BIOINFORMATIKA

Oleh : Nama : Wina Pratiwi Nugrahani NIM : B1J011019 Rombongan : VI Kelompok : 3 Asisten : Puspa Dwi Pratiwy

LAPORAN PRAKTIKUM BIOLOGI MOLEKULER

KEMENTERIAN PENDIDIKAN DAN KEBUDAYAANUNIVERSITAS JENDERAL SOEDIRMANFAKULTAS BIOLOGIPURWOKERTO2013I. PENDAHULUANA. Latar Belakang Plasmid adalah molekul DNA sirkular berukuran kecil yang terpisah dari kromsom. Palsmid ini ditemukan di dalam bakteri dan ragi yang merupakan eukariota uniseluler. Plasmid dapat bereplikasi tanpa tergantung dengan genom sel yang lain dan kadang-kadang ditransfer diantara sel-sel (Campbell, 2002).Kemampuan untuk memahami dan memanipulasi kode genetik DNA sekarang ini sangat didukung oleh teknologi informasi melalui perkembangan hardware dan soffware. Baik pihak pabrikan sofware dan hardware maupun pihak ketiga dalam produksi perangkat lunak. Perkembangan teknologi DNA rekombinan memainkan peranan penting dalam lahirnya bioinformatika. Teknologi DNA rekombinan memunculkan suatu pengetahuan baru dalam rekayasa genetika organisme yang dikenala bioteknologi. Perkembangan bioteknologi dari bioteknologi tradisional ke bioteknologi modren salah satunya ditandainya dengan kemampuan manusia dalam melakukan analisis DNA organisme, sekuensing DNA dan manipulasi DNA (Rizki, 2008). Proses penemuan gen memerlukan adanya pelacak spesifik gen tersebut. Selain itu, pelacak spesifik juga dapat digunakan dalam mempelajari ekspresi suatu gen yang sesuai. Pelacak spesifik gen dapat dikembangkan dengan memanfaatkanm kemajuan bioinformatika teknik-teknik biologi molekuler (Santoso, 2008).

B. Tujuan Tujuan praktikum kali ini adalah untuk melakukan penjajaran (aligment) data hasil sekuensing DNA, membuat peta restriksi dan melakukan perancangan primer.

II. MATERI DAN METODEA. MateriAlat-alat yang digunakan pada praktikum ini yaitu laptop, modem atau wifi, lcd dan proyektor.Bahan yang digunakan pada praktikum ini yaitu sequence DNA.B. Metodes

