aula engenharia genetica
DESCRIPTION
Biologia molecularTRANSCRIPT
![Page 1: Aula Engenharia Genetica](https://reader033.vdocuments.site/reader033/viewer/2022061518/5586edefd8b42afa4b8b45a3/html5/thumbnails/1.jpg)
Fundamentos de Engenharia Genética
Prof. Dr. Eduardo Honda
Porto Velho2008
![Page 2: Aula Engenharia Genetica](https://reader033.vdocuments.site/reader033/viewer/2022061518/5586edefd8b42afa4b8b45a3/html5/thumbnails/2.jpg)
Dogma Central da Biologia Molecular
![Page 3: Aula Engenharia Genetica](https://reader033.vdocuments.site/reader033/viewer/2022061518/5586edefd8b42afa4b8b45a3/html5/thumbnails/3.jpg)
O que é Engenharia Genética?É um conjunto de tecnologias que permitem a manipulação (modificação) de material genético in vitro
Também conhecida como Tecnologia do DNA Recombinante
Inclui o isolamento, cópia e multiplicação de genes, recombinação de genes, ou DNA de diferentes espécies, e transferência de genes de uma espécie para outra, contornando o processo reprodutivo
![Page 4: Aula Engenharia Genetica](https://reader033.vdocuments.site/reader033/viewer/2022061518/5586edefd8b42afa4b8b45a3/html5/thumbnails/4.jpg)
Clonagem Molecular
Para se estudar um determinado gene que codifica uma proteína ou RNA é preciso isolá-lo.
Clonagem = fazer várias cópias idênticas
Clonagem de DNA isolar um fragmento específico de DNA do cromossomo, introduzi-lo num vetor capaz de replicá-lo, e fazer milhões de cópias idênticas
![Page 5: Aula Engenharia Genetica](https://reader033.vdocuments.site/reader033/viewer/2022061518/5586edefd8b42afa4b8b45a3/html5/thumbnails/5.jpg)
Clonagem Molecular
Isolamento de Novos organismos que produzem enzimas de interesse Biotecnológico.
![Page 6: Aula Engenharia Genetica](https://reader033.vdocuments.site/reader033/viewer/2022061518/5586edefd8b42afa4b8b45a3/html5/thumbnails/6.jpg)
Clonagem Molecular- Isolamento Gênico
Isolamento do DNA: PCR, Banco de cDNA.
![Page 7: Aula Engenharia Genetica](https://reader033.vdocuments.site/reader033/viewer/2022061518/5586edefd8b42afa4b8b45a3/html5/thumbnails/7.jpg)
Isolamento do DNA- PCR
Desnaturação do DNA Fita-Dupla
![Page 8: Aula Engenharia Genetica](https://reader033.vdocuments.site/reader033/viewer/2022061518/5586edefd8b42afa4b8b45a3/html5/thumbnails/8.jpg)
Isolamento do DNA- PCR
Após vários ciclos...
Amplificação do Fragmento gênico desejado !!!
![Page 9: Aula Engenharia Genetica](https://reader033.vdocuments.site/reader033/viewer/2022061518/5586edefd8b42afa4b8b45a3/html5/thumbnails/9.jpg)
Isolamento de DNA e Biblioteca de cDNA
As bibliotecas de DNA representam, teoricamente, todo o material genético de um organismo clonado em um vetor
Tipos:
A) Genômica: - clonado diretamente do genoma.
B) cDNA:- feita a partir de mRNA .
![Page 10: Aula Engenharia Genetica](https://reader033.vdocuments.site/reader033/viewer/2022061518/5586edefd8b42afa4b8b45a3/html5/thumbnails/10.jpg)
![Page 11: Aula Engenharia Genetica](https://reader033.vdocuments.site/reader033/viewer/2022061518/5586edefd8b42afa4b8b45a3/html5/thumbnails/11.jpg)
Isolamento de DNA- Biblioteca genômica
Extração do DNA Genômico;
Clivagem com enzimas de restrição;
Ligação dos Fragmentos nos vetores;
Transformação Celular;
Replicação do vetor.
