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JORLANA CATRINE CORRÊA FERREIRA

AVALIAÇÃO IN VITRO DA ATIVIDADE ANTI-

INFLAMATÓRIA DO ÓLEO ESSENCIAL DE Cyperus

articulatus L. EM MACRÓFAGOS

Santarém

2018

UNIVERSIDADE FEDERAL DO OESTE DO PARÁ

PRÓ-REITORIA DE PESQUISA, PÓS-GRADUAÇÃO E INOVAÇÃO TECNOLÓGICA

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM BIOCIÊNCIAS

JORLANA CATRINE CORRÊA FERREIRA

AVALIAÇÃO IN VITRO DA ATIVIDADE ANTI-

INFLAMATÓRIA DO ÓLEO ESSENCIAL DE Cyperus

articulatus L. EM MACRÓFAGOS

Dissertação apresentada ao Programa de Pós

Graduação em Biociências da Universidade

Federal do Oeste do Pará, como requisito para

obtenção do título de Mestre em Biociências.

Orientador: Prof. Dr. Waldiney Pires Moraes.

Coorientadora: Profa. Dra. Grazielle Ribeiro

Goes.

Santarém

2018

DEDICATÓRIA

A Deus, a Ele toda honra e glória.

À minha mãe, Maria Lusanira Cunha Corrêa, meu exemplo de mulher e de ser humano, que

sempre se dedicou e me apoiou durante meus estudos.

À minha avó, Lucimar Cunha Corrêa, in memoriam, pelos ensinamentos e palavras de

sabedoria.

AGRADECIMENTOS

A Deus, meu porto seguro e refúgio, que nunca me deixou esmorecer diante das

adversidades e sempre me fez (e faz) enxergar uma luz em meio à escuridão.

À minha família, pelo amor e apoio incondicionais. Aos meus pais, Maria Lusanira

Cunha Corrêa e Jorge Ivan Repolho Ferreira, pela compreensão nos momentos de ausência.

As minhas irmãs, Lanna Cristina Ferreira de Sousa e Luanna Caroline Corrêa Ferreira, pelo

incentivo e momentos de serenidade.

Ao meu orientador Waldiney Pires Moraes, pela oportunidade e confiança concedidas

a mim, e por não medir esforços para a concretização deste trabalho.

À Profa. Dra. Leda Quercia Vieira, por abrir as portas de seu laboratório para a

realização dos ensaios in vitro, e pelo acolhimento imensurável.

À minha co-orientadora, Grazielle Ribeiro Goes, pelos conhecimentos transmitidos a

mim, pela paciência e pelos diversos momentos que viabilizou e tornou possível a realização

deste trabalho.

À Profa. Dra. Tânia Mara Pires Moraes, pelo incentivo e palavras de sabedoria,

mesmo quando este trabalho representava um anseio inatingível.

Ao prof. Dr. Lauro E. S. Barata e a Me. Aline Aparecida Kasper, do Laboratório de

Pesquisa & Desenvolvimento de Produtos Naturais Bioativos, da Universidade Federal do

Oeste do Pará, pela contribuição para o desenvolvimento deste trabalho.

Ao José de Sousa Almeida Junior e Edén Bruno Sousa da Silva, pela parceria e auxílio

nas análises estatísticas.

Ao farmacêutico Daniel Jackson Pinheiro Costa, pela gentileza concedida a mim

durante uma fase de transição.

Aos meus amigos Jardel Araújo da Silva e Omero Martins, por tornarem essa jornada

mais leve.

A todos do Laboratório de Farmacologia, da Universidade Federal do Oeste do Pará,

pela contribuição para a consolidação deste trabalho.

A todos do Laboratório de Gnotobiologia e Imunologia, da Universidade Federal de

Minas Gerais, pela hospitalidade e aprendizado.

Aos colegas e professores do Programa de Pós-Graduação em Biociências, da

Universidade Federal do Oeste do Pará, pelo convívio e agregação de conhecimento.

E a todos que contribuíram direta ou indiretamente para a realização desta pesquisa:

muito obrigada!

“Todas as coisas cooperam para o bem daqueles que amam a Deus.”

Romanos 8:28

RESUMO

As plantas medicinais são uma das melhores fontes de compostos bioativos candidatos a

novos fármacos. Dentre elas, destaca-se a Cyperus articulatus L., nativa da Amazônia, na

qual o seu óleo essencial é amplamente empregado na medicina tradicional. Considerando as

aplicações etnofarmacológicas, este estudo tem como objetivo investigar a composição

química e avaliar a atividade anti-inflamatória do óleo essencial da Cyperus articulatus L

(OECA) em macrófagos. A análise da composição química do OECA foi realizada em um

cromatógrafo a gás Agilent, modelo HP-6890 equipado com um detetor seletivo de massas

Agilent, modelo HP-5975 utilizando uma coluna capilar HP-5MS. Macrófagos da linhagem

celular RAW 264.7 foram estimulados com LPS e IFN-γ, e em seguida, tratados com as

concentrações (250, 500 e 1000 µg/mL) do OECA para análise da viabilidade celular e

dosagem de mediadores inflamatórios (NO, IL-1β, TNF-α e PGE2). A viabilidade celular foi

realizada de acordo com o método MTT, a produção de NO pelo método de Griess, as

dosagens de IL-1β, TNF-α e PGE-2 foram quantificadas pelo método de ELISA. Os

resultados demonstraram que o OECA reduziu significativamente a produção de NO, TNF-α

e PGE2, nos grupos estimulados com LPS+INF-γ e tratados com as concentrações de 250,

500 e 1000 µg/mL do OECA. Os resultados dos níveis de IL-1β demonstraram que o OECA

promoveu uma redução significativa apenas no grupo estimulado com LPS+INF-γ e tratado

com a concentração de 1000 µg/mL do OECA. Foi observado também que o OECA não

promoveu efeito citotóxico em concentrações inferiores a 2000 µg/mL. A análise da

composição química indicou a presença de monoterpenos, sesquiterpenos e cetonas

sesquiterpênicas como constituintes majoritários do OECA. Os resultados obtidos indicam

que o tratamento com OECA exerce uma potente atividade anti-inflamatória e inibição de

importantes mediadores inflamatórios.

Palavras-chave: Inflamação, Cyperus articulaus L, óleo essencial, priprioca, citocinas.

ABSTRACT

Medicinal plants are one of the best sources of bioactive compounds that are candidates for

new drugs. Among them, stands out Cyperus articulatus L., native to the Amazon, in which

its essential oil is widely used in traditional medicine. Considering ethnopharmacological

applications, this study aims to investigate the chemical composition and to evaluate the anti-

inflammatory activity of the essential oil of Cyperus articulatus L (OECA) in macrophages.

Analysis of the chemical composition of OECA was performed on an Agilent gas

chromatograph, model HP-6890 equipped with an Agilent mass-selective detector, model HP-

5975 using an HP-5MS capillary column. Macrophage RAW 264.7 cells were stimulated with

LPS and IFN-γ, and then treated with OECA concentrations (250, 500 and 1000 µg/mL) for

analysis of cell viability and dosage of inflammatory mediators (NO, IL-1β, TNF-α e PGE2).

The cell viability was performed according to the MTT method, the NO production by the

Griess method, the IL-1β, TNF-α and PGE2 dosages were quantified by the ELISA method.

The results demonstrated that OECA significantly reduced the production of NO, TNF-α and

PGE2 in the LPS+INF-γ stimulated groups and treated with OECA concentrations of 250, 500

and 1000 µg/mL. Results of IL-1β levels demonstrated that OECA promoted a significant

reduction only in the LPS+INF-γ stimulated group and treated with the 1000 µg/mL

concentration of OECA. It was also observed that OECA did not promote cytotoxic effect at

concentrations lower than 2000 µg/mL. The analysis of the chemical composition indicated

the presence of monoterpenes, sesquiterpenes and sesquiterpene ketones as major constituents

of OECA. The results indicate that treatment with OECA exerts a potent anti-inflammatory

activity and inhibition of important inflammatory mediators.

Keywords: Inflammation, Cyperus articulaus L, essential oil, priprioca, cytokines.

LISTA DE FIGURAS

Figura 1 Priprioca 6

Figura 2 Formato dos rizomas da Priprioca 7

Figura 3 Migração de neutrófilos 9

Figura 4 Infecção e lesão celular 12

Figura 5 Ativação de TLR4 por LPS 16

Figura 6 Modelo de ativação de macrófagos 18

Figura 7A

Efeito de diferentes concentrações de OECA sobre a

viabilidade celular de macrófagos RAW 264.7 após 24 h de

tratamento

31

Figura 7B

Efeito de diferentes concentrações de OECA sobre a

viabilidade celular de macrófagos RAW 264.7 após 48 h de

tratamento

31

Figura 8

Efeito do OECA sobre a produção de nitrito em macrófagos

RAW 264.7 estimulados por INF-γ (50 UI/mL) e LPS (100

ug/mL)

32

Figura 9

Efeito do OECA sobre a Produção de TNF-α em macrófagos


ug/mL)

33

Figura 10

Efeito do OECA sobre a Produção de IL-1β em macrófagos


ug/mL)

33

Figura 11 Efeito do OECA sobre a Produção de PGE2 em macrófagos

RAW 264.7 estimulados por INF-γ (50 UI/mL) e LPS (100 35

ug/mL)

LISTA DE TABELA

Tabela 1 Composição química do óleo essencial de C. articulatus L 29

LISTA DE ABREVIAÇÕES E SIGLAS

AA Ácido araquidônico

AIEs Anti-inflamatórios esteroidais

AINEs Anti-inflamatórios não-esteroidais

APC Células apresentadoras de antígenos

COX Ciclooxigenase

CLRs Receptores de lectina tipo C

DMSO Dimetilsulfóxido

DMEM Dulbecco´s modified Eagle´s medium

eNOS Óxido nítrico sintase endotelial

GM-CSF Fator de estimulação de colônias de granulócitos-macrófagos

G-CSF Fator de estimulação de colônias de granulócitos

IFN—γ Interferon—γ

IL-1 Interleucina 1

IL-1β Interleucina-1β

IL-4 Interleucina 4

IL-6 Interleucina 6

IL-7 Interleucina 7

IL-13 Interleucina 13

iNOS Óxido nítrico sintase induzível

LT Leucotrienos

LPS Lipopolissacarídeo

LOX Lipoxigenases

MHC Complexo principal de histocompatibilidade

M-CSF Fator de estimulação de colônias de macrófagos

MTT Brometo de [3-(4,5-dimetiltiazol-2yl)-2,5-difenil tetrazolium

NF-kB Fator nuclear Kb

NLRs Receptores do tipo NOD

nNOS Óxido nítrico sintase neuronal

NO Óxido Nítrico

OECA Óleo essencial de Cyperus articulatus L.

