banco de dentes humanos - decÍduostede.bc.uepb.edu.br/jspui/bitstream/tede/1913/1/pdf... ·...

UNIVERSIDADE ESTADUAL DA PARAÍBA

CENTRO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS E DA SAÚDE

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM ODONTOLOGIA

MESTRADO EM ODONTOLOGIA

RONIERY DE OLIVEIRA COSTA

AVALIAÇÃO DA AÇÃO DO LASER, LED E DA TERAPIA FOTODINÂMICA NA

CICATRIZAÇÃO DE QUEIMADURAS EM PELE: ESTUDO CLÍNICO E

HISTOLÓGICO EM RATOS

CAMPINA GRANDE

2013




HISTOLÓGICO EM RATOS

Orientadora: Profª. Drª. Maria Helena Chaves de Vasconcelos Catão

CAMPINA GRANDE

2013

Dissertação apresentada ao

Programa de Pós-Graduação em

Odontologia da Universidade

Estadual da Paraíba, como parte

dos requisitos necessários à

obtenção do título de Mestre em

Odontologia.

Odonto

FICHA CATALOGRÁFICA ELABORADA PELA BIBLIOTECA CENTRAL – UEPB

C837a Costa, Roniery de Oliveira.

Avaliação da ação do laser, Led e da terapia

fotodinâmica na cicatrização de queimaduras em pele

[manuscrito] : estudo clínico e histológico em ratos /

Roniery de Oliveira Costa. – 2013.

91 f. : il. color.

Digitado

Dissertação (Mestrado em Odontologia) –

Universidade Estadual da Paraíba, Pró-Reitoria de Pós-

Graduação e Pesquisa, 2013.

“Orientação: Profa. Dra. Maria Helena Chaves de

Vasconcelos Catão, Departamento de Odontologia”.

1. Terapia fotodinâmica. 2. Queimaduras. 3.

Cicatrização. 4. Laser. I. Título.

21. ed. CDD 617.11




HISTOLÓGICOS EM RATOS.

Dissertação apresentada ao

Programa de Pós-Graduação em

Odontologia da Universidade

Estadual da Paraíba, como parte

dos requisitos necessários à

obtenção do título de Mestre em

Odontologia.

Odonto

Esta dissertação é dedicada a

minha esposa Ivna Rafaela

Ribeiro dos Santos Costa e a

minha filha Raquel dos Santos

Costa pelas horas de convívio

“roubadas”.

AGRADECIMENTO ESPECIAL

A minha orientadora Profa. Dra. Maria Helena Chaves de Vasconcelos Catão

agradeço a oportunidade de partilhar do seu conhecimento e experiência, sempre

presente, apesar de tantos compromissos. Em nenhum momento você deixou de

acreditar no meu potencial, me ensinou que os desafios podem ser superados e me

fez enxergar cada dificuldade como uma ocasião de crescimento. Sua confiança,

amizade e apoio foram imprescindíveis. Meu sincero respeito e admiração!

Ao Prof. Dr. Ricardo Luiz Cavalcanti de Albuquerque Júnior pela

colaboração desde a qualificação do projeto à coloração e leitura do picrosírius, por

tamanha dedicação e empenho em contribuir em cada etapa, pela agradável

companhia e amizade. Sou grato pelo privilégio de ter acompanhado um profissional

dedicado à pesquisa científica e comprometido com o ensino e com a ética. Seu

bom humor e tranquilidade fizeram com que tudo parecesse mais fácil, obrigado por

me acolher e pelos ensinamentos. Seu auxílio foi indispensável no engrandecimento

desta pesquisa. Meu sincero agradecimento!

Ao Prof. Dr. Cassiano Francisco Weege Nonaka pelas contribuições precisas

e sábias, pela solicitude com que sempre atendeu cada uma das minhas dúvidas,

quer pessoalmente ou à distância. Agradeço enormemente suas contribuições, seu

auxílio foi indispensável ao término desta pesquisa em tempo hábil. Muito Obrigado!

AGRADECIMENTO

A Deus, minha fonte inesgotável, por estar sempre comigo em todos os

momentos, dando-me força para mais essa conquista e sabedoria para lidar com as

adversidades.

À minha esposa, Ivna Rafaela, que sempre esteve comigo nas horas que mais

precisei. Por mostrar que duas pessoas podem ser um só pensamento, que duas

vidas podem estar em só momento e que dois sonhos podem triunfar por um só

caminho. Te amo!

Aos meus pais, Assis e Lúcia, pelo amor incondicional, pelo carinho e

dedicação nos momentos difíceis, sendo “peças” fundamentais na minha formação

acadêmica por sempre acreditarem nos filhos e por mostrarem que os sonhos não

têm idade e que somos capazes de realizá-los. Amo Vocês!

Aos meus irmãos, Rosemberg, Rodolpho e Raíssa, pelo carinho, confiança e

dedicação, durante esse trajeto.

À Universidade Estadual da Paraíba (UEPB) pela minha formação na

graduação e pós-graduação.

À Universidade Federal de Campina Grande (UFCG) e à Universidade

Tiradentes (UNIT) pela parceria estabelecida e pela oportunidade de utilizar os

equipamentos necessários à execução desta pesquisa.

A todos os professores da pós-graduação pelos ensinamentos e

disponibilidade em atender cada dúvida, cada questionamento, sobretudo pelo

incentivo em cada etapa do mestrado.

Aos colegas de turma Armiliana Soares, Fabio Gomes, Leonardo Gomes,

Lorena Nóbrega, Marcela Lins, Maria Betânia, Manuela Gouvea, Priscila

Suassuna, Raulison Sousa, Rennaly Lima, Yeska Paola e Vanessa Abilio por

todos os momentos compartilhados.

A Denise Sousa, técnica do Laboratório de Histopatológica da UEPB e

Nely, técnica do Laboratório de Morfologia e Biologia Estrutural da UNIT, que

estiveram sempre dispostas a me auxiliar em toda e qualquer dificuldade nas fases

da pesquisa laboratorial.

Ao Sr. Paulinho, técnico do Biotério da UFCG pela colaboração durante o

experimento com os animais, pela agradável companhia e amizade.

A todos que diretamente ou indiretamente contribuíram para a realização deste

trabalho,

Muito Obrigado!

“Sonhar é gratuito, torná-lo em realidade tem seu preço”

Willian Douglas

LISTA DE ILUSTRAÇÕES

Figura 1 Fluxograma dos grupos de tratamento em função dos subgrupos e

dos tempos de sacrifícios ..................................................................

27

Figura 2 Fluxograma da área de colagenização e da análise descritiva das

fibras colágenas. ...............................................................................

33

Figura 3a Balança analítica utilizada na pesagem dos ratos e da ração .......... 34

Figura 3b Garrafa de água para Ratos ............................................................. 35

Figura 4a Anestesia intraperitoneal .................................................................. 36

Figura 4b Tricotomia realizada no dorso do rato .............................................. 36

Figura 4c Instrumental metálico de queimadura .............................................. 36

Figura 4d Aquecimento do instrumental metálico ............................................ 36

Figura 4e Indução da queimadura no dorso do animal .................................... 36

Figura 4f Aspecto da queimadura no dorso do rato ........................................ 36

Figura 5a Aparelho Laser MMO TWIN FLEX Evolution ………………………. 37

Figura 5b Aparelho LED KONDORTECH ........................................................ 37

Figura 5c Irradiação de um dos pontos da queimadura com laser de λ660nm

.........................................................................................................

37

Figura 5d Os quatros pontos de irradiação coincidentes com os ângulos da

queimadura do laser λ660 nm ou λ780 nm .....................................

37

Figura 5e Azul de Metileno Chimiolux, 100µg/mL ........................................... 37

Figura 5f Aplicação de gotas do azul de metileno 0,5µg/mL na ferida .......... 37

Figura 5g Irradiação de um dos pontos da queimadura com LED ................. 37

Figura 5h Irradiação da luz LED nos quatros pontos coincidentes com os

ângulos da queimadura ...................................................................

37

Figura 5i Aferição do diâmetro da ferida. ....................................................... 37

Figura 1

Queimaduras em pele dos grupos CTR, LVER e LED durante os

tempos de sacrifícios (artigo 1).........................................................

47

Figura 2 Avaliação do índice de retração da ferida de cada grupo de

tratamento durante os tempos de sacrifícios (artigo 1)......................

48

Figura 3 Cortes histológicos em Hematoxilina e Eosina em 14 e 21 dias dos

grupos CTR, LVER e LED (artigo 1)................................................ 50

Figura 4

Áreas de colagenização em 14 e 21 dias dos grupos CTR, LVER e

LED (artigo 1)..................................................................................

51

Figura 5

Fotomicrografias em picrosírius das áreas de colagenização em 14

e 21 dias dos grupos CTR,LVER e LED (artigo 1) ..........................

52

Figura 1

Queimaduras em pele pelos grupos CTR, LINF e TFD durante os

tempos de sacrifícios (artigo 2).........................................................

65

Figura 2 Avaliação do índice de retração da ferida de cada grupo de

tratamento durante os tempos de sacrifício (artigo 2) ......................

66

Figura 3

Cortes histológicos em Hematoxilina e Eosina em 14 e 21 dias dos

grupos CTR, LINF e TFD (artigo 2). .................................................

68

Figura 4

Áreas de colagenização em 14 e 21 dias dos grupos CTR, LINF e

TFD (artigo 2) ...................................................................................

69

Figura 5

Fotomicrografias em picrosírius das áreas de colagenização em 14

e 21 dias dos grupos CTR, LINF e TFD (artigo 2) ............................

70

LISTA DE ABREVIATURAS

cm centímetro

cm2 centímetro quadrado

cm3 centímetro cúbico

g grama

J joule

Kg quilo

mg miligrama

mL mililitros

mW miliwatt

mm milímetro

nm nanômetro

p nível de significância

s segundos

µg micrograma

µm micrômetros

µs microsegundos

LISTA DE SIGLAS

AsGaAl Arseneto de Gálio e Alumínio

AM Azul de Metileno

ATP Adenosina Trifosfato

CTR Controle

CESED Centro de Ensino Superior e Desenvolvimento

CEUA Comitê de Ética no Uso de Animais

FGF-α Fator de crescimento fibroblástico ácido

TGF-β Fator transformante de crescimento beta

FS Fotossenssibilizador

HE Hematoxilina e Eosina

InGaAlP Fosfeto de Índio Gálio e Alumínio

InGaN Nitreto Índio e Gálio

LBI Laser de baixa intensidade

Leds Diodos emissores de luz

LED Led verde

LINF Laser Infravermelho

LVER Laser Vermelho

LMBE Laboratório de Morfologia e Biologia Estrutural

RNAm RNA mensageiro

SPSS Statistical Package for the Social Sciences

TFD Terapia Fotodinâmica

UEPB Universidade Estadual da Paraíba

UFCG Universidade Federal de Campina Grande

UNIT Universidade Tiradentes

LISTA DE SÍMBOLOS

º Grau

ºC Grau celsius

= Igual

% Por cento

< Menor

λ Lambda

± Desvio padrão

RESUMO

O objetivo desta pesquisa foi avaliar a ação do laser vermelho, infravermelho, terapia fotodinâmica e LED na cicatrização de queimaduras em pele, através da análise clínica e histológica em ratos. Para tanto, 100 animais foram aleatoriamente distribuídos em cinco grupos: G1 – controle, não tratado (CTR), G2- laser vermelho (LVER), G3- Laser infravermelho (LINF), G4- Terapia Fotodinâmica (TFD) e G5 - Led verde (LED). A indução da queimadura foi realizada no dorso do rato através da aplicação por 20 segundos de um instrumento metálico previamente aquecido por 40 segundos na chama azul do maçarico. O tratamento dos grupos experimentais foi a irradiação da luz vermelha (10J/cm2, 10s, 40mW e λ660 nm), infravermelha (10J/cm2, 10s, 40mW e λ780 nm), Led verde (60J/cm2, 10s, λ520 a 550 nm) e terapia fotodinâmica (10J/cm2, 40mW e λ660 nm), esta última associada ao fotossenssibilizador azul de metileno na concentração 0,5µg/mL. As aplicações foram pontuais nos quatro pontos coincidentes dos ângulos da ferida e em cada ponto foi depositada a quantidade de 10J/cm2, totalizando 40J/cm2, com exceção do Led verde que foi aplicado 60J/cm², totalizando 240J/cm2 por sessão. As aplicações foram diárias até o dia anterior ao sacrifício do animal em 3, 7, 14 e 21 dias com overdose de anestésico intraperitoneal. Os espécimes removidos foram analisadas clinicamente e logo após, processadas e corados em HE e Picrosírius para análise sob microscopia de luz e luz polarizada, respectivamente. Os animais tratados com LVER, LINF e TFD (p<0,001) e Led (p<0,05) estimularam a produção e maturação do colágeno, além de aumentarem o consumo de ração e água comparado ao grupo controle (p<0,001). O laser λ660 nm e λ780 nm apresentaram as maiores retrações da ferida dos grupos (p=0,012 e p=0,04, respectivamente). Em conclusão, o laser vermelho, infravermelho, terapia fotodinâmica e LED verde favoreceram o processo de cicatrização em queimaduras de terceiro grau em ratos.

Palavras-chaves: Cicatrização; Lasers; Queimaduras; Ratos; Terapia Fotodinâmica.

ABSTRACT

The aim of this study was to evaluate the influence of the red laser, infrared, photodynamic therapy and LED on the healing of wound burns through the clinical and histological analysis in rats. Therefore, 100 animals were randomly divided into five groups: G 1- untreated controlled (CTR), G2- red laser (LVER), G3- infrared laser (LINF), G4- photodynamic therapy (TFD) and G5- green led (LED). The induction of wound burns was obtained by applying a squared metal instrument, previously heated on a torch for 40 seconds, on the back of the rats for 20 seconds. The treatment of the experimental groups was the irradiation of red light (10J/cm2, 10s, and 40mW λ660 nm), infrared (10J/cm2, 10s, and 40mW λ780 nm), green LED (60J/cm2, 10s, λ520 to 550 nm) and photodynamic therapy (10J/cm2, and 40mW λ660 nm) that was associated with 0.5 µg/mL of methylene blue .The applications were punctually applied on four coincident points of the wound angles. At each point was added 10J/cm2 totaling 40J/cm2 except from the green LED that was applied 60J/cm², totaling 240J/cm2 per session. The applications were daily until the day before the animal sacrifice that occurred respectively ,considering the group classification, in 3, 7, 14 and 21 days when was applied an overdose of intraperitoneal anesthetic on the animals. The samples were removed and clinically examined then processed and stained with HE and Sirius red for analysis under light microscopy and polarized light, respectively. Animals treated with LVER, LINF, TFD (p <0.001) and LED (p <0.05), stimulated the production and maturation of collagen. Besides the fact that the animals from the group ate better and drink more water if compared to the other untreated controlled group (p<0.001). In conclusion, the red laser, infrared, photodynamic therapy and green led stimulated the healing process in third degree burns in rats.

Key-words: Healing; Lasers; Burns; Rats; Therapy Photodynamic.

SUMÁRIO

1 CONSIDERAÇÕES INICIAIS .............................................................. 18

2 OBJETIVOS.......................................................................................... 24

2.1 OBJETIVO GERAL.............................................................................. 24

2.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS ............................................................... 24

3 MATERIAIS E MÉTODOS.................................................................. 26

3.1 CARACTERIZAÇÃO DO ESTUDO..................................................... 26

3.2 ASPECTOS ÉTICOS ......................................................................... 26

3.3 AMOSTRA ......................................................................................... 26

3.3.1 Critérios de inclusão e exclusão da amostra ............................... 26

3.3.2 Tipos de grupos de tratamento ..................................................... 27

3.4 MÉTODO EXPERIMENTAL .............................................................. 27

3.4.1 Anestesia/tricotomia ....................................................................... 28

3.4.2 Indução da queimadura .................................................................. 28

3.4.3 Estudo piloto ................................................................................... 28

3.5 CARACTERÍSTICAS DO LASER ..................................................... 29

3.6 CARACTERÍSTICAS DO LED .......................................................... 29

3.7 TIPOS DE TRATAMENTO ............................................................... 29

3.8 EUTANÁSIA DOS ANIMAIS E ANÁLISE CLINICA ........................ 31

3.9 PROCESSAMENTO HISTOLÓGICO .............................................. 31

3.9.1 Método de avaliação histológica .................................................. 32

3.9.1.2 Infiltrado inflamatório ......................................................................... 32

3.9.1.3 Análise morfológica do colágeno ...................................................... 32

3.9.1.4 Análise quantitativa da área de colagenização ................................ 32

3.10 ANÁLISE ESTATÍSTICA ................................................................... 33

4 ARTIGOS A SEREM SUBMETIDOS ............................................... 40

4.1 ARTIGO 1 ......................................................................................... 41

4.2 ARTIGO 2 ......................................................................................... 59

5 CONSIDERAÇÕES FINAIS ............................................................. 79

REFERÊNCIAS

APÊNDICE A - Ficha de Avaliação clinica

APÊNDICE B - Ficha do consumo da água e ração

ANEXO A - Parecer do Comitê de Ética no Uso de Animais

CONSIDERAÇÕES INICIAIS

18

1 CONSIDERAÇÕES INICIAIS

A queimadura é um dos traumas mais devastadores que podem atingir o

homem, e considerada uma das causas frequentes de morbidade, mortalidade e de

graves incapacidades a longo prazo. Na Europa, estima-se uma taxa de mortalidade

variando de 1,4% a 34% dos pacientes hospitalizados por queimaduras, na qual

metade desses enfermos tem idade inferior a 16 anos e 75% das vítimas são do

sexo masculino (BRUSSELAERS et al., 2010). Mais de um milhão de queimaduras

ocorrem nos Estados Unidos a cada ano, cerca de 5000 destes ferimentos são

fatais, fazendo com que a queimadura seja a quarta principal causa de morte por

lesões não intencionais neste país (EDELMAN, 2007) enquanto no Brasil são

relatados 1 milhão de casos de queimaduras, de acordo com a Sociedade Brasileira

de Queimaduras, das quais 200.000 são tratados em salas ambulatórias e 40.000

necessitam de hospitalização (POTOKAR; PROWSE; WHITAKER, 2008).

