2018

UNESP

UNIDADE III ENDÓCRINOLOGIA E

REPRODUÇÃO

1- Fator Inibidor da Prolactina (PIF)

Esta aula serve como um bom modelo para o estudo do arco reflexo nervoso

que controla a secreção de hormônios essenciais para a lactação. O desenvolvimento

completo da glândula mamária depende da ação de vários hormônios, como:

estrógeno, progesterona, hormônio do crescimento, prolactina, hormônios tireoidianos,

glicocorticóides e insulina. Durante a gestação ocorre aumento dessas glândulas e da

sua capacidade secretora devido a ação dos hormônios citados acima, associados aos

de origem placentária (lactogênio placentário e esteróides) sobre o sistema canavicular,

promovendo o desenvolvimento dos ductos e dos alvéolos. A manutenção da secreção

de leite no período pós-parto depende de um arco-reflexo neuroendócrino, que se inicia

ao nível dos mamilos, por estímulos dos mecanorreceptores aí localizados (sucção).

Por intermédio dos nervos sensitivos e conexões multisinápticas ao nível da medula

espinhal, bulbo e mesencéfalo, os impulsos chegam ao hipotálamo e ativam os

mecanismos responsáveis pela secreção de prolactina e ocitocina. A prolactina é o

principal fator responsável pela produção do leite, enquanto a ocitocina age nas células

mioepiteliais que revestem os alvéolos determinando sua contração que promove a

expulsão do leite (lactopoiese ou descida do leite).

� Objetivos:

O objetivo deste experimento é de verificar alguns fatores que

atuam na liberação do PIF, aumentando-o ou diminuindo-o.

� Materiais e Soluções: Materiais: 4 gaiolas, balança comum, balança analítica, seringas. Soluções: pentobarbital sódico à 50 mg/ml, xilocaína 2%, L-Dopa 15 mg/ml, ocitocina. Animais : 4 ratas com as ninhadas.

Serão utilizadas neste experimento, ratas em fase de lactação com suas

respectivas ninhadas, tendo o mesmo número de filhotes de (06) de aproximadamente

14 dias.

As ninhadas deverão ser separadas das mães por 12-14 horas do início

dos experimentos. Durante este período as mães terão acesso livre à alimentação e à

água.

No tempo zero do experimento a ninhada será pesada e colocada junto à

mãe e após 45 minutos, a ninhada será novamente pesada. As bexigas urinárias dos

filhotes devem ser esvaziadas por compressão do ventre.

Obs. 1: Número limitado de 6 filhotes/ ninhadas visa evitar que em ninhadas maiores

ocorra competição entre os filhotes na disputa pelos mamilos e isso interfira nos

resultados.

Obs. 2: Antes da pesagem da ninhada do tempo zero proceder o esvaziamento da

bexiga urinária dos filhotes por meio de compressão leve com o polegar na bexiga

abdominal baixa. Esse manuseio tem o objetivo de evitar que ocorram variações de

peso dos filhotes em decorrência de eliminação urinária que poderia anular as

variações provocadas pela ingestão do leite.

� Técnica: Os animais serão divididos nos seguintes 4 grupos de 1 mãe e filhotes:

1. Controle - Deixar apenas os seis filhotes. Cuidado em esvaziar as bexigas dos

filhotes. Pesar os filhotes. Colocá-los junto à mãe. Retornar a pesá-los 45 minutos

após.

2. Injeção de L-Dopa – Injetar na rata mãe 7,5 mg de L-Dopa (i.p.) e colocar a

ninhada. Após 45 minutos retirá-los e pesá-los. Após esse período, injeta, via

endovenosa, 60 mµ de ocitocina na mãe, junte novamente os filhotes e tome o peso

final dos mesmos.

3. Pentobarbital sódico – Pesar os filhotes; injetar pentabarbital sódico 5 mg/ 100g

(i.p.) na mãe e quando esta estiver anestesiada, colocar os filhotes. Marcar o tempo

zero e pesá-los 45 minutos após. Passado esse tempo injetar 60 mµ (endovenoso)

de ocitocina na mãe. Juntar os filhotes durante 45 minutos e pesá-los novamente.

