bioelectricity and regeneration - currents in regenerating newt limbs (becker ref.)

7/28/2019 Bioelectricity and Regeneration - Currents in Regenerating Newt Limbs (Becker Ref.)

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P r o c . N a t i . A c a d . S c i . U S AV o l . 7 4 , N o . 1 0 , p p . 4 5 2 8 - 4 5 3 2 , O c t o b e r 1 9 7 7D e v e l o p m e n t a l B i o l o g yB i o e l e c t r i c i t y a n d r e g e n e r a t i o n : L a r g e c u r r e n t s l e a v e t h e s t u m p s o fr e g e n e r a t i n g newt l i m b s *

( s k i n - d r i v e n s o d i u m c u r r e n t s / v i b r a t i n g p r o b e / u r o d e l e s / a m i l o r i d e )R I C H A R D B . B O R G E N S , J O S E P H W. V A N A B L E , J R . , AND L I O N E L F . J A F F ED e p a r t m e n t o f B i o l o g i c a l S c i e n c e s , P u r d u e U n i v e r s i t y , L a f a y e t t e , I n d i a n a 4 7 9 0 7C o m m u n i c a t e d b y J a m e s D . E b e r t , J u l y 1 4 , 1 9 7 7A B S T R A C T E l e c t r i c a l c u r r e n t s n e a r r e g e n e r a t i n g n e w tl i m b s w e r e m e a s u r e d w i t h a r e c e n t l y d e v e l o p e d v i b r a t i n g p r o b e .S t e a d y c u r r e n t s w i t h l o c a l s u r f a c e d e n s i t i e s o f 1 0 t o 1 0 0 M A / c m 2o r m o r e l e a v e t h e e n d o f t h e s t u m p d u r i n g t h e f i r s t 5 - 1 0 d a y sa f t e r a m p u t a t i o n a n d a r e b a l a n c e d b y c u r r e n t s w i t h d e n s i t i e so f o n l y 1 - 3 j A / c m 2 t h a t e n t e r t h e i n t a c t s k i n a r o u n d t h e s t u m p .T h e y a r e i m m e d i a t e l y d e p e n d e n t u p n t h e e n t r y o f s o d i u m i o n si n t o t h i s s k i n a n d a r e t h e r e f o r e i n f e r r e d t o b e s k i n - d r i v e n . T h eo u t w a r d c u r r e n t s a r e c o m p a r a b l e i n d i r e c t i o n , d e n s i t y , d u r a t i o n ,a n d p o s i t i o n t o a r t i f i c i a l l y i m p o s e d c u r r e n t s p r e v i o u s l y f o u n ds u f f i c i e n t t o i n d u c e s i g n i f i c a n t r e g e n e r a t i o n o f a m p u t a t e d a d u l tf r o g l i m b s . T h i s c o m p a r i s o n s u g g e s t s t h a t t h e e n d o g e n o u s s t u m pc u r r e n t s p l a y s o m e c a u s a l r o l e i n i n i t i a t i n g r e g e n e r a t i o n .W e h a v e r e c e n t l y d e m o n s t r a t e d t h a t a n u r a n l i m b r e g e n e r a t i o nc a n b e i n i t i a t e d b y d r i v i n g a s m a l l s t e a d y c u r r e n t t h r o u g h t h es t u m p . T h e e f f e c t i v e s t i m u l u s i s t r u l y e l e c t r i c a l ( i . e . , t h e e f f e c ti s n o t m e d i a t e d b y e l e c t r o d e p r o d u c t s ) . C u r r e n t m u s t b e p u l l e do u t o f t h e s t u m p t o i n d u c e r e g e n e r a t i o n , w h e r e a s i n w a r d c u r -r e n t a c t u a l l y i n d u c e s d e g e n e r a t i o n ( 1 ) . M a n y o t h e r s t i m u l i a r ek n o w n t o i n d u c e a m e a s u r e o f r e g e n e r a t i o n i n a d u l t a n u r a n s( 2 , 3 ) . T h e c r i t i c a l q u e s t i o n i s w h e t h e r a c o m p a r a b l e e l e c t r i c a lc o m p o n e n t i s p a r t o f a n a t u r a l c o n t r o l s y s t e m . A s a f i r s t s t e p i na n s w e r i n g t h i s q u e s t i o n , we a s k w h e t h e r n o r m a l l y r e g e n e r a t i n ga m p h i b i a n s t u m p s g e n e r a t e c o m p a r a b l e c u r r e n t s a f t e r a m p u -t a t i o n .A n o l d a n d n e a r l y f o r g o t t e n p a p e r o f M o n r o y ' s i n d i c a t e s t h a te n d o g e n o u s c u r r e n t s d o , i n d e e d , l e a v e t h e r e g e n e r a t i n g a m -p h i b i a n s t u m p s u r f a c e ( 4 ) . M o n r o y u s e d a r e l a t i v e l y l o w - r e s i s -t a n c e g a l v a n o m e t e r t o m a k e t h e s e m e a s u r e m e n t s . H e n c e , a sw i l l b e d i s c u s s e d b e l o w , i t i s p o s s i b l e t o e s t i m a t e t h e s i z e o f t h e s ec u r r e n t s . Tw o s u b s e q u e n t s t u d i e s h a v e y i e l d e d s o m e w h a tc o n t r a d i c t o r y r e s u l t s ( 5 - 7 ) . H o w e v e r , b o t h B e c k e r a n d t h e R o s e su s e d i n s t r u m e n t s w i t h v e r y h i g h r e s i s t a n c e , s o t h e r e s i s t a n c eb e t w e e n t h e p o i n t s o f m e a s u r e m e n t w a s e s s e n t i a l l y t h e r e s i s -t a n c e a l o n g t h e s k i n s u r f a c e . B e c a u s e t h i s w a s n o t m e a s u r e d ,t h e s i z e o f t h e c u r r e n t s r e s p o n s i b l e f o r t h e m e a s u r e d v o l t a g e sc a n n o t b e i n f e r r e d .W e h a v e t h e r e f o r e r e i n v e s t i g a t e d t h e s t u m p c u r r e n t s i na m p u t a t e d a n d r e g e n e r a t i n g n e w t l i m b s , u s i n g t h e r e c e n t l yd e v e l o p e d u l t r a s e n s i t i v e v i b r a t i n g p r o b e ( 8 ) . W i t h i t , o n e c a nd i r e c t l y m e a s u r e t h e p a t t e r n o f c u r r e n t d e n s i t i e s e n t e r i n g o rl e a v i n g a b i o l o g i c a l s o u r c e i m m e r s e d i n i t s n a t u r a l a q u e o u sm e d i u m . F u r t h e r m o r e , t h e p r o b e i s p l a c e d a t a s u f f i c i e n t d i s -t a n c e f r o m t h e a n i m a l a s t o p r a c t i c a l l y a v o i d d i s t u r b i n g i t . T h ep r o b e i s v i b r a t e d b e t w e e n t w o e x t e r n a l p o i n t s a n d r e g i s t e r s t h em i n u t e v o l t a g e d i f f e r e n c e g e n e r a t e d b y a n y c u r r e n t t h a t mayt r a v e l b e t w e e n t h e s e t w o p o i n t s . T h e o n l y a c c e s s o r y m e a s u r e -m e n t n e e d e d t o i n f e r t h e c u r r e n t d e n s i t y i s t h e r e s i s t i v i t y o f t h em e d i u m . U s e o f t h e v i b r a t i n g p r o b e a l l o w s o n e t o m e a s u r e e x -T h e c o s t s o f p u b l i c a t i o n o f t h i s a r t i c l e w e r e d e f r a y e d i n p a r t b y t h ep a y m e n t o f p a g e c h a r g e s . T h i s a r t i c l e m u s t t h e r e f o r e b e h e r e b y m a r k e d" a d v e r t i s e m e n t " i n a c c o r d a n c e w i t h 1 8 U . S . C . 1 7 3 4 s o l e l y t o i n d i c a t et h i s f a c t .

