, 36 y 48 horas.
Producto: Inmunoestimulante en solución inyectable estéril aplicado en 3 dosis (dosificación
1,2,,3).
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Diseño Experimental General para Bioensayos de Inmunoestimulación Pruebas de Evaluación inmunitaria en camarones
Sistema InmuneHumoral
Sistema Inmune celular
Ø Fenoloxidasa totalØ FenoloxidasaØ proFenoloxidasaØ Acividad de proteasasØ Inhibidores de proteasasØ AglutininasØ Lisozima
Ø Cuenta total de hemocitosØ Estallido respiratorio (NBT)Ø SOD
PARÁMETROS DEL SISTEMA HUMORAL Y CELULAR
Sistema InmuneHumoral
Sistema InmuneHumoral
Sistema Inmune celular
Sistema Inmune celular
Ø Fenoloxidasa totalØ FenoloxidasaØ proFenoloxidasaØ Acividad de proteasasØ Inhibidores de proteasasØ AglutininasØ Lisozima
Ø Cuenta total de hemocitosØ Estallido respiratorio (NBT)Ø SOD
PARÁMETROS DEL SISTEMA HUMORAL Y CELULAR
Inyección inmunoestimulante
50 camarones
50 camarones
CONTROL
INYECCIÓN, SOLUCIÓN. SALINA
ENSAYO
INYECCIÓN C/PRODUCTO
Inyección en región toráxicaExtracción hemolinfa (10 camarones por
periodo, se eliminan)
1h3h6h12h24hEVALUACIÓN
SISTEMA INMUNE HUMORAL
SISTEMA INMUNE CELULAR
Temperatura: 28 +/- 0.5 C
Salinidad: 38 +/- 0.5 PPT
Oxígeno Disuelto: Aeración continua (> 4.5 mg/l)
pH: 7-7.5
Agua marina filtrada a 10 micras
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Protocolos Metodologías Parámetros Inmunológicos en camarones.
q Muestreo de Hemolinfa
La hemolinfa es extraída desde el camarón vivo por punción desde la región ventral del
camarón entre el último par de pereiópodos y el primer par de pleópodos, en la siguiente
relación: 1 volumen de hemolinfa en 2 volúmenes de anticoagulante SIC-EDTA, previamente
enfriado. Se utiliza una jeringa estéril 29G x13 mm, 1 ml. Se toma muestra de hemolinfa
1,3,6,12,y 24 hrs post inyección del producto.
q Proteínas Totales
El nivel de proteínas Totales se determina en muestras de plasmas, obtenidas por
centrifugación de la hemolinfa extraída. Se toma un volumen y se agrega a una microplaca. Se
hace reaccionar con el reactivo de Biuret formándose un complejo coloreado al cabo de tiempo
de reacción, el cual es medido en lector de Elisa a 546 nm. (Kit Proteinas totales, Mét. Biuret,
RANDOX).
A partir de una curva de calibrado con una solución stock de BSA estándar (1mg/mL) se
extrapola la concentración de proteínas totales en el plasma de la muestra.
q Conteo Total de Hemocitos:
El conteo Total de los hemocitos se realiza por observación al microscopio utilizando una
cámara de Neubahuer. Un volumen de muestra de hemolinfa completa mantenida en una
solución de anticoagulante con formol al 20%, se deposita en la cámara y se cuenta el nº de
hemocitos totales (sin diferenciar hemocitos hialinos, semi-granulares y granulares) en cada
cuadrado según protocolo (Cat. Sigma, Pag. 1849).
El Número o conteo total de hemocitos se expresa en millones de Hemocitos/mL hemolinfa.
q Actividad Fenoloxidasa (FO) libre en hemolinfa completa.
La determinación de la actividad (FO) libre en muestras de hemolinfa de camarón se realizó
mediante el método de oxidación de L-dopa en microplacas y cuantificando la formación de
dopacromo a 490 nm., según protocolo Hernández-López (1996).
Los resultados se expresan como actividad específica ( (Abs 490 nm/min)/(mg proteínas /mL)).
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q Actividad Fenoloxidasa (FO) Total (ProFO+ FO)en hemolinfa completa.