![Page 12: Aula Engenharia Genetica](https://reader033.vdocuments.site/reader033/viewer/2022061518/5586edefd8b42afa4b8b45a3/html5/thumbnails/12.jpg)
Biblioteca de cDNA
- mRNA de um tipo celular específico;
- “primer” de oligo dT e transcriptase reversa;
- DNA Polimerase I e dNTPs;
- Clonagem em um vetor de escolha
![Page 13: Aula Engenharia Genetica](https://reader033.vdocuments.site/reader033/viewer/2022061518/5586edefd8b42afa4b8b45a3/html5/thumbnails/13.jpg)
Clonagem Molecular- Requerimentos
1) Método para clivar o DNA alvo;2) Método para juntar 2 moléculas de DNA
covalentemente (inserto + vetor)- LIGAÇÃO!3) Célula hospedeira;4) Método para introduzir moléculas de DNA para
dentro da célula hospedeira que as possa duplicar;
5) Método para selecionar moléculas de DNA quimérico ou recombinantes;
6) Métodos para o screening da característica procurada .
![Page 14: Aula Engenharia Genetica](https://reader033.vdocuments.site/reader033/viewer/2022061518/5586edefd8b42afa4b8b45a3/html5/thumbnails/14.jpg)
Geração de moléculas recombinantes
- Clonagem Molecular -
![Page 15: Aula Engenharia Genetica](https://reader033.vdocuments.site/reader033/viewer/2022061518/5586edefd8b42afa4b8b45a3/html5/thumbnails/15.jpg)
CLONAGEM
![Page 16: Aula Engenharia Genetica](https://reader033.vdocuments.site/reader033/viewer/2022061518/5586edefd8b42afa4b8b45a3/html5/thumbnails/16.jpg)
Ligação de extremidades compatíveis
![Page 17: Aula Engenharia Genetica](https://reader033.vdocuments.site/reader033/viewer/2022061518/5586edefd8b42afa4b8b45a3/html5/thumbnails/17.jpg)
Sítio Múltiplo
de Clonage
m(Polylink
er)
![Page 18: Aula Engenharia Genetica](https://reader033.vdocuments.site/reader033/viewer/2022061518/5586edefd8b42afa4b8b45a3/html5/thumbnails/18.jpg)
As endonucleases de Restrição
Clonagem Orientada
![Page 19: Aula Engenharia Genetica](https://reader033.vdocuments.site/reader033/viewer/2022061518/5586edefd8b42afa4b8b45a3/html5/thumbnails/19.jpg)
As “Ferramentas”1) Enzimas
2) Vetores
3) Células hospedeiras
![Page 20: Aula Engenharia Genetica](https://reader033.vdocuments.site/reader033/viewer/2022061518/5586edefd8b42afa4b8b45a3/html5/thumbnails/20.jpg)
ENZIMAS
![Page 21: Aula Engenharia Genetica](https://reader033.vdocuments.site/reader033/viewer/2022061518/5586edefd8b42afa4b8b45a3/html5/thumbnails/21.jpg)
Enzimas de RestriçãoSão endonucleases que clivam o DNA em seqüências específicas chamadas sítio de restrição.
Quebram a ligação fosfodiéster
Os sítios de restrição são, geralmente, seqüências palindrômicas (mesma seqüência nos dois sentidos)
![Page 22: Aula Engenharia Genetica](https://reader033.vdocuments.site/reader033/viewer/2022061518/5586edefd8b42afa4b8b45a3/html5/thumbnails/22.jpg)
Enzymes for DNA manipulation – restriction enzymes
Source: http://www.blc.arizona.edu/INTERACTIVE/recombinant3.dna/clones.html
![Page 23: Aula Engenharia Genetica](https://reader033.vdocuments.site/reader033/viewer/2022061518/5586edefd8b42afa4b8b45a3/html5/thumbnails/23.jpg)
Enzimas de Restrição
Classes of Restriction Enzymes
Type Icleavage occurs 400-7000 bpfrom recognition site
Type IIcleavage occurs adjacent orwithin recognition site
Type IIIcleavage occurs 25-27 bpfrom recognition site
•Endonucleases sítio-específicas isoladas de procariotos
•Protegem a bactéria do ataque de vírus (fagos)
•Protegem seu próprio DNA metilando-o no sítio de restrição
•Enzimas do tipo II são as mais utilizadas em Biologia Molecular
EcoRI metilase
![Page 24: Aula Engenharia Genetica](https://reader033.vdocuments.site/reader033/viewer/2022061518/5586edefd8b42afa4b8b45a3/html5/thumbnails/24.jpg)
DNA LigasePromover a união de moléculas de DNA pela formação de uma ligação fosfodiéster entre uma extremidade 3’-OH e outra 5’-PO4.