4. Efeito da anestesia local – Injetar ao redor de cada mamilo 0,10 ml (subcutânea)

de xilocaína 2%. Pesar os filhotes. Colocá-los junto à mãe. Pesá-los novamente

após 45 minutos. Passado esse tempo, injetar 60 mµ (endovenoso) de ocitocina na

mãe. Juntar os filhotes à mãe durante 45 minutos e pesá-los novamente.

� Resultados:

O efeito de cada condição experimental será avaliado pela variação no peso

dos filhotes (peso final – peso inicial) em correlação direita com a quantidade de leite

ejetado pela rata.

VARIAÇÃO DO PESO DOS FILHOTES (APÓS AMAMENTAÇÃO) DE

RATAS EM LACTAÇÃO SUBMETIDAS A VÁRIAS CONDIÇÕES EXP ERIMENTAIS: Tratamento Grupo de alunos Variação de

peso dos filhotes (g): Pfinal – Pinicial

Média dos resultados

G1 Controle G5

G2 Pentobarbital sódico G6

G2 Pentobarbital sódico + ocitocina G6

G3 Dopamina G7

G3 Dopamina + ocitocina G7

G4 Xilocaína G8

G4 Xilocaína + Ocitocina G8

2-Regulação Homeostática da Glicemia INTRODUÇÃO

A manutenção da concentração plasmática de glicose é de suma

importância para a sobrevivência, visto que a glicose plasmática é o principal substrato

metabólico utilizado pelo sistema nervoso central (exceto no jejum prolongado). Uma

breve hipoglicemia pode ocasionar uma disfunção cerebral, e prolongando-se este

estado pode-se ocasionar morte cerebral. Por isso, é imprescindível a existência de

mecanismos glico-regulatórios incumbidos de prevenir ou corrigir a hipoglicemia.

A regulação da captação, estoque e mobilização dos combustíveis celulares

e substratos sob as variações das condições ambientais e fisiológicas em organismos

superiores envolve fatores hormonais, neurais e de substratos.

Fatores Hormonais

Os principais hormônios envolvidos na manutenção da glicemia plasmática

são: insulina, glucagon, epinefrina, cortisol e hormônio do crescimento. Sendo que os

quatro últimos são chamados de hormônios contra-regulatórios, pois se opõem à

principal ação da insulina, que é reduzir a glicemia plasmática.

A insulina desempenha uma função primordial na regulação da glicose

sangüínea. Esse hormônio é produzido no pâncreas, pelas células β das ilhotas de

Langerhans, e é secretado no sangue como uma resposta direta à hiperglicemia. Sua

concentração no sangue acompanha a da glicose, e sua administração provoca

hipoglicemia imediata. As principais substâncias que determinam a liberação de

insulina são: carboidratos, alguns aminoácidos, ácidos graxos livres, corpos cetônicos,

glucagon, secretina, gastrina... A insulina tem efeito imediato, em tecido adiposo e o

muscular, aumentando a velocidade de absorção de glicose. Essa reação é causada

pelo aumento de transporte de glicose na membrana celular devido ao recrutamento de

transportadores de glicose GLUT4, que estão no interior da célula, para a membrana

plástica. Ao contrário, não há efeito direto da insulina na entrada de glicose nas células

hepáticas. Todavia, indiretamente, a insulina aumenta a captação de glicose pelo

fígado em virtude de sua ação: 1) estimulante sobre enzimas que regulam a glicólise e

a síntese de glicogênio; 2) inibitória sobre algumas enzimas glicogenolíticas e

neoglicogênicas.

O glucagon é o hormônio sintetizado no pâncreas pelas células α das ilhotas

de Langerhans. Sua secreção é estimulada pela hipoglicemia, e quando ele chega ao

fígado (via veia porta), provoca glicogenólise por ativar a fosforilase. A maior parte do

glucagon endógeno é retirada da circulação pelo fígado. O glucagon também aumenta

a gliconeogênese a partir de aminoácidos e do lactato. Tanto a glicogenólise quanto a

gliconeogênese, que ocorrem no fígado, contribuem com os efeitos hiperglicêmicos do

glucagon, cujas ações opõem-se às da insulina.