La actividad (FO) Total corresponde a la suma de las actividades FO libre y Pro FO , esta última
es activada en presencia de tripsina transformándose a FO. Por lo tanto, la actividad FO Total
se mide utilizando el mismo protocolo para FO libre pero la hemolinfa es previamente incubada
en microplacas conteniendo tripsina (1 mg/mL) en cada pocillo. Una vez transformada toda la
ProFO a FO se determina esta última en presencia de L-Dopa y medido a 490 nm según
protocolo anterior. Para calcular la Profenoloxidasa: ProFO= (FO Total-FO libre)
q Determinación de actividad Lisozima en placas de agarosa
La actividad lisozima se determinó por un método basado en la lisis de Micrococcus luteus
medido por difusión radial en agar.(Hernández-López, 2001)
Para lo cual se confeccionaron placas de agarosa al 1.2% conteniendo micrococcus luteus.
Sobre la agarosa sólida, se realizan perforaciones que sirven de deposito para un volumen de
hemolinfa.
Las placas son incubadas a 37º C por 24 horas.
La presencia de actividad enzimática lisozima de visualiza por la formación de un halo
traslucido alrededor de la perforación con la muestra al cabo del periodo de incubación.
La actividad lisozima de cada muestra se determinó midiendo el diámetro de lisis alrededor de
los pozos y extrapolada a una una curva estándar de lizosima de huevo comercial (Sigma).
Curva de calibrado: estándar de Lisozima de huevo (1mg/mL). Se preparan diluciones de 1,0.5,
0.25,0.125, utilizando un blanco agua.
q Actividad Superóxido Dismutasa en Hemolinfa de Camarón.
El rol de la enzima superoxido dismutasa (SOD) es acelerar la dismutación del radical
superóxido tóxico (O2-) producido durante los procesos oxidativos y transformarlo a peróxido y
oxígeno.
Para la cuantificación in vitro de SOD en hemolinfa de camarón, se utilizó el Kit Ransod,
Randox). Este método emplea Xantina y Xantina oxidasa (XOD) para generar radicales
superóxidos, los cuales reaccionan con el compuesto I.N.T para formar un compuesto coloreado
rojo. (Kit Radson. RANDOX;Woolliams JA, 1983)
La actividad SOD es luego medida por el grado de inhibición de esta reacción.
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Una unidad de SOD es la que causa un 50% de inhibición de la velocidad de reducción de INT
bajo las mismas condiciones del ensayo.
El ensayo se realizó en microplacas leyendo la absorbancia a 505 nm a los 30 segundos de
comenzado el ensayo y luego a los 6 minutos.
El cálculo se realiza (A2-A1)/6= Delta absorbancia/min de los estándares o muestras
Con la ayuda de una curva de calibrado confeccionada con estandares de SOD del kit se grafica
% de inhibición v/s unidades SOD /mL.
q Determinación de Estallido Respiratorio (NBT).
El estallido respiratorio es un proceso oxidativo asociado a la fagocitosis, en el que varios
radicales tóxico de oxígeno son generados para destruir al patógeno invasor que está siendo
ingerido por las células inmunitarias.
Se utilizó la técnica espectrofotométrica de reducción de NBT para cuantificar la producción del
anión superóxido por los hemocitos del camarón blanco Penaeus vannamei (Pick at. Al.,1981)
según protocolo optimizado por Hernández-López (2001;Rook et al.,1985). El test optimizado
de microplacas de NBT se basa en la cuantificación a 630 nm de formazan solubilizado por
KOH /DMSO mejorando la sensibilidad y la exactitud de la cuantificación.
q Ensayo de Fagocitosis.
La actividad fagocítica en hemocitos se determinó utilizando el Kit Vybrant Phagocytosis Assay
V-6694. Este kit fue diseñado para cuantificar el efecto de drogas u otros factores ambientales
sobre la función fagocítica en PMN (humanos) o macrófagos (ratón).
El proceso de fagocitosis puede ser observado también en hemocitos (camarón) según
protocolo optimizado de Hernández-López.
Este kit se basa en la internalización de la bacteria E. coli (K-12 strain) marcada con
fluoresceína. Una vez englobada por los hemocitos, la fluorescencia es medida en un lector de
Florescencia a 480 excitación y 520 nm de emisión.
Para calcular la fagocitosis neta y la respuesta a al agente efector de la fagocitosis, se resta la
fluorescencia de una control negativo a los grupos positivos para calcular la LECTURA
POSITIVA NETA. Este valor representa la fagocitosis en condiciones fisiológicas normales.
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Luego, se resta la florescencia del control negativo a las florescencia de las muestras
estimuladas con el efector. LECTURAS EXPERIMENTAL NETA , es el resultado de la fagocitosis
en respuesta a un efector.
