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FUNDAÇÃO OSWALDO CRUZ
CENTRO DE PESQUISAS AGGEU MAGALHÃES
DEPARTAMENTO DE SAÚDE COLETIVA – NESC
MESTRADO EM SAÚDE PÚBLICA
AVALIAÇÃO DO TESTE DE AGLUTINAÇÃO DIRETA (TAD) NO D IAGNÓSTICO
DA LEISHMANIOSE TEGUMENTAR AMERICANA (LTA)
Recife – PE
2003
ODAIR VIEIRA DA SILVA
AVALIAÇÃO DO TESTE DE AGLUTINAÇÃO DIRETA (TAD) NO D IAGNÓSTICO
DA LEISHMANIOSE TEGUMENTAR AMERICANA (LTA)
Dissertação apresentada ao Departamento
de Saúde Coletiva – NESC do Centro de
Pesquisas Aggeu Magalhães – CPqAM da
Fundação Oswaldo Cruz - FIOCRUZ/MS
para a obtenção de título de Mestre em
Saúde Pública, área de concentração em
Métodos Diagnósticos e controle de
Endemias.
Orientadora: Dra. Otamires Alves da Silva, PhD – Saúde Pública
Recife – PE
2003
Dedico esta obra aos meus pais, Otávio Vieira e
Célia Gomes, que tanto se esforçaram para
a minha formação, por ter me conduzido ao
caminho da honestidade e dignidade.
Aos meus irmãos, Otávio Júnior e Kátia
Maria, pela compreensão, companheirismo e
incentivo prestado a este trabalho.
Por mais difícil que o trabalho possa parecer, difícil mesmo é explicar a solidariedade das pessoas que nos acompanha a cada dia. E difícil mesmo é poder explicar o sentimento de todos aqueles que participaram da execução deste trabalho, após a conquista.
Autor Desconhecido
SUMÁRIO
Pág.
AGRADECIMENTOS i
LISTA DE ABREVIATURAS ii
LISTA DE FIGURAS iii
LISTA DE TABELAS iv
RESUMO v
ABSTRACT vii
1. Introdução 1
1.1 Histórico das Leishmanioses 1
1.2 Leishmaniose Tegumentar Americana: etiologia, morfologia,
ciclo biológico, epidemiologia
4
1.2.1. Agente etiológico 4
1.2.2. Morfologia 5
1.2.3. Epidemiologia da Leishmaniose Tegumentar Americana 10
1.2.4. Distribuição geográfica 14
1.2.5. Ciclo Biológico 16
1.3. Relação parasito-hospedeiro e resposta imune 18
1.4. Formas clínicas da leishmaniose Tegumentar Americana 20
1.5. Diagnóstico 22
1.6. Tratamento 27
1.7. Justificativa 28
2. Objetivos 32
2.1. Objetivo Geral 33
2.2. Objetivos Específicos 33
3. Material e Métodos 34
3.1. Casuística de caso 35
3.2. Definição de caso 35
3.3. Amostras de soro 36
3.4. Exames Imunológicos 36
3.4.1. Teste de Imunofluorescência Indireta (IFI) 36
3.4.2. Teste de Aglutinação Direta (TAD) 37 37
3.4.2.1. Cultivo dos parasitos – Preparação do Antígeno 37
3.4.2.2. Protocolo Técnico 38
3.5. Validação do Teste 39
4. Resultados 41
5. Discussão 45
6. Conclusões 48
7. Bibliografia 49
8. Anexos 61
8.1. Artigo enviado para publicação 62
8.2. Resumos apresentados em congressos 68
i
AGRADECIMENTOS
A Deus por me fortalecer a cada dia, permitindo superar os momentos mais difíceis da minha vida.
Ao Dr. Rômulo Maciel, diretor do Centro de Pesquisas Aggeu Magalhães (CPqAM/FIOCRUZ) pela disponibilidade das instalações, materiais e equipamentos. Aos colegas do Departamento de Parasitologia do CPqAM, em especial ao Petronildo Bezerra, pelo convívio e auxilio. À Dra Otamires Silva, pela perseverança, dedicação e orientação no desenvolvimento desta tese. À Coordenação do Curso de Pós-graduação do NESC/CPqAM/FIOCRUZ : diretores, professores, funcionários e colegas, pela presteza e amizade durante o curso de Mestrado. Aos colegas Fábio Brayner e Luiz Carlos, pelo constante apoio e ensinamentos, que contribuíram para o crescimento deste trabalho. Ao Dr. Alexandre Bezerra de Carvalho, ex-diretor do CPqAM/FIOCRUZ, que possibilitou a disponibilidade do laboratório no início deste trabalho. A Ulisses Montarroyos, pela elaboração das análises estatísticas, assim como a todos que compõem o NICC/CPqAM/FIOCRUZ, pela atenção e cooperação cordial nos momentos de dificuldades. Às funcionárias da biblioteca do CPqAM/FIOCRUZ, em especial a Luciana Abrantes e Virgínia Guimarães, pela amizade e efetiva colaboração com as referências bibliográficas. À família Guimarães Vieira, especial ao Dr. Renato, homem simples, humilde e tão sábio a quem tomei como referência humana, pela sua dignidade, solidariedade e honestidade. A todos que direta e indiretamente contribuiram com uma boa e significante parcela particular, para que terminássemos esse grande trabalho.
ii
LISTA DE ABREVIATURAS
mg Miligrama
µl Microlitro
µm Micrômetro
BSA Albumina Sérica Bovina
IRM Intradermoreação de Montenegro
Kg Kilograma
ELISA Enzyme Linked Immunosorbent Assay
IFI Imunofluorescência Indireta
TAD Teste de Aglutinação Direta
LCD Leishmaniose Cutânea-Difusa
LCM Leishmaniose Cutânea-Mucosa
LIT Infuso de Fígado Triptose
LTA Leishmaniose Tegumentar Americana
LV Leishmaniose Visceral
SFB Soro Fetal Bovino
NNN Novy, McNeal e Nicole
NaCl Cloreto de Sódio
PCR Reação em Cadeia da Polimerase
cm Centímetro
Lu Lutzomyia
SFM Sistema Fagocítico Momonuclear
CPqAM Centro de Pesquisas Aggeu Magalhães
WHO World Health Organization (Organização Mundial de Saúde)
UFPE Universidade Federal de Pernambuco
FIOCRUZ Fundação Oswaldo Cruz
MS Ministério da Saúde
FUNASA Fundação Nacional de Saúde
DNA Ácido Desoxirribonucleíco
iii
LISTA DE FIGURAS
Pág.
Figura 1: Estátua descoberta no Equador (época pré-colombiana): lesões múltiplas do nariz ........................................................................
02
Figura 2: Amastigotas de Leishmania sp. em preparação citológica obtida por biópsia ...................................................................................................
06
Figura 3: Representação esquemática da ultra-estrutura das diferentes fases evolutivas de uma Leishmania.................................................................
08
Figura 4: Flebótomo vetor responsável pela transmissão da doença.......................
12
Figura 5: Leishmaniose Cutânea – Países altamente endêmicos (90%)..................
15
Figura 6: Ciclo Evolutivo da Leishmania spp..........................................................
17
Figura 7: Apresentação das Equações utilizadas para calcular sensibilidade, especificidade, valores preditivos positivo (VPP) e negativo (VPN).......