t r a c e l l u l a r v o l t a g e d i f f e r e n c e s r e l i a b l y ( a n d t h e r e b y i n f e r e x -t r a c e l l u l a r c u r r e n t d e n s i t i e s ) a t a l e v e l ' / h o o t o ' / l o o o o f t h a tm e a s u r a b l e w i t h o l d e r t e c h n i q u e s .U s i n g t h i s n e w m e t h o d , w e f i n d t h a t l a r g e s t e a d y c u r r e n t sl e a v e t h e e n d o f t h e s t u m p f o r a w e e k o r t w o a f t e r a m p u t a t i o n .W e f u r t h e r s h o w t h a t t h e s e r e g e n e r a t i o n c u r r e n t s a r e s o d i u md e p e n d e n t a n d n e r v e i n d e p e n d e n t . W e i n f e r t h a t t h e y a r es k i n - d r i v e n .MATERIAL AND METHODS

R e d - s p o t t e d n e w t s , N o t o p h t h a l m u s v i r i d e s c e n s ( f o r m e r l yT r i t u r u s v i r i d e s c e n s ) , w e r e p u r c h a s e d f r o m L e e ' s N e w t F a r m( O a k R i d g e , T N ) . T h e s e a n i m a l s were a d u l t s o f m i x e d s e x a n d6 - 1 1 cm i n l e n g t h . A m i l o r i d e ( N - a m i d i n o - 3 , 5 - d i a m i n o - 6 -c h l o r o p y r a z i n e c a r b o x a m i d e ) w a s k i n d l y p r o v i d e d b y W . B . G a l lo f M e r c k S h a r p a n d D o h m e R e s e a r c h L a b o r a t o r i e s ( R a h w a y ,N J ) .P r i o r t o u s e t h e a n i m a l s w e r e k e p t i n w e l l w a t e r . A l l w o r k w a sd o n e a t 1 9 - 2 0 . D u r i n g e l e c t r i c a l m e a s u r e m e n t s a n d r e g e n -e r a t i o n , t h e a n i m a l s w e r e k e p t i n a r t i f i c i a l p o n d w a t e r c o n -t a i n i n g 1 . 5 mM N a C l , 0 . 2 mM N a H C O 3 , 0 . 1 mM K C 1 , a n d 0 . 8mM C a C 1 2 ( 9 ) . T h i s m e d i u m h a d a r e s i s t i v i t y o f 2 3 0 0 - 2 6 0 0 o h mc m .E x t r a c e l l u l a r c u r r e n t d e n s i t i e s w e r e m e a s u r e d w i t h a 3 0 - M md i a m e t e r , u l t r a s e n s i t i v e v i b r a t i n g p r o b e ( 8 ) w i t h a n i m p r o v e dv i b r a t o r ( 1 0 ) . I t w a s o p e r a t e d a t a r e s o n a n t f r e q u e n c y o f3 1 0 - 3 2 0 H z , a p e a k - t o - p e a k a m p l i t u d e o f 7 0 , m , a n d a t i m ec o n s t a n t o f 1 s e c . T h e r o o t - m e a n - s q u a r e n o i s e w a s a b o u t 0 . 0 0 4M A / c m 2 .P r i o r t o a m p u t a t i o n a n d e l e c t r i c a l m e a s u r e m e n t s , t h e a n i m a l sw e r e a n e s t h e t i z e d i n 0 . 3 5 % t r i c a i n e m e t h a n e s u l f o n a t e ( S i g m a ) ,c o m m o n l y c a l l e d M S - 2 2 2 . ( T h e s t a n d a r d 0 . 1 % s o l u t i o n d i d n o ta d e q u a t e l y i m m o b i l i z e t h e a n i m a l s f o r e l e c t r i c a l m e a s u r e -m e n t s . ) T h e r i g h t f o r e l i m b w a s a m p u t a t e d t h r o u g h t h e e l b o wj o i n t w i t h s u r g i c a l s c i s s o r s . T h e p r o t r u d i n g h u m e r u s w a s t h e nc a r e f u l l y t r i m m e d f l u s h w i t h i r i d e c t o m y s c i s s o r s . D u r i n g r e -g e n e r a t i o n , s i n g l e a n i m a l s w e r e k e p t p a r t i a l l y i m m e r s e d i nf i n g e r b o w l s . T h e y w e r e f e d f r e e z e - d r i e d T u b i f e x o r l i v e " w h i t ew o r m s " ( E n c h y t r a e s p . ) t w i c e a w e e k , a n d t h e i r m e d i u m w a sc h a n g e d a t l e a s t t h r e e t i m e s a w e e k . P r i o r t o e l e c t r i c a l m e a -s u r e m e n t s , e a c h a n i m a l w a s r i n s e d i n a n e s t h e t i c - f r e e m e d i u ma n d t r a n s f e r r e d t o a s h a l l o w , o p e n - t o p p e d , t r a n s p a r e n t m e a -s u r i n g c h a m b e r ( 7 0 X 4 5 X 5 m m ) . E n o u g h m e d i u m t o i m -m e r s e t h e l i m b a n d t o a l l o w c o n v e n i e n t m e a s u r e m e n t s ( 3 - 5 mmd e p t h ) w a s a d d e d . R e f e r e n c e m e a s u r e m e n t s w e r e m a d e a t l e a s t1 c m a w a y f r o m t h e l i m b . T h e p r o b e w a s v i b r a t e d h o r i z o n t a l l ya n d n o r m a l t o t h e n e a r b y s u r f a c e o f t h e l i m b t o m e a s u r e t h eh o r i z o n t a l d e n s i t i e s o f c u r r e n t l e a v i n g o r e n t e r i n g t h i s s u r f a c e .T h e c e n t e r o f v i b r a t i o n w a s u s u a l l y 3 4 0 um a w a y f r o m t h i sA b b r e v i a t i o n : m e L y s , m e t h y l e s t e r o f l y s i n e .* T h i s i s p a p e r n o . 2 i n a s e r i e s . P a p e r n o . 1 i s r e f . 1 .

4 5 2 8


2/5

P r o c . N a t l . A c a d . S c i . USA 7 4 ( 1 9 7 7 ) 4 5 2 9

A 4

mm

*~~~ ~~Xip+_A / C M 2r1 ~ 2 mm

F I G . 1 . C u r r e n t p a t t e r n s a r o u n d ( A ) i n t a c t a n d ( B ) a m p u t a t e dn e w t f o r e l i m b s . E a c h a r r o w i n d i c a t e s t h e c u r r e n t d e n s i t y i n t h em i d - h o r i z o n t a l p l a n e , n o r m a l t o t h e s u r f a c e a n d 3 4 0 , g m o u t f r o m t h i ss u r f a c e . N o t e t h a t i n A t h e c u r r e n t d e n s i t y s c a l e i s 1 0 - f o l d l a r g e r t h a ni n B i n o r d e r t o a l l o w v i s u a l i z a t i o n o f t h e r e l a t i v e l y l o w v a l u e s f o u n dn e a r i n t a c t l i m b s . ( A ) I n t a c t l i m b , O c t . 2 8 , 1 9 7 6 . No m e a s u r e m e n t sw e r e m a d e o n t h e p r e a x i a l s i d e o f t h e u p p e r a r m b e c a u s e t h i s r e g i o nw a s i n a c c e s s i b l e t o t h e p r o b e . ( B ) M e a s u r e m e n t s 2 0 h r a f t e r a m p u -t a t i o n o n M a r c h 8 , 1 9 7 6 .s u r f a c e . A t t h i s d i s t a n c e , s o m e d e c l i n e i n c u r r e n t d e n s i t y h a do c c u r r e d ( s e e b e l o w ) . N e v e r t h e l e s s , r o u t i n e m e a s u r e m e n t s w e r em a d e a t t h i s d i s t a n c e b e c a u s e t h e o p t i c s w e r e b e t t e r a n d b e c a u s et h i s r e d u c e d t h e l i k e l i h o o d t h a t o c c a s i o n a l t w i t c h e s o f t h e l i g h t l ya n e s t h e t i z e d a n i m a l w o u l d s m a s h t h e p r o b e .