A epinefrina, hormônio sintetizado pela medula adrenal, estimula a produção

de glicose hepática e limita a utilização de glicose. As ações da epinefrina são diretas e

indiretas, e são mediatas através da sua ligação aos receptores α e β adrenérgicos. O

efeito α adrenérgico inibindo a secreção de insulina, é um dos principais efeitos

hiperglicemiante indiretos da epinefrina. A estimulação β adrenérgica da secreção de

glucagon também ocorre, mas sua contribuição no efeito hiperglicemiante sob

condições fisiológicas parece ser menor. A epinefrina também atua diretamente

aumentando a glicogenólise e gliconeogênese hepática. Como o glucagon, a epinefrina

atua em minutos e produz um aumento transiente na produção de glicose. Já o cortisol

e hormônio do crescimento possuem efeitos mais lentos, requerendo diversas horas

para promover o aumento glicêmico. Por isso, estes hormônios, embora sejam

liberados durante a hipoglicemia, não são importantes para a contra-regulação a curto

prazo.

Os glicocorticóides do córtex adrenal elevam a glicose sangüínea e

produzem uma curva de intolerância à glicose do tipo diabético. Na espécie humana,

esta ação ocorre somente em indivíduos com predisposição genética ao diabetes. A

tolerância à glicose está reduzida em 80% dos pacientes com síndrome de Cushing e

20% desses pacientes têm franco diabetes. Os glicocorticóides são necessários para o

glucagon exercer sua ação gliconeogênica durante o jejum. Os principais efeitos

diabetogênicos são: 1) o aumento do catabolismo protéico, que aumenta a

gliconeogênese no fígado; 2) o aumento da glicogenogênese e da cetogênese

hepáticas; 3) a redução de utilização periférica de glicose, que pode ser devido à

inibição da fosforilação da glicose.

O hormônio de crescimento (GH), secretado pela hipófise anterior, também

ocasiona aumento da glicemia. Esse hormônio mobiliza os ácidos graxos livres do

tecido adiposo favorecendo assim a cetogênese, ele reduz a captação de glicose em

alguns tecidos (ação anti-insulínica), aumenta a liberação de glicose hepática e pode

reduzir a capacidade da insulina ligar-se aos seus receptores. O GH não estimula

diretamente a secreção de insulina, porém, a hiperglicemia por ele produzida estimula

secundariamente o pâncreas e pode eventualmente produzir exaustão das células B.

Há evidências de que o GH reduz o número de receptores insulínicos e de que os

glicocorticóides reduzem suas afinidades à insulina. Contudo, a diminuição na

utilização da glicose produzida por esses hormônios deve-se mais à inibição da

fosforilação da glicose do que de sua entrada nas células.

O efeito hiperglicemiante de infusão combinada de glucagon, epinefrina e

cortisol é substancialmente maior do que a soma dos efeitos de cada hormônio

infundido individualmente. Essas interações sinergísticas são potencialmente

relevantes na contra-regulação da glicose.

Fatores Neurais

Estimulações elétricas dos nervos simpáticos hepáticos diminuem o

conteúdo de glicogênio, aumentando liberação de glicose hepática e causando

hiperglicemia em animais. Essas estimulações no pâncreas inibem a liberação de

insulina e estimulam a liberação de glucagon o que resulta no aumento da glicemia.

A estimulação parassimpática via nervo vago aumenta o conteúdo de

glicogênio hepático e diminui a liberação hepática de glicose, sendo que no pâncreas

promove a liberação de insulina, ocasionando a diminuição da glicemia.

Substratos

A glicose “per si” impulsiona o metabolismo hepático em favor do estoque de

glicogênio. Isto se baseia no conceito da auto-regulação de glicose hepática, isto é a

taxa de produção de glicose hepática é uma função inversa da concentração de glicose

plasmática, independente de fatores hormonais ou neurais. Os ácidos graxos e corpos

cetônicos também interferem no metabolismo de glicose.

� Objetivo

Analisar o papel de hormônios no perfil glicêmico, após ingestão de glicose (75g).

� Materiais e Métodos

� 2 Alunos em jejum (8h)

� 200 g de açúcar

� 1 limão (opcional)

� Álcool 77%

� Almotolia

� Algodão

� Luvas

� Lancetas descartáveis adaptadas a um lancetador - Accu-Chek Softclix

Pro; Roche, USA)

� Fitas (Advantage II -ROCHE-USA) para aferir a glicemia.

Monitor de glicemia (Accu-Chek Advantage II, Roche, USA).

