UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO SUL

INSTITUTO DE CIÊNCIAS BÁSICAS DA SAÚDE

DEPARTAMENTO DE BIOQUÍMICA

ASPECTOS LABORATORIAIS DO DIAGNÓSTICO

DA DEFICIÊNCIA DE GLICOSE-6-FOSFATO

DESIDROGENASE (G6PD)

Simone Martins de Castro

Orientador: Prof. Dr. Roberto Giugliani

Tese apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Ciências Biológicas –

Bioquímica do Instituto de Ciências Básicas da Saúde da Universidade Federal do

Rio Grande do Sul (UFRGS) como requisito parcial para obtenção do título de

Doutor em Bioquímica

Fevereiro, 2006

Simone Martins de Castro Tese de Doutorado

II

Nada na vida deve ser temido, somente compreendido. Agora é hora de

compreender mais, para temer menos.

(Marie Curie, física)

Simone Martins de Castro Tese de Doutorado

III

AGRADECIMENTOS

Ao meu orientador Roberto Giugliani, pelo apoio e confiança em mim depositada

para desenvolver este trabalho.

Ao Dr. George Reclos, pela amizade, estímulo e ajuda inestimável em todas as

fases de realização deste trabalho.

À Dra. Úrsula Matte, pelo apoio não somente com sugestões e auxílio prático,

mas principalmente como incentivadora e orientadora deste trabalho.

À Raquel Weber, um agradecimento especial, uma pessoa essencial para que

este trabalho fosse realizado, pela permanente disponibilidade, leituras críticas e

principalmente pela sua competência.

À Ana Paula Santin pela dedicação e apoio na execução da parte prática desta

tese.

À Sandrine Wagner por todo o apoio e amizade.

Aos meus colegas de laboratório de Triagem Neonatal, Laboratório de Análises

Clínicas da Faculdade de Farmácia e da Terapia Gênica do HCPA pela amizade e

disponibilidade em ajudar, e a todos que, de uma maneira ou de outra, contribuíram para

a realização deste trabalho.

À Universidade Federal do Rio Grande do Sul, Intercientífica e HCPA pelo apoio

financeiro

Ao Prof. Dr. Mário Wagner, pela amizade e assessoria na análise estatística.

Aos pacientes pela colaboração.

Às minhas filhas Luisa e Laura e meus pais, a quem dedico esta tese, desculpe

pela ausência.

Simone Martins de Castro Tese de Doutorado

IV

SUMÁRIO Apresentação VII

Resumo VIII

Abstract IX

Lista de Abreviaturas X

I. Introdução 1

I.1 – Vias Metabólicas da Glicose 2

I.1.1 – A Enzima G6PD e a Via das Pentoses-Fosfato 3

I.2 – A Deficiência da G6PD 5

I.3 – Manifestações Clínicas 6

I.3.1 – Anemia hemolítica Aguda 6

I.3.1.1 – Hemólise Induzida por Drogas 7

I.3.1.2 – Hemólise Induzida por Infecções 9

I.3.1.3 – Hemólise Induzida por Acidose Diabética 9

I.3.1.4 – Favismo 9

I.3.2 - Icterícia Neonatal 10

I.3.2.1 – A deficiência da G6PD e a Icterícia Neonatal 10

I.3.3 – Anemia Hemolítica não Esferocítica Crônica 14

I.4 –Distribuição Geográfica da Deficiência da G6PD 14

I.4.1 – Distribuição das Principais Variantes da G6PD 15

I.4.2 – Variantes de G6PD no Brasil 19

Simone Martins de Castro Tese de Doutorado

V

I.5 – Aspectos Genéticos 19

I.5.1 – Polimorfismo de DNA no Gene da G6PD em Populações Humanas 21

I.6 – A Ocupação da Região Sul do Brasil 24

I.7 - Objetivos 26

II. Resultados 27

II.1- Capítulo 1- Evaluation of G6PD Stability in blood samples under different

collection and storage conditions.

Castro SM, Weber R, Dadalt V, Santos VF, Reclos GJ, Pass KA, Giugliani R

Publicado em “Clinical Chemistry, 2005 Jun;51(6):1080-1” 28

II.2- Capítulo 2- Prevalence of G6PD Deficiency in Newborns in The South of

Brazil.

Castro SM, Dadalt V, Weber R, Tavares V, Giugliani R.

Submetido ao Journal of Medical Screening 31

II.3- Capítulo 3 - Molecular Characterization of Glucose-6-Phosphate

Dehydrogenase Deficiency in Patients from Porto Alegre – RS.

Castro SM, Weber R, Matte U, Giugliani R

Submetido ao Genetics and Molecular Biology 41

Simone Martins de Castro Tese de Doutorado

VI

II.4- Capítulo 4- G6PD: Discrepancies between genotype and phenotype

Castro SM, Weber R, Matte U, Pass K, Tanyalcin T, Reclos G, Giugliani R

Em fase final de revisão pelos autores para ser submetido ao Clinical Chemistry 58

III. Consideração Finais 78

IV. Referências Bibliográficas 91

V. Anexos 106

Simone Martins de Castro Tese de Doutorado

VII

APRESENTAÇÃO

Esta tese é composta de “Introdução” (ítem I), seguida de “Resultados”

(ítem II) que estão apresentados sob forma de artigos publicados e artigos

submetidos à publicação, os quais encontram-se organizados em Capítulos.

Material e Métodos, Resultados, Discussão dos Resultados e Referências

Bibliográficas, encontram-se nos próprios artigos e representam a íntegra deste

estudo. O ítem III, Considerações Finais, encontrado no final desta tese,

apresenta interpretações e comentários gerais sobre o conjunto dos trabalhos aqui

apresentados. O ítem IV, Referências Bibliográficas, refere-se somente às

citações que aparecem na introdução e nas considerações finais desta tese. O

item V (Anexos) apresenta dados e técnicas que foram utilizados na elaboração

desta tese e que podem ser úteis para a interpretação dos resultados.

Simone Martins de Castro Tese de Doutorado

VIII

RESUMO

A G6PD é expressa em todos os tecidos, onde catalisa a primeira etapa da via das pentoses-fosfato. O NADPH produzido pela ação da G6PD serve como doador de elétrons na biossíntese redutora. Pelo fato de os glóbulos vermelhos não terem mitocôndria, a via das pentoses-fosfato é a única fonte de NADPH e essencial para sua proteção contra o stress oxidativo. A deficiência da G6PD é classificada como anemia hemolítica hereditária ligada ao cromossomo X, associada a manifestações clínicas heterogêneas. O gene da G6PD possui cerca de 140 variantes moleculares já descritas, muitas dessas associadas à enzimopatia. Considerando-se a alta freqüência populacional da deficiência de G6PD, a constituição da população do Rio Grande do Sul e as dificuldades diagnósticas desta deficiência, este trabalho teve como objetivo caracterizar os aspectos laboratoriais do diagnóstico da deficiência de G6PD em nosso meio. Para a quantificação da atividade da G6PD, foi utilizado o método enzimático-colorimétrico com normalização da hemoglobina (kit intercientífica) e para as análises moleculares foram investigadas as mutações 202, 376 e 563 por PCR/RFLP. O presente estudo revelou uma prevalência combinada de 7,9% das duas formas de deficiência de G6PD (completa e parcial) no Rio Grande do Sul, com alta prevalência de pacientes parcialmente deficientes e sem correlação com origem étnica. Usando técnicas bioquímicas e moleculares, foi caracterizada a deficiência de G6PD em amostras de Porto Alegre como sendo principalmente devida às mutações G202A e A376G, representando a variante G6PD A-, confirmando uma distribuição homogênea do padrão G6PD A- no Brasil. Os resultados apresentados aqui demonstraram que as condições de estocagem (temperatura principalmente) desempenham um papel fundamental na atividade da G6PD, especialmente nas coletas em papel filtro. Na avaliação da acurácia do método enzimático de medida da atividade da G6PD as sensibilidades e especificidades calculadas para os valores de cut-off estabelecido em uma população normal foram: para 2,9 U/gHb ( 11,4% e 100%), para 8 U/g Hb (77,1% e 94,7%) e para 11,5 U/g hb (97,1% e 76,3%). Estima-se que a deficiência de ambas as formas combinadas de G6PD seja de aproximadamente 8% numa amostra do RS. A partir de uma probabilidade pré-teste de 8,0%, após a realização do ensaio enzimático, a probabilidade pós-teste de uma pessoa ser deficiente de G6PD com nível enzimático inferior a 8 U/g Hb passa a ser 55,9%. Ao passo que para níveis superiores a 11,5 U/gHb esta probabilidade de deficiência diminui para 0,37%. Pode-se concluir que o método empregado (kit Intercientífica) foi adequado para avaliar a atividade enzimática de G6PD em amostras de sangue total. É um método capaz de detectar a deficiência de G6PD, demonstrando de forma satisfatória o grau de deficiência em indivíduos que possuem mutações que causam deficiência enzimática menos severa, inclusive mulheres heterozigotas. A análise molecular pode identificar o tipo de variante mas não pode indicar o risco real para as mulheres portadoras, que é diretamente estimado pelo nível de atividade enzimática.