OMS Organização Mundial de Saúde

PAF Fator ativador plaquetário

PAMPs Padrões moleculares associados a patógenos

PBS Tampão fosfato salino

PIs Prostaciclinas

PGs Prostaglandinas

PGE2 Prostaglandinas tipo-2

PRRs Receptores de reconhecimento de padrões

RLRs Receptores RIG-I-like

TLRs Receptores Toll-like

TXs Tromboxanos

SUMÁRIO

1. INTRODUÇÃO ---------------------------------------------------- 1

1.1. Produtos Naturais -------------------------------------------------- 1

1.2. Família Cyperaceae--------------------------------------------------- 4

1.3. Cyperus articulatus L. ----------------------------------------------- 5

1.4. Inflamação ------------------------------------------------------------- 8

1.4.1. Macrófagos ----------------------------------------------------------- 14

1.5. Mediadores Inflamatórios ------------------------------------------- 18

1.5.1. Citocinas-------------------------------------------------------------- 18

1.5.2. Eicosanóides ---------------------------------------------------------- 19

1.5.3. Óxido Nítrico -------------------------------------------------------- 20

2. JUSTIFICATIVA -------------------------------------------------- 22

3. OBJETIVOS--------------------------------------------------------- 22

3.1. GERAL --------------------------------------------------------------- 23

3.2. ESPECÍFICOS ------------------------------------------------------ 23

4. MATERIAL E MÉTODOS -------------------------------------- 24

4.1. Coleta e identificação do material vegetal------------------------- 24

4.2. Extração do OECA --------------------------------------------------- 24

4.3. Análise cromatográfica do OECA -------------------------------- 24

4.4. Drogas e soluções ---------------------------------------------------- 25

4.5. Modelos experimentais --------------------------------------------- 25

4.5.1. Cultura de macrófagos murinos RAW 264.7 -------------------- 25

4.5.2. Análise da viabilidade celular -------------------------------------- 26

4.5.3. Planejamento Experimental ----------------------------------------- 26

4.5.4. Dosagem de nitrito --------------------------------------------------- 27

4.5.5. Método ELISA para dosagem de IL-1β, TNF-α PGE2 ---------- 28

4.6. Análise Estatística -------------------------------------------------- 28

5. RESULTADOS ----------------------- ------------------------------ 28

5.1. Análise da composição química do OECA------------------------ 28

5.2. Análise da viabilidade celular -------------------------------------- 30

5.3. Avaliação da Produção de Nitrito em macrófagos RAW 264.7 32

estimulados com LPS + IFN-γ e tratados com OECA-----------

5.4. Produção de TNF-α por macrófagos RAW 264.7 estimulados

com LPS+IFN-γ e tratados com OECA ---------------------------

32

5.5. Produção de IL-1β por macrófagos RAW 264.7 estimulados

com LPS+IFN-γ e tratados com OECA-------------------

33

5.6. Produção de PGE2 por macrófagos RAW 264.7 estimulados

com LPS+IFN-γ e tratados com OECA

34

6. DISCUSSÃO ------------------------------------------------------------- 35

7. CONCLUSÃO ---------------------------------------------------- 44

8. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ------------------------- 45

1

1. INTRODUÇÃO

1.1. Produtos Naturais

Os produtos naturais, principalmente aqueles derivados de plantas, são utilizados

pela humanidade desde tempos imemoriais como fontes terapêuticas. A busca por alívio e

cura de enfermidades pela ingestão de ervas e folhas talvez tenham sido uma das primeiras

formas de utilização de produtos naturais. Até meados do século XIX, os recursos

terapêuticos eram pautados no uso empírico de plantas e extratos vegetais, porém, a partir de

1950, a flora medicinal foi substituída lentamente por medicamentos contendo substâncias

ativas dela extraída ou seus derivados sintéticos, impulsionado pelo interesse do homem no

isolamento de princípios ativos, dando início a uma nova fase de pesquisa envolvendo os

produtos naturais (SCHENKEL; GOSMANN; PETROVICK, 2003; VIEGAS; BOLZANI;

BARREIRO, 2006; CRAGG; NEWMAN, 2013).

Na busca por novos fármacos, os produtos naturais destacam-se pela diversidade

estrutural e, assim, as plantas são candidatas importantes para a prospecção de novos

compostos bioativos, e ao mesmo tempo, representam um desafio para a química

farmacêutica, farmacologia e bioquímica, no que diz respeito à elucidação dos componentes

ativos das plantas, bem como seus mecanismos de ação. Os produtos vegetais apresentam

uma vasta gama de atividades biológicas, que incluem analgésicas, anticonvulsivantes,

sedativos, anti-inflamatórios, anticoagulantes e antialérgicos (GIORDANI et al.,2008;

PEREIRA; CARDOSO, 2012; KATZ; BALTZ, 2016).

Dentre os produtos naturais, encontram-se as plantas medicinais, definidas como

vegetais que contém em sua estrutura compostos que podem ser empregados para finalidades

terapêuticas, e que são amplamente utilizadas na medicina tradicional. O uso de plantas

medicinais é uma prática comum entre a população mundial, e em algumas comunidades e

grupos étnicos, o conhecimento sobre essas plantas simboliza o único recurso (PUPO;

GALLO, 2007; FIRMO et al., 2011; GOMES; FIRMO;VILANOVA, 2014).

No Brasil, o emprego de plantas para resolução de problemas com a saúde está

presente desde antes da colonização, quando os índios já as utilizavam para a cura de doenças.

Tais conhecimentos ainda são transmitidos de geração para geração e praticados nos dias

2

atuais não apenas pelos indígenas, mas também pelas comunidades tradicionais como as

ribeirinhas e os quilombolas, e também nas populações contemporâneas (LIMA et al., 2012).

Segundo a Organização Mundial de Saúde (OMS), 80% da população mundial

recorrem à medicina tradicional para atender as suas necessidades primárias de assistência à

saúde, até mesmo nos países desenvolvidos, nos quais a população possui acesso fácil aos

medicamentos modernos, porém preferem o uso de plantas medicinais por razões históricas e

tradicionais. Em contrapartida, nos países em desenvolvimento 65%-80% da população

depende exclusivamente das plantas medicinais para os cuidados básicos, devido ao fácil

acesso e baixo custo (SIXEL; PECINALLI, 2005; VENDRUSCOLO; MENTZ, 2006;

AGRA; FREITAS; BARBOSA-FILHO, 2007).

Embora os fatores econômicos e sociais sejam os principais motivos para o uso das

plantas medicinais, principalmente, nas regiões menos favorecidas, eles não são os únicos.

Estudos relatam que outros fatores também influenciam o uso de medicamentos produzidos a

partir de matérias-primas vegetais, como a preferência dos consumidores por terapias naturais,

a falha dos medicamentos sintéticos no tratamento de doenças, aumento do volume de

informação acerca dos medicamentos fitoterápicos, automedicação, e principalmente, a busca

por alternativas terapêuticas com menos efeitos adversos e complicações decorrentes do uso

de medicamentos (RIBEIRO; MOURA, 2009; BRUNING; MOSEGUI; VIANNA, 2012).

Os efeitos adversos a medicamentos estão relacionados diretamente a não-adesão ao

tratamento medicamentoso dos pacientes, em especial, daqueles acometidos por doenças

crônicas como por exemplo, a artrite reumatoide, cujo tratamento requer terapia com

medicamentos anti-inflamatórios que comumente resultam em complicações gastrointestinais.

Dessa forma, estudos são necessários para a descoberta de fármacos que proporcionem

maiores benefícios clínicos e menos efeitos adversos, otimizando a terapia medicamentosa do

paciente, bem como sua qualidade de vida (DE MARTINO et al., 2017; SYNGLE et al.,

2017).

Para Simões et al. (1988) o conhecimento popular pode fornecer dados importantes

para descobertas científicas e resultar na aplicação de tais conhecimentos para o

desenvolvimento de novos fármacos. Adicionalmente, pesquisas evidenciam que é muito mais

provável encontrar atividade biológica em plantas a partir de uma orientação do seu uso

3

popular do que em plantas escolhidas ao acaso (VILLANUEVA; ESTEBAN;

VILLANUEVA, 2017).

Neste contexto, o interesse acadêmico sobre as informações etnofarmacológicas

aumentou após a constatação de que a base empírica, fruto do conhecimento repassado entre

gerações, pode resultar em comprovação científica, contribuindo assim para a desmistificação

na questão do uso de fitoterápicos, uma vez que esses medicamentos sofrem rejeição por parte

de alguns pacientes e prescritores por acreditarem que essa terapia medicamentosa é uma

prática do curandeirismo. Isto é evidenciado, com o crescente interesse, nos últimos anos, no

aproveitamento de recursos naturais, principalmente, no que se refere ao uso de plantas para

finalidades terapêuticas (VIEIRA et al., 2014; AKRAM; NAWAZ, 2017).

Este interesse por parte da comunidade científica ocasionou um avanço nos estudos

químicos e farmacológicos envolvendo plantas, que além do seu uso na medicina popular, tem

contribuído, ao longo dos anos, para a obtenção de novos fármacos, que até hoje estão

inseridos na prática clínica. Dentre eles, podemos citar a pilocarpina, alcalóide extraído de

folhas das plantas do gênero Pilocarpus sp., utilizada no tratamento do glaucoma; a

vincristina e vimblastina, ambas drogas antineoplásicas de origem vegetal (Catharanthus

roseus); a artemisinina, substância utilizada no tratamento da malária, obtida da espécie

Artemisia annua, dentre outras (GUERRA; NODARI, 2007; BRAGA, 2009; CRAGG;

NEWMAN, 2013).

Considerando a grande biodiversidade vegetal que detém o Brasil, com mais de

55.000 espécies catalogadas de um total estimado de 350-550.000, as plantas medicinais

brasileiras, principalmente da região amazônica, são consideradas altamente promissoras para

o desenvolvimento de novos fármacos. Entretanto, estudos sobre possíveis efeitos

terapêuticos dessas plantas ainda são escassos. Nesse contexto, a pesquisa de novos fármacos

oriundos de plantas medicinais é bastante promissora no Brasil, devido à vastíssima

biodiversidade brasileira e ainda ao baixo número de espécimes vegetais explorados na região

e que dispõe de grande potencial terapêutico (SIMÕES; SCHENKEL, 2002).

Um exemplo de destaque é a “priprioca’’ (Cyperus articulatus L), pertencente à

família Cyperaceae, a qual apresenta uma ampla distribuição geográfica no norte do Brasil, e,

atualmente, destaca-se por seu alto valor econômico e aplicação de seu óleo essencial à

4

indústria de cosméticos. O produto natural desta espécie, o óleo essencial, é muito utilizado na

medicina tradicional da Amazônia como anti-inflamatório, e ainda no tratamento de

enxaqueca, diarreia, malária, epilepsia, e outras moléstias, fatos estes, que justificam a

necessidade de pesquisa do óleo essencial desta espécie endêmica da Floresta Nacional do

Tapajós (FLONA TAPAJÓS) (ZOGHBI et al., 2008a).

Mesmo com sofisticados métodos de análises disponíveis, ainda existem lacunas no

conhecimento sobre a atividade biológica e da composição química dos princípios ativos da

grande maioria das plantas medicinais. Dentre as diversas famílias de plantas consideradas

como medicinais encontra-se a família das Cyperacea, na qual estudos evidenciam que muitos

óleos essenciais isolados desta família têm demonstrado exercer atividade biológica, o que

motivou a investigação de sua atividade farmacológica em modelo experimental in vitro, a

partir de informações da medicina tradicional, focada na avaliação da atividade anti-

inflamatória da priprioca (SAKLANI; KUTTY, 2008).

1.2. Família Cyperaceae

A família Cyperaceae é composta por cerca de 5.000 espécies e 104 gêneros. É a

terceira maior das plantas monocotiledôneas, após gramíneas e orquídeas, e é muito

conhecida nos sistemas tradicionais da medicina. São plantas herbáceas, de pequeno porte,

cosmopolitas, encontrada, principalmente, associada às formações vegetais mal drenadas,

como brejos e margens de rios. Esta família divide-se em duas subfamílias, são elas:

Mapanioideae e Cyperoideae (MUASYA et al., 2008; KAKARLA; KATRAGADDA,

BOTLAGUNTA, 2015; ROCHA et al., 2016).

A subfamília que apresenta uma quantidade maior de gêneros é a Cyperoideae, com

91 gêneros, e os demais estão incluídos na subfamília Mapanioideae. No Brasil as Cyperaceae

estão bem representadas, com aproximadamente 670 espécies e 39 gêneros, distribuídos em

todas as regiões do país. Estes números representam quase 15% do total de espécies e 40% do

total de gêneros da família encontrados no mundo (SIMPSON et al., 2007).

5

Das cinco regiões geográficas do Brasil, a mais rica em número de gêneros é a região

norte, com 34 gêneros. Na região amazônica, dentre as espécies, destaca-se a Cyperus

articulatus L, pertencente ao gênero Cyperus e subfamília Cyperoideae (ALVES et al., 2009).

1.3. Cyperus articulatus L.

A Cyperus articulatus L, conhecida vulgarmente como priprioca ou piri-piri,

pertence à família Cyperaceae que são geralmente ervas perenes, rizomatosas, cosmopolitas,

com corpo vegetativo constituído por raízes, folhas e escapo triangular em secção transversal

(Figura 1) (JUDD et al., 2009; SANTOS et al., 2012).

A priprioca tem distribuição nas Américas tropical e subtropical, apresenta rizoma

endurecido, com lâmina foliar ausente, com tubérculos cobertos por brácteas avermelhadas. É

uma espécie herbácea aromática, considerada como uma planta rústica e apresenta tolerância

a solos ácidos, típicos na Amazônia; quanto à reprodução, é predominantemente assexuada,

viabilizada sob o ponto de vista agronômico pela divisão dos tubérculos, já que a reprodução

através de sementes é mínima, pois menos de 5% das sementes formadas são viáveis

(ROCHA, 2008; CASTELLANI et al., 2011).