� Teste de tolerância à glicose (GTT)

Os testes serão realizados pela manhã, após jejum de 8 horas. As amostras de

sangue (glicemia capilar) serão colhidas do dedo médio (utilizando-se lancetas

descartáveis adaptadas a um lancetador - Accu-Chek Softclix Pro; Roche, USA), antes

e após 2h da ingestão de glicose (75g). A glicemia será aferida utilizando um monitor

de glicemia (Accu-Chek Advantage II, Roche, USA).

3- Influências da Atividade Ovariana Sobre o Útero � Objetivos: (3 GRUPOS)

1. Familiarizar o aluno com o desenvolvimento de trabalhos científicos que duram

vários dias.

2. Analisar os efeitos da atividade dos ovários sobre o útero e massa corporal.

� Materiais e Soluções:

Materiais: Gaiolas para ratos, ração granulada, frascos para água, mesa cirúrgica,

instrumental cirúrgico, agulha e fios para sutura, luvas, seringa de tuberculina, éter,

algodão, câmara para anestesia, balança analítica e balança comum, fita adesiva.

Soluções: pentobarbital sódico, benzoato de estradiol à 25 µg/ Ml/óleo de milho.

Animal: ratas (180 g).

� Técnica: (DEMONSTRATIVA)

1. Separe as ratas em 4 grupos: 1.0) controle/ scham; 1.1) controle + estrógeno; 2.0)

ovariectomizado (OVX) + óleo vegetal; 2.1) OVX + estrógeno; Coloque duas ratas

em cada gaiola, identificadas com o nome dos grupos experimentais e a data do

início do experimento. Para diferenciar as ratas na gaiola, realize marcações nas

orelhas mediante pequenos cortes em V. Isto deve ser feito após a rata estar

anestesiada.

2. Anestesie, por via intraperitoneal, com pentobarbital sódico i.p.

3. Coloque a rata em decúbito lateral sobre a mesa cirúrgica, localize a última costela e

faça a assepsia. Faça uma incisão de 1-1,5 cm, na pele e subcutâneo entre a última

costela e a coxa.

4. Com uma pinça fazer uma seguida incisão na camada muscular abrindo a cavidade

peritoneal (B). Divulsione o músculo abrindo a pinça (C) e observe neste local massa

de gordura (esbranquiçada).

5. O ovário está localizado nesta massa de gordura. Com auxílio da pinça puxe o

ovário ou a massa de gordura (F). Faça uma ligadura logo abaixo da trompa uterina

(G). Corte entre o ovário e a ligadura.

6. Recoloque o restante da cavidade abdominal e suture o tecido (H,I). Não esqueça

que a cirurgia é bilateral.

7. No grupo 1.0 (controle) e 1.1 (tratado com estrógeno), localize os ovários, porém

sem retirá-los. Suture a musculatura e a seguir a pele em planos separados,

passando mertiolato após o término da sutura.

8. Nos outros 2 grupos realize a OVX

Ovariectomia Sequência Experimental :

1. Durante 4 dias que antecedem o sacrifício (9 dias após as cirurgias), injete

subcutaneamente:

- estrógeno na dose de 20 µg (benzoato de estradiol) por dia em cada rata do grupo

1.1 e 2.1

- óleo vegetal nos animais do grupo 2.0;

- pese todas as ratas

- os grupos de alunos 1 a 4 serão responsáveis pelos animais dos grupos 1.0 e 1.1; e

os alunos dos grupos 5 a 8, pelos grupos de animais 2.0 e 2.1.

2. Após 14 dias, sacrificá-las com éter na câmara para anestesia. Abrir a cavidade

abdominal e expor os cornos uterinos. Amarre as 2 extremidades, no seu extremo

mais anterior e, posteriormente, imediatamente antes de formar os 2 cornos.

Seccione a vagina próxima a esta última ligadura e remova-os da rata. É importante

manter igual procedimento em todas as ratas com respeito à retirada dos cornos

uterinos.

3. Os cornos devem ser pesados com o líquido neles contidos. A seguir esvaziados e

pesados novamente.

4. Faça o gráfico da média da massa corporal dos diversos grupos e apresente as

tabelas das massa médias dos cornos uterinos com e sem líquido e relacioná-las

com a massa corporal. Esta relação deve ser expressa em mg/100 g de massa

corporal.

