axón de jibia 2 de abril de 2007 clases/voltageclampk.ppt 04/04/2007 03:11:36 p.m
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Axón de jibia
2 de abril de 2007
http://einstein.ciencias.uchile.cl/Fisiologia2007/Clases/VoltageClampK.ppt
04/04/2007 03:11:36 p.m.
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Axón de jibiaElectrodo que inyecta corriente Vx(t)
+
_
oElectrodos para medir el potencial
Con este sistema podemos observar la propagación del impulso nervioso a lo largo del axón.
Circuito con realimentación negativa:VO = V+
Estímulo en de 25 A en x = 0. Dura 0,5 ms y empieza a t = 0.
Registro del potencial eléctrico intracelular a lo largo del nervio.
0.00 ms
0.04 ms
Estímulo en de 25 A en x = 0. Dura 0,5 ms y empieza a t = 0.
Registro del potencial eléctrico intracelular a lo largo del nervio.
0.12 ms
Estímulo en de 25 A en x = 0. Dura 0,5 ms y empieza a t = 0.
Registro del potencial eléctrico intracelular a lo largo del nervio.
0.52 ms
Estímulo en de 25 A en x = 0. Dura 0,5 ms y empieza a t = 0.
Registro del potencial eléctrico intracelular a lo largo del nervio.
1.00 ms
1.24 ms
1.88 ms
2.28 ms
2.92 ms
3.72 ms
4.60 ms
5.48 ms
6.44 ms
8.04 ms
8.84 ms
9.80 ms
10.76 ms
12.52 ms
15.12 ms
Axón de jibiaElectrodo que inyecta corriente Electrodos para medir
el potencial
Con este sistema podemos observar la propagación del impulso nervioso a lo largo del axón.
Vx(t)
En cada punto del axón pasa algo diferente, esto complica el análisis, tratemos de simplificar eliminando la variable espacio
Eliminando la variable espacio
Electrodo que inyecta corriente Vx(t)
La placa de tierra asegura que la resistencia del medio externo sea muy chica. Ro = 0
El alambre axial asegura que la resistencia del medio interno sea muy chica. Ri = 0.
oi
m
RR
R
2
¿Qué valor toma la constante de espacio?
Eliminando la variable espacio
Electrodo que inyecta corriente
El potencial de acción no se propaga. Se llama potencial de acción de membrana.
V (t)
Electrodo que mide potencial
A todo lo largo del axón pasa exactamente lo mismo, esto simplifica el análisis. Desaparece la variable espacio (Space clamp).
Potencial de acción de membrana
Space clampElectrodo que inyecta corriente
Vi (t)
PERO mientras esté circulado corriente por el electrodo de tierra no sabemos el potencial extracelular
Necesitamos otro electrodo para medir el potencial extracelular.
Electrodo que mide potencial intracelular
Space clamp
Necesitamos otro electrodo para medir el potencial extracelular.
Vi (t)
Electrodo que mide potencial intracelular
Ve (t)
Electrodo que inyecta corriente
Electrodo que mide el potencial extracelular
Medida de Vm
Vi (t)
Ve (t)
Medida de Vm
Vi (t)
Ve (t)
R R
0 V
RVi /0 RVi /0
-Vi
RVe /
Medida de Vm
Vi (t)
Ve (t)
R R
-Vi
R R
0 V
RVi /
Vi -Ve R
Vm
? RViVe /
Space clampElectrodo que inyecta corriente
Vm (t)
Electrodo que mide potencial intracelular
Electrodo que mide el potencial extracelular
Arreglo experimental para controlar el potencial eléctrico de la membrana. (Voltage Clamp)
Vcomando
El potencial de la membrana es igual al potencial de comando en todos los puntos a lo largo del axón. El amplificador se encarga de pasar tanta corriente como sea necesario para mantener esta igualdad.
Voltage clamp
Vm
Arreglo experimental para controlar el potencial eléctrico de la membrana. (Voltage Clamp)
El potencial de la membrana es igual al comando.
El ampérmetro A mide la corriente que pasa por 1 cm lineal de axolema.
