bab iv cara kerja
TRANSCRIPT
BAB IV
METODE KERJA PRAKTEK
4.1 Pelaksanaan Kerja Praktek
4.1.1 Tempat Kerja Praktek
Gambar 4.1. Lokasi Kerja Praktek dan Pengambilan Sampel (Kiri :
BLPMHP Mataram, Kanan : Pasar Kebon Roek, Ampenan).
Kerja praktek ini dilaksanakan di Balai Laboratorium Pengujian
Mutu Hasil Perikanan (BLPMHP) Dinas Perikanan dan Kelautan Provinsi
Nusa Tenggara Barat. Sedangkan pengambilan sampel dilakukan di pasar
Kebon Roek, Ampenan.
4.1.2 Waktu Pelaksanaan Kerja Praktek
Kerja praktek ini dilaksanakan mulai tanggal 9 Juli 2012 sampai
dengan 9 Agustus 2012.
36
4.2 Alat dan Bahan
Alat dan bahan yang digunakan dalam pengujian mikrobiologi
yang meliputi ; Preparasi Sampel, Angka Lempeng Total (ALT), uji
Coliform, dan uji Escherichia coli serta Uji Biokimia adalah sebagai
berikut :
4.2.1 Preparasi sampel
a)Alat :
- Pisau
- Gunting
- Telenan
- Plastik Sampel
- Timbangan Analitik
- Pinset
- Bunsen
b)Bahan :
- Sampel Ikan Kakap Merah
- Alkohol 70%
- Tissue
4.2.2 Penentuan ALT (Angka Lempeng Total)
a)Alat :
- Tabung Duran (Botol Pengencer)
- Cawan Petri
- Gelas Ukur 500 ml
- Gelas Ukur 250 ml
- Gelas Kimia 200 ml
37
- Gelas Kimia 500 ml
- Labu Alas Bundar 1000 ml
- Ceret 2000 ml
- Pipet Volume 10 ml
- Mikropipet
- Tip
- Tabung Reaksi
- Rak Tabung Reaksi
- Vortex Mixer
- Colony Counter
- Stopwatch
- Stomacher
- Autoclave
- Inkubator
- Bunsen
- Kapas
- Kertas jagung
- Karet Gelang
b)Bahan :
- Media BFP (Butterfield’s Phosphate Buffered)
- Sampel Ikan Kakap(yang telah dipreparasi)
- Media PCA (Plate Count Agar)
- Aquadest
- Kertas Label
4.2.3 uji Coliform dan uji Escherichia coli
a)Alat :
- Tabng Reaksi
- Rak Tabng Reaksi
38
- Mikropipet
- Tip
- Pipet Volume
- Waterbath
- Inkubator
- Cawan Petri
- Tabung Durham
- Timbangan Analitik
- Gelas Ukur
- Gelas Kimia
- Erlenmeyer
- Autoklaf
- Hot Plate
- Stirerr
- Jarum Inokulasi
- Bunsen
- Sendok
- PH Meter
b)Bahan :
- Sampael Ikan Yang sudah diencerkan
- Media LTB
- Media BGLB
- Media LEMB
- Aquadest
- Alkohol
- Karet Gelang
- Kertas Jagung
- Kertas Label
39
- Tissu
4.2.4 uji Biokimia
a)Alat :
- Tabung Reaksi
- Rak Tabung Reaksi
- Autoklaf
- Inkubator
- Pipet Volume
- Hot Plate
- Erlenmeyer
- Gelas Kimia
- Timbangan Analitik
- Jarum Inokulasi
b)Bahan :
- Media PCA Miring
- Media Tryptone Broth
- Media Simmon Citrate
- Indikator Methyl - Red
- Reagen α-Napthol
- Reagen KOH
- Aquadest
4.3 PROSEDUR KERJA
Berdasarkan data BLPMHP Dirjen Perikanan bahwa setiap prosedur kerja
yang dilakukan harus berdasarkan pada Standar Nasional Indonesia (SNI) yaitu
40
01-2332.3-2006. Berikut prosedur kerja yang dilakukan untuk pengujian
mikrobiologi :
4.3.1 Preparasi Sampel
a. Sterilisasi alat yang akan digunakan untuk preparasi menggunakan alkohol.