4-Esfregaço Vaginal e Ciclo Estral em Ratas

Obs.: Esta atividade será demonstrativa.

� Objetivos:

1. Conhecer técnicas de investigação das funções endócrinas.

Ovariectomia

2. Identificar as fases do ciclo estral nas ratas, correlacionando-as com as alterações

hormonais.

� Materiais e Soluções:

Materiais: conta-gotas, microscópio, lâminas para microscópio.

Soluções: pentobarbital sódico à 50 mg/ml, mertiolato, solução de NaCl a 0,9%.

Animais: ratas (180 g).

� Técnica:

1. Obtenção e análise do esfregaço vaginal:

2. Segure firmemente a rata pelo dorso, mantendo-a de ventre para cima. Outro

estudante introduz na vagina a ponta de um conta gotas de ponta fina, tendo uma

gota de solução fisiológica.

3. Libere a solução fisiológica na vagina da rata e aspire novamente a solução, a qual

deverá conter suspensão células do epitélio vaginal

4. Esparrame a suspensão na lâmina de vidro e anote na mesma a identificação da

rata.

5. Examine o esfregaço no microscópio com pequeno aumento e faça o diagnóstico da

fase do ciclo estral de cada rata, anotando as características do campo

miscroscópico.

Coleta de material

Microscopicamente as fases do ciclo estral se caracterizam:

Diestro (DII): poucas e pequenas células epiteliais, predominância de leucócitos

e bastante muco.

Proestro: células epiteliais grandes e nucleadas e ausência de leucócitos.

Estro: presença apenas, de células queratinizadas.

Metaestro (DI): algumas células queratinizadas e outras células epiteliais com

presença de leucócitos.

5-Efeitos da Castração e Terapêutica Substitutiva e m Ratos

� Objetivos: (3 GRUPOS)

1. Familiarizar o estudante com a investigação em Endocrinologia.

2. Observar os efeitos dos hormônios sexuais nos órgãos anexos do aparelho

reprodutor.

3. Observar o papel da terapêutica substitutiva.

� Materiais e Soluções:

Esfregaço Vaginal e Ciclo Estral

Materiais: 3 gaiolas, 3 frascos para água, ração granulada, instrumental cirúrgico,

luvas, mesa cirúrgica para ratos, agulha e fio para sutura, balança comum, balança

analítica, seringa de tuberculina, câmara para anestesia, éter, esparadrapo.

Soluções: pentobarbital sódico à 50 mg/ml, mertiolato, propianato de testosterona à

1 mg/ml.

ANIMAIS: ratos de 150-180 g.

� Técnica:

1. Separe, aleatoriamente, 3 grupos de ratos, denominados: 1.0) controle; 2.0) castrado

e 2.1) castrado e tratado com propianato de testosterona.

2. Coloque cada grupo numa gaiola e identificação devida. Faça também a

identificação de cada rato, mediante um pique na orelha, em V, em posição diferente

para cada rato contido na gaiola. Esta identificação faça-a após o rato estar

anestesiado.

3. Anestesie os ratos com pentobarbital sódico , coloque-os em decúbito dorsal e

realize a castração do grupo b e c.

Animal anestesiado em decúbito dorsal Procedimento da orquidectomia: (DEMOSTRATIVO)

3.1. Faça a assepsia com mertiolato e a seguir uma incisão na bolsa escrotal,

separando o testículo dos tecidos adjacentes por divulsão.

4. Retire o testículo da bolsa escrotal. Faça uma ligadura, envolvendo o cordão

espermático com os vasos sanguíneos. Seccione e remova o testículo (H-I).

Orquidectomia

3.3. Proceda de modo análogo para retirar o testículo do outro lado.

3.4. Faça as suturas, mediante pontos separados e passe novamente mertiolato.

� Sequência Experimental:

1. Mantenha os ratos nas gaiolas com ração e água, pesando-os, diariamente, durante

o decorrer do experimento.

2. No 10º dia após a castração, injete no grupo 2.1 propianato de testosterona por via

subcutânea, na dose de 300 µg por rato. Este tratamento deverá ser diário, num

período mínimo de 4 dias, a partir do décimo dia pós-cirúrgico.

