Bio FM 70160 Bio FM V.C.A. 70161MEZZo PER L’iSoLAMENTo RAPiDo Di MiCoBATTERi / SUPPLEMENTo SELETTiVo

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1- USO PREVISTOI micobatteri sono Bacilli Acido-Resistenti (AFB) che crescono piuttosto lentamente su mezzi solidi convenzionali (Lowenstein-Jensen, Coletsos, Middlebrook 7H10 e 7H11): l’isolamento di Mycobacterium tuberculosis può richiedere da 2 a 8 settimane.Bio FM è un mezzo di coltura liquido arricchito, destinato ad accelerare in modo significativo la crescita dei micobatteri (1, 2). Le colture ottenute su mezzo Bio FM sono adatte all’identificazione (test biochimici convenzionali o sonde) e test sulla sensibilità agli antibiotici.

2- PRINCIPIOIl brodo Bio FM è un mezzo Middlebrook 7H9 non selettivo, arricchito con OADC (acido Oleico, Albumina, Destrosio, Catalasi), ottimizzato per la crescita di micobatteri.Bio FM consente l’isolamento di micobatteri da tutti i tipi di campioni biologici.La selettività del mezzo Bio FM è ottenuta con l’aggiunta del supplemento selettivo Bio FM V.C.A. (Vancomicina, Colistina, Amfotecina B) inibendo la crescita dei principali micro-organismi Gram negativi e Gram positivi, oltre ai lieviti, compresa la flora associata ai principali campioni patologici.La crescita di ceppi di micobatteri è individuata mediante un indicatore di positività, che dà alle colture un colore dal blu scuro al violetto.

3- PRESENTAZIONE• Mezzoprontoall’uso: Bio FM

- 24 tubi con tappo a vite contenenti 5 ml di brodo codice 70160• Supplementoselettivoprontoall’uso: Bio FM V.C.A.

- 1 flacone contagocce da 3 ml codice 70161

4- COMPOSIZIONE• BrodoBioFM

- KH2PO4 - Biotina- Na2HPO4 - Sodio citrato- NH4SO4 - Ammino acidi- MgSO4 - digestione Pancreatica di caseina- ZnSO4 - albumina Bovina - CuSO4 - Glicerolo- CaCl2 - Glucosio

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- NaCl - acido grasso- Citrato di ferro ammoniacale - Catalasi- Piridoxina - Indicatore di crescita- Acqua distillata

• BioFMV.C.A.- Vancomicina- Colistina - Amfotericina B

5- CONSERVAZIONE• Mezzoprontoall’uso:conservarea+2-8°C,protettodallaluce.• Supplementoselettivoprontoall’uso:conservarea+2-8°C,protettodalla

luce. Dopo l’apertura, questo reagente deve essere usato entro 45 giorni. Dopo ciascun utilizzo, rimettere rapidamente il flacone nel frigorifero.

La data di scadenza e il numero di lotto sono indicati sulla confezione.

6- PROCEDURA

Materiale:• Materialefornito: Bio FM, Bio FM V.C.A.

Precauzioni/IstruzionirelativeaigieneesicurezzaÈ necessario seguire le tecniche di prevenzione e le norme di sicurezza relative ai germi di III classe in caso di manipolazione di campioni biologici che probabilmente contengono micobatteri (3, 4). • Tutti i campioni biologici possono essere inoculati su questo mezzo

purché siano stati prima liquefatti e decontaminati. Per le condizioni di conservazione di campioni biologici, fare riferimento alle raccomanda-zioni vigenti (6).

• Poichélaquantitàdibatterinelcampionepuòessereridotta,ilcampioneè concentrato mediante centrifugazione per aumentare la sensibilità di individuazione.

InoculodelmezzoBioFMIn condizioni asettiche, aggiungere fino a 5 ml di brodo Bio FM*:

- 0,5 ml di campione decontaminato ; omogeneizzare,- 100 µl (2 gocce) di supplemento selettivo Bio FM V.C.A.

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Quando si sospetta M. haemophilum, è necessario aggiungere al mezzo una fonte di emina.Il mezzo * Bio FM è pronto all’uso e contiene il supplemento OADC.Dopo la scomparsa dell’inoculo, (3 o 4 giorni), i tubi sono ermeticamente sigillati con un tappo a vite o altrimenti con un cappuccio di plastica.

IncubazioneIncubare per 5 - 6 settimane a 37°C.

Lettura–Interpretazione• Ciclodi lettura: effettuare da 2 a 4 letture settimanali per 3 - 4 setti-

mane, poi due volte la settimana per altre 2 settimane.• Lettura–metododiinterpretazioneLa lettura del mezzo Bio FM generalmente comprende 2 fasi: 1° fase: esame del sedimento e del mezzo liquido senza agitare il tubo• Esaminareattentamenteilfondodeitubieilmezzoliquido:

- Se non vi sono segni di crescita (nessuna opacità, torbidità, grani o schegge blu scuro/violetto): procedere con la 2° fase di lettura.

- Se sono presenti segni di crescita:. grani o piccoleschegge blu scuro/violetto sedimentati sul fondo del

tubo: sospetto di M. tuberculosis. opacità o torbidità, con un colore variabile da blu scuro a violetto, e

che tende a sedimentarsi parzialmente sul fondo del tubo: sospetto di micobatteri atipici Questo potrebbe probabilmente essere confermato nella 2° fase di lettura.

2° fase: esame del sedimento dopo agitazione del tubo• Collocare il tubo all’altezza degli occhi (preferibilmente esaminare alla

luce del giorno) e risospendere il precipitato di sedimentazione situato sul fondo del tubo con un lieve movimento in avanti e indietro del tubo:- Se non ci sono segni di crescita (nessuna opacità, torbidità, grani o

schegge blu scuro/violetto): coltura negativa, continuare l’incuba-zione del mezzo.

- Se sono presenti segni di crescita:. graniopiccoleschegge blu scuro/violetto: sospetto di M. tuberculo-

sis.. opacità o torbidità, con un colore blu scuro/violetto: sospetto di

micobatteri atipici.- La presenza di un’opacità omogenea (possibilmente con una colora-

zione blu del mezzo molto leggera), osservata dopo 3 giorni di incu-bazione, è indicativa di contaminazione.

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NB: Il colore blu scuro, indicativo di crescita di micobatteri, è visibile anche in presenza di detriti cellulari o particelle insolubili.Si raccomanda di effettuare una conta e uno studio morfologico di colonie tra la 2° e l’8° settimana dopo l’inoculazione.

Identificazione,testdisensibilitàagliantibiotici.Quando viene individuata crescita batterica in mezzo Bio FM, raccogliere le particelle colorate con una pipetta Pasteur e cercare un’eventuale presenza di bacilli resistenti all’acido (AFB).Le colture ottenute su mezzo Bio FM sono idonee all’identificazione (test biochimici convenzionali o sonde) e test di sensibilità agli antibiotici.

7- PRESTAZIONE DEL TEST Uno studio clinico prospettico di 34 campioni micobatteri-positivi ha dimostrato che non vi era differenza significativa (p>>0.05 - Mac Nemard χ2 su dati abbinati) tra la percentuale di isolamento di un mezzo di riferimento convenzionale (Lowenstein-Jensen) e quella del mezzo Bio FM. Tuttavia, è stato dimostrato che il tempo per la positività era significativamente inferiore (p = 0.000129 < 0.05 – Wilcoxon coppie di test abbinate) per Bio FM (tempo di rilevamento medio su Bio FM = 18,4 giorni) rispetto a Lowenstein-Jensen (tempo di rilevamento medio su LJ = 24,0 giorni).