A queimadura é um tipo de ferida aberta em que o processo cicatricial ocorre

por segunda intenção, na qual as bordas da ferida se apresentam afastadas em

consequência da perda de parte dos tecidos (FOULKES; DAVIDSON; GATELEY,

2011), resultando em perda de líquidos corporais, inflamação, edema, infecção, dor

e choque, todos estes fatores podem resultar em morte da vítima (SHARMA, 2007;

VALE, 2005; BARRILO; PAUSEN, 2003; WASSERMANN, 2002; SHERIDAN et al.,

2000).

Quando a integridade da pele é alterada, inicia-se a cicatrização, que é um

processo complexo que envolve a interação de vários tipos de células, tais como

linfócitos, monócitos, células epiteliais e fibroblastos (CLARK, 1993; DIEGELMANN;

EVANS, 2004). Este processo é constituído por três fases independentes e

sobrepostas dinamicamente no tempo (DIEGELMANN; EVANS, 2004).

A fase inflamatória ou exsudativa inicia-se logo após a lesão, com formação de

rede de fibrina e migração de macrófagos e neutrófilos e mais tardiamente, os

linfócitos. Os macrófagos tem o objetivo de fagocitar o tecido necrosado, liberar os

agentes quimiotáticos que atraem fibroblastos e células endoteliais, estimulando

essas células a proliferarem (fase proliferativa), que estimulam a síntese de

19

colágeno por parte dos fibroblastos (MANDELBAUM; DISANTIS; MANDELBAUM,

2003).

A fase proliferativa é dividida em três subfases e é responsável pela formação

do tecido de granulação. A primeira subfase é a fibroplasia, caracterizada pela

proliferação de fibroblastos e produção de colágeno, elastinas e outras proteínas; a

segunda é a angiogênese que ocorre paralelamente à fibroplasia, na qual novos

vasos darão suporte à formação da nova matriz (MANDELBAUM; DISANTIS;

MANDELBAUM, 2003). Nessa fase, os fibroblastos podem se diferenciar em

miofibroblastos que são responsáveis pela redução de 0.60 a 0.75mm por dia da

área da ferida (COELHO; REZENDE; TENÓRIO, 1999). A reepitelização (terceira

subfase) ocorre após a formação da reação de granulação, caracterizada pela

migração de queratinócitos das bordas e anexos remanescentes.

A última fase é a maturação ou remodeladora, caracterizada pela substituição

do colágeno tipo III pelo tipo I, reorientação e reorganização da nova matriz de

colágeno, absorção de água, diminuição do número de vasos e do infiltrado

inflamatório (MANDELBAUM; DISANTIS; MANDELBAUM, 2003; BALBINO;

PEREIRA; CURI, 2005).

Quando o tecido é lesado, ocorre o extravasamento de líquido do interior dos

vasos sanguíneos, levando à produção de um edema. Em uma queimadura muito

extensa, a perda de grande volume de líquido desses vasos pode levar ao choque,

ocasionado pela queda brusca da pressão arterial, reduzindo o sangue que flui para

o cérebro e outros órgãos vitais (VALE, 2005).

Na avaliação desse ferimento deve ser analisado principalmente a

profundidade, a localização e a extensão além da idade da vítima, a existência de

doenças prévias bem como a concomitância de condições agravantes. Com relação

à profundidade, fator determinante do resultado estético e funcional, deve-se levar

em consideração o agente térmico e o tempo de contato (VALE, 2005).

A verdadeira profundidade da queimadura pode não ser precisa ou facilmente

identificada no primeiro dia. Durante sua evolução, uma infecção ou uma

instabilidade hemodinâmica podem aprofundar a lesão. O próprio processo de

reposição volêmica produz vários radicais livres que levam os danos adicionais aos

20

tecidos (BARBOSA et al., 2007) isto permite que uma lesão de espessura parcial

superficial evolua para espessura total depois de 72h após o ferimento (GOMES,

1998).

Para o tratamento de queimaduras é necessário compreender a fisiopatologia

da área afetada, sendo de fundamental importância a extensão e a profundidade da

ferida. A gravidade das lesões cutâneas provocadas pelos danos térmicos é

diretamente proporcional à duração e intensidade da exposição à fonte sendo

dividida em lesões de primeiro, segundo e terceiro graus (MONSTREY et al., 2005).

As queimaduras geram graves prejuízos sociais e psicológicos ao paciente,

deste modo o desenvolvimento de uma modalidade de tratamento eficaz, rápida e

de baixo custo para esse tipo de ferimento, representa um enorme benefício para a

qualidade de vida do paciente (SHOLAR et al., 2007).

Um dos tratamentos evidenciados na literatura na aceleração do reparo

tecidual, com efeitos analgésicos e anti-inflamatórios no processo de cicatrização de

queimaduras é a laserterapia (MEIRELES et al., 2008; ARAÚJO et al., 2007;

HAWKINS; ABRAHAMSE, 2006), Terapia Fotodinâmica (TFD) (GARCIA; LIMA;

OKAMOTO, 2010; KARU, 1989) e Led (LEE; KIM, 2012; FIÓRIO; SILVEIRA; MUNIN

et al., 2011; ADAMSKAYA; DUNGEL; MITTERMAYR et al., 2011; OLIVEIRA;

PINHEIRO; DE CASTRO et al., 2011).

Os primeiros trabalhos com laser de baixa intensidade foram conduzidos por

Mester e colaboradores, que observaram que o laser é capaz de modular processos

biológicos, em particular, estimular processo de regeneração tecidual (MESTER;

MESTER; MESTER, 1985).

Para avaliar a eficácia da absorção e a extensão da interação luz-tecido,

considera-se a associação entre as propriedades físicas do laser (comprimento de

onda, potência e tempo) com as características ópticas do tecido irradiado (KARU;

KOLYAKOV, 2005). Essa interação é responsável pelos efeitos estimuladores nos

diversos mecanismos metabólicos em diferentes níveis celulares. Um dos principais

efeitos da absorção da luz vermelha é a estimulação das mitocôndrias, o que resulta

em aumento de energia e na ativação da síntese de ácido nucleico (TUNÈR; HODE,

2002). Por outro lado, o uso da luz infravermelha (TUNÈR; HODE, 2002) e dos

21

diodos emissores de luz (Led) apresentam resultados semelhantes, sendo o

processo iniciado à nível de membrana celular (RIBEIRO; SILVA; ARAÚJO, 2004).

Diversos estudos (KHOSHVAGHTI; ZIBAMANZARMOFRAD; BAYAT, 2011;

GARCIA; LIMA; OKAMOTO et al., 2010; RIBEIRO; ALBUQUERQUE JÚNIOR;

RAMALHO et al., 2009; MEIRELES; SANTOS; CHAGAS et al., 2008; ROCHA;

OLIVEIRA; FARIAS et al., 2006) tem mostrado que o laser de baixa atua como

coadjuvante na cicatrização, visto que, promove um estímulo à revascularização

precoce, fornece energia em forma de adenosina trifosfato (ATP) às células de

reparo, estimula a secreção do fator de crescimento de fibroblastos (FGF) e inibe

mediadores químicos da inflamação (HAMBLIN; DEMIDOVA, 2006).

A terapia fotodinâmica (TFD) é a combinação de um fotossensibilizador (FS)

que se liga a célula alvo e a luz de um comprimento de onda específico

(WAINWRIGHT, 1998). Na presença de oxigênio do meio, o FS ativado pode reagir

com moléculas na sua vizinhança levando à produção de oxigênio singlete, que

reage com os componentes celulares, sejam eles bactérias ou células neoplásicas,

provocando inviabilidade celular (DAI; TEGOS; LU, 2009). Isso oferece a terapia

fotodinâmica algumas vantagens, como natureza não invasiva, repetibilidade fácil e

ação antimicrobiana (HUANG, 2005), já que a presença de bactérias na ferida pode

retarda o processo de cicatrização (PARSONS; MCCOY; GORMAN, 2009).

O efeito do TFD no processo de cicatrização de queimaduras evidencia que a

terapia fotodinâmica quando associado a luz vermelha pode promover a

biomodulação do tecido através do aumento da cadeia respiratória mitocondrial e

síntese de adenosina trifosfato, favorecendo assim o processo de cicatrização

(LAMBRECHTS; DEMIDOVA; AALDERS, 2005), através da proliferação celular,

produção de ácidos nucleico, síntese de colágeno e redução da inflamação

(GARCIA et al., 2010; KARU, 1989).

Os diodos emissores de luz (LEDs) são pequenos dispositivos robustos que

atuam com faixa de comprimento de onda, variando do espectro ultravioleta ao

infravermelho (WEISS; MCDANIEL; GERONEMUS et al., 2005) e são bastante

utilizados na odontologia (COUTINHO et al., 2009; TORRES et al., 2011).

http://lattes.cnpq.br/9720714380256956

22

Os LEDs têm sido utilizados em várias indicações clínicas, destacando-se a

aceleração em pele do processo de cicatrização em incisões (KLEBANOV et al.,

2005; ADAMSKAYA et al., 2011) e queimaduras (LEE; KIM, 2012; FIÓRIO;

SILVEIRA; MUNIN et al., 2011; OLIVEIRA; PINHEIRO; DE CASTRO et al., 2011;

O objetivo deste estudo foi avaliar a ação do Laser, LED e da terapia

fotodinâmica na cicatrização de queimaduras em pele, estudo clínico e histológico

em ratos.

OBJETIVOS

24

2 OBJETIVOS

2.1 OBJETIVO GERAL

Avaliar a ação do Laser, LED e da terapia fotodinâmica na Cicatrização de

Queimaduras em Pele, estudo clínico e histológico em ratos.

2.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS

Analisar histologicamente o processo inflamatório, reação de granulação e

fibroplasia das feridas;

Avaliar macroscopicamente as ferida nos grupos;

Calcular o índice de retração das feridas em cada grupo;

Aferir a quantidade de ração consumida por cada grupo de tratamento durante

os tempos de sacrifícios;

Aferir a quantidade de água consumida por cada grupo de tratamento durante

os tempos de sacrifícios.

MATERIAIS E MÉTODOS

26

3 MATERIAIS E MÉTODOS

3.1 CARACTERIZAÇÃO DO ESTUDO

Trata-se de um estudo de caráter experimental in vivo, quantitativo e

randomizado.

3.2 ASPECTOS ÉTICOS

Para a realização deste estudo foram seguidas as premissas da COBEA

(Colégio Brasileiro de Experimentação Animal). Este estudo foi aprovado pelo

Comitê de Ética no Uso de Animais (CEUA) do Centro de Ensino Superior e

Desenvolvimento (CESED) nº 0019/240712.

3.3 AMOSTRA

Foram utilizados 100 ratos, adultos, da espécie Ratthus norvegicus, classe

Mammalia, ordem Roedentia, da linhagem Wistar, provenientes do biotério do

Departamento de Medicina da Universidade Federal de Campina Grande – UFCG.

Os animais foram mantidos em gaiolas de polipropileno com cama de maravalha,

cada subgrupo (5 ratos) foi divididos em duas gaiolas respectivamente com 2 e 3

animais. A temperatura variava de 23°C ± 2°C sob iluminação controlada (12 hs de

ciclo claro/escuro) com condições adequadas de ração e água ad libitum.

3.3.1 Critérios de inclusão e exclusão da amostra

Os animais selecionados nesta pesquisa foram ratos machos, da linhagem

Wistar, com idade entre 60 a 90 dias e peso entre 200 a 250 gramas. Foram

excluídos do estudo aqueles animais que apresentaram qualquer sinal ou sintoma

de enfermidade local ou sistêmica.

27

3.3.2 Tipos de grupos de tratamento

Os 100 animais foram divididos aleatoriamente em 5 grupos experimentais

(n=20), com subgrupo de 5 ratos para cada tempo de sacrifício (3, 7, 14 e 21 dias),

conforme descrito na figura 1.

Figura 1: Fluxograma dos grupos de tratamento em função dos subgrupos e dos

tempos de sacrifícios. G1-CTR-controle, G2-LVER– Laser vermelho, G3-LINF- Laser

Infravermelho, G4-TFD-Terapia Fotodinâmica, G5- LED – diodos emissores de luz

(LEDs), SG- subgrupos e TS- tempo de sacrifício.

3.4 MÉTODO EXPERIMENTAL

Utilizou-se uma balança analítica (série shimadzu AUY229, São Paulo, SP,

Brasil) (figura 3A) para o controle do peso do animal e da ração consumida e uma

garrafa de água para ratos (figura 3B), com o intuito de calcular da quantidade de

àgua ingerida. Os animais foram pesados antes do experimento e cada gaiola

recebia diariamente uma quantidade de 200 gramas de ração, o consumo era

28

calculado pela diferença da massa entre dois dias consecutivos. Diariamente, cada

gaiola recebia uma garrafa de água para ratos com 250 mL/H2O, essa quantidade

era medida por uma proveta e o consumo calculado pela diferença entre dois

consecutivos.

3.4.1 Anestesia/Tricotomia

Os animais foram anestesiados com uma associação anestesica de 100 mg/Kg

de Ketamina (Cetamin®, Syntec, São Paulo, SP, Brasil) 10% e 5 mg/Kg de Xilazyna

2% (Dopaser®, Syntec, São Paulo, SP, Brasil) aplicados na região intraperitoneal

(figura 4A), através de uma seringa descartável para insulina com agulha de 1 mL.

Depois de constatado o plano anestésico profundo, realizou-se a tricotomia do dorso

do animal (figura 4B), com lâmina de barbear descartável, água e sabão neutro.

3.4.2 Indução da Queimadura

A indução da queimadura foi realizada no dorso de todos os animais com um

instrumental de ferro, com ponta ativa chata e plana de diâmetro 1,0 X 1,0 X 1,0 cm3

(Figura 4C) previamente confeccionado, segundo metodologia empregada por Meyer

e Silva (1999) modificada nas dimensões (5.5 x 2.0 x 2.0 cm3). Esse instrumento foi

aquecido com auxílio de maçarico até que ficasse rubro. O aquecimento se deu pela

chama azul do maçarico em contato direto com o ferro por 40 segundos (Figura 4D).

Quando atingindo esse estado, o instrumental era imediatamente encostado no

dorso do animal (Figura 4E), permanecendo por 20 segundos, queimando a pele

(Figura 4F).

3.4.3 Estudo piloto

Foram selecionados aletoriamente dois animais com intuito de definir o tipo e a

padronização da queimadura. Realizou-se em ambos a anestesia, tricotomia,

aquecimento do instrumento metálico no maçarico por 40 segundos, diferindo no

tempo de queimadura em pele, 20 e 30 segundos respectivamente. Após a leitura

29

das lâminas em Hematoxilina e Eosina, optou-se pelo tempo de 20 segundos,

constatando uma destruição total da epiderme e derme, característico da

queimadura de terceiro grau.

3.5 CARACTERÍSTICAS DO LASER

Neste estudo foi utilizado o laser de baixa intensidade (MMO TWIN FLEX

Evolution, São Carlos, Brasil) InGaAlP – Fosfeto Índio de Gálio e Alumínio, na

emissão vermelha (λ660 nm), e AsGaAl – Arseneto de Gálio e Alumínio, na emissão

infravermelha (λ780 nm). O laser foi devidamente calibrado e possuía potência de

saída de 40 mW (Figura 5A).

3.6 CARACTERÍSTICAS DO LED

Utilizou-se neste estudo os LEDs (KONDORTECH, São Paulo, Brasil) InGaN –

Nitreto Índio e Gálio, na emissão verde (λ520 a 550 nm), devidamente calibrado com

potência de saída individual 60 mW ( Figura 5B).

3.7 TIPOS DE TRATAMENTOS

Aplicação do laser foi feita por um único operador devidamente calibrado e

seguiu as normas de segurança necessárias, ressaltando a utilização dos óculos de

segurança para operador e demais assistentes e utilização de um filme plástico entre

a superfície da ferida e do equipamento evitando assim possíveis contaminações.

Os grupos de tratamento foram divididos, em:

G1 – Controle (CTR)

Não foi aplicado nenhum tipo de tratamento. Tempos de sacrifícios foram 3, 7,

14 e 21 dias após a queimadura.

G2 - laser vermelho – Laser λ660 nm (LVER) – Modo de Aplicação: Pontual

30

A irradiação (40J/cm²; 40 mW; 40s, 660nm) foi aplicada imediatamente após a

queimadura, com o laser de baixa intensidade - InGaAlP (MMO TWIN FLEX

Evolution, São Carlos, Brasil) aplicado de forma pontual em quatro pontos

coincidentes com os ângulos da ferida (Figura 5D), e em cada ponto depositada a

quantidade de 10J/cm2, totalizando 40J/cm2 por sessão de laserterapia. Aplicações

eram diárias, com exceção do dia do sacrifício do animal, na qual não se realizava a

irradiação. Os tempo de sacrifícios foram 3, 7, 14 e 21 dias após a queimadura.

