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CROMATOGRAFIA LÍQUIDA DE ALTA EFICIÊNCIA –

CLAE (HPLC)

LAÍS BASTOS DA FONSECA

Cromatografia Líquida de Alta Eficiência

“Cromatografia é uma técnica utilizada naseparação dos componentes de umaamostra, os quais se distribuem em 2

fases, uma estacionária e a outra móvel. A fase estacionária pode ser um sólido, um líquido retido sobre um sólido, ou um gel. A fase móvel pode ser líquida ou gasosa.”

(IUPAC)


CromatografiaLíquida

Planar Coluna

CDD CP Alta eficiência Convecional

Adsorção Partição Iônica Exclusão

Cromatografia Líquido-sólido ou por adsorção (CLS)

O mecanismo de separação: competição entre moléculas da amostra e da fase móvel em ocupar os sítios ativos da fase estacionária, sólido.

Adsorventes mais utilizado: sílica.

É importante que as partículas da fase estacionária apresentem um grande número de sítios ativos ( grande área de superfície).

Fase estacionária (polar) é afetada com frequência pela retenção de moléculas de alta polaridade como álcoois, água.

Acarreta mudança nas propriedades da coluna.

Pode dar origem a pobre eficiência. Assimetria dos picos compostos básicos Diminuindo inclusive a vida útil.

Cromatografia Líquido-líquido ou por partição (CLL)

O mecanismo de separação: baseia-se nas diferentes solubilidades que apresentam os componentes da amostra na fase móvel e na faseestacionária.

Fase estacionária: líquido adsorvido sobre um suporte sólido formando um leito não miscível com a fase móvel.

Os componentes mais solúveis na fase estacionária são seletivamente retidos, enquanto os menos solúveis são transportados mais rapidamente pela fase móvel.

Suporte sólido: sílica purificada.

O maior inconveniente desta técnica é a solubilidade da fase estacionária na fase móvel.

Cromatografia Líquida com fase ligada (CLFL)

Surgiu como conseqüência de problemas associados a CLL.

A fase estacionária (FE) está quimicamente ligada à superfície de um suporte, elimina-se o problema da solubilidade FE na FM.

Variando a natureza dos grupos funcionais da fase estacionária, é possível diferentes tipos de seletividade.

Grupo funcional de natureza polar, como o grupo amino (- NH2 ) e o grupo Ciano (-CN), que funcionando similarmente às fases polaresda CLS (SiOH), são chamadas de FASE NORMAL.

Grupo funcional de natureza apolar, como os grupos octil (- C8H17)octadecil (- C18H37), fenil (- C6H5), são chamados de FASE REVERSA.

Cromatografia Líquida com fase ligada (CLFL)

FASE NORMAL: fase estacionária polar e fase móvel apolar.

FASE REVERSA: fase estacionária apolar e fase móvel polar.

Segundo o CDER, a maioria dos métodos de análises submetidos ao mesmo, são por cromatografia em fase reversa , detecção UV.

Cromatografia líquida por par iônico, é uma forma especial de CLFL.

A molécula da amostra iônica ou ionizável, forma um par de íons por associação com um contra íon orgânico, da fase móvel.

O par de íons é então distribuído entre a fase estacionária, normalmente uma de fase reversa, e a fase móvel, normalmente aquosa-orgânica, que solubiliza as espécies ionizadas.

Cromatografia por troca iônicaA fase estacionária é, normalmente, uma resina de poliestireno e

divinilbenzeno, a qual são ligados grupos iônicos, como por exemplo,

- SO-3 trocadores fortes de cátion

- CO-2 trocadores fracos de cátion

- NR+3 trocadores fortes de ânions

- NH2R+ trocadores fracos de ânions

As colunas catiônicas são adquiridas comercialmente na forma de sais de Na+ ou de íon hidroxônio (H+) as aniônicas na forma de cloreto (Cl-).

Cromatografia por troca iônica

Os grupos iônicos têm um contra-íon (com carga oposta) que pode ser deslocado pelos íons da fase móvel de carga similar a ele.

Para uma resina trocadora de cátions, tem-se o equilíbrio entre o contra íon Na+ e o cátion da amostra, M+

M+ + R-SO-3Na+ Na+ + R-SO-

3M+

Cromatografia por exclusão

A separação é efetuada de acordo com o tamanho efetivo das moléculas.