Esta espécie destaca-se pela produção do óleo essencial amarelo intenso, de interesse

econômico na confecção de perfumes e fragrâncias na indústria cosmética, devido seu odor

forte e agradável. Há relatos, de que o uso do óleo essencial desta espécie na perfumaria seria

uma prática milenar, como no caso das mulheres egípcias que perfumavam os adornos dos

cabelos utilizando a fragrância obtida dos tubérculos de C.articulatus (ZOGHBI et al.,

2008a).

6

Figura 1: Priprioca. Fonte: Zoghbi et al., 2005

Segundo Simões et al. (1999), os óleos essenciais são compostos voláteis,

caracterizados por serem misturas complexas de diversos compostos, conferindo aromas

agradáveis e sabores característicos. São metabólitos secundários e instáveis, principalmente,

na presença de luz, calor, umidade, ar e metais, e em temperatura ambiente, apresentam-se

como líquidos oleosos de alta volatilidade, o que os difere dos óleos fixos. Quanto à estrutura

química, são basicamente formados por oxigênio, carbono e hidrogênio, entretanto, sua

composição química é bastante variada, podendo ser formada de derivados fenilpropanóides e

terpenóides, preponderando o último com aproximadamente, 90% da composição química dos

óleos essenciais, destacando-se os monoterpenos e sesquiterpenos (BAKKALI et al., 2008).

Os rizomas da priprioca destacam-se por ser a parte da planta que apresenta uma maior

concentração do óleo essencial (figura 2). Segundo Zoghbi et al. (2005) alguns fatores podem

ocasionar variação na composição química deste óleo, como as práticas agronômicas, período

do plantio e diferentes tempos de colheita, sendo recomendado o plantio no início da época

chuvosa e a colheita na estação do verão devido ao maior estresse da planta no período da

seca, e consequentemente, índices mais elevados no rendimento de seu óleo essencial.

Em trabalhos iniciais, Couchman et al. (1964) identificaram a presença de mirtenal,

mirtenol e articulona a partir da caracterização química do óleo essencial de C.articulatus.

Nyasse et al. (1988) identificaram a presença de mustacona, corimbolona e álcool α-

corimbolol. Zoghbi et al. (2008a) relataram predominância de compostos terpênicos do óleo

7

essencial de C.articulatus cultivados no Pará e os principais componentes químicos foram α-

pineno, mustacona e óxido de cariofileno.

No Brasil, com a recente introdução do óleo essencial da priprioca na indústria

cosmética, o cultivo da espécie C.articulatus elevou-se, principalmente, no estado do Pará,

representando uma fonte de renda aos agricultores da região, que já forneciam o produto às

empresas locais para a composição de fragrâncias e banhos aromáticos tradicionais,

principalmente, no período de festas juninas (ROCHA, 2008; ZOGHBI et al.,2008b).

O interesse pelos óleos essenciais está baseado não somente na possibilidade de

obtenção de compostos aromáticos, mas também daqueles possuidores de efeitos

farmacológicos, já que apresentam uma larga tradição de uso como agentes medicinais. Em

diversas partes do mundo, a Cyperus articulatus é utilizada na medicina tradicional para o

tratamento de várias doenças como epilepsia, malária, enxaqueca e outras. Dentre essas

finalidades terapêuticas, várias já foram comprovadas por diversos autores, como atividade

antimicrobiana (DESMACHELIER et al., 1996; OLADUSU et al., 2011), propriedade

anticonvulsivante (BUM et al., 2003), atividade antiparasitária (METUGE et al., 2014) e

atividade antioxidante (DESMACHELIER et al., 1997). No entanto, o papel anti-inflamatório

dessa espécie tão importante da região amazônica ainda tem sido pouco explorado pelos

pesquisadores, apesar de seu vasto uso pela medicina popular.

Figura 2: Formato dos rizomas da priprioca. Fonte: Gordon-Gray et al., 2006

8

1.4. Inflamação

A inflamação é uma resposta de defesa a estímulos agressivos que envolvem uma

série de alterações bioquímicas, fisiológicas e imunológicas, as quais o organismo recorre

para localizar, inativar e destruir o agente agressor, além de promover a cicatrização e

reparação do tecido danificado. Em termos moleculares, refere-se ao processo de

recrutamento de leucócitos e proteínas plasmáticas, seguida do seu acúmulo nos tecidos que

auxiliam na defesa e remoção do estímulo lesivo (KULKARNI et al., 2016; VILLANUEVA;

ESTEBAN; VILLANUEVA, 2017).

É desencadeada após dano celular causado por agentes patogênicos (vírus, bactérias,

parasitas), agentes físicos (radiação, trauma, queimaduras), químicos (toxinas) e reações

imunológicas, e apresenta como sinais clínicos característicos rubor, calor, edema, dor e

prejuízo funcional, resultantes dos fenômenos vasculares e celulares do processo inflamatório

(JEONG et al., 2013; RIBEIRO et al., 2015).

Durante o processo inflamatório diversas vias intra e intercelulares são ativadas no

sentido de recuperar e manter o equilíbrio homeostático. Neste processo, a participação das

células (neutrófilos, monócitos, linfócitos, células dendríticas) do sistema imune é

fundamental, bem como a ativação das vias inflamatórias e liberação dos mediadores

inflamatórios (PARISI et al., 2017).

A inflamação ocorre em duas fases distintas: aguda e crônica. A primeira, fase

aguda, apresenta início imediato e duração relativamente curta, nela predomina fenômenos de

aumento da permeabilidade, vasodilatação e migração de leucócitos, predominantemente

neutrófilos, por meio da ativação das células endoteliais. Essa fase tem como objetivo

principal a eliminação do agente, porém se ele persistir, a inflamação poderá evoluir para a

segunda fase, a crônica. Diferentemente da aguda, a fase crônica tem início tardio e duração

maior, com predomínio de macrófagos, com formação de tecido conjuntivo e angiogênese

(TABAS; GLASS, 2013; RIBEIRO et al., 2015).

Na fase aguda, os neutrófilos são as primeiras células a responder, migrar para o

local da inflamação e fagocitar o micro-organismo. Eles migram para o local lesionado,

aderindo-se às células endoteliais através das moléculas de adesão expressas (selectinas,

9

integrinas, moléculas de adesão intercelular), e em seguida, migram em direção ao espaço

extravascular atraídos pelos agentes quimiotáticos, conforme figura 3. No final deste

processo, os neutrófilos sofrem apoptose e promovem a entrada de monócitos, que se

diferenciarão em macrófagos, para o local lesionado. Neste processo, três dos cinco sinais

cardinais da inflamação são manifestados: calor e rubor, consequência do aumento do fluxo

sanguíneo local, e o edema, formado por exsudato, proveniente do extravasamento das

proteínas plasmáticas e recrutamento dos leucócitos circulantes (HAJISSHENGALLIS, G.;

CHAVAKIS, T.; HAJISSHENGALLIS, E.; LAMBRIS, J., 2015; LIM; GRINSTEIN; ROTH,

2017; TENG, T; JI, A.; JI, X.; LI, Y., 2017).

Figura 3: Migração de neutrófilos - o processo de migração dos neutrófilos é caracterizado

pela adesão dessas células no revestimento endotelial das vênulas pós-capilares, seguida do

movimento através do endotélio e da membrana basal. Trata-se de uma sequência de

interações entre neutrófilos e o endotélio vascular, mediada por moléculas de baixa

(selectinas) e alta (integrinas) afinidade e envolve etapas distintas: ancoragem e rolamento,

adesão, rastejamento e transmigração. Fonte: Adaptado de Kolaczkowska e Kubes, (2013).

Apesar de os neutrófilos serem consideradas células de curta duração, estudos

demonstram que eles permanecem na circulação por um tempo maior, e que a própria

inflamação aumentaria sua vida útil. Essa condição seria possível devido à presença de

citocinas, como o fator de necrose tumoral (TNF), por exemplo, no processo inflamatório que

impediriam a apoptose dos neutrófilos, prolongando assim sua vida útil. Um tempo de vida

10

mais longo dessas células pode permitir uma atuação mais complexa na resolução da

inflamação, e eventualmente, na modulação da resposta imune adaptativa (PILLAY et al.,

2010; KOLACZKOWSKA; KUBES, 2013; PIETROSIMONE; LIU, 2015).

Geralmente o processo inflamatório é desencadeado com o intuito de proteger o

organismo, agindo no local e restringindo a extensão do dano tecidual, mas ocasionalmente

ele pode evoluir de maneira inadequada tornando-se prejudicial, consequência de uma

inflamação extensiva, prolongada ou não regulada. Isso pode ocorrer quando a resposta

inflamatória extravasa os limites do seu microambiente, perdendo o controle homeostático e

manifestando-se de modo sistêmico no organismo. Exemplo disso é a sepse, caracterizada

como uma síndrome decorrente de uma resposta desequilibrada do hospedeiro a uma infecção

(FANGKRATHOK; JUNLATAT; SRIPANIDKULCHAI, 2013; KULKARNI et al., 2016;

VAN DER POLL et al., 2017).

Em outras condições, os mecanismos de defesa da reação inflamatória podem ser

desencadeados de maneira inapropriada em resposta a outros tipos de agentes não

patogênicos, como substâncias estranhas inócuas (pólen) ou ainda contra as substâncias

endógenas do organismo. Nessas circunstâncias, a própria inflamação pode ocasionar lesão,

tanto na forma aguda, como por exemplo, na anafilaxia, ou na forma crônica, como por

exemplo, na artrite reumatoide. Por conta disso, as respostas inflamatórias são consideradas

críticas para a patogênese de doenças autoimunes. Além das doenças autoimunes, estudos

vêm demonstrando o envolvimento da inflamação como causa de dano tecidual e patogênese

de diversas doenças, tais como, doença de Alzheimer, doença renal e acidente vascular

encefálico (GLASS; SAIJO, 2010; KAHLENBERG; KAPLAN, 2013; PINEGIN;

VOROBJEVA; PINEGIN, 2015; KIMURA; ISAKA; YOSHIMORI, 2017).

O conhecimento dos mecanismos de defesa que o organismo utiliza contra micro-

organismos são mediados por reações das imunidades inata e adaptativa. A resposta inata é

ativada imediatamente após uma infecção ou lesão e é considerada a primeira linha de defesa

do hospedeiro contra micro-organismos. Os mecanismos celulares e bioquímicos envolvidos

neste tipo de reação estão presentes no organismo antes do contato com o patógeno e

respondem da mesma maneira a infecções repetidas (DESMET; ISHII, 2012; NOREEN et al.,

2012).

11

O sistema imune inato depende de componentes solúveis e células efetoras-

neutrófilos, macrófagos, células dendríticas e células natural killer (NK) - para controlar uma

infecção. Essas células são caracterizadas pela capacidade de fagocitar e eliminar os

patógenos, reconhecendo-os através de receptores de reconhecimento de padrões (PRRs) que

interagem com os PAMPs (padrões moleculares associados a patógenos) presentes na

superfície dos micróbios. Esses PRRs também podem detectar os DAMPs (padrões

moleculares associados a dano), moléculas liberadas por células hospedeiras danificadas,

provenientes de injúria celular, como por exemplo, em lesões de trauma ou queimaduras. O

resultado desta interação é a produção e secreção de mediadores inflamatórios, iniciando o

que chamamos de cascata inflamatória, como mostra a figura 4 (ZHANG et al., 2010;

KRISHNA; MILLER, 2012; RICHMOND; HARRIS, 2014; YEH et al., 2016; SAYOUR;

MITCHELL, 2017).

Esses eventos contribuem para a ativação da resposta imunológica adaptativa, que

somente é desencadeada após o reconhecimento do patógeno pelo sistema imune inato.

Consiste em um conjunto de reações específicas contra um determinado patógeno invasor,

auxiliando e tornando mais eficiente a resposta imune inata. A imunidade adaptativa possui

como componentes fundamentais os linfócitos T e B, os quais realizam o reconhecimento dos

patógenos por meio dos receptores de antígenos que estão distribuídos na superfície dessas

células, diferentemente do outro sistema, que o faz através de PRRs (TAKEUCHI; AKIRA,

2010; GABRIELLI et al., 2016).