G3 - laser infravermelho – Laser λ780 nm (LINF) – Modo de Aplicação: Pontual

A irradiação (40J/cm²; 40 mW; 40s, 780nm) foi aplicada imediatamente após a

queimadura, com o laser de baixa intensidade - AsGaAl (MMO TWIN FLEX

Evolution, São Carlos, Brasil) aplicado de forma pontual em quatro pontos

coincidentes com os ângulos da ferida (Figura 5D), e em cada ponto depositada a

quantidade de 10J/cm2, totalizando 40J/cm2 por sessão de laserterapia. Aplicações

eram diárias, com exceção do dia do sacrifício do animal, na qual não se realizava a

irradiação. Os tempo de sacrifícios foram 3, 7, 14 e 21 dias após a queimadura.

G4 – Terapia Fotodinâmica (TFD) – Laser λ660 nm associado ao

fotossenssibilizador azul de metileno 0,5 µg/mL - Modo de Aplicação: Pontual

O fotossenssibilizador (FS) azul de metileno (AM) chimiolux (Hypofarma,

Ribeirão das Neves, MG, Brasil) possuía a concentração de 100 µg/mL (Figura 5E).

Segundo Barbosa et al. (2011) concentrações acima de 1 µg/mL são tóxicas, deste

modo, realizou-se a diluição com água deionizada (0,66 µs/ cm) para a

concentração de 0,5 µg/mL. Logo após, com uma seringa descartável, aplicou-se

gotas do AM (Figura 5F) e 5 minutos depois, aplica-se o laser (40J/cm²; 40 mW; 40s,

λ660nm) de forma pontual (Figura 5G) em quatro pontos coincidentes com os

ângulos da ferida (Figura 5H), e em cada ponto depositada a quantidade de 10J/cm2,

totalizando 40J/cm2 por sessão.

31

G5 – diodos emissores de luz - LEDs – λ520 a 550nm – Modo de Aplicação:

Pontual

A irradiação (60 mW/cm2; 40s, λ520 a 550nm) foi aplicada imediatamente após

a queimadura, com o laser de baixa intensidade (KONDORTECH, São Paulo, Brasil)

InGaN aplicado de forma pontual em quatro pontos coincidentes com os ângulos da

ferida, e em cada ponto depositada a quantidade de 60mW/cm2, totalizando

240mW/cm2 por sessão.

3.8 EUTANÁSIA DOS ANIMAIS E CÁLCULO DO ÍNDICE DE RETRAÇÃO DA

FERIDA (IRF)

Terminado o período experimental para cada subgrupo definido em 3, 7, 14 e

21 dias os animais foram submetidos à nova administração de anestésico em

quantidade três vezes maior àquela utilizada para anestesia (300 mg/Kg de

Ketamina (Cetamin®, Syntec, São Paulo, SP, Brasil) 10% e 15 mg/Kg de Xilazyna

2% (Dopaser®, Syntec, São Paulo, SP, Brasil) injetada no peritônio. Após a

Eutanásia, realizou-se com auxilio do paquímetro digital o cálculo do índice de

retração da ferida (IRF) pela fórmula: IRF (%) = Área inicial- Área do dia do

sacrifícios ÷ Área inicial x 100. Área inicial tinha 1cm2 e a área do dia do sacrifício foi

calculada pelo quadrado do raio multiplicado por pi (r2π).

3.9 PROCESSAMENTO HISTOLÓGICO

Depois de constatado a morte do animal através da cessação dos sinais vitais

e opacificação da córnea foi realizada a remoção da espécime. Utilizando um bisturi

a ferida foi excisada com margem de segurança de 0,5cm e acondicionada em

recipiente plástico contendo formol a 10% com volume aproximadamente igual a 5

vezes o volume da peça, onde permaneceu por um período mínimo de 24 horas.

Após o período de fixação a peça foi processada seguindo os métodos rotineiros

para coloração em Hematoxilina-Eosina (HE) e Picrosírius. Todo o processamento,

coloração e leitura das lâminas em HE foi realizado no Laboratório de Histopatologia

32

Oral da UEPB, enquanto a coloração, leitura e calibração das lâminas em picrosírius,

realizou-se no laboratório de morfologia e biologia estrutural(LMBE) UNIT-SE.

3.9.1 Método de avaliação Histológica

3.9.1.2 Infiltrado Inflamatório

Análise do infiltrado inflamatório realizado nos cortes histológicos em HE, foi

descritivo para os grupos de tratamento dentro dos tempos de sacrifícios.

3.9.1.3 Análise Morfológica do Colágeno

Cortes histológicos corados em picrosírius e analisadas sob luz polarizada

foram utilizados para a análise descritiva e quantitativa da deposição de colágeno.

As fibras de colágeno foram classificadas de acordo com o seu padrão de

birrefringência (esverdeado / amarelo-esverdeada ou laranja), aparência morfológica

(ondulados ou estirados, delgadas ou espessas, curto ou longo) e disposição

(reticular, paralela ou entrelaçado).

3.9.1.4 Análise Quantitativa da área de Colagenação (AC)

A quantificação da área ocupada pela deposição de colágeno na área de ferida

foi determinada pela densidade óptica do sistema de análise de imagens em 8

campos microscópicos de cada lâmina com amplificação de 100x. O sistema

utilizado consiste de uma câmara de vídeo CCD Sony DXC-101 aplicado a um

microscópio Olympus CX31, a partir do qual as imagens foram enviadas para um

monitor (Trinitron Sony). Por meio de um sistema de digitalização (Olympus C-7070

WideZoom) as imagens foram carregados em um computador (Pentium 133 MHz) e

processados utilizando o software (ImageTool), que proporcionará a interpretação e

a obtenção de valores de mensuração das fibras colágenas, através da

33

quantificação de suas medidas originais, optando em transformar a medida da

imagem digitalizada (o pixel) em medida micrometrada.

Figura 2. Fluxograma da área de colagenização e da análise descritiva das fibras

colágenas.

Os limiares para as fibras colágeno foram estabelecidos para cada lâmina,

depois de aumentar o contraste até um ponto em que as fibras foram facilmente

identificadas como birrefringentes (colágeno). A área ocupada pelas fibras foi

determinada pelos limiares das diferentes densidades de cores do colágeno e

destacada por uma ferramenta de seleção.

3.10 ANÁLISE ESTATÍSTICA

Na análise estatística foi utilizado o programa Statistical Package for the Social

Sciences (SPSS) versão 17.0. Foram aplicados os testes de Shapiro-Wilk para

verificação da normalidade dos dados, sendo considerado o nível de significância de

5% para as diferenças observadas quando p<0,05. A significância estatística da área

de colagenização e análise quantitativa da água consumida foram avaliadas pela

análise de variância (ANOVA) com pós teste Tukey e Bonferroni, respectivamente,

34

com exceção da ingestão da água em 21 dias, da ração consumida e do cálculo do

IRF em 3, 7 e 21 dias que utilizaram o teste de kruskall Wallis. O IRF em 14 dias foi

avaliado pela ANOVA com pós teste de Tukey.

35

Figura 3

Figura 3A. Balança Analítica Marte utilizada na pesagem dos ratos e da ração

(Campina Grande-PB/2013).

Figura 3B. Garrafa de Água para Ratos (Campina Grande-PB/2013).

36

Figura 4

Figura 4A. Anestesia Intraperitoneal realizada com associação anestésica com

Ketamina 10% e Xilazyna 2% (Campina Grande-PB/2013).

Figura 4B. Tricotomia realizada no dorso do rato (Campina Grande-PB/2013).

Figura 4C. Instrumental metálico de queimadura (Campina Grande-PB/2013).

Figura 4D. Aquecimento do instrumental metálico pela chama azul do maçarico


Figura 4E. Indução da queimadura no dorso do animal por meio da ponta aquecida

do instrumental (Campina Grande-PB/2013).

Figura 4F. Aspecto da queimadura no dorso do rato (Campina Grande-PB/2013).

37

Figura 5

Figura 5A. Aparelho Laser MMO TWIN FLEX Evolution com caneta λ660nm ou

λ780nm, 40mW (Campina Grande-PB/2013).

Figura 5B. Aparelho LED KONDENTECH com caneta λ520nm a 550nm, 60mW


Figura 5C. Irradiação de um dos pontos da queimadura com laser de λ660nm


Figura 5D. Os quatros pontos de irradiação coincidente com os ângulos da

queimadura do laser λ660nm ou λ780nm ou TFD (λ660nm associado ao azul de

metileno). (Campina Grande-PB/2013).

Figura 5E. Azul de Metileno Quimiloux, 100µg/mL (Campina Grande-PB/2013).

Figura 5F. Aplicação de gotas do azul de metileno 0,5µg/mL na ferida com auxilio de

uma seringa descartável (Campina Grande-PB/2013).

38

Figura 5G. Irradiação de um dos pontos da queimadura com LED de λ520 a λ 550

nm (Campina Grande-PB/2013).

Figura 5H. Irradiação da luz LED nos quatros pontos coincidente com os ângulos da

queimadura (Campina Grande-PB/2013).

Figura 5I. Aferição do diâmetro da ferida com auxilio de um paquímetro digital


ARTIGOS

40

4 ARTIGOS A SEREM SUBMETIDOS

Artigo 1 - Efeitos do Led verde e Laser vermelho no processo de cicatrização de

queimaduras de terceiro grau: estudo clínico e histológico em ratos será

submetido ao periódico Laser in Medical Science.

Artigo 2 - Ação do laser infravermelho e da Terapia fotodinâmica no processo

de cicatrização de queimaduras de terceiro grau em pele: Análise clínica e

histológica em ratos será submetido ao periódico Journal of Photochemistry and

Photobiology B: Biology.

41

4.1 ARTIGO 1

Efeitos do Led verde e Laser vermelho no processo de cicatrização de

queimaduras de terceiro grau: estudo clínico e histológico em ratos

Roniery de Oliveira Costa ● Cassiano Francisco Weege Nonaka ● Ricardo Luiz

Cavalcanti de Albuquerque Júnior ● Patrícia Meira Bento ● Maria Helena Chaves de

Vasconcelos Catão

Resumo:

O objetivo desta pesquisa foi avaliar os efeitos do laser vermelho e do Led verde na cicatrização de queimaduras em pele, através da analise clínica e histopatológica em ratos. Para tanto, 60 animais foram aleatoriamente distribuídos em três grupos: controle (CTR), laser vermelho (LVER) e Led verde (LED). A indução da queimadura foi realizada no dorso do rato através da aplicação por 20 segundos de um instrumento metálico previamente aquecido por 40 segundos na chama azul do maçarico. O tratamento para os grupos experimentais foi laser vermelho (10J/cm2, 10s, λ660 nm) e Led verde (60J/cm2, 10s, λ520 a 550 nm) aplicados pela técnica pontual em quatro pontos coincidentes com os ângulos da ferida. As aplicações eram diárias até o dia anterior à morte animal que se deu em 3, 7, 14 e 21 dias com overdose de anestésico intraperitoneal. Os espécimes removidos foram analisados clinicamente e logo após processadas e corados em hematoxilina-eosina e picrosírius, analisados sob microscopia de luz e luz polarizada, respectivamente. Os animais tratados com laser vermelho e Led verde estimularam a produção, maturação do colágeno (p<0,001 e p<0,05, respectivamente) e aumento do consumo de ração e água (p<0,001) comparado ao grupo controle. O laser λ660 nm apresentou a maior retração da ferida dos grupos (p=0,012). Em conclusão, o laser vermelho e Led verde apresentaram efeitos benéficos na aceleração do processo de cicatrização de queimaduras de terceiro grau.

Palavras-Chaves Cicatrização ● Lasers ● Queimaduras ● Ratos.

R.O. Costa* ● C.F.W. Nonaka ● P.M. Bento ● M.H.C.V. Catão Programa de Pós-Graduação em Odontologia da Universidade Estadual da Paraíba, R. Baraúnas, 351, Bodocongó, Campina Grande - PB, 58429-500, Brasil *Email: [email protected] R.L.C. Albuquerque Júnior Programa de Pós-Graduação em Saúde e Ambiente da Universidade Tiradentes, Av. Murilo Dantas, 300, Farolândia, CEP 49030-490, Aracaju/SE, Brasil

42

Introdução

A queimadura é um tipo de ferida aberta em que o processo cicatricial ocorre

por segunda intenção [1], resultando em perda de líquidos corporais, inflamação,

edema, infecção, dor e choque, todos estes fatores podem resultar em morte da

vítima [2-5].

Nas queimaduras de terceiro grau, a lesão acomete toda espessura da pele,

envolvendo toda a epiderme e derme e, em alguns casos, se estendem aos tecidos

subcutâneos, músculos e ossos. Podem ter um aspecto branco, marrom ou ter uma

textura de couro [6-8].

Um dos tratamentos evidenciados na literatura na aceleração do processo de

cicatrização de queimaduras é a laserterapia [6,9-17] e recentemente os diodos

emissores de luz (Leds) [18-21]. Os primeiros trabalhos foram conduzidos por

Mester e colaboradores, que observaram que o laser é capaz de modular processos

biológicos, em particular, estimular processo de regeneração tecidual [22].

O laser de baixa intensidade tem demostrado efeitos benéficos no processo de

cicatrização de queimaduras, atuando no infiltrado inflamatório, reepitelização,

formação e maturação do colágeno, além da sua ação analgésica e anti-inflamatória

[6,9-11,14,15,23]. Porém, ainda existe falta de padronização na escolha do melhor

comprimento de onda, potência, frequência, densidade de energia associado às

propriedades ópticas do tecido irradiado [24-26].

Os diodos emissores de luz (LEDs) são pequenos dispositivos robustos que

atuam com faixa de comprimento de onda, variando do espectro ultravioleta ao

infravermelho [27] e são utilizados na odontologia [28,29]. No entanto, recentemente

têm sido estudados seus efeitos sobre o processo de reparo em incisões [21,30] e

queimaduras [18-20].

O objetivo deste estudo foi avaliar a ação do Led verde e Laser vermelho no

processo de cicatrização de queimaduras de terceiro grau: estudo clínico e

histológico em ratos.

Materiais e Métodos

43

Animais

Nesta pesquisa foram utilizados 60 ratos machos da linhagem Wistar com 200

a 250 gramas, provenientes do biotério do Departamento de Medicina da

Universidade Federal de Campina Grande e mantido em gaiolas de polipropileno

revestido com cama de maravalha, submetidos a temperatura (23°C ± 2°C) e

iluminação (12 hs de ciclo claro/escuro) controlada com ração e água ad libitum. Os

animais foram divididos aleatoriamente em 3 grupos experimentais: G1- Controle

(CTR), G2-Laser infravermelho (LINF) e G3-Terapia fotodinâmica (TFD), cada grupo

com 20 animais foram divididos em subgrupos de 5 animais para cada tempo de

3,7,14 e 21 dias de sacrifício. Essa pesquisa foi aprovada pelo Comitê de Ética no

Uso de Animais (CEUA) /CESED, conforme parecer nº 0019/240712.

Ração e Água consumida

Utilizou-se uma balança analítica para o controle do peso do animal e da ração

consumida, além de uma garrafa de água para ratos com o intuito de calcular da

quantidade de água ingerida. Os animais eram pesados antes do experimento e

cada gaiola recebia diariamente uma quantidade de 200 gramas de ração e 250mL

de água. O consumo da ração era calculado pela diferença do seu peso entre dois

dias consecutivos, enquanto a ingestão de água era quantificada com uma proveta e

o consumo calculado pela diferença entre dois consecutivos.

Queimadura

Os animais foram anestesiados com uma associação anestesica de 100 mg/Kg

de Ketamina 10% e 5 mg/Kg de Xilazyna 2% aplicados na região intraperitoneal,

logo após realizou-se a tricotomia do dorso do animal com uma lâmina de barbear

descartável associado a água e sabão neutro. A indução da queimadura foi

realizada no dorso de todos os animais com um instrumental de ferro de 1,0 X 1,0 X

1,0 cm3 que foi aquecido com auxilio de maçarico até que ficasse rubro. O

44

aquecimento se deu pela chama azul do maçarico em contato direto com o ferro por

40 segundos. Quando atingindo esse estado, o instrumental era imediatamente

encostado no dorso do animal, permanecendo por 20 segundos, queimando a pele.

Estudo piloto

Foram selecionados aleatoriamente dois animais com intuito de definir o tipo e

a padronização da queimadura. Realizou-se em ambos a anestesia, tricotomia,






Irradiação a Luz

A irradiação com laser vermelho (MMO TWIN FLEX Evolution®, São Carlos,

Brasil com 10J/cm²; 40 mW; 10s, λ660 nm/InGaAlP) e Led verde (KONDORTECH,

São Paulo, Brasil com 60J/ cm²; 60 mW; 10s e λ520 a 550 nm/InGaN) foi realizada

imediatamente após a queimadura, de forma pontual nos quatro pontos coincidentes

com os ângulos da ferida. No laser vermelho, em cada ponto, foi depositada a

quantidade de 10J/cm2, totalizando 40J/cm2 por sessão, enquanto no Led Verde era

aplicado 60J/cm², totalizando 240J/cm2. As aplicações foram realizadas diariamente,

com exceção do dia do sacrifício do animal, na qual não se realizava a irradiação.