A coluna é recheada com matéria inerte cujos poros têm tamanho controlado.

As moléculas pequenas podem penetrar na maioria dos poros da fase estacionária enquanto as maiores são excluídas.

Assim, moléculas grandes movem-se rapidamente através da coluna e as moléculas pequenas são eluídas lentamente pela fase móvel.

A CLAE necessita que a coluna seja de materiais com estruturas mais rígidas, normalmente de sílica mas também de resina.

Cromatografia por por exclusão.A separação é efetuada de acordo com o tamanho efetivo das

moléculas.

A coluna é recheada com matéria inerte cujos poros têm tamanho controlado.

As moléculas pequenas podem penetrar na maioria dos poros da fase estacionária enquanto as maiores são excluídas.

Assim, moléculas grandes movem-se rapidamente através da coluna e as moléculas pequenas são eluídas lentamente pela fase móvel.

A CLAE necessita que a coluna seja de materiais com estruturas mais rígidas, normalmente de sílica mas também de resina.


Sistema de CLAE

Sistema de bombeamento

InjetorColuna

Detector

Registrador

Fase Móvel

Reservatório da Fase Móvel

Sistema de CLAE

Recipientes de vidro, aço inox ou plásticos inertes – 1 a 3 L.

Filtro de aço sinterizado para reter as partículas sem produzir uma queda excessiva de pressão.

A Fase Móvel deve ser filtrada, antes de ser colocada no reservatório.

Sistema de filtração por membrana de 0,45 µm de porosidade.

Sistema de CLAECaracterísticas básicas – Bomba para CLAE

Quimicamente inerte (resistentes a fase móveis agressivas).

Trabalha a altas pressões.

Fluxo contínuo, livre de pulsação.

Reprodutibilidade do fluxo.

Fluxos - 0,1 a 10 mL/min analíticas e até 100 mL/min preparativas

Pequeno volume interno.

Fluxo constante a curto e longo prazo.

Sistema de CLAE

Tipo de Bomba.

Reciprocantes. São bombas que escoam volumes constantes de forma não contínua, isto é pulsante.

Amortizadores de fluxo.

Duplo pistão – quando um pistão succiona a fase móvel o outro expulsa o líquido para fora da bomba. A vazão (fluxo) de ambos os pistões, já quase livre de pulsações, é encaminhada à coluna.

A principal vantagem – vazão de volume constante.

Vazão pulsando pode causar perda na eficiência da coluna e instabilidade no detector.

Sistema de CLAE

Gradiente:

Isocrático: Composição da fase móvel permanece constante.Capaz de separar um número limitado de picos.

Composição da fase móvel varia durante a análise.Sistema aplicável quando a polaridade dos compostos é

muito diferente.Separação de amostras complexas. A determinação de

impurezas relacionadas em uma matéria-prima é um exemplo.

Sistema de bombeamento.

Sistema de CLAEInjetores.

Manual.

Automático (auto-sampler).

Não é atacado por solvente.

É reprodutível e preciso.

Opera a altas pressões.

Otimização do tempo de análise.

Melhor reprodutibilidade analítica.

Sistema de CLAE

Injetor Rheodyne – Diagrama de fluxo

CUIDADO ! limpeza do injetor.

Sistema de CLAE

Detectores.Características de um detector ideal.

Alta sensibilidade.Baixo ruído (quanto maior o ruído pior será o LD).Resposta rápida a todos os solutos.Ter uma larga faixa de linearidade.Insensibilidade à mudanças na temperatura e vazão da FM.Não provocar alargamento do pico.Não destruição do soluto.

Tipos de Detectores usados em CLAE.UV/VIS.Índice de Refração.Fluorescência.

Condutividade Elétrica.Eletroquímico.

Sistema de CLAE

Características de alguns detectores de CLAE

Detector por

espectrofoto- metria UV.

Detector por fluorescência.

Detector por índice de refração.

Detector por eletroquímico (eletrodo Hg gotejante).

Detector por condutividadeelétrica.

Princípio de operação

absorbância de luz na faixa do UV

excitação com luz produz uma emissão fluorescente

mudanças no índice de refração da fase móvel

oxidação ou redução em potencial fixo

condutividade elétrica devido a presença de íons.