3. Após este período, sacrifique os animais com éter na câmara para anestesia.

4. Retire as vesículas seminais, hipófise e adrenais.

5. Imediatamente após a retirada das estruturas do item anterior, pese-as. Relacione a

massa de cada uma em mg/100 g de massa corporal de rato.

Orquidectomia

UNIDADE IVUNIDADE IVUNIDADE IVUNIDADE IV

SISTEMA DIGESTÓRIO E ESTOMATOGNÁTICOSISTEMA DIGESTÓRIO E ESTOMATOGNÁTICOSISTEMA DIGESTÓRIO E ESTOMATOGNÁTICOSISTEMA DIGESTÓRIO E ESTOMATOGNÁTICO

SECREÇÃO SALIVAR E pH BUCALSECREÇÃO SALIVAR E pH BUCALSECREÇÃO SALIVAR E pH BUCALSECREÇÃO SALIVAR E pH BUCAL

� Objetivos: 1. Mostrar a influência do fluxo salivar sobre o pH da boca. 2. Analisar a relação entre o tipo de alimento a ingestão alimentar e a

secreção salivar. � Materiais e métodos: Materiais: fita de pH, limão, chiclete com açúcar, chiclete sem açúcar, bolacha salgada, bolacha doce, refrigerante comum e refrigerante dietético.

Soluções: fluoreto de sódio a 0,05%. Técnicas Para a Determinação do pH da Boca:

Segurar uma das pontas da fita indicadora de pH com os dedos polegar e indicador; introduzir aproximadamente 1/3 da fita na boca do voluntário, mantendo-a dentro até o completo umedecimento com a saliva, colocando a ponta da fita sob a língua a fim de favorecer o contato com o líquido bucal. Após 10 segundos, retirar a fita e fazer a leitura, comparando a reação de cor ocorrida com a da escala colorimétrica fornecida na caixa de fitas, verificando o valor correspondente de pH. Nesta determinação do pH, permanecer no mínimo 1 hora sem ingerir alimentos, chupar balas, mascar chicletes, fumar ou beber refrigerantes. � Seqüência Experimental: 1. Escrever os nomes dos alunos do grupo e numerar seqüencialmente.

Usando a fita para pH, fazer a determinação do pH da boca de cada aluno do grupo. Anotar os resultados.

2. O aluno número 1 irá mastigar um chiclete com açúcar por um período de 5 minutos e, a seguir, medir o pH da boca. Anotar o resultado.

3. Após a realização do item 2, fazer bocheco com solução de fluoreto de sódio a 0,05% e determinar novamente o pH. Anotar os resultados.

4. O número 1 da relação de nomes deverá repetir os ítens 2 e 3 utilizando chicletes sem açúcar e a solução de flúor, Anotando os dados obtidos.

5. O aluno número 2 irá realizar o experimento, ingerindo três bolachas doces em um período de 1 minuto. Medir o pH da boca. A seguir, fazer bochecho com a solução de flúor e medir novamente o pH. Anotar os resultados.

6. O aluno do grupo número 2 deverá repetir o experimento anterior ingerindo três bolachas salgadas.

7. O aluno número 3 deverá ingerir lentamente, mas de forma contínua, um copo de refrigerante comum e, logo a seguir determinar o pH da boca. Após um intervalo de 10 minutos, medir novamente o pH e repetir o experimento ingerindo refrigerante dietético.

8. Escolher dois alunos do grupo e pedir para colocarem 3 gotas de suco de limão sobre o dorso da língua. Após 1 minuto, determinar o pH bucal. Anotar os resultados.

9. Ilustrar os efeitos das manobras experimentais preparando tabelas com os dados obtidos.

� Estudo Orientado: ♦ Em relação ao tipo de alimento apresentado e ingerido, que influência

teve no ph da boca? ♦ O volume de saliva formado foi influenciado pelo tipo de alimento?

Descreva. ♦ Quais são as glândulas encarregadas de produzir saliva? Classificá-las

de acordo com o tipo de saliva secretado. ♦ Explicar a importância da saliva para a manutenção da fisiologia bucal. ♦ Qual a função dos ácinos e dos ductos na secreção salivar? ♦ Como é feita a regulação da secreção salivar? ♦ Qual o volume diário de secreção salivar? Citar fatores que podem

alterar este volume. ♦ Explicar como o fluxo e a composição da saliva podem influenciar o ph

da boca.