Eutanásia dos animais e Índice de retração da ferida

Terminado o período experimental para cada subgrupo (3, 7, 14 e 21 dias), os

animais foram submetidos à nova anestesia peritoneal em quantidade três vezes

maior àquela utilizada para anestesia (300 mg/Kg de Ketamina (Cetamin®, Syntec,

São Paulo, SP, Brasil) 10% e 15 mg/Kg de Xilazyna 2% (Dopaser®, Syntec, São

45

Paulo, SP, Brasil). Após a Eutanásia, realizou-se com auxilio do paquímetro digital o

cálculo do índice de retração da ferida (IRF) pela fórmula: IRF (%) = Área inicial-

Área do dia do sacrifícios ÷ Área inicial x 100. Área inicial tinha 1cm2 e a área do dia

do sacrifício foi calculada pelo quadrado do raio multiplicado por pi (r2π)

Processamento Histológico

Depois de constatado a morte do animal através da cessação dos sinais vitais

e opacificação da córnea foi realizada a remoção do espécime. Utilizando um bisturi

a ferida foi excisada com margem de segurança de 0,5cm e acondicionada em

recipiente plástico contendo formol a 10%. Após o período de fixação a peça foi

processada seguindo os métodos rotineiros para coloração em Hematoxilina-Eosina

(HE) e Picrosírius.

Aspectos morfológicos das células inflamatórias e das fibras colágeno

Na análise morfológica do HE foi realizado a descrição das células

inflamatórias nos grupos de tratamento dentro do mesmo tempo de sacrifícios.

Cortes histológicos corados em picrosírius e analisadas sob luz polarizada foram

utilizados para a análise descritiva e quantitativa da deposição de colágeno. As

fibras de colágeno foram classificadas de acordo com o seu padrão de


(ondulada ou estirada, espessa ou delgada, curta ou longa) e disposição (reticular,

paralela ou entrelaçado).

Análise quantitativa da área de colagenização (AC)

A quantificação da área ocupada pela deposição de colágeno na ferida foi

determinada pela densidade óptica do sistema de análise de imagens em 8 campos

microscópicos para cada lâmina com amplificação de 100x. O sistema utilizado

consiste de uma câmara de vídeo CCD Sony DXC-101 aplicado a um microscópio

46

Olympus CX31, a partir do qual as imagens foram enviadas para um monitor

(Trinitron Sony). Por meio de um sistema de digitalização (Olympus C-7070

WideZoom) as imagens foram carregadas em um computador (Pentium 133 MHz) e

processadas utilizando o software (ImageTool), que proporcionou a interpretação e a

obtenção de valores de mensuração das fibras colágenas, através da quantificação

de suas medidas originais, optando em transformar a medida da imagem digitalizada

(o pixel) em medida micrometrada, utilizando-se um barra milimetrada de 50 ɥ m.

Os limiares para as fibras colágeno foram estabelecidos para cada lâmina, depois de

aumentar o contraste até um ponto em que as fibras foram facilmente identificadas

como birrefringentes (colágeno). A área ocupada pelas fibras foi determinada pelos

limiares das diferentes densidades de cores do colágeno e destacada por uma

ferramenta da seleção.

Análise Estatística

Na análise estatística foi aplicado o teste de Shapiro-Wilk para verificação da

normalidade dos dados, sendo considerado o nível de significância de 5% para as

diferenças observadas quando p<0,05. A significância estatística da área de

colagenização e análise quantitativa da água consumida foram avaliadas pela





Resultados

Índice de Retração da Ferida

Em 3 dias não houve diferença significativa no IRF nos grupos de tratamento.

Em 7 dias o índice nos grupo LVER (mediana -53%), LED (-100%) e CTR (-127%)

foram estatisticamente diferentes (p=0,006). Com 14 dias IRF nos grupos LVER

47

(média 7,8 ± 14,1%) e LED (-9,6 ± 15,4%) foram maiores (p=0,0001 e p=0,013,

respectivamente) que o CTR (-49 ± 18,2%). Em 21 dias o grupo LVER (mediana

72%) apresentou a maior retração da ferida (p=0,012) quando comparado ao CTR

(5%) e LED (5%) (fig. 1 e 2).

Fig. 1 Queimadura em pele de ratos por cada grupo de tratamento durante os

tempos de sacrifícios.

48

5 10 15 20 25

-200

-150

-100

-50

0

50

100CTR

LVER

LED

*

*****

#

Tempo (dias)Índ

ice

de

retr

ação

da

feri

da

(%)

Fig. 2. Avaliação do índice de retração da ferida de cada grupo de tratamento

durante os tempos de sacrifícios.

* Diferença significativa entre os grupos (p=0,006)

** Diferença significativa do LVER com CTR (p=0,0001)

*** Diferença significativa do LED com CTR (p=0,013)

# Diferença significativa do LVER e LED com CTR (p=0,012)

Ração e Água consumida

Em 3 dias de tratamento não houve diferença no consumo de ração e água

entre os grupos. Aos 7 dias o grupo LVER (média 39,28±0,75 mL) ingeriu uma maior

quantidade de água (p=0,013) em relação ao grupo CTR (média 36,71±1,25mL). A

ração consumida não apresentou diferença entre os grupos. Em 14 dias os grupos

LVER (mediana 23g) e LED (mediana 21,5g) consumiram uma quantidade superior

de ração (p=0,04) comparado ao grupo CTR (mediana 18g). Os animais do grupo

LVER (média 40,28±1,38mL) ingeriram uma maior quantidade de água em relação

aos grupos CTR (37±1,17mL) e LED (38,64±2,13mL), p<0,001 e p=0,032

respectivamente. Além do mais, o grupo LED consumiu uma quantidade de água

superior ao CTR (p=0.032). Aos 21 dias os grupos LVER (mediana 25g) e LED

49

(mediana 23g) consumiram uma maior quantidade de ração (p=0,001) em relação ao

CTR (mediana 20g), enquanto os grupos LVER (mediana 40mL) e LED (mediana

39mL) ingeriram uma quantidade superior de água (p<0,001) comparada ao CTR

(mediana 38mL).

Infiltrado inflamatório

Na análise morfológica em três dias os grupos revelaram infiltrado inflamatório

composto por neutrófilos que permeavam as fibras musculares nas margens da

ferida. Na porção mais central da queimadura, a inflamação era predominantemente

linfocítica e limitada ao tecido conjuntivo fibroso frouxo hipodérmico, bem como foi

observado uma proeminente dilatação vascular (arteríolas e vênulas), por vezes

associada à marginação leucocitária (fig. 3a).

Em 7 dias os grupos exibiram infiltrado inflamatório predominantemente

neutrofílico, disposto tanto nas margens quanto na porção mais central da ferida.

Nesta última região, o infiltrado inflamatório limitava-se ao tecido conjuntivo fibroso

frouxo hipodérmico. Como identificado no período de 3 dias, foi observada

importante dilatação de arteríolas e vênulas, com ocasional marginação leucocitária

(fig. 3b).

Com 14 dias os grupos apresentaram infiltrado inflamatório constituído por

linfócitos, macrófagos e neutrófilos. Estes últimos predominavam em áreas

superficiais da ferida. Tanto nas margens quanto nas áreas centrais da ferida, era

possível constatar a presença de exuberante reação de granulação, com vasos

sanguíneos neoformados e fibroblastos jovens, dispostos em meio a uma matriz

extracelular constituída por feixes colágenos delgados e alongados. As queimaduras

se apresentavam recobertas por crosta seroemática de espessura variável e exibiam

reepitelização em estágios iniciais (fig. 3c).

Em 21 dias os grupos exibiram infiltrado inflamatório constituído por neutrófilos,

linfócitos e macrófagos, com predomínio do componente mononuclear. Ao longo de

toda a extensão da ferida, evidenciava-se uma exuberante reação de granulação,

com vasos sanguíneos neoformados, muitos dos quais ingurgitados, e fibroblastos

50

jovens, dispostos em meio a uma matriz extracelular constituída por feixes

colágenos ora curtos ora alongados, com espessuras variadas (fig. 3d). Em

comparação com o período de 14 dias, as fibras colágenas se apresentavam mais

espessas e mais densamente organizadas. As queimaduras se apresentavam

recobertas por crosta de espessura variável e exibiam reepitelização em estágios

ainda parciais.

Fig. 3. Cortes histológicos dos grupos CTR (a), LED (b), LVER (c) e LED (d) nos

tempos 3,7,14 e 21 dias, respectivamente (HE,100x). Em destaque nas

fotomicrografias (a) e (b) o infiltrado inflamatório composto por neutrófilos que

permeavam as fibras musculares nas margens da ferida e, em (c) e (d) predomínio

de linfócitos, macrófagos e neutrófilos (HE, 400x).

51

Quantificação do colágeno usando a luz polarizada

Em 3 e 7 dias, não houve formação de colágeno nos grupos de tratamento,

com 14 dias não houve diferença significativa nas áreas de colagenização entre os

grupos: LED e CTR/ LVER e LED. Entretanto, os animais tratados com o LVER

apresentaram uma maior área de colagenização (p<0,05) comparado ao CTR (Fig.

4a). Em 21 dias o grupo LVER apresentou uma área de colagenização bastante

superior (p<0,001) aos demais grupos, enquanto o LED apresentou uma maior área

de colagenização (p<0,05) em relação ao CTR (Fig. 4b).

Fig. 4 Áreas de colagenização formada em 14 dias (a) pelos grupos CTR, LVER e

LED e, em 21 dias (b) pelos grupos CTR, LVER e LED.

*Diferença significativa com CTR (p<0,05)

**Diferença significativa com CTR e LED (p<0,001)

Descrição morfológica do colágeno usando a luz polarizada

As fibras colágenas em 14 dias nos grupos CTR (Fig.5a), LVER (Fig.5b ) e

LED (Fig.5c) apresentaram em relação ao seu padrão de birrefringência um

predomínio do colágeno tipo I nos grupos LVER (n=3 ratos/60%) e LED (n=3

ratos/60%), enquanto no grupo CTR foi observado em 20% dos animais (n=1 rato).

Quanto à aparência morfológica e a disposição, não houve variações nas

descrições, apresentando em todos os animais fibras colágenas onduladas,

delgadas, curtas e reticulares.

52

As Fig. 5d, 5e e 5f mostram o colágeno em 21 dias nos grupos CTR,LVER e

LED, respectivamente. Neste tempo, os grupos LVER e LED apresentaram em

relação ao seu padrão de birrefringência um predomínio de colágeno tipo I em todos

os animais, e o grupo CTR apresentou em 60% dos ratos (n=3 animais). Aparência

morfológica e a disposição das fibras do grupo do LVER foram estiradas, espessas,

longas e reticulares em 3 animais (60%), no grupo LED 20% apresentava essa

característica e o CTR apresentou fibras onduladas, delgadas, curtas e reticulares

(100%).

Fig. 5. Fotomicrografias das áreas de colagenização da ferida nos grupo CTR (a),

LVER (b) e LED(c) em 14 dias e, em 21 dias os grupo CTR (d), LVER(e) e LED(f),

(Picrosírius, 100x, 50 ɥ m).

Discussão

Neste estudo, o aumento significativo do consumo da ração e água ingerida

pelos grupos nos tempos de sacrifícios, provavelmente seja decorrente do efeito

analgésico do LVER e LED, já que estudos imuno-histoquímicos [31] afirmam que o

53

laser de baixa intensidade (LBI) inibem a expressão da enzima ciclo-oxigenase 2,

evitando a conversão do ácido araquidônico em prostaglandina [32]. Apesar do

grupo LVER já ingerir uma quantidade de água significativa em relação ao CTR em 7

dias, destaca-se os resultados do LED, diodo emissor de luz bastante utilizado na

odontologia no clareamento dental e pouco estudado na cicatrização de

queimaduras de terceiro grau.

Um dos principais efeitos da absorção do LVER na pele é a estimulação das

mitocôndrias, o que resulta no aumento de energia das células, estimulação da

liberação de mediadores químicos e na ativação da síntese de ácido nucleico [33].

Por outro lado, o LED tem seus efeitos sobre a bicamada lipídica da membrana

celular, como as extremidades polarizadas dos lipídios tendem a rotacionar em

direção à fonte de luz, ocorre alteração da estrutura da membrana devido à

transferência de energia pelas proteínas da bicamada [34].

Na análise do IRF observou-se principalmente nos tempos de 3 e 7 dias valores

negativos, possivelmente decorrentes do edema intersticial que aumenta as

dimensões macroscópicas da ferida. Nos demais tempos o aumento da retração da

ferida provavelmente seja decorrente da diferenciação miofibroblástica. Ribeiro et al.

[14] afirmaram que o LVER estimula o aumento de miofibroblastos na queimadura,

sugerindo também a transformação de fibroblastos em miofibroblastos nas fases

iniciais. No entanto, Al-Waltban e Delgado [24] discordaram dos resultados

encontrados, afirmaram que o LVER não acelera a retração da ferida.

O LVER e o LED, neste estudo, promoveram uma substituição mais rápida das

fibras de colágeno do tipo III para o tipo I e uma formação de colágeno significativa a

partir de 14 dias para LVER e 21 dias para LED comparado ao CTR. A maioria dos

estudos evidenciam os benefícios do LVER [6,9-11,14,15] e/ou LED [18-20] no

processo de cicatrização em queimaduras. Apoiando estes resultados, Pereira et al.

[35] e Pereira et al. [36] demostraram que o LVER é capaz de regular a liberação de

citocinas que são responsáveis pela proliferação de fibroblastos e síntese de

colágeno, tal como fator de crescimento fibroblástico ácido (FGF-α) e fator

transformante de crescimento beta (TGF-β), respectivamente. Entretanto, autores

afirmam que a irradiação com LVER [24,25,37,38] e/ou LED [39] não auxiliam no

54

processo de cicatrização de queimaduras.

Além do mais, a dose diária de 40J/cm2 aplicada em 21 dias no grupo LVER

foi eficaz na estimulação dos fibroblastos na formação de colágeno e na retração da

ferida, contrariando os estudos de Meireles et al. [15] que afirmaram que doses

acima de 38J/cm2 possuem efeitos inibitórios sobre estes tipos celulares.

Provavelmente essa divergência na eficácia da interação luz-tecido seja dependente

da falta de padronização na escolha do comprimento de onda, potência, frequência e

densidade de energia associado às propriedades ópticas do tecido irradiado [26,40].

A quantidade significativa de colágeno formada em 21 dias pelo grupo LVER

pode ser confundida com a formação de cicatrizes hipertróficas [41], entretanto

durante a análise morfológica não foi constatado a formação da última fase do

processo de cicatrização (maturação ou remodelação) [42,43], deste modo pode-se

afirmar neste estudo que a síntese de colágeno, não formou cicatrizes e seja

decorrente da aceleração do processo de cicatrização. A reepitelização parcial

encontrada neste estudo é justificada por autores [10,15] que demonstram que a

irradiação do LVER em queimaduras de terceiro grau por 21 dias favoreceu o

processo de cicatrização, no entanto não houve uma reepitelização total,

provavelmente decorrente do pequeno tempo de acompanhamento no processo de

reparo para esse tipo de ferimento.

É importante ressaltar a formação significativa de colágeno em 21 dias pelo

LED verde em relação ao CTR, Taga et al. [44] relatam que os LEDs podem

estimular os fibroblastos na produção de colágeno, aumentando a expressão do

RNAm do procolágeno tipo I. Deste modo propomos novos estudos para um melhor

entendimento da luz verde sobre o processo de cicatrização de queimaduras de

terceiro grau, já que há poucos estudos na literatura.

Em conclusão, o LVER e LED apresentaram efeitos benéficos na aceleração

do processo de cicatrização de queimaduras de terceiro grau, esses grupos

estimularam os fibroblastos na produção e maturação do colágeno, nos efeitos

analgésicos provavelmente decorrentes do aumento do consumo de água e ração

comparado ao grupo CTR, além da maior retração da ferida em 21 dias dos animais

tratados com LVER em relação aos demais grupos.