RESULTSW e m a d e t h r e e p r e l i m i n a r y s c a n s o f t h e s t e a d y c u r r e n t s l e a v i n go r e n t e r i n g t h e i n t a c t f o r e l i m b s o f a d u l t n e w t s ( F i g . 1 A ) . S p e -c i f i c a l l y , w e m a d e m e a s u r e m e n t s a t 3 4 0 - , g m i n t e r v a l s i n t h em i d p l a n e a r o u n d t h e e n t i r e f o r e l i m b d i s t a l t o t h e e l b o w a s w e l la s i n t h e a c c e s s i b l e r e g i o n s p r o x i m a l t o t h e e l b o w . C u r r e n t w a sf o u n d t o e n t e r a t a l m o s t a l l l o c a t i o n s . I t l e f t t h e b a s e o f t h e f i r s td i g i t a n d o c c a s i o n a l l y a t t h e f i n g e r t i p s . M e a s u r e d e n t r y c u r r e n td e n s i t i e s w e r e g e n e r a l l y i n t h e r a n g e o f 0 . 0 1 - 1 j A A / c m 2 ,w h e r e a s e x i t c u r r e n t s w e r e b e t w e e n 0 . 2 a n d 1 . 4 , g A / c m 2 .F a r l a r g e r s t e a d y c u r r e n t s , o f t h e o r d e r o f 5 0 t i m e s l a r g e r , l e f tt h e s t u m p s o f r e c e n t a m p u t e e s . F i g . 1 B s h o w s a t y p i c a l s c a nw i t h a p e a k e x i t c u r r e n t d e n s i t y o f 3 0 g A / c m 2 . N o t e t h a t t h ec o m p a r a b l e i n c r e a s e s i n e n t r y c u r r e n t d e n s i t i e s w e r e m u c hs m a l l e r . T h e s e i l l u s t r a t i v e v a l u e s w e r e m e a s u r e d a b o u t 3 4 0 , g mf r o m t h e a n i m a l ' s s u r f a c e . A p p r o p r i a t e m e a s u r e m e n t s o f t h ec u r r e n t d e n s i t y v a r i a t i o n w i t h d i s t a n c e f r o m t h e s u r f a c e i n d i -c a t e d t h a t d e n s i t i e s a t t h e s u r f a c e w e r e a b o u t 7 0 % h i g h e r . A l ls u b s e q u e n t v a l u e s w e r e t h u s c o r r e c t e d .I t w a s o f o b v i o u s i n t e r e s t t o e x p l o r e t h e t i m e c o u r s e o f t h e s el a r g e s t e a d y s t u m p c u r r e n t s . I n 1 1 c a s e s , t h e s t e a d y s u r f a c ec u r r e n t s w e r e m e a s u r e d d a i l y f r o m a m p u t a t i o n t h r o u g h t h em e d i u m b u d s t a g e t o l a t e b u d s t a g e o f b l a s t e m a f o r m a t i o n , 2 - 3

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8 g DD O A0 0 0 0 a (

0 C A C CS~ ) 0

2 3 45 67 8 9 1 0 1 1 1 2 1 3 1 4 1D a y s a f t e r a m p u t a t i o nF I G . 2 . P e a k s u r f a c e c u r r e n t d e n s i t i e s v e r s u s t i m e a f t e r a m p u -t a t i o n . R e c o r d s o f e i g h t s e p a r a t e a n i m a l s a m p u t a t e d D e c . 1 , 1 9 7 6 , a r es h o w n . S h a d e d r e g i o n s i n d i c a t e a p p r o x i m a t e t i m e o f e x t e r n a l b l a s -t e m a a p p e a r a n c e . S h a d i n g b e g i n s a t t h e f i r s t h i n t o f t h i s e v e n t a n de n d s w h e n i t i s u n m i s t a k a b l e . I n s e t s h o w s s t a n d a r d m e a s u r i n g p o s i -t i o n a t w h i c h c o n t i n u o u s v e r t i c a l s c a n s w e r e m a d e . N o t e t h a t i n g o i n gf r o m A t o E , o n e p r o g r e s s e s f r o m t h e p r e a x i a l t o t h e p o s t a x i a l s i d e o ft h e s t u m p . T h e l o c a t i o n o f t h e m a xim u m c u r r e n t d e n s i t y a l o n g t h i sd i r e c t i o n i s i n d i c a t e d a b o v e e a c h d a t a p o i n t . T h e s y m b o l u s e d f o r e a c hd a t a p o i n t i n d i c a t e s t h e c h a r a c t e r o f t h e i n t e g u m e n t a t t h i s m a x i m u m :x , i n t e g u m e n t may n o t y e t b e r e s t o r e d ; 0 , c l e a r e p i t h e l i u m ; 0 , f u l l yp i g m e n t e d s k i n ; Q , a t r a n s i t i o n a l r e g i o n . ( c f . F i g . 3 ) . T h e v e r y f i r s tm e a s u r e m e n t w a s a t 5 h r a f t e r a m p u t a t i o n i n e v e r y c a s e .

w e e k s l a t e r ( 1 1 ) . I n a l l 1 1 c a s e s , t h e b a s i c p a t t e r n i l l u s t r a t e d i nF i g . 1 B p e r s i s t e d f o r 1 - 2 w e e k s a f t e r a m p u t a t i o n . R e l a t i v e l yi n t e n s e c u r r e n t s , o f t h e o r d e r o f 1 0 - 1 0 0 A A / c m 2 a t t h e s u r f a c e ,c o n t i n u e d t o l e a v e t h e e n d o f t h e s t u m p , w h e r e a s c u r r e n t s o fr e l a t i v e l y l o w d e n s i t y , o f t h e o r d e r o f 1 - 3 , i A / c m 2 a t t h e s u r -f a c e , c o n t i n u e d t o e n t e r t h e r e s t o f t h e l i m b .I n e i g h t c a s e s , w e e x t e n d e d o u r e x p l o r a t i o n t o t h e v e r t i c a l a x i st o f i n d t h e l o c u s o f p e a k c u r r e n t d e n s i t y m o r e e x a c t l y . T h i sp r o c e d u r e w a s r e p e a t e d d a i l y f r o m t h e t i m e o f a m p u t a t i o nt h r o u g h t h e t i m e o f b l a s t e m a f o r m a t i o n . M o r e o v e r , c a m e r al u c i d a d r a w i n g s o f t h e s k i n p a t t e r n a t t h e s t u m p ' s e n d w e r em a d e a t t h e t i m e o f e a c h c u r r e n t d e n s i t y s c a n ( F i g s . 2 a n d3 ) . T h e s e r e s u l t s i n d i c a t e d s e v e r a l s u b s t a n t i a l r e g u l a r i t i e s . A l l

D e v e l o p m e n t a l B i o l o g y : B o r g e n s e t a l .

- 2

k s '- I


3/5

4 5 3 0 D e v e l o p m e n t a l B i o l o g y : B o r g e n s e t a l .