A resposta imunológica adaptativa pode ser dividida em imunidade humoral e

celular. A primeira é mediada por anticorpos produzidos por células B, que desempenham a

função de reconhecer e neutralizar os antígenos extracelulares, promovendo a eliminação dos

micro-organismos através de mecanismos efetores. Já a imunidade celular é mediada pelas

células T, caracterizada pela capacidade de eliminar os patógenos fagocitados, já que os

anticorpos não possuem a eficácia de neutralizar os micro-organismos intracelulares

(SÁNCHEZ-TRUJILLO et al., 2017).

12

Figura 4: Infecção e lesão celular: resultam na produção de PAMPs e DAMPs,

respectivamente, desencadeando uma resposta inflamatória através dos TLRs localizados na

membrana celular e endossomas, seguida da ativação de transcrição nuclear do NFқB.

Adaptado de Brennan et al., (2010).

Os mecanismos envolvidos na resposta inflamatória são fundamentais para o

desenvolvimento de novos fármacos anti-inflamatórios. Segundo Tak e Firestein (2001) as

formas utilizadas pelo organismo para cessar a inflamação incluem respostas celulares e

imunológicas, que podem ser iniciadas utilizando compostos anti-inflamatórios cuja atuação

está baseada na inibição de componentes inflamatórios ou fatores de transcrição ativadores.

Dentre as classes de medicamentos para tratamento de doenças inflamatórias, os anti-

inflamatórios não-esteroidais (AINEs) são os mais utilizados para o manejo dessas patologias.

Os AINEs estão entre os medicamentos mais usados no mundo, e diariamente, mais de 30

milhões de pessoas utilizam esses fármacos para alívio de dor de cabeça, artrite e outras

condições. No Brasil encontram-se facilmente disponíveis como analgésico de venda livre, o

que representa um risco à saúde do paciente, quando em situação de uso prolongado sem

supervisão, e principalmente, devido aos efeitos adversos inerentes ao uso desses

medicamentos (AL-SAEED, 2011).

13

Geralmente, todos os AINEs podem causar efeitos indesejáveis devido ao próprio

mecanismo de ação desses fármacos, ou seja, a inibição da cicloxigenase. Acredita-se que

esses efeitos resultem particularmente da inibição da COX-1, enzima constitutiva, presente na

maioria dos tecidos, responsável pela formação de pequenas quantidades de prostaglandinas

necessárias para a homeostase. Dentre os efeitos adversos mais comuns dos AINEs incluem

sangramento gastrointestinal, alterações nas funções cardiovascular e renal, e ainda, as

complicações mais graves como hemorragia, perfuração ou morte que ocorrem com uma

incidência de aproximadamente 2% ao ano, chegando até 10% ao ano em usuários de alto

risco (pacientes idosos ou em uso concomitante de corticosteroides e/ou anticoagulantes)

(UNGPRASERT et al., 2016).

Outra classe importante utilizada para o tratamento de doenças inflamatórias são os

anti-inflamatórios esteroidais (AIEs) que reduzem os efeitos pró-inflamatórios do ácido

araquidônico, atuando diretamente em receptores nucleares de esteroides que alteram a síntese

de mRNA e proteínas, inibindo a produção de importantes fatores de transcrição nuclear

envolvidos no processo inflamatório, como o NF-kB. Além disso, esses medicamentos

reduzem os níveis de citocinas inflamatórias, inibem a ativação da enzima fosfolipase A2, e

ainda, regulam negativamente a secreção de células pró-inflamatórias. Causam

imunossupressão devido à redução dos linfócitos no sangue periférico, e por conta disso,

também são drogas empregadas no manejo de doenças que envolvem mecanismos imunes

(LAW et al., 2015; WESTERGAARD et al., 2015).

Dexametasona, hidrocortisona e prednisona são exemplos de fármacos esteroidais

(glicocorticoides) altamente eficazes no controle de diversas doenças inflamatórias. Esses

medicamentos exercem ação mais ampla que os AINEs devido à inibição de inúmeras vias de

sinalização envolvidas no processo inflamatório, porém os AIEs apresentam vários efeitos

adversos, assim como os AINEs, e uma exposição sistêmica prolongada pode resultar em

diversas alterações fisiológicas, como miopatia, retenção de líquido, estado cushingoide,

osteoporose e diabetogênese (UINGS et al., 2013).

Embora o mercado farmacêutico disponha de uma diversidade de medicamentos anti-

inflamatórios, ainda não há um ideal, de menor toxicidade e com baixa incidência de efeitos

adversos. Tal situação estimula a busca por novas moléculas que deem origem a fármacos

14

mais seguros e com menos efeitos adversos e que possam ser inseridos na prática clínica para

o tratamento da inflamação (COUTINHO; MUZITANO, COSTA, 2009; IBRAHIM et al.,

2012).

1.4.1. Macrófagos

Os macrófagos são células essenciais na imunidade inata e sua atuação é

fundamental na resposta inflamatória e defesa do hospedeiro. Considerados como mediadores

centrais do sistema imunológico contribuem tanto para iniciação quanto para a resolução da

inflamação. Diferente dos neutrófilos, os macrófagos são células dominantes do estágio tardio

da inflamação. São classificadas como fagócitos mononucleares, cujo precursor, o monócito,

origina-se na medula óssea, circulam no sangue, e são ativados nos tecidos. Os monócitos são

derivados de uma célula precursora comum da linhagem mielóide na medula óssea e sua

diferenciação é dirigida pelos fatores de estimulação de colônias (CSFs), também

denominados de fatores de crescimento hematopoiéticos. Foram descritos três tipos de CSFs:

o fator estimulador de colônia de granulócitos/macrófagos (GM-CSF), fator estimulador de

colônia de granulócitos (G-CSF) e fator estimulador de colônia de macrófagos (M-CSF),

sendo o último específico para a promoção da sobrevivência, proliferação, diferenciação e

ativação da linhagem de macrófagos (SICA; MANTOVANI, 2012; ZIMMERMANN;

TRAUTWEIN; TACKE, 2012; LIU; YANG, 2013; BAGYINSZKY et al., 2017).

Além dos macrófagos provenientes dos monócitos, há uma população com

denominações específicas conforme sua localização, os chamados macrófagos residentes. Por

exemplo, no fígado, são denominados de células de Kupffer, no pulmão são chamados de

macrófagos alveolares, nos rins denominados de células mesenquiais, no sistema nervoso

recebe a designação de células microgliais, e entre outros. Diferentemente dos macrófagos

“inflamatórios”, que migram para o tecido quando há uma infecção ou dano celular, esses

macrófagos encontram-se amplamente distribuídos no organismo e desempenham funções

fisiológicas distintas de acordo com o tecido em que residem (RANG et al., 2007;

TORROELLA-KOURI; RODRÍGUEZ; CASO, 2013).

15

Assim como as células que atuam no sistema imune inato, os macrófagos

reconhecem os micro-organismos através dos PRRs, que detectam os PAMPs ativando a

resposta inflamatória. Os PAMPs são componentes altamente conservados e comuns à classe

de agentes patogênicos (bactérias, fungos, vírus), como por exemplo, o LPS

(lipopolissacarídeo) e o peptidioglicano, constituinte da membrana externa das bactérias

gram-negativas e componente da parede celular da maioria das bactérias, respectivamente

(DE LA FUENTE-NÚNEZ, et al., 2017; VAN DER POLL et al., 2017).

Atualmente, quatro famílias de PRRs foram identificadas: receptores Toll-like

(TLRs), receptores de lectina tipo C (CLRs), receptores do tipo NOD (NLRs) e receptores

RIG-I-like (RLRs). Os macrófagos expressam diversos PRRs, e a maioria pertence à família

de receptoresToll-like (TLRs). Essa família detecta patógenos invasores e desempenha papel

essencial para o início da resposta imune inata com subsequente ativação de uma resposta

imune adaptativa. Cada um desses receptores apresenta três domínios: o domínio de interação

com o ligante, o domínio transmembranar e o domínio de sinalização, denominado Toll/IL-1R

(TIR). Os TLRs são classificados em 11 tipos de acordo com sua especificidade de ligante,

incluindo bactérias, fungos, protozoários e vírus. Alguns desses receptores (TLR3, -7, -8 e, -9)

encontram-se no compartimento endossomal/lissossômico, ou seja, no interior da célula, e

outros TLRs (TLR1, -2, -4, -5 e -6) estão localizados na membrana celular externa

(BRENNAN; LUNSFORD; KUO, 2010; NOREEN et al., 2012).

Como demonstrado na figura 5, o TLR4, presente na superfície dos macrófagos,

reconhece o LPS bacteriano e leva à ativação de vias de sinalização intracelular. Este

reconhecimento se dá, primeiramente, pela ligação do LPS a uma proteína solúvel (LBP), que

forma o complexo LPS-LBP. Esse complexo liga-se à outra proteína, CD14, e em seguida, é

apresentada ao TLR4, em estreita associação a outra proteína, MD2, presente na superfície

celular. O complexo CD14/TLR4/MD2 desencadeia a cascata de sinalização intracelular

levando à ativação de diferentes fatores de transcrição. Dentre os principais reguladores

transcricionais destacam-se o fator nuclear kB (NF- kB) e proteína ativadora 1 (AP-1), ambos

estimulam a expresão de citocinas pró-inflamatorias TNF-α (fator de necrose tumoral) , IL-1

(interleucina-1), IL-6 (interleucina- 6), quimiocinas, bem como outros mediadores

inflamatórios que atuam nas células endoteliais provocando a expressão de moléculas de

adesão e aumento da permeabilidade vascular, além do recrutamento de células sanguíneas

16

para o tecido inflamado. Outros fatores de transcrição também participam da sinalização

intracelular, como o fator regulador de interferon 3 (IRF-3) e o fator regulador de interferon 7

(IRF-7), que promovem a produção de interferons de tipo I, importantes nas respostas imunes

inatas virais (PEEK; FISKE; WILSON, 2010; MATSUI et al., 2012).

Figura 5: Ativação de TLR4 por LPS – O complexo LPS-LBP-CD14 induz a dimerização de

TLR4, levando a ativação de diversas vias de sinalização e fatores de transcrição que induzem

a expressão de genes que levam à produção de citocinas pró-inflamatórias e desenvolvimento

de respostas antivirais. Fonte: Adaptado de Bohannon et al., (2013) e Płóciennikowska, et al.,

(2015)

O reconhecimento inicial do patógeno realizado pelos macrófagos provoca a ativação

dessas células e produção de diversos mediadores inflamatórios, incluindo aminas vasoativas,

eicosanóides e produtos de cascatas proteolíticas. O efeito imediato destes mediadores é a

obtenção do exsudato inflamatório, seguido de proteínas plasmáticas e migração de leucócitos

para o espaço extravascular, decorrente da expressão de moléculas de adesão (selectinas,

ICAM-1 e VCAM-1), que contribuem para a amplificação da resposta protetora contra o

micro-organismo (MEDZHITOV, 2008).

17

Os macrófagos são considerados fagócitos profissionais, e uma vez ativados ligam-se

ao patógeno e os fagocitam. Vários mecanismos estão envolvidos nesse processo, seja na

resposta imune inata ou na adaptativa, dentre eles incluem a geração enzimática de espécies

reativas de oxigênio e nitrogênio, ativação via receptores Fc de anticorpos e receptores para

componentes do sistema complemento (JENKINS; HUME, 2014; LAUVAU et al., 2014).

A ativação dos macrófagos também pode ser desencadeada pela expressão de IFN-γ,

produzida pelos linfócitos T ativados, que potencializa a ação fagocítica dessas células, sendo

fundamental via de ativação na resposta imune adaptativa. Dessa forma, essas células

desempenham a função de apresentação de antígeno ao linfócito T, via expressão de

moléculas de MHC (complexo principal de histocompatibilidade) sendo assim designada

como célula apresentadora de antígeno (APC)(TORROELLA-KOURI; RODRÍGUEZ;

CASO, 2013).

O macrófago é uma célula caracterizada por sua diversidade e plasticidade. Diversos

sinais (por exemplo, células danificadas, produtos microbianos) podem levar à sua ativação,

conferindo assim fenótipos diferentes a essas células. Essa ativação se dá por duas vias

distintas: via clássica (M1) e a via alternativa (M2). A primeira é mediada por estímulos como

IFN-γ, receptores TLR e lipopolissacarídeo (LPS), enquanto que a via alternativa é mediada

pela interleucina-4 (IL-4) e interleucina (IL-13). Estes estados espelham a polarização Th1-

Th2 das células T, como demonstrado na figura 6. O fenótipo M1 está envolvido com a

resposta inflamatória, e consiste na expressão de citocinas pró-inflamatórias, produção de

óxido nítrico, além de forte atividade microbicida. Já o fenótipo M2 está envolvido com a

remodelação tecidual, progressão tumoral e função imunorreguladora, e atuam como resposta

de “feedback” terminando com a inflamação, na tentativa de restaurar a homeostase do tecido

(SICA; MANTOVANI, 2012; LOCATI; MANTOVANI; SICA, 2013).