b. Nyalakan bunsen, dan siapkan pisau, telenan dan pinset. Kemudian
letakkan ikan yang akan dipreparasi diatas telenan. Ikan dipotong dan diambil
daging ikan dari bagian kepala, perut, ekor, dan sedikit isi dalamnya.
c. Disiapkan plastik sampel kemudian diberi kode (Ikan Kakap Merah).
d. Dimasukkan sampel ikan yang telah dipreparasi kedalam plastik sampel,
kemudian ditimbang sebanyak 25 gram.
4.3.2 Penentuan Angka Lempeng Total (ALT) sesuai dengan SNI 01-2332.3-
2006
a. Homogenkan 25 gr contoh (sampel) dalam plastik steril dengan
menambahkan larutan Butterfield’s Phosphate Buffered (BFP) sebanyak
225 ml. Kemudian dihomogenkan dengan menggunakan stomacher
selama 90 detik, nyatakan sebagai pengenceran 10-1.
b. Siapkan pipet steril atau mikropipet serta 5 buah tabung pengencer berisi 9
ml larutan BFP dan beri kode pengenceran 10-2,10-3, 10-4,10-5 dan 1 tabung
lainnya untuk blangko.
c. Dengan menggunakan pipet steril ambil 1 ml homogenate contoh dari
pengenceran 10-1 kemudian masukkan pada tabung berisi larutan BFP 9
41
ml dan homogenkan dengan menggunakan Vortex mixer, untuk
mendapatkan pengenceran 10-2 . Demikian pula untuk pengenceran 10-3
ambil 1 ml dari pengenceran 10-2 kemudian masukkan pada 9 ml larutan
BFP, begitu seterusnya sampai mendapatkan pengenceran 10-5.
d. Siapkan 9 buah petri disk steril beri kode contoh dan beri kode
pengenceran, masing – masing dilakukan secara duplo dan 1 buah untuk
blanko.
e. Ambil 1 ml larutan 10-1 dan masukkan pada tabung pengencer 10-2,
homogenkan dengan Vortex Mixer. Kemudian dengan pipet baru,ambil 1
ml dari larutan 10-2 masukkan ke petri disk steril yang berkode sampel
pengenceran 10-2 2 buah (duplo), masing – masing 1 ml. Dengan cara
yang sama dilakukan pula untuk pengenceran 10-3,10-4 dan 10-5. Untuk
blangko, 1 ml Larutan BFP dimasukkan pula dalam petri disk.
f. Siapkan PCA hangat – hangat kuku dengan suhu 40-45ᵒ C. Tuang masing
– masing ± 12-15 ml dalam petri disk berisi larutan contoh termasuk juga
pada petri disk blanko. Putar ke kanan dan ke kiri agar merata keseluruh
permukaan. Dinginkan selama ± 30 menit.
g. Inkubasi pada suhu 35ᵒ C selama 48 jam ± 2 hari dengan posisi petri disk
terbalik. Kemudian dihitung koloni yang ada pada cawan petri dengan
Colony Counter atau Electric Bactery Colony Counter dan dicatat pada
lembar kerja.
42
h. Dilanjutkan dengan perhitungan jumlah ALT dan jumlah koloni dengan
menggunakan rumus (analisis data).
4.3.3 Penentuan Coliform & Escherichia coli sesuai dengan SNI 01-2332-
2006.