40
iv
LISTA DE TABELAS
Pág.
Tabela 1. Distribuição por faixa etária dos indivíduos pesquisados
segundo sexo e resultado do Teste IFI....................................................
42
Tabela 2: Tabela de contingência, mostrando a categorização dos
indivíduos estudados, aplicando-se a definição de caso de LTA...........
44
v
RESUMO
As leishmanioses, causadas por diferentes espécies de leishmanias, são uma das
seis doenças declaradas prioritárias pela Organização Mundial de Saúde (OMS).
Os sinais e sintomas de diferentes formas de leishmaniose são confusos e
freqüentemente semelhantes aos de outras doenças. Embora somente os testes
parasitológicos forneçam o diagnóstico de certeza, muitas vezes a escassez de
parasitas na Leishmaniose Tegumentar torna difícil a detecção dos mesmos.
Este trabalho teve como objetivo, avaliar o Teste de Aglutinação Direta (TAD), no
diagnóstico da Leishmaniose Tegumentar Americana (LTA) utilizando como
antígeno formas promastigotas de L. (V) braziliensis tratadas com tripsina, fixadas
em formalina e coradas com Coomassie blue. Um total de 100 soros humanos de
diferentes idades, sexos e cor foi utilizado nos testes. Dos 50 soros positivos para
IFI, 49 (98 %) demonstraram títulos a partir de 1:1.600 chegando até 1:51.200,
quando analisados pelo TAD. Dos soros restantes, negativos, apenas 8 (16 %)
apresentaram títulos iguais a 1:3.200, sendo esta também sua maior titulação.
Um ‘’cut-off ’’ de 1:1.600 foi capaz de discriminar 98 % de sensibilidade e 84 %
de especificidade. Os resultados apresentados sugerem que o TAD pode ser
indicado como um instrumento importante no diagnóstico da LTA, uma vez que
seus procedimentos são fáceis de serem executados, tanto no laboratório como no
vi
campo, é de baixo custo, não apresenta reação cruzada com outras doenças e não
necessita de equipamentos sofisticados.
vii
ABSTRACT
Leishmaniasis, caused for different species of leishmanias, is one of the six with
priority declared illnesses for the World Health Organization (WHO). The signals
and symptoms of different forms of leishmaniasis are confused and frequently
similar to the ones of other illnesses. Although the parasitological tests only supply
the certainty diagnosis, many times the scarcity of parasites in the Leishmaniasis
Cutaneous becomes difficult the detention of the same ones.
This work had as objective, to evaluate the Direct Agglutination Test (DAT), in the
diagnosis of American Cutaneous Leishmaniasis (ACL) using as antigen forms
promastigotas of L. (V) braziliensis treated with trypsina, fixed in formalin and
stained with Coomassie blue. A total of 100 human sérums of different ages, sex
and color was used in the tests. Of the 50 positive sera for IFI, 49 (98 %) had
demonstrated headings from 1:1.600 arriving up to 1:51.200, when analyzed for
the DAT. Of the remaining, negative sera, only 8 (16 %) had presented equal
headings the 1:3.200, being this also its bigger titulation.
One '' cut-off '' of 1:1.600 was capable to discriminate 98 % of sensitivity and 84 %
of specificity. The presented results suggest that the DAT can be indicated as an
important instrument in the diagnosis of the ACL, a time that its procedures are
easy to be executed, as much in the laboratory as in the field, it is of low cost, it
viii
does not present reaction crossed with other illnesses and it does not need
sophisticated equipment.
Silva, O.V Avaliação do Teste de Aglutinação Direta.......................... 1
1. INTRODUÇÃO
1.1 - Histórico das Leishmanioses
No homem, as Leishmanioses representam um complexo de patologias
associadas à infecção de células do Sistema Fagocítico Mononuclear (SFM) por
protozoários do gênero Leishmania. A forma cutânea da leishmaniose já havia
sido descrita no primeiro século da era cristã, com os relatos de feridas na pele
que recebiam o nome de acordo com a região onde ocorriam: botão de Bagdá no
Iraque, botão de Aleppo na Síria, ferida de Balkh no Afeganistão, etc. (Neves,
1998).
Na América, a doença é conhecida desde a época pré-colombiana (400 a
900 d. C.), através de cerâmicas peruanas e equatorianas, que documentam em
potes Mochica e Huaco, faces humanas com mutilações do nariz e dos lábios,
semelhantes às provocadas pela leishmaniose cutâneo-mucosa (Brücker e
Gentilini, 1987) (Figura 1).
Silva, O.V Avaliação do Teste de Aglutinação Direta.......................... 2
Figura 1. Estátua descoberta no Equador (época pré-Colombiana: lesões múltiplas do nariz. Fonte: La Fondation Rhône-Poulenc Santé
Silva, O.V Avaliação do Teste de Aglutinação Direta.......................... 3
Segundo Neves (1998), em 1885, Cunningham observou pela primeira vez
parasitos pertencentes ao gênero Leishmania, em casos de leishmaniose visceral
na Índia. Em seguida, vários outros pesquisadores também passaram a encontrar
e descrever esses parasitos. Em 1903, Ross criou o gênero Leishmania e no
mesmo ano, foi identificado o agente etiológico do botão-do-Oriente,
classificado como Leishmania tropica.
No Brasil, a leishmaniose foi conhecida quando Cerqueira em 1855,
identificou lesões de pele semelhantes ao botão-do-Oriente. A partir de 1908
durante a construção da Estrada de Ferro do Noroeste do Brasil, em São Paulo,
ocorreram numerosos casos, principalmente na cidade de Bauru, originando-se
daí o nome “úlcera-de-Bauru”. Lindenberg, Carini e Paranhos, em 1909,
relataram a presença das leishmanioses furunculosas e de úlceras crônicas em
uma população residente em Baúru, Estado de São Paulo, e ainda identificaram
o parasito causador dessas lesões (Terra, 1913).
Em 1911, Gaspar Vianna, considerando o agente etiológico da “úlcera-de-
Bauru” diferente da Leishmania tropica, propôs o nome de Leishmania
braziliensis. No mesmo ano, Carlos Chagas, durante uma excursão à Amazônia,
suspeita de casos de leishmaniose visceral. (Pessoa e Martins, 1988).
Silva, O.V Avaliação do Teste de Aglutinação Direta.......................... 4
1.2. Leishmaniose Tegumentar Americana: etiologia, morfologia, ciclo
biológico e epidemiologia.
1.2.1. Agente etiológico
Segundo Rey (1992), o gênero Leishmania, Ross 1903, agrupa espécies de
protozoários unicelulares, parasitos pertencentes à família Trypanosomatidae e à
ordem Kinetoplastida. Os organismos desta ordem apresentam de um a dois
flagelos, localizados em uma depressão da membrana plasmática, e uma
organela rica em DNA, o cinetoplasto. Dos nove gêneros da família
Trypanosomatidae, apenas dois, o Trypanosoma e a Leishmania, são de
interesse médico, sendo o primeiro responsável pela Doença de Chagas
(Américas) e pela Doença do sono (África), e o segundo pelas leishmanioses:
cutânea, cutânea-mucosa e visceral.