A
Voltage clamp
Vcomando
Vm
Extracelular Intracelular
Voltage Clamp
Cim III
Extracelular
Intracelular
Vm
Rm
Vr
Cm
Im
Ii IC
dt
dVC
R
VVI m
m
rmm
Vm
Tiempo
Im
Vr
Voltage clamp de un circuito pasivo
Cim III
dt
dVC
R
VVI m
m
rmm
Vm
Tiempo
Im
Vr
Voltage clamp de un circuito pasivo
Extracelular
Intracelular
Rm
Vr
Cm
Im
Ii IC
Cim III
Vm
TiempoIm
Vr
Eliminando la corriente capacitiva
dt
dVC
R
VVI m
m
rmm
XX
Extracelular
Intracelular
Rm
Vr
Cm
Im
Ii IC
VNa
GNa GK
VK
Extracelular
Intracelular Vm
)( NamNaNa VVGI )( KmKK VVGI
KNam III
INa IK
Im
0)( 54 mNaNa VGI)0( 94 mKK VGI
NaKm GGI 5494
Corrientes iónicas a Vm = 0 en un circuito con dos vías paralelas
Vm
Tiempo
Im
Vm=Vr
Vm=0
I, mA/cm2
t, ms
Voltage clamp de un axón de jibia
NaNaNaKKKm gpNgpNI 5494
NatVNaNaKtVKKm gpNgpNI ),(),( 5494
-60,8mV0mV
)0()0( NaNaKKm VGVGI
dtdV
CVVGVVGI mNamNaKmKm )()(
FUGU es un plato japonés que se prepara con la carne del pez globopufferfish (especies Takifugu, Lagocephalus, or Sphoeroides) o del pez puercoespín (género Diodon) . Debido a que el pez globo es un letalmente venenoso si se prepara en forma incorrecta, el fugu es el plato más celebrado y famoso de la cocina japonesa.
Reino: AnimaliaFilo: ChordataSubfilo: VertebrataClase: ActinopterygiiOrden: TetraodontiformesFamilia: TetraodontidaeGénero: TakifuguAbe, 1949
FUGU
Tetrodotoxin (anhydrotetrodotoxin 4-epitetrodotoxin, tetrodonic acid, TTX) es una neurotoxina sin un antídoto conocido. Bloquea los potenciales de acción en los nervios uniéndose a los canales de sodio rápidos de las membranbas celulares de los nervios.
El Dr. Yoshizumi Tahara la aisló en 1909 y la llamó tetrodotoxina, nombre derivado de Tetraodontiformes, el orden al que pertenece el pez globo.
I, mA/cm2
t, ms
-60,8mV0mV
Voltage clamp de un axón de jibia en presencia de TTX, bloqueador de los canales de Na
NatVNaNaKtVKKm gpNgpNI ),(),( 5494 KtVKKK gpNI ),(94
Control
TTX
I, mA/cm2
t, ms
-60,8mV0mV
NatVNaNaKtVKKm gpNgpNI ),(),( 5494
La corriente de Na es la diferencia de la corriente control – corriente con TTX.
KtVKKK gpNI ),(94NatVNaNaNa gpNI ),(54
Extracelular Intracelular
Voltage Clamp
dtdV
CVVGVVGI mNamNaKmKm )()(
GNa y GK son funciones de Vm y t
Canales de potasio de axón de jibia
5 de abril de 2007
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I, mA/cm2
t, ms
Voltage clamp de un axón de jibia
-60,8mV0mV
dt
dVCVVGVVGI m
NamNaKmKm )()(
I, mA/cm2
t, ms
-60,8mV0mV
Voltage clamp de un axón de jibia en presencia de TTX, bloqueador de los canales de Na
Control
TTX
dt
dVCVVGVVGI m
NamNaKmKm )()(
-2
-1
0
1
2
3
4
5
6
7
-150 -100 -50 0 50 100 150
Conductancia GK?
)( KmKK VVGI
Potencial de inversión, VK?
Vm, mV
I K, m
A c
m-2
y = 0.0434x + 1.6983
-2
-1
0
1
2
3
4
5
6
7
-150 -100 -50 0 50 100 150
Conductancia GK?
)( KmKK VVGI
Potencial de inversión, VK?
?Vm, mV
I K, m
A c
m-2
-39.1 mV
GK = 43.4 mS cm-2
VK = -39.1 mV
y = 0.0434x + 1.6983
-2
-1
0
1
2
3
4
5
6
7
-150 -100 -50 0 50 100 150
Conductancia GK?
)( KmKK VVGI
Potencial de inversión, VK?
?Vm, mV
I K, m
A c
m-2
-39.1 mV
GK = 43.4 mS cm-2
VK = -39.1 mV
-2
-1
0
1
2
3
4
5
6
7
-150 -100 -50 0 50 100 150
Conductancia GK?
)( KmKK VVGI
Potencial de inversión, VK?
Vm, mV
I K, m
A c
m-2
Estrategia para buscar el potencial de inversión VK.
Sospecha: VK = -94 mV
Problema: alrededor de -94 mV no se registra inversión de la corriente. ¿Por qué?Porque los canales están cerrados a -94 mV.
Solución: 1) Abrir los canales, despolarizando la membrana 2) Cambiar el potencial en forma instantánea y 3) Medir la corriente antes de que los canales se cierren 4) Explorar la superficie I/V.
Vm, mV
IK,
mA
/cm
2
Los canales de K obedecen a la ley de Ohm:
)( KmOKK VVPNgI
La PO de la ecuación es la probabilidad de encontrar el canal abierto a 0 mV.