Uji Coliform dan Escherichia coli terdiri dari uji pendugaan dan uji
penegasan. Prosedur kerjanya adalah sebagai berikut :
1. Uji Pendugaan Coliform
a. Homogenkan 25 gr contoh (sampel) dalam plastik steril dengan
menambahkan larutan Butterfield’s Phosphate Buffered (BFP) sebanyak
225 ml. Kemudian dihomogenkan dengan menggnakan stomacher selama
90 detik,nyatakan sebagai pengenceran 10-1.
b. Tulis kode sampel dan pengenceran pada tiap tabung berisi LTB dan
tabung durham yang akan digunakan, yaitu tiga tabung LTB sebagai
pengenceran 10-1 , tiga tabung LTB sebagai pngenceran 10-2 dan tiga
tabung LTB sebagai pengenceran 10-3.
c. Selanjutnya sampel ikan yang telah dihomogenisasi (sebagai pengenceran
10-1) diambil 1ml menggunakan mikropipet kemudian masukkan pada
tabung berisi larutan BFP 9 ml, untuk mendapatkan pengenceran 10 -2,
kemudian masukkan masing – masing 1ml contoh ke dalam tabung LTB
sesuai dengan pengencerannya dan homogenkan dengan menggunkan
43
vortex mixer. Demikian pula untuk pengenceran 10-3, ambil 1 ml dari
pengenceran 10-2 kemudian masukkan pada 9 ml larutan BFP dan 1 ml ke
masing – masing tabung LTB.
d. inkubasi tabung – tabung tersebut selama 48 jam, pada suhu 35º C. Baca
hasil inkubasinya. Lakukan uji penegasan Coliform dan uji pendugaan
Escherichia Coli untuk tabung – tabung positif.
Hasil : Positif : Terbentuknya gas pada tabung Durham.
Negatif: Tidak terbentuk gas pada tabung durham.
2. Uji Penegasan Coliform
a. Siapkan tabung yang berisi 9 ml BGLB dan tabung durham sesuai dengan
jumlah tabung LTB yang positif. Tulis kode dan pengenceran pada tabung
BGLB sesuai dengan tabung LTB yang positif.
b. Ambil dengan ose steril dari tabung LTB yang positif dan inokulasikan
pada tabung BGLB sesuai dengan kode dan pengenceran. Inkubasi tabung
BGLB pada inkubator selama 48 jam pada suhu 35º C. Baca hasil yang
positif kemudian tentukan nilainya sesuai pada tabel APM.
Hasil : Positif : Terbentuknya gas pada tabung durham
Negatif: Tidak terbentuknya gas pada tabung durham.
44
3. Uji Pendugaan Escherichia coli
a. Siapkan tabung yang berisi 9 ml EC Broth dan tabung durham sesuai
dengan jumlah tabung LTB yang Positif. Tulis kode dan pengenceran pada
tabung EC Broth sesuai dengan tabung LTB yag positif.
b. Diambil biakan dengan ose steril dari tabung LTB yang positif dan
pindahkan pada tabung EC Broth sesuai dengan kode dan pengenceran.
Inkubasi pada Waterbath dengan suhu 45,5 º C selama 48 jam. Baca hasil
inkubasinya, lakukan uji berikutnya untuk hasil yang positif.
Hasil : Positif : Terbentuknya gas pada tabung Durham.
Negatif : Tidak terbentuk gas pada tabung Durham.
4. Uji Penegasan Escherichia coli
a. Siapkan cawan petri steril yang telah diisi media LEMB agar sebanyak
tabung EC Broth yang positif. Tulis kode dan pengenceran pada LEMB
agar sesuai dengan tabung EC Broth yang positif.
b. Ambil dengan ose steril dari tabung EC Broth positif dan pindahkan
dengan cara di strike pada cawan petri yang telah berisi LEMB agar sesuai
dengan kode dan pengenceran. Inkubasi pada inkubator dengan suhu 35º C
selama 24 jam.
45
c. Diperhatikan koloni tersangka yang berwarna hitam atau gelap yang bagian
pusat koloni dengan atau tanpa metalik kehijauan. Jika tidak terdapat
koloni tersangka berarti pengujian telah selesai. Tapi jika ada, maka
dilanjutkan dengan uji IMVIC biokimia.
4.3.4 Uji Biokimia Dengan Reaksi IMViC
1. PERSIAPAN MEDIA PCA
Siapkan PCA miring pada tabung. Tulis kode dan pengenceran pada
PCA miring sesuai dengan LEMB agar yang positif (+). Ambil dengan
jarum ose satu koloni tunggal tersangka pada media LEMB agar,tanam
pada media PCA miring dengan cara menggoreskan pada permukaan
agar miringtersebut. Inkubasi pada incubator dengan suhu 35º C
selama 24 jam.