1 mm24 5 ~ ~~~~711 13 15D a y s a f t e r a m p u t a t i o nF I G . 3 . Tw o r e p r e s e n t a t i v e s e r i e s o f camera l u c i d a d r a w i n g s o f stump s u r f a c e s f o l l o w i n g a m p u t a t i o n . U p p e r s e r i e s i s o f a n i m a l 6 i n Fig. 2 ;L o w e r s e r i e s i s o f a n i m a l 3 . B l a c k r e g i o n s , f u l l y p i g m e n t e d s k i n ; w h i t e , u n p i g m e n t e d ; s t i p p l e d , p a r t i a l l y p i g m e n t e d s k i n . V e r t i c a l s c a n s w e r em a d e a t e a c h o f t h e f i v e s t a n d a r d m e a s u r i n g p o s i t i o n s A - E . E a c h d o t i n d i c a t e s t h e l o c a t i o n o f t h e p e a k c u r r e n t d e n s i t y a l o n g one o f t h e s e scans.L a r g e s t d o t i n d i c a t e s t h e l a r g e s t o f t h e s e f i v e . P r o t u b e r a n c e s a s s o c i a t e d w i t h d e v e l o p m e n t o f an e x t e r n a l l y o b v i o u s b l a s t e m a f o r m e d b e t w e e nd a y s 9 a n d 1 2 i n b o t h c a s e s . A r r o w s i n d i c a t e t i m e s a t w h i c h t h e p e a k c u r r e n t d e n s i t y f e l l b e l o w 5 M A / c m 2 .

o f t h e p e a k c u r r e n t d e n s i t i e s d u r i n g t h e f i r s t w e e k w e r e o u t w a r da n d m o s t w e r e very h i g h , i n t h e r a n g e o f 2 0 - 1 0 0 , g A / c m 2 . T h e yd i d n o t n e c e s s a r i l y d e c r e a s e s t e a d i l y a f t e r a m p u t a t i o n . O f t e nt h e y r e a c h e d a m a x i m u m s e v e r a l d a y s a f t e r a m p u t a t i o n , a n di n m o s t cases t h i s l a t e m a x i m u m e q u a l e d or e x c e e d e d t h e e a r-l i e s t v a l u e , m e a s u r e d 4 - 5 h r a f t e r a m p u t a t i o n . T h e y t h e n f e l la n d r e m a i n e d a t q u i t e l o w v a l u e s or e v e n r e v e r s e d a t a b o u t t h et i m e o f g r o s s l y v i s i b l e b l a s t e m a f o r m a t i o n .L a r g e o u t w a r d c u r r e n t s s h o w e d a s t r o n g t e n d e n c y t o p e a kov e r c l e a r , n e w l y f o r m e d e p i t h e l i u m a n d r a r e l y a p p e a r e d overf u l l y p i g m e n t e d , matu re s k i n . O f 5 6 p e a k o u t w a r d c u r r e n t sl a r g e r t h a n 5 t i A / c m 2 , 4 4 ( o r 7 8 % ) w e r e ov e r c l e a r e p i t h e l i u m ,1 0 ( o r 1 8 % ) were o v e r b o r d e r l i n e or t r a n s i t i o n a l r e g i o n s ,w h e r e a s o n l y 2 ( o r 4 % ) l a y ov e r m a t u r e s k i n . L a r g e o u t w a r dc u r r e n t s a l s o s h o w e d a s t r o n g t e n d e n c y t o a p p e a r ov e r t h ep o s t a x i a l r e g i o n ( p o s i t i o n s D or E , F i g . 3 ) : 4 1 ( o r 7 3 % ) werep o s t a x i a l , 1 1 ( o r 2 0 % ) were c e n t r a l , a n d o n l y 4 ( o r 7 % ) werep r e a x i a l .S o u r c e o f t h e C u r r e nt . T h e l i m b s w e r e d e p r i v e d o f t h e i rm o t o r a n d se n sor y n e r v e s i n o r d e r t o t e s t w h a t c o n t r i b u t i o n , i fa ny , t h e s e n e r v e s m a d e t o t h e r e g e n e r a t i o n c u r r e n t s . T h e r i g h tl i m b s o f t h r e e a n i m a l s were d e n e r v a t e d b y r e m o v i n g s e c t i o n sa t l e a s t 1 mm l o n g f r o m a l l o f t h e t r u n k s o f t h e i r b r a c h i a l p l e x i .A d a y l a t e r , t h e e f f e c t i v e n e s s o f t h i s p r o c e s s w a s e s t a b l i s h e d b yn o t i n g t h a t t h e d e n e r v a t e d a r m s w e r e c o m p l e t e l y i m m o b i l e a n dg a v e n o s t a r t l e response w h e n p r i c k e d . T h e n , b o t h f o r e l i m b sw e r e a m p u t a t e d a n d t h e p e a k c u r r e n t s w e r e m e a s u r e d 3 0 h rl a t e r . I n a l l t h r e e c a s e s , t h e d e n e r v a t e d s t u m p g e n e r a t e d a l a r g e rc u r r e n t t h a n t h e c o n t r a l a t e r a l c o n t r o l s t u m p . S p e c i f i c a l l y , t h ep e a k c o n t r o l c u r r e n t d e n s i t i e s were 2 8 , 3 9 , a n d 3 8 , u A / c m 2w h e r e a s t h e c o r r e s p o n d i n g d e n e r v a t e d s t u m p v a l u e s were 9 9 ,6 1 , a n d 4 7 t i A / c m 2 .A s a f u r t h e r d i r e c t t e s t o f t h e h y p o t h e s i s t h a t t h e r e g e n e r a t i o nc u r r e n t s a r e s k i n - d r i v e n , we v a r i e d t h e s o d i u m c o n c e n t r a t i o ni n t h e m e d i u m a n d o b s e r v e d m a r k e d a n d r e v e r s i b l e e f f e c t s ont h e s e c u r r e n t s ( T a b l e 1 ) . Wh e n t h e s o d i u m l e v e l w a s r a i s e d f r o mt h e s t a n d a r d 1 . 7 mM b y a b o u t 5 - f o l d ( t o 8 m M ) , t h e p e a k cur-r e n t d e n s i t y l e a v i n g t h e s u r f a c e o f t h e s t u m p was a l w a y s f o u n dt o h a v e r i s e n 1 5 - 2 0 m i n l a t e r . I n c a s e s 1 - 7 , i n w h i c h t h e s t a r t i n gc u r r e n t s w e r e 1 6 , A / c m 2 or l e s s , t h e i n c r e a s e a v e r a g e d 4 . 7 - f o l d .T h u s , t h e r e l a t i v e i n c r e a s e i n c u r r e n t t e n d e d t o e q u a l t h a t i ne x t e r n a l s o d i u m c o n c e n t r a t i o n . I n cases 8 - 1 1 , i n w h i c h t h es t a r t i n g c u r r e n t s were r e l a t i v e l y h i g h ( 2 9 - 8 6 j A A / c m 2 ) , t h e i n -c r eas e t e n d e d t o b e f a r s m a l l e r , v a r y i n g f r o m 1 0 t o 4 5 % a n da v e r a g i n g o n l y 2 3 % . We l o w e r e d t h e s o d i u m l e v e l t o n e a r l y zero( i . e . , < 0 . 0 0 1 m M) i n t w o d i f f e r e n t ways . In cases 1 2 - 1 4 , we

s h i f t e d d i r e c t l y t o t h i s m e d i u m f r o m t h e s t a n d a r d m e d i u m . T h ep e a k c u r r e n t t h e n f e l l g r e a t l y . W i t h i n 1 5 - 3 0 m i n , i t f e l l b y 9 9 % ,9 6 % , a n d 7 9 % , r e s p e c t i v e l y . I n cases 4 - 1 1 , we s h i f t e d t o n e a r -z ero s o d i u m f r o m h i g h s o d i u m a n d t h e c u r r e n t f e l l b y 6 0 - 9 8 % .A l t o g e t h e r , t h e s e d a t a seem c o n s i s t e n t w i t h t h e c o n c e p t t h a t t h er e g e n e r a t i o n c u r r e n t t e n d s t o v a r y w i t h e x t e r n a l s o d i u m c o n -c e n t r a t i o n ov e r a c o n s i d e r a b l e r a n g e o f c o n c e n t r a t i o n s , w h i c hi n c l u d e s t h e n a t u r a l l e v e l , a s w e l l as o ve r a c o n s i d e r a b l e r a n g eo f c u r r e n t d e n s i t i e s b e t w e e n a s m a l l s o d i u m - i n d e p e n d e n t b a s ec u r r e n t a n d a s a t u r a t i n g l e v e l .A s a c o n f i r m a t o r y t e s t o f t h e h y p o t h e s i s t h a t t h e s e c u r r e n t sa re g e n e r a t e d b y t h e s k i n , we b l o c k e d s o d i u m e n t r y i n t o t h e s k i nT a b l e 1 . E f f e c t s o f c h a n g e s i n e x t e r n a l s o d i u m * o n p e a k s t u m p

c u r r e n t s 1 d a y a f t e r a m p u t a t i o nA n i m a l

N a + T i m e t 1 2 3R e s p o n s e t o s t a n d a r d , h i g h , t h e n s t a n d a r d s o d i u m