55

Referências

1. Foulkes R , Davidson L, Gateley C (2011) Full thickness burn to a latissimus dorsi flap donor site due to a heat pad--there is still a need to improve patient information. BMJ Caso Rep. doi: 10.1136/bcr.05.2011.4224

2. Sharma BR (2007) Infection in patients with severe burns: causes and prevention thereof. Infect Dis Clin North Am 21: 745–759 3. Vale ECS (2005) Inicial management of burns: approach by dermatologists. An Bras Dermatol 80(1) 9-19

4. Barrilo DJ, Pausen SM (2003) Management of Burns to the hand. Wounds 15:4–9

5. Wassermann D (2002) E´ valuation et premiers soins d’une bruˆ lure thermique. Rev Prat. 52:2228–2233

6. Fiório FB, Albertini R, Leal-Junior EC, de Carvalho PD (2013) Effect of low-level laser therapy on types Iand III collagen and inflammatory cells in rats with induced third-degreeburns. Lasers Med Sci. doi: 10.1007/s10103-013-1341-2

7. Siger AJ, Brebbia J, Soroff HH (2007) Management of local burn wounds in the ED. Am J Emerg Med 25:666–671 8. Johson RM, Richard R (2003) Partial-thickness burn: identification and management. Adv Skin Wound Care, 16 (4):178-187 9. Núñez SC, França CM, Silva DFT, Nogueira GEC, Prates RA, Ribeiro MS (2013) The influence of red laser irradiation timeline on burn healing in rats. Lasers Med Sci 28(2): 633-641 10. Morais JM, Mendonça DEO, Moura VBL, Oliveira MAP, Afonso CL, Vinaud MC, Bachion MM, Lino Júnior RS (2012) Anti-inflammatory effect of low-intensity laser on the healing of third-degree burn wounds in rats. Lasers Med Sci. doi:10.1007/s10103-012-1213-1 11. Renno AC, Iwama AM, Shima P, Fernandes KR, Carvalho JG, Oliveira P, Ribeiro DA (2011) Effect of low-level laser therapy (660 nm) on the healing of second-degree skin burns in rats. J Cosmet Laser Ther 13(5): 237-242

12. Khoshvaghti A, Zibamanzarmofrad M, Bayat M (2011) Effect of low-level treatment with an 80-Hz pulsed infrared diode laser on mast-cell numbers and degranulation in a rat model of third-degree burn. Photomed Laser Surg 29(9): 597–604

13. Garcia VGG, Lima MA, Okamoto T, Milanezi LA, Gualberto Júnior C, Fernandes

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Foulkes%20R%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=22679152

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Davidson%20L%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=22679152

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Gateley%20C%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=22679152

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Fi%C3%B3rio%20FB%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=23677436

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Albertini%20R%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=23677436

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Leal-Junior%20EC%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=23677436

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=de%20Carvalho%20PD%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=23677436

56

LA, De Almeida JM, Theodoro LH (2010) Effect of photodynamic therapy on the healing of cutaneous third-degree-burn: histological study in rats. Lasers Med Sci 25: 221–228

14. Ribeiro MAG, Albuquerque Júnior RLC, Ramalho LMP, Pinheiro ALB, Bojardim LR, Da Cunha SS (2009) Immunohistochemical assessment of myofibroblasts and lymphoid cells during wound healing in rats subjected to laser photobiomodulation at 660 nm. Photomed Laser Surg 27:49-55

15. Meireles GCS, Santos JN, Chagas PO, Moura AP, Pinheiro ALB (2008) A comparative study of the effects of laser photobiomodulation on the healing of third-degree burns: a histological study in rats. Photomed Laser Surg 26(2): 159-166

16. Araújo CEN, Ribeiro MS, Favaro R, Zezell DM, Zorn TMT (2007) Ultrastructural and autoradiographical analysis show a faster skin repair in He-Ne lasertreated wounds. J Photochem Photobiol B 86:87-96 17. Hawkins D, Abrahamse H (2006) Effect of multiple exposures of low level laser therapy on the cellular responses of wounded human skin fibroblasts. Photomed Laser Surg 24(6):705-714

18. Lee GY, Kim WS (2012) The systemic effect of 830-nm LED phototherapy on the

wound healing of burn injuries: A controlled study in mouse and rat models. J Cosmet

Laser Ther 14(2): 107-110

19. Fiório FB, Silveira LJr, Munin E, De Lima CJ, Fernandes KP, Mesquita-Ferrari, RA, de Carvalho PT (2011) Effect of incoherent LED radiation on third-degree burning wounds in rats. J Cosmet Laser Ther 13(6):315-22

20. Oliveira PC, Pinheiro AL, De Castro IC, Reis JÁ, Noia MP, Gurgel C, Teixeira

Cangussú MC, Pedreira Ramalho LM (2011) Evaluation of the effects of polarized

light (λ400-200 nm) on the healing of third-degree burns in induced diabetic and

nondiabetic rats. Photomed Laser Surg 29(9): 619-25

21. Adamskaya N, Dungel P, Mittermayr R, Hartinger J, Feichtinger G, Wassermann K (2011) Light therapy by blue LED improves wound healing in an excision model in rats. Injury Int J Care Injured 42:917–921 22. Mester E, Mester A, Mester A (1985) The biomedical effects of laser application. Lasers Surg Med 5(1):31-39 23. Dantas MDM, Cavalcante DRR, Araújo FEN, Barretto SR, Aciole GTS, Pinheiro ALB, Ribeiro MAG, Lima-Verde IB, Melo CM, Cardoso JC, Albuquerque Júnior RLC (2011) Improvement of dermal burn healing by combining sodium alginate/chitosan-



http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Silveira%20L%20Jr%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=21981305

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Munin%20E%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=21981305

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=de%20Lima%20CJ%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=21981305

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Fernandes%20KP%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=21981305

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Mesquita-Ferrari%20RA%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=21981305


http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=de%20Carvalho%20Pde%20T%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=21981305

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/21981305

57

based films and low level laser therapy. J Photochem and Photobiol B: Biol 105:51–59 24. Al-Watban FA, Delgado GD (2005) Burn healing with a diode laser: 670nm at different doses as compared to a placebo group. Photomed laser Surg, 23(3):245-250 25. Bayat M, Vasheghani MM, Razavi N, Taheri S, Rakhshan M (2005) Effect of low level laser therapy on the healing of second- degree burns in rats: a histological and microbiological study. J Photochem Photobiol B 78(2):171-177 26. Karu T, Kolyakov SF (2005) Exact action spectra for cellular responses relevant to phototherapy. Photomed Laser Surg 23:355–361

27. Weiss RA, McDaniel DH, Geronemus RG, Weiss MA, Beasley KL, Munavalli GM, Bellew SG (2005) Clinical experience with light-emitting diode (LED) photomodulation. Dermatol Surg 31:1199–205

28. Torres CR, Barcellos DC, Batista GR , Borges AB, Cassiano KV, Pucci CR (2011) Assessment of the effectiveness of light-emitting diode and diode laser hybrid lightsources to intensify dental bleaching treatment. Acta Odontol Scand 69(3):176-181

29. Coutinho DS, Silveira L Jr, Nicolau RA , Zanin F, Brugnera A Jr (2009) Comparison of temperature increase in in vitro human tooth pulp by different light sources in the dental whitening process. Lasers Med Sci 24(2):179-85, 2009

30. Klebanov GI, Shuraeva NIu, Chichuk TV, Osipov AN, Rudenko TG, Shekhter AB, Vladimirov LUA (2005) A comparative study of the effects of laser and light-emitting diode irradiation on the wound healing and functional activity of wound exudate leukocytes. Biofizika 50:1137–44 31. Rocha CLJV, Rocha Júnior AMR, Aerestrup BJV (2012) Inhibition of

cyclooxygenase 2 expression in NOD mice cutaneous wound by low-level laser

therapy. J Vasc Bras 11(3): 175-181

32. Lohinai Z, Stachlewitz R, Székely AD, Fehér E, Dézsi L, Szabó C (2001)

Evidence for the expression of cyclooxigenase-2 enzyme in periodontitis. Life Sci

70(3):279-90

33. Tunèr J, Hode L (2002) Laser therapy: clinical practice and scientific background. Grangeberg: Prima Books AB, Chapt 1—Some basic laser physics 1–44

34. Ribeiro MS, Da Silva DFT, De Araújo CEN, Oliveira SF, Pelegrini CMR, Zorn

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Weiss%20RA%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=16176771

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=McDaniel%20DH%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=16176771

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Geronemus%20RG%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=16176771

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Weiss%20MA%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=16176771

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Beasley%20KL%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=16176771

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Munavalli%20GM%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=16176771


http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Bellew%20SG%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=16176771

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Klebanov%20GI%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=16358796

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Shuraeva%20NIu%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=16358796

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Chichuk%20TV%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=16358796

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Osipov%20AN%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=16358796

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Rudenko%20TG%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=16358796

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Shekhter%20AB%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=16358796


http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Vladimirov%20IuA%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=16358796

58

TM, Zezell DM (2004) Effects of low-intensity polarized visible laser radiation on skin burns: A light microscopy study. J Clin Laser Med Surg 22: 59–66

35. Pereira MCMC, Pinho CB, Medrado ARP, Andrade ZA, Reis SRA (2010) Influence of 670 nm low-level laser therapy on mast cells and vascular response of cutaneous injuries. J Photochem Photobiol B 98:188–192 36. Pereira AN, Eduardo CDEP, Matson E, Marques MM (2002) Effect of low-power laser irradiation on cell growth and procollagen synthesis of cultured fibroblasts. Lasers Surg Med 31:263–267 37. Schlager K, Oehler K, Huebner M, Schmuth L, Spoetl L (2000) Healing of burns after treatment with 670-nanometer low-power laser light. J Dermatol Surg Austria 105:1635–1639 38. Schlager A, Kronberger P, Petschke F Ulmer H (2000) Low power laser light in the healing of burns: a comparison between two different wavelengths (635nm and 690nm) and placebo group. Lasers Surg Med 27(1):39-42. 39. Al-Watban FA; Andres BL (2003) Polychromatic LED therapy in burn healing of non-diabetic and diabetic rats. J Clin Laser Med Surg 21 (5): 249-258 40. Medrado ARAP, Pugliese LS, Reis SRA, Andrade ZA (2003) Influence of low level laser therapy on wound healing and its biological action upon myofibroblasts. Lasers Surg Med 32(3):239–244 41. Van der Veer WM, Bloemen MC, Ulrich MM, Molema G, van Zuijlen PP, Middelkoop E, Niessen FB (2009) Potential cellular and molecular causes of hypertrophic scar formation burns. Burns 35:15–29 42. Balbino CA, Pereira LM, Curi R (2005) Mechanisms involved in wound healing: a revision. Braz J Pharm Sci 41(1):27-51 43. Mandelbaum SH, DiSantis EP, Mandelbaum MHS (2003) Cicatrization: current concepts and auxiliary resources -Part I. An Bras Dermatol 78(4): 393-410 44. Tada K, Ikeda K, Tomita K (2009) Effect of polarized light emitting diode irradiation on wound healing. J Trauma 67: 1073–1079

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=van%20der%20Veer%20WM%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=18952381

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Bloemen%20MC%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=18952381

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Ulrich%20MM%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=18952381

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Molema%20G%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=18952381

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=van%20Zuijlen%20PP%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=18952381


http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Middelkoop%20E%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=18952381

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Niessen%20FB%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=18952381

59

4.2 ARTIGO 2

Ação do laser infravermelho e da Terapia fotodinâmica no processo de

cicatrização de queimaduras de terceiro grau em pele: Análise clínica e

histológica em ratos.

R.O. Costa a,*, C.F.W. Nonaka a, R.L.C. Albuquerque Júnior b, M.H.C.V. Catão a

a Universidade Estadual da Paraíba, R. Baraúnas, 351, Bodocongó, Campina Grande/PB, 58429-500, Brasil b Universidade Tiradentes, Av. Murilo Dantas, 300, Farolândia, CEP 49030-490, Aracaju/SE, Brasil.

Resumo

O objetivo deste estudo foi avaliar a ação do laser infravermelho e da terapia fotodinâmica na cicatrização de queimaduras em pele, através da análise clínica e histológica em ratos. Para tanto, 60 animais foram aleatoriamente distribuídos em três grupos: G1 – controle, não tratado (CTR), Laser infravermelho (LINF) e Terapia Fotodinâmica (TFD). A indução da queimadura foi realizada no dorso do rato através da aplicação por 20 segundos de um instrumento metálico previamente aquecido por 40 segundos na chama azul do maçarico. O tratamento dos grupos experimentais foi a irradiação da luz infravermelha (10J/cm2, 40mW e 780nm) e vermelha (10J/cm2, 40mW e 660nm) na terapia fotodinâmica com fotossenssibilizador azul de metileno na concentração 0,5µg/mL. As aplicações foram pontuais nos quatro pontos coincidentes dos ângulos da ferida e em cada ponto foi depositada a quantidade de 10J/cm2 com o tempo de 10s, totalizando 40J/cm2

por sessão realizada com intervalo de 24 horas até o dia anterior ao sacrifício do animal em 3, 7, 14 e 21 dias com dose letal de anestésico intraperitoneal. Os espécimes removidos foram analisados clinicamente e logo após processados e corados em HE e Picrosírius para análise sob microscopia de luz e luz polarizada, respectivamente. Os animais tratados com Laser infravermelho e terapia fotodinâmica estimularam a produção e maturação do colágeno (p<0,001), além do aumento no consumo de ração e água comparado ao grupo controle (p<0,001). O laser λ780 nm apresentou a maior retração da ferida dos grupos (p=0,04). Em conclusão, o laser infravermelho e terapia fotodinâmica favoreceram a cicatrização de queimaduras de terceiro grau em ratos. Palavras Chaves: Lasers; Queimaduras; Ratos; Terapia Fotodinâmica.

* Autor correspondente

Roniery de Oliveira Costa

Endereço: Rua José Gonçalves de Lucena, 407B, Cruzeiro, 58415-375, Campina

Grande, PB, Brasil. Tel. (83) 3066-8257. Email: [email protected].

60

1. Introdução

A queimadura é um dos traumas mais devastadores que podem atingir o

homem, e uma das causas frequentes de morbidade, mortalidade e de graves

incapacidades em longo prazo. Na Europa, estima-se uma taxa de mortalidade que

varia de 1,4% a 34% para pacientes hospitalizados por queimaduras [1]. Nos

Estados Unidos, mais de um milhão de queimaduras ocorrem a cada ano e cerca de

5000 destes ferimentos são fatais [2]. Por sua vez no Brasil são relatados 1 milhão

de casos de queimaduras, de acordo com a Sociedade Brasileira de Queimaduras,

das quais 200.000 são tratados em ambulatórios e 40.000 necessitam de

hospitalização [3].

Nas queimaduras de terceiro grau a lesão acomete toda espessura da pele,

envolvendo toda a epiderme e derme e, em alguns casos, se estendem aos tecidos

subcutâneos, músculos e ossos. [4-6].

Várias modalidades terapêuticas tem sido proposta na literatura para minimizar

os efeitos prejudiciais das queimaduras [7]. O laser de baixa intensidade tem

demonstrado efeitos benéficos no processo de cicatrização de queimaduras,

atuando no infiltrado inflamatório, reepitelização, formação e maturação do colágeno,

além da ação analgésica e anti-inflamatória [4,8-13]. Entretanto, ainda existe muita

divergência entre os pesquisadores [14-16].

A terapia fotodinâmica (TFD) é a combinação de um fotossensibilizador que se

liga a célula alvo e a luz com comprimento de onda específico [17], sendo utilizada

na odontologia [18,19], na ação antimicrobiana [20] e na cicatrização de incisões

cutâneas [21]. Há poucos trabalhos sobre a TFD no processo de cicatrização de

queimaduras [22], no entanto estudo recente [23] evidencia seus efeitos na

aceleração do processo de cicatrização deste ferimento.

O objetivo deste estudo foi avaliar ação do laser infravermelho e da terapia

fotodinâmica no processo de cicatrização de queimaduras de terceiro Grau: estudo

clínico e histológico em ratos.

2. Materiais e Métodos CTR-21dias

CTR-21dias

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Austah%20ON%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=22057609

61

2.1 Animais

Após aprovação pelo Comitê de Ética no uso de Animais (CEUA)/CESED, nº

0019/240712, foram selecionados 60 ratos machos, adultos, da linhagem Wistar,

com massa entre 200 a 250g, provenientes do biotério do Departamento de Medicina

da Universidade Federal de Campina Grande. Os animais foram mantidos em

gaiolas de polipropileno revestido com cama de maravalha, submetidos à

temperatura (23°C ± 2°C) e iluminação (12 hs de ciclo claro/escuro) controlada, com

ração e água ad libitum. Os animais foram divididos aleatoriamente em 3 grupos:

G1- Controle (CTR), G2-Laser infravermelho (LINF) e G3-Terapia fotodinâmica

(TFD). Posteriormente cada grupo com 20 animais foi dividido em subgrupos de 5

animais para cada tempo (3,7,14 e 21 dias) de observação.

2.2 Ração e água consumida

Utilizou-se uma balança analítica para o controle do peso do animal e da ração

consumida, além de uma garrafa de água para ratos, com o intuito de calcular da

quantidade de água ingerida. Os animais eram pesados antes do experimento e

cada gaiola recebia diariamente uma quantidade de 200 gramas de ração e 250mL

de água. O consumo da ração era calculado pela diferença do seu peso entre dois

dias consecutivos, enquanto que a ingestão de água era quantificada com uma

proveta e o consumo calculado pela diferença entre dois consecutivos.

2.3 Anestesia/Tricotomia/Queimadura

Os animais foram anestesiados com uma associação anestésica de 100

mg/Kg de Ketamina 10% e 5 mg/Kg de Xilazyna 2%, aplicados na região

intraperitoneal. Logo após, realizou-se a tricotomia do dorso do animal com uma

lâmina de barbear

62

descartável associado a água e sabão neutro. A indução da queimadura foi

realizada no dorso de todos os animais com um instrumental de ferro de 1,0 X 1,0 X

1,0 cm3. Esse instrumento foi aquecido com auxílio de maçarico até que ficasse

rubro. O aquecimento se deu pela chama azul do maçarico em contato direto com o

ferro por 40 segundos. Quando atingi esse estado, o instrumental era imediatamente

encostado no dorso do animal permanecendo por 20 segundos, queimando a pele.