Simone Martins de Castro Tese de Doutorado

IX

ABSTRACT

GP6D is expressed in all tissues, where it catalizes the first step in the

pentose phosphate pathway. The NADPH produced by G6PD serves as an electron donor in reductive biosynthesis. Because the red blood cell lack mitochondria, the pentose phosphate shunt is the only source of NADPH, which is essencial to its protection. G6PD deficiency is classified as hereditary hemolytic anemia linked to the X-chromosome, associated with heterogeneous clinical manifestations. More than 140 molecular G6PD variants have been described. Many of those are associated with the enzymopathy among humans. Considering the high incidence of G6PD deficiency in human populations, the constitution of the population of the Brazilian state of Rio Grande do Sul and the difficulties to diagnose this deficiency, the purpose of this paper was characterize the laboratory aspects of the diagnosis of G6PD deficiency. For the quantitaive determination of the activity of G6PD, the hemoglobin normalization method (Interscientific Screening Kit) was used. And the PCR/RFLP analysis was applied to detect mutations at codons 202, 376 and 563. This study has revealed a combined prevalence of 7.9% of the two forms of G6PD deficiency (complete and partial) in the state of Rio Grande do Sul. There is a high prevalence of partially deficient patients with no correlation with ethnic origin. With the use of biochemical and molecular techniques, G6PD deficiency was detected in samplings collected in the city of Porto Alegre. Such deficiency was mainly due to G202A and A376G mutations, representing the G6PD A- standard in Brazil. The results presented here have shown that the storage conditions (mainly temperature) have played a fundamental role in the G6PD activity, specially in the samples collected on filter paper. In the evalution of the accuracy of the enzymatic method for the G6PD activity measurement, the sensitivities and specifities calculated for the cut-off values established in a normal population were: for 2.9 U/gHb (11.4% and 100% ), for 8.0 U/gHb (77.1 and 94.7%), and for 11.5 U/gHb (97.1% and 76.3%). It is estimated that the deficiency of both combined forms of G6PD is approximately 8.0% in a sample in the state of Rio Grande do Sul. From a pretest probability of 8%, after enzyme assay the odds ratio of a given person to be G6PD deficient (having enzyme levels lower than 8 U/gHb) becomes 55.9%. On the other hand, for enzyme levels higher than 11.5 U/gHb, this probability goes down to 0.37%. It is them possible to conclude that the method employed (Interscientific Screening Kit) was suitable to evaluate the G6PD enzimatic activity in whole blood sample. It is a method that can detect G6PD deficiency showing, in a satisfactory way, the deficiency level in individuals who have mutations that cause less severe enzymatic deficiency, including heterozygote women. The molecular analysis can identify the type of variant, but in cannot indicate the true risk for women with this disorder, which is directly estimated by the level of enzymatic activity.

Simone Martins de Castro Tese de Doutorado

X

LISTA DE ABREVIATURAS

AHNEC Anemia hemolítica não esferocítica crônica

ATP Adenosina Trifosfato

BIND Disfunção neurológica induzida pela bilirrubina

DNA Ácido desoxiribonucleico

G6P Glicose-6-fosfato

G6PD Glicose-6-fosfato desidrogenase

GSH Glutatião reduzido

GSSG Glutatião oxidado

H2O2 Peróxido de Hidrogênio

INN Icterícia Neonatal

Km Constante de Michaelis

NADP+ Nicotinamida Adenina Dinucleotídio Fosfato

NADPH Nicotinamida Adenina Dinucleotídio Fosfato reduzida

R5P D-ribose-5-fosfato

UDPG Uridina difosfoglicose

Introdução

1

I. INTRODUÇÃO

Introdução

2

I.1 – VIAS METABÓLICAS DA GLICOSE

A vida de uma célula depende de uma série de eventos complexos e

ordenados, envolvendo inúmeras transformações químicas específicas. No

metabolismo celular, a energia contida nas biomoléculas é mobilizada nos

processos de síntese e degradação. Para que estes processos ocorram são

requeridas centenas de reações catalisadas por enzimas, as quais são as

unidades funcionais das vias metabólicas. A glicose é uma importante fonte de

energia da maioria dos organismos. Nos mamíferos, este monossacarídeo é

metabolizado por todas as células através da via glicolítica (via principal) e da via

das pentoses-fosfato (Devlin, 2003).

A via glicolítica ou via de Embden-Meyerhof pode funcionar na presença

(via aeróbia) ou na ausência (via anaeróbia) de O2. O produto principal do

processo aeróbio é o piruvato. Todavia, para oxidar a glicose, além desta etapa,

são necessários sistemas enzimáticos mitocondriais, como o ciclo de Krebs e a

cadeia respiratória para a produção de ATPs/molécula de glicose. A glicólise

anaeróbia tem como produto final o lactato, liberando apenas 2 ATPs/molécula de

glicose nesse processo (Nancy, 2003).

A via das pentoses-fosfato, também denominada hexose monofosfato ou

via oxidativa direta, é responsável pela produção do Nicotinamida Adenina

Dinucleotídeo Fosfato reduzido (NADPH). Esta é uma via especial e

particularmente importante em todas as células animais, principalmente no

eritrócito maduro (Berg, 2004) que, por não ter núcleo nem mitocôndria, é incapaz

Introdução

3

de obter energia a partir do ciclo de Krebs. Desta forma, esta célula metaboliza

90% da glicose pela via anaeróbia de Embden-Meyerhof e 10% pela via das

pentoses-fosfato, na qual atua a glicose-6-fosfato desidrogenase (G6PD).

I.1.1 – A Enzima G6PD e a Via das Pentoses-Fosfato

A G6PD é uma enzima citoplasmática, distribuída em todas as células, que

catalisa especificamente o primeiro passo da via das pentoses-fosfato (Luzzatto &

Mehta, 1995). Esta enzima converte a molécula de glicose-6-fosfato (G6P) em 6-

fosfoglicono-δ-lactona pela retirada dos hidrogênios. Estes hidrogênios são

transferidos para o Nicotinamida Adenina Dinucleotídeo Fosfato (NADP+), o qual

encontra-se fortemente ligado à G6PD, reduzindo-o a NADPH. Outras enzimas

dão prosseguimento à degradação do composto 6-fosfoglicono-δ-lactona até

chegar a D-ribose-5-fosfato (R5P) (Berg, 2004) (Figura 1).

Figura 1. A G6PD e a via das Pentoses-Fosfato.

Glicose-6-Fosfato

D-Ribose-5-Fosfato

NADP NADPH

Glicose-6-Fosfato Desidrogenase

6-Fosfogliconato- δ -Lactona

6-Fosfogliconato

D-Ribulose-5-Fosfato

H2O

NADPNADPH

Lactonase

CO2

H

Fonte: Berg, 2004.

Fosfopentose-Isomerase

Introdução

4

A ribose produzida por este processo é utilizada pela célula na síntese de

nucleotídeos. O NADPH, por sua vez, tem como principal função doar o hidrogênio

ao glutatião oxidado (GSSG), para convertê-lo em glutatião reduzido (GSH). O

composto GSH é responsável pela regeneração dos grupos sulfidrilas da cadeia β

da hemoglobina, os quais tornam-se oxidados durante o transporte do oxigênio

(Luzzatto & Mehta, 1995). O GSH pode também remover os peróxidos (H2O2) que

são produzidos pela ação de drogas e que são altamente tóxicos para as

hemácias (Berg, 2004) (Figura 2). Uma via alternativa de detoxificação de

peróxidos é a catalase, porém, esta rota é provavelmente ineficiente nas

hemácias, devido à afinidade da catalase pelo H2O2 ser muito menor que a do

GSH (Luzzatto & Mehta, 1995). Portanto, o NADPH torna-se indispensável para a

manutenção dos grupamentos sulfidrilas e para a conversão do GSSG em GSH,

condição essencial para a proteção da célula contra o dano oxidativo. Assim, a

eliminação de H2O2 da célula requer a presença de NADPH que no eritrócito

maduro é produzido exclusivamente pela G6PD. (Figura 2). Durante o stress

oxidativo, desencadeado por drogas ou agentes químicos ambientais, a presença

de NADPH é essencial para a detoxificação de radicais livres ativos e

hidroperoxidases (Beutler, 1994).

Introdução

5

NADP

NADPH GSSG

GSH H O2 2

H O2

Figura 2. Processo de eliminação de Peróxidos.

I.2 – A DEFICIÊNCIA DA G6PD

A deficiência da enzima G6PD é causada por uma alteração genética que

causa diminuição de sua atividade ou estabilidade. Esta enzimopatia hereditária

foi descrita pela primeira vez em homens negros americanos na década de 50,

quando eram realizados estudos de sensibilidade ao efeito hemolítico do

antimalárico primaquina (Carson et al., 1956).