Como célula majoritária na fase crônica da inflamação, os macrófagos atuam no

remodelamento dos tecidos após infecções e lesões, produzindo fatores de crescimento para

fibroblastos e células endoteliais, fundamentais para a promoção do reparo tecidual,

angiogênese e fibrose (RANG et al., 2007).

18

Figura 6: Modelo de ativação de macrófagos: via clássica M1(a) e via alternativa M2 (b).

Fonte: Martinez et al., 2009.

1.5. Mediadores Inflamatórios

Os mediadores inflamatórios atuam no sentindo de influenciar e amplificar a resposta

inflamatória. Quanto a sua origem, podem ser derivados de proteínas plasmáticas, secretados

por células, ou ainda podem ser pré-formados e armazenados nos grânulos de leucócitos. Os

principais são os seguintes: citocinas, eicosanoides e óxido nítrico (RANG et al., 2007).

1.5.1. Citocinas

As citocinas são reguladores peptídicos sintetizados e liberados por células do

sistema imune, principalmente os macrófagos. Realizam a intercomunicação celular por

mecanismos parácrino e autócrino influenciando na atividade, diferenciação, proliferação e/ou

ativação das células imunológicas. Sua atuação é feita, na grande maioria, através dos

receptores ligados a quinases, responsáveis pela cascata de fosforilação relacionada à

expressão gênica via fator nuclear kB (NF- kB), resultando no estímulo da célula-alvo.

Algumas citocinas, além de sua ação direta sobre as células, também potencializam a

inflamação e induzem à formação de outros mediadores inflamatórios (OLIVEIRA et al.,

2011; YEOM et al., 2015).

19

Esses mediadores estão agrupados em interleucinas (IL), fatores de necrose tumoral

(TNF), quimiocinas, interferons (IFN) e fatores de crescimento. Consideradas como citocinas

pró-inflamatórias, o TNF-α e a IL-1, são as principais citocinas primárias envolvidas no

processo inflamatório. O TNF-α é secretado por macrófagos, linfócitos ou monócitos, cujo

principal estímulo para a produção é o LPS, e uma vez secretado promove o recrutamento dos

neutrófilos e monócitos para o local da infecção, além de ocasionar vasodilatação, à nível

endotelial, e estimular a secreção de quimiocinas. As quimiocinas são consideradas citocinas

quimioatraentes, devido sua ação quimiotáxica que regula a migração dos leucócitos durante

as reações inflamatórias, e diferente das outras citocinas, atuam nos receptores acoplados à

proteína G. Nos macrófagos, o TNF-α age potencializando a fagocitose, bem como a

produção de outras citocinas pro-inflamatórias e prostaglandina E2 (PGE2) (VITALE;

RIBEIRO, 2007; KIM; MOUDGIL, 2017).

A IL-1 desempenha funções similares ao TNF e é secretada por macrófagos ou

leucócitos ativados e compreende uma família de três citocinas: dois agonistas (IL-1α e IL-

1β) e um antagonista do receptor IL-1 (IL-1AR), esse último atua como regulador endógeno.

A principal forma biologicamente ativa secretada é a IL-1β, responsável pela ativação da

ciclooxigenase-2, produção de óxido nítrico, substância-P e moléculas de adesão endotelial

(COUTINHO; MUZITANO, COSTA, 2009; OLIVEIRA et al., 2011; ARANGO DUQUE;

DESCOTEAUX, 2014).

As citocinas também desempenham função regulatória na inflamação. Como por

exemplo, a IL-10, citocina anti-inflamatória que pode inibir a geração de reações pró-

inflamatórias, bem como a ativação de macrófagos e produção de quimiocinas. É importante

ressaltar que as citocinas são essenciais na condução da resposta inflamatória, entretanto, a

produção exagerada de citocinas pró-inflamatórias pode resultar em patologias, tais como

desequilíbrio hemodinâmico e distúrbios metabólicos (OLIVEIRA et al., 2011; WYNN;

VANNELLA, 2016).

1.5.2. Eicosanóides

20

Como consequência de estímulos inflamatórios (físicos, mecânicos, bacterianos e/ou

mediadores), os fosfolipídios das membranas celulares liberam o ácido araquidônico (AA), a

partir da ativação da enzima fosfolipase A2

(PLA2). O AA pode ser metabolizado pelas vias

das cicloxigenases (COX-1 e COX2) e das lipoxigenases, cujo produto do metabolismo

denomina-se eicosanóides. São considerados um dos principais mediadores na inflamação, e

também moduladores de vários processos fisiológicos. Pela via das cicloxigenases, originam-

se as prostaglandinas (PGs), prostaciclinas (PIs) e os tromboxanos (TXs), e pela via das

lipoxigenases (LOX) são sintetizados os leucotrienos (LT) e lipoxinas (ANDRADE; DO

CARMO, 2006; LIMA et al.,2008).

A isoforma 1 da cicloxigenase (COX-1) está presente na fisiologia normal e atua

como reguladora homeostática e está presente de maneira constitutiva na maioria das células.

Já a isoforma 2 (COX-2) é expressa após estímulo das células migratórias ou tecidos

danificados durante os eventos inflamatórios, gerando a produção de diversos prostanóides.

Os principais envolvidos na inflamação são PGD2, PGE2, PGF2α, PGI2 e TXA2, com destaque

para PGE2 considerada o principal metabólito do ácido araquidônico, além disso, pode ser

expressa pela maioria das células (ANDRADE; DO CARMO, 2006; YEDGAR et al., 2007).

Os prostanóides desempenham diversas funções durante a reação inflamatória e suas

principais ações são: vasodilatação, inibição plaquetária, aumento da permeabilidade vascular,

sinergismo com outros mediadores, ação pirogênica e potencialização dos efeitos álgicos da

bradicinina e histamina. Essa última ação, estimula as fibras nervosas do tipo C, provocando a

dor, sinal cardinal da inflamação. Os eicosanóides desempenham importante participação no

processo patológico da inflamação, e por conta disso, a supressão de suas ações tornaram-se

um dos principais alvos terapêuticos no desenvolvimento de fármacos anti-inflamatórios

(YEDGAR et al., 2007).

1.5.3. Óxido Nítrico

O óxido nítrico é um radical solúvel gasoso de curta duração, sintetizado a partir de L-

arginina e oxigênio molecular por um grupo de enzimas denominadas óxido nítrico sintetase

(NOs). São conhecidas três isoformas: duas isoformas constitutivas endotelial e neuronal

21

(eNOS e nNOS, respectivamente), e uma isoforma induzível (iNOS). As isoformas

constitutivas estão presentes em condições fisiológicas no organismo, já a induzível é

expressa pelas células inflamatórias em resposta a diversos estímulos, como citocinas, LPS,

endotoxinas, entre outros (KRAUSZ; FRIEDMAN, 2015; SU, 2015).

A iNOS é um potente vasodilatador, com características pró-inflamatórias como

aumento da permeabilidade e produção de prostaglandinas. A nível endotelial inibe a

agregação plaquetária e adesão de leucócitos, regulando assim o recrutamento dessas células.

Nos macrófagos, o óxido nítrico e seus metabólitos (nitrito e nitrato) destacam-se pela

atividade microbicida e ações citotóxicas. No interior dos fagolisossomos, o gás (óxido

nítrico) se difunde e combina-se com o peróxido de hidrogênio ou ao superóxido, produzindo

radicais altamente tóxicos que destroem os micro-organismos (COUTINHO; MUZITANO,

COSTA, 2009; HODGKINSON; GRAYFER; BELOSEVIC, 2015).

22

2. JUSTIFICATIVA

As plantas medicinais são uma das melhores e mais efetivas fontes de compostos

candidatos a novas classes de medicamentos, e para muitas dessas plantas utilizadas na

medicina popular, já é possível comprovar o que a medicina tradicional reportou durante

milênios, ou seja, os produtos naturais constituem importantes fontes de agentes terapêuticos.

O Brasil é conhecido mundialmente não só por ser uma potência economicamente

emergente, mas também por apresentar uma flora bastante diversificada. A região amazônica

é rica em biodiversidade e apresenta um grande potencial terapêutico. Dentre as espécies de

interesse da região, encontra-se a Cyperus articulatus L., pertencente à família Cyperacea,

conhecida no estado do Pará como priprioca, cuja utilização mais conhecida é a produção de

seu óleo essencial, largamente empregado pela indústria cosmética.

O interesse pelos óleos essenciais está baseado não somente na possibilidade de

obtenção de compostos aromáticos, mas também daqueles possuidores de propriedades

terapêuticas, já que apresentam uma larga tradição de uso como agentes medicinais com

finalidades sedativas, antiespasmódicos, antidiarréicos, antimicrobianos e analgésicos.

De acordo informações etnofarmacológicas, o óleo essencial da Cyperus articulatus

L. apresenta um enorme potencial anti-inflamatório, fato esse que despertou o interesse da

pesquisa pela espécie para a investigação de efeitos possivelmente farmacológicos,

considerando a alta incidência de doenças inflamatórias agudas e crônicas, e principalmente, a

ocorrência de efeitos adversos relacionados ao uso de medicamentos anti-inflamatórios que

impacta diretamente na baixa adesão ao tratamento dos pacientes que fazem uso desses

fármacos. Outro fator que fundamenta esta pesquisa é a indisponibilidade de dados entre as

literaturas pesquisadas sobre o efeito anti-inflamatório dessa planta, apesar do uso na

medicina popular para essa finalidade.

23

3. OBJETIVOS

3.1 GERAL

Avaliar a atividade anti-inflamatória in vitro do óleo essencial de Cyperus articulatus L

(OECA) em cultura de macrófagos RAW 264.7 estimulados com LPS e IFN-γ.

3.2 ESPECÍFICOS:

Identificar os principais componentes químicos do OECA;

Avaliar, in vitro, o efeito do OECA sobre a viabilidade de macrófagos da linhagem

RAW 264.7;

Analisar o efeito do OECA sobre a síntese de Óxido Nítrico em macrófagos

estimulados com LPS e IFN-γ;

Investigar o efeito do OECA sobre a produção das citocinas pró-inflamatórias TNF-α

e IL-1β, em cultura de macrófagos RAW 264.7 estimulados com LPS e IFN-γ;

Avaliar os efeitos do OECA sobre a produção do eicosanóide PGE2, em culturas de

macrófagos RAW 264.7 estimulados com LPS e IFN-γ;

24

4. MATERIAL E MÉTODOS

4.1. Coleta e identificação do material vegetal

Em março (período seco) foram coletados os rizomas da espécie C. articulatus L. em

uma área de cultivo na região do Tabocal, BR-163, no município de Santarém, Pará, [(-

54°43’00,10”W e -02°37’41,10”S)]. A espécie foi identificada pelo botânico Dr. Antônio

Elielson Sousa da Rocha. Um exemplar da exsicata foi depositado no herbário do Museu

Paraense Emílio Goeldi localizado em Belém, Pará, sob número de registro MG: 207174.

4.2. Extração do OECA

O óleo essencial de C. articulatus L. foi cedido gentilmente pelo Prof. Lauro E. S.

Barata (Laboratório de Pesquisa & Desenvolvimento de Produtos Naturais Bioativos,

UFOPA, PA, Brasil). O procedimento de extração foi realizado pela empresa Beraca, no

município de Belém, Pará. Foram coletados 5 kg de rizomas de C. articulatus. Após a coleta

os rizomas foram submetidos à limpeza, secos por um período de 3 dias consecutivos e

moídos em moinho de facas em ambiente aberto. Após lavagem e secagem em estufa a 60 ºC,

o material foi triturado e submetido à hidrodestilação por arraste a vapor, em uma dorna de

150 L, com uma duração de 4 h. Após extração o óleo essencial foi armazenado em frasco

âmbar e seu rendimento foi de 0,7%.