As leishmanias são parasitos digenéticos, encontrados nas formas
amastigotas como parasitos de células do SFM de mamíferos e flagelados
promastigotas, no trato digestivo de insetos vetores da família Psychodidae. Sua
transmissão ocorre através da picada do inseto infectado (Neves, 1998).
Silva, O.V Avaliação do Teste de Aglutinação Direta.......................... 5
1.2.2. Morfologia
As formas evolutivas dos parasitos do gênero Leishmania apresentam
grandes semelhanças morfológicas entre suas diversas espécies. As formas
amastigotas são arredondadas, intracelulares, vivem e se multiplicam no interior
de fagolisossomos das células do SFM dos mamíferos. Quando fixadas e
coradas pelos métodos derivados do Romanowski (Giemsa ou Leishman) e
observadas através do microscópio óptico, as amastigotas são identificadas
como organismos ovais ou esféricos, com citoplasma corado em azul-claro, um
único núcleo grande e arredondado que se cora em vermelho-púrpura (Figura 2).
No citoplasma, além de vacúolos, encontra-se uma organela característica,
o cinetoplasto em forma de bastonete, que também se cora em vermelho-púrpura
situando-se próximo ao núcleo, geralmente tangente a este. Não há flagelo livre,
mas apenas um rudimento que dificilmente pode ser visualizado. Os limites
micrométricos dos diâmetros da forma amastigota são de aproximadamente 1,5
a 3,0 x 3,0 a 6,0(m, dependendo da espécie (Rey, 1992; Neves, 1998).
Examinadas na microscopia eletrônica, observa-se que as formas amastigotas,
apresentam uma unidade de membrana plasmática trilaminar.
Silva, O.V Avaliação do Teste de Aglutinação Direta.......................... 6
No hospedeiro, a membrana do parasito é responsável pela aquisição de
nutrientes, secreção, excreção de metabólitos e principalmente, como proteção
dos diversos mecanismos de defesa do hospedeiro (Gottlieb e Dwyer, 1988).
Figura 2. Amastigotas de Leishmania sp. em preparação citológica obtida por biópsia. Fonte: Manual de Controle da Leishmaniose Tegumentar Americana, 2000
Silva, O.V Avaliação do Teste de Aglutinação Direta.......................... 7
Várias moléculas, com diversas funções, têm sido identificadas na
superfície das formas amastigotas de Leishmania. A maioria destas moléculas
está ligada à membrana via âncora de glicosil-fosfatilinositol (Moody, 1993;
McConville, 1996). Sob a membrana plasmática, existe um sistema de
microtúbulos (microtúbulos subpeliculares) em hélice disposto ao redor do
corpo do parasito. Na parte anterior do protozoário, a membrana forma uma
invaginação onde se localiza a bolsa flagelar contendo o pequeno flagelo. Nesta
região, não estão presentes os microtúbulos subpeliculares e são grandes as
atividades de excreção e pinocitose (Neves, 1998; Roberts e Janovy, 1996). São
observados ainda, no citoplasma, o aparelho de Golgi, o retículo
endoplasmático, além de vacúolos e inclusões (Neves, 1998).
As formas promastigotas se apresentam alongadas, extracelulares e são
geralmente encontradas no inseto vetor ou em cultura axênica. As organelas e
estruturas moleculares citadas anteriormente para as formas amastigotas são
essencialmente as mesmas encontradas nas formas promastigotas (Figura 3).
Silva, O.V Avaliação do Teste de Aglutinação Direta.......................... 8
Figura 3. Representação esquemática da ultra-estrutura das diferentes fases evolutivas de uma Leishmania. A = Forma amastigota. B = Forma promastigota. Fonte: Parasitologia Luis Rey, 1992
Silva, O.V Avaliação do Teste de Aglutinação Direta.......................... 9
O tamanho das formas promastigotas pode variar, dependendo da espécie,
entre 16 e 40µm de comprimento e 1,5 a 3µm de largura . Possuem um flagelo
longo e funcional que emerge da parte anterior do corpo, proporcionando
mobilidade ao parasito, além de ajudá-lo a se fixar no epitélio digestivo do
hospedeiro invertebrado (Pessoa e Martins, 1988). A estrutura deste flagelo é
típica de um axonema eucariótico com o característico arranjo 9+2 de
microtúbulos ligados à dineína. Uma estrutura peculiar, o bastão para flagelar, é
encontrado ao longo do axonema do flagelo de alguns organismos, entre eles,
diversas espécies da ordem Kinetoplastida (Bastin et al.,1996). Sua função
parece estar envolvida com a motilidade do parasito (Santrich et al., 1997). As
formas promastigotas metacíclicas são consideradas como estágios infectivos e
encontradas no vetor ou em culturas axênicas em fase estacionária (Sacks, 1988;
Alexander e Russel, 1992). Segundo Sacks (1988), estes estágios só podem ser
realmente identificados ao nível molecular. Formas evolutivas de Leishmania
bastante semelhante às formas promastigotas, são encontradas aderidas, pelo
flagelo, através de hemidesmossomos, ao epitélio do trato digestivo de
flebótomos infectados (Rangel et al.,1992; Neves, 1998).
Silva, O.V Avaliação do Teste de Aglutinação Direta.......................... 10
A multiplicação assexuada das leishmanias, por divisão binária e simples, é
iniciada pela duplicação do cinetoplasto, onde um mantém o flagelo
remanescente enquanto o outro promove a reprodução flagelar. Em seguida, o
núcleo se divide e, em seqüência, o corpo do parasito se fende, no sentido
ântero-posterior (Neves, 1998). Por outro lado, existem diversas evidências de
que o parasito possa sofrer alguma forma de reprodução sexuada, entre elas o
encontro de híbridos na natureza (Kelly et al.,1991; Kreutzer et al., 1994; Belli
et al., 1994).
1.2.3. Epidemiologia da Leishmaniose Tegumentar Americana
Hospedeiros e vetores
O gênero Leishmania é mais complexo do que originalmente se pensava,
possui um número de diferentes espécies que infecta uma larga variedade de
reservatórios (mamíferos silvestre ou não, pertencentes a várias ordens) e
vetores (flebotomíneos do gênero Lutzomyia) (Grimaldi et al.,1993; Marzochi e
Marzochi, 1994; Travi et al.,1998). Sabe-se que os pequenos mamíferos
Silva, O.V Avaliação do Teste de Aglutinação Direta.......................... 11
(roedores e marsupiais), considerados reservatórios naturais do parasito,
raramente a Leishmania produz doença. A infecção geralmente permanece
benigna e inaparente, sugerindo uma antiga e bem balaceada relação parasito-
hospedeiro. Em hospedeiros acidentais, entretanto, incluindo o homem e alguns
animais domésticos como cães e eqüinos, a infecção comumente produz seus
sintomas (Neves,1998). Em 1995 surgiram os primeiros relatos de flébotomos
como vetores das leishmanioses, com a identificação do gênero Phlebotomus
(atualmente vetor da Leishmania do Velho Mundo) como carreador da L. (L)
tropica (Herrer e Christensen,1975). Desde 1992, o gênero Lutzomyia tenha sido
considerado como o responsável pela transmissão da leishmaniose no Brasil e
nas Américas (Pessoa e Martins, 1998). Estes dípteros, pertencentes à família
Psychodidae, subfamília Phlebotominae, são insetos pequenos, medindo de 2 a
4mm de comprimento e possuem o corpo densamente coberto por pêlos. No
Brasil, são conhecidos por vários nomes: birigüi, mosquito-palha, tatuquira, asa-
dura, entre outros. Quando vivos, e em repouso, exibem uma posição
característica com as asas mantidas divergentes e semi-eretas. Apenas a fêmea é
hematófaga. Muito pouco se sabe sobre os locais de desenvolvimento dos
flebotímeos (Neves, 1998). (Figura 4.).