III.HASIL DAN PEMBAHASANA. HasilFoto Hasil BioinformatikaBlast

Restriksi

Primer

Idt left analyze

Idt left hairpin

Idt left self-dimer

Idt left hetero-dimer

Idt right analyze

Idt right hairpin

Idt right self-dimer

Blast left

Blast right

B. Pembahasan Berdasarkan hasil praktikum didapatkan hasil primer3 adalah left primer TGCCGGACGCCAGGCTGCTGAA dan AGCGTTCCTGGCGCCTGCGGAT untuk right primer. Spesies yang diuji spesifisitasnya dengan sequence telah teruji ketepatannya karena hasil spesies yang sama yaitu Salmonella enterica. Memperoleh primer dengan spesifitas yang tinggi terhadap fragmen cDNA yangakan diamplifikasi, dalam merancang primer telah dipertimbangkan beberapa hal yangmerupakan ketentuan dalam perancangan primer yang baik di antaranya adalahpanjang primer antara 18-28 nukleotida, kandungan basa guanin dan sitosin (G+C)berkisar antara 50-60%, dan kedua primer memiliki titik leleh yang sebanding (Budiani dan Purba, 2010).Bioinformatika merupakan ilmu terapan yang lahir dari perkembangan teknologi informasi dibidang molekular. Pembahasan dibidang bioinformatik ini tidak terlepas dari perkembangan biologi molekular modern, salah satunya peningkatan pemahaman manusia dalam bidang genomik yang terdapat dalam molekul DNA. Perkembangan jaringan internet juga mendukung berkembangnya bioinformatika. Pangkalan data bioinformatika yang terhubung melalui internet memudahkan ilmuwan dalam mengumpulkan hasil sekuensing ke dalam pangkalan data tersebut serta memperoleh sekuens biologi sebagai bahan analisis. Selain itu, penyebaran program-program aplikasi bioinformatika melalui internet memudahkan ilmuwan dalam mengakses program-program tersebut dan kemudian memudahkan pengembangannya (Rizki, 2008). Studi Bioinformatika mulai tumbuh sebagai akibat dari perkembangan berbagai metode sekuens baru yang menghasilka data yang sangat banyak. Hal tersebut, secara kebetulan, didukung pula oleh teknologi penyimpanan, manajemen, dan pertukaran data melalui komputer. Inovasi dalam pemetaan dan sekuensing memiliki peran penting dalam proses pengambilan data biologis. Penggunaan Yeast Artificial Chromosome (YAC), sangat membantu dalam konstruksi peta fisik genom kompleks secara lengkap (Touchmann & Green, 1998). Untuk mengklon fragmen-fragmen DNA besar (sekitar 150.000 pasangan basa) digunakan bacterial Artificial Chromosome (BAC). Kemungkinan, teknologi yang paling banyak kontribusinya adalah teknologi PCR. Walaupun tergolong tua (PCR ditemukan tahun 1985), meode ini sangat efektif, dan telah mengalami penyempurnaan selama bertahun-tahun (Riski, 2008).Perkembangan teknologi sekuensing dimulai dan semi-automatic sequencer yang pertama pada tahun 1987, dilanjutkan dengan Taq Cycle sequencing pada tahun 1990. Pelabelan Flourescen fragmen DNA dengan Sanger dideoxy Chain Termination Method, merupakan dasar bagi proyek sekuensing skala besar. Seluruh perkembangan tersebut sia-sia saja tanpa obyek yang diteliti, yang memiliki nilai komersil tinggi dan data yang berlimpah. Gampang ditebak, pasti Manusia melalui Human Genome Project. Selain perkembangan dalam bidang Genomik, Bioinformatika sangat dipengaruhi oleh perkembangan di bidang teknologi informasi dan komputer (Rizki,2008).Pada fase awal (sekitar tahun 80-an) perkembangan yang paling signifikan adalah kapasitas penyimpanan data. Dari hanya baeberapa puluh byte (1980), hingga mencapai Terabyte (1 terabyte=1 trilyun byte), setelah pembuatan database, selanjutnya dimulai perkembangan pemuatan perangkat lunak untuk mengolah data. Awalnya, metode yang digunakan hanya pencariaan kata kunci, dan kalimat pendek. Perkembangan selanjutnya berupa perangkat lunak dengan algoritma yang lebih kompleks, seperti penyandian nukleotida, menjadi asam-asam amino, kemudian membuat struktur proteinnya. Saat ini, perangkat lunak yang tersedia meliputi pembacaan sekuens nukleotida dari gel elektroforesis, prediksi kode protein, identifikasi primer, perbandingan sekuens, analisis kekerabatan, pengenalan pola dan prediksi struktur. Dengan perkembangan seperti diatas, ternyata masih belum cukup. Kurangnya pemahaman terhadap sistem biologis dan organisasi molekular membua analisis sekuens masih mengalami kesulitan. Perbandingan sekuens antar spesies masih sulit akibat variabilitas DNA (Rizki, 2008).Usaha yang dilakukan