2. UJI INDOL
Siapkan tabung berisi 5 ml Tryptone Broth. Tulis kode dari
pengenceran pada tabung reaksi yang berisi media Trypton Broth.
Ambil dengan ose steril dari media PCA miring dan tanam pada media
Tryptone Broth.
Inkubasi selama 24 jam dengan suhu 35º C.
Tambahkan 4 tetes reagen Kovac’s pada media Tryptone Broth yang
telah diinkubasi.
46
Hasil : Positif : Terbentuk cincin merah pada permukaan media.
Negatif: Tidak Terbentuk cincin merah pada permukaan media.
3. UJI VOGES PRESKUER
Siapkan tabung berisi 5 ml MR – VP Broth. Tulis kode dan
pengenceran pada tabung reaksi yang berisi media MR – VP Broth`.
Ambil dengan ose steril dari media PCA miring dan tanam pada media
MR – VP Broth.
Inkubasi selama 48 jam dengan suhu 35ºC.
Tambahkan reagen α- Napthol 0,6 ml. Kemudian tambahkan reagen
KOH 40% 5 ml ke dalam media MR – VP Broth yang telah diinkubasi.
Hasil : Positif : Terbentuk warna merah pada media.
Negati : Tidak berubah / berwarana kuning kehijauan.
4. UJI METHYL RED
Siapkan tabung berisi 5 ml MR – VP Broth. Tulis kode dan
pengenceran pada tabung reaksi yang berisi media MR – VP Broth.
Ambil dengan ose steril dari media PCA miring dan tanam pada media
MR – VP Broth.
Inkubasi selama 96 jam dengan suhu 35ºc
Tambahkan indicator Methal – Red kedalam media MR – VP Broth
yang telah di inkubasi
47
Hasil : Positif :Terbentuk warna merah pada media.
Negatif :Terbentuk warna kuning pada media.
5. UJI CITRATE
Siapkan tabung berisi Simmon Citrat agar miring.Tulis kode dan
pengenceran pada tabung reaksi yang berisi media Simmon Citrat
Agar.
Ambil dengan Ose Steril dari media PCA miring dan tanam.Pada
media Simmon Citrate dengan cara menggoreskan pada sisi miring
media tersebut.
Inkubasi selama 96 jam dengan suhu 35ºC
Hasil : Positif :Media berubah jadi biru
Negatif :Media berwarna tetap ( hijau )
Hasil Escherichia coli pada IMVIC adalah :
Uji Indol : Positif / Negatif
Uji Voges Preskuer : Negatif
Uji Methyl Red : Positif
Uji Citrate : Negatif
48
4.4 Analisis Data
Analisa data untuk uji penegasan Coliform menggunakan kombinasi
tabung-tabung positif dari tiga seri pengenceran pada media BGLB kemudian
dicocokkan dengan Tabel MPN/APM. Sedangkan analisis data untuk pendugaan
Escherichia coli dilakukan dengan mencocokkan kombinasi tabung-tabung
positif dari tiga seri pengenceran pada media EC-Broth dengan Tabel MPN atau
APM (Angka Paling Memungkinkan). Untuk uji penegasan Escherichia coli
ditentukan berdasarkan hasil uji IMViC yang dicocokkan juga dengan tabel
APM.
4.1 Analisis Data ALT
Berdasarkan tabel perhitungan ALT dapat ditentukan dengan
rumus sebagai berikut :
Keterangan :
N : Jumlah koloni produk dinyatakan dalam koloni ml atau per gram
ΣC: Jumlah koloni pada semua cawan yang dihitung
n1 : Jumlah cawan pada pengenceran pertama yang dihitung
n2 : Jumlah cawan pada pengenceran kedua yang dihitung
d : pengenceran pertama yang dihitung
Standar ALT untuk produk perikanan yaitu 5 x 105 koloni/gram
49