A exposição de eritrócitos deficientes da G6PD a certas drogas resulta na

produção de H2O2 ou formação de radicais livres que oxidam diretamente o GSH

(Devlin, 2003). A oxidação do GSH pode levar à formação de um complexo misto

com a hemoglobina, a qual sofre mudanças conformacionais, expondo à oxidação

grupos sulfidrilas internos, resultando na desnaturação da globina (Srivastava &

Beutler, 1970). A globina desnaturada forma massas insolúveis chamadas corpos

de Heinz, que se ligam à membrana das hemácias comprometendo a sua

plasticidade e por fim alterando a sua forma. Essas células deformadas são

Fonte: Berg, 2004.

Introdução

6

reconhecidas pelo organismo como estranhas e, portanto, são removidas da

circulação por macrófagos, levando à hemólise extravascular (Jacob &

Winterhalter, 1970). Embora ocorra hemólise extravascular, o acúmulo

descontrolado de H2O2 dentro da hemácia pode também clivar as ligações C-C

dos fosfolipídios da membrana celular, resultando no rompimento prematuro da

hemácia dentro da circulação, levando à hemoglobinemia e hemoglobinúria (Berg,

2004).

I.3 – MANIFESTAÇÕES CLÍNICAS

Os pacientes são assintomáticos. A expressão clínica das variantes

deficientes da G6PD pode resultar a partir da interação das propriedades

moleculares com fatores exógenos e fatores genéticos (Luzzatto & Mehta, 1995).

A deficiência pode causar diversas patologias humanas, com clínicas bem

caracterizadas como: 1) anemia hemolítica aguda que pode ser provocada por:

drogas, infecção, acidose diabética, ingestão de feijão fava (favismo); 2) icterícia

neonatal (INN); 3) anemia hemolítica não esferocítica crônica (AHNEC).

I.3.1 – Anemia Hemolítica Aguda

As características clínicas de um episódio hemolítico agudo, iniciam-se

geralmente por volta de 2 a 4 dias após o contato com o fator desencadeante. Nas

variantes deficientes mais comuns (G6PD A- e G6PD Mediterrânea), a hemólise

grave ocorre após à exposição a certos agentes oxidantes (Nancy, 2003).

Introdução

7

Nos indivíduos G6PD A-, a hemólise limita-se às hemácias com mais de 50

dias. A manifestação nestes pacientes pode ser variável, existindo casos em que

as alterações são subclínicas, enquanto em outros a crise é grave, ocorrendo

icterícia acentuada, dores musculares abdominais e lombares, febre,

hemoglobinúria e reticulocitose (Ramalho et al., 1985). O processo hemolítico

agudo termina espontaneamente após uma semana, mesmo se a exposição à

droga for mantida. Isto pode ser explicado pela natureza seletiva das hemácias

ocasionada pela eliminação das células mais velhas, as quais não são capazes de

sintetizar novas moléculas da enzima para substituir as degradadas, assim como

não podem sintetizar novos componentes da membrana celular danificados pelo

excesso de H2O2. O produto da hemólise estimula a liberação de células jovens

que contém maior quantidade da enzima, sendo estas, portanto, mais capazes de

resistir ao estresse oxidativo (Ramalho et al., 1985; Nancy, 2003).

O processo hemolítico que ocorre nos indivíduos com G6PD mediterrânea é

semelhante ao descrito anteriormente. No entanto, nestes deficientes as hemácias

jovens também são afetadas em virtude da maior instabilidade e da maior redução

da velocidade de reação da enzima e por isso a hemólise não é autolimitada e

tende a ser mais acentuada (Ramalho et al., 1985).

I.3.1.1 – Hemólise Induzida por Drogas

A primaquina não é a única droga que pode ter efeito hemolítico nos

deficientes da G6PD. Existem outras drogas que são prejudiciais e podem

desencadear eventos hemolíticos nestes pacientes. Existem ainda algumas

Introdução

8

drogas que apesar de produzir uma modesta redução na sobrevida das hemácias

deficientes, podem ser administradas em doses terapêuticas normais (Beutler,

1994). Na Tabela 1 estão listados os principais agentes químicos envolvidos com

o processo hemolítico nos deficientes da G6PD.

Tabela 1. Drogas e Químicos Associados com Hemólise em Indivíduos com Deficiência da G6PD, segundo Luzzatto & Mehta, 1995. Drogas Associação Definitiva Associação

Possível *

Antimaláricos

Primaquina Pentaquina Pamaquina

Cloroquina

Sulfonamidas

Sulfonamida, Sulfanilamida Sulfacetamida Sulfapiridina Sulfametoxasol Tiazolesulfona Difenilsulfona(DDS) Dapsona

Sulfametoxipiridazina Sulfadimidina

Nitrofuranos Nitrofurantoína Analgésicos-Antipiréticos

Acetanilida

Outros

Ácido Nalidíxico Naftaleno Niridazol Fenilhidrazina Azul de Toluidina Trinitrotolueno (TNT) Azu de Metileno Fenazolpiridina

Cloranfenicol Vitamina K análogas

*Causam hemólise significativa apenas quando administradas em doses terapêuticas elevadas ou quando ingeridas por indivíduos com variantes da classe I.

Introdução

9

I.3.1.2 – Hemólise Induzida por Infecção

Um número elevado de infecções bacterianas e virais está envolvido com a

hemólise aguda. E o tipo de variante de G6PD que o indivíduo apresenta

determina a severidade do quadro hemolítico. Muitos episódios hemolíticos

atribuídos às drogas podem na verdade ser conseqüência de processos

infecciosos, para as quais estas foram administradas (Luzzatto & Mehta, 1995).

Desta forma, é possível que a infecção esteja mais relacionada com eventos

hemolíticos do que as próprias drogas.

I.3.1.3 – Hemólise Induzida por Acidose Diabética

Segundo Gellady & Greenwood (1972), o processo hemolítico pode ocorrer

em associação com cetoacidose diabética e hipoglicemia (Shalev et al., 1985).

Entretanto, a coexistência de infecção e/ou exposição à droga não pode ser

excluída nestes casos (Shalev et al., 1984).

I.3.1.4 – Favismo

O favismo constitui um evento hemolítico desencadeado pela ingestão de

feijão fava (Vicia faba), comum nos países do Mediterrâneo. A fava é tóxica

principalmente para os indivíduos que apresentam a variante Mediterrânea

(Jacobasch & Rapoport, 1996). Os sintomas de hemólise aguda são observados

nas primeiras horas após a ingestão dessa leguminosa ou inalação do seu pólen,

o que geralmente ocorre em crianças de 1 a 5 anos e pode ser fatal (Luzzatto &

Mehta, 1995).

Introdução

10

I.3.2 – Icterícia Neonatal

A icterícia neonatal é freqüente e grave em recém-nascidos com a variante

Mediterrânea, embora isso também possa ocorrer com a variante A- (Kaplan et al.,

2004). No entanto, há uma ampla variação na freqüência e severidade deste

processo hemolítico, quando consideradas diferentes populações, o que pode ser

explicado pela ação de fatores genéticos ou ambientais, tais como o contato com

a naftalina (Luzzatto & Mehta, 1995) e drogas ou substâncias químicas ingeridas

pela mãe no final da gestação e que são potencialmente hemolíticas (Mentzer &

Collier, 1975).

I.3.2.1 – A Deficiência da G6PD e a Icterícia Neonatal

A icterícia é a manifestação clínica decorrente do aumento da concentração

sérica de bilirrubina e sua conseqüente deposição nos tecidos, causando uma

coloração amarelada na pele.

A bilirrubina é um pigmento derivado do heme, resultante principalmente do

catabolismo da hemoglobina ao nível do sistema retículo-endotelial, sendo que

70% dela origina-se dos eritrócitos senescentes. Este pigmento é composto por

duas frações principais: indireta - fração lipossolúvel que circula conjugada à

albumina e direta - fração hidrossolúvel (Henry, 1995).

A bilirrubina indireta é captada da circulação pelas células hepáticas, liga-se

a uma proteína receptora e, por conjugação com o ácido glicurônico através da

UDP-glicuroniltransferase (UDPG), torna-se hidrossolúvel. O principal produto que

é então eliminado pela bile no intestino delgado é o diglicuronídio de bilirrubina.

Introdução

11

Existe, nesse ponto, uma diferença entre o metabolismo de adultos e de recém-

nascidos. Nos adultos, uma grande porção deste produto sofre redução pela flora

bacteriana formando urobilinogênios que são eliminados pelas fezes. Apenas

pequena parte sofre hidrólise pela β- glicuronidase. Já nos recém-nascidos, por

apresentarem deficiência da flora bacteriana normal e atividade da β-

glicuronidase aumentada, grande parte do produto é hidrolisado, transformando-se

novamente em bilirrubina indireta, e absorvido pela circulação entero-hepática.