Silva, O.V Avaliação do Teste de Aglutinação Direta.......................... 12
Figura 4 – Flebótomo vetor responsável pela transmissão da doença.
Silva, O.V Avaliação do Teste de Aglutinação Direta.......................... 13
Espécies de hábitos silvestres como Lutzomyia wellcomei são altamente
antropofílicas, picando avidamente o homem. Outros como o Lu. whitmani,
adaptaram-se ao ambiente peridomiciliar ou mesmo intra-domiciliar
(Neves,1998). As diversas características epidemiológicas dos vetores e
hospedeiros vertebrados tais como habitat, horário de atividade, etc.,
determinam como se processa o ciclo de transmissão da doença é
essencialmente silvestre, devido ao fato dos mamíferos hospedeiros serem
animais selvagens. Os seres humanos geralmente se infectam apenas quando
penetram na floresta, embora possa haver o risco da doença atingir a zona
periurbana de cidades próximas à áreas de desflorestamento (Marzochi e
Marzochi, 1994). Por outro lado no calazar, doença causada pela L. (L.) chagasi,
pode existir um ciclo silvestre, com a participação da raposa (Cerdocyon thous)
e talvez, de marsupiais (Travi et al., 1998), e um ciclo doméstico, onde o cão
parece ser o reservatório principal do parasito onde o homem é geralmente
infectado (Courtenay et al., 1994). O vetor Lu. Longipalpis, parece ser bem
adaptado tanto à floresta quanto ao peridomicílio. O papel do homem como
reservatório do calazar não deve ser destacado (De Andrade,1997).
Silva, O.V Avaliação do Teste de Aglutinação Direta.......................... 14
1.2.4. Distribuição geográfica
As leishmanioses acompanham a distribuição do inseto vetor, pertencente a
sub-família Phlebotominae, podendo ser encontradas praticamente em todo o
mundo. Atualmente, as leishmanioses estão presentes em quatro continentes e
são endêmicas em 88 países, atingindo aproximadamente 12 milhões de pessoas
e com um número estimado de 1,5 a 2 milhões de casos por ano. Destes, 1 a 1,5
milhões são casos de leishmaniose cutânea e 500.000, de leishmaniose visceral
(WHO,1998). Aproximadamente 37 milhões de pessoas estão sob risco de
contrair a doença (Ivens e Smith,1997). (Figura 5.).
Grande parte dos países americanos, inclusive os Estados Unidos relatam
casos autóctones de leishmaniose (McHugh et al.,1996). Segundo a OMS, o
Brasil está entre os países onde ocorrem a maioria dos casos de leishmaniose no
mundo, tanto na forma cutânea como visceral. Tanto a Leishmaniose Visceral
(LV) como as Leishmanioses Tegumentar Americana (LTA): cutânea, cutâneo-
mucosa e cutâneo-difusa, são doenças de notificação compulsória em todo
território nacional.
Silva, O.V Avaliação do Teste de Aglutinação Direta.......................... 15
Figura 5. Leishmaniose cutânea Países altamente endêmicos (90%) - Fonte: WHO/TDR, 1996
Silva, O.V Avaliação do Teste de Aglutinação Direta.......................... 16
1.2.5. Ciclo biológico
Os hospedeiros vertebrados são infectados quando formas promastigotas
infectantes (metacíclicas) são inoculadas, pelas fêmeas dos insetos vetores,
durante o repasto sanguíneo. Ao ser inoculado no vertebrado, o parasito
necessita superar o ambiente hostil personificado pelas defesas orgânicas do
hospedeiro.
Os promastigotas, ao entrarem no macrófago através de um vacúolo
endossômo, gradativamente se transformam em amastigotas imóveis e
arredondadas. Dentro do vacúolo fagocitário, os amastigotas multiplicam-se por
divisão binária até ocupar todo o citoplasma do macrófago. Esgotando-se sua
resistência, é pressuposto que a membrana do macrófago se rompe
mecanicamente liberando os amastigotas no tecido onde são novamente
fagocitadas (Figura 6). No entanto, é possível que moléculas produzidas pelo
parasito, como a leishporina, promovam a ruptura da membrana do macrófago
(Horta, 1997).
Silva, O.V Avaliação do Teste de Aglutinação Direta.......................... 17
Ciclo de vida da Leishmaniose spp
Os promastigotas entram no macrófago e se transformam em
amastigotas
O hospedeiro vertebrado é infectado com
promastigotas, após ser picado pelo inseto vetor
Dentro do inseto vetor os amastigotas
transforma-se em promastigotas
O vetor ingere macrófagos
infectados durante a hematofagia
O tipo de Leishmaniose (i.e., cutânea, visceral, etc) é determinada
pela localização primária dos macrófagos infectados
O macrófago se rompe, os amastigotas são liberados e vão infectar outros macrófagos
Figura 6. Ciclo Evolutivo da Leishmania spp.
Fonte: Ohio State University, 2000
Silva, O.V Avaliação do Teste de Aglutinação Direta.......................... 18
O curso da infecção nos hospedeiros vertebrados, incluindo o homem, é
bastante variável e dependendo da espécie do parasito, esta poderá ficar restrita
à pele ou visceralizar, tornando-se sistêmica. A infecção no vetor se dá através
da eventual ingestão de macrófagos contendo parasitos no seu interior, por
fêmeas de flebótomos, durante seu repasto sanguíneo no vertebrado (Roberts e
Janovy, 1996).
1.3. Relação parasito-hospedeiro e resposta imune
O desfecho da relação parasito-hospedeiro, seja no sentido da cura ou na
produção de formas clínicas as mais diversas, depende de fatores genéticos do
parasito ou do hospedeiro, bem como das interações que se desenvolvem entre
as populações de células hospedeiras (macrófagos) e outras células
imunocompetentes (T e B) envolvidas em mecanismos de estimulação ou de
modulação das reações imunológicas.
O parasito, uma vez inoculado no organismo vertebrado, é fagocitado pelos
macrófagos através da interação entre receptores CR3 com glicoconjugados e
lectinas da Leishmania, como a Gp63 (proteinase dependente de zinco) e os
Silva, O.V Avaliação do Teste de Aglutinação Direta.......................... 19
lipofosfoglicanos (LPG), glicolipídeos presentes na membrana, iniciando assim
seu estágio de desenvolvimento intracelular (Mosser, Springer & Diamond,
1992). O parasito produz alterações nas células infectadas, nas quais
eventualmente sobrevivem e se multiplicam no organismo hospedeiro, que
paralelamente desenvolve suas respostas à infecção. Na infecção, o encontro dos
antígenos parasitários com as células imunocompetentes possivelmente ocorre
durante os breves períodos extracelulares do parasito, quando são inoculados, ou
no momento da ruptura dos macrófagos infectados, com liberação parasitária.