La respuesta a fagocitosis al efector puede ser expresada como:
% Efecto= (Lectura Experimental neta/ Lectura neta positiva) *100
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4.- Resultados y Discusión Primera Parte
Ø RESULTADOS BIOENSAYO ESTUDIO DE INMUNOESTIMULACION PRODUCTO
Nº1 (SUSPENSIÓN inyectable estéril) 4.a) Actividad proFenol- Fenoloxidasa
Las mediciones de los niveles de proFenoloxidasa y Fenoloxidasa total muestrasn una
disminución entre la 1, 3 y 6 horas post-inyección (gráfica 4.1 y 4.2), reestableciéndose a
valores de tiempo 0, a las 12 horas comparados con el grupo control. A las 12 y 24 horas no
hay mayores diferencias entre ambos grupos.
Gráfica 4.1: Variación de niveles de proFO en hemolinfa de camarones inoculados con aditivo A suspensión (2X) comparados con control . Los asteriscos rojos indican diferencias significativas.
proFenoloxidasa (proFO)
0
0.2
0.4
0.6
0.8
1
1.2
1.4
0 3 6 9 12 15 18 21 24
Tiempo post-inyección (h)
Abs
orba
ncia
(nm
)
Control proFO
Tratamiento proFO*
*
10
Gráfica 4.2: Concentración de FO en hemolinfa de camarones inoculados con aditivo A (2X) (tratamientos) comparados con control. No se observaron cambios significativos con el tratamiento 4.b) Conteo de Hemocitos Totales El recuento de Hemocitos disminuyó significativamente por efecto del aditivo, desde las 3 horas (Gráfica 4.3), comparados con el grupo control.
Gráfica 4.3: Recuento total de hemocitos en hemolinfa de camarones inoculados con aditivo 1 (2X) suspensión comparados con control. Asteriscos rojos indican diferencias significativas.
Fenoloxidasa (FO)
0
0.005
0.01
0.015
0.02
0.025
0.03
0.035
0.04
0.045
0 3 6 9 12 15 18 21 24
Tiempo post-inyección
Abs
orba
ncia
(nm
)
Control FO
Tratamiento FO
Cuenta total de hemocitos
0
5
10
15
20
25
30
35
40
0 3 6 9 12 15 18 21 24
Tiempo post-inyeción (h)
No
de H
emoc
itos
(mill
on
es/m
l)
Control
Tratamiento
* **
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c) Estallido Respiratorio (NBT) En la gráfica Nº 4.4 se presenta el los resultados de la medición del estallido respiratorio en
hemocitos, medido por reducción de NBT, durante el bioensayo. Se puede observar, que existe
una respuesta mayor en grupo control, especialmente, a las 6 horas comparados al grupo
tratado. En todos los puntos de muestreo el grupo control tuvo mejor respuesta que el grupo
inyectado con el Aditivo A.
Gráfica 4.4: Reducción de NBT de hemocitos de camarones inoculados con aditivo 1(2x) Suspension (2X) comparados con tratamiento control . Asteriscos rojos indican diferencias significativas. Por lo tanto, en base a los antecedentes expuestos sobre el estudio de inmunoestimulación de
camarones L. vannamei con el producto Aditivo A (2x) en suspensión inyectable, desarrollado
por Biodinámica S.A. se puede concluir que el producto no tuvo un efecto Inmunoestimulante
en estos organismos a la dosis inyectada y en el periodo de tiempo analizado.
El producto Aditivo A (suspensión inyectable) presenta, además, un efecto inmunosupresor
sobre la respuesta inmune en el intervalo de 1 a 12 horas después de la inyección comparado
con el grupo control.
Reducción de NBT
00.020.040.060.080.10.120.140.160.180.2
0 3 6 9 12 15 18 21 24
Tiempo post-inyección (h)A
bsor
banc
ia (
nm)Control
Tratamiento
* *
*
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Consideraciones
1. De acuerdo a los antecedentes de Biodinámica S.A., el producto A en suspensión posee un alto potencial como inmunoestimulador en salmones. Sin embargo, el hecho de que un producto tenga un efecto en peces no significa, necesariamente, que tenga el mismo efecto en otras especies, sobre todo si los mecanismos de defensa y la estimulación del sistema inmune es distinto, como es el caso de los crustáceos comparado con peces. Debido a esto, los resultados obtenidos en este trabajo no deben ser comparados con los obtenidos en peces.
2. Otro aspecto que debe ser tomado en cuenta en la discusión de los resultados del presente ensayo, es la baja solubilidad del producto analizado. De hecho, la granulosidad del producto pudo haber impedido la introducción de material particulado grande y la dosis requerida para generar el efecto inmunoestimulante no se haya logrado adecuadamente.
3. También es importante considerar que la dosis que se manejó en este ensayo fue calculada en base a los resultados obtenidos en peces. En base al punto 1 de estas consideraciones, es posible que se requiera realizar un ensayo cinético de concentraciones.
4. Como se aprecia en los resultados de los parámetros donde hay disminución de actividad o número, las diferencias importantes se encuentran en el intervalo de las 3 a las 6 horas post-inyección.
5.- Resultados y Discusión Segunda Parte
Ø RESULTADOS BIOENSAYO ESTUDIO DE INMUNOESTIMULACION CON
ADITIVO B (SOLUCION INYECTABLE ESTÉRIL).
En base a los resultados de inmunoestimulación cuantificados con el Aditivo A (en suspensión)
se procedió a realizar un nuevo bioensayo, considerando los siguientes parámetros que
pudieron haber influído en el anterior:
- En el segundo bioensayo se probó un producto soluble (aditivo B).
- Se inyectaron en 3 dosis : Dosis 1: 30 ul (1x), Dosis 2: 30 ul (3x) y Dosis 3:50 ul(3x).
-Se consideró una duración mayor del bioensayo: 48 hrs. para verificar la posibilidad de una
activación de la respuesta en forma tardía.
-Se analizó un mayor nº de parámetros bioquímicos: Actividad Fagocítica, superóxido dismutasa
(SOD), proteína plasmática, Lisozima, los cuales no fueron considerados en el primer estudio.
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5.a)Sistema ProFO- Fenoloxidasa:
Los resultados obtenidos mostraron un aumento de la actividad de Fenoloxidasa total, con un
pick a las 12 horas post-inyección tanto de organismos tratados con 30 µl de aditivo B (1x) y 3
x, como el grupo control, siendo en este último grupo el que se alcanza máxima actividad. En el
grupo inyectados con el producto en la más alta dosis no se observó una activación en el
transcurso del bioensayo. Mientras que los valores de la Fenoloxidasa activada no fue afectada
en ninguno de los tratamientos comparados con el grupo control (Gráficas Nº5.1).
Gráfica 5.1: Concentración de FO y FO Total en hemolinfa de camarones inoculados con aditivo B (1X, 30 µl; 3X 30 µl; 3X 50 µl.) o con solución salina estéril (controles). El tiempo cero corresponde a los valores obtenidos en camarones sin inocular. No hay diferencias significativas.
FOtotal
0
0.02
0.04
0.06
0.08
0.1
0.12
0.14
0.16
0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50
Tiempo (horas)
Act
ivid
ad (A
bs/m
in)
Control1x3x
3x50
FO
0
0.02
0.04
0.06
0.08
0.1
0.12
0.14
0.16
0 10 20 30 40 50Tiempo (horas)
Act
ivid
ad (A
bs/m
in)
Control1x3x3x50
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b)Conteo Total de Hemocitos
En la gráfica Nº5.2 se puede observar que el nº de Hemocitos Totales disminuye en los grupos
de camarones tratados con dosis altas (3x), especialmente entre las 6 y 12 horas comparados
con el grupo control, restableciéndose cercano a las 24 horas. Este efecto se mantiene hasta las
48 hras. Comparado a los valores de los controles , todos los grupos tratados tuvieron menor
conteo de hemocitos durante el ensayo, quizá debido a una migración a los tejidos o al sitio de
inyección en los individuos inyectados con el producto.
Gráfica 5.2: Cuenta total de hemocitos en hemolinfa de camarones inoculados con aditivo B (1X, 30 µl; 3X 30 µl; 3X 50 µl.) o con solución salina estéril (controles). El tiempo cero corresponde a los valores obtenidos en camarones sin inocular. Los asteriscos rojos indican diferencias significativas.
Cuenta Total de Hemocitos
0
5000000
10000000
15000000
20000000
25000000
0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50Tiempopost-inoculación (h)
No
de H
emoc
itos/
ml
ctr1x3x3x50
*
15
5.c) Estallido Respiratorio:
Los valores obtenidos de NBT tanto de camarones controles como tratados tuvieron un
mismo comportamiento, se mantuvieron constantes, salvo pasadas las 24 horas, donde se
detectó una leve alza. Ver grafico Nº5.3
Gráfica 5.3: Reducción de NBT en hemocitos de camarones tratados con aditivo B (1X, 30 µl; 3X 30 µl; 3X 50 µl.) o con solución salina estéril (control). El tiempo cero corresponde a los valores obtenidos en camarones sin inocular.
