BD Biosciences 最新 SPCell analysis 理論と実

際- 実験 Methods と機器性能とは？ -

アジェンダ• 造血幹細胞における SPCell Analysis

– 今までの研究の流れ• がん細胞における SPCell Analysis

– いくつかの成果と問題点の抽出– 今後の展望

• 条件を満たす機器のスペック– 上記内容からどんな性能が必要？

Side Population (SP)マウス造血幹細胞研究における SPから、

がん幹細胞研究における SPへ

マウス造血幹細胞における Side Populationの発見Isolation and functional properties of murine hematopoietic stem cells th

at are replicating in vivo.

Goodell MA, Brose K, Paradis G, Conner AS, Mulligan RC.J Exp Med. 1996 Apr 1;183(4):1797-806.

A novel method to identify HSCs in mouse bone marrow that depends on dual-wavelength flow cytometric analysis of cells stained with Hoechst 33342 alone.

マウス骨髄 SPの表現型を支える遺伝子：Bcrp1/ABCG2Bcrp1 gene expression is required for normal numbers of side population st

em cells in mice, and confers relative protection to mitoxantrone in hematopoietic cells in vivo.

Zhou S, Morris JJ, Barnes Y, Lan L, Schuetz JD, Sorrentino BP.PNAS vol. 99, no. 19, 12339-12344, Sep, 2002

Competitive repopulation assay to compare the normal overall stem cell activity in Bcrp1-/- versus Bcrp1+/+ mice showed no difference in stem cell activity in the bulk bone marrow population.

These results show that Bcrp1 gene expression alone defines the SP stem cell phenotype, and suggested that the physiological function of Bcrp1 expression in HSC is to provide protection from cytotoxic substates.

CD34- KSL SP cells analysis

Methods

Mice : C57BL/6J Jcl ♂ 10-week-old

Sample : 1x106/ml (5x105/ml, 2x106/ml )

Medium : DMEM 2% FBS (Low glucose, High glucose, RPMI, αMEM)

SP Positive : Hoechst 5ug/ml (4ug/ml, 6ug/ml, 7ug/ml)

SP Negative : Hoechst 5ug/ml + Verapamil 20ug/ml

Incubation : 90min, 37℃

Antibody : 　 CD34 FITC　 Sca-1 PE　 7AAD　 Lineage (CD3e, B220, Gr-1, Mac-1, and Ter119) PE-Cy7　 c-Kit APC　 (CD45 APC-Cy7)

VantageSE KSL SP cell : Hoechst 5ug/ml

KSL SP0.003-0.03%

VantageSE KSL SP cell : Hoechst 5ug/ml + Verapamil 20ug/ml

Aria KSL SP cell : Hoechst 5ug/ml

KSL SP0.003-0.03%

Aria KSL SP cell : Hoechst 5ug/ml + Verapamil 20ug/ml

CD34- KSL SP cells

CD34- population :

about 30%

FACSを用いたマウス造血幹細胞の解析からの知見

・これまでの KSL細胞と相関が高く、複数のマーカーなしに造血幹細胞の濃縮ができるSP の性質は造血幹細胞以外の、他のマーカーの少ない組織幹細胞でも報告されており、幹細胞を濃縮できる方法としての応用が期待された → 以降のがん幹細胞解析へと続く

・ BCRP1ノックアウトの解析により、 SPは造血幹細胞の維持と分化に必須ではないSP の薬剤耐性の性質は、長期的な幹細胞としての性質の維持に役立っている可能性がある（幹となる細胞として、外的な変異要素を受けないようにするのは、固体の長期的な維持を考えた場合にも、自然な働きと考えられる）

・マウスの造血幹細胞における SPは静止期にある細胞と考えられる造血幹細胞が自己複製や分化に移行している段階では、必ずしも SP の表現型を示さないことが報告されており、造血幹細胞の状態に応じて、 SP の表現型は変化すると考えられる