VK=-73.4 mV
Sorpresa: El valor encontrado es mayor que -94mV, el esperado según Nernst.
Explicación: Los canales de K no son idealmente selectivos: pasa algo de Na.
Tarea: Calcular GK/GNa para estos canales
Vm, mV
IK,
mA
/cm
2
VK=-73.4 mV
)( KmKK VVGI
VK=-73.4 mV
)( KmKK VVGI
Km
KK VV
IG
Vm, mV
IK,
mA
/cm
2
OKK PNgG )1/(1 )/)(( 0 RTVVzF
OmeP
No. La forma de la curva no corresponde a una función de Boltzmann.
Extracelular
Intracelular
Bicapa
Estructura de los canales dependientes de voltaje.
1 2 4 5 6
1
2 3
45
6
Shrivastava, I. H., Durell, S. R. & Guy, H. R. (2004) Biophys. J. 87, 2255–2270.
Más detalles estructurales en (tema de seminario):
P loop
+ +
+ +
Vm = +60 mV Vm = -60 mV
Posible movimiento del segmento S4 impulsado por las diferencias de potencial eléctrico.
Despolarizar
Hiperpolarizar
Compuerta abierta Compuerta cerrada
Filtro de selectividad ( Na, K, Ca )
Aggarwal,. & MacKinnon. (1996) Neuron 16, 1169–1177.
Larsson, et al 1996. (1996) Vol. Neuron, 16, 387–397,
Papers para seminarios sobre este punto:
Los canales de K son tetrámeros.
Cada monómero tiene su propio sensor de potencial: es el segmento S4 que tiene varios residuos de arginina.
Los sensores de potencial tiene dos estados: reposo y activo
Los sensores de potencial operan en forma independiente.
El canal se abre sólo cuando los cuatro sensores de potencial están activos.
Sea n la probabilidad de encontrar un sensor activo
La probabilidad de encontrar un canal abierto es... n4
)-V(VnNgI KmKK4
)-V(VngNI KmKKK4
4ngNG KKK
)1( nndt
dnnn
nn
nn
ntt ennnn /
0 )(
nnn
1
)/),((
1
1RTnoVmVFnz
en
nn
nn
ntt ennnn /
0 )(
nnn
1
)/),((
1
1RTnoVmVFnz
en
)-V(VngNI KmKKK4
4
max4
)/),((
1
1
RTnoVmVFnz
eGngNG KKKK
4
max
)/),((
1
1
RTnoVmVFnz
eGG KK
Vm, mV
GK,
mS
/cm
2 Resultado de Solver:GK
max = 34 mS/cm2
V0,n = -51.6 mVzn = 1.2
4, ngNG KKK
4,
KK
K
gN
Gn
n
Vm, mV
Medición de la probabilidad de encontrar los canales abiertos
usando el análisis de las corrientes de cola.
Vm, mV Vm, mVG
K,
mS
/cm
2
IKcola@-60mV, mA/cm2 GK mS/cm2I K
cola@
60m
V, m
A/c
m2
Medición de la probabilidad de encontrar los canales abiertos usando el análisis de las corrientes de cola.
La corriente de cola es la medida a -60 mV, siendo la probabilidad de encontrar abiertos los canales igual a la correspondiente a Vm
Cinética
ntt ennnn /
0 )(
4/0 )( nt
tO ennnP
nt
tO ennnP /0
4 )(
)()()(4/
0 Kmt
KKK VVennngNtI n
Tarea: Demuestre que la corriente de cola decae exponencialmente para el caso en que n = 0.Relacione la constante de tiempo de la corriente de cola con n cuando n = 0.
40 mV
-140 mV
4/0 )()( nt
KK ennnNgtG
40 mV
-140 mV
ntKK ennnNgtG /
044 )()(
¿Cómo determinar n?
40 mV
-140 mV
n a diferentes voltajes
nnn
1
n a diferentes voltajes
nn
nn
nnn
1
nn
n
n
n
n
1Demostrar que:
n y n a diferentes voltajes
1
5001.0
10
50
mVm
n
e
V80
60
125.0mV
n e
Demostar que n =0,1 para límite Vm -50 mV
ntt ennnn /
0 )(
)()()(4/
0 Kmt
KK VVennnNgtI n
Ngk = 34 mS/cm2 VK = -74,2 mV
Descripción completa de los canales de K del axón de jibia
nn
Calcular la fracción de canales de potasio abiertos después de 5 ms de despolarizar desde -60 mV a 0 mV.
Calcular la fracción de canales de potasio abiertos si se mantiene la membrana por mucho tiempo a -60 mV.
Calcular la fracción de canales de potasio abiertos después de 1 ms de repolarizar desde 0 mV a -60 mV.