4.3. Análise cromatográfica do OECA

A cromatografia gasosa acoplada à espectrometria de massa é uma técnica utilizada

para análise e determinação de um grande número de compostos simultaneamente. Consiste

na partição dos componentes de uma amostra entre a fase móvel gasosa e a fase estacionária,

seguida da obtenção de informação estrutural e massa molar para identificação dos compostos

a serem analisados. A análise da composição química do OECA foi realizada no Centro de

Pesquisas Químicas, Biológicas e Agronômicas da Universidade Estadual de Campinas

(UNICAMP), com a participação da Me. Aline Aparecida Kasper (Laboratório de Pesquisa &

Desenvolvimento de Produtos Naturais Bioativos, UFOPA, PA, Brasil). O equipamento

utilizado foi o cromatógrafo a gás acoplado a espectrômetro de massa Agilent, modelo HP-

6890 equipado com um detector seletivo de massas, com coluna capilar HP-5MS (30m x

0,25mm x 0,25µm) nas seguintes condições: temperatura do injetor = 220°C, coluna = 60°C,

25

taxa de aquecimento de 3°C/min até 280°C (20 min) e detetor = 250°C. Foi utilizado hélio

como gás de arraste numa vazão de 1mL/min. Os espectros de massa obtidos foram

comparados com a biblioteca eletrônica do equipamento (NIST-05) e com a bibliografia

Adams (2007).

4.4. Drogas e Soluções

Foram utilizadas as seguintes substâncias neste estudo: dexametasona (Sigma

Chemical Co), penicilina (GIBCO), estreptomicina (GIBde CO), Dulbecco´s modified

Eagle´s medium (DMEM) (Cultilab, São Paulo, Brazil), LPS (InvivoGen, São Diego, CA,

EUA), IFN-γ (BD Biosciences), FBS (Cultilab, São Paulo, Brasil). O OECA, objeto de

estudo desta pesquisa, foi solubilizado em dimetilsulfóxido (DMSO), obtendo uma

concentração final de 10 mg/mL.

4.5 Modelos Experimentais

4.5.1 Cultura de macrófagos murinos RAW 264.7

Para este estudo, foi utilizada linhagem de macrófagos murinos RAW 264.7 obtidos

da Coleção Americana de Cultura de Células (ATCC, American Type Culture Collectio,

Rockville, MD, USA) de um cultivo cedido originalmente pela Dra. Juliana Vago

(Departamento de Morfologia – UFMG, MG, Brasil). Os ensaios in vitro foram realizados no

Laboratório de Gnotobiologia e Imunologia, coordenado pela Dra. Leda Quercia Vieira

(Departamento de Bioquímica e Imunologia – UFMG, MG, Brasil). As células RAW 264.7

foram cultivadas em meio DMEM, suplementadas com 10 % de soro fetal bovino (SFB) e

antibióticos (50 U/mL penicilina e 50 μg/mL estreptomicina), mantidas em garrafas de cultura

celular a 37 °C em estufa a 5 % de CO2.

Depois das células atingirem a confluência de 80-90%, foi descartado o meio DMEM

completo das garrafas de cultura celular com auxílio de uma pipeta sorológica, seguida da

lavagem dos frascos com PBS. As células aderidas à superfície dessas garrafas foram

desprendidas utilizando o raspador celular (Corning Cell Scraper, Nova Iorque, EUA) após

adição de 10 ml de meio DMEM completo. Posteriormente, o meio contendo as células foi

transferido para tubos esterilizados de 50 ml, centrifugados a 300 g, durante 10 minutos, a 4

26

°C. O sobrenadante foi descartado e o sedimento ressuspendido com meio completo.

Utilizando a câmara de Neubauer, foi realizada a contagem global das células, a partir da

diluição de 1:20 em solução de Azul de Trypan. Os macrófagos foram cultivados em

microplacas de 96 poços, na concentração de 5 x 105

(célula/poço), incubadas durante 18 h, a

37 °C em estufa a 5 % de CO2. Após o período de incubação e adesão celular, as células

foram tratadas com as diferentes concentrações (2.000; 1.500; 1.000; 750; 500; 375; 250;

187,5; 125; 93,75; 62,5 e 31,75 μg/mL) do óleo essencial de Cyperus articulatus testado em

triplicata e em dois períodos de tratamento: 24 e 48 h. Como controle negativo foi avaliado

apenas o meio de cultura, e a fim de verificar a interferência do DMSO, optou-se por um

controle apenas desse diluente.

4.5.2 Análise da viabilidade celular

A viabilidade celular da linhagem RAW 264.7 foi avaliada pelo método MTT. Esse

teste é o mais empregado como indicador colorimétrico da viabilidade celular e consiste na

avaliação da função mitocondrial da célula, a partir da redução enzimática do sal tetrazólico

pela atividade das enzimas desidrogenases mitocondriais das células viáveis, gerando os

cristais de formazan. Esses cristais são solubilizados com DMSO o que dá origem a uma

coloração violeta, tornando possível a quantificação espectrofotométrica da citotoxicidade

induzida pela substância teste (MOSMANN, 1983; MELO, 2015).

As culturas de macrófagos foram lavadas com tampão PBS (pH: 7,4). Após a

lavagem, foi adicionado 100μL/ poço de MTT (1mg/ml) (brometo de 3-[4,5-dimetil-2-

tiazolil]-2,5-difenil-2H tetrazolio) diluído em PBS (1 mg/ml). As células foram incubadas

durante 4 h a 37º C em atmosfera contendo 5 % de CO2. Após o tempo de incubação o

sobrenadante foi retirado e os cristais formados foram solubilizados com 100 µL/poço de

dimetilsulfóxido (DMSO). A absorbância foi medida a 590 nm utilizando um leitor de

microplaca automático (Biochrom EZ Read 400).

4.5.3 Planejamento Experimental

Os macrófagos RAW 264.7 foram cultivados na concentração de 1 x 106

(célula/poço), em placas de 48 poços e incubadas por 24 h para adesão das células, a 37 °C em

estufa a 5 % de CO2, para a realização dos tratamentos desejados. Após o período de incubação

27

as células foram estimuladas com LPS (100 ng/ml) + IFN-γ (50 UI/ml) e tratadas com as 4

concentrações (1.000; 500; 250 e 125 μg/mL) selecionadas para este estudo, e em seguida,

incubadas por mais 24 horas a 37 ºC, 5 % de CO2. A fim de obter o efeito comparativo da

resposta anti-inflamatória do óleo essencial de Cyperus articulatus foi utilizado como padrão a

dexametasona (10 µM), e como controle positivo o grupo tratado apenas com o estímulo (LPS

+ IFN-γ) nas mesmas condições experimentais. O sobrenadante da cultura foi submetido ao

ensaio de Griess para a determinação dos níveis de nitrito e avaliação de citocinas (estocado à -

20°C até a realização da dosagem). Os tratamentos foram divididos da seguinte forma:

Grupo 01: (controle negativo): células cultivadas apenas com o meio de cultura DMEM.

Grupo 02: diluente DMSO 0,5%.

Grupo 03: (controle positivo): células estimuladas com LPS (100 ng/ml) + IFN-γ (50 UI/ml)

Grupo 03: células estimuladas com LPS (100 ng/ml) + IFN-γ (50UI/ml) + dexametasona (10

µM)

Grupo 05: células estimuladas com LPS (100 ng/ml) + IFN-γ (50 UI/ml) + OECA (125 μg)



Grupo 08: células estimuladas com LPS (100 ng/ml) + IFN-γ (50 UI/ml) + OECA (1.000 μg)

4.5.4 Dosagem de Nitrito

Este método baseia-se na quantificação indireta de NO pelo seu principal metabólito,

o nitrito. Para avaliar o efeito inibitório do óleo de Cyperus articulatus na produção de Óxido

Nítrico foi determinada a concentração de Nitrito (NO-2) presente no sobrenadante de culturas

de macrófagos, tratados ou não com óleo essencial de Cyperus articulatus, baseado na reação

de Griess (Green et al., 1982). Este método consiste em uma reação colorimétrica na qual o

sobrenadante da cultura é incubado com igual volume dos reagentes de Griess. Este reagente é

preparado pela mistura de volume de solução de naftiletileno-diamina a 0,1% (Sigma) com a

28

solução de sulfanilamida a 1 % (Sigma) em ácido fosfórico a 2,5%. Alíquotas de 50 µL dos

sobrenadantes foram incubadas com o mesmo volume de reagente de Griess, em temperatura

ambiente por 10 minutos no escuro. A concentração padrão de nitrito utilizado foi de 500 µM.

O resultado da reação é a coloração rosa púrpura, que em seguida foi submetida à leitura em

leitor de microplacas (540 nm).

4.5.5 Método ELISA para dosagem de IL-1β, TNF-α e PGE2

Os níveis de IL-1β, TNF-α e PGE2 foram quantificados por ELISA (do inglês,

Enzyme-Linked Immuno Sorbent Assay). Este teste baseia-se em reações antígeno-anticorpo

detectáveis através de reações enzimáticas. Considerado um método de grande sensibilidade e

especificidade, é caracterizado pelo uso de uma enzima, geralmente a peroxidase, que se liga

a um anticorpo específico e reconhece o antígeno alvo, dando origem a um produto colorido a

partir desta reação. A dosagem dessas citocinas foi realizada a partir do sobrenadante da

cultura de macrófagos RAW 264.7, tratadas ou não com óleo essencial de Cyperus

articulatus. Para isto, foram utilizados Kits de ELISA comercialmente disponíveis. Os

resultados foram expressos em pg/mL.

4.6 Análise Estatística

Os dados obtidos foram analisados pela análise de variância (ANOVA), utilizando o

programa GraphPad Prism versão 5, seguido do pós-teste de comparações múltiplas Newman-

Keuls (p < 0,05 = nível de significância). Os dados são expressos como média ± erro padrão

da média (EPM).

5 RESULTADOS

5.1 Análise da composição química do OECA

Foi identificado um total de 88,43% dos constituintes do óleo essencial de C.

articulatus, conforme descrito na tabela 1. A análise da composição química do OECA

revelou a presença de oito compostos majoritários correspondendo a 54.7% de constituintes

29

totais do OECA, dos quais quatro apresentaram percentuais de concentração maiores que 6%:

α-copaeno, β-selineno, ciclocolorenona e mustacona (constituinte majoritário).

Tabela 01: Composição química do óleo essencial de C. articulatus

tR (min) IR Identificação % rel.

5,54 933 α-pineno 4,85

6,05 953 tuja-2,4(10)-dieno 0,56

6,66 977 β-pineno 1,94

8,08 1024 ρ-cimeno 0,83

8,21 1028 Limoneno 0,49

9,70 1071 trans-epoxi-ocimeno 2,12

10,35 1090 ρ-cimeneno 1,47

12,26 1139 trans-pinocarveol 3,08

12,64 1148 n.i. 0,69

13,39 1167 para-menta-1,5-dien-8-

ol

1,33

14,37 1191 alfa-terpineol 1,19

14,62 1198 Mirtenol 4,21

15,11 1209 Verbenona 2,77

21,66 1366 Ciclosativeno 0,69

22,06 1375 α-copaeno 6,57

22,99 1398 Cipereno 3,29

23,25 1404 cis-tujopsadieno 2,79

25,38 1457 Rotundeno 2,06

26,00 1473 isolongifolene, 4,5-

dehydro

1,32

26,12 1476 δ-cadineno 2,28

26,53 1486 β-selineno 8,45

27,01 1498 cycloisolongifolene,8,9-

dehydro

2,45

27,29 1505 α-bulneseno 2,38

27,61 1513 M = 202 0,86

30

27,96 1523 trans-calameneno 2,52

28,32 1532 M = 220 2,40

28,42 1534 M = 220 1,72

28,73 1542 α-calacoreno 2,63

29,04 1550 M = 220 0,90

29,69 1567 M = 220 1,41

30,20 1581 óxido de cariofileno 1,28

30,62 1591 β-copaen-4-α-ol 1,12

31,46 1614 epóxido de

humuleno

1,19

33,29 1664 M = 218 1,66

33,61 1672 M = 222 0,92

33,84 1679 Mustacona 10,65

34,36 1693 Ciperotundona 1,49

34,91 1708 cis-tujopseno 3,44

35,91 1737 M = 234 1,04

36,36 1750 Ciclocolorenona 6,99

Total de constituintes identificados 88.43%

tR = Tempo de retenção; IR = Índice de retenção; M = Massa molecular; % rel= Porcentagem relativa

5.2 Análise da Viabilidade Celular

O OECA foi testado em macrófagos RAW 264.7 com o objetivo de avaliar

preliminarmente o seu possível efeito citotóxico em função da concentração utilizada.