![Page 25: Aula Engenharia Genetica](https://reader033.vdocuments.site/reader033/viewer/2022061518/5586edefd8b42afa4b8b45a3/html5/thumbnails/25.jpg)
![Page 26: Aula Engenharia Genetica](https://reader033.vdocuments.site/reader033/viewer/2022061518/5586edefd8b42afa4b8b45a3/html5/thumbnails/26.jpg)
DNA PolimerasesPolimerizam a molécula de DNA
a partir de uma extremidade 3´-OH e usando uma das fitas do DNA como molde.
Exe: Taq polimerase
![Page 27: Aula Engenharia Genetica](https://reader033.vdocuments.site/reader033/viewer/2022061518/5586edefd8b42afa4b8b45a3/html5/thumbnails/27.jpg)
Transcriptase reversa
Polimeriza uma fita de DNA a partir de um molde de RNA
Isolada dos retrovírus
Aplicação: síntese de cDNA
![Page 28: Aula Engenharia Genetica](https://reader033.vdocuments.site/reader033/viewer/2022061518/5586edefd8b42afa4b8b45a3/html5/thumbnails/28.jpg)
VETORES
![Page 29: Aula Engenharia Genetica](https://reader033.vdocuments.site/reader033/viewer/2022061518/5586edefd8b42afa4b8b45a3/html5/thumbnails/29.jpg)
Os Vetores
São moléculas de DNA que irão propagar o DNA clonado.
Características desejadas: Características desejadas:
•Habilidade de se duplicar na célula hospedeira;Habilidade de se duplicar na célula hospedeira;
• Marca genética para selecionar a célula Marca genética para selecionar a célula contendo o vetor (resistência a drogas ou marcas contendo o vetor (resistência a drogas ou marcas auxotróficas);auxotróficas);
•Sítios de clonagem únicos.Sítios de clonagem únicos.
![Page 30: Aula Engenharia Genetica](https://reader033.vdocuments.site/reader033/viewer/2022061518/5586edefd8b42afa4b8b45a3/html5/thumbnails/30.jpg)
Tipos de vetoresPlasmídios
Bacteriófagos (fagos)
Cosmídios
Cromossomos artificiais de levedura (YAC)
Vetores especiais para plantas, células de insetos e mamíferos
![Page 31: Aula Engenharia Genetica](https://reader033.vdocuments.site/reader033/viewer/2022061518/5586edefd8b42afa4b8b45a3/html5/thumbnails/31.jpg)
PlasmídiosMoléculas de DNA fita dupla circulares e de replicação autônoma (ORI);
Têm marcas de seleção para resistência a antibióticos ou complementação auxotrófica.
![Page 32: Aula Engenharia Genetica](https://reader033.vdocuments.site/reader033/viewer/2022061518/5586edefd8b42afa4b8b45a3/html5/thumbnails/32.jpg)
![Page 33: Aula Engenharia Genetica](https://reader033.vdocuments.site/reader033/viewer/2022061518/5586edefd8b42afa4b8b45a3/html5/thumbnails/33.jpg)
![Page 34: Aula Engenharia Genetica](https://reader033.vdocuments.site/reader033/viewer/2022061518/5586edefd8b42afa4b8b45a3/html5/thumbnails/34.jpg)
Sequências de
DNA de um vetor
de expressão de E.
coli
![Page 35: Aula Engenharia Genetica](https://reader033.vdocuments.site/reader033/viewer/2022061518/5586edefd8b42afa4b8b45a3/html5/thumbnails/35.jpg)
Vetores de expressão
![Page 36: Aula Engenharia Genetica](https://reader033.vdocuments.site/reader033/viewer/2022061518/5586edefd8b42afa4b8b45a3/html5/thumbnails/36.jpg)
Transformação Bacteriana
Source: http://www.blc.arizona.edu/INTERACTIVE/recombinant3.dna/clones.html
Células podem ser selecionados em placas com antibiótico. Alguns plasmídios utilizam o gene da B-galactosidase.
![Page 37: Aula Engenharia Genetica](https://reader033.vdocuments.site/reader033/viewer/2022061518/5586edefd8b42afa4b8b45a3/html5/thumbnails/37.jpg)
O gene da beta-galactosidase é interrompido quando um fragmento de DNA é clonado. O substrato "X-gal“ fica azul se o gene da beta-gal permanece intacto, isto é a enzima está ativa. As colônias brancas na presença de X-gal significa a presença de DNA recombinante no plasmidio.