8- CONTROLLO DI QUALITA DEL TEST• BioFMLe prestazioni del Brodo Bio FM sono controllate usando i seguenti ceppi:

CEPPIRISULTATODICOLTURADOPO

21GIORNI A37°CINCONDIZIONIANAEROBICHE

Mycobacterium bovis BCG Crescita, grani blu

Mycobacterium tuberculosis CIP 64.31 Crescita, grani blu

Mycobacterium avium CIP 104244 Crescita, opacità, grani blu

Mycobacterium gordonae Crescita, opacità blu

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• BioFMV.C.A.La selettività del supplemento V.C.A. è testata su vari ceppi batterici Gram positivi e Gram negativi e su lieviti: l’inibizione della crescita dimostra conformità del supplemento selettivo.

9- LIMITI DEL METODOIn caso di opacità marcata del mezzo, controllare la presenza di contami-nazione associata con un micobatterio mediante esame diretto. In questo caso, ogniqualvolta sia possibile, si preferisce iniziare nuove colture dal campione iniziale conservato a +4°C. Qualsiasi crescita (opacità blu scuro/violetto, torbidità, granuli, schegge) confermata da colorazione di Ziehl come caratteristica di un micobatterio deve essere sottoposta a identifi-cazione, secondo le procedure usuali (identificazione biochimica, sonde). L’assenza di crescita non indica necessariamente l’assenza di infezione micobatterica. Alcuni fattori possono prevenire la crescita di micobatteri.

10- CONTROLLO DI QUALITA DEL PRODUTTORETutti i reagenti realizzati sono preparati in base al nostro Sistema di Assicurazione di Qualità dal ricevimento delle materie prime, alla com-mercializzazione finale del prodotto Ciascun lotto di prodotto finito è sot-toposto a un controllo di qualità e viene messo in commercio soltanto se risulta conforme ai criteri di approvazione predefiniti. La documentazione relativa alla produzione e al controllo di ciascun singolo lotto è conservata presso Bio-Rad.

11- BIBLIOGRAFIAVedere la versione francese.

CEPPI RISULTATODISELETTIVITA

Mycobacterium tuberculosis CIP 64.31 Crescita

Mycobacterium avium CIP 104244 Crescita

Staphylococcus aureus ATCC 25923 Inibizione

Pseudomonas aeruginosa ATCC 25619 Inibizione

Candida albicans ATCC 10231 Inibizione

11-RÉFÉRENCES BIBLIOGRAPHIQUES1. SAVAGE C., FACON J.P., VERMEULEN M. : Comparaison du milieu liqui-

de Bio FM et de son supplément sélectif par rapport à la méthode deréférence sur milieux solides. 1998. 5ème Congrès de la SFM, Lille,France.

2. TOUZARD M., PERELLO M., FOSSE T. : Bilan d'utilisation du BioArgos(V2) en parallèle avec la technique classique pour la culture desMycobactéries en routine. Vème journées de MycobactériologieNovembre 1996, Nice, France.

3. Mesures techniques de prévention, notamment de confinement, à mett-re en œuvre dans les industries et les laboratoires de recherche et d'en-seignement où les travailleurs sont susceptibles d'être exposés à desagents biologiques pathogènes - Arrêté du 13 août 1996 - JournalOfficiel de la République Française.

4. Kent P.T., and KUBICA G.P. 1995. Public health mycobacteriology aguide for the level III laboratory. USDHMS, Centers for Disease Control,Atlanta.

5. Basic Laboratory Procedures in Clinical Bacteriology. World HealthOrganization. Geneva.1991. 1st edition.

6. Annual Meeting of the International Union Against Tuberculosis and LungDiseases (IUATLD), October 1997, Paris, France.

7. CERNOCH P.L., ENNS R.K., SAUBOLLE M.A., and WALLACE R.J., JR. :Laboratory Diagnosis of the Mycobacterioses. Oct. 1994, CUMITECH 16A.

8. SALFINGER M., PFYFFER G.E. : The New Diagnostic MycobacteriologyLaboratory. 1994. 13 : 961-979.

Bio-Rad 3, boulevard Raymond Poincaré 92430 Marnes-la-Coquette France Tel. : +33 (0) 1 47 95 60 00 12/2011 Fax.: +33 (0) 1 47 41 91 33 code: 881089 www.bio-rad.com

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