saat ini, baru mencoba mempelajari teori-teori tersebut melalui proses inferensi, penyesuaian model, dan belajar dari contoh yang tersedia. Perkembangan perangkat keras komputer juga berperan sangat penting. Kecepatan prosesor, kapasitas RAM, dan kartu grafik merupakan salah satu pendorong majunya bioinformatika. Terakhir perkembangan bioinformatika sangat dipengaruhi oleh pertumbuhan jaringan Internet. Mulai dari e-mail, FTP, Telnet (1980-an), Gopher, WAIS, hingga ditemukannya World Wide Web oleh Tim Berners-Lee pada tahun 1990, mendukung kemudahan transfer data yang cepat dan mudah. Saat ini, telah tersedia sekitar 400 database biologis yang dapat diakses melalui internet (Riszki, 2008).Adapun NCBI (National Centre for Biotechnology Information) merupakan suatu institusi yang konsen sebagai sumber informasi perkembangan biologi molekuler. NCBI membuat database yang dapat diakses oleh public, merangsang riset biologi terkomputasi, mengembangkan software penganalisis data genome dan menyebarkan informasi biomedical yang kesemuanya diharapkan mengarah pada pemahaman yang lebih baik tentang proses-proses molekuler yang mempengaruhi manusia dan kesehatannya. Pada NCBI GenBank, kita dapat menemukan rangkaian-rangkaian DNA yang terdapat dalam tubuh makhluk hidup, baik itu rangkaian yang mengkodekan warna kulit, warna mata, bentuk hidung, bentuk bibir, bentuk telinga, bentuk mata, dan banyak lainnya. Semua itu dapat kita dapatkan di NCBI GenBank dengan cara memasukkan nomor akses yang telah disahkan (Rizki, 2008).Salah satu tools yang tersedia dalam situs NCBI adalah BLAST (Basic Local Alignment Search Tool), yaitu suatu alat pencari yang dapat menyesuaikan dan mencari sekuen yang mirip dengan sekuen meragukan yang kita miliki melalui perbandingan sekuen melalui GenBank DNA database dalam waktu singkat. Perangkat bioinformatika yang berkaitan erat dengan penggunaan pangkalan data sekuens Biologi ialah BLAST (Basic Local Alignment Search Tool). Penelusuran BLAST (BLAST search) pada pangkalan data sekuens memungkinkan ilmuwan untuk mencari sekuens baik asam nukleat maupun protein yang mirip dengan sekuens tertentu yang dimilikinya. Hal ini berguna misalnya untuk menemukan gen sejenis pada beberapa organisme atau untuk memeriksa keabsahan hasil sekuensing atau untuk memeriksa fungsi gen hasil sekuensing. Algoritma yang mendasari kerja BLAST adalah penyejajaran sekuens (Rizki, 2008). BLAST (Basic Local Alignment Search Tool) merupakan perkakas bioinformatika yang berkaitan erat dengan penggunaan basis data sekuens biologis. Penelusuran BLAST (BLAST search) pada basis data sekuens memungkinkan ilmuwan untuk mencari sekuens asam nukleat maupun protein yang mirip dengan sekuens tertentu yang dimilikinya. Hal ini berguna misalnya untuk menemukan gen sejenis pada beberapa organisme atau untuk memeriksa keabsahan hasil sekuensing maupun untuk memeriksa fungsi gen hasil sekuensing. Algoritma yang mendasari kerja BLAST adalah penyejajaran sekuens. Daerah terkonservasi (conserved regions) dari gen tersebut ditentukan melalui analisis BLAST (http://www.ncbi. nlm.nih.gov/BLAST) dengan input sekuen baik asam aminonya maupun nukleotidanya. Primer DNA dirancang atas dasar sekuen pada daerah terkonsevasi ini secara semimanual ataupun dengan program komputer antara lain GeneRunner. Primer yang disintesis berdasarkan hasil rancangan tersebut digunakan dalam PCR baik dengan cetakan (template) DNA maupun RNA total organisme sumber atau target (Santoso, 2008).Enzim endonuklease restriksi adalah enzim yang mengikat molekul DNA pada urutan yang spesifik dan membuat potongan DNA ganda berpilin pada atau di dekat urutan tersebut, dikarenakan kespesifikan dari urutan tersebut, posisi potongan pada molekul DNA dapat diprediksi, selama urutan DNA target diketahui. Kemampuan ini mendasari adanya cloning gen dan semua yang berhubungan dengan teknologi rekombinasi DNA dimana fragmen DNA yang diketahui dan diinginkan didapatkan. Ada tiga tipe dari endonuklease restriksi. Tipe I dan III memiliki tingkat ketelitian letak pemotongan yang kurang dapat diprediksi. Fragmen hasil pemotongan sulit diperkirakan. Oleh karena itu, tipe I dan III kurang berguna. Endonuklease restriksi tipe II berbeda dengan tipe I dan III, posisi pemotongan selalu ditempat yang sama, kadang juga sangat dekat dengan posisi tersebut. Pemendekan DNA dengan enzim tipe II memberikan potongan yang dapat diprediksi apabila susunan DNA target. Aplikasi untuk melakukan pemotongan sekuens ialah dengan Nebcutter (Brown, 2002).Sequence allignment merupakan metode dasar dalam analisis sekuens. Metode ini digunakan untuk mempelajari evolusi sekuens-sekuens dari leluhur yang sama (common ancestor). Ketidakcocokan (mismatch) dalam alignment diasosiasikan dengan proses mutasi, sedangkan kesenjangan atau gap, dengan tanda "" diasosiasikan dengan proses insersi atau delesi. Sequence alignment memberikan hipotesis atas proses evolusi yang terjadi dalam sekuens-sekuens tersebut. Misalnya, kedua sekuens dalam contoh alignment di atas bisa jadi berevolusi dari sekuens yang sama "ccatgggcaac". Dalam kaitannya dengan hal ini, alignment juga dapat menunjukkan posisi-posisi yang dipertahankan (conserved) selama evolusi dalam sekuens-sekuens protein, yang menunjukkan bahwa posisi-posisi tersebut bisa jadi penting bagi struktur atau fungsi protein tersebut (Yoga, 2010).Saat ini terdapat sekitar 3000 Enzim restriksi yang sudah dipelajari dan 600 diantaranya tersedia secara komersial. Enzim restriksi sangat diperlukan dalam teknologi rekayasa genetika (lihat kembali artikel kami tentang rekayasa genetika). Peta enzim restriksi sangat diperlukan untuk mengetahui enzim apa saja yang dapat memotong DNA kita dan mana yang tidak. Berikut ini beberapa software yang dapat membantu kita membuat peta enzim restriksi yaitu NEBcutter. Software ini adalah fasilitas gratis yang disediakan situs NEB (New England Biolabs). NEBCuttet harus diakses secara online melalui web browser (Ezza, 2011). Program yang dipakai dalam praktikum bioinformatika adalah NCBI, NEBcutter, primer3 dan IDT oligo analyzer. NCBI atau National Centre for Biotechnology Information dimulai dengan membuka program untukbrowsing dibuka dan kemudian masuk Google. Pencarian Google dimulai dengan mengetik ncbi blast kemudian dimulai search. Akan ditemukan hasil pencarian ncbi blast, lalu pilih pada bagian yang paling atas yaitu BLAST: Basic Local Alignment Search Tool NCBI dan diklik. Ketika masuk halaman web BLAST- NCBI, pada bagian Basic BLAST dipilihprogram nucleotide blast. Setelah masuk pada halaman nucleotide blast terdapat kolom tempat meletakkan sekuens yang akan diblast. Sekuens di Copy yang terdapat pada Notepad hasil alignment. Dilakukan pengaturan beberapa hal, seperti pada set Database pilih Others (or etc.) setelah itu pastikan setting-an Other Databases pada Nucleotidecollection (nr/nt). BLAST diklik pada bagian bawah untuk mulai melakukan blast. Selanjutnya akan terlihat halaman hasil blastberupa Graphic Summary yang menjelaskan nilai dari hasil alignmentsekuens, Descriptions yang menunjukanproduk-produk yang terdapat pada GenBank dari hasil sekuens dan Alignments yang menampilkan urutan dari setiap pasangan basa pada sekuens. Bagian Descriptions terdapat banyak pilihan yang memiliki urutan sekuens yang hampirsama. Salah satu yang memiliki nilai persentasi kesamaan yang tinggi (biasanyapaling atas 90% - 100%) dipilih, maka akan terlihat urutan sekuens yangdimasukan dengan sekuens dari gen bank.NEBcutter yang digunakan untuk restriksi dimulai dengan program Browser dibuka dan masuk ke Google. Diketik nebcutter dan dimulaipencarian. Klik NEBcutter V2.0 pada hasil pencarian Google yang paling atas, maka akan masuk kedalam home NEBcutter dan terlihat kotak tempat meletakkan sekuens. Sekuens dicopy yang akan dicari nama enzim pemotongnya. Kemudian pada bagian Enzymes to use pilih All commercially available specificaties. Setelah itu pilih Submit, maka akan muncul gambar. Gambar menunjukan bahwa enzim yang dapat digunakan untuk memotong. Dipilih 1 cutter dan cut position.Primer3 yang digunakan untuk merancang primer dimulai dengan program Browser dibuka dan masuk ke Google. Ketik primer3 dan dimulaipencarian. Klik Primer3 Input (version 0.4.0) pada hasil pencarian Google yangpaling atas. Masuk kedalam home Primer3. Sekuens yang akan dicari primernya dimasukan pada kotak sekuens. Kemudian lakukan pengaturan pada General Primer Picking Conditions. Setelah dilakukan pengaturan dan sekuens dimasukan yang akan dicari primernya, klik Pick Primer. Copy primer yang diperoleh dibahas didalam Laporan