aula 9 - técnicas de diagnóstico (parte 2)
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Técnicas Diagnóstico Virologia – Parte II
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TÉCNICAS DE BIOLOGIA MOLECULAR
Detecção do genoma viral
Futuro do diagnóstico de vírus
Necessidade de equipamento e pessoal treinado
Biologiareal-time PCRTécnicas
Molecular
Aula 4 - Técnicas Diagnóstico Virologia - Parte II 2
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TÉCNICAS
Métodos de Amplificação Polimerase Chain Reaction (PCR) Restriction Fragment Lenght Position (RFLP) Single Strand Conformation Polymorphism (SSCP) Reverse Transcriptase - Polimerase Chain Reaction (RT- PCR) Real-Time PCR Sequenciação
Métodos de Hibridização Captura Híbrida Southern Blot Hibridização em tiras CHIPS
Biologiareal-time PCRTécnicas
Molecular
Aula 4 - Técnicas Diagnóstico Virologia - Parte II 3
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Extração de Ácidos Nucléicos
Aula 4 - Técnicas Diagnóstico Virologia - Parte II
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Extração Ácidos Nucléicos Biologiareal-time PCRTécnicas
Molecular
Aula 4 - Técnicas Diagnóstico Virologia - Parte II
Lise alcalina; Neutralização; Precipitação de Proteínas e detritos celulares; Purificação Ácidos Nucleicos
Precipitação Eluição em colunas
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Extração Ácidos Nucléicos Biologiareal-time PCRTécnicas
Molecular
Aula 4 - Técnicas Diagnóstico Virologia - Parte II 6
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Extração Ácidos Nucléicos Biologiareal-time PCRTécnicas
Molecular
Aula 4 - Técnicas Diagnóstico Virologia - Parte II 7
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Extração Ácidos Nucléicos Biologiareal-time PCRTécnicas
Molecular
Aula 4 - Técnicas Diagnóstico Virologia - Parte II
Add DNase
Add RNase
+ DNase (protein)
+ RNase (protein)
Utilização Nucleases Remoção DNA Remoção RNA
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Extração Ácidos Nucléicos Biologiareal-time PCRTécnicas
Molecular
Aula 4 - Técnicas Diagnóstico Virologia - Parte II
Avaliação Ácidos Nucléicos por Espectofotometria UV
Estimar a concentração de DNA e RNA a ~260nm.[dsDNA] ≈ A260 x (50 µg/mL)[ssRNA] ≈ A260 x (40 µg/mL)
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Técnicas de Amplificação AN
Aula 4 - Técnicas Diagnóstico Virologia - Parte II
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Polymerase Chain Reaction Biologiareal-time PCRTécnicas
Molecular
Aula 4 - Técnicas Diagnóstico Virologia - Parte II 11
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Amplifica um fragmento de DNA especifico;
Amplificação através de ciclos repetidos que vão permitir obter milhões de cópias do fragmento pretendido;
Fragmento pretendido está localizado entre duas regiões de DNA de sequência conhecida;
Região Alvo
5’ – (…) ATGCGTATCGATCGATATCGATAAGCTAGCTAGGCTA (…) – 3’3’ – (…) TACGCATAGCTAGCTATAGCTATTCGATCGATCCGAT (…) – 5’
Polymerase Chain Reaction Biologiareal-time PCRTécnicas
Molecular
Aula 4 - Técnicas Diagnóstico Virologia - Parte II 12
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Polymerase Chain Reaction Biologiareal-time PCRTécnicas
Molecular
MISTURA DE REAÇÃO:
DNA
Primers: Oligonucleotídeos de cadeia simples com sequência complementar às sequências alvo do DNA (idealmente 20-24 nucleotídeos);
Buffer: Solução tampão para estabilizar a reacção;
Mg2+ (Magnésio): Ajuda na ligação dos nucleotídeos e estabilidade da Taq;
dNTPs: Nucleotideos livres (A, T, C, G);
Taq polimerase: Enzima termo-estável (+/-72ºC) que efetua a cópia da sequência alvo do DNA.