Conforme mostra as figuras 7A e B, observa-se que o tratamento com OECA não promoveu

efeito citotóxico nas concentrações inferiores a 1500 μg/mL após 24 e 48 h de incubação,

sendo tóxico na concentração de 2000 μg/mL, na qual foi observado uma diminuição

significativa da viabilidade celular. Desta forma, esta última concentração foi excluída dos

demais parâmetros de análise.

31

Figura 7A: Efeito de diferentes concentrações de OECA sobre a viabilidade celular de

macrófagos RAW 264.7 após 24 h de tratamento. Dados representados

por média ± EPM. ***p<0,001 quando comparados ao grupo controle; ANOVA One-way,

Teste de Múltipla Comparação de Newman-Keuls.

Figura 7B: Efeito de diferentes concentrações de OECA sobre a viabilidade celular de

macrófagos RAW 264.7 após 48 h de tratamento. Dados representados

por média ± EPM. ***p<0,001 quando comparados ao grupo controle; ANOVA One-way,

Teste de Múltipla Comparação de Newman-Keuls.

32

5.3 Avaliação da Produção de Nitrito em macrófagos RAW 264.7 estimulados com

LPS + IFN-γ e tratados com OECA

Conforme a figura 8, observa-se uma inibição significativa na produção de nitrito nas

culturas de macrófagos RAW 264.7 estimulados com LPS + IFN-γ e tratados nas diferentes

concentrações (250, 500 e 1000 μg/mL) de OECA, reduzindo os níveis de nitrito em 86.4,

95.5, 95.3%, respectivamente. A dexametasona (10 µM), usada como padrão de anti-

inflamatório, também inibiu a produção de nitrito significativamente comparado com controle

positivo, correspondendo a uma redução de 95.5%.

Figura 8: Efeito do OECA sobre a produção de nitrito em macrófagos RAW 264.7

estimulados por IFN- γ (50 UI/mL) e LPS (100 ug/mL). Dados representados por média ± DP

(n=3). ***p<0,001 indica uma diferença significativa entre o grupo estimulado por LPS +

IFN-γ e o grupo tratado com OECA. ### P < 0,001 indica uma diferença significativa entre o

grupo de controle negativo e o grupo estimulado por LPS + IFN-γ; ANOVA One-way, Teste

de Múltipla Comparação de Newman-Keuls.

5.4 Produção de TNF-α por macrófagos RAW 264.7 estimulados com LPS+IFN-γ e

tratados com OECA

Conforme figura 9, verifica-se que o tratamento com OECA promoveu nas

concentrações de 250, 500 e 1000 μg/mL uma diminuição significativa na produção de TNF-α

33

em cultura de macrófagos RAW 264.7, representando uma redução de 34.5, 48.4 e 59.1 %,

respectivamente, das concentrações testadas quando comparadas com o grupo tratado somente

com o estímulo. A dexametasona, droga padrão, também inibiu uma a produção de TNF-α

significativamente 66.4% quando comparado com o controle positivo.

Figura 9: Efeito do OECA sobre a produção de TNF-α em macrófagos RAW 264.7






5.5 Produção de IL-1β por macrófagos RAW 264.7 estimulados com LPS+IFN-γ e

tratados com OECA

A figura 10 demonstra que apenas a concentração de OECA 1000 μg/mL promoveu

uma diminuição significativa nos níveis de IL-1β comparado com o controle positivo

(somente com estímulo), reduzindo 56.9% os níveis dessa citocina. Observamos também uma

diminuição significativa da produção de IL-1β no grupo tratado com dexametasona (10 µM)

usado como padrão, também em relação ao controle positivo, representando uma redução de

87.9%.

34

Figura 10: Efeito do OECA sobre a produção de IL-1β em macrófagos RAW 264.7






5.6 Produção de PGE2 por macrófagos RAW 264.7 estimulados com LPS+IFN-γ e

tratados com OECA

A figura 11 demonstra que as diferentes concentrações (250, 500 e 1000 μg/mL) de

OECA reduziram de maneira significativa a produção de PGE2 em cultura de macrófagos

RAW 264.7, quando comparados com o controle positivo (apenas o grupo estimulado),

representando uma redução de 18.2, 32.3, 54.1%, respectivamente. O anti-inflamatório

padrão, dexametasona (10 µM), também reduziu significativamente a produção de PGE2, em

relação ao controle positivo (grupo estimulado).

35

Figura 11: Efeito do OECA sobre a produção de PGE2 em macrófagos RAW 264.7






6 DISCUSSÃO

Os produtos naturais, principalmente os derivados de plantas, desempenham um papel

fundamental na saúde humana em relação à prevenção e ao tratamento de diversas doenças.

Resultados de outras pesquisas utilizando o óleo essencial da Cyperus articulatus L (planta

amplamente utilizada na medicina tradicional) comprovaram diversas finalidades terapêuticas,

porém a atividade biológica anti-inflamatória dessa planta ainda é desconhecida, o que torna

esta pesquisa relevante e de grande contribuição para a literatura científica (IBRAHIM et al.,

2012).

A inflamação é uma resposta do organismo a qualquer injúria tecidual, envolvendo

vários tipos de células de defesa, sendo as principais os macrófagos. Uma vez ativados, eles

induzem à produção de mediadores inflamatórios, responsáveis pela sinalização e regulação

36

do processo inflamatório. Apesar de a inflamação ser um mecanismo de defesa, ela pode

progredir e tornar-se crônica, o que gera necessidade de intervenção medicamentosa. Por

conta disso, os mediadores inflamatórios liberados a partir da ativação dos macrófagos são

alvos considerados promissores para o tratamento de doenças inflamatórias (SEO et al.,

2016).

Existem vários tipos de modelos (in vivo, in vitro e in silico) experimentais de

inflamação que podem ser utilizados para avaliar a atividade anti-inflamatória de compostos

naturais. Neste estudo optou-se pelo ensaio in vitro que consiste na ativação de macrófagos

frente à presença de agentes patogênicos. Assim como em outros grupos de pesquisas que

atuam na avaliação de produtos naturais utilizando esse tipo de modelo, a linhagem celular

RAW 264.7 (células imortalizadas) foi a adotada para a avaliação da atividade anti-

inflamatória do OECA, devido sua semelhança com as células primárias, e ainda, por

apresentarem alta aderência e uma relativa facilidade no cultivo celular e manutenção para os

estudos in vitro. Devido a esses fatores, as células de macrófagos murinos RAW 264.7 são

consideradas atualmente um modelo adequado para a análise dos efeitos imunomoduladores e

anti-inflamatórios de drogas (RAELE, 2013; SHI et al., 2017).

A partir dos ensaios realizados neste trabalho, os resultados demonstraram que o

tratamento de macrófagos com o OECA foi capaz de reduzir de maneira significante

parâmetros inflamatórios in vitro como a produção de citocinas pró-inflamatórias (TNF-α e

IL-1β), síntese do óxido nítrico e produção do eicosanóide PGE2, o que pode estar relacionado

com a composição química do óleo essencial da espécie estudada.

A primeira etapa realizada antes do início dos ensaios in vitro foi o processo de

extração para a obtenção do óleo essencial, o qual foi realizado pelo método de

hidrodestilação por arraste a vapor, cujo valor de rendimento resultou em um percentual de

0,7%. Esse resultado mostra ser coerente ao descrito na literatura, uma vez que se aproxima à

faixa de rendimento obtido por Zoghbi et al. (2006), cujos valores foram de 0,9 a 1,6%,

utilizando a mesma metodologia de extração.

Os óleos essenciais são misturas complexas encontradas, principalmente, em plantas

aromáticas, e são regidos pelo tipo e quantidade de seus constituintes químicos, que em geral,

são terpenos, compostos oxigenados e isoprenóides. Conforme os dados apresentados na

37

tabela 1, que representa a análise da composição química do OECA, foram identificados um

total de 40 compostos, tendo como constituintes majoritários monoterpenos, sesquiterpenos e

cetonas sesquiterpênicas. Esses resultados são semelhantes aos obtidos por Nyasse et al.

(1988) que identificaram a presença de compostos sesquiterpênicos no extrato dos rizomas de

Cyperus articulatus, e ainda determinaram a presença de mustacona, composto que passou a

ser considerado como marcador biológico da priprioca (TONGNUANCHAN; BENJAKUL,

2014).

Considerando o total (88,43%) de compostos identificados a partir da caracterização

química do OECA foi evidenciada a presença de quatro constituintes majoritários

sesquiterpênicos correspondendo a um percentual superior a 6%, destacando-se a mustacona

(10,65%), seguida de ciclocolorenona (6,99%), β-selineno (8,45%) e α-copaeno (6,57%). No

trabalho realizado por Zoghbi et al. (2006) também foi observada uma presença abundante de

mustacona com variações de 7,3 a 14,5% nas amostras dos óleos essenciais obtidos a partir

dos rizomas da espécie Cyperus articulatus, caracterizando esse composto como o principal

sesquiterpeno presente nessa planta. Os compostos α-copaeno e β-selineno também foram

identificados no estudo realizado por Zoghbi et al. (2006).

Rukunga et al. (2008) identificaram a presença de dois sesquiterpenos, mustacona e

corimbolona, isolados do extrato de clorofórmio dos rizomas de Cyperus articulatus L., os

quais exibiram propriedades anti-plasmodiais significativas, destacando-se a mustacona por

apresentar dez vezes mais ativa contra o Plasmodium falciparum, o que sugere que tal

composto pode ser considerado como “composto marcador’’ dos medicamentos naturais a

partir de Cyperus articulatus L. Um alto índice de mustacona também foi descrito no trabalho

de Silva et al. (2014), a partir do óleo essencial de Cyperus articulatus L, incluindo α-

cipereno e α-pineno. Mattoso (2005) que também utilizou o processo de hidrodestilação para

obtenção do óleo essencial observou em seu estudo a presença de cinco compostos

identificados nesta pesquisa, sendo eles α-pineno (hidrocarboneto monoterpênico), α-copaeno,

cipereno, β-selineno e α-calacoreno, os quatro últimos pertencem à classe de hidrocarbonetos

sesquiterpênicos. Isso demonstra que a composição química do OECA se assemelha ao perfil

descrito na literatura.

No trabalho realizado por Zoghbi et at. (2008b) em que compararam as variações da

38

composição química dos óleos essenciais de espécies do gênero Cyperus, foi detectada uma

maior porcentagem de mustacona e óxido de cariofileno, comparado com os outros compostos

químicos nos óleos analisados das espécies C. articulatus var. articulatus e C. articulatus var.

nodosus. Ambos compostos também foram identificados no OECA, porém os resultados se

assemelham apenas quando comparados à concentração de mustacona, pois a concentração de

óxido de cariofileno (1,28%) em nosso estudo foi acentuadamente abaixo do identificado no

trabalho mencionado anteriormente, o qual foi registrado concentrações de até 13,7%. Isso

demonstra a diferença na composição química dos óleos essenciais de diferentes espécies do

gênero Cyperus, o que pode estar relacionado a diversos fatores, dentre eles o clima, período

da coleta, sazonalidade, estresse hídrico, tipo de solo e outros (ZHANG et al., 2017).

Os sesquiterpenos são metabólitos secundários conhecidos por diversas ações

biológicas e farmacológicas, incluindo atividades anti-inflamatórias. Alguns dos compostos

sesquiterpênicos identificados no OECA já possuem atividade biológica anti-inflamatória

comprovada, como por exemplo, podemos citar o estudo de Afoulous et al. (2013) no qual

avaliaram diversas atividades biológicas do óleo essencial da espécie Cedrelopsis grevei, e

atribuíram a atividade anti-inflamatória à presença do monoterpeno α-pineno e a de outros

sesquiterpenos presente no óleo. Adicionalmente, estudos demonstram que espécies do

gênero Cyperus tem apresentado atividade biológica anti-inflamatória, em modelos in vitro e

in vivo, o OECA, também é formado em grande parte por compostos terpenóides

(KANGRALKAR et al., 2010; JUNG et al., 2013; SOUMAYA et al., 2013; PIRZADA et al.,

2015; AZIMI et al., 2016)

A presença dos compostos terpenóides na constituição química do OECA é um dado

importante, visto que, diversos fármacos foram desenvolvidos a partir de produtos naturais,

com menos efeitos adversos e mais segurança para tratamento a longo prazo (SIBI; RABINA,

2016).