(Heidrich, 1992)

A hiperbilirrubinemia ocorre devido a um desequilíbrio no balanço da

bilirrubina, onde mais bilirrubina é produzida e menos é excretada.O aumento da

produção normal diária de bilirrubina, a diminuição da reabsorção entero-

hepática, aliado a uma diminuição da conjugação da bilirrubina pelo fígado nos

RN, explica a chamada icterícia fisiológica, resultante da própria imaturidade do

organismo (Bhutani et al., 2004).

O objetivo principal do tratamento da icterícia é evitar a encefalopatia

bilirrubínica aguda e crônica ou “kernicterus”, termos utilizados para designar a

disfunção neurológica induzida pela bilirrubina (BIND). Esta patologia é causada

em grande parte pela passagem de bilirrubina indireta livre através da barreira

hematoencefálica e sua deposição no cérebro, causando danos irreversíveis às

células, podendo levar a distúrbios auditivos, visuais e cognitivos, retardo mental

e até à morte (Kaplan & Hammerman, 2005).

As icterícias hemolíticas ocorrem com maior freqüência depois da icterícia

fisiológica. Elas são agrupadas em três grandes categorias: imunes, que

Introdução

12

compreendem as incompatibilidades sangüíneas ABO e Rh; hereditárias, que

englobam deficiências de enzimas eritrocitárias, defeitos de membrana eritrocitária

e hemoglobinopatias e adquiridas, causadas por infecções e pelo uso de certos

medicamentos (Heidrich, 1992).

A deficiência de G6PD é a alteração enzimática mais comumente associada

à anemia hemolítica, principalmente por exposição do indivíduo deficiente a

agentes oxidantes.

Nas últimas duas décadas a deficiência de G6PD tem sido relacionada

entre os principais fatores que contribuem para as icterícias neonatais não

hemolíticas (Kaplan et al., 2001a,b). Apesar disso, muitos pediatras e

neonatologistas, ainda não associam esta deficiência como uma possível causa

de hiperbilirrubinemia neonatal grave. Estudos demonstraram que em somente

poucos casos de readmissão hospitalar por hiperbilirrubinemia, a determinação de

G6PD foi solicitada (Kaplan & Hammerman, 2000; Kaplan et al., 2001a,b).

Considerando a alta incidência e correlacionando com o número de nascimentos

por ano, constatou-se que um grande número de crianças possui um alto risco de

apresentar severa hiperbilirrubinemia neonatal grave (Kaplan & Hammerman,

2000)

Em áreas onde a deficiência de G6PD é endêmica, a triagem da bilirrubina

total no soro pode ser realizada como rotina, simplificando o papel do médico na

identificação do alto risco natural dessas crianças, principalmente quando for

necessário avaliar um neonato com icterícia inexplicada (Kaplan & Hammerman,

2004).

Introdução

13

Diversos estudos têm demonstrado que a deficiência de G6PD pode

predispor neonatos, nesses grupos de maior risco, a uma icterícia severa (Neto et

al., 1999; Krzelj et al., 2001). Casos de encefalopatia bilirrubínica podem ser

evitados, desde que seja identificada e tratada precocemente, tornando-se um

risco evitável. Nas últimas décadas, as modernas técnicas de prevenção e

tratamento da hiperbilirrubinemia, incluindo exsangüineo-transfusão, fototerapia e

o uso de imunoglobulinas intravenosas, praticamente eliminaram as chances de

ocorrências de “kernicterus”. Além disso, em função da hiperbilirrubinemia causar

danos irreversíveis, é de extrema importância a realização de todos os exames

disponíveis para detectar a possível causa (Kaplan & Hammerman, 2004).

Infelizmente, a magnitude do problema é desconhecida, uma vez que existem

poucos estudo prospectivos (Kaplan & Hammerman, 2000; Clague & Thomas,

2002).

Os primeiros estudos realizados na Grécia, no início dos anos 60,

demonstravam uma associação entre hiperbilirrubinemia e a mutação mais grave

(G6PD mediterrânea). No entanto, foram posteriormente relatados casos de

icterícia associados a forma menos grave de mutação a G6PD A-. Um estudo

associando hiperbilirrubinemia neonatal e deficiência de G6PD em populações de

maior risco torna-se necessário para avaliar o potencial de risco associado,

especialmente em relação ao uso de drogas contraindicadas na gestação.

Introdução

14

I.3.3 – Anemia Hemolítica não Esferocítica Crônica

Algumas variantes de G6PD são capazes de causar hemólise durante toda

a vida, mesmo na ausência de um fator desencadeante, embora a exposição a

agentes oxidantes possa intensificar um processo hemolítico estabelecido

(Luzzatto & Mehta, 1995). Essas variantes pertencentes à classe I tem sido

identificadas em afro-americanos e em caucasóides (Beutler, 1994). A icterícia e a

anemia geralmente começam a ser perceptíveis ainda no período neonatal, muitas

vezes havendo necessidade de transfusão sanguínea. Após a infância, os sinais e

sintomas do distúrbio hemolítico são sutis e inconstantes, mas podem ser

agravados pela interrupção temporária da eritropoese ocasionada por doença

febril ou pela exposição a fatores desencadeantes de hemólise.

I.4 – DISTRIBUIÇÃO GEOGRÁFICA DA DEFICIÊNCIA DA G6PD

Esta enzimopatia é o distúrbio metabólico mais comum das hemácias,

afetando cerca de 400 milhões de pessoas em todo o mundo. Freqüências

elevadas são observadas principalmente nas zonas tropicais e subtropicais do

hemisfério oriental (Luzzatto & Mehta, 1995): 1% a 3% no sul da Itália (Calabro et

al., 1993), 2% a 16% no sul da China e Taiwan (Chiu et al., 1993), 4,5% no Kwait

(Samilchuk et al., 1999), 3% a 25% na Sardenha, acima de 26% em algumas

regiões da África (Luzzatto & Battistuzzi, 1985), e até 70% em judeus (Beutler,

1994) (Figura 3).

Introdução

15

Figura 3. Distribuição mundial da deficiência da G6PD.

Cerca de 10% dos afro-brasileiros e 1,5% dos caucasóides do Rio Grande

do Sul são deficientes (Hutz et al., 1977; Weimer et al., 1981; Weimer et al., 1993).

Na região amazônica a freqüência dessa enzimopatia é de 6,1% (Hamel et al.,

2002).

I.4.1 – Distribuição das Principais Variantes da G6PD

Atualmente, já foram descritas mais de 140 mutações envolvendo os 12

éxons codificadores, e cerca de 400 enzimas variantes (Beutler & Vulliamy, 2002)

Fonte: Luzzatto & Mehta, 1995

<0,5% 7-9,9%

0,5-2,9% 10-14,9%

3-6,9% 15-26%

Introdução

16

Desde a descoberta da deficiência da G6PD (Carson et al., 1956),

observou-se que este distúrbio genético ocorria em diversas populações humanas

e que havia variação na sua expressão clínica, sugerindo uma possível

heterogeneidade bioquímica (Luzzatto & Mehta, 1995). Nos anos que se seguiram

um número considerável de variantes foi descrito. Em 1967 um grupo de pesquisa

da Organização Mundial de Saúde (OMS) padronizou os métodos de análise para

a caracterização das variantes. As variantes de G6PD diferem umas das outras

em relação à atividade da enzima, mobilidade eletroforética, Km (constante de

Michaelis) para seu substrato (G6P e NADP), uso de substratos análogos,

estabilidade ao calor e pH ótimo. Com base nesses critérios, cerca de 400

variantes da G6PD foram descritas, tendo a maioria atividade reduzida, sendo por

isso caracterizadas como variantes deficientes (Saha & Samuel, 1991). De acordo

com Luzzatto & Mehta (1995), as variantes da G6PD determinam diferentes graus

de alterações na atividade enzimática e podem ser agrupadas em cinco classes

com base na atividade residual:

Classe I – Variantes deficientes associadas à anemia hemolítica crônica não

esferocítica;

Classe II – Variantes com deficiência grave (menos que 10% de atividade);

Classe III – Variantes com deficiência moderada (10% a 60% de atividade);

Classe IV – Variantes com atividade normal ou ligeiramente diminuída (60% a

100%);

Classe V– Variantes com atividade enzimática aumentada.

Introdução

17

As variantes clinicamente importantes são as das classes II e III por serem

mais comuns que as da classe I. A maioria das variantes da classe I são de

ocorrência esporádica.

De todas as variantes das classes II e III, as que mostram maior

importância pela sua freqüência são (Tabela 2): a variante G6PD A-, que ocorre

comumente em descendentes africanos, bem como no Sul da Itália, Espanha,

Portugal e Península Arábica; a variante Mediterrânea, que é encontrada mais

usualmente em italianos (em especial, da Sardenha e da Sicília), em gregos,

judeus orientais, árabes e persas; a variante Cantão, freqüente no sul da China; a

variante Seattle, que atinge freqüências polimórficas na Sardenha, Grécia e sul da

Itália; e, finalmente, a variante Union, encontrada em chineses e no sul da Itália.