Aula 4 - Técnicas Diagnóstico Virologia - Parte II 13
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Polymerase Chain Reaction Biologiareal-time PCRTécnicas
Molecular
PROCEDIMENTO
1º Passo: Abertura do ADN cadeia dupla (T=95ºC);
2º Passo: Annealing/Ligação dos Primers (Ta~50 a 65ºC);
3º Passo: Activação da Taq polimerase (T~75ºC);
3’ – (…) TACGCATAGCTAGCTATAGCTATTCGATCGATCCGAT (…) – 5’
5’ – (…) ATGCGTATCGATCGATATCGATAAGCTAGCTAGGCTA (…) – 3’ATCCGAT (…) – 5’
5’ – (…) ATGCGTA
Aula 4 - Técnicas Diagnóstico Virologia - Parte II 14
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Polymerase Chain Reaction Biologiareal-time PCRTécnicas
Molecular
PROCEDIMENTO
4º Passo: Repetição dos passos anteriores por 30-45 ciclos no máximo;
FINAL: Obtenção de 2nºciclos copias do fragmento alvo.
Aula 4 - Técnicas Diagnóstico Virologia - Parte II 15
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Polymerase Chain Reaction Biologiareal-time PCRTécnicas
Molecular
Electroforese em Gel de Agarose:
Separa as moléculas (proteínas ou ácidos núcleicos) de acordo com o seu peso molecular;
DNA e RNA possuem carga elétrica negativa migram para o pólo positivo (quanto mais pequenas mais migram);
Brometo de Etídeo: corante fluorescente que se vai intercalar na dupla hélice de DNA e possibilitar a visualização dos fragmentos quando em exposição a luz UV; ( cuidado=> carcinógeno!)
Amostras da PCR carregadas no gel;
Aula 4 - Técnicas Diagnóstico Virologia - Parte II 16
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Polymerase Chain Reaction Biologiareal-time PCRTécnicas
Molecular
Pólo Positivo (+)
Pólo Negativo (-)
Aula 4 - Técnicas Diagnóstico Virologia - Parte II
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Polymerase Chain Reaction
APLICAÇÕES
Detecção de sequências específicas de DNA viral Detecção AdV em amostras respiratórias Detecção EBV em biópsias Nasofaringe Detecção JCV em LCR ...
DESVANTAGENS Altamente sensível à contaminação com quantidades residuais de DNA. Falsos positivos e artefatos.
Biologiareal-time PCRTécnicas
Molecular
Aula 4 - Técnicas Diagnóstico Virologia - Parte II 18
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RestrictionFragment Length Polymorphism (RFLP) Biologia
real-time PCRTécnicasMolecular
Aula 4 - Técnicas Diagnóstico Virologia - Parte II 19
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Restriction Fragment Length Polymorphism (RFLP) Biologia
real-time PCRTécnicasMolecular
Baseada na técnica da PCR;
Análise de polimorfismos (mutações pontuais funcionais);
Variação no tamanho de fragmentos de DNA provocada pela atividade diferencial de enzimas de restrição (cortam o DNA numa sequência específica)
Presença de polimorfismo Perda ou ganho de local de restrição Variação no tamanho de fragmentos de DNA.
5’ – (…) ACTGA (…) – 3’3’ – (…) TGACT (…) – 5’
Aula 4 - Técnicas Diagnóstico Virologia - Parte II 20
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Restriction Fragment Length Polymorphism (RFLP) Biologia
real-time PCRTécnicasMolecular
Aula 4 - Técnicas Diagnóstico Virologia - Parte II 21
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Restriction Fragment Length Polymorphism (RFLP) Biologia
real-time PCRTécnicasMolecular
Aula 4 - Técnicas Diagnóstico Virologia - Parte II 22
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Restriction Fragment Length Polymorphism (RFLP) Biologia
real-time PCRTécnicasMolecular
Aula 4 - Técnicas Diagnóstico Virologia - Parte II 23
APLICAÇÕES
Detecção de variantes Virais Detecção variantes CMV – Associação com resposta a terapia Detecção variantes HPV – Associação com patologias Detecção variantes EBV – Associação com agressividade ...
DESVANTAGENS Todas as do PCR Sensível a contaminação por DNAses Artefactos
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Single Strand Conformation Polymorphism (SSCP) Biologia
real-time PCRTécnicasMolecular
Aula 4 - Técnicas Diagnóstico Virologia - Parte II 24
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Single Strand Conformation Polymorphism (SSCP) Biologia
real-time PCRTécnicasMolecular
Baseada na técnica da PCR;
Análise de polimorfismos/mutações;
Diferenças de sequência de um único nucleotídeo são suficientes para que cadeias simples de DNA adquiram uma conformação tri-dimensional diferente;
Gel de Poliacrilamida permite correr as amostras (apenas em cadeia simples/desnaturadas) em função da sua conformação.