S t d . 0 m i n 2 . 8 4 . 2 1 6H i g h 2 0 1 7 1 8 1 0 6S t d . 1 0 0 1 2 1 . 4 1 4A n i m a l

4 5 6 7 8 9 1 0 1 1R e s p o n s e t o s t a n d a r d , h i g h , t h e n l o w s o d i u mS t d . 0 m i n 2 . 4 3 . 6 3 . 6 4 . 3 2 9 3 7 4 1 8 6H i g h 1 5 2 . 5 8 . 2 8 . 0 4 6 4 2 4 1 5 0 9 9Lo w 1 5 1 . 0 4 0 . 2 0 . 2 0 . 8 5 1 . 0 3 . 6 3 . 4 3 . 7

A n i m a l1 2 1 3 1 4

R e s p o n s e t o s t a n d a r d , l o w , t h e n s t a n d a r d s o d i u mS t d . 0 m i n 1 0 . 4 2 0 2 7Low 1 5 8 . 0 0 . 8 9 0 . 2 23 0 2 . 2S t d . 2 h r 6 . 5 1 . 5 8 . 13 1 . 4 9 . 54 1 2 . 2 5 . 1 2 65 1 4

T h e v a l u e s w i t h i n t h e b o d y o f t h e t a b l e i n d i c a t e p e a k c u r r e n td e n s i t i e s i n M A / c m 2 .* S t a n d a r d s o d i u m w a s 1 . 7 mM ( a r t i f i c i a l p o n d w a t e r ) ; h i g h w a s 8 mM( a r t i f i c i a l p o n d w a t e r p l u s 6 . 3 mM N a C l ) ; l o w c o n t a i n e d < 0 . 0 0 1 mMa s d e t e r m i n e d w i t h a s o d i u m - s p e c i f i c e l e c t r o d e ( a r t i f i c i a l p o n d w a t e rw i t h s o d i u m s a l t s o m i t t e d ) .t Time e l a p s e d a f t e r t h e l a s t c h a n g e o f m e d i u m .

P r o c . N a t l . A c a d . S c i . USA 7 4 ( 1 9 7 7 )


4/5

P r o c . N a t l . A c a d . S c i . USA 7 4 ( 1 9 7 7 ) 4 5 3 1T a b l e 2 . R a p i d e f f e c t s o f a m i l o r i d e a n d o f m e L y s t r e a t m e n t o n

p e a k s t u m p c u r r e n t s ( i n u A / c m 2 )D r u g C a s e B e f o r e d r u g 1 5 m i n a f t e r 5 0 m i n a f t e r

A m i l o r i d e 1 3 . 9 0 . 4 82 6 . 8 2 . 53 2 2 1 6 4 . 44 5 3 1 5 4 . 05 7 9 2 4 3 . 26 1 2 0 2 6 8 . 8m e L y s 7 1 5 0 . 48 2 1 1 . 99 2 4 8 . 0 0 . 2

1 0 2 8 2 . 3C u r r e n t s w e r e m e a s u r e d 2 4 ( c a s e s 3 a n d 4 ) o r 3 0 h r a f t e r a m p u t a -t i o n . I n e a c h c a s e , a c o n t r o l m e a s u r e m e n t w a s m a d e w i t h s t a n d a r da r t i f i c i a l p o n d w a t e r . A n i m a l s w e r e t h e n f u l l y i m m e r s e d i n a s o l u t i o no f e i t h e r 0 . 5 mM a m i l o r i d e o r 3 mM m e L y s i n t h i s s a m e m e d i u m .R e a d i n g s w e r e t h e n m a d e 1 5 m i n a n d 5 0 m i n l a t e r ( e x c e p t f o r c a s e 9 ,i n w h i c h i t w a s m a d e 3 0 m i n l a t e r ) .

w i t h a m i l o r i d e ( 1 2 , 1 3 ) o r w i t h t h e m e t h y l e s t e r o f l y s i n e( m e L y s ) ( 1 4 ) . T a b l e 2 s h o w s t h e r e s u l t s . I n s i x c a s e s , i n c l u d i n ga r a n g e o f i n i t i a l v a l u e s f r o m 4 t o 1 2 0 M A / c m 2 , 0 . 5 mM a m i l o -r i d e r e d u c e d t h e p e a k c u r r e n t b y a n a v e r a g e o f 6 8 % w i t h i n 1 5m i n . M e a s u r e m e n t s w e r e c o n t i n u e d f o r 5 0 m i n i n f o u r c a s e s .I n t h e s e , t h e c u r r e n t h a d f a l l e n b y a n a v e r a g e o f 9 0 % . I n t h r e eo f f o u r c a s e s , 3 mM m e L y s r e d u c e d t h e p e a k c u r r e n t b y 9 0 %o r m o r e w i t h i n 1 5 m i n ; i n a f o u r t h c a s e , s u c h r e d u c t i o n t o o k 3 0m i n t o r e a c h .W e r o u t i n e l y i m m o b i l i z e d t h e a n i m a l s w i t h t r i c a i n e m e t h -a n e s u l f o n a t e b e f o r e m e a s u r i n g c u r r e n t s . H o w e v e r , c h e c k s w i t ht w o o t h e r a g e n t s [ 0 . 5 % u r e t h a n a n d d - t u b o c u r a r i n e ( i n t r a -p e r i t o n e a l l y ) ] s h o w e d c o m p a r a b l e o u t w a r d s t u m p c u r r e n td e n s i t i e s ( s e e a l s o r e f . 1 5 ) . B e c a u s e t h r e e q u i t e d i f f e r e n t i m -m o b i l i z i n g a g e n t s y i e l d e d c o m p a r a b l e v a l u e s , w e c o n c l u d e t h a to u r u s e o f t r i c a i n e m e t h a n e s u l f o n a t e d i d n o t u n d u l y a f f e c t t h er e s u l t s .

DISCUSSIONN a t u r e a n d S o u r c e o f t h e S t u m p C u r r e n t s . O u r m a i nf i n d i n g i s t h a t a c u r r e n t w i t h a p e a k d e n s i t y o f t h e o r d e r o f1 0 - 1 0 0 M i A / c m 2 i s d r i v e n o u t o f t h e e n d o f t h e n e w t ' s f o r e l i m bs t u m p f o r a b o u t a w e e k a f t e r a m p u t a t i o n . O u r r e s u l t s a g r e e w i t ht h o s e o f M o n r o y a n d o f B e c k e r i n s h o w i n g c u r r e n t l e a v i n g t h es t u m p e n d d u r i n g t h e f i r s t w e e k o r t w o a f t e r a m p u t a t i o n .N e i t h e r M o n r o y n o r B e c k e r d e t e r m i n e d t h e s i z e o f t h e c u r r e n t st h a t p r o d u c e d t h e s u r f a c e p o t e n t i a l s w h i c h t h e y m e a s u r e d .H o w e v e r , i t i s o f a t l e a s t h i s t o r i c a l i n t e r e s t t o n o t e t h a t M o n r o yu s e d a 1 KQ g a l v a n o m e t e r t o m e a s u r e t h e s e v o l t a g e s ( A . M o n -r o y , p e r s o n a l c o m m u n i c a t i o n ) , a m e t e r o f s u c h l o w r e s i s t a n c et h a t m u c h o f t h e c u r r e n t m a y a c t u a l l y h a v e t r a v e r s e d t h e m e t e r .H e n c e , t h e o u t w a r d c u r r e n t d e n s i t y ( f r o m a 1 - m m 2 s t u m ps u r f a c e ) c o r r e s p o n d i n g t o h i s f i r s t r e c o r d e d m e a s u r e m e n t ( o f0 . 1 5 mV a t 1 d a y a f t e r a m p u t a t i o n ) c a n n o w b e e s t i m a t e d a sa b o u t 1 5 M A / c m 2 . T h u s , i n r e t r o s p e c t , i t a g r e e s w i t h o u r n e wm e a s u r e m e n t s .B o t h t h e s k i n a n d t h e n e r v e s h av e b e e n s u g g e s t e d a s t h es o u r c e o f t h e e l e c t r i c a l o u t p u t o f i n j u r e d o r a m p u t a t e d a m -p h i b i a n l i m b s . T h u s , B e c k e r h a s c l a i m e d t h a t d e n e r v a t i o nl a r g e l y e l i m i n a t e s t h e s u r f a c e p o t e n t i a l g r a d i e n t a l o n g i n t a c tl i m b s ( 1 6 ) a n d h a s a p p a r e n t l y a s s u m e d t h a t n e r v e s a r e t h es o u r c e o f l i m b r e g e n e r a t i o n c u r r e n t s ( 5 ) . H o w e v e r , t h e r e s u l t so f b o t h M o n r o y ( 4 ) a n d L a s s a l l e ( 1 7 ) a r g u e a g a i n s t a n e u r a ls o u r c e o f r e g e n e r a t i o n c u r r e n t s a n d a r g u e f o r a s k i n s o u r c e . B o t hf o u n d s u r f a c e p o t e n t i a l s t o b e u n a f f e c t e d b y d e n e r v a t i o n ,

w h e r e a s L a s s a l l e f u r t h e r r e p o r t e d t h a t a b l a t i o n o f t h e e p i d e r m i se l i m i n a t e s t h e s e p o t e n t i a l s .O u r o w n f i n d i n g s c l e a r l y p o i n t t o t h e s k i n r a t h e r t h a n t o t h en e r v e s a s t h e pump t h a t d r i v e s t h e s e s t u m p c u r r e n t s . T r a n s e c -t i o n o f t h e m a i n l i m b n e r v e s c e r t a i n l y d o e s n o t r e d u c e t h e s ec u r r e n t s ; i n d e e d , i t s e e m s t o a c t u a l l y i n c r e a s e t h e m . M o r e o v e r ,s t r o n g p o s i t i v e e v i d e n c e f o r a n e p i d e r m a l o r i g i n o f t h e s e c u r -r e n t s i s p r o v i d e d b y t e c h n i q u e s t h a t a f f e c t t h e t e n d e n c y o f e x -t e r n a l s o d i u m t o e n t e r t h e s k i n . I t i s w e l l k n o w n t h a t a m p h i b i a ns k i n c u r r e n t s c o n s i s t , i n f a c t , o f a s o d i u m i n f l u x a n d t h e r e f o r er e q u i r e s o d i u m e n t r y ( 1 8 ) . When we e i t h e r r e m o v e d s o d i u mf r o m t h e m e d i u m o r i n t r o d u c e d s u b s t a n c e s ( a m i l o r i d e o rm e L y s ) t h a t b l o c k s o d i u m e n t r y , t h e s t u m p c u r r e n t w a s q u i c k l ya n d g r e a t l y r e d u c e d . On t h e o t h e r h a n d , i n c r e a s e s i n e x t e r n a ls o d i u m a b o v e t h e u s u a l p o n d - w a t e r l e v e l i n d u c e d r a p i d i n -c r e a s e s i n t h e s t u m p c u r r e n t .A l t h o u g h t h e s t u m p s u r f a c e i s c o v e r e d b y a w o u n d e p i t h e -l i u m w i t h i n 5 - 1 0 h r a f t e r a m p u t a t i o n ( S . V . B r y a n t , p e r s o n a lc o m m u n c a t i o n ) , l a r g e o u t w a r d c u r r e n t s p e r s i s t f o r a w e e k o rm o r e . P r e s u m a b l y , t h e n e w e p i t h e l i u m h a s a r e l a t i v e l y h i g he l e c t r i c a l c o n d u c t i v i t y , s o t h a t t h e c h a r g e s p u m p e d i n t o t h ea n i m a l b y i t s i n t a c t s k i n l e a k o u t t h r o u g h t h i s r e g i o n . H o w e v e r ,i t m a y b e n o t e d t h a t t h e d e n s i t y o f t h e s e o u t w a r d c u r r e n t s d o e sn o t n e c e s s a r i l y d e c l i n e s t e a d i l y a f t e r a m p u t a t i o n . I n d e e d , i t m a yp e a k a s l a t e a s 4 d a y s a f t e r a m p u t a t i o n . F i n a l l y , i t s h o u l d b ep o i n t e d o u t t h a t c u r r e n t s d r i v e n b y i n j u r y t o i n d i v i d u a l n e r v ea n d m u s c l e c e l l s w o u l d b e e x p e c t e d t o e n t e r t h e s t u m p r a t h e rt h a n l e a v e i t . T o t h e e x t e n t t h a t s u c h c e l l u l a r i n j u r y c u r r e n t sw e r e s i g n i f i c a n t , t h e y w o u l d t h e r e f o r e b e e x p e c t e d t o h a v er e d u c e d t h e o b s e r v e d o u t w a r d s t u m p c u r r e n t s a n d m a y w e l le x p l a i n w h y t h e e a r l i e s t c u r r e n t s a r e n o t a l w a y s t h e l a r g e s t .I t m a y a l s o b e a s k e d w h a t s p e c i f i c i o n s c a r r y t h e s t u m p c u r -r e n t . M o s t o f t h e c u r r e n t p u m p e d b y t h e s k i n i n t o t h e s t u m pu n d o u b t e d l y c o n s i s t s o f s o d i u m i o n s , w h e r e a s t h e c u r r e n tl e a v i n g t h e c u t e n d o f t h e s t u m p i s d r i v e n b y t h e e l e c t r i c f i e l di n t u r n p r o d u c e d b y t h i s s o d i u m p u m p . M o r e o v e r , u n t i l a n e we p i t h e l i u m f o r m s , t h i s o u t w a r d c u r r e n t s h o u l d a l s o c o n s i s tl a r g e l y o f s o d i u m i o n s b e c a u s e t h e s e a r e t h e d o m i n a n t i n t e r -

s t i t i a l s p e c i e s a v a i l a b l e f o r c a r r y i n g p o s i t i v e c h a r g e s o u t w a r d .I n w a r d e l e c t r o p h o r e s i s o f c h l o r i d e i o n s s h o u l d c o n t r i b u t e r e l -a t i v e l y l i t t l e t o t h i s c u r r e n t b e c a u s e c h l o r i d e i s s o d i l u t e i n t h ee x t e r n a l m e d i u m , w h e r e a s o u t w a r d d i f f u s i o n o f N a C l , w h i c hm u s t a l s o o c c u r , w i l l n o t o f c o u r s e c a r r y a n y n e t c h a r g e . A f t e ra n e p i t h e l i u m c o v e r s t h e s t u m p , t h e i o n s t h a t c a r r y c u r r e n t o u ta r e u n k n o w n .R e l a t i o n s h i p o f S t u m p C u r r e n t s t o R e g e n e r a t i o n . O u r n e wd a t a s u g g e s t t h a t t h e s t u m p c u r r e n t s a r e a p a r t o f t h e r e g e n e r -a t i o n m e c h a n i s m a n d n o t j u s t a n e p i p h e n o m e n o n . F i r s t o f a l l ,t h e n a t u r a l s t u m p c u r r e n t i n n e w t s p r o v e s t o b e c o m p a r a b l e t ot h e a r t i f i c i a l l y i m p o s e d c u r r e n t s p r e v i o u s l y u s e d t o s t i m u l a t ea d e g r e e o f r e g e n e r a t i o n i n f r o g l i m b s ( 1 , 1 9 ) , i n d i r e c t i o n ( F i g .4 ) , d u r a t i o n ( w e e k s ) , p o s i t i o n ( m a i n l y p o s t a x i a l ) , a n d d e n s i t y .T h e u p p e r l i m i t t o t h e d e n s i t i e s i m p o s e d i n t h e s t i m u l a t i o ne x p e r i m e n t s c a n b e c a l c u l a t e d o n - t h e a s s u m p t i o n t h a t t h e t o t a lc u r r e n t d r a w n o u t o f t h e s t u m p b o t h c r o s s e d a n d a f f e c t e d t h er e g i o n j u s t b e n e a t h t h e s t i m u l a t i n g e l e c t r o d e . I n S m i t h ' s e x -p e r i m e n t ( 1 9 ) , t h i s f i g u r e w a s 0 . 1 M A d i v i d e d b y 0 . 1 c m 2 o r 1M A / c m 2 ; i n o u r o w n e x p e r i m e n t , i t w a s a b o u t 0 . 2 M t A / 0 . 0 1 c m 2o r 2 0 M A / c m 2 . T h e s e v a l u e s a r e c l e a r l y c o m p a r a b l e t o o r e v e ns m a l l e r t h a n t h e n a t u r a l c u r r e n t d e n s i t i e s l e a v i n g n e w t s t u m p s( F i g . 2 ) .S e c o n d , a c a r e f u l r e c o n s i d e r a t i o n o f s o m e o l d e r p a p e r s r e -p o r t i n g s t i m u l a t i o n o f f r o g r e g e n e r a t i o n b y s a l t s o l u t i o n s r e v e a l st h a t r e l a t i v e l y l o w c o n c e n t r a t i o n s o f s o d i u m s a l t s a r e q u i t e e f -f e c t i v e . A m o n g t h e m o s t e f f e c t i v e t r e a t m e n t s u s e d b y R o s e ( 2 0 )

D e v e l o p m e n t a l B i o l o g y : B o r g e n s e t a l .


5/5

4 5 3 2 D e v e l o p m e n t a l B i o l o g y : B o r g e n s e t a l .

F I G . 4 . C o m p a r i s o n o f c i r c u i t s d r i v i n g e n d o g e n o u s c u r r e n t st h r o u g h n e w t l i m b stumps ( U p p e r ) t o a r t i f i c i a l l y i m p o s e d c u r r e n t st h r o u g h f r o g l i m b s t u m p s ( L o w e r ) . T h e e n d o g e n o u s c u r r e n t wasd r i v e n b y t h e s k i n b a t t e r i e s . T h e a r t i f i c i a l l y i m p o s e d o n e was d r i v e nb y a m e r c u r y c e l l i m p l a n t e d i n t h e d o r s a l l y m p h s a c . C u r r e n t wasp u l l e d t h r o u g h t h e t i s s u e t o t h e m e r c u r y c e l l f r o m t h e e n d o f t h estump t h r o u g h a R i n g e r ' s s o l u t i o n - s o a k e d w i c k t h a t was i n s u l a t e df r o m t h e t i s s u e ( 1 ) .a n d P o l e z h a e v ( 2 ) were r e p e a t e d b r i e f a p p l i c a t i o n s o f 5 0 mMN a C l a n d 1 0 mM N a H C O 3 , r e s p e c t i v e l y . C o m p a r a b l e i n c r e a s e si n e x t e r n a l s o d i u m g r e a t l y i n c r e a s e t h e v o l t a g e across f r o g s k i n( 2 1 , 2 2 ) . H e n c e , t h e s e p r e v i o u s l y i n e x p l i c a b l e a n d l a r g e l y f o r -g o t t e n e f f e c t s o f d i l u t e s o d i u m s o l u t i o n s c a n now b e i n t e r p r e t e das a c t i n g b y s t i m u l a t i o n o f t h e f r o g ' s s k i n b a t t e r y .A t h i r d a r g u m e n t t h a t s u p p o r t s a r o l e f o r t h e stump c u r r e n t si n n e w t r e g e n e r a t i o n i s t h a t a p l a u s i b l e g e n e r a l m e c h a n i s m f o rp o s s i b l e e f f e c t s o n c e l l b e h a v i o r o f s u c h c u r r e n t s i s now a v a i l -a b l e . W e w o u l d s u g g e s t t h a t s k i n - d r i v e n c u r r e n t s o f t h i s m a g -n i t u d e a n d d u r a t i o n p r o d u c e s u f f i c i e n t f i e l d s i n t r a v e r s i n g somep a r t o f t h e s t u m p t o move a n d l o c a l i z e c e r t a i n d e v e l o p m e n t a l l yc r i t i c a l m a c r o m o l e c u l e s e l e c t r o p h o r e t i c a l l y . B o t h c a l c u l a t i o na n d e x p e r i m e n t i n d i c a t e t h a t s t e a d y p o t e n t i a l d r o p s a s s m a l las 1 mV a c r o s s a c e l l c a n e l e c t r o p h o r e t i c a l l y s e g r e g a t e some o ft h e m o b i l e m a c r o m o l e c u l e s f l o a t i n g i n i t s p l a s m a m e m b r a n e( 7 , 2 3 , 2 4 ) . B e c a u s e t h e e l e c t r o m o t i v e f o r c e s o f a m p h i b i a n s k i nb a t t e r i e s a r e k n o w n t o r a n g e f r o m 1 0 t o 1 0 0 mV ( 1 4 ) , t a r g e t c e l l si n some s u f f i c i e n t l y r e s i s t i v e p a r t o f t h e c u r r e n t ' s p a t h m i g h tw e l l b e e x p o s e d t o a v o l t a g e d r o p o f 1 mV or m o r e . P l a u s i b l et a r g e t c e l l s w o u l d i n c l u d e e p i d e r m a l c e l l s w i t h i n t h e w o u n de p i t h e l i u m a s w e l l a s t h e n e u r o n s t h a t p e n e t r a t e t h i s t i s s u e(1).A l t o g e t h e r , t h e s e c o n s i d e r a t i o n s h a v e e n c o u r a g e d us t o f u r -t h e r e x p l o r e t h e h y p o t h e s i s t h a t t h e r e a r e n a t u r a l e l e c t r i c a lc o n t r o l s o f a m p h i b i a n r e g e n e r a t i o n .T h e s e e x p e r i m e n t s a l s o r a i s e a f u r t h e r q u e s t i o n . A r e t h e r es k i n - d r i v e n e l e c t r i c a l c u r r e n t s t h a t p r o m o t e h e a l i n g or e v e nr e g e n e r a t i o n i n o t h e r v e r t e b r a t e s i n c l u d i n g m a n ? T h e r e i s a h i n t

i n t h e c l i n i c a l l i t e r a t u r e t h a t a r t i f i c i a l a p p l i c a t i o n o f s t e a d yc u r r e n t ( w h i c h s e e m s t o h a v e b e e n o f t h e o r d e r o f 1 0 - 1 0 0, u A / c m 2 ) m a y s p e e d h e a l i n g o f s k i n u l c e r s i n m a n ( 2 5 ) . M o r e -o v e r , t h e r e i s a n o l d a n d l a r g e l y f o r g o t t e n l i t e r a t u r e t h a t h a sd e m o n s t r a t e d w h a t m a y w e l l b e a n a t u r a l c o u n t e r p a r t t o t h e s ea r t i f i c i a l l y i m p o s e d c u r r e n t s : l a r g e , s t e a d y , e n d o g e n o u s e l e c -t r i c a l c u r r e n t s i n v a r i a b l y l e a v e i n j u r e d r e g i o n s o f h u m a n s k i na s w e l l a s a w i d e v a r i e t y o f o t h e r v e r t e b r a t e i n t e g u m e n t s ( 2 6 ,2 7 ) . H e r l i t z k a , f o r e x a m p l e , d e t e c t e d c u r r e n t s a s l a r g e a s 1 . 4 g Al e a v i n g s m a l l , s u p e r f i c i a l w o u n d s m a d e i n t h e s k i n o f h i s o w nh a n d . T h e a r e a o f t h e d a m a g e d r e g i o n s s e e m s t o h a v e b e e n o ft h e o r d e r o f 1 m m 2 , i n d i c a t i n g o u t w a r d c u r r e n t d e n s i t i e s o f u pt o 1 0 0 A t A / c m 2 . O u r n e w r e s u l t s e n c o u r a g e r e i n v e s t i g a t i o n o ft h e s e o l d f i n d i n g s .W e t h a n k D r . R i c h a r d N u c c i t e l l i f o r c a r e f u l l y i n s t r u c t i n g R . B . B . i nt h e u s e o f t h e v i b r a t i n g p r o b e a s w e l l a s f o r t h o u g h t f u l l y r e v i e w i n g t h i sp a p e r . T h i s w o r k w a s s u p p o r t e d b y g r a n t s f r o m P u r d u e ' s B i o m e d i c a lE n g i n e e r i n g C e n t e r a s w e l l a s G r a n t N S 1 1 5 4 5 f r o m t h e N a t i o n a l I n -s t i t u t e s o f H e a l t h .

1 . B o r g e n s , R . B . , V a n a b l e , J . W . , J r . & J a f f e , L . F . ( 1 9 7 7 ) J . E x p .Z o o l . 2 0 0 , 4 0 3 - 4 1 6 .2 . P o l e z h a e v , L . V . ( 1 9 7 2 ) L o s s a n d R e s t o r a t i o n o f R e g e n e r a t i v eC a p a c i t y i n T i s s u e s a n d O r g a n s o f A n i m a l s ( H a r v a r d U n i v .P r e s s . C a m b r i d g e , M A ) .3 . S m i t h , S . D . ( 1 9 7 0 ) A m . Z o o l . 1 0 , 1 9 1 - 1 9 5 .4 . M o n r o y , A . ( 1 9 4 1 ) P u b b i . S t n . Z o o l . N a p o l i 1 8 , 2 6 5 - 2 8 1 .5 . B e c k e r , R . 0 . ( 1 9 6 1 ) J . B o n e J t . S u r g . 4 3 - A , 6 4 3 - 6 5 6 .6 . R o s e , S . M . & R o s e , F . C . ( 1 9 7 4 ) G r o w t h 3 8 , 3 6 3 - 3 8 0 .7 . J a f f e , L . F . & N u c c i t e l l i , R . ( 1 9 7 7 ) A n n u . R e v . B i o p h y s . B i o m e d .E n g . 6 , 4 4 5 - 4 7 6 .8 . J a f f e , L . F . & N u c c i t e l l i , R . ( 1 9 7 4 ) J . C e l l B i o l . 6 3 , 6 1 4 - 6 2 8 .9 . A l v a r a d o , R . & K i r s c h n e r , L . B . ( 1 9 6 3 ) C o m p . B i o c h e m . P h y s i o l .1 0 , 5 5 - 6 7 .1 0 . N u c c i t e l l i , R . , P o o , M . - m . , & J a f f e , L . F . ( 1 9 7 7 ) J . G e n . P h y s i o l .6 9 , 7 4 3 - 7 6 4 .1 1 . I t e n , L . E . , & B r y a n t , S . V . ( 1 9 7 3 ) W i l h e l m R o u x A r c h . E n t -w i c k l u n g s m e c h . O r g . 1 7 3 , 2 6 3 - 2 8 2 .1 2 . B e n o s , D . L . , S i m o n , S . A . , M a n d e l , L . J . & C a l a , P . M . ( 1 9 7 6 ) J .G e n . P h y s i o l . 6 8 , 4 3 - 6 3 .

1 3 . L i n d e m a n n , B . & V a n D r i e s c h e , W . ( 1 9 7 7 ) S c i e n c e 1 8 5 , 2 9 2 -2 9 4 .1 4 . K i r s c h n e r , L . B . ( 1 9 7 3 ) i n T r a n s p o r t M e c h a n i s m s i n E p i t h e l i a ,e d s . U s s i n g , H . H . & T h o r n , N . A . ( M u n k s g a a r d , C o p e n h a g e n ) ,p p . 4 4 7 - 4 6 0 .1 5 . K i r s c h n e r , L . B . ( 1 9 7 0 ) A m . Z o o l . 1 0 , 3 6 5 - 3 7 6 .1 6 . B e c k e r , R . 0 . ( 1 9 6 0 ) I R E T r a n s . M e d . E l e c t r o n . 7 , 2 0 2 - 2 0 7 .1 7 . L a s s a l l e , B . ( 1 9 7 4 ) C . R . H e b d . S e a n c e s A c a d . S c i . , S e r . D ,1 0 5 5 - 1 0 5 8 .1 8 . U s s i n g , H . H . ( 1 9 6 4 ) H a r v e y L e c t . 5 9 , 1 - 3 0 .1 9 . S m i t h , S . D . ( 1 9 7 4 ) A n n . N . Y . A c a d . S c i . 2 3 8 , 5 0 0 - 5 0 7 .2 0 . R o s e , S . M . ( 1 9 4 4 ) J . E x p . Z o o l . 9 5 , 1 4 9 - 1 7 0 .2 1 . K i r s c h n e r , L . B . ( 1 9 5 5 ) J . C e l l . C o m p . P h y s i o l . 4 5 , 6 1 - 8 7 .2 2 . B e n t l e y , P . J . ( 1 9 7 5 ) C o m p . B i o c h e m . P h y s i o l . 5 0 A , 6 3 9 - 6 4 3 .2 3 . J a f f e , L . F . ( 1 9 7 7 ) N a t u r e 2 6 5 , 6 0 0 - 6 0 2 .2 4 . P o o , M . - m . , & R o b i n s o n , K . R . ( 1 9 7 7 ) N a t u r e 2 6 5 , 6 0 2 - 6 0 5 .2 5 . W h e e l e r , P . C . , W o l c o t t , L . E . , M o r r i s , J . L . & S p a n g l e r , M . R .( 1 9 6 8 ) i n N e u r o e l e c t r i c R e s e a r c h , e d s . R e y n o l d s , D . U . & S j o b e r g ,A . E . ( C . C T h o m a s , S p r i n g f i e l d , I L ) , p p . 8 3 - 9 9 .2 6 . Du B o i s - R e y m o n d , E . ( 1 8 6 0 ) U n t e r s u c h u n g e n f i b e r t i e r i s c h eE l e k t r i z i t a t I I . 2 ( R e i m e r , B e r l i n ) .2 7 . H e r l i t z k a , A . ( 1 9 1 0 ) W i l h e l m R o u x A r c h . E n t w i c k l u n g s m e c h .O r g . 1 0 , 1 2 6 - 1 5 8 .

P r o c . N a t l . A c a d . S c i . USA 7 4 ( 1 9 7 7 )

No a l l ..4 . 4 - *--

0. O N

bioelectricity and regeneration - currents in regenerating newt limbs (becker ref.)

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