![Page 38: Aula Engenharia Genetica](https://reader033.vdocuments.site/reader033/viewer/2022061518/5586edefd8b42afa4b8b45a3/html5/thumbnails/38.jpg)
![Page 39: Aula Engenharia Genetica](https://reader033.vdocuments.site/reader033/viewer/2022061518/5586edefd8b42afa4b8b45a3/html5/thumbnails/39.jpg)
Bacteriófagos
Infectam células de E. coli e o DNA se duplica na célula hospedeira.
Ex: Fago
![Page 40: Aula Engenharia Genetica](https://reader033.vdocuments.site/reader033/viewer/2022061518/5586edefd8b42afa4b8b45a3/html5/thumbnails/40.jpg)
Vetores baseados no fago
Foram retirados 20 Kb do genoma do fago necessários para integração/excisão para serem substituídos por DNA exógeno e formar um genoma de 50 Kb que é empacotado in vitro.
Genomas maiores ou menores não são empacotados.
Ciclo lítico compulsório
![Page 41: Aula Engenharia Genetica](https://reader033.vdocuments.site/reader033/viewer/2022061518/5586edefd8b42afa4b8b45a3/html5/thumbnails/41.jpg)
Clonando no Fago λ
![Page 42: Aula Engenharia Genetica](https://reader033.vdocuments.site/reader033/viewer/2022061518/5586edefd8b42afa4b8b45a3/html5/thumbnails/42.jpg)
Cosmídios
• São plasmídios contendo as extremidas “cos” do fago λ
• Capacidade de clonagem: 40 Kb
![Page 43: Aula Engenharia Genetica](https://reader033.vdocuments.site/reader033/viewer/2022061518/5586edefd8b42afa4b8b45a3/html5/thumbnails/43.jpg)
![Page 44: Aula Engenharia Genetica](https://reader033.vdocuments.site/reader033/viewer/2022061518/5586edefd8b42afa4b8b45a3/html5/thumbnails/44.jpg)
![Page 45: Aula Engenharia Genetica](https://reader033.vdocuments.site/reader033/viewer/2022061518/5586edefd8b42afa4b8b45a3/html5/thumbnails/45.jpg)
Cromossomos artificiais
![Page 46: Aula Engenharia Genetica](https://reader033.vdocuments.site/reader033/viewer/2022061518/5586edefd8b42afa4b8b45a3/html5/thumbnails/46.jpg)
CÉLULAS HOSPEDEIRAS
![Page 47: Aula Engenharia Genetica](https://reader033.vdocuments.site/reader033/viewer/2022061518/5586edefd8b42afa4b8b45a3/html5/thumbnails/47.jpg)
Células hospedeirasCaracterísticas:
Permitir a duplicação do vetor;
Permitir a seleção do vetor (sensibilidade a drogas ou auxotrofia);
Não pode representar perigo ao meio ambiente;
Não deve modificar o DNA exógeno;
Podem ser procariotos (E. coli) ou eucariotos (leveduras, células vegetais, cultura de células de insetos e mamíferos).
![Page 48: Aula Engenharia Genetica](https://reader033.vdocuments.site/reader033/viewer/2022061518/5586edefd8b42afa4b8b45a3/html5/thumbnails/48.jpg)
Métodos de introdução do DNA na célula hospedeira
Transformação com cloreto de cálcio (bactérias);
Transdução (fagos empacotados in vitro);
Transfecção (células de mamíferos);
Eletroporação (leveduras e bactérias);
Biolística ou “bombardeamento” (plantas);
Microinjeção (ovos e oócitos).
![Page 49: Aula Engenharia Genetica](https://reader033.vdocuments.site/reader033/viewer/2022061518/5586edefd8b42afa4b8b45a3/html5/thumbnails/49.jpg)
O canhão gênico é uma nova forma de transformação celular.
Esta arma usa uma particula de bombardeamento - Biolística
Inserindo genes nas células
![Page 50: Aula Engenharia Genetica](https://reader033.vdocuments.site/reader033/viewer/2022061518/5586edefd8b42afa4b8b45a3/html5/thumbnails/50.jpg)
Adapted from Human Genetics, Ricki Lewis
Microinjeção
![Page 51: Aula Engenharia Genetica](https://reader033.vdocuments.site/reader033/viewer/2022061518/5586edefd8b42afa4b8b45a3/html5/thumbnails/51.jpg)
Transformação Bacteriana
Source: http://www.blc.arizona.edu/INTERACTIVE/recombinant3.dna/clones.html
Células podem ser selecionados em placas com antibiótico. Alguns plasmídios utilizam o gene da B-galactosidase.
