Astrocyte-Like Cells Derived From Human Oral Mucosa Stem Cells Provide Neuroprotection In

Vitro And In Vivo

Javier Ganz, Ina Arie, Tali Ben-zur, Michal Dadon-nachum, Sammy Pour, Shareef Araidy, Sandu Pitaru, Daniel

Offen

ABSTRAK

Abstrak

• Human oral mucosa stem cell (hOMSC) akhir-akhir ini dijelaskan sebagai sel puncak dari populasi stem sel

• Potensi terapetik HOMSC bisa didapatkan dari biopsi kecil

• Kondisi medium dari induksi sel, menyelamatkan motor neuron dari hipoksia atau stres oksidatif in vitro, yang memacu menjadi efek neuroprotektif melalui faktor soluble.

Abstrak

• Subjek tikus dengan cedera saraf panggul dan di transplantasi dengan HOMSC menunjukkan kemajuan perbaikan pada fungsi motorik

• Pada tempat transplantasi, didapatkan peningkatan level NTF (neurotrophic factor) dan menjaga secara signifikan fungsi neuromuscular junction

Abstrak

• HOMSC –NS yang dihasilkan dari mukosa mulut menunjukkan efek neuroprotektif in vitro dan in vivo sebagai terapi masa depan pada gangguan neural

PENDAHULUAN

Pendahuluan

• Terapi berbasis stem sel menjanjikan sebagai pengobatan penyakit neurodegenerative

• Strategi yang digunakan dalam penelitian ada 2:– Penggantian sel untuk menambahkan sel yang hilang

dengan sel yang baru (Parkinson disease)– Menggunakan sel sebagai vector yang memproduksi dan

mensekresi neuroprotektif atau trophic stimuli untuk mempertahankan neuron.

Pendahuluan

• Neurotrophic factor (NTF) menghasilkan polypeptida alami yang mendukung perkembangan, kelangsungan hidup, dan membesarkan neuron.

• NTF seperti Brain Derived Neurotrophic Factor (BDNF) dan Vascular Endhotelial Growth Factor (VEGF) mempunyai peranan penting sebagai pertumbuhan, pemeliharaan dan regenerasi sistem saraf.

Pendahuluan

• Populasi HOMSC menunjukkan sebuah primitive neural crest (NC) stem cell dibuktikan dengan faktor transkripsi pluripotent Oct4, Nanog dan Sox2 dan sesuai ekspresi dari NC marker.

• Embrio NC memberi peningkatan untuk diferensiasi populasi glial di sistem saraf perifer.

Pendahuluan

• Penulis berhipotesis bahwa sel ini secara tepat memberi sinyal ke faktor solubel yang dapat memberi manfaat stem sel sebagai sumber terapi sel autolog pd ggn neurologi

BAHAN DAN METODE

Kultur HOMSC

• HOMSC didapatkan dari biopsi mucosa mulut pada pembedahan mulut

• HOMSC didapatkan dan dibiakkan di media yg terdiri dari low glucose Dulbecco dimodifikasi Eagle dan dilengkapi – 100mg/ml streptomycin, 100U/ml penicilin, 1250 U/ml

Nystatin (SPN), 2mM glutamine dan 10 % fetal calf serum

Kultur HOMSC

• Hasil biopsi disimpan dalam suhu 40 C dalam semalam

• Kemudian lapisan epitelial dipisah dari lamina propia dan diinsisi menjadi lembaran 0,5mm3

• sel dipindah ke piringan cultur yang dipanen dengan 0,25% trypsin dan ditanam pada ketebalan 4x104 cell/cm2

Diferensiasi HOMSC

• Ada 2 tahapan pada diferensiasi:1. Sel yang disimpan pada serum murni dengan ditambah

suplement-seplement dengan konsentrasi akhir 20ng/ml2. 72 jam kemudian dilakukan tahapan diferensiasi kedua

diaktifkan. Sel disimpan pada media serum bebas ditambah • 1mM dibutyryl cyclic AMP, 0,5 Mm 3-isobutyl-1methylxantlon,

50ng neurogulin, 1ng.ml PDGF selama 72 jam

Immunodetection

• Untuk analisis imunofloresin, sel difiksasi pd posphate buffer saline (PBS) 4% selama 60 menit di dalam blok

• Antibodi primer dilemahkan pd blok dan disimpan semalaman pd suhu 40 C

• Antibodi primer dideteksi dgn antibodi sekunder Alexa 488 dan 568 yang dilabeli dgn flouresin selama 1 jam pd suhu ruangan.

Immunodetection

• Foto diambil dgn floresin Olympus IX70-S8F2 dengan sumber cahaya flouresin.

Western Blot Analysis

• Untuk Western Blot Analysis , sel yang dilarutkan dlm buffer yg mengandung PBS 1% SDS dan complete protease inhibitor ditambahkan 12 % SDS-Polyacrylamide gel elektrophoresis.

• 3 kultur independent digunakan sebagai replikasi biologi

• Membran dianalisis dan dikumpulkan, diukur dengan Odyssey IR imaging system.

Real Time Polymerase Chain Reaction

• Total RNA diisolasi oleh TRI reagent• Jumlah dan kualitas RNA ditentukan dengan

ND-1000 spectrophometer• Real time semiquantitative polymerase chain

reaction (PCR) dari gen berperan pada ABI Prism 7700 rangkaian sistem deteksi.

Enzyme-Linked Immunosorbent Assay Berdasar Pengukuran Sekresi NTF

• Konsentrasi human VEGF dan BDNF dalam kultur sel supernatant diukur menggunakan prosedur ELISA

• Sampel yang diinkubasi semalaman pada piring berlapis, diikuti paparan antibodi sekunder dan streptavidin-horseradish H2O2

• Hasilnya dikalkulasi sebagai sekresi protein oleh 1 juta sel/mm dri media

Pengujian Kemampuan Hidup Sel

• Peneliti telah menguji kemampuan undiferensisasi dan diferensiasi HOMSC pd media preparat untuk melindungi motor neuron-like hybird cell line (NSC-34) dari hipoksia dan stres oksidatif

Cedera Saraf Panggul dan Transplantasi Sel

• Percobaan dgn kerusakan saraf panggul digunakan pada tikus Sprague-Dawley laki-laki usia 8 minggu dgn berat 230-250gr

• HOMSC didapatkan dari donor yang berbeda dan digunakan pd eksperimen yg independent

• Hasil dari 2 eksperimen disatukan dan dipresentasikan sbg rata-rata + SEM/binatang

Cedera Saraf Panggul dan Transplantasi Sel

• Tikus dibius dgn chloral hydrate pada cedera saraf panggul dan sel transplantasi, maintenance dgn cyclosporine

• Saraf panggul kanan dikeluarkan dan di klem 10mm diatas cabang pertama saraf selama 30 detik

Cedera Saraf Panggul dan Transplantasi Sel

• 20 jam setelah cedera, diferensiasi HOMSC dan naif sel dipanen, dilabeli dgn seperparamagnetic iron oxide, disentrifugal dan diresuspensi pd konsentrasi 1x106 sel/100µL dimaintenence dgn es sampai transplantasi dilakukan

• HOMSC diinjeksi melalui m. gastrocnemius menuju saraf dan diatas cabang pertama saraf panggul

Cedera Saraf Panggul dan Transplantasi Sel

• Semua hewan coba dikorbankan 10 hari setelah transplantasi untuk dilakukan pengamatan histologi.