2.4 Estudo piloto

Foram selecionados aleatoriamente dois animais com intuito de definir o tipo e

a padronização da queimadura. Realizou-se em ambos a anestesia, tricotomia e






2.5 Irradiação a Luz

Na irradiação dos grupos do LINF (AsGaAl/ λ780 nm) e da TFD (InGaAlP/ λ

660 nm) utilizou-se o laser de baixa intensidade (MMO TWIN FLEX Evolution®, São

Carlos, Brasil) com a dose, potência e tempo de 10J/cm², 40 mW e 10s

respectivamente, que foram aplicada imediatamente após a queimadura, de forma

pontual nos quatro pontos coincidentes com os ângulos da ferida, em cada ponto era

depositada a quantidade de 10J/cm2 totalizando 40J/cm2 por sessão.. As aplicações

eram diárias até as vésperas do sacrifício do animal. No grupo da TFD foram

utilizadas gotas do fotossenssibilizador azul de metileno aplicado diariamente

durante 5 minutos antes da irradiação pontual da luz λ 660nm, a concentração do

AM foi 0,5µg/mL, já que concentrações acima de 1 µg/mL são tóxicas para a pele

[24].

2.6 Eutanásia / Avaliação clínicas / Procedimentos Histológicos

63

Os animais foram sacrificados através da associação anestésica de 300 mg/Kg

de Ketamina (Cetamin®, Syntec, São Paulo, SP, Brasil) 10% e 15 mg/Kg de

Xilazyna 2% (Dopaser®, Syntec, São Paulo, SP, Brasil) injetada no peritônio. Após a

Eutanásia, realizou-se com auxilio do paquímetro digital o cálculo do índice de

retração da ferida (IRF) pela fórmula: IRF (%) = Área inicial- Área do dia do

sacrifícios ÷ Área inicial x 100. Área inicial tinha 1cm2 e a área do dia do sacrifício foi

calculada pelo quadrado do raio multiplicado por pi (r2π). Em seguida realizou a

remoção do espécime utilizando um bisturi, a ferida foi excisada com margem de

segurança de 0,5cm e fixada em formol a 10%. Após o período de fixação a peça foi

processada seguindo os métodos rotineiros para coloração em Hematoxilina-Eosina

(HE) e Picrosírius.

2.7 Aspectos morfológicos das células inflamatórias e das fibras colágenas

Na análise morfológica do HE foi realizado a descrição das células

inflamatórias nos grupos de tratamento dentro do mesmo tempo de sacrifícios.

Cortes histológicos corados em picrosírius e analisados sob luz polarizada foram

utilizados para avaliação descritiva e quantitativa da deposição de colágeno. As

fibras de colágeno foram classificadas de acordo com o seu padrão de


(ondulada ou estirada, delgada ou espessa, curta ou longa) e disposição (reticular,

paralela ou entrelaçado).

2.8 Análise quantitativa da área de colagenização (AC)

A quantificação da área ocupada pela deposição de colágeno na ferida foi

determinada pela densidade óptica do sistema de análise de imagens em 8 campos

microscópicos para cada lâmina com amplificação de 100x. O sistema utilizado

consiste de uma câmara de vídeo CCD Sony DXC-101 aplicado a um microscópio

Olympus CX31, a partir do qual as imagens foram enviadas para um monitor

(Trinitron Sony). Por meio de um sistema de digitalização (Olympus C-7070

64

WideZoom) as imagens foram carregadas em um computador (Pentium 133 MHz) e

processadas utilizando o software (ImageTool), que proporcionou a interpretação e a

obtenção de valores de mensuração das fibras colágenas, através da quantificação

de suas medidas originais, optando em transformar a medida da imagem digitalizada

(o pixel) em medida micrometrada, utilizando-se um barra milimetrada de 50 ɥ m.

Os limiares para as fibras colágeno foram estabelecidos para cada lâmina, depois de

aumentar o contraste até um ponto em que as fibras foram facilmente identificadas

como birrefringentes (colágeno). A área ocupada pelas fibras foi determinada pelos

limiares das diferentes densidades de cores do colágeno.

2.9 Análise Estatística

Na análise estatística foi aplicado o teste de Shapiro-Wilk para verificação da

normalidade dos dados, sendo considerado o nível de significância de 5% para as

diferenças observadas quando p<0,05. A significância estatística da área de

colagenização e análise quantitativa da água consumida foram avaliadas pela





3. Resultados

Índice de Retração da Ferida (%)

Em 3 dias IRF nos grupos LINF (mediana -53%), TFD (-76%) e CTR (-154%)

foram estatisticamente diferentes (p=0,012). Com 7 dias houve diferença significativa

(p=0,011) no índice entre os grupos LINF (mediana -53%), TFD (-76%) e CTR (-

124%). Em 14 dias IRF nos grupos LINF (média 0,4 ± 22,9%) e TFD (1,0 ± 14,3%)

foram maiores (p=0,002) que o CTR (-49,2 ± 18,2%). Com 21 dias os grupos LINF

65

(mediana 87%), TFD (72%) e CTR (5%) foram estatisticamente diferentes (p=0,004)

(Fig. 1 e 2).

Fig. 1. Queimadura em pele de ratos por cada grupo de tratamento durante os

tempos de sacrifícios.

66

5 10 15 20 25

-200

-150

-100

-50

0

50

100CTR

LINF

TFD

***

***

****

Tempo (dias)Índ

ice d

e r

etr

ação

da f

eri

da (

%)

Fig. 2. Avaliação do índice de retração da ferida para cada grupo de tratamento

durante os tempos de sacrifícios.

* Diferença significativa entre os grupos LINF, TFD e CTR (p=0,012)

** Diferença significativa entre os grupos LINF, TFD e CTR (p=0,011)

*** Diferença significativa do LINF e TFD com CTR (p=0,002)

**** Diferença significativa entre os grupos LINF, TFD e CTR (p=0,04)

3.2. Controle da ração e água consumida

Nos 3 dias iniciais de tratamento não houve diferença no consumo de ração e

água entre os grupos. Aos 7 dias os grupos tratado com LINF (média 43,71±2,21

mL) e TFD (42,28±3,19 mL) ingeriram uma maior quantidade de água (p<0,001) em

relação ao CTR (36,71±1,25 mL). A ração consumida não apresentou diferença

entre os grupos. Em 14 dias os animais tratados com LINF (média 43,71±1,89 mL) e

TFD (média 42±2,48 mL) apresentaram um consumo de água superior (p<0,001) ao

CTR (média 37±1,17mL). A ração consumida pelo grupo LINF (mediana 24,5g) foi

maior (p<0,001) que CTR (mediana 18g). Aos 21 dias os grupos LINF (mediana 43

67

mL) e TFD (mediana 41 mL) ingeriram maior quantidade de água (p<0,001) em

relação ao CTR (mediana 38 mL), enquanto o consumo de ração foi superior nos

grupos LINF (mediana 26g) e TFD (mediana 25g) comparado ao CTR (mediana

20g).

3.3. Infiltrado Inflamatório

Aos 3 dias observou-se durante análise morfológica que os grupos revelaram

infiltrado inflamatório composto por neutrófilos que permeavam as fibras musculares

nas margens da ferida. Na área mais central da queimadura, a inflamação era

predominantemente linfocítica e limitada ao tecido conjuntivo fibroso frouxo

hipodérmico, bem como foi observado uma proeminente dilatação vascular

(arteríolas e vênulas), por vezes associada à marginação leucocitária (Fig. 3a).

Com 7 dias os grupos exibiram infiltrado inflamatório predominantemente

neutrofílico, disposto tanto nas margens quanto na porção mais central da ferida.

Nesta última região, o infiltrado inflamatório limitava-se ao tecido conjuntivo fibroso

frouxo hipodérmico. Como identificado no período de 3 dias, foi observada

importante dilatação de arteríolas e vênulas, com ocasional marginação leucocitária

(Fig. 3b).

Aos 14 dias os grupos apresentaram infiltrado inflamatório constituído por

linfócitos, macrófagos e neutrófilos. Estes últimos predominavam em áreas

superficiais da ferida. Tanto nas margens quanto nas áreas centrais da ferida, era

possível constatar a presença de exuberante reação de granulação, com vasos

sanguíneos neoformados e fibroblastos jovens, dispostos em meio a uma matriz

extracelular constituída por feixes colágenos delgados e alongados. As queimaduras

se apresentavam recobertas por crosta seroemática de espessura variável e exibiam

reepitelização em estágios iniciais (Fig. 3c).

Em 21 dias os grupos exibiram infiltrado inflamatório constituído por neutrófilos,

linfócitos e macrófagos, com predomínio do componente mononuclear. Ao longo de

toda a extensão da ferida, evidenciou-se uma exuberante reação de granulação,

com vasos sanguíneos neoformados, muitos dos quais ingurgitados, e fibroblastos

68

jovens, dispostos em meio a uma matriz extracelular constituída por feixes

colágenos ora curtos ora alongados, com espessuras variadas (Fig. 3d). Em

comparação com o período de 14 dias, as fibras colágenas se apresentavam mais

espessas e mais densamente organizadas. As queimaduras se apresentavam

recobertas por crosta de espessura variável e exibiam reepitelização em estágios

ainda parciais.

Fig. 3. Cortes histológicos dos grupos TFD (a), LINF(b), CTR (c) e LINF (d) nos

tempos 3,7,14 e 21 dias, respectivamente (HE, 100x). Em destaque nas

69

fotomicrografias (a) e (b) o infiltrado inflamatório composto por neutrófilos nas

margens da ferida e, em (c) e (d) predomínio de linfócitos, macrófagos e neutrófilos

(HE, 400x).

3.4. Quantificação do colágeno usando a luz polarizada

Em 3 e 7 dias, não houve formação de colágeno nos grupos de tratamento,

com 14 dias o grupo do LINF apresentou uma maior área de colagenização em

relação ao CTR (p<0,001) e ao TFD (p<0,05), enquanto o grupo TFD apresentou

uma maior área de colagenização (p<0,05) em relação ao CTR (Fig. 3a). Em 21 dias

(Fig. 3b), o grupo LINF formou uma maior área de colagenização comparado ao

CTR e TFD (p<0,001) e o grupo TFD apresentou uma maior área de colagenização

em relação ao CTR (p<0,001).

Fig. 4 Áreas de colagenização formada em 14 dias (a) pelos grupos CTR, LINF e

TFD e, em 21 dias (b) pelos grupos CTR, LINF e TFD.

*Diferença significativa com CTR (p<0,05)

**Diferença significativa com TFD (p<0,05)

***Diferença significativa com CTR (p<0,001)

#Diferença significativa com CTR e TFD (p<0,001)

3.5. Descrição morfológica do colágeno usando a luz polarizada

70

As fibras colágenas em 14 dias nos grupos CTR (Fig.5a), LINF (Fig.5b) e TFD

(Fig.5c) apresentaram em relação ao seu padrão de birrefringência um predomínio

do colágeno tipo I nos grupos LINF (n=3 ratos/60%) e TFD (n=3 ratos/60%),

enquanto no grupo CTR observou-se em 20% dos animais (n=1 ratos). Quanto à

aparência morfológica e a disposição, não houve variações nas descrições,

apresentando em todos os animais fibras colágenas onduladas, delgadas, curtas e

reticulares.

As Fig. 5d, 5e e 5f mostram o colágeno em 21 dias nos grupos CTR, LINF e

TFD, respectivamente. Neste tempo, os grupos LINF e TFD apresentaram em

relação ao seu padrão de birrefringência um predomínio de colágeno tipo I em todos

os animais, e o grupo CTR apresentou em 60% dos ratos (n=3 animais). Aparência

morfológica e a disposição das fibras do grupo TFD foram estiradas, espessas,

longas e reticulares em 3 animais (60%), no grupo LINF 20% apresentava essas

características, e o CTR apresentou em todos os ratos (n=5 animais) fibras

onduladas, delgadas, curtas e reticulares.

71

Fig 5. Fotomicrografias das áreas de colagenização da ferida nos grupo CTR (a),

LINF(b) e TFD(c) em 14 dias e, em 21 dias os grupo CTR (d), LINF(e) e TFD(f)

(Picrosírius, 100x, 50 ɥ m).

4. Discussão

Apesar das divergências entre os pesquisadores [14,15,25,26] a laserterapia

tem sido proposta como uma das modalidades de tratamento para lesões de tecido

mole, principalmente devido a suas propriedades bioestimulantes que podem

acelerar o processo de cicatrização de queimaduras [4,12,13]. No presente estudo,

os grupos TFD e LINF consumiram uma maior quantidade de água e ração em

relação grupo CTR, possivelmente esse resultado seja decorrente do efeito

analgésico, já que todos os animais eram do mesmo sexo, raça, espécie e faixa de

peso, provenientes do mesmo local e estavam sobre as mesmas condições de

temperatura e iluminação. Estudos imuno-histoquímicos afirmam que a laserterapia

inibe a expressão da enzima ciclo-oxigenase 2 [27], evitando a conversão do ácido

araquidônico em prostaglandina [28].

O mecanismo de ação da TFD na pele, quando associado a luz vermelha, é

através das mitocôndrias que pode promover a biomodulação do tecido através do

aumento da cadeia respiratória e síntese de adenosina trifosfato, favorecendo o

processo de cicatrização, através da proliferação celular, produção de ácidos

nucléicos, síntese de colágeno e redução da inflamação [23,29,30]. Por outro lado, o

uso do LINF têm também resultados semelhantes, sendo o processo iniciado em

nível de membrana celular [30].

Na análise do IRF observou-se principalmente nos tempos de 3 e 7 dias

valores negativos, possivelmente decorrentes do edema intersticial que aumenta as

dimensões macroscópicas da ferida. Nos demais tempos o aumento da retração da

ferida provavelmente seja decorrente da diferenciação miofibroblástica. Estudos

recentes afirmam que LINF estimula a diferenciação miofibroblástica na queimadura

em 8 dias de tratamento [10], célula responsáveis pela contração da ferida [12]

72

demonstrando sua ação na aceleração do processo de retração da queimaduras em

pele comparado ao grupo CTR [31-33].

O LINF apresenta o maior poder de penetração na pele se comparado ao laser

vermelho utilizado na TFD [31], essa característica pode ter influenciado neste

estudo, na substituição mais rápida das fibras de colágeno do tipo III para o tipo I e

uma formação de colágeno significativa em 14 e 21 dias comparado ao CTR.

Estudos evidenciam os benefícios do LINF [10,31-33,35] e da TFD [23] no processo

de cicatrização em queimadura, demonstrando que a laserterapia é capaz de regular

a liberação de citocinas que são responsáveis pela proliferação de fibroblastos e

síntese de colágeno, tal como fator de crescimento fibroblástico - ácido (FGF-α) e

fator transformante de crescimento- beta (TGF-β), respectivamente [36,37].

Observou-se que a dose diária de 40J/cm2 aplicada em 21 dias no grupo LINF

foi eficaz na estimulação dos fibroblastos na formação de colágeno e na retração da

ferida, contrariando os estudos que afirmam que doses acima de 38J/cm2 possuem

efeitos inibitórios [13]. Provavelmente essa divergência na eficácia da interação luz-

tecido seja dependente da falta de padronização na escolha do comprimento de

onda, potência, frequência e densidade de energia, associados às propriedades

ópticas do tecido irradiado [16,38].

A quantidade significativa de colágeno formada em 21 dias pelo grupo LINF

pode ser confundida com a formação de cicatrizes hipertróficas [39], entretanto

durante a análise morfológica não foi constatado a formação da última fase do

processo de cicatrização (maturação ou remodelação) [40,41], deste modo pode-se

afirmar neste estudo que a síntese de colágeno, não formou cicatrizes e seja

decorrente da aceleração do processo de cicatrização. A reepitelização parcial

encontrada neste estudo é justificada por autores [13] que demonstram que a

irradiação do LINF em queimaduras de terceiro grau por 21 dias favoreceu o

processo de cicatrização, no entanto não houve uma reepitelização total,

provavelmente decorrente do pequeno tempo de acompanhamento do processo de

reparo para esse tipo de ferimento.

Há poucos estudos sobre a atuação da TFD no processo de cicatrização de

queimaduras em pele, principalmente quando utiliza a luz vermelha sobre o azul de

73

metileno diluído a concentrações atóxicas (0,5 µg/mL) [24]. Deste modo, os

resultados significativos encontrados na síntese, formação, maturação do colágeno e

consumo de ração e água relação ao CTR podem ser decorrentes da combinação

do azul de metileno que se liga a célula alvo e a luz de comprimento de onda 660nm

na presença de oxigênio do meio, o FS é ativado podendo reagir com moléculas

vizinhas levando à produção de oxigênio singlete, que reage com os componentes

celulares, sejam eles bactérias ou células neoplásicas, provocando inviabilidade

celular [42]. Isso oferece à TFD algumas vantagens, como natureza não invasiva,

repetibilidade fácil e ação antimicrobiana [43], já que a presença de bactérias na

ferida pode retardar o processo de cicatrização [44].

Os resultados do presente estudo sugerem que o LINF e a TFD favorecem o

processo de cicatrização de queimaduras de terceiro grau em ratos através do

estímulo à produção e maturação do colágeno pelos fibroblastos, além dos efeitos

analgésicos decorrentes do aumento do consumo de ração e água. É importante

ressaltar que o maior índice de retração da ferida nos animais tratados com LINF

sugere que este tipo de terapia apresenta maior potencial para estimular a

diferenciação de miofibroblastos.

Referências

[1] N. Brusselaers, S. Monstrey, D. Vogelaers, E. Hoste, S. Blot, Severe burn injury in Europe: a systematic review of the incidence, etiology, morbidity, and mortality, Crit. Care 14 (5) (2010) R188.