Os antígenos processados, ao serem apresentados às células T, dependendo da
espécie de Leishmania e da susceptibilidade do hospedeiro, determinarão a
resposta do tipo Th1 ou do tipo Th2, que podem ser diferenciadas pelo seu
padrão de produção de citocinas (Reed & Scott, 1993).
As leishmanioses consistem em um complexo de doenças, que tanto do
ponto de vista imunológico, como do ponto de vista clínico, podem ser
enquadradas em três principais categorias: cutânea, mucocutânea e visceral. Nas
formas cutâneas, exemplificada pela doença causada por L. major e L.tropica no
Velho Mundo e L. mexicana e L. braziliensis no Novo Mundo, a recuperação
Silva, O.V Avaliação do Teste de Aglutinação Direta.......................... 20
espontânea geralmente ocorre e caracteriza-se por reação do tipo
hipersensibilidade retardada aumentada, resposta anticórpica de baixa
intensidade e resistência à reinfecção. Na leishmaniose mucocutânea, causada
por L. braziliensis, a recuperação ocorre eventualmente, apesar de ser muito
lenta. Tanto as reações de hipersensibilidade retardada, como a resposta
anticórpica estão presentes.
Na leishmaniose visceral, causada por espécies do complexo L. donovani, a
recuperação espontânea é rara e as infecções são caracterizadas por fraca reação
de hipersensibilidade retardada e intensa produção de anticorpos.
1.4. Formas clínicas da Leishmaniose Tegumentar Americana
Existem várias formas de leishmaniose tegumentar americana.
a) Leishmaniose cutânea (LC) consiste em lesões ulceradas que podem
apresentar três formas: localizada, caracterizada pela lesão única; disseminada,
contendo numerosas lesões em várias regiões do corpo e a forma difusa, que é
nodular.
As lesões ulceradas cutâneas manifestam-se com quinze dias ou mesmo
Silva, O.V Avaliação do Teste de Aglutinação Direta.......................... 21
após vários anos de infecção. Estas úlceras variam de tamanho, podendo medir
0,25 cm a 30 cm de diâmetro. Classicamente, a lesão tem bordos elevados, em
moldura, fundo granulomatoso, com ou sem exsudação. Observam-se também
outros tipos de lesões como: úlcero-crostosa, impetigóide, úlcero-vegetante,
verrucosa, tuberosa, linquenóide e outras. Nestas formas, na fase inicial,
freqüente a linfangite e/ou adenopatia satélite, que poderia preceder a lesão de
pele (Pessoa & Barreto, 1948; Marsden, 1986).
Na forma difusa, as lesões são papulosas ou nodulares, distribuem-se
amplamente na superfície corporal, são deformantes e muito graves,
semelhantes às lesões manisfestadas na hanseníase virchowiana. Uma das
características da forma difusa é que os indivíduos afetados são anérgicos e a
enfermidade é crônica recidivante, não existindo cura. Toda as lesões são ricas
em parasitas. Supõe-se que haja uma deficiência imunológica específica do
hospedeiro em combinação com um parasita relativamente não imunogênico.
b) Leishmaniose mucocutânea (LMC), compreende as formas infiltrativas
iniciais, ulcerosas, vegetantes e úlcero-vegetante. Acomete a região
nasofaríngea, laringe e cavidade oral. É de natureza metastática, pode ou não
Silva, O.V Avaliação do Teste de Aglutinação Direta.......................... 22
acompanhar os quadros cutâneos e apresentar-se até 24 horas após a lesão
inicial.
O diagnóstico diferencial inclui outras doenças crônicas de lesões ulceradas
ou não ulceradas tais como: as lesões cutâneas, devem ser excluídas as úlceras
traumáticas, as úlceras de estase, a úlcera tropical, úlceras de membros inferiores
por anemia falciforme, piodermites, paracoccidioidomicose, esporotricose, lúpus
vulgaris, sarcoidose, cromomicoses cutâneas, sífilis, tuberculose cutânea,
blastomicose, donovanose e epiteliomas. A hanseníase virchowiana deverá ser
excluída, pincipalmente no diagnóstico diferencial da leishmaniose cutânea
difusa e nas lesões mucosas, o diagnóstico diferencial deve ser feito com a
paracoccidioidomicose, hanseníase virchowiana, rinoscleroma, bouba, sífilis
terciária, granuloma médio facial e neoplasias (Molyneux & Ashford, 1983).
1.5. Diagnóstico
O diagnóstico da leishmaniose pode ser feito a partir de um conjunto de
abordagens: a) manifestações clínicas compatíveis associadas à procedência de
uma área endêmica; b) resposta à terapêutica específica; c) detecção do parasita
Silva, O.V Avaliação do Teste de Aglutinação Direta.......................... 23
em material de biópsia, através de observação histológica de formas amastigotas
ou através de cultura de amostras clínicas para a detecção de promastigotas ; d)
detecção do DNA do parasita, particularmente DNA de cinetoplasto; e)
imunodiagnóstico (detecção de anticorpos específicos, detecção de antígenos
parasitários e detecção de imunidade por células) (Kar, 1995).
Os sinais e sintomas de diferentes formas de leishmaniose são confusos e
freqüentemente são semelhantes aos de outras doenças. Nessas circunstância, o
diagnóstico é dado com base no conjunto de dados disponíveis sobre o caso.
Classicamente, a detecção do parasita é feita pela observação direta ao
microscópio de preparados citológicos corados pelo Giemsa, que é um
procedimento sensível e rápido, podendo diagnosticar mais de 50% dos
pacientes com lesões recentes (Lane et al., 1994). Na leishmaniose tegumentar,
a demonstração das formas amastigotas pode ser feita também por técnicas
imunocitoquímicas em tecidos de lesão e em “imprints” do tecido ou aspirado de
lesão colocados sobre papel de nitrocelulose. Na identificação dos parasitas tem
sido utilizados os anticorpos policlonais e monoclonais (Salinas et al., 1989).
A biópsia histopatológica é utilizada como técnica diagnóstica em estudo
de processo ulcerativo desconhecido. A menos que se observem as formas
Silva, O.V Avaliação do Teste de Aglutinação Direta.......................... 24
amastigotas, os fragmentos histopatológicos são freqüentemente semelhantes
aos de outras enfermidades deramtológicas inflamatórias ou granulomatosas.
Dado que sua sensibilidade é baixa devido à escassez de parasitas ou distorção
dos amastigotas ao fixar o tecido, a biópsia de pele é muito mais útil para
diagnóstico diferencial, já que estabelece outras etiologias (Weigle et al., 1987).
Um dos métodos diagnósticos mais específicos para a leishmaniose tegumentar
americana consiste no isolamento do parasita em cultura a partir de material
obtido por punção aspirativa ou biópsia das lesões de pacientes.
Um outro método diagnóstico consiste em inocular animais susceptíveis,
sendo o hamster o mais usado para o cultivo in vivo de aspirado ou homogenato
de tecidos infectados. Além de ser falho algumas vezes, a cultura de biópsias
requer pessoal e estrutura laboratorial especializados, não sendo adequada para
rastreamentos epidemiológicos em grande escala. Existe muita discrepância
quanto ao êxito deste procedimento e a positividades das culturas podem variar
entre 13 a 90% (Cuba, Marsden & Barreto, 1981; Weigle et al., 1987; Navin,
Arana & Mérida, 1990). Entre os fatores que determinam esta variabilidade,
podem estar as diferenças nas técnicas utilizadas para obter as amostras,
Silva, O.V Avaliação do Teste de Aglutinação Direta.......................... 25
diferenças entre os meios de cultivo empregados e diferenças entre as espécies
de leishmanias envolvidas.
Com o avanço das técnicas, a biologia molecular vem proporcionar a
identificação de Leishmania em casos de doenças subclínicas, casos com poucos
parasitas e no acompanhamento do tratamento. A detecção do DNA do parasito
pode ser feito por hibridação “in situ” ou pela reação em cadeia da DNA
polimerase (PCR). A amplificação de seqüências específicas de DNA parasitário
por PCR permite a detecção de pouquíssima quantidade de parasitos em
diversos tipos de material (Wilson, 1995). A hibridização é feita com o uso de
sondas que permitem a distinção de complexos e mesmo espécies parasitárias.
Foram descritas sondas específicas para L. major, L. tropica, L. donovani e L.
braziliensis e “primers”para PCR específicos para L. donovani e L. braziliensis
(Barker, 1989; Rogers, Poper & Wirth, 1990; De Bruijn & Barker, 1992;
Grimaldi &Tesh, 1993). Devido à sua grande sensibilidade, potencial e
capacidade de distinguir entre infecções passadas e ativas de LTA, a PCR
poderá futuramente se tornar uma ferramenta importante para o diagnóstico de
infecções subclínicas e na avaliação da resposta terapêutica. Contudo, são
abordagens dispendiosas, complexas, requerendo estrutura especializada,
Silva, O.V Avaliação do Teste de Aglutinação Direta.......................... 26
dificilmente encontradas nas zonas endêmicas.
A intradermorreação pelo teste de Montenegro (IRM) é um dos testes mais
utilizados no imunodiagnóstico, devido à sua sensibilidade e especificidade,
apresentando-se positiva na grande maioria dos casos de LTA. Pode ser negativa
nos casos em que as lesões são recentes (seis semanas ou menos), assim como
nos casos de leishmaniose cutânea difusa e visceral (Marzochi et al., 1980).
Entretanto, em áreas de alta endemicidade é muito freqüente encontrar
reatividade a esta prova na população, de tal forma, que esta não é útil no
diagnóstico de lesão ativa. Shaw & Lainson (1975) relataram 84 e 100% de
positividade para as lesões cutâneas simples e mucocutâneas, respectivamente.
Nos casos de leishmaniose cutânea difusa, o teste de Montenegro se mostrou
não reativo, podendo ser útil quando os parasitas são escassos nas lesões e no
diagnóstico de visitantes após retorno de áreas endêmicas (Kar, 1995).
Silva, O.V Avaliação do Teste de Aglutinação Direta.......................... 27
1.6. Tratamento
Apesar dos esforços recentes na pesquisa de novas drogas para o
tratamento específico das leishmanioses, os antimoniais pentavalentes
permanecem como as drogas de eleição. São eles antimoniato de meglumina
(Glucantime®) e stibogluconato de sódio (Pentostam®). Estas drogas são
administradas por via parenteral, na dose de 10 a 20 mg/kg/dia durante 30 dias,
em até 3 séries consecutivas de tratamento com intervalo de 10 dias entre uma
série e outra. Se não houver cicatrização após 3 meses do término do tratamento,
o esquema deverá ser repetido.
Não havendo resposta satisfatória ao tratamento com antimoniais
pentavalentes, as drogas de segunda escolha são: a) Anfotericina B
(Fungizon®), administrada via endovenosa, gota-a-gota, na dose diária de 0,2
mg/kg até o máximo de 50 mg, dissolvidos no soro glicosado 5% com tempo de
infusão de 3 a 4 horas; b) Pentamidina de 4mg/kg/dia, via intra muscular, de 2
em 2 dias (WHO, 1996).
Silva, O.V Avaliação do Teste de Aglutinação Direta.......................... 28
1.7. Justificativa
Apesar do diagnóstico conclusivo da leishmaniose depender da detecção do
parasito em amostras biopsiadas de tecidos infectados, da detecção de
amastigotas em amostras coradas ou da detecção de promastigotas através de
cultura de biópsias em meio de cultura, muitas vezes os resultados são
negativos. Os parasitos são escassos em pacientes com mais de um ano de
evolução e, além disso, em áreas rurais e pequenos vilarejos não existe estrutura
para inocular os parasitos em meios de cultura ou animais. Nesta situação, o
sorodiagnóstico parece, portanto, ser uma alternativa válida de diagnóstico de
infecção leishmaniótica em áreas de baixa endemicidade e no diagnóstico em
visitantes recentemente expostos a áreas endêmicas. Um estudo mais elaborado,
no sentido de caracterizar a resposta humoral, pode ser útil para uma melhor
compreensão dos mecanismos imunes envolvidos na resposta protetora, além de
possibilitar a identificação de antígenos fortemente reativos que poderão ser
úteis na elaboração de testes diagnósticos mais eficientes e aprimorados.
Silva, O.V Avaliação do Teste de Aglutinação Direta.......................... 29
A baixa sensibilidade detectada no método sorológico convencional de IFI
para diagnóstico de uma infecção leishmaniótica e a alta reação cruzada com
pacientes chagásicos nos chama a atenção para analisar na rotina de diagnóstico
da LTA métodos mais sensíveis e específicos, como o Teste de Aglutinação
Direta (TAD), acompanhados de um diagnóstico clínico e sorológico diferencial
entre Leishmanias especialmente nas zonas onde coexistem os vetores de ambas
enfermidades (Pozzoli et al ,1997).
O Teste de Aglutinação Direta (TAD), na sua versão aperfeiçoada, tem sido
empregado com sucesso no diagnóstico da leishmaniose visceral ou Calazar. Ele
permite um diagnóstico extraordinariamente preciso, com elevada sensibilidade
e sem reações cruzadas (Harith et al., 1987). É um método que dispensa a
utilização de equipamentos sofisticados, é de baixo custo e seus procedimentos
são simples de serem executados. Do ponto de vista técnico, uma das maiores
vantagens que apresenta é a não utilização de um conjugado de imunoglobulina
espécie-específico, podendo ser útil em casos de infecções naturais e
experimentais de mamíferos (Garcez et al., 1996). Além disso, o antígeno tem
uma longa duração quando bem acondicionado.
Silva, O.V Avaliação do Teste de Aglutinação Direta.......................... 30
Vários autores descreveram a utilização do Teste Aglutinação Direta de
parasitas, comparando com os resultados do Teste de Imunofluorescência.
Vattuone e Yanowsky (1971), uitlizando uma suspensão de formas
epimastogotas de T. cruzi, tratadas em enzimas e fixadas pelo formol, obtiveram
boa sensibilidade na detecção de anticorpos na fase aguda da doença de Chagas.
Alain e Kagan, em 1975, chamam a atenção da necessidade da realização
de tratamento das leishmanias com tripsina e preservação em formalina durante
a preparação do antígeno para evitar auto-aglutinação.
Harith e colaboradores em 1986, modificaram a técnica para utilização no
diagnóstico sorológico da leishmaniose visceral adicionando-se à preparação do
antígeno o azul brilhante de Coomassie, possibilitando a visualização de títulos
superiores a 1:51.200. O título indicativo de leishmaniose visceral foi
considerado superior a 1:1.600 com sensibilidade de 100% e especificidade de
99,3%.