Considerando que o estudo da toxicidade garante a segurança necessária para o

desenvolvimento de novos medicamentos, nossos estudos com o OECA iniciaram com a

determinação do potencial citotóxico do óleo essencial a partir da avaliação da citotoxicidade

nos macrófagos RAW 264.7. Segundo Rogero et al. 2003, os testes de citotoxicidade são

fundamentais para avaliar a interferência dos compostos naturais nos processos que envolvem

39

a sobrevivência, proliferação e função celular, e consideram os testes in vitro mais vantajosos

comparados ao in vivo devido à facilidade na execução, controle ambiental das células,

rapidez para obtenção de dados, além de substituir o uso de animais nos testes (LOIODICE;

NOGUEIRA DA COSTA; ATIENZAR, 2017).

Nesse sentido, o método MTT foi o ensaio in vitro utilizado neste estudo para avaliar a

viabilidade celular, e consequentemente, a influência do OECA a partir das concentrações

testadas. A partir desse ensaio foi observado que as concentrações inferiores a 1500 μg/mL do

OECA não demonstraram efeito tóxico para as células, tanto no período de 24 h quanto de 48

h (figuras 7A e 7B). Apenas a concentração de 2000 μg/mL apresentou redução significativa

na viabilidade celular, o que indica uma redução da proliferação e morte celular, e por conta

disso, essa concentração foi excluída dos testes de avaliação anti-inflamatória. Diante deste

dado, foi estabelecido que as concentrações testes utilizadas nos ensaios anti-inflamatórios

seriam 250, 500 e 1000 μg/mL do OECA.

Não encontramos na literatura trabalhos que demonstrem à atividade citotóxica do

óleo essencial de Cyperus articulatus L, apenas de outras espécies pertencente ao mesmo

gênero, como por exemplo, o estudo de Jung et al. (2013) que demonstraram atividade

citotóxica na concentração de 200 μg/mL da fração n-hexano da Cyperus rotundus em células

RAW 264.7. Observa-se uma diferença acentuada da concentração citotóxica de ambas as

espécies, o que pode ser justificada pelo uso do composto concentrado extraído da planta

naquele estudo, e não o óleo essencial bruto, como o caso do presente trabalho, e ainda, por se

tratar de espécies diferentes.

A atividade anti-inflamatória do OECA, foi testada frente aos parâmetros in vitro

selecionados neste estudo. O primeiro parâmetro avaliado foi o efeito inibitório do óleo

essencial de Cyperus articulatus na produção de óxido nítrico por meio da determinação de

nitrito presente no sobrenadante de cultura dos macrófagos da linhagem RAW 264.7

estimulados por LPS + IFN-γ.

O óxido nítrico é um mediador importante que participa dos processos inflamatórios e

sua produção é consequência da ativação dos macrófagos após o estímulo por endotoxina

(LPS). Assim, a supressão na sua produção decorrente da inibição da expressão de iNOS ou

da atividade enzimática desta mesma enzima, é um importante mecanismo de ação, e drogas

40

que consigam exercer esta atividade, é um potente candidato para o desenvolvimento de

novos medicamentos para o tratamento de doenças inflamatórias (SHIN et al., 2015).

O efeito do OECA foi avaliado após o estímulo dos macrófagos RAW 264.7 com LPS

+ IFN-γ, seguida da determinação do nitrito no meio de cultura utilizando a reação de Griess.

Esse método consiste em uma reação colorimétrica que avalia indiretamente os níveis de NO,

é de simples execução e confiável, porém sua única desvantagem reside no fato de detectar

somente o nitrito (principal metabólito do óxido nítrico), já que o NO é um gás bastante

reativo e dificilmente dosado de forma direta.

De acordo com a figura 8, observa-se que o OECA reduziu de maneira significativa a

produção de óxido nítrico em todas as concentrações testadas, o que corresponde a uma

diminuição de 86.4, 95.5 e 95.3% nas concentrações de 250, 500 e 1000 μg/mL de OECA,

respectivamente. A droga padrão (dexametasona) utilizada no teste também apresentou uma

inibição significativa de 95.5% na produção de nitrito.

O resultado do presente trabalho corrobora com estudos de outros pesquisadores que

avaliaram a atividade anti-inflamatória de espécies do gênero Cyperus e demonstraram o

efeito inibitório de compostos dessas plantas sobre a produção de óxido nítrico, como por

exemplo, o trabalho realizado por Jung et al., (2013) que demonstraram efeito inibitório da

Cyperus rotundus sobre a produção de NO em células RAW 264.7 tratadas com fração

isolada n-hexano dessa planta. Do mesmo modo, Khan et al., (2011) demonstraram atividade

anti-inflamatória de sesquiterpenos isolados de Cyperus rotundus em células RAW 264.7 e a

capacidade desses compostos em reduzir de maneira significativa a expressão de iNOS,

relacionando tal redução à regulação negativa da via de sinalização NF-kB. Em nosso estudo,

não investigamos qual(is) via(s) de sinalização podem estar envolvidas na inibição da

produção de NO.

Outro parâmetro avaliado para investigar a capacidade anti-inflamatória do OECA foi

a influência desse óleo sobre a produção de citocinas pró-inflamatórias. Optou-se pela análise

de TNF-α e IL-1β, consideradas como umas das principais citocinas liberadas, após o

processo de ativação do macrófago ou monócito, na resposta inflamatória. É importante

ressaltar, que ambas ativam a imunidade celular para regular o processo inflamatório, o que

pode representar possíveis mecanismos para atuação de novos fármacos (SIBI; RABINA,

41

2016).

De acordo com análise da figura 9, observa-se que o OECA diminuiu

significativamente os níveis de produção de TNF-α, em células RAW 264.7, em todas as

concentrações avaliadas neste estudo, isto é, 250, 500 e 1000 μg/mL. Considerando que o

percentual da redução dos níveis desta citocina foi proporcional ao da concentração testada,

sugere-se uma redução do tipo concentração-dependente exercida pelo OECA neste ensaio.

Esse resultado difere do encontrado no trabalho de Jung et al. (2013) o qual testaram a

atividade biológica de α-ciperona, fração isolada dos rizomas de outra espécie do gênero,

Cyperus rotundus, e não constataram redução nos níveis de produção de TNF-α. Além de

espécies diferentes, no referido estudo foi avaliada a atividade biológica de uma fração

isolada, e não de um óleo essencial bruto, como é o caso do presente estudo. O OECA possui

diversos componentes químicos, em torno de 100 componentes, não identificamos quais os

responsáveis pela redução dos níveis de TNF-α, tendo em vista que esse não foi o propósito

do nosso estudo (ZOGHBI et al., 2006).

Quanto ao efeito do OECA sobre a produção de IL-1β, foi verificado que apenas a

concentração de 1000 μg/mL inibiu significativamente os níveis desta citocina, o que

corresponde uma redução de 56.9% comparada com o controle positivo. A dexametasona,

droga padrão, também promoveu redução comparada ao controle positivo, o que corresponde

a um percentual de 87.9 % (figura 10).

Esse resultado corrobora com o trabalho de Seo et al.(2016) que avaliaram a atividade

biológica de um sesquiterpeno isolado dos rizomas de Cyperus rotundos, o isociperol, no qual

esse composto inibiu significativamente a produção de IL-1β em macrófagos RAW 264.7

estimulados com LPS, suprimindo a expressão do gene responsável pela produção dessa

citocina. Esse composto também está presente no OECA, e pode ter inibido os níveis de

produção de outros mediadores inflamatórios avaliados neste estudo, como por exemplo, o

NO.

Em suma, foi possível verificar neste estudo que o OECA atenuou a produção das

principais citocinas envolvidas na resposta inflamatória, ou seja, TNF-α e IL-1β, contudo não

temos evidencias suficientes para afirmar quais os mecanismos de atuação responsáveis por

42

este resultado. Logo, estudos adicionais são necessários para a elucidação dos mecanismos

moleculares envolvidos no efeito anti-inflamatório do óleo essencial de Cyperus articulatus

L.

De acordo com a literatura, as principais vias de atuação dos fármacos anti-

inflamatórios consistem na inibição da atividade de células inflamatórias e de mediadores

inflamatórios. Nesse contexto, os fármacos anti-inflamatórios não esteroidais (AINEs) e

glicocorticoides são as drogas consideradas de escolha no manejo de doenças inflamatórias, e

parte de seus efeitos estão relacionados à inibição da atividade de NF-kB. NF-kB é um

modulador chave de sinalização envolvido na regulação da transcrição de inúmeros

mediadores inflamatórios e citocinas, como iNOS, COX-2 e IL-1β (SIBI; RABINA, 2016).

Há evidências de várias plantas com propriedades anti-inflamatórias, até mesmo

espécies do gênero Cyperus, que inibem a atividade de NF-kB. Esses dados apontam

possíveis vias de atuação do OECA que ainda são obscuras, mas que são promissoras para o

desenvolvimento de novos medicamentos anti-inflamatórios (HEO et al., 2016; JUNG et al.,

2013; SEO et al., 2016).

O último parâmetro inflamatório avaliado neste estudo para investigar a capacidade da

atividade anti-inflamatória do OECA, foi a influência deste óleo sobre a produção do

eicosanóide PGE2. PGE2 é uma prostaglandina gerada pela ciclooxigenase-2 (COX-2), que

participa da resposta inflamatória causando dor, febre, inchaço e rigidez, logo, sua regulação

representa uma importante abordagem terapêutica para o tratamento de desordens

inflamatórias (VYSAKH et al., 2018).

Como dito anteriormente, uma das principais estratégias para tratamento de doenças

inflamatórias consiste no uso de anti-inflamatórios não-esteroidais (AINEs), cujo mecanismo

de ação ocorre através da inibição das isoformas COX. Embora sejam amplamente usadas,

essas drogas causam sérios efeitos colaterais, fato esse que reforça a necessidade de pesquisas

em busca de novos compostos anti-inflamatórios com farmacologia mais seletiva e de menor

toxicidade (VYSAKH et al., 2018).

Neste estudo, observou-se que todas as concentrações (250, 500 e 1000 μg/mL)

testadas do OECA diminuíram significativamente a produção dos níveis de PGE2,

43

demonstrando uma redução do tipo concentração-dependente (figura 11). A dexametasona

(droga-padrão) também demonstrou uma redução significativa comparada ao grupo

estimulado.

Embora não tenhamos conhecimento de outros trabalhos envolvendo a atividade anti-

inflamatória do óleo essencial de Cyperus articulatus L, esse resultado assemelha-se ao de

outros autores que avaliaram espécies do gênero Cyperus e evidenciaram a supressão de PGE2

em modelo in vitro com macrófagos RAW 264.7 estimulados com LPS. Exemplo disso é

ácido fulgídico, composto isolado dos rizomas de Cyperus rotundus, o qual reduziu de

maneira significativa a produção de PGE2, em células RAW 264.7, pela supressão da

transcrição de COX-2 (SHIN et al., 2015).

Como descrito em material e métodos, a droga padrão utilizada nos ensaios anti-

inflamatórios foi a dexametasona. Esse fármaco glicocorticoide, com atividade anti-

inflamatória bem estabelecida, atua inibindo múltiplas vias sinalizadoras envolvidas na

resposta inflamatória, e apesar de nosso estudo não avaliar o mecanismo de ação do OECA, é

possível que algum composto presente no OECA esteja atuando por uma(s) via(s) que a

dexametasona. Contudo, é necessária a realização de estudos adicionais para a elucidação de

seu mecanismo de ação molecular.

Não encontramos nenhum trabalho sobre a atividade anti-inflamatória do óleo

essencial da Cyperus articulatus L, o que torna este estudo inédito e pioneiro nesse aspecto e

base para futuros estudos dessa espécie que se mostrou uma fonte potencial para o

desenvolvimento de novos agentes anti-inflamatórios.

44

7 CONCLUSÃO

O OECA é constituído majoritariamente por monoterpenos, sesquiterpenos e cetonas

sesquiterpênicas.

Por meio de análise da viabilidade celular em macrófagos da linhagem RAW 264.7,

podemos afirmar que o OECA não demonstra atividade citotóxica em concentrações

inferiores a 1500 µg/mL.

O OECA exerce potente atividade anti-inflamatória e efeitos inibitórios sobre a

produção de importantes mediadores inflamatórios como TNF-α, IL-1β, NO e PGE2 em

macrófagos da linhagem RAW 264.7.

45

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