[2] L.S. Edelman, Social and economic factors associated with the risk of burn injury, Burns 33(8) (2007) 958-965. [3] T.S. Potokar, S. Prowse, I.S. Whitaker, A global overview of burns research highlights the need for forming networks with the developing world, Burns 34 (2008) 3–5. [4] F.B. Fiório, R. Albertini, E.C. Leal-Junior, P.D. de Carvalho, Effect of low-level laser therapy on types Iand III collagen and inflammatory cells in rats with induced third-degreeburns, Lasers Med. Sci. (2013) [ in press].

74

[5] A.J. Siger, J. Brebbia, H.H. Soroff, Management of local burn wounds in the ED, Am. J. Emerg. Med. 25 (6) (2007) 666–671. [6] R.M. Johson, R. Richard, Partial-thickness burn: identification and management, Adv. Skin Wound Care 16(4) (2003) 178-187.

[7] L. Cuttle, J. Pearn, J.R. McMillan, R.M. Kimble, A review of first aid treatments for burn injuries, Burns 35(6) (2009) 768-775.

[8] S.C. Núñez, C.M. França, D.F.T. Silva, G.E.C Nogueira, R.A. Prates, M.S. Ribeiro, The influence of red laser irradiation timeline on burn healing in rats, Lasers Med. Sci. 28 (2) (2013) 633-641. [9] J.M. Morais, D.E.O. Mendonça, V.B.L. Moura, M.A.P. Oliveira, C.L. Afonso, M.C. Vinaud, M.M. Bachion, R.S. Lino Júnior, Anti-inflammatory effect of low-intensity laser on the healing of third-degree burn wounds in rats, Lasers Med. Sci. (2012) [in press].

[10] M.D.M. Dantas, D.R.R. Cavalcante, F.E.N. Araújo, S.R. Barretto, G.T. Aciole, A.L.B. Pinheiro, M.A.G. Ribeiro, I.B. Lima-Verde, C.M. Melo, J.C. Cardoso; R.L.C. Albuquerque Júnior, Improvement of dermal burn healing by combining sodium alginate/chitosan-based films and low level laser therapy, J. Photochem. Photobiol. B. 105 (1) (2011) 51-59.

[11] A.C. Renno, A.M. Iwama, P. Shima, K.R. Fernandes, J.G. Carvalho, P. Oliveira, D.A. Ribeiro. Effect of low-level laser therapy (660 nm) on the healing of second-degree skin burns in rats, J. Cosmet. Laser Ther. 13 (5) (2011) 237-242.

[12] M. A. G. Ribeiro, R. L. C. Albuquerque Júnior, L. M. P. Ramalho, A.L.B. Pinheiro, L. R. Bojardim, S.S. Da Cunha, Immunohistochemical assessment of myofibroblasts and lymphoid cells during wound healing in rats subjected to laser Photobiomodulation at 660 nm, Photomed. Laser Surg. 27 (2009) 49-55.

[13] G.C.S Meireles, J.N. Santos, P.O. Chagas, A.P. Moura, A.L.B. Pinheiro, A comparative study of the effects of laser photobiomodulation on the healing of third-degree burns: a histological study in rats, Photomed. Laser Surg. 26(2) (2008) 159-166.

[14] M. Bayat, M.M. Vasheghani, N. Razavi, S. Taheri, M. Rakhshan, Effect of low level laser therapy on the healing of second- degree burns in rats: a histological and microbiological study, J Photochem. Photobiol. B. 78 (2) (2005) 171-177.

[15] F.A. Al-Watban, G.D. Delgado, Burn healing with a diode laser: 670nm at different doses as compared to a placebo group, Photomed. laser Surg. 23 (3) (2005) 245-250.


75

[16] T. Karu, S.F. Kolyakov, Exact action spectra for cellular responses relevant to phototherapy, Photomed. Laser Surg. 23 (2005) 355–361.

[17] M. Wainwright, Photodynamic antimicrobial chemotherapy, J. Antimicrob. Chemother. 42 (1998) 13–28. [18] M.S. Al-Zahrani, O.N. Austah, Photodynamic therapy as an adjunctive to scaling and root planing in treatment of chronic periodontitis in smokers, Saudi. Med. J. 32 (11) (2011) 1183-1188. [19] D. Schär, C.A. Ramseier, S. Eick, N.B. Arweiler, A. Sculean, G.E. Salvi, Anti-infective therapy of peri-implantitis with adjunctive local drug delivery or photodynamic therapy: six-month out comes of a prospective randomized clinical trial, Clin. Oral Implants Res. 24(1) (2013) 104-110. [20] X.J. Fu, Y. Fang, M. Yao, Antimicrobial photodynamic therapy for methicillin-resistant Staphylococcus aureus infection. Antimicrobial photodynamic therapy for methicillin-resistant Staphylococcus aureus infection. Biomed. Res. Int. 2013 (2013) 1-9.

[21] F.F Sperandio, A. Simões, A.C.C. Aranha, L. Corrêa, S.C.O.M. Sousa, Photodynamic therapy mediated by methylene blue dye in wound healing, Photomed. Laser Surg. 28 (5) (2010) 581–587. [22] S.A. Lambrechts, T.N. Demidova, M.C. Aalders, T. Hasan, M.R. Hamblin, Photodynamic therapy for Staphylococcus aureus infected burn wounds in mice, Photochem. Photobiol. Sci. 4 (2005) 503–509.

[23] V.G.G. Garcia, M. A. Lima, T. Okamoto, L. A. Milanezi, C. Gualberto Júnior, L.A. Fernandes, J. M. De Almeida, L.H. Theodoro, Effect of photodynamic therapy on the healing of cutaneous third-degree-burn: histological study in rats, Lasers Med. Sci. 25 (2010) 221–228.

[24] A.F.S. Barbosa, L.G.P. Soaresb, J.M.S. Acioleb, JMS, G.T.S. Aciole, I.R. Pitta, A.L.B. Galdino, Evaluation of photodynamic antimicrobial therapy (PACT) against Trypomastigotes of Trypanosoma cruzi: In vitro study, Advances in Laserology 1364 (2011) 55-59.

[25] A. Schlager, K. Oehler, K.U. Huebner, M. Schmuth, L. Spoetl, Healing of burns after treatment with 670 nanometer low power laser light, Plast. Reconstr. Surg. 105 (5) (2000) 1635-1639.

76

[26] A. Schlager, P. Kronberger, F. Petschke, H. Ulmer, Low power laser light in the healing of burns: a comparison between two different wavelengths (635nm and 690nm) and placebo group, Lasers Surg. Med. 27 (1) (2000) 39-42. [27] C.L.J.V. Rocha, A.M.R. Rocha Júnior, B.J.V. Aerestrup, Inhibition of

cyclooxygenase 2 expression in NOD mice cutaneous wound by low-level laser

therapy, J. Vasc. Bras. 11 (3) (2012) 175-181.

[28] Z. Lohinai, R.Stachlewitz, A.D. Székely, E. Fehér, L. Dézsi, C. Szabó, Evidence

for the expression of cyclooxigenase-2 enzyme in periodontitis, Life Sci. 70 (3) (2001)

279-290.

[29] T. Karu, Photobiology of low power laser effects, Health Phys. 56 (1989) 691–704.

[30] J. Tunèr, L. Hode, Laser therapy: clinical practice and scientific background. Grangeberg: Prima Books AB, Chapt 1—Some basic laser physics, (2002) 1–44.

[31] A. Ezzati, M. Bayat, A. Khoshvaghti, Low-level laser therapy with a pulsed infrared laser accelerates second-degree burn healing in rat: a clinical and microbiologic study, Photomed. Laser Surg. 28 (5) (2010) 603-611.

[32] A. Ezzati, M. Bayat, S. Taheri, Z. Mohsenifar, Low-level laser therapy with pulsed infrared laser accelerates third-degree burn healing process in rats, J. Rehabil. Res. Dev. 46 (4) (2009) 534-554.

[33] M.M. Vasheghani, M. Bayat, M. Dadpay, M. Habibie, F. Rezaei, Low-level laser therapy using 80-Hz pulsed infrared diode laser accelerates third-degree burn healing in rat, Photomed. Laser Surg. 27 (6) (2009) 959-964. [34] H. Kolárová, D. Ditrichová, J. Wagner, Penetration of laser light into the skin in vitro, Lasers Surg. Med. 24 (1999) 231–235. [35] A. Khoshvaghti, M. Zibamanzarmofrad, M. Bayat, Effect of low-level treatment with an 80-Hz pulsed infrared diode laser on mast-cell numbers and degranulation in a rat model of third-degree burn, Photomed. Laser Surg. 29 (9) (2011) 597–604.

[36] M.C.M.C. Pereira, C.B. Pinho, A.R.P. Medrado, Z.A.Andrade, S.R.A. Reis, Influence of 670 nm low-level laser therapy on mast cells and vascular response of cutaneous injuries, J Photochem. Photobiol. B. 98 (2010) 188–192. [37] A.N. Pereira, C.D.E.P. Eduardo, E. Matson, M.M. Marques, Effect of low-power laser irradiation on cell growth and procollagen synthesis of cultured fibroblasts, Lasers Surg. Med. 31 (2002) 263–267.


77

[38] A.R.A.P. Medrado, L.S. Pugliese, S. R.A. Reis, Z.A. Andrade Influence of low level laser therapy on wound healing and its biological action upon myofibroblasts. Laser in Surg. and Med. 32(3) (2003) 239–244. [39] W.M, Van der Veer, M.C. Bloemen, M.M. Ulrich, G. Molema, P.P. Van Zuijlen, E. Middelkoop, F.B. Niessen, Potential cellular and molecular causes of hypertrophic scar formation burns, Burns 35 (2009) 15–29. [40] C.A. Balbino, L.M. Pereira, R. Curi, Mechanisms involved in wound healing: a revision, Braz. J. Pharm. Sci. 41 (1) (2005) 27-51. [41] S.H. Mandelbaum, E.P. DiSantis, M.H.S. Mandelbaum, Cicatrization: current concepts and auxiliary resources -Part I. An. Bras. Dermatol. 78(4) (2003) 393-410. [42] T. Dai, G.P. Tegos, Z. Lu, L. Huang, T. Zhiyentayev, M.J. Franklin, D.G. Baer, M.R. Hamblin. Photodynamic therapy for Acinetobacter baumannii burn infections in mice, Antimicrob. Agents Chemother. 53 (9) (2009) 3929-3934, 2009. [43] Z. Huang , A review of progress in clinical photodynamic therapy. Technol. Cancer Res. Treat. 4 (2005) 283–293. [44] C. Parsons, C.P. McCoy, S.P. Gorman, D.S. Jones, S.E. Bell, C. Brady, S.M. M.C. Glinchey, Anti-infective photodynamic biomaterials for the prevention of intraocular lens- associated infectious endophthalmitis, Biomaterials 30 (2009) 597–602.

CONSIDERAÇÕES FINAIS

79

5 CONSIDERAÇÕES FINAIS

Neste estudo, pode-se concluir que os grupos LVER, LINF, TFD E LED

favoreceram o processo de cicatrização de queimaduras de terceiro grau em ratos,

apresentando as maiores áreas de colagenização, promovendo uma substituição

mais rápida das fibras de colágeno tipo III em tipo I, apresentaram também efeitos

analgésicos decorrentes do aumento do consumo de ração e água, contudo os

grupos LINF e LVER obtiveram os maiores índices de retração da ferida em relação

aos demais grupos.

Convém ressaltar que os resultados dos grupos TFD e LED foram de extrema

importância, já que carece de estudos sobre suas aplicações em queimaduras e,

neste estudo, apresentaram efeitos benéficos na aceleração do processo de

cicatrização desse ferimento, deste modo, propomos novos estudos visando

fundamentar melhor essas terapias utilizadas.

REFERÊNCIAS

81

REFERÊNCIAS

1. ADAMSKAYA, N.; DUNGEL, P.; MITTERMAYR, R.; HARTINGER, J.; FEICHTINGER, G.; WASSERMANN, K. Light therapy by blue LED improves wound healing in an excision model in rats. Injury Int. J. Care Injured, v. 42, p. 917–921, 2011. 2. ARAÚJO, C. E. N.; RIBEIRO, M. S.; FAVARO, R.; ZEZELL, D. M.; ZORN, T. M. T. Ultrastructural and autoradiographical analysis show a faster skin repair in He-Ne lasertreated wounds. J Photochem Photobiol B, v. 86, p. 87-96, 2007. 3. AL-WATBAN, F. A.; DELGADO, G. D. Burn healing with a diode laser: 670nm at different doses as compared to a placebo group. Photomed laser Surg, v. 23, n. 3, p. 245-250, 2005. 4. AL-WATBAN, F. A.; ANDRES, B. L. Polychromatic LED therapy in burn healing of non-diabetic and diabetic rats. J Clin Laser Med Surg, v. 21, n. 5, p. 249-58, 2003. 5. AL-ZAHRANI , M. S.; , AUSTAH, O. N. Photodynamic therapy as an adjunctive to

scaling and root planing in treatment of chronic periodontitis in smokers. Saudi Med

J, v. 32, n. 11, p. 1183-1188, 2011.

6.BALBINO, C. A.; PEREIRA, L. M.; CURI, R. Mechanisms involved in wound healing: a revision. Braz. J. Pharm. Sci, v. 41, n. 1, p. 27-51, 2005. 7.BARBOSA, E.; MOREIRA, E. A. M.; FAINTUCH, J.; PEREIMA, M. J. Suplementação de antioxidantes: enfoque em queimados. Rev Nutr, v. 20, n. 6, p. 693-702, 2007. 8.BARBOSA, A. F. S.; SOARES, L. G. P.; ACIOLE, J. M. S.; ACIOLE, G. T. S.; PITTA, I. R.; GALDINO, A. L. B. Evaluation of Photodynamic Antimicrobial Therapy (PACT) against Trypomastigotes of Trypanosoma cruzi: In Vitro Study. Advances in Laserology, v. 1364, p.55-59, 2011. 9. BARRILO, D. J.; PAUSEN, S. M. Management of burns to the hand. Wounds, v. 15, p. 4–9, 2003. 10. BAYAT, M.; VASHEGHANI, M. M.; RAZAVI, N.; TAHERI, S.; RAKHSHAN, M.; Effect of low level laser therapy on the healing of second- degree burns in rats: a histological and microbiological study. J Photochem Photobiol B, v. 78, n. 2, p. 171-177, 2005.

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Al-Zahrani%20MS%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=22057609

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Austah%20ON%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=22057609

82

11. BRUSSELAERS, N.; MONSTREY, S.; VOGELAERS, D.; HOSTE, E.;, BLOT, S. Severe burn injury in Europe: a systematic review of the incidence, etiology, morbidity, and mortality. Crit Care, v. 14, n. 5, R188, 2010.

12. CLARK, R. A. F. Biology of dermal wound repair. Dermatol Clin, v. 11, p. 647-666, 1993.

13. COELHO, C. O. M.; REZENDE, C. M. F.; TENÓRIO, A. P. M. Contração de feridas após cobertura com substitutos temporários de pele. Ciência Rural, v. 29, n. 2, p. 297-303, 1999. 14. COUTINHO, D. S.; SILVEIRA, L. JR.; NICOLAU, R. A.; ZANIN, F.; BRUGNERA,

A. JR. Comparison of temperature increase in vitro human tooth pulp by different light

sources in the dental whitening process. Lasers Med Sci, v. 24, n. 2, p. 179-85, 2009.

doi: 10.1007/s10103-008-0546-2.

15. CUTTLE, L.; PEARN, J.; MCMILLAN, JR.; KIMBLE, R.M. A review of first aid

treatments for burn injuries. Burns, v. 35, n. 6, p. 768-775, 2009. doi:

10.1016/j.burns.2008.10.011.

16. DAI, T.; TEGOS, G. P.; LU, Z.; HUANG, L.; ZHIYENTAYEV, T.; FRANKLIN, M.J.;

BAER, D. G.; HAMBLIN, M. R. Photodynamic therapy for Acinetobacter baumannii

burn infections in mice, Antimicrob. Agents Chemother, v. 53, n. 9, p. 3929-3934,

2009.

17. DANTAS, M. D.; CAVALCANTE, D. R.; ARAÚJO, F. E.; BARRETTO, S. R.; ACIOLE, G. T.; PINHEIRO, A. L.; RIBEIRO, M. A.; LIMA-VERDE, I. B.; MELO, C. M.; CARDOSO, J. C.; ALBUQUERQUE JÚNIOR, R. L. Improvement of dermal burn healing by combining sodium alginate/chitosan-based films and low level laser therapy. J Photochem Photobiol B, v. 105, n. 1, p.51-59, 2011.

18. DIEGELMANN, R. F.; EVANS, M. C. Wound healing:an overview of acute, fibrotic and delayed healing. Front. Biosci, v. 9, p. 283–289, 2004. 19. EDELMAN, L. S. Social and economic factors associated with the risk of burn injury. Burns, v. 33, n. 8, p. 958-965, 2007. 20. EZZATI, A.; BAYAT, M.; KHOSHVAGHTI, A. Low-level laser therapy with a pulsed infrared laser accelerates second-degree burn healing in rat: a clinical and microbiologic study. Photomed. Laser Surg, v. 28, n. 5, p. 603-611, 2010.

21. EZZATI, A.; BAYAT, M.; TAHERI, S.; MOHSENIFAR, Z. Low-level laser therapy with pulsed infrared laser accelerates third-degree burn healing process in rats. J Rehabil Res Dev, v. 46, n. 4, p. 534-554, 2009.