Tipo seletivo depende prop. do composto

altamente seletivo depende prop. do composto

universal depende prop. fase móvel

seletivo depende prop. do composto

seletivo depende propdo composto

Quantidade mínima de detecção (g/mL)

10-9

10-9 e 10-12

10-7

10-12

10-8

Volume de cela (μL)

1-20 10-25 3-15 5-10 1,5-2,5

Detectores.

Características de alguns detectores de CLAE Detector por

espectrofoto- metria UV.

Detector por fluorescência.

Detector por índice de refração.

Detector por eletroquímico (eletrodo Hg gotejante).

Detector por condutividadeelétrica.

Sensibilidade à temperatura

baixa

baixa

alta

média

Média

Sensível à vazão da fase móvel

não

não

não

sim

sim

Útil com gradientes

sim

sim

não

não

não

Aplicações composto que absorvem no comprimento de onda selecionado

Composto ou derivados que fluorescem

geral Espécies que oxidam ou reduzem

Soluções aquosas com compostos iônicos

Sistema de CLAEDetectores.

Sistema de CLAE

Detector UV de Arranjo de Fotodiodos.

Sistema de CLAEDetector UV de Arranjo de Fotodiodos.

Sistema de CLAEDetector UV/VIS.

AbsorbânciaAbsortividade molarConcentração molarComprimento de percurso da célula

Lei de Lambert-Beer. BCA ε=

Requer:Luz monocromática

Solução sem turbidezConcentrações baixas

aa BCA ε= pp BCA ε=p

p

a

a

CA

CA

=

p

apa A

ACC ×==aC

=aA Absorbância da amostra

Conc. da amostra

=pA

=pC

Absorbância do padrão

Conc. do padrão

(A) (B) Substituindo (A) em (B)

Sistema de CLAE

Fase Móvel.

Ser de alto grau de pureza.

Dissolver a amostra sem decompor os seus componentes.

Não decompor ou dissolver a fase estacionária.

Ter baixa viscosidade.

Ser compatível com o tipo do detector utilizado.

Ter polaridade adequada para permitir uma separação conveniente dos componentes da amostra.

Sistema de CLAEO papel da Fase Móvel.

A fase móvel interage com amostra e a coluna, através de sua polaridade e características químicas, assim exercendo uma

grande influência na separação.

Coluna

Fase Móvel

Amostra

Interação Química

Sistema de CLAE

Fase Reversa.

Fase Móvel.

Tipicamente a fase móvel é uma mistura de um componente aquoso, freqüentemente contendo um tampão para controle de pH, e um solvente orgânico polar miscível em água.

Metanol e Acetonitrila, são os mais utilizados.Solventes orgânicos.

Tetrahidrofurano (THF) - usualmente na proporção de 5 –20% junto com acetonitrila ou metanol para melhorar a seletividade.

Fosfato é um tampão muito utilizado.

Sistema de CLAEFase Móvel.

Fase Reversa.

Ordenando em uma série decrescente de polaridade e crescente de poder de eluíção.

A principal desvantagem para o uso de sais inorgânicos, é que podem precipitar nas tubulações, bomba, injetor... do sistema cromatográfico, principalmente se a proporção do solvente orgânico for alta.

Especial atenção de ser data a limpeza do equipamento.


Fase Normal.

Utiliza solventes apolares.

O problema mais freqüente neste tipo de cromatografia –desativação da coluna de sílica ou alumina por adsorção de água.

A água adsorvida é responsável por mecanismos mistos de retenção (partição e adsorção) e produz grandes variações na retenção e seletividade.

Os solventes devem apresentar baixo teor de água.

Hexano, n-Heptano, Diclorometano e n-Propanol.

Sistema de CLAEFase Móvel

Características FASE NORMAL FASE REVERSAPolaridade da Fase

Estacionáriaalta baixa

Polaridade da Fase Móvel

baixa alta

Ordem de eluíção da amostra

- polar + polar + polar - polar

Efeito do aumento da polaridade da FM

Reduz os tempos de retenção

Aumento dos tempos de retenção

Sistema de CLAEFASE NORMAL

Polaridade FM

Retenção

Sistema de CLAEFASE REVERSA

Polaridade FM

Retenção


O ar dissolvido na fase móvel pode:

Formar bolhas na cabeça da bomba - pressão, interrompendo o fluxo, prejudicando a integridade do pistão de safira e selo da bomba.