がん幹細胞への研究の展開

SW480 cell

Vantage SE DiVa UV Laser SORP Aria 355nm laser

がんを起こす細胞にも分化段階があるHuman acute myeloid leukemia is organized as a hierarchy that originates from a primitive hematopoietic cell

Dominique Bonnet and John E. Dick Nature Medicine. 1997, 3, 730-737

がんにおける幹細胞の存在はそれまでにも示唆されていたが、 AML において CD34強陽性 CD38 陰性の分画に leukemia-initiating cell の存在を NOD/SCID マウスへの移植実験により示し、今日注目されているががん幹細胞の存在を始めて明確に示した。

Prospective identification of tumorigenic breast cancer cells

Muhammad Al-Hajj, Max S. Wicha, Adalberto Benito-Hernandez, Sean J. Morrison, andMichael F. ClarkePNAS April 1, 2003 vol.100 no.7, 3983-3988

Breast cancer において、 CD44+ CD24-/low Lineage- の分画が、 NOD/SCID マウスへの移植実験により、 CD44+ CD24+ Lineage- と比較し、明らかに腫瘍形成能が高いことを示した。

がん幹細胞における SP解析Presistence of a small subpopulation of cancer stem-like cells in C6 glioma cell line

Toru Kondo, Takao Setoguchi, and Tetsuya Taga 　 PNAS, January 20, 2004, vol.101, no.3, 781-786

Our findings suggest that the SP may be a general source of cancer stem cells, which need targeted for effective cancer therapy.

C6 glioma における SP は、 non-SP と比較し明らかに腫瘍形成能が高く、また、様々な神経細胞に分化する多分化能も維持していることを示し、 SPによるがん幹細胞解析の可能性を始めて示した。

SORPAria 355nm UV レーザーを用いた SP 解析

MethodsCells : HeLa, HT-29, SW480 など細胞の処理には Accutase を使用。細胞は凝集がない状態に単分散させることが重要。

Sample : 1x106/ml

Medium : DMEM 2-5% FBS (Low glucose, High glucose)グルコース濃度のよっても SP の割合は変化する（データ参照）

SP Positive : Hoechst 5ug/ml (1ug/ml - 10ug/ml and more)がん細胞によって、 Hoechst の排出能には大きく差がある。

SP Negative : Hoechst 5ug/ml + Verapamil 10-30ug/ml or Reserpine 5-15ug/ml

Incubation : 60min, 37℃インキュベート中は、染色条件を一定に保つため攪拌することが望ましい。

細胞により適切な SP の染色条件は必要である。

SORPAria UV レーザーを用いた HeLa 細胞の SP 解析 .1

SP Sort MP Sort

VantageSE での HeLa SP

SORPAria UV レーザーを用いた HeLa 細胞の SP 解析 .2

Hoechst 1ug/ml – 5ug/ml

Hoechst 6ug/ml – 10ug/ml

Hoechst 濃度の基準をどこに置くかは、 SP の実験を組み立てる上での重要な要素となる。

例えば先の C6 glioma の論文では、 2.5ug/ml で 90 分で Hoechst 染色されているが、

染色の濃度や時間、染色中の攪拌などは各研究者で異なっている。

SORPAria UV レーザーを用いた HeLa 細胞の SP 解析 .3

HeLa 細胞を 2 種類の培養液で、それぞれ Hoechst 濃度を変えて染色した場合のSP 存在率。

グルコース濃度が変わるだけで、 SP の存在比率は約半分となる。

DMEM high glucose

DMEM low glucose

SORPAria UV レーザーを用いた HeLa 細胞の SP 解析 .4

例えば 3種類の表面マーカーを組み合わせることで、 SPと同様の集団を特定することもできた

・がん細胞においても SPを用いることで腫瘍形成能の高い細胞が濃縮できるSP により濃縮された細胞により、 1,000 個のオーダーでも腫瘍形成能が認められている報告がある。マーカーの少ないがん幹細胞の検索において、 SP は未分化ながん細胞を濃縮するための有効なマーカーとして考えられる。

・がん細胞においても表面抗原を用いることで腫瘍形成能の高い細胞を濃縮できる表面抗原を用いた解析からは 100 個の細胞からも腫瘍形成を認めるとの報告も出ている。用いられている表面マーカーは、 CD133 など、これまでの組織幹細胞の解析を応用したものも多い。

・ SPや表面抗原を組み合わせたマルチパラメーターでの解析が期待されるマウス造血幹細胞での展開は表面抗原から SP であったが、がん細胞においてはSP からさらに表面抗原を見出し、同時に解析していくことが期待される。また、マウス造血幹細胞における SP の詳細な解析は、がん幹細胞研究における SP の結果を理解する上でも、非常に重要である。

FACSを用いたがん幹細胞の解析からの知見

条件を満たす機器スペックって？• 高感度

– フローセルを使用したシステム– 長方形フローセルの採用

• マルチカラー対応– 豊富なレーザー構成– ハイパワー UV レーザー

• 操作性– 従来 Sorter のハンドリングからの脱却– 安定 Sorting の条件

高感度 Rectangleフローセル１

•Cuventte flow cell はベンチに組み込れています。よってレーザーの照射位置は固定されています。•蛍光検出レンズと Cuventte flow cell はゲルで接着されています、よって蛍光の検出感度が高く半導体レーザーのような出力の少ないレーザーで測定することが出来ます。•ノズルサイズは 70μ 、 100μ が装着できます、先端のノズル部（金属＆ダイアモンド）を取り外すことにより変更することが出来ます。

高感度 Rectangleフローセル２

現行： Vantage システム

上面から見たフローセルの断面

レンズ

ゲル

新性能

Rectangle （＝長方形）フローセル＆ゲルの装着

高感度 Rectangleフローセル３

• Rectangular Quartz Cuventte長方形 Quartz Cuventte を使用しています。– sample 流が細く絞りこまれるため、レーザー照射時に細胞が均一に流れるの

で C.V 値が小さくなります。

Laser Lase

r

他メーカー

上面図

側面図

強い弱い

Laser Power

弱い

強い弱い

Laser Power

弱い

Rectangular Cuventte Non Rectangular Cuventte

FACSAria

FACSVantageSE/DivaFACSVantageSE/Diva におけるにおける高速高速 SortingSorting による蛍光感度への影響　による蛍光感度への影響　––

マウスマウス ESES 細胞細胞 --

E-cadherin Alexa488

Flk

-1 P

E

Control

10PSI 70PSI35PSI20PSI

FACSAriaFACSAria におけるにおける高速高速 SortingSorting による蛍光感度への影響　による蛍光感度への影響　––

マウスマウス ESES 細胞細胞 --

E-cadherin Alexa488

Flk

-1 P

E

LO(20PSI) MED(35PSI) HI(70PSI)

Control

マルチカラー対応システム１

Regular FACSAria

SORP FACSAria

Blue(488nm) 20 mW 100 mW

Red(633nm) 17 mW 30 mW

Violet(405nm) 10 mW 50 mW

UV(355nm) --- 20 mW / 60 mW

Green(561nm)

---

蛍光色素組み合わせ

FACSAria の蛍光補正値の自動計算＊

フォルダと Experimentを作成したら、 Instrumentメニュー＞Instrument Setup＞ Create Compensationを選択します。