Em 1987, Harith e colaboradores padronizaram o teste de microaglutinação
de formas epimastigotas de T.cruzi, tratadas com tripsina e coradas pelo
Comassie Blue. O tratamento dos soros com 2-mercaptaetanol foi fundamental
Silva, O.V Avaliação do Teste de Aglutinação Direta.......................... 31
para a eliminação de anticorpos inespecíficos obtendo altos índices de
sensibilidade e especificidade.
Neste nosso, estudo procuramos avaliar o TAD como método utilizado no
auxílio ao exame clínico e epidemiológico da LTA associada à L. braziliensis
com o propósito de contribuir e facilitar o diagnóstico na áreas endêmicas.
Silva, O.V Avaliação do Teste de Aglutinação Direta.......................... 32
2. OBJETIVOS _________________________________________
Silva, O.V Avaliação do Teste de Aglutinação Direta.......................... 33
2.1. Objetivo Geral
Analisar a validade do Teste de Aglutinação Direta (TAD) no diagnóstico
da Leishmaniose Tegumentar Americana Humana, em comparação com a
técnica de Imunofluorescência Indireta (IFI).
2.2. Objetivos Específicos
Verificar a importância do TAD como indicador da prevalência da doença,
observando a sensibilidade e a especificidade do teste diante do convencional.
Investigar a infecção por Leishmania com finalidade de poder distinguir as
manifestações clínicas entre as leishmanioses (LTA e LV) e a doença de
Chagas, por acaso existentes na mesma área.
Silva, O.V Avaliação do Teste de Aglutinação Direta.......................... 34
3. MATERIAL E MÉTODOS _________________________________________
Silva, O.V Avaliação do Teste de Aglutinação Direta.......................... 35
3.1. Casuística e métodos
Os soros utilizados neste estudo fazem parte da soroteca do Laboratório de
Leishmaniose do Departamento de Parasitologia/CPqAM/FIOCRUZ, utilizados
em projetos anteriores submetidos à Comissão se Ética Médica da Universidade
Federal de Pernambuco/UFPE e posteriormente à Comissão de Ética Médica do
Centro de Pesquisas Aggeu Magalhães/CPqAM/FIOCRUZ. Ambos os projetos
foram aprovados pelas respectivas comissões.
3.2. Definição de caso
A definição de caso de leishmaniose Tegumentar Americana (LTA) foi
baseada nos seguintes critérios;
1 - Presença de lesões tegumentares típicas e antecedentes epidemiológicos.
2 - Positividade nos testes diagnósticos seguintes:
sorologia (IFI) e exame histopatológico.
Silva, O.V Avaliação do Teste de Aglutinação Direta.......................... 36
3.3. Amostras de soro
A amostra consistiu de 100 soros de indivíduos de ambos os sexos, idades
variadas, residentes em área endêmica para LTA (Município de Primavera/PE),
com confirmação através da sorologia (IFI) ou exame histopatológico.
- Foram distribuídos da seguinte maneira:
50 soros positivos (sorologia e histopatológico positivos)
50 soros negativos (sorologia negativa)
3.4. Exames Imunológicos
3.4.1. Teste de Imunofluorescência Indireta (IFI)
(Leishmaniose Humana - kit Bio-Manguinhos).
A IFI foi utilizada para detecção de anticorpos circulantes específicos
contra Leishmania sp. em soros humanos essencialmente de acordo com
Silva, O.V Avaliação do Teste de Aglutinação Direta.......................... 37
Camargo (1966). Foi utilizado o Kit-IFI-Leishmaniose humana produzido por
Bio-Manguinhos-FIOCRUZ, seguindo as instruções do fabricante. Foram
utilizados dois soros padrão (positivo e negativo) na diluição de 1:40, tendo sido
considerados positivos aqueles que apresentaram fluoreescência das leishmanias
na lâmina a uma diluição sérica de 1:40.
3.4.2. Teste de Aglutinação Direta (TAD).
3.4.2.1. Cultivo dos Parasitas – Preparação do antígeno
Promastigotas de Leishmnania (V.) braziliensis (MHOM/BR/75/M-2903)
foram cultivadas em meio LIT (suplementado com 10% de SFB e 1% de
Streptomicina/Penicilina), NNN com fase sólida ágar sangue, e na fase líquida o
RPMI 1640 com soro fetal bovino. Foram utilizadas na produção de antígenos
(para obtenção do antígeno total), segundo o método de Harith et al (1988); os
parasitos foram lavados em solução de Locke (pH 7,7) a 4oC, tratados com
tripsina (1:250, Gibco, Detroit, USA) a 0,4% em solução de Locke por 45 min a
37oC, e fixados por 20h a 4oC com formalina a 1% em solução de Locke. Após
Silva, O.V Avaliação do Teste de Aglutinação Direta.......................... 38
lavagem em salina-citrato (0,15M cloreto de sódio + 0,056M citrato de sódio,
pH 7,4), os parasitos foram corados com azul brilhante de Coomassie a 0,1% em
salina por 90 min, sob agitação. Os parasitos, após corados, foram lavados em
salina-citrato e ressuspensos com formalina a 1% em salina-citrato. A
suspensão foi filtrada em filtro Millipore (41µm/dm. de porosidade) e a
concentração de parasitas foi ajustada para 2x108 parasitos/ml em formalina. A
preparação foi mantida no escuro a 4°C até sua utilização.
3.4.2.2. Protocolo técnico
Para a realização do teste, diluições seriadas de 1:50 até 1:51.200 dos 100
soros foram feitas com NaCl a 0,9% suplementado com 1% de albumina sérica
bovina (BSA) e 2-mercaptoetanol 0,1M (SIGMA). Os soros diluídos foram
colocados em microplacas de fundo em “V”, começando a partir da segunda
coluna. A primeira coluna, contendo diluente + antígeno, foi usada como
controle da reação. Após a distribuição dos soros, foi adicionado 50µl do
antígeno em cada poço. As placas foram então incubadas durante 24h à
temperatura ambiente e lidas em seguida. O título de aglutinação foi
Silva, O.V Avaliação do Teste de Aglutinação Direta.......................... 39
determinado como sendo o do poço anterior àquele onde se observava um
“botão” idêntico ao observado no poço controle da 1a coluna..
3.5. Validação do Teste :
Os parâmetros sorológicos (sensibilidade e especificidade) do Teste de
Aglutinação Direta realizados com antígeno de promastigotas de L. (V)
braziliensis da cepa MHOM/BR/75/M-2903, foram estimados de acordo com
Guimarães (1985), Ferreira & Ávila (2001), utilizando uma tabela de dupla
entrada. (Figura 7).
Silva, O.V Avaliação do Teste de Aglutinação Direta.......................... 40
Figura 7. Apresentação das equações utilizadas para calcular sensibilidade,
Teste
Doença Presente
Doença Ausente
Positivo
Positivos verdadeiros
a
Positivos falsos
b
Negativo
Negativos falsos
c
Negativos verdadeiros
d
Total
a + c
b + d
Sensibilidade = a Especificidade = b _______ _______ a + c b + d
VPP = a VPN = d ________ ________ a + b c + d
Silva, O.V Avaliação do Teste de Aglutinação Direta.......................... 41
especificidade, valores preditivo positivo (VPP) e negativo (VPN).