5.d) Actividad Lisozima:
No se detectó actividad lisozima, no se observaron halos de inhibición en todas las muestras,
incluyendo los controles.
5.e) Superóxido Dismutasa:
Los resultados de mediciones de SOD en hemocitos se muestran el la gráfico Nº5.4. Se aprecia
que los valores tanto de grupos tratados como control se mantuvieron constantes y similares
comparados al control, sólo después de las 24 horas se observó una leve baja en todos los
grupos. Esto estaría desmostrando talvez que los camarones del estudio, se encontraban en un
estado de alto estrés.
Reducción de NBT
0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
0.6
0.7
0.8
0.9
1
0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50
Tiempo post-inyección (h)
Abs
orba
ncia
Control
1x3x
3x50
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Gráfica 5.4: Actividad de SOD de hemocitos en hemolinfa de camarones inoculados con
aditivo B (1X, 30 µl; 3X 30 µl; 3X 50 µl.) o con solución salina estéril (control). El tiempo cero
corresponde a los valores obtenidos en camarones sin inocular.
5.f) Proteínas Totales en hemolinfa:
La concentración de proteínas en hemolinfa de camarón se mantuvo estable entre el rango de 100-120 mg/mL en todos los grupos. Se observa en la grafica siguiente:
Gráfica 5.5: Concentración de proteína total en hemolinfa de camarones inoculados con aditivo B (1X, 30 µl; 3X 30 µl; 3X 50 µl.) o con solución salina estéril (controles). El tiempo cero corresponde a los valores obtenidos en camarones sin inocular.
SOD
0,000
0,050
0,100
0,150
0,200
0,250
0,300
0,350
0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50
Tiempo post-inoculación
Ab
sorb
anci
a
Control1x
3x
3x50
Proteína Total
0
20
40
60
80
100
120
140
160
180
0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50
Tiempo post-inoculación (h)
Con
cent
raci
on d
e pr
oteí
na t
otal
(m
g/m
l)
CTR
1x
3x
3x 50
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5.g)Actividad Fagocítica:
Los resultados de % Fagocitosis tanto en grupos tratados como control se presentan en la
gráfica Nº5.6. El gráfico muestra que no hay diferencias significativas en % fagocitosis de
grupos tratados comparados con grupo control. Los valores se encuentran dentro de un 30-
40% durante todo el bioensayo.
Gráfica Nº5.6: % fagocitosis en grupos tratados con aditivo B en distintas dosis comparadas con grupo control (solución salina estéril).
Conclusión Bioensayo Nº2
ü Por lo tanto, en base a los resultados obtenidos en el Bioensayo Nº 2, el aditivo B (1x)
(solución inyectable) utilizado en dosis (1x,30ul), (3x,30ul) y (3x,50 uL), inyectado en
camarones, no produce un efecto inmunoestimulante a pesar de su formulación
soluble.
Fagocitosis
0102030405060708090
100
0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50Tiempo post-inoculación (h)
Fago
cito
sis
(%)
ctr1x3x3x50
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6. Conclusión Generales
ü Los productos A y B desarrollados por Biodinámica S.A. no tuvieron un efecto en la
inmunoestimulación en camarones L. vannamei al ser inyectados en ninguna de las
dosis ensayadas.
ü Existe una variación importante de los parámetros bioquímicos entre cada ensayo, no
pudiéndose comparar resultados en ensayos realizados en forma separada. Por lo que
cada resultados es comparado sólo con su control (inyección solución salina estéril).
ü Las condiciones fisiológicas y ambientales influyen en forma importante en el nivel de
estrés de camarones, por lo que hace difícil el llevar a cabo bioensayos, y poder
individualizar sólo el efecto del producto, ya que el sistema inmune del camarón
reacciona rápidamente a cualquier factor externo que lo desequilibre. Puede haber
ocurrido que el producto si tuvo un efecto Inmunoestimulante postivo, sin embargo,
dicho efecto se haya enmascarado con condiciones de estrés.
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7.Bibliografía citada Sritunyalucksana, K.; Cerenius, L. and Söderhäll, K. (1999). Molecular cloning and characterization of prophenoloxidase in the black tiger shrimp, Penaeus monodon. Developmental and Comparative Immunology 23: 179-186.
Rodríguez, J. and Le Moullac, G. (2000). State of the art of immunological tools and health control of penaeid shrimp. Aquaculture 191: 109-119.
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