蛍光補正に必要な染色試験管の準備とそれぞれに専用の Work Sheetが作成されます。

FACSAria の蛍光補正値の自動計算＊

蛍光補正用試験管を測定したら、各試験間の positive領域をクリックします。アイコンを使って 1-クリックで選択できます。

Instrumentメニュー＞ Instrument Setup＞ Calculate Compensationを選択します。

これだけで、測定に使用するすべてのパラメータ間で蛍光補正値が自動計算されます。

補正値は Experimentレベルの Instrument Levelに保存されますので、その後に測定するサンプルには補正されたデータが保存されます。

微調整のために、測定後に蛍光補正値を変更することも可能です。

操作性　 -固定式フローセル

自動ソーティング設定機能

液滴ﾓﾆﾀﾘﾝｸﾞｼｽﾃﾑ SweetSpot

DropDelay自動計算AccuDrop

4方向ｿｰﾃｨﾝｸﾞQuadraSort

自動液滴制御機能『 Sweet　 Spot』

BD FACSAria はフローセルが固定されいます。よって液滴の形成状態を CCDカメラにてモニターして最適の液滴形成状態にフィードバックすることが出来ます。

ブレークポイント、液滴の大きさ、液滴と液滴の間隔、サテライトドロップを画像解析して固定の DDF （ ：振動ﾄﾞﾛｯﾌﾟﾄﾞﾗｲﾌﾞﾌﾘｰｹﾝｼｰ数）に対して AP （ ：振幅）をフィーｱﾝﾌﾟﾘﾁｭｰﾄﾞドバックします。

DropDelay自動計算『 AccuDrop』機能

蛍光ビースを流して soritng を行い、サイドストリームにビーズが最も多く分離されるDropDelay値をコンピューター画面上で調整します。作業時間は 1 分以内に終了します。よって、ノズル交換時、短時間に Soritng を再開することが出来ます。

DropDelay値の計算行うために、スライドにビーズを受けて、蛍光顕微鏡で数え最適な DropDelay値を確認する作業（ 1 時間）は必要ありません。

AccuDropTM画面

センターアスピレーターサイドストリーム

シース圧の安定装置『 Plenum reservoirTM』方

式

シースタンク内の圧力変動が少ない設計です

長時間の soritng でも液滴変動が少ない状態を維持します

高速 Sorting -液滴形成に関連するパラメータ

ー‐•ノズルサイズ

•シース圧

•振動数及び振幅（ KHz and Drive）

圧力と液滴形成数

Nozzle 選択50 60 70 80 90 100

130液滴形成及び収率を高めるためには粒子（細胞）の大きさによってノズルを選択する必要があります。粒子径<= ノズル径 /6粒子径> 　ノズル径 /４

thymus

spleen - bone marrow

adherent cells - larger cells

液滴形成数と分取速度

現実には！ -VantageSE/Aria-：マウス ES 細胞

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0 10,000 20,000 30,000 40,000

events/ sec

%

Purity (%)

Electronic Aborts= Electronicabort/ Threshold count

Efficiency (%)= Sort Count/ (Sortcount+Conflict count)

Yield (%)=Sort Count/ (Tresholdcount*Sort target %)

Recovery (%) = SortCount/ TruCOUN*100

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events/ sec

%

Purity (%)

Electronic Aborts= Electronicabort/ Threshold count

Efficiency (%)= SortCount/ (Sort count+Conflictcount)Yield (%)=SortCount/ (Treshold count*Sorttarget %)Recovery (%) = SortCount/ TruCOUN*100

FACSVantageSE/Diva FACSAria

まとめ　 1-アプリケーション別必要な機能 -

• 細胞表面マーカー解析– 488/633nmレーザー– 表面マーカーと細胞内抗原などのマルチカラー解析

– 希少細胞を高速 Sorting

• がん幹細胞解析– UVレーザー– SPと表面マーカー解析– 細胞毎の条件検討– 患者検体で実験

• BD が提案できる内容– 標準装備、さらに 2 本追加可能– 標準で 5 カラー (488nm) 、 2 カ

ラー (633nm)– 90,000 個 /sec( 液滴）、 35,000 個 /sec( 細胞 )

– 355nmUV レーザー– 2 ～ 3 種類の細胞で表面マーカ

ー解析– 更なる検討必要– 今後の課題

まとめ　２• 蛍光感度の違いを明確にリサーチ

– 蛍光の強弱だけでなく、弱陽性に注目– 表面マーカーと違い、 SP は蛍光強度の違いが　　ほとんど無い

• SPと表面マーカーによるマルチカラー解析– 多重染色のメリットも最大限に！– デメリットをどう回避する ?

• いつ、誰が、どんな時でも！– 全国で Aria専属オペレーター　０人– トレーニングは私が !?