4. RESULTADOS
Um total de 100 soros de indivíduos de ambos os sexos, na faixa etária de 0
a 65 e mais (Tabela 1), residentes em área endêmica para LTA (Município de
Primavera/PE), com confirmação através da sorologia (IFI) ou exame
histopatológico.
Dos 50 soros positivos para IFI, 49 (98%) demonstraram títulos a partir de
1:1.600 chegando até 1:51.200. Dos soros restantes, negativos, apenas 8 (16%)
apresentaram títulos iguais a 1:3.200, sendo esta também sua maior titulação.
A distribuição dos soros em relação aos seus títulos está demonstrada na
figura 8. Um “Cut-off” de 1.1600 foi capaz de discriminar 98% de sensibilidade
e 84% de especificidade (Tabela 2). Os resultados obtidos com o TAD neste
estudo indicam a possibilidade do deste teste sorológico como mais um
diagnóstico.
Silva, O.V Avaliação do Teste de Aglutinação Direta.......................... 42
Tabela 1. Distribuição por faixa etária dos indivíduos pesquisados segundo
sexo e resultado do teste IFI
Sexo
Faixa Feminino
Masculino
Etária (em anos)
Positivo
Negativo
Positivo
Negativo
n
%
n
%
Total
n
%
n
%
Total
Total
0 a 5
01
4,8
00
0,0
01
02
6,9
00
0,0
02
03
6 a 12 04 19,0 03 17,6 07 03 10,3 12 36,4 15 22
13 a 19 03 14,3 04 23,5 07 05 17,2 05 15,2 10 17
20 a 39 07 33,3 05 29,4 12 10 34,5 05 15,2 15 27
40 a 65 06 28,6 04 23,5 10 06 20,7 09 27,3 15 25
65 e mais 00 0,0 01 5,9 01 03 10,3 02 6,1 05 06
Total
21
100,0
17
100,0
38
29
100,0
33
100,0
62
100
Silva, O.V Avaliação do Teste de Aglutinação Direta.......................... 43
Figura 8. Distribuição dos títulos do teste de aglutinação direta de uma
amostra de 100 soros humanos com diagnósticos positivos e negativos para
Leishmania (V) braziliensis.
0
5
10
15
20
25
30
800 1600 3200 6400 12800 25600 51200
Diluições do soro
nº d
e in
diví
duos
NegativoPositivo
Silva, O.V Avaliação do Teste de Aglutinação Direta.......................... 44
Tabela 2. Tabela de contigência, mostrando a categorização dos indivíduos
estudados, aplicando-se a definição de caso de LTA.
IFI
+
-
TAD
+
49
8
-
1
42
TOTAL
50
50
Silva, O.V Avaliação do Teste de Aglutinação Direta.......................... 45
5. DISCUSSÃO
O diagnóstico laboratorial da leishmaniose é tradicionalmente feito através
da identificação de amastigotas em amostras teciduais ou esfregaços, e cultura in
vitro de parasitos presentes em biópsias, associado ao teste cutâneo do tipo
hipersensibilidade retardada. A pesquisa direta do parasito, ou o seu isolamento
através de cultura não são testes muito sensíveis e o sucesso é variável (De
Bruijn et al., 1993).
A discordância dos resultados entre a doença e os diferentes métodos
sorológicos existentes, leva ao questionamento sobre a validade da sorologia
nos inquéritos epidemiológicos para LTA. Os resultados sorológicos só
permitem a análise com maior facilidade quando são utilizados no diagnóstico
diferencial juntamente com outros parâmetros ou no acompanhamento
terapêutico (Sanchez et al., 1992).
Para a análise técnica e estatística de um exame sorológico são empregados
como parâmetros fundamentais a sensibilidade e a especificidade apresentada
Silva, O.V Avaliação do Teste de Aglutinação Direta.......................... 46
pelo referido teste. A especificidade do teste sorológico pode ser influenciada
por inúmeros fatores que levam a falsos resultados.
Indivíduos poliinfectados por parasitas intestinais apresentam um
somatório de anticorpos que cruzam com inúmeros antígenos-alvos dos testes
sorológicos.(Ferreira & Ávila, 2001). As reações sorológicas de
imunofluorescência indireta (IFI) e o teste imunoenzimático “enzyme linked
imunosorbent assay” (ELISA) são de utilidade no diagnóstico de forma clínica
de lesões extensas, múltiplas e nas lesões mucosas secundárias e primárias
(Mendonça et al., 1988). No entanto, apresentam reações cruzadas com
leishmaniose visceral e doença de Chagas (causadas por organismos próximos
filogeneticamente).
Quando promastigotas de Leishmania são utilizados como antígenos em
IFI, a reatividade cruzada entre espécies relacionadas (como Trypanosoma
cruzi) e não relacionadas (Mycobacterium tuberculosis) pode ser observada
(Carmago & Rebonato, 1966; Matossian, Kurban & Malwk, 1975; Anthony,
Christenson & Johnson, 1980).
Silva, O.V Avaliação do Teste de Aglutinação Direta.......................... 47
No caso específico das leishmanioses, um fator que contribui para
dificuldade de implementação de testes mais eficazes é a grande diversidade de
agentes etiológicos e os casos clínicos associados.
Torna-se imperativo a necessidade de desenvolvimento e validação de
testes diagnósticos mais sensíveis e com maior acurácia (Rodrigues, 2000).
Dentro deste cenário o TAD com antígeno L.(V.) braziliensis revelou
98% sensibilidade e 84% de especificidade, tendo como referência um limiar
de reatividade de 1:1600. Esses resultados estão de acordo com outros obtidos
por Harith e col (1987), Garcez et al (1996), Bezerrra et al (1996), Nielsen
(1992) que utilizaram o TAD com a finalidades diagnósticas semelhantes.
O nível de especificidade obtido neste estudo sugere que o TAD pode ser
usado como diagnóstico para LTA, principalmente nas regiões onde se possa
excluir a leishmaniose visceral e a doença de Chagas.
Fica demonstrado também neste estudo que o TAD, por sua facilidade de
realização, bem como baixo custo, podetá ser usado no diagnóstico da
infecção por Leishmania.
Silva, O.V Avaliação do Teste de Aglutinação Direta.......................... 48
6. CONCLUSÕES
O Teste de Aglutinação Direta (TAD) demonstrou um bom desempenho
no sorodiagnóstico da Leishmaniose Tegumentar Americana (LTA), comparável
àquele observado em IFI. A sua utilização em ampla escala para o diagnóstico
da doença é indicada, desde que monitorada por um laboratório de referência
que possa garantir a qualidade dos antígenos utilizados.
As observações realizadas neste estudo contribuíram para o entendimento
dos procedimentos da técnica e elucidaram aspectos, não descritos por outros
autores, relacionados às dificuldades inerentes à produção de antígenos.
Um dos pontos mais importantes abordados neste estudo refere-se à
utilização do TAD em casos de Leishmaniose Visceral e doença de Chagas
como diagnóstico diferencial, bem como para outras patologias de pele com
formas clínicas semelhantes a LTA.
Silva, O.V Avaliação do Teste de Aglutinação Direta.......................... 49
7. BIBLIOGRAFIA
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