praktikum.IDT oligo analyzer digunakan umtuk menguji kualitas hasil rancangan primer dimulai dengan primerhasilrancangaandiujikualitasnya pada IDT oligoanalyzer. Program Browser dibuka dan masuk ke Google. Ketik IDT Oligo Analyzer dan dimulaipencarian. Klik IDT Oligo Analyzer pada hasil pencarian Google yangpaling atas. Masuk kedalam home IDT Oligo Analyzer. Sekuensleft di copy dan paste kedalamkotaksequence dan diujianalyze, hairpin, selfdimer dan heterodimer. Sekuens right di copy dan paste ke dalam kotak sequence dan diuji analyze, hairpin dan selfdimer. Rancangan primer juga diujispesifisitasnyadenganBLASTn. Cara kerja sama seperti pada NCBI.GenBank ini adalah database sekuen genetik, semua sekuen DNA teranotasi dan tranlasinya yang dipublikasikan di seluruh dunia ada di sini. Data pada GenBank selalu bertambah setiap saat. GenBank dikelola oleh NIH (National Institute of Health) pemerintah Amerika, dan merupakan bagian dari Kolaborasi Database Sekuen Nukleotida Internasional yang terdiri atas DNA DataBank of Japan (DDBJ), European Molecular Biology Laboratory (EMBL), dan GenBank sendiri di National Center for Biotechnology Information (NCBI). Ketiga organisasi ini selalu bertukar data setiap hari agar semua datanya selalu ter-update. Blast-n digunakan untuk mengetahui jenis organisme yang digunakan sebagai sampel. Hal tersebut dilakukan dengan mencocokan hasil sekuens yang ada dengan yang ada di BankGen. Pencocokan sekuens dilakukan dalam keadaan Online (Brown,2002). Primer adalah molekul oligonukleotida untai tunggal yang terdiri atas sekitar30 basa. Primer berfungsi sebagai penginisiasi reaksi polimerisasi DNA secara in vitro karena tanpa primer. Reaksi polimerisasi DNA tidak akan terjadi meskipun enzim dankomponen lainnya sudah tersedia. Selain itu, primer juga berfungsi untuk membatasi daerah mana yang akan diamplifikasi pada reaksi PCR (Sari, 2007). Primerspesifik untuk mengamplifikasi suatu fragmen DNA dirancang berdasarkan informasiurutan nukleotida dari gen yang sama yang dapat diakses menggunakan program Primer3 yang dapat diakses secara online (http://www.biotools.umassmed.edu/),dengan memperhatikan beberapa parameter seperti ukuran dan posisi fragmen DNA target, titik leleh (Tm), komplementasi pada ujung 3 dan lain sebaginya (Budiani dan Purba, 2010). Fungsi primer sebagai inisiator sekaligus pembatas daerah yang akan diamplifikasi, maka idealnya primer memiliki urutan basa nukleotida yang tepatberpasangan dengan urutan basa DNA target yang akan diamplifikasi dan tidakmenempel di bagian lainnya. Oleh sebab itu, primer dirancang (perancangan primer) untuk menentukan keseimbangan antara spesifisitas dan efisiensi. Spesifisitas didefiniskan sebagai frekuensi terjadinya mispriming(kesalahan penempelan) primerpada tempat yang tidak seharusnya. Primer dengan spesifisitas buruk akan terlihat daribanyaknya pita-pita yang tidak diinginkan saat produk PCR divisualisasi denganelektroforesis gel, sedangkan efisiensi adalah seberapa dekat perolehan jumlah produkPCR dengan nilai teoritis yang seharusnya dicapai (ingat bahwa setelah n siklus PCRmaka akan dihasilkan 2n kopi produk). Menurut Prasetyo (2009), proses perancangan primer dapat dilakukan dengancara manual maupun menggunakansoftware. Perancangan primer PCR secara manualberbekal beberapa aturan dasar. Kelebihan dari desain primer secara manual adalahkita dapat mendesain primer PCR yang efektif dengan karakteristik yang mungkin"tidak diijinkan" oleh program yang ada. Perancangan primer dengan menggunakan Software yaitu MEDUSA, Primer3, PrimerQuest, dan lain-lain. Penggunaan program semacam ini sangat disarankan untukmendesain protokol PCR baru. Aturan dasar tersebut adalah sebagai berikut (Budiani dan Purba, 2010): Panjang primer sebaiknya antara 18-30 nukleotida (kecuali untuk tujuan tertentu). Sekuens dalam primer sebaiknya tidak mengandung daerah komplementariinternal. Sebaiknya dalam sepasang primer tidak ada daerah yang saling berkomplementari. Dalam primer tidak ada struktur sekunder. Memiliki kandungan GC (guanosine dan cytosine) 50%. Hindari ketidakseimbangan distribusi daerah kaya G/C dan A/T. Untuk PCR diagnostik pilih primer PCR yang mengamplifikasi daerah yang stabil secara genetik. Perbedaan suhu anealing dalam suatu pasangan primer jangan lebih dari 50.