![Page 52: Aula Engenharia Genetica](https://reader033.vdocuments.site/reader033/viewer/2022061518/5586edefd8b42afa4b8b45a3/html5/thumbnails/52.jpg)
Clonando no Fago λ
![Page 53: Aula Engenharia Genetica](https://reader033.vdocuments.site/reader033/viewer/2022061518/5586edefd8b42afa4b8b45a3/html5/thumbnails/53.jpg)
Seleção de clones recombinantes
resistência e sensibilidade a antibióticos;
requerimentos nutricionais (auxotrofia);
formação de placas de lise
![Page 54: Aula Engenharia Genetica](https://reader033.vdocuments.site/reader033/viewer/2022061518/5586edefd8b42afa4b8b45a3/html5/thumbnails/54.jpg)
Identificação de um clone de
interesse
- hibridação com sonda radioativa- anticorpo específico
Screening
![Page 55: Aula Engenharia Genetica](https://reader033.vdocuments.site/reader033/viewer/2022061518/5586edefd8b42afa4b8b45a3/html5/thumbnails/55.jpg)
Aplicações da Engenharia Genética
![Page 56: Aula Engenharia Genetica](https://reader033.vdocuments.site/reader033/viewer/2022061518/5586edefd8b42afa4b8b45a3/html5/thumbnails/56.jpg)
Análise da estrutura/função de genes Produção de proteínas de interesse
industrial e terapêutico Engenharia proteica Criação de organismos transgênicos Terapia gênica Diagnóstico molecular (doenças
parasitárias e genéticas) Teste de paternidade / medicina
forense Arqueologia molecular / evolução
![Page 57: Aula Engenharia Genetica](https://reader033.vdocuments.site/reader033/viewer/2022061518/5586edefd8b42afa4b8b45a3/html5/thumbnails/57.jpg)
Plantas Transgênicas
![Page 58: Aula Engenharia Genetica](https://reader033.vdocuments.site/reader033/viewer/2022061518/5586edefd8b42afa4b8b45a3/html5/thumbnails/58.jpg)
![Page 59: Aula Engenharia Genetica](https://reader033.vdocuments.site/reader033/viewer/2022061518/5586edefd8b42afa4b8b45a3/html5/thumbnails/59.jpg)
Animais Transgênicos
![Page 60: Aula Engenharia Genetica](https://reader033.vdocuments.site/reader033/viewer/2022061518/5586edefd8b42afa4b8b45a3/html5/thumbnails/60.jpg)
![Page 61: Aula Engenharia Genetica](https://reader033.vdocuments.site/reader033/viewer/2022061518/5586edefd8b42afa4b8b45a3/html5/thumbnails/61.jpg)
Microinjeção de DNA no núcleo Microinjeção de DNA no núcleo de ovo fertilizado de de ovo fertilizado de
camundongo - gene do fator de camundongo - gene do fator de crescimento humanocrescimento humano
![Page 62: Aula Engenharia Genetica](https://reader033.vdocuments.site/reader033/viewer/2022061518/5586edefd8b42afa4b8b45a3/html5/thumbnails/62.jpg)
Biofármacos Recombinantes
![Page 63: Aula Engenharia Genetica](https://reader033.vdocuments.site/reader033/viewer/2022061518/5586edefd8b42afa4b8b45a3/html5/thumbnails/63.jpg)
![Page 64: Aula Engenharia Genetica](https://reader033.vdocuments.site/reader033/viewer/2022061518/5586edefd8b42afa4b8b45a3/html5/thumbnails/64.jpg)
![Page 65: Aula Engenharia Genetica](https://reader033.vdocuments.site/reader033/viewer/2022061518/5586edefd8b42afa4b8b45a3/html5/thumbnails/65.jpg)
Terapia Gênica
![Page 66: Aula Engenharia Genetica](https://reader033.vdocuments.site/reader033/viewer/2022061518/5586edefd8b42afa4b8b45a3/html5/thumbnails/66.jpg)
Adição do gene terapêutico
Substituição do gene terapêutico
![Page 67: Aula Engenharia Genetica](https://reader033.vdocuments.site/reader033/viewer/2022061518/5586edefd8b42afa4b8b45a3/html5/thumbnails/67.jpg)
Uso de vírus
![Page 68: Aula Engenharia Genetica](https://reader033.vdocuments.site/reader033/viewer/2022061518/5586edefd8b42afa4b8b45a3/html5/thumbnails/68.jpg)