83

22. FIÓRIO, F. B.; ALBERTINI, R.; LEAL-JUNIOR, E. C.; DE CARVALHO, P. D. Effect of low level laser therapy on types Iand III collagen and inflammatory cells in rats with induced third-degree burns. Lasers Med Sci, 2013. doi: 10.1007/s10103-013-1341-2. 23. FIÓRIO, F. B; SILVEIRA, L. J. R.; MUNIN E.; DE LIMA C. J.; FERNANDES, K.P.; MESQUITA-FERRARI, R.A.; DE CARVALHO, P.T. Effect of incoherent LED radiation on third-degree burning wounds in rats. J Cosmet Laser Ther, v.13, n. 6, p. 315-322, 2011. 24. FOULKES, R.; DAVIDSON, L.; GATELEY, C. Full thickness burn to a latissimus dorsi flap donor site due to a heat pad--there is still a need to improve patient information. BMJ Caso Rep, 2011. doi: 10.1136/bcr.05.2011.4224

25. FU, X. J.; FANG, Y.; YAO, M. Antimicrobial photodynamic therapy for methicillin-resistant Staphylococcus aureus infection. Antimicrobial photodynamic therapy for methicillin-resistant Staphylococcus aureus infection. Biomed Res Int, 2013. doi: 10.1155/2013/159157. 26. GARCIA, V. G. G.; DE LIMA, M. A.; OKAMOTO, T.; MILANEZI, L. A.; GUALBERTO JÚNIOR, C.; FERNANDES, L. A.; DE ALMEIDA, J. M.; THEODORO, L. H. Effect of photodynamic therapy on the healing of cutaneous third-degree-burn: histological study in rats. Lasers Med Sci, v. 25, p. 221–228, 2010. 27. GOMES, D. R. Fisiologia e fisiopatologia. In: Gomes DR, Serra MC, Pellon MA. Tratamento de queimaduras: um guia prático. Rio de Janeiro: Revinter, p. 8-17, 1998. 28. HAMBLIN, M. R.; DEMIDOVA, T. N. Mechanisms of low-level light therapy. Proc. SPIE, v. 6140, p. 1–11, 2006. 29. HAWKINS, D.; ABRAHAMSE, H. Effect of multiple exposures of low level laser therapy on the cellular responses of wounded human skin fibroblasts. Photomed Laser Surg, v. 24, n. 6, p. 705-714, 2006. 30. HUANG, Z. A review of progress in clinical photodynamic therapy. Technol Cancer Res Treat, v. 4, p. 283–293, 2005. 31. JOHSON, R. M.; RICHARD, R. Partial-thickness burn: identification and management. Adv Skin Wound Care, v. 16, n. 4, p. 178-187, 2003. 32. KARU, T.; KOLYAKOV, S. F. Exact action spectra for cellular responses relevant to phototherapy. Photomed. Laser Surg, v. 23, p. 355–361, 2005. 33. KARU, T. Photobiology of low power laser effects. Health Phys, v. 56, p. 691–704, 1989. doi:10.1097/00004032-198905000-00015


http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Albertini%20R%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=23677436

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Leal-Junior%20EC%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=23677436

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=de%20Carvalho%20PD%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=23677436


http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Silveira%20L%20Jr%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=21981305

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Munin%20E%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=21981305

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=de%20Lima%20CJ%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=21981305

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Fernandes%20KP%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=21981305


http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=de%20Carvalho%20Pde%20T%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=21981305


http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Foulkes%20R%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=22679152

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Davidson%20L%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=22679152

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Gateley%20C%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=22679152

84

34. KHOSHVAGHTI, A.; ZIBAMANZARMOFRAD, M.; BAYAT, M. Effect of Low-Level treatment with an 80-Hz pulsed infrared diode laser on mast-cell numbers and degranulation in a rat model of third-degree burn. Photomed Laser Surg, v. 29, n. 9, p. 597–604, 2011. 35. KLEBANOV, G. I.; SHURAEVA, N. I. U.; CHICHUK T. V.; OSIPOV, A. N.; RUDENKO, T. G.; SHEKHTER, A. B.; VLADIMIROV, L. U. A. A comparative study of the effects of laser and light-emitting diode irradiation on the wound healing and functional activity of wound exudate leukocytes. Biofizika, v. 50, p. 1137–44, 2005. 36. KOLÁROVÁ, H.; DITRICHOVÁ, D.; WAGNER, J. Penetration of laser light into the skin in vitro. Lasers Surg. Med, v.24, p. 231–235, 1999. 37. LAMBRECHTS, S. A.; DEMIDOVA, T. N.; AALDERS, M.C.; HASAN, T.; HAMBLIN, M.R. Photodynamic therapy for Staphylococcus aureus infected burn wounds in mice. Photochem Photobiol Sci, v. 4, p. 503–509, 2005. doi:10.1039/b502125a 38. LEE, G.Y.; KIM, W.S. The systemic effect of 830-nm LED phototherapy on the wound healing of burn injuries: A controlled study in mouse and rat models. J Cosmet Laser Ther, v. 14, n. 2, p. 107-110, 2012.

39. LOHINAI, Z.; STACHLEWITZ, R.; SZÉKELY, A. D.; FEHÉR, E.; DÉZSI, L.; SZABÓ, C. Evidence for the expression of cyclooxigenase-2 enzyme in periodontitis. Life Sci, v. 70, n. 3, p.279-290.

40. MANDELBAUM, S. H.; DISANTIS, E. P.; MANDELBAUM, M. H. S. Cicatrization: current concepts and auxiliary resources -Part I. An. Bras. Dermatol, v. 78, n. 4, p. 393-410, 2003.

41. MEDRADO, A. R. A. P.; PUGLIESE, L. S.; REIS, S. R. A.; ANDRADE, Z. A. Influence of low level laser therapy on wound healing and its biological action upon myofibroblasts. Laser Surg Med, v. 32, n. 3, p. 239–244, 2003.

42. MEIRELES, G. C. S; SANTOS, J. N.; CHAGAS, P. O.; MOURA, A. P.; PINHEIRO A. L. B. A comparative study of the effects of laser photobiomodulation on the healing of third-degree burns: A histological study in rats. Photomed Laser Surg, v. 26, n.2, p. 159-166, 2008.

43. MESTER, E.; MESTER, A.; MESTER, A. The biomedical effects of laser application. Lasers Surg Med, n. 5, v. 1, p. 31-39, 1985. 44. MEYER, T. N.; SILVA, A. L. A standard burn model using rats. Act. Cir. Bras, v. 14, n. 4, 1999. 45. MORAIS, J. M.; MENDONÇA, D. E. O.; MOURA, V. B. L.; OLIVEIRA, M. A. P.; AFONSO, C. L.; VINAUD, M. C.; BACHION, M. M.; LINO JÚNIOR, R. S. Anti-

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Klebanov%20GI%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=16358796

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Shuraeva%20NIu%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=16358796

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Chichuk%20TV%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=16358796

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Osipov%20AN%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=16358796

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Rudenko%20TG%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=16358796


http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Vladimirov%20IuA%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=16358796

85

inflammatory effect of low-intensity laser on the healing of third-degree burn wounds in rats. Lasers Med Sci, 2012. doi:10.1007/s10103-012-1213-1 46. MONSTREY, S.; HOEKSEMA, H.; SAELENS, H.; DEPUYDS, K.; HAMDI, M.; VAN LANDUYD, K.; BLONDEEL, P. A conservative approach for dermal burn wounds using polarized-light therapy. Brit. J. Plast. Surg, v. 55, p. 420-426, 2005. 47. NÚÑEZ, S. C.; FRANÇA, C. M.; SILVA, D. F. T.; NOGUEIRA, G.E.C.; PRATES, R.A.; RIBEIRO, M. S. The influence of red laser irradiation timeline on burn healing in rats. Lasers Med Sci, v. 28, n. 2, p. 633-64, 2013.

48. OLIVEIRA, P. C.; PINHEIRO, A. L.; DE CASTRO, I. C.; REIS, J. A.; NOIA, M. P.;

GURGEL, C.; TEIXEIRA CANGUSSÚ, M. C.; PEDREIRA RAMALHO, L. M.

Evaluation of the effects of polarized light (λ 400-200 nm) on the healing of third-

degree burns in induced diabetic and non diabetic rats. Photomed Laser Surg, v. 29,

n.9, p. 619-25, 2011. 49. PARSONS, C.; MCCOY, C. P.; GORMAN, S. P.; JONES, D. S.; BELL, S. E.; BRADY, C.; GLINCHEY, S. M. M. C. Anti-infective photodynamic biomaterials for the prevention of intraocular lens-associated infectious endophthalmitis. Biomaterials, v. 30, p. 597–602, 2009. doi:10.1016/j.biomaterials.2008.10.015 50. PEREIRA, M. C. M. C.; PINHO, C. B.; MEDRADO, A. R. P.; ANDRADE, Z. A.; REIS, S.R. A. Influence of 670 nm low-level laser therapy on mast cells and vascular response of cutaneous injuries. J Photochem Photobiol B, v. 98, p.188–192, 2010. 51. PEREIRA, A. N.; EDUARDO, C. D. E. P.; MATSON, E.; MARQUES, M.M. Effect of low-power laser irradiation on cell growth and procollagen synthesis of cultured fibroblasts. Lasers Surg Med, v. 31, p. 263–267, 2002. 52. POTOKAR, T.S.; PROWSE, S.; WHITAKER, I. S. A global overview of burns research highlights the need for forming networks with the developing world. Burns, v. 34, p. 3–5, 2008. 53. RENNO, A. C.; IWAMA, A.M.; SHIMA, P.; FERNANDES, K.R.; CARVALHO, J.G.; OLIVEIRA, P.; RIBEIRO, D.A. Effect of low-level laser therapy (660 nm) on the healing of second-degree skin burns in rats. J Cosmet Laser Ther, v. 13, n. 5, p. 237-242, 2011. 54. RIBEIRO, M. A. G.; ALBUQUERQUE JÚNIOR, R. L. C.; RAMALHO, L. M. P.; PINHEIRO, A. L. B ; BOJARDIM, L. R. ; DA CUNHA, S. S. Immunohistochemical assessment of myofibroblasts and lymphoid cells during wound healing in rats subjected to laser photobiomodulation at 660 nm. Photomed Laser Surg, v. 27, p. 49-55, 2009.


86

55. RIBEIRO, M. S.; DA SILVA, D. F. T.; DE ARAÚJO, C. E. N.; OLIVEIRA, S. F.; PELEGRINI, C. M. R.; ZORN, T. M.; ZEZELL, D. M. Effects of low-intensity polarized visible laser radiation on skin burns: A light microscopy study. J. Clin. Laser Med Surg, v. 22, p. 59–66, 2004.

56. ROCHA, C. L. J. V.; ROCHA JÚNIOR, A. M. R.; AERESTRUP, B. J. V. Inhibition

of cyclooxygenase 2 expression in NOD mice cutaneous wound by low-level laser

therapy. J Vasc Bras, v. 11, n. 3, p. 175-181, 2012.

57. ROCHA JR, A. M. R.; OLIVEIRA, R. G.; FARIAS, R. E.; ANDRADE, L. C. F.; AARESTRUP, F. M. Modulation of fibroblast proliferation and inflammatory response by low-intensity laser therapy in tissue repair process. An Bras Dermatol., v. 81, n. 2, p.150-6, 2006. 58. SCHÄR, D.; RAMSEIER, C.A.; EICK, S.; ARWEILER, N. B.; SCULEAN, A.; SALVI, G.E. Anti-infective therapy of peri-implantitis with adjunctive local drug delivery or photodynamic therapy: six-month outcomes of a prospective randomized clinical. trial. Clin Oral Implants Res, v. 24, n. 1, p.104-10, 2013. doi: 10.1111/j.1600-0501.2012.02494.x.. 59. SCHINDL, A.; MERWALD, H.; SCHINDL, L.; KAUN, C.; WOJTA, J. Direct stimulatory effect of low intensity 670nm laser irradiation on human endothelial cell proliferation. Br J Dermatol, v. 148, n. 2, p. 334-336, 2003. 60. SCHLAGER, A.; OEHLER, K.; HUEBNER, K.U.; SCHMUTH, M.; SPOETL, L. Healing of burns after treatment with 670 nanometer low power laser light. Plast Reconstr Surg, v. 105, n. 5, p. 1635-1639, 2000. 61. SCHLAGER, A.; KRONBERGER, P.; PETSCHKE, F.; ULMER, H. Low power laser light in the healing of burns: a comparison between two different wavelengths (635nm and 690nm) and placebo group. Lasers Surg Med, v. 27, n. 1, p. 39-42, 2000. 62. SIGER, A.J.; BREBBIA, J.; SOROFF, H.H. Management of local burn wounds in the ED. Am. J. Emerg. Med, v. 25, p. 666–671, 2007. 63. SHARMA, B.R. Infection in patients with severe burns: causes and prevention thereof. Infect. Dis. Clin. North Am, v. 21, p. 745–759, 2007. 64. SHERIDAN, R. L.; HINSON, M. I.; LIANG, M. H.; NACKEL, A. F.; SCHOENFELD, D. A.; RYAN, C. M.; MULLIGAN, J.L.; TOMPKINS, R. G. Long-term outcome of children surviving massive burns. JAMA, v. 283, p. 69–73, 2000. 65. SHOLAR, A. D.; WONG, L. K.; CULPEPPER, J. W.; SARGENT, L. A. The specialized wound care center A 7-years experience at tertiary care hospital. Ann Plast Surg, v. 58, p. 279–284, 2007. doi:10.1097/01.sap.0000248116.28131.94

87

66. SPERANDIO, F. F.; SIMÕES, A.; ARANHA, A.C.C.; CORRÊA, L.; SOUSA, S.C.O.M. Photodynamic Therapy Mediated by Methylene Blue Dye in Wound Healing Photomed Laser Surg, v. 28, n. 5, p. 581–587, 2010. doi: 10.1089/pho.2009.2601 67. TADA, K.; IKEDA, K.; TOMITA, K. Effect of polarized light emitting diode irradiation on wound healing. J. Trauma, v. 67, p. 1073–1079, 2009.

68. TORRES, C.R.; BARCELLOS, D. C.; BATISTA, G. R.; BORGES, A. B.; CASSIANO, K. V.; PUCCI, C. R. Assessment of the effectiveness of light-emitting diode and diode laser hybrid lightsources to intensify dental bleaching treatment. Acta Odontol Scand, v. 69, n. 3, p. 176-181, 2011. doi: 10.3109/00016357.2010.549503

69. TUNÈR, J.; HODE, L. Laser therapy: clinical practice and scientific background. Grangeberg: Prima Books AB, Chapt 1—Some basic laser physics, pp 1–44, 2002. 70. VALE, E. C. S. Inicial management of burns: approach by dermatologists. An Bras Dermatol, v. 80, n. 1, p. 9-19, 2005.

71. VAN DER VEER, W. M.; BLOEMEN, M. C.; ULRICH, M. M.; MOLEMA, G.; VAN ZUIJLEN, P.P.; MIDDELKOOP, E.; NIESSEN, F. B. Potential cellular and molecular causes of hypertrophic scar formation burns. Burns, v. 35, p. 15–29, 2009. 72. VASHEGHANI, M. M; BAYAT, M.; DADPAY, M.; HABIBIE, M.;REZAEI, F. Low-level laser therapy using 80-Hz pulsed infrared diode laser accelerates third-degree burn healing in rat. Photomed Laser Surg, v. 27, n. 6, p. 959-964, 2009.

73. WASSERMANN, D. E´ valuation et premiers soins d’une bruˆ lure thermique. Rev. Prat, v. 52, p. 2228–2233, 2002.

74. WAINWRIGHT, M. Photodynamic antimicrobial chemotherapy. J Antimicrob Chemother, v. 42, p.13–28, 1998. doi:10.1093/jac/42.1.13. 75. WEISS, R. A.; MCDANIEL, D. H.; GERONEMUS, R.G, WEISS, M. A.; BEASLEY, K. L.; MUNAVALLI, G. M.; BELLEW, S.G. Clinical experience with light emitting diode (LED) photomodulation. Dermatol Surg, v. 31, p. 1199–205, 2005.

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=van%20der%20Veer%20WM%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=18952381

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Bloemen%20MC%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=18952381

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Ulrich%20MM%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=18952381

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Molema%20G%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=18952381



http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Middelkoop%20E%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=18952381

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Niessen%20FB%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=18952381

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Vasheghani%20MM%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Bayat%20M%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Dadpay%20M%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Habibie%20M%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Rezaei%20F%22%5BAuthor%5D


http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Weiss%20MA%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=16176771




http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Bellew%20SG%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=16176771

APÊNDICES

89

Apêndice A

Ficha de Avaliação Clínica

Rato número __________ Grupo de tratamento:_______________________ Ferimento – Queimadura

Dia

Pus Escara Área avermelhada

Área esbranquiçada

Sangramento

Maior diâmetro lesão (mm)

03

07

14

21

Observações:

90

Apêndice B

Ficha do consumo de água e ração

Tempo

(dias)

CTR

A R

LVER

A R

LINF

A R

TFD

A R

LED

A R

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

11

12

13

14

15

16

17

18

19

20

21

ANEXO A

92

ANEXO A

Parecer do comitê de ética no uso de animais

banco de dentes humanos - decÍduostede.bc.uepb.edu.br/jspui/bitstream/tede/1913/1/pdf... ·...

Documents