A presença de bolhas no detector pode causar ruídos muito alto.

Em ambos os casos, há oscilação da linha de base, influência sobre os tempos de retenção ou aparecimento de picos adicionais.

Sistema de CLAE

Métodos de desgaseificação.

Fase Móvel.

Ultra-som (lento, pouco eficiente)

Vácuo (lento, requer agitação)

Vácuo + Ultra-som (mais eficiente)

Purga de Hélio (contínua)

“Degasser” (contínuo remove o ar logo antes de entrar na bomba)

Sistema de CLAEFase Estacionária.

Partículas de Sílica esféricas e irregulares.

Sílica ou Resina de Poliestireno-divinilbenzeno

Irregulares são menos eficientes.

Sistema de CLAEFase Estacionária.

Macroporoso

Partícula macroporosa esférica de Sílica

Forma irregular ou esférica15 – 100 μAlta capacidadeBaixa EficiênciaBaixo custoSeparações preparativasLimpeza da mostra Pressão baixa

Sistema de CLAE

Fase Estacionária.

Forma irregular ou esférica3 – 10 μAlta capacidadeAlta EficiênciaAlto custoSeparações analíticasSeparações semi-preparativasPressão alta

Microporoso

Partícula microporosaesférica de Sílica.

Sistema de CLAE

Superfície Silanol

FASE NORMAL

Sílica: superfície polar e ácida.

Muito higroscópica. Adsorção de água.

A pico com muita cauda para compostos básicos, causada pela interação com os sítios ácidos.

Pode dar origem:A pobre eficiência originada dos

mecanismos mistos de retenção.

Grupos funcionais: SiOH, (CH2OH)2 (Diol), NH2, NO2 e CN (Ciano).

Sistema de CLAE

Si-O

R1

R3

FASE REVERSA

Si-OH

Si-OH

Si-OH +

Ligação do tipo siloxano – a reação é chamada de silanização.

Cl Si R2

R1

R3

R1 e R3 = CH3 ou O- CH3

Si-OH

Si-OH

Si R2

R2 = C18, C8, C4, C2, fenil e ciano (CN).

+ HCl

Sistema de CLAEFASE REVERSA

Os grupos silanos (Si-OH) que não chegaram a “silanizar- se” podem:

Promover mecanismos duplos de retenção.

Forte retenção de compostos polares.

Picos assimétricos em compostos básicos.

Adsorções indesejadas, diminuindo inclusive a vida útil da coluna.

Para eliminar este feito, usa-se o processo conhecido como “end-capping”.

Que consiste complementar a primeira silanização (C8, C18,...) com moléculas menores como trimetilsilano (TMS). Desativação da sílica.

Sistema de CLAE

FASE REVERSA

Sílica não desativada.

NH2- C-C-C-C-C-CH3

Si-O-Si

Si-O-Si

Si-OH

C18

C18

Os grupos silanos ( ) livres.

Distorção do pico (cauda) pela formação de ponte de hidrogênio com compostos básicos.

Sistema de CLAELimpeza da coluna após análise.

Fase Reversa – H2O ACN:H2O (10:90) ACN:H2O (90:10)

Fase Normal – n-Propanol n-Heptano

100, 125 e 150x4/4,6 mm = 30’ cada etapa, fluxo de 1 ml/minColunas

250 e 300x4/4,6 mm = 60’ cada etapa, fluxo de 1 ml/min

Procedimento de regeneração.

Fase Normal:Heptano Clorofómio Acetato de etila Acetona Etanol H2O

Fase Reversa:H2O Metanol Clorofórmio Metanol H2SO4 0,05M

Sistema de CLAEAtivação de colunas novas

Fase Reversa – ACN ou Metanol 100%

100, 125 e 150x4/4,6 mm = 30’ cada etapa, fluxo de 1 ml/minColunas

250 e 300x4/4,6 mm = 60’ cada etapa, fluxo de 1 ml/min

Estocagem de colunas

Fase Reversa – ACN:H2O (90:10)

Fase Normal – n-Heptano 100%

Fase Normal – n-Heptano

Antes de introduzir a FMverificar a miscibilidadecom o solvente de ativação.

Utilizar H2O antes de solvente tamponado.

Utilizar Etanol ou n-Propranol antes de solvente aquoso.

Sistema de CLAE

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