IV. KESIMPULAN DAN SARANA. Kesimpulan Berdasarkan hasil dan pembahasan dapat disimpulkan bahwa :1. Hasil dari praktikum bioinformatika adalah spesies yang disekuensing adalah Salmonella enterica. Hasil primer3 TGCCGGACGCCAGGCTGCTGAA untuk left primer dan AGCGTTCCTGGCGCCTGCGGAT untuk right primer.

B. Saran Saat melaksanakan praktikum diharapkan praktikan mempersiapkan jaringan wifi dengan baik sehingga pada saat acara dimulai sudah tidak mengurusi wifi lagi.

DAFTAR REFERENSIBrown, T.A. 2002. DNA in Genomes, 2nd ed.

Budiani, A. dan A. R. Purba. 2010. Kloning Fragmen Gen Penyandi -Ketoacyl-ACPSynthase II dari Dua Tipe Kelapa Sawit dengan Kandungan Asam Oleatyang Berbeda. Menara Perkebunan, 78(1): 1-8.

Campbell, N.A., Reece, J.B., Mitchell, L.G. 2002. Genetics, a Conceptual Approach 3rd ed. W.H. Freeman and Co. New York.

Ezza, H. 2011. http://ezzahhidayati.blogspot.com/2011_07_01_archive.html. diakes pada tanggal 18 Juni 2013.

Prasetyo, A. A. 2009. Materi Asistensi Biomedik. UNS, Solo.

Rama, A. 2011. http://ardhianrama89.blogspot.com/. Diakses pada tanggal 18 Juni 2013.

Rizki. 2008. Bioinformatika. http://bioinformatika-q.blogspot.com/. Diakses pada tanggal 18 Juni 2013.

Santoso, J. 2008. Pengembangan pelacak DNA spesifik gen melalui bioinformatika: Indentifikasi gen penyandi protein biji 21 kDa pada kakao UAH Indonesia. Menara Perkebunan, 69 (1), 10-17.

Sari, M. I. 2007. Struktur Protein. Universitas Sumatra Utara.

Yoga, M. 2010. Komputasi Modern. http://mochamadyoga.blogspot.com/ 2010/03/komputasi-modern.html. Diakses pada tanggal 18 Juni 2013.