Aula 4 - Técnicas Diagnóstico Virologia - Parte II 25
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Single Strand Conformation Polymorphism (SSCP) Biologia
real-time PCRTécnicasMolecular
Aula 4 - Técnicas Diagnóstico Virologia - Parte II
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Single Strand Conformation Polymorphism (SSCP)
Aula 4 - Técnicas Diagnóstico Virologia - Parte II
Biologiareal-time PCRTécnicas
Molecular
APLICAÇÕES
Detecção de variantes Virais Detecção variantes CMV – Associação com resposta a terapia Detecção variantes HPV – Associação com agressividade ...
DESVANTAGENS Todas as do PCR Contaminações Leitura gel poliacrilamida
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Reverse Transcriptase PCR Biologiareal-time PCRTécnicas
Molecular
Aula 4 - Técnicas Diagnóstico Virologia - Parte II 28
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Reverse Transcriptase PCR Biologiareal-time PCRTécnicas
Molecular
Baseada na técnica da PCR;
Análise de expressão de mRNA;
Usa a enzima Transcritase Reversa para converter o mRNA em cDNA;
Protocolo PCR para aumentar exponencialmente o número de cópias do mRNA;
Molécula Alvo
mRNA: 5’ – AUGCGUAUCGAUAUCGAUAAGCUA (…) AAAAAAAAA – 3’TTTTTTTTTT – 5’
Aula 4 - Técnicas Diagnóstico Virologia - Parte II 29
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Reverse Transcriptase PCR Biologiareal-time PCRTécnicas
Molecular
Aula 4 - Técnicas Diagnóstico Virologia - Parte II 30
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Reverse Transcriptase PCR Biologiareal-time PCRTécnicas
Molecular
VANTAGENS
Permite fazer análise quantitativa da expressão de mRNA.
Aula 4 - Técnicas Diagnóstico Virologia - Parte II 31
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Reverse Transcriptase PCR Biologiareal-time PCRTécnicas
Molecular
Aula 4 - Técnicas Diagnóstico Virologia - Parte II
APLICAÇÕES
Expressão mRNA viral Avaliação da replicação viral
DESVANTAGENS Todas as do PCR Contaminações
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Real Time PCR Biologiareal-time PCRTécnicas
Molecular
Aula 4 - Técnicas Diagnóstico Virologia - Parte II 33
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Real Time PCR Biologiareal-time PCRTécnicas
Molecular
PCR was traditionally limited to end-point analysis using agarose gels
Limitations of end-point PCR: Poor precision Low sensitivity Short dynamic range Low resolution Size-based discrimination Ethidium bromide for staining does not allow
for accurate quantitation Requires post-PCR processing
Aula 4 - Técnicas Diagnóstico Virologia - Parte II 34
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35
Monitora a fluorescência emitida durante a reação de PCR como um indicador da produções de amplicons em cada ciclo de PCR;
Monitorização em tempo real;
Detecção da amplificação nos estádios precoces da reação – maior precisão;
Alvo: DNA ou RNA
Real Time PCR Biologiareal-time PCRTécnicas
Molecular
Aula 4 - Técnicas Diagnóstico Virologia - Parte II
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Real Time PCR Biologiareal-time PCRTécnicas
Molecular
Aula 4 - Técnicas Diagnóstico Virologia - Parte II
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Real Time PCR Biologiareal-time PCRTécnicas
Molecular
Aula 4 - Técnicas Diagnóstico Virologia - Parte II 37
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Real Time PCR Biologiareal-time PCRTécnicas
Molecular
SYBR Green I Sonda de Hibridação Sonda TaqMan
Aula 4 - Técnicas Diagnóstico Virologia - Parte II 38
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PCR phases in linear view
Cycle #
[DNA]
ExponentialIf 100% efficiency – exact doubling of products. Specific and precise
LinearHigh variability. Reaction components are being consumed and PCR products are starting to degrade.
PlateauEnd-point analysis. The reaction has stopped and if left for long – degradation of PCR products.
Real Time PCR Biologiareal-time PCRTécnicas
Molecular
Exponential
Linear
Plateau
Aula 4 - Técnicas Diagnóstico Virologia - Parte II
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40
Real Time PCR Biologiareal-time PCRTécnicas
Molecular
Baseline – The baseline phase contains all the amplification that is below the level of detection of the real time instrument.Threshold – where the threshold and the amplification plot intersect defines CT. Can be set manually/automatically
CT – (cycle threshold) the cycle number where the fluorescence passes the threshold
Rn – (Rn-baseline)NTC – no template controlDRn is plotted against cycle numbers to produce the amplification curves and gives the CT value.
Aula 4 - Técnicas Diagnóstico Virologia - Parte II
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CT = threshold cycle
Fracção dos ciclos de PCR a partir da qual é detectado sinal
Real Time PCR Biologiareal-time PCRTécnicas
Molecular
Quanto maior a quantidade de DNA, menor o valor de Ct
Aula 4 - Técnicas Diagnóstico Virologia - Parte II
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Real Time PCR
Aplicações Quantificação carga viral Monitoração carga viral Monitoração terapêutica
VANTAGENS Amplificação monitorizada em tempo real Ausência de processamento pós-PCR (baixo risco de contaminação) Requer pouca quantidade de amostra (DNA ou RNA) Rápido, específico, sensível e reprodutível Quantitativo Barato
Biologiareal-time PCRTécnicas
Molecular
Aula 4 - Técnicas Diagnóstico Virologia - Parte II 42
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Sequenciação Biologiareal-time PCRTécnicas
Molecular
Aula 4 - Técnicas Diagnóstico Virologia - Parte II 43
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Sequenciamento Biologiareal-time PCRTécnicas
Molecular
Usada para determinar a sequência de nucleotídeos
Método de sequenciamento mais utilizado – método dideoxi
Adição de dideoxinucleotideos que terminam a reação de polimerização
3’ OH – necessário para adição do nucleotídeo seguinte
Aula 4 - Técnicas Diagnóstico Virologia - Parte II 44
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45
Sequenciamento Biologiareal-time PCRTécnicas
Molecular
Aula 4 - Técnicas Diagnóstico Virologia - Parte II
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Sequenciamento Biologiareal-time PCRTécnicas
Molecular
Aula 4 - Técnicas Diagnóstico Virologia - Parte II 46
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Técnicas de HibridizaçãoAula 4 - Técnicas Diagnóstico Virologia - Parte II
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Alvo – DNA ou RNA
Utilização de sondas específicas
Possibilidade de diferenciação entre subtipos de vírus
Técnicas Captura Híbrida Hibridização em tiras Southern Blotting CHIPS
Técnicas de Hibridização
Aula 4 - Técnicas Diagnóstico Virologia - Parte II
Biologiareal-time PCRTécnicas
Molecular
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Captura Híbrida Biologiareal-time PCRTécnicas
Molecular
Aula 4 - Técnicas Diagnóstico Virologia - Parte II 49
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Captura Híbrida Biologiareal-time PCRTécnicas
Molecular
Principio da técnica Hibridização de Ácidos Nucleicos Amplificação sinal por Quimioluminescência Método semi-quantitativo
Método Hibridização amostras positivas com sondas específicas Complexo Sonda-Amostra é capturado por anticorpos de uma microplaca Reação com anticorpo secundário conjugado com FA Adição de reagente e detecção por quimioluminescência
Aula 4 - Técnicas Diagnóstico Virologia - Parte II 50
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Captura Híbrida Biologiareal-time PCRTécnicas
Molecular
45 minutesat 65ºC
60 minutesat 65ºC
60 minutesagitação
30 minutes
15 minutes
Aula 4 - Técnicas Diagnóstico Virologia - Parte II 51
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Southern Blot Biologiareal-time PCRTécnicas
Molecular
Aula 4 - Técnicas Diagnóstico Virologia - Parte II 52
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Southern Blot Biologiareal-time PCRTécnicas
Molecular
Aula 4 - Técnicas Diagnóstico Virologia - Parte II 53
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Hibridização em tiras Biologiareal-time PCRTécnicas
Molecular
Aula 4 - Técnicas Diagnóstico Virologia - Parte II 54
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Hibridização em tiras
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Biologiareal-time PCRTécnicas
Molecular
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Chips Biologiareal-time PCRTécnicas
Molecular
Aula 4 - Técnicas Diagnóstico Virologia - Parte II 56
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Chips
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Biologiareal-time PCRTécnicas
Molecular
Tipagem de vírus: HPV, HCV, HIV
Tubos ou lâminas com sondas específicas para cada subtipo
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Chips
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Biologiareal-time PCRTécnicas
Molecular
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Professor Mark Pallen
We ask the lab for a diagnosis, expecting a yes or no, but often end up
with just a maybe…
Aula 4 - Técnicas Diagnóstico Virologia - Parte II 59
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VirologiaAno Lectivo 2010/11
Técnicas Diagnóstico Virologia – Parte II