1 2013. GADA 1. MARTS

Nils Rostoks

AUGU GENOMU STRUKTŪRA

MĀCĪBU PLĀNS UN LEKCIJU SARAKSTS

2013. GADA 1. MARTS

2

Datums Lekcijas temats08.02.2013 Iepazīšanās, ievadlekcija15.02.2013 Augu ģenētikas vēsture. Augi kā ģenētikas modeļorganismi. 22.02.2013 Augu genomu struktūra un pētīšanas metodes 01.03.2013 Augu genomu struktūra un evolūcija. Genomu polimorfisms, poliploīdija

08.03.2013 Molekulāro marķieri un to genotipēšanas tehnoloģijas un to pielietojums genoma kartēšanā

15.03.2013 Kartēšana augos izmantojot eksperimentālas un dabiskas populācijas 22.03.2013 Lekcija nenotiek 29.03.2013 Lieldienu brīvdienas05.04.2013 Molekulārie marķieri augu selekcijā 12.04.2013 Seminārs. Augu genoma struktūra un molekulārie marķieri 19.04.2013 Augu - augu patogēnu molekulārā ģenētika un bioloģija

26.04.2013 Augu abiotiskā stresa izturības un hormonālās regulācijas molekulārā ģenētika

03.05.2013Transgēno augu iegūšanas vēsture, metodes un pielietojums fundamentālos pētījumos. Latvijas un ES likumdošana ĢMO kultūraugu līdzāspastāvēšanas un ierobežotas izmantošanas jomās Transgēno augu pielietojums biotehnoloģijā. Ģenētiski modificēti kultūraugi.

10.05.2013 Seminārs. Augu abiotiskais un biotiskais stress un ĢMO 17.05.2013 Lekcija nenotiek 24.05.2013 Eksāmens

SINTĒNIJA

2013. GADA 1. MARTS

3

Sākotnēji šis termins nozīmēja, ka gēni ir uz vienas hromosomas, t.i., sintēniski (no grieķu valodas burtiski “uz viena pavediena”)

Termins tiek plaši lietots, lai uzsvērtu, ka gēnu kārtība hromosomā dažādiem organismiem ir vienāda (sintēniska)

Mikrosintēnija – gēnu kārtības saglabāšanās nelielā genoma rajonā

Kolinearitāte – gēnu (marķieru) kārtības saglabāšanās

GĒNU KĀRTĪBAS SAGLABĀŠANĀS EVOLŪCIJAS GAITĀ (SINTĒNIJA)

2013. GADA 1. MARTS

4

A B C D E

A X B C E A B CB’ D E

A B C D E A B C D E

Sākotnējā hromosomaJaunu sugu

veidošanās

Suga 1 Suga 2

Neatkarīga evolūcija mutācijas, gēnu duplikācijas, insercijas un delēcijas

5SINTĒNIJAS PIELIETOJUMS

GENOMU KARTĒŠANĀ

Kukurūzas – rīsu gēnu sintēnija

Rīsu hromosoma ir sintēniska kukurūzas 3 un 8 hromosomai.

2013. GADA 1. MARTS

CILVĒKA – ŠIMPANZES UN CILVĒKA – PELES

GENOMU SALĪDZINĀJUMS

2013. GADA 1. MARTS

6

Genomu salīdzinājumi ļauj atbildēt uz fundamentāli atšķirīgiem jautājumiem

Cilvēks – pele. Iespējams identificēt gēnus un kontroles elementus, kas saglabājušies nemainīgi evolūcijas gaitā. Var pētīt proteīnu funkcionālos domēnus, kas saglabājušies nemainīgi, vai arī gēnus, kas atšķir abus organismus

Cilvēks – šimpanze. Genomi, tai skaitā nekodējošā DNS, ļoti līdzīgi, kas ļauj identificēt mutācijas, kas radušās tieši cilvēka evolūcijas gaitā. Iespējams identificēt mutācijas gēnos un kodējošās daļās, kas potenciāli atšķir cilvēku no šimpanzes

7MIEŽU – RĪSU UN MIEŽU –

ARABIDOPSIS SALĪDZINĀJUMS

2013. GADA 1. MARTS

Miežu – rīsu salīdzinājums

Miežu un rīsu līnijas atdalījās pirms 40 – 50 miljoniem gadu. Miežu un rīsu genomā nereti saglabājusies gēnu kārtība hromosomā. Zinot rīsu genoma sekvenci, iespējams paredzēt kādi gēni atradīsies atbilstošā miežu genoma rajonā

Miežu – Arabidopsis salīdzinājums

Viendīgļlapji un divdīgļlapji atdalījās pirms >100 miljoniem gadu. Nav saglabājusies līdzība gēnu kārtībā hromosomā. Iespējams salīdzināt gēnu un to kodēto proteīnu struktūru. Līdzīgiem gēniem nereti vēl aizvien ir arī līdzīga funkcija

8GENOMA STRUKTŪRAS

VARIĀCIJA

2013. GADA 1. MARTS

Ģenētiskās analīzes pamatā ir atšķirības starp organismiem un to genomiem

Galvenās atšķirības starp genomiem ir:

- punktveida mutācijas;

- insercijas un delēcijas;

- kopiju skaita atšķirības;

- poliploīdija.

9 GENOMU DINAMIKA

2013. GADA 1. MARTS

http://www.intl-pag.org/19/abstracts/W11_PAGXIX_076.html

http://www.intl-pag.org/19/abstracts/W94_PAGXIX_583.html

10MUTĀCIJU

FREKVENCES

2013. GADA 1. MARTS

Cilvēka un peles salīdzinājums (75 miljoni gadu neatkarīgas evolūcijas)

Cilvēkiem mutāciju (aizvietoto bāzu pāru) frekvence - 2.2 × 10–9 aizvietojumu uz vienu nukleotīdu gadā vai ~2.2 × 10–8 uz vienu nukleotīdu vienā paaudzē

Pelēm mutāciju (aizvietoto bāzu pāru) frekvence - 4.5 × 10–9 uz vienu nukleotīdu gadā vai ~10–9 uz vienu nukleotīdu vienā paaudzē

Kukurūzas Adh1 un Adh2 lokusos - 6.5 × 10–9 aizvietojumu uz vienu nukleotīdu gadā

11PUNKTVEIDA MUTĀCIJAS

2013. GADA 1. MARTS

Visbiežāk sastopamā atšķirība starp genomiem

Punktveida mutācijas notiek visās šūnās jebkurā laikā. Mutācijas somatiskos audos netiek nodotas pēcnācējiem. Mutācijas izraisa DNS replikācijas un reparācijas kļūdas, dažādi ķīmiskie savienojumi, UV un jonizējošais starojums

Mutācijas ir normāls process. Tām vajadzētu notikt ar +/- konstantu ātrumu, atšķirības mutāciju frekvencē liecina par izlasi

Mutāciju frekvence kodola, mitohondriju un hloroplastu genomos ir atšķirīgas (dzīvnieku mtDNS mutāciju frekvence augstāka nekā kodola genomā, bet augu cpDNS frekvence ir zemāka nekā kodola genomā

12PUNKTVEIDA MUTĀCIJU

IEDALĪJUMS

2013. GADA 1. MARTS

Pēc DNS bāzu tipa

Tranzīcijas – transversijas

Pēc efekta uz proteīna sekvenci

Klusējošās vai sinonīmās mutācijas (aminoskābju sekvence nemainās, vai tiek aizvietotas ar funkcionāli līdzīgu aminoskābi)

Nesinonīmās mutācijas (atšķirīgas aminoskābes);

Nonsense mutācijas (translācijas terminatora kodons)

13PUNKTVEIDA MUTĀCIJAS

2013. GADA 1. MARTS

14INSERCIJAS –

DELĒCIJAS

2013. GADA 1. MARTS

Indeli – retāki kā punktveida mutācijas , it īpaši kodējošās daļās

Mikrosatelītu polimorfisms var tikt uzskatīts par indel veidu, piemēram:

AGCTGGATTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGGGGAACTAC

AGCTGGATTGTGTGTGTGTGTGT..GTGGGGAACTAC

Indelus var izraisīt DNS replikācijas kļūdas, mobilo ģenētisko elementu insercijas, kā arī ķīmiskie mutagēni, UV un jonizējošā radiācija

15INSERCIJAS –

DELĒCIJAS

2013. GADA 1. MARTS

16KOPIJU SKAITA

VARIĀCIJA

2013. GADA 1. MARTS

Kopiju skaita variācija attiecas uz lieliem genomiskās DNS rajoniem (tūkstoši līdz miljoni bāzu pāru), kuri var būt atkārtoti genomā

Kopiju skaita variācija izraisa gēnu kopiju skaita izmaiņas un attiecīgi arī to kodēto proteīnu daudzuma izmaiņas šūnā

Visvairāk pētīta cilvēkos, bet pilnīgi noteikti ir novērojama arī augu genomā (Sebat et al. (2005) Large-scale copy number polymorphism in the human genome. Science, 305: 525)

17

2013. GADA 1. MARTS

18 POLIPLOĪDIJA

2013. GADA 1. MARTS

Poliploīdija augiem ir bieži sastopama

x – monoploīds hromosomu skaits, n – haploīds hromosomu skaits gamētās

Autopoliploīdija (piemēram, kartupeļi (2n = 4x = 48))

Allopoliploīdija (piemēram, kvieši (2n = 6x = 42), tritikāle)

Genoma duplikācijas un segmentālas duplikācijas

Kukurūza un rīsi ir seni tetraploīdi

Paterson et al. (2004) Ancient polyploidization predating divergence of the cereals, and its consequences for comparative genomics. PNAS, 101: 9903

19 POLIPLOĪDJA

2013. GADA 1. MARTS

Poliploīdija var atgadīties spontāni vai tikt inducēta

Poliploīdi bieži ir sterili

Homologās hromosomas un homeologās hromosomas

Bivalenti, univalenti, trivalenti

Triploīdi (rodas diploīdas un tetraploīdas sugas krustojumos , x un 2x gamētas)

Eiploīdi, aneiploīdi

TRITICEAE GENOMU EVOLŪCIJA

2013. GADA 1. MARTS

20

21PH LOKUSS UN HEKSAPLOĪDO

KVIEŠU RAŠANĀS

2013. GADA 1. MARTS

Kvieši (Triticum aestivum) ir heksaploīdi, bet to hromosomas mejozē sadalās kā diploīdam (tātad n = 21)

Šo skaldīšanos nodrošina Ph lokuss uz 5B hromosomas, kurš novērš homeologo hromosomu pārošanos mejozē

Ph lokuss ir izveidojies poliploidizācijas procesā pirms 8000 – 10000 gadiem

Ph lokuss atrodams tikai uz 5B hromosomas, bet ne 5A un 5D. Tas atrodams gan tetraploīdajos un heksaploīdajos kviešos, bet ne diploīdajās kviešu sugās

22

2013. GADA 1. MARTS

Griffiths et al. (2006) Nature, 439: 749

23RĪSU GENOMA DUPLIKĀCIJAS

2013. GADA 1. MARTS

Paterson et al. (2004) PNAS, 101: 9903

24

2013. GADA 1. MARTSSalse et al. (2009) Reconstruction of monocotelydoneous proto-chromosomes reveals faster evolution in plants than in animals. PNAS, 106:14908)

25ARABIDOPSIS GENOMA

DUPLIKĀCIJAS

2013. GADA 1. MARTSArabidopsis Genome Initiative (2000) Nature, 408: 796

26 2013. GADA 1. MARTS

Nils Rostoks

MOLEKULĀRIE MARĶIERI

27 MARĶIERI

2013. GADA 1. MARTS

Almost all aspects of life are engineered at the molecular level, and without understanding molecules we can only have a very sketchy understanding of life itself

Francis Crick

Tāpat kā ceļojumā orientēties palīdz ceļa stabi, genomā orientēties palīdz marķieri

AUGU MARĶIERI

2013. GADA 1. MARTS

28

Morfoloģiskie marķieri – vārpas forma un plēkšņu krāsa

Bioķīmiskie marķieri –dažāda izmēra proteīnu zonas SDS-PAGE

Molekulārie marķieri – atšķirības DNS molekulas nukleotīdu secībā

29MOLEKULĀRO MARĶIERU

IEDALĪJUMS

2013. GADA 1. MARTS

Pēc polimorfisma veida DNS molekulas sekvencē Punktveida mutāciju marķieri, mikrosatelītu marķieri

Pēc genotipa noteikšanas metodes Restrikcijas fragmentu garuma polimorfisms, CAPS (cleaved amplified polymorphic sequence)

Pēc genoma sekvences veida

Gēnu (cDNS) marķieri, anonīmie marķieri, retrotranspozonu marķieri un tmldz.

30MOLEKULĀRIE

MARĶIERI

RFLP – restrikcijas fragmentu garuma polimorfisms

AFLP – amplificētu fragmentu garuma polimorfisms

SSR – mikrosatelītu garuma polimorfisms SNP – punktveida mutācija

2013. GADA 1. MARTS

31BAKTĒRIJU GENOMA

RESTRIKCIJAS ANALĪZE

2013. GADA 1. MARTShttp://wheat.pw.usda.gov/~lazo/docs/xmal/rflps.html

32POLIMORFISMA DETEKCIJA

NOTEIKTĀ GENOMA RAJONĀ

2013. GADA 1. MARTS

Augu genomi lieli un kompleksi un starp dažādiem vienas sugas indivīdiem pastāv ļoti daudzas atšķirības (polimorfismi) genoma līmenī

Kā noteikt atšķirības DNS sekvencē noteiktā genoma rajonā?

DNS zondes un DNS hibridizācija Polimerāzes ķēdes reakcija ar specifiskiem

oligonukleotīdiem

33 RFLP SHĒMA I

2013. GADA 1. MARTS

Diploīds miežu genoms = 10x109 bp Restriktāze EcoRI (G^AATTC) vidēji

šķeļ ik pēc 46=4096 bp Vidēji sagaidāmi 2.5x106 DNS

fragmenti

Iedomāts ~150 000 bp gDNS rajons

GT1

GT1 AATTC GT2 AATTC

GA

GT2 X

Botstein et al. (1980) Construction of a genetic linkage map in man using restriction fragment length polymorphisms. American J Human Genetics, 32:314.

34 RFLP SHĒMA II

2013. GADA 1. MARTS

GT2GT1MGT2GT1M

1. blots 2. Hibridizācija ar specifisku zondi 3. Autoradiogrāfija

Southern

Genomiskās DNS restrikcija ar EcoRI, DNS fragmentu elektroforētiska sadalīšana agarozes gelā

35GENOMISKĀS DNS

RESTRIKCIJA RFLP ANALĪZEI

2013. GADA 1. MARTSKang and Yang (2004) BMC Biotechnology, 4:20

36 RFLP REZULTĀTI

DNS tiek šķelta ar restrikcijas fermentu, fragmenti tiek sadalīti agarozes gēlā atbilstoši to garumam un noteiktu fragmentu garumu nosaka izmantojot hibridizācijas zondes. Pirmās paaudzes molekulāro marķieru kartes

2013. GADA 1. MARTS

37RFLP TRŪKUMI UN

PRIEKŠROCĪBAS

2013. GADA 1. MARTS

Nepieciešamas specifiskas zondes – pirmais solis RFLP genoma kartēšanā ir hibridizācijas zondu izveidošana

Laikietilpīga metode, Southern hibridizācija nav automatizējama Relatīvi neliels alēļu skaits, problēmas ar krosshibridizāciju Lielākoties kodominanti marķieri Robusta metode, ja atstrādāti tehniskie aspekti, tā ir jutīga un

droša Vēl aizvien “zelta standarts”, pat salīdzinot ar mūsdienīgākām

metodēm

38 RFLP PIEMĒRI

2013. GADA 1. MARTS

39 RFLP VARIANTI

2013. GADA 1. MARTS

Genoma kompleksitātes samazināšana ar PCR, nevis specifiskām zondēm

Detekcijai izmanto fluorescentās krāsas, nevis autoradiogrāfiju, fragmentus sadala uz sekvenatora, nevis agarozes gelā

40 T-RFLP

2013. GADA 1. MARTS

Terminālo restrikcijas fragmentu garuma polimorfisms http://rdp8.cme.msu.edu/html/t-rflp_jul02.html

41MOLEKULĀRIE MARĶIERI

– AFLP

2013. GADA 1. MARTS

DNS polimorfismu detekcija balstoties uz restrikcijas enzīmu šķelšanu

Uz PCR balstīta metode genoma kompleksitātes samazināšanai

Fragmentus sadala denaturējošā poliakrilamīda gelā (sekvenēšanas gelā), vai arī kapilārajā elektroforēzē

Vos et al. (1995) AFLP: a new technique for DNA fingerprinting. Nucleic Acids Res, 23: 4407

42

2013. GADA 1. MARTS

43SELEKTĪVO NUKLEOTĪDU

SKAITA IETEKME UZ AFLP

2013. GADA 1. MARTS

A – viens selektīvs nukleotīds B – divi selektīvi nukleotīdi C – trīs selektīvi nukleotīdi D – četri selektīvi nukleotīdi I – III dažādas praimeru kombinācijas

44AFLP KĀ UNIVERSĀLA

MARĶIERSISTĒMA

2013. GADA 1. MARTS

I – Arabidopsis II – tomāts III – kukurūza IV – cilvēks

45AFLP PRIEKŠROCĪBAS UN

TRŪKUMI

2013. GADA 1. MARTS

Dominanta marķiersistēma – DNS fragmenti tiek skaitīti kā +/- (1 vai 0)

Universāla marķiersistēma – izmantojama jebkuram organismam Liels marķieru daudzums jau no dažām praimeru kombinācijām (van

Os et al. (2006) Construction of a 10,000-marker ultradense genetic recombination map of potato: providing a framework for accelerated gene isolation and a genomewide physical map. Genetics, 173: 1075)

Iespējams automatizēt izmantojot fragmentu analīzi uz sekvenatora Patentēta tehnoloģija

46MOLEKULĀRIE MARĶIERI

– SSR

Mikrosatelīti (arī Simple Sequence Repeats (SSR)) , piemēram, (AG)15

Rajons, kas satur mikrosatelītu atkārtojumu tiek amplificēts ar PCR un fragmenti tiek sadalīti agarozes vai poliakrilamīda gēlos

Weber and May (1989) Abundant class of human DNA polymorphisms which can be typed using the polymerase chain reaction. Am J Hum Genet, 44: 388

Litt and Luty (1989) A hypervariable microsatellite revealed by in vitro amplification of a dinucleotide repeat within the cardiac muscle actin gene. Am J Hum Genet, 44: 397

2013. GADA 1. MARTS

47 SSR

2013. GADA 1. MARTS

48 SSR ĪPAŠĪBAS

2013. GADA 1. MARTS

Kodominanti marķieri Liels skaits alēļu katrā lokusā Viens noteikts polimorfisma veids Nepieciešams neliels genomiskās DNS

daudzums, tehniski vienkāršāki nekā RFLP Iespējams analizēt lielu paraugu skaitu, it īpaši,

ja izmanto fluorescenti iezīmētus DNS fragmentu analīzi ar kapilāro elektroforēzi

49SSR FRAGMENTU

KAPILĀRĀ ELEKTROFORĒZE

2013. GADA 1. MARTS

Wang et al. (2003) Genome Introgression of Festuca mairei into Lolium perenne Detected by SSR and RAPD Markers. Crop Sci, 43: 2154

50MOLEKULĀRIE MARĶIERI

– SNP SNP – single nucleotide polymorphism (punktveida

mutācija)

Restrikcijas ar AgeI

2013. GADA 1. MARTS

51SNP

RAKSTUROJUMS

2013. GADA 1. MARTS

Galvenokārt bialēli marķieri, taču principā iespējami četri varianti katrā saitā

SNP – visbiežāk sastopamais ģenētiskā polimorfisma veids

SNP kombinācijas veido haplotipus (haploīdos genotipus)

Brookes AJ (1999) The essence of SNPs. Gene, 234: 177

52ALĒLES, HAPLOTIPI,

MUTĀCIJAS

2013. GADA 1. MARTS

consM1 M2 M3

Lokuss

AAAAA

TTC

TT

CCCCCCG

R Y S

G

G1G2G3G4G5G6

H1H2

H3

H4

H2

H2

Diploīds organisms, homologo hromosomu pāris

katrā lokusā var saturēt 2 alēles

PCR amplifikācija A1 un A2 fragmentu maisījums

PCR fragmentu sekvenēšana

Haplotipu fāze nav zināma

A1A2 A T

CCCG

R Y C

Nevar atšķirt H1, H2 un H3 haplotipus

53SNP GENOTIPĒŠANAS

TEHNOLOĢIJAS

2013. GADA 1. MARTS

Dažādas... Piemēram RFLP... CAPS – Cleaved Amplified Polymorphic

Sequences Alēles specifiska PCR amplifikācija,

piemēram, Applied Biosystems SNaPshot® Pirosekvenēšana

54ALĒLES SPECIFISKI OLIGONUKLEOTĪDI

2013. GADA 1. MARTS

55APPLIED BIOSYSTEMS

SNAPSHOT

2013. GADA 1. MARTS

Pievieno četrus dažādus ddNTP (A – dR6G, C – dTAMRA, G – dR110, T – dROX)

Reakcijas produktus sadala kapilārajā elektroforēzē

56

2013. GADA 1. MARTS

APPLIED BIOSYSTEMS

SNAPSHOT

57 ABI SNPLEX

2013. GADA 1. MARTS

Dai et al. (2008) BMC Medical Genomics, 1: 24

58 PIROSEKVENĒŠANA

2013. GADA 1. MARTS

http://www.pyrosequencing.com/DynPage.aspx?id=7454&mn1=1366&mn2=1367

1.

2. 3.

4.

59PIROSEKVENĒŠANA SNP

ANALĪZE

2013. GADA 1. MARTS

100

110

120

130

140

150

160

170

180

190

200

210

220

230

240

250

E S T G C T G C G A G A T C G C A

C:43.0%G:57.0%

5 10 15

60AUGSTAS CAURLAIDSPĒJAS

SNP GENOTIPĒŠANA

2013. GADA 1. MARTS

Vienlaicīga vairāku tūkstošu SNP analīze simtos DNS paraugu

Jo vairāk SNP lielākā paraugu skaitā, jo lielāka iespēja atrast noteiktu SNP asociāciju ar fenotipu

Augstas caurlaidspējas genotipēšanai nepieciešama specializēta (dārga) aparatūra, taču tā bieži pieejama arī kā pakalpojums

Affymetrix SNP čipi Illumina SNP čipi