Tabela 2. Classificação das variantes de G6PD segundo Luzzatto & Mehta, 1995. CLASSE GRAU DE

DEFICIÊNCIA VARIANTES DESCRITAS

EXEMPLOS

I AHNEC 97 G6PD Andaloris,

Campinas e Sumaré

II Grave 112 G6PD Mediterrânea

e Union

III Moderada 103

G6PD A-, Cantão e

Seattle

IV Normal 52 G6PD A

V Aumentada 2 G6PD Verona

AHNEC= anemia hemolítica crônica não esferocítica.

Introdução

18

A forma G6PD B é a mais freqüente em humanos, seguida pelas formas

mutantes G6PD A, G6PD A- e G6PD mediterrânea (B-) (Calabro et al., 1993).

Todas as quatro formas podem ser distinguidas através da mobilidade

eletroforética e da sua atividade enzimática. Exceto as variantes B, A e A-, todas

as demais são designadas por nomes geográficos, em conseqüência do grande

número de variantes existentes com a mesma mobilidade eletroforética.

A G6PD A é encontrada em cerca de 20% dos homens afro-americanos.

Difere da variante normal por ser eletroforeticamente mais rápida, porém com

atividade enzimática semelhante à normal, não tendo repercussão clínica (Yoshida

et al. 1988).

A variante africana G6PD A- pode ser observada em cerca de 11% dos

indivíduos afro-americanos deficientes (Heller et al., 1979), e apresenta freqüência

elevada em algumas regiões da África (Welch et al.,1978). A G6PD A-, que é uma

das variantes mais freqüentes da classe III, possui a mesma mobilidade

eletroforética da G6PD A, porém é menos estável e possui de 20 a 60% de

atividade enzimática (Luzzatto & Mehta, 1995).

A variante Mediterrânea tem mobilidade eletroforética semelhante à normal,

porém é instável frente ao calor e tem apenas cerca de 7% da atividade normal. É

a variante mais bem estudada da classe II. Tem ampla distribuição na Europa e

Ásia e é conhecida pela sua alta freqüência nos países limítrofes do Mar

Mediterrâneo, como a Grécia (Luzzatto & Metha, 1995) e a Itália (Calabro et al.,

1993).

Introdução

19

I.4.2 – Variantes de G6PD no Brasil

Na fase que antecede a introdução de técnicas de biologia molecular no

Brasil, as variantes de G6PD mais freqüentemente encontradas foram a G6PD A,

A– e Mediterrânea. Os primeiros estudos da deficiência de G6PD em populações

brasileiras demonstraram prevalências que variaram de 2,5 a 11,4% (Barretto &

Jamra, 1967; Azevedo et al., 1978; Sena & Ramalho, 1985). Mais recentemente

com a utilização de técnicas de biologia molecular, comprovou-se a predominância

das variantes G6PD A, A- e Mediterrânea em nosso país (Saad et al, 1997a;

Weimer et al. 1993, ; Compri et al., 2000). A investigação molecular da deficiência

de G6PD no Brasil, tem contribuído para a identificação de novas mutações,

permitindo a descrição de novas variantes, como é o caso da G6PD Lages, São

Borja, Farroupilha, Anaheim, Campinas e Sumaré (Saad et al., 1997b; Weimer et

al., 1998).

O estudo da deficiência de G6PD, além do seu aspecto médico, é

importante marcador genético de etnias e populações. Desta forma, essa

enzimopatia fornece informações úteis para o estudo da composição genética das

populações brasileiras que foram incorporando ao longo de sua história, povos

das mais diferentes origens e com diversos graus de miscigenação.

I.5 - ASPECTOS GENÉTICOS

A G6PD inativa consiste de um monômero de 515 aminoácidos, com massa

molecular de 59.256 daltons. Os monômeros se agregam em dímeros ou

tetrâmeros para formar a enzima ativa, que contém NADP+ fortemente ligado

Introdução

20

(Cohen & Rosemeyer,1969). Nos eritrócitos humanos os dímeros são a forma

predominante (Miwa & Fujii, 1996).

O gene codificador da enzima G6PD está localizado no braço longo do

cromossomo X, na região Xq28, apresentando um padrão de herança “ligado ao X

recessivo” (Beutler, 1994). Segundo Chen et al. (1991), o gene da G6PD

apresenta cerca de 20 Kb de comprimento, dividido em 13 éxons e 12 introns. A

região não traduzida do mRNA corresponde ao éxon 1 e parte do éxon 2.

Conseqüentemente, apenas 12 éxons formam o mRNA e serão traduzidos para a

síntese da enzima (Martini et al.,1986).

Uma característica marcante do gene da G6PD é seu alto grau de

polimorfismo. A aplicação da biologia molecular no estudo das variantes tem

fornecido importantes dados, possibilitando o acesso a informações

imprescindíveis para a caracterização das variantes bioquimicamente conhecidas.

Após a clonagem e seqüenciamento do gene que codifica a G6PD (Martini et

al.,1986; Persico et al., 1986), muitas pesquisas foram e ainda continuam sendo

realizadas com o intuito de identificar as mutações responsáveis por tais variantes.

Entretanto, o número de mutações observadas até o momento não corresponde

ao número muito maior de variantes bioquímicas já descritas. Além disso,

diferentes defeitos genéticos foram observados em variantes bioquimicamente

homogêneas, como é o caso da variante A-, onde se conhece três grupos de

mutações distintas (Hirono & Beutler, 1988; Beutler et al., 1989). O oposto também

foi observado quando variantes bioquimicamente heterogêneas, apresentaram a

mesma mutação (G6PD Betica e G6PD Matera), idênticas à variante A- em termos

Introdução

21

de seqüência de DNA (Beutler et al., 1989). Uma hipótese para explicar estes

achados sugere que as propriedades bioquímicas da G6PD podem ser

condicionadas pela estrutura tridimensional da proteína, ou ainda, que fatores

extragênicos, geneticamente determinados ou modificações pós-traducionais,

possam alterar o comportamento da enzima e levar à deficiência da G6PD (Mehta

et al., 2000).

Beutler (1989) propôs uma classificação de variantes baseada nos defeitos

genéticos, porém para uma nova classificação ser aceita será necessário o

avanço da pesquisa na detecção de um número maior de variantes com base na

biologia molecular. A maioria das mutações identificadas são substituições

nucleotídicas que não modificam o quadro de leitura (Xu et al., 1995). Mutações

sem sentido e deleções são raras. As deleções, quando ocorrem não envolvem

mais do que oito aminoácidos. A baixa freqüência de deleções como causa de

deficiência da G6PD sugere que uma alteração estrutural drástica do gene seja

presumivelmente letal (Miwa & Fujii, 1996).

I.5.1– Polimorfismo de DNA no Gene da G6PD em Populações Humanas

De todas as variantes descritas, pelo menos 100 delas têm freqüências

polimórficas em várias populações (Vulliamy et al, 1988). Os estudos de

populações que abordam o polimorfismo genético da G6PD sugerem que o estado

de deficiência na África resulta do alelo G6PD*A- e que nos países mediterrâneos

resulta do alelo G6PD*Mediterrâneo (Kurdi-Haidar et al., 1990; Luzzatto & Metha,

1995). Nos asiáticos o alelo G6PD*Cantão é prevalente entre os chineses,

Introdução

22

enquanto que os alelos G6PD*Ube e G6PD*Konan são os mais comuns em

japoneses (Hirono et al., 1993).

A primeira variante a ser investigada utilizando métodos de biologia

molecular foi a G6PD A (alelo G6PD*A) (Takizawa & Yoshida, 1987). Este alelo

apresenta uma mutação de A→G no nucleotídeo 376 (éxon 5). Posteriormente,

Hirono & Beutler (1988) observaram a mesma mutação nt 376 no alelo G6PD* A-.

Contudo, verificou-se que uma segunda mutação, geralmente localizada no

nucleotídeo 202 G→A (éxon 4), é necessária para causar a deficiência. Outras

mutações nos nucleotídeos 680 G→T (éxon 7) e 968 T→C (éxon 9) também

podem ocorrer mais raramente em associação com a mutação 376 A→G (Beutler

et al.,1989), originando três grupos de mutações: 376G/202A, mais freqüente

(90%); 376G/680T e 376G/968C, mais raras (3% e 7%, respectivamente) (Beutler

& Kuhl, 1990a) (Figura 5).

O alelo G6PD*Mediterrâneo é decorrente de uma substituição C→T no

nucleotídeo 563 (éxon 6). Este alelo é um dos tipos polimórficos mais severos da

deficiência, sendo encontrado em uma ampla área geográfica, abrangendo muitos

grupos étnicos.

Introdução

23

Figura 4. Polimorfismos de restrição do gene da G6PD associados com atividade

deficiente da enzima.

O alelo G6PD*Cantão apresenta uma substituição de G→T no nucleotídeo

1376, estando presente em 1,7% da população do sul da China. Segundo Hirono

et al. (1993), os alelos G6PD*Konan e G6PD*Ube tem a mesma mutação de C→

T no nucleotídeo 241 (éxon 4).

Além dessas mutações, originalmente descritas em populações africanas,

européias e asiáticas, existem outros tipos de mutações que não alteram a

enzima, causando apenas polimorfismo no gene.

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13

5’ 3’

202 G A

Nla I

376 A G

Fok I

563 C T

MboIII

680 G T

BstN I

968 C T

Nci I

Fonte: Vulliamy et al., 1991.

Introdução

24

I.6 - A OCUPAÇÃO DA REGIÃO SUL DO BRASIL

No início do século XIX, grande parte das terras das regiões da Campanha,

do Litoral e da Depressão Central estava ocupada por estancieiros e açorianos.

Porém as regiões montanhosas do Planalto e da Serra Geral ainda estavam

despovoadas. A fim de garantir a posse dessas terras o governo imperial começou

a incentivar a vinda de imigrantes ao nosso estado. Os alemães provindos

principalmente de Holstein, Hamburgo, Mecklemburgo, Hannover, Hunsrück e do

Palatino foram os primeiros, tendo chegado a partir de 1824. Ocuparam terras das

regiões leste, norte e noroeste do nosso estado (Nogueira & Hutter, 1975) . Em

1875, imigrantes italianos provindos, quase de modo exclusivo do norte da Itália,

principalmente de Vêneto, Vicenza, Treviso, Verona e Beluno, se instalaram nas

regiões do Planalto (De Boni & Costa, 1984). Grupos de imigrantes poloneses,

judeus, sírios, libaneses e japoneses também contribuíram, mas em menor

número, no povoamento do Rio Grande do Sul (Pesavento, 1993).

Entre os anos de 1884 e 1944, o Brasil recebeu cerca de 1,5 milhões de

imigrantes Italianos. Até 1930 o Brasil também recebeu um grande número de

portugueses e espanhóis. Após 1930, somente os Portugueses, por não serem

considerados propriamente estrangeiros, continuaram migrando em quantidade

significativa para o Brasil. Outros povos, como árabes e judeus chegaram após

essa data, mas em colônias numericamente pequenas. A distribuição desses

indivíduos no território brasileiro não foi homogênea, visto que estes se

estabeleceram principalmente nos estados de São Paulo, Paraná e Rio Grande do

Sul (Compri et al., 2000), tendo um número reduzido chegado à região

Introdução

25

Amazônica. Os grupos étnicos que mais contribuíram para formação do Rio

Grande do Sul foram os índios, negros, portugueses, espanhóis, alemães,

italianos, poloneses, judeus, sírios, libaneses e japoneses (Pesavento, 1993).

Introdução

26

I.7- OBJETIVOS

Considerando-se a alta freqüência populacional da deficiência de G6PD, a

constituição da população do Rio Grande do Sul e tirando proveito dos inúmeros

trabalhos realizados na região sobre o tema, este trabalho foi desenhado com os

seguintes objetivos:

1- Estabelecer as condições ótimas de armazenamento de amostras de

sangue total e de amostras de sangue embebidas em papel filtro para

quantificação da atividade da G6PD por método enzimático colorimétrico.

2- Determinar a prevalência da deficiência total e parcial da G6PD em recém-

nascidos do estado do Rio Grande do Sul.

3- Determinar a freqüência das variantes G6PD A, A- e Mediterrânea através

do emprego de técnicas de biologia molecular para a detecção das

mutações 202, 376 e 563 em pacientes deficientes de G6PD.

4- Comparar os resultados aqui obtidos com os estudos prévios já realizados

no RS sobre o tema.

5- Determinar a acurácia do método de quantificação enzimático da G6PD,

utilizando a técnica de biologia molecular como padrão ouro.

Resultados

27

II. RESULTADOS

Os resultados estão apresentados a seguir na forma de artigos publicados

ou submetidos para publicação, em quatro capítulos distintos (cada capítulo

representado por um artigo completo).

Resultados

28

Capítulo 1

Evaluation of G6PD Stability in blood samples under different

collection and storage conditions.

Simone M Castro ; Raquel Weber; Vivian Dadalt; Vanessa F Santos;

George J. Reclos; Kenneth A. Pass; Roberto Giugliani

Publicado em “Clinical Chemistry, 2005 Jun;51(6):1080-1”

Resultados

29

Resultados

30

Resultados

31

Capítulo 2

PREVALENCE OF G6PD DEFICIENCY IN NEWBORNS IN THE SOUTH

OF BRAZIL

Simone Castro, Vivian Dadalt, Raquel Weber, Volnei Tavares,

Roberto Giugliani .

Artigo submetido ao Journal of Medical Screening em 23/01/06

Resultados

32

-------Mensagem original------- De: Jan Mackie Data: 01/26/06 06:18:20 Para: 'Simone Castro' Assunto: RE: Journal of Medical Screening - Manuscript 06008

Dear Dr Castro Manuscript 06008 Thank you for sending us your manuscript entitled "Prevalence of G6PD deficiency in newborns in South of Brazil" which is being considered for publication. We shall contact you again when the paper has been considered. Yours sincerely Janette Mackie Editorial Assistant J Med Screen

-------Mensagem original------- De: Jan Mackie Data: 02/17/06 11:37:55 Para: 'Simone Castro' Assunto: Journal of Medical Screening - Manuscript 06008 Dear Dr Castro Manuscript 06008 Thank you for sending us this manuscript, which we have considered carefully with expert assistance. If you were able to deal with the referee's query below, we would be pleased to accept the paper for publication. I think this point will only require you to add one or two sentences. If you could then send us (i) your revised manuscript, and (ii) a note of how the referee's comment has been addressed we will check again with the reviewer to see that the changes are satisfactory. FROM THE REFEREE I do not know what type of climate the south of Brazil enjoys. Since G6PD prevalence is higher in areas where malaria is prevalent, it is not clear to me whether the authors are totally ignoring the possibility of selection advantage in the high prevalence they found as they only discussed the issue of the origins of the population. Is/was malaria ever common in this region? Also it is not clear (perhaps I missed it) in what century the founders of the immigrant Brazilian population arrived. This connects to the previous question of selection advantage; if we are talking only a couple of generations, then there would have been no time for selection to express itself and the prevalence would only reflect the gene pool of the ancestors. END OF COMMENT We will also need the positions (eg: professor of epidemiology; consultant haematologist; laboratory manager etc) for each of the authors, to appear on the cover page of the manuscript please. Please contact me if there are any problems with this. Yours sincerely Janette Mackie Editorial Assistant JMS London

Resultados

33

Short Report:

PREVALENCE OF G6PD DEFICIENCY IN NEWBORNS IN THE SOUTH

OF BRAZIL

Simone Castro1, Vivian Dadalt1, Raquel Weber1, Volnei Tavares2,

Roberto Giugliani 3.

1- School of Pharmacy, UFRGS, Av. Ipiranga, 2752, Porto Alegre, RS, Brazil;

2- School of Medicine, UFRGS - Rua Ramiro Barcelos, 2400, Porto Alegre, RS, Brazil;

3- Medical Genetics Service, HCPA, UFRGS - Rua Ramiro Barcelos, 2350, Porto Alegre,

RS, Brazil

Contact address:

Simone Martins de Castro

Faculdade de Farmácia – UFRGS

Av. Ipiranga, 2752, Porto Alegre, RS, Brazil, 90610-000

FAX NUMBER : (+55) 51 33165434

E-mail address : scastro@adufrgs.ufrgs.br

Keywords: G6PD deficiency, haemolytic anaemia, newborn screening.

Short Title: G6PD DEFICIENCY IN SOUTH BRAZIL

Resultados

34

Abstract

G6PD deficiency is an X-linked disorder which is associated with intake of

drugs or foods (like fava) which causes haemolytic crises and neonatal jaundice in

most cases. The aim of this study was to determine the prevalence of G6PD

deficiency in Rio Grande do Sul (RS), the Southermost state of Brazil. We tested

2,799 blood samples obtained from newborns. A commercial kit was used for the

quantitative measurement of G6PD activity. From the 2,799 samples, 39 (1.4%)

exhibited total deficiency, 181 (6.5%) intermediate deficiency, and 2,582 (92.2%)

were normal. We found no correlation of G6PD deficiency with ethnic origin, but a

high prevalence of patients with partial deficiency could be associated with the type

of colonization of RS. In conclusion the combined prevalence for both types of

deficiency (complete and partial) was 7.9% among the newborn population. This

finding is important as both types of deficiency must receive same kind of

preventive care .

Introduction

Glucose-6-phosphate dehydrogenase (G6PD; EC 1.1.1.49) deficiency is a

genetic disorder which is associated with drug or fava bean - induced haemolytic

crises and neonatal jaundice in most cases. It is one of the most common

enzymopathies throughout the world. The disorder occurs most frequently in

individuals of Meditarrenean, African and Asian origin with an incidence as high as

25% in some populations.1 Inheritance of G6PD shows a characteristic X-linked

Resultados

35

pattern. In heterozygote females, the residual enzyme activity is 20-60 % of that

found in normal individuals. This is called “partial deficiency” and these cases are

also susceptible to severe haemolytic episodes, under unfavorable circunstances.

Data available in the literature is discrepant regarding the actual prevalence

of G6PD deficiency in different regions of Brazil, suggesting values close to 7%.2,3

The aim of this study was to determine the prevalence of G6PD deficiency in RS,

the Southermost State of Brazil using more sensitive and specific tests than those

used in earlier studies.2,3

Materials and Methods

Blood specimens spotted on SS903 filter paper from newborns referred to

the Neonatal Screening Reference Laboratory of RS, at the School of Pharmacy,

UFRGS, were collected between January and November 2003. Samples were

stored at 4oC until analysis. Enzyme activity was measured within 3 days post

collection.

G6PD Deficiency Neonatal Screening Test Kit (Interscientific Corporation,

Cat. No. 3570-050) was used for the quantitative measurement of G6PD activity

as previously described.4

Briefly, a blood spot paper disk (3mm of diameter) was placed in a 96 well

microplate. Elution buffer was added for the lysis of red blood cells. Fifteen μL of

eluate were transferred to a new microplate and 75 μL of the working reagent was

added. After ten minutes, the whole microplate was measured once at 405 nm to

evaluate the haemoglobin (Hb) content of each sample. Then, a color reagent was

Resultados

36

added and the plate was read at 570nm in kinetic mode (ΔOD/min), to measure the

NADPH produced per minute. The samples were normalised for their Hb content

and then compared to the reference samples (supplied by Interscientific) with three

levels of G6PD activity: Normal=15.8 U/gHb, Intermediate=4.7 U/gHb and

Deficient= 1.3 U/gHb (at 37°C). Statistical analysis was performed using SPSS v

11.0, using Student’s T-test with statistical significance stated as P<0,05.

Results

Two thousand seven hundred ninety-nine newborns participated in this

study. The distribution of values of G6PD according to gender and ethnic origin is

shown in Table 1. Of the 2,799 samples, 39 (1.4%) showed total deficiency, 178

(6.4%) intermediate deficiency, and 2,582 (92.2%) were normal.

Discussion

Although previous reports have shown that the prevalence of G6PD

deficiency, in several regions of Brazil, is around 10% among males of African

origin and between 1 and 6% on euro-descendent males, the present study reveals

a combined prevalence of 7,9% for the two forms of G6PD deficiency (complete

and partial) in RS, South of Brazil, with a higher prevalence of partially deficient

patients. This is a sub-tropical region, non-endemic for malaria, so our results

would only reflect the gene pool of the ancestors.

Resultados

37

Early 19th century, the most important groups that contributed to the

colonization of RS were Indians, Afro-descendents, Portuguese, Spanish,

Germans and Italians, followed for Polishes, Jews, Syrians, Lebanese and

Japanese.5 The high proportion of partial deficiency of G6PD on this study

suggests the predominance of variant A-, which is characteristic of people with

African origin,6 but also frequent in populations from Southern Italy, Spain, Portugal

and Arabic Peninsula.1 Despite RS received immigration waves of Mediterranean

people in the past, the proportion of complete G6PD deficiency was lower than the

proportion of partially deficient found in the study. These findings can be explained

by the fact that the waves of Italian immigrants that arrived in RS came,

predominantly, from the North of Italy, where the frequency of G6PD deficiency is

significantly lower, in comparision to observed in the Southern part of Italy,

Sardinia and Sicily.7 We should point out that the ethnic classification in this study

was established by data collectors, so the lack of correlation among G6PD

deficiency and ethnic origin may be due to the fact that the skin color is not a true

indicator of ethnic origin in Brazil.8

Moreover, these findings are of great practical significance, because the

prevalence of G6PD deficiency in females has been infrequently studied and for

many years, G6PD deficient heterozygotes were not regarded as being at risk. It

has been shown that heterozygotes can develop severe neonatal

hyperbilirubinemia, being at risk as hemizygous males.9,10 Despite being an X-

linked disorder, G6PD deficiency is not uncommon among women. Because X-

inactivation may be non random, there may be varying phenotypes, and the red

Resultados

38

blood cells of heterozygous may exhibit normal, intermediate or grossly deficient

G6PD activity.11 The method used to diagnose the G6PD deficient individuals is

important because a qualitative enzyme measurement is likely to pick up

hemizigotes, heterozygotes and even individuals with less severe enzyme

deficiency.9 The quantitative measurement of enzymatic activity used in this study

can give a satisfactory guide for the severity of G6PD deficiency in heterozygous

females.

In conclusion, this study demonstrated that the prevalence of G6PD

deficiency was 7.9% among RS newborn population and it is important to consider

that both types of deficiency should receive some kind of preventive care.

Financial support:: Empresa Intercientífica - SP and FIPE- HCPA,RS.

References

1. Luzzato L, Mehta A . Glucose-6-phosphate dehydrogenase deficiency. In:

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Resultados

39

4. Reclos GJ, Hatzidakis CJ, Schulpis KH. Glucose-6-phosphate dehydrogenase

deficiency neonatal screening: preliminary evidence that a high percentage of

partially deficient female neonate are missed during routine screening. J Med

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Resultados

40

Table 1 – Distribution of G6PD activity values in newborns according to

gender and ethnic origin for the two major ethnic groups found in RS.

G6PD activity Gender Ethnic Origin

Male (%) Female (%) P Caucasians (%) Afro (%) P

Deficient (<2.0 U/g Hb) 25( 1.7%) 12 (0.9%) 0.101 25 (1.1%) 5 (3%) 0.089

Partially Deficient (2.0 – 6.0 U/g Hb) 99 (6.9%) 82 (6.1%) 146 (6.5%) 13 (7.7%)

Normal (>6.1 U/g Hb) 1309 (91.3%) 1245 (93%) 2,080 (92.4%) 151 (89.3%)

Total 1,433 (100%) 1,339 (100%) 2,251(100%) 169 (100%)

* Samples colected between January and November, 2003, referred to the

Neonatal Screening Program Reference Laboratory of RS.

Resultados

41

Capítulo 3

Molecular Characterization of Glucose-6-Phosphate Dehydrogenase

Deficiency in Patients from Porto Alegre – RS

Simone M. de Castro, Raquel Weber, Ursula Matte and Roberto Giugliani 3

Artigo submetido ao Genetics and Molecular Biology em 24/01/06

Resultados

42

-------Mensagem original------- De: EDITOR/GMB Data: 02/03/06 09:21:11 Para: scastro@orion.ufrgs.br Assunto: MS2006/015- Genetics and Molecular Biology Subject: MS2006/015 Molecular Characterization of Glucose-6-Phosphate Dehydrogenase Deficiency in Patients from Porto Alegre - RS Dear Dr. Castro, We acknowledge receipt of the abovementioned manuscript, to which has been assigned the following number: MS2006/015. Please refer to the manuscript number whenever you contact us. We thank you for submitting your paper to Genetics and Molecular Biology. Yours sincerely, Angela M. Vianna-Morgante Editora Genetics and Molecular Biology editor@gmb.org.br .

Resultados

43

Molecular Characterization of Glucose-6-Phosphate Dehydrogenase

Deficiency in Patients from Porto Alegre – RS

Simone M. de Castro1, Raquel Weber1, Ursula Matte2 and

Roberto Giugliani 3

1- School of Pharmacy, UFRGS, Av. Ipiranga, 2752, Porto Alegre, RS, Brazil;

2- Center of Gene Terapy, HCPA, UFRGS, Rua Ramiro Barcelos, 2350, Porto Alegre, RS, Brazil;

3- Medical Genetics Service, HCPA, UFRGS, Rua Ramiro Barcelos, 2350, Porto Alegre, RS, Brazil

Contact address:

Simone Martins de Castro

Faculdade de Farmácia – UFRGS

Av. Ipiranga, 2752, Porto Alegre, RS, Brazil, 90610-000

FAX NUMBER : (+55) 51 33165434

E-mail address : scastro@adufrgs.ufrgs.br

Keywords: G6PD deficiency, Haemolytic anaemia, Pentose pathway.

Short Title: MOLECULAR STUDIES OF G6PD IN SOUTH BRAZIL

Resultados

44

Abstract

G6PD deficiency is one of the most common human enzymopathies

throughout the world. Although most affected individuals are asymptomatic, there

is a risk of neonatal jaundice and acute haemolytic anaemia, triggered by infection

and the ingestion of certain drugs and fava beans. In this study, we have

characterized the molecular basis of G6PD deficiency in a sample from Porto

Alegre, Southern Brazil. Genomic DNA was extracted from peripheral blood

leukocytes. We studied the three mutations that appear to be the most frequent in

Southern Brazil: the A- (G202A and A376G) and the Mediterranean (C563T) G6PD

variants. From July 2004 to October 2005, 348 individuals from Porto Alegre were

referred to our laboratory for G6PD analysis, and 36 of them (9.7%) showed

defcient activity of the enzyme. These individuals, as well as 34 randomly selected

non-deficient individuals were submitted to molecular analysis. Mutation screening

revealed an allele frequency of 74.5% (38/51) for G6PD A- among deficient

individuals. The prevalence of this variant is in agreement to its distribution among

the ethnic groups that colonized Rio Grande do Sul, specially Africans,

Portuguese, Spaniards, and Italians.

Introduction

Glucose 6-phosphate dehydrogenase (G6PD; EC 1.1.1.49) is expressed in

all tissues, where it catalyses the first step in the pentose phosphate pathway

(PPP). The NADPH produced by the action of G6PD serves as an electron donor

Resultados

45

in reductive biosynthesis. Since red blood cells lack mitochondria, the PPP is their

only source of NADPH and crucial for their protection from oxidative stress (Mehta

et al., 2000).

G6PD deficiency is one of the most common human enzymopathies

throughout the world. Although most affected individuals are asymptomatic, there

is a risk of neonatal jaundice and acute haemolytic anaemia, triggered by infection

and the ingestion of certain drugs and fava beans (favism) (Beutler, 1994). The

disorder occurs most frequently in individuals of Meditarrenean, African and Asian

origin with an incidence as high as 20% in some populations. Previous reports

have shown that the prevalence of G6PD deficiency, in several regions of Brazil, is

around 10% among males of African origin and between 1 and 6% on euro-

descendent males (Azevedo and Azevedo, 1974; Garlip and Ramalho, 1988;

Weimer et al., 1993; Saad et al., 1997; Weimer et al., 1998). Inheritance of G6PD

shows a characteristic X-linked pattern and the gene has been mapped to Xq28.

Males are more prone to developing symptoms of this disorder. The gene

comprises of 13 exons, spanning nearly 20 kb, enconding 515 amino acids and

possesses a GC-rich promoter typical of many housekeeping genes (Beutler,

1994; Mehta et al.,2000).

To date, more than 140 different molecular abnormalities and 400

biochemical variants have been described in G6PD-deficient subjects, with a

considerable variation in the defects among various racial groups (Luzzato and

Mehta, 1995; Beutler and Vulliamy, 2002, Human Genetics Database). The vast

majority of affected individuals are asymptomatic. Almost all mutations of G6PD

Resultados

46

affect the coding sequence of the gene. The vast majority are single base

substitutions leading to amino acid change. A few of these occur as a second

mutation, most frequently in combination with the polymorphic mutation that

distinguishes the non-deficient variant G6PD A from the wild-type enzyme G6PD

B. The only deletions seen in the coding sequence are small and in-frame. The

absence of large deletions or frameshift mutations suggests that a total lack of

G6PD is incompatible with life (Mehta et al., 2000).

Estimates of the frequency of G6PD deficiency among males and females in

RS range from 3% to 8% (Weimer et al., 1981; Neto et al., 1999). Several G6PD-

deficient variants have been reported among patients from south of Brazil (Hutz et

al., 1977; Weimer et al., 1993; Saad et al., 1997; Weimer et al., 1998; Compri et

al., 2000). The most common of these variants is G6PD A- (Saad et al., 1997;

Compri et al., 2000). This mutation results in a residual enzymatic activity between

85% and 95% as compared to normal donors (Kay et al., 1992).

In this study, we have characterized the molecular basis of G6PD deficiency

in a sample from Porto Alegre, Brazil.

Materials and Methods

Subjects recruitment

Blood samples were collected from patients under investigation for G6PD

deficiency from Porto Alegre, Southern Brazil. These patients came to our attention

because of reported crises of acute haemolytic anaemia, a family history of G6PD

deficiency or occasional findings of reduced enzyme activity. Informed consent

Resultados

47

form was signed by all subjects investigated. Blood samples were taken in EDTA

tubes, transported at 40C, and stored at that temperature for no more than 3 days

before enzyme assay and DNA extraction for molecular analysis.

Detection of enzyme activity

The Interscientific Neolisa G-6-PD Kit (Interscientific Corporation, 2700

North 29th Avenue – Suite 220, Hollywood, FL- USA Cat. Nr 3570-050) was used

for the quantitative measurement of G-6-PD activity as previously described

(Reclos et al., 2000).

The assay was performed as follows: A dried blood spot paper disk with a

diameter of 3/16” was placed in each well of a round bottomed 96 well microplate.

Seventy five microliters of elution buffer were added per well for the lysis of red

blood cells. Upon completion of the elution stage, 15 μL of eluant was transferred

to a new round bottomed microplate and 75 μL of the work reagent was added.

Ten minutes after addition of the reagents, the whole microplate was measured

once at 405 nm to evaluate the haemoglobin (Hb) content of each sample. After

adition of color reagent, the plate was read with a 570nm optical filter in kinetic

mode (ΔOD / min), for measurement of the NADPH produced. After termination of

the kinetic the samples were normalised for their Hb content and then compared to

the controls. The Controls used were Interscientific G-6-PD Controls which were

supplied in three levels of G-6-PD activity (Normal=15.8 U/gHb, Intermediate=4.7

U/gHb and Deficient= 1.3 U/gHb). The whole procedure was very easily automated

using an Excel macro which immediately transformed the readings to U/g Hb.

Resultados

48

Molecular Analysis

Genomic DNA was extracted from peripheral blood leukocytes as previously

described (Miller et al., 1988). We studied the three mutations that appear to be the

most frequent in Southern Brazilian region: the A- (G202A, A376G) and the

Mediterranean (C563T) G6PD variants. The coding region of the G6PD gene

encompassing Mediterranean and A- mutations were analyzed by polymerase

chain reation (PCR) using primer sets to amplify exons 6, 4 and 5 (Table 1). PCR

was performed in a final volume of 25 µL using 100 ng of genomic DNA, 1x 500mM

KCl buffer (pH8.4), 5mM MgCl2, 2mM of dNTPset, 20pmol of each primer and 1 U

Taq DNA polymerase – all reagents were purchased from Invitrogen. For all PCRs,

10% DMSO (Merck) was added to increase specificity. The PCR amplification

consisted of DNA denaturation at 940C for 5 min followed by 34 cycles of

amplification in a termocycler (Eppendorf Personal Cycler). Each cycle consisted of

a denaturation step at 950C for 30s, an annealing step at varying temperatures

(see table 1) for 30s and an elongation step at 720C for 45s. The final elongation

step was extended for another 10 min. A sample containing only the PCR mixture

was used as negative control. Finally, 10 µL of the PCR produtct were analyzed in

1.5% agarose gel electrophoresis. Ten microliters of the amplified fragments were

digested overnight at 37oC using the appropriate endonuclease (BioLabs) The

digestion products were tested on a 1.5 % agarose or 12% poliacrilamide gel

containing ethidium bromide. Digestion patterns of normal and mutant samples are

summarized inTable 2.

Resultados

49

Results

From July 2004 to October 2005, 348 individuals from Porto Alegre were

referred to our laboratory for G6PD analysis. Out of these, enzyme assay detected

36 (9.7%) individuals with a deficiency for the enzyme. These individuals, as well

as 34 randomly selected non-deficient individuals were submitted to molecular

analysis.

Mutation screening in these 70 subjects revealed a high proportion of

individuals positive for G6PD A- variant, showing an allele frequency of 74.5%

(38/51) among deficient individuals. However, only four female individuals were

homozygous for G6PD A- (Table 3). None of the non-deficient subjects was

positive for any of the mutations investigated.

Discussion

Other studies have characterized the relatively high variability of G6PD

among Brazilian populations. As expected, these studies reported the same alleles

commonly found in European and African descent populations (G6PD B, G6PD A,

G6PD A- and G6PD Med) (Saad et al., 1997; Weimer et al., 1998; Compri et al.,

2000). Several biochemical variants have been described in South of Brazil, some

of which have been characterized at the molecular level (Weimer et al., 1998;

Weimer et al., 1993, Hutz et al., 1977). However, regarding G6PD, the State of Rio

Grande do Sul is mainly triallelic, showing a predominance of the wild type enzyme

(G6PD B), followed by the African-origin alleles, G6PD A and G6PD A-.

Resultados

50

Using molecular and biochemical techniques, we could characterize G6PD

deficiency in a sample from Porto Alegre as being mainly due to the G202A or

A376G mutations, representing allele G6PD A-. Although we have screened a

small number of cases, our results are in accordance to published data (Saad et

al., 1997; Weimer et al., 1998; Compri et al., 2000), showing the homogeneous

distribution of the G6PD A- mutation in Brazil.

Weimer et al (1993) and Luzzato and Mehta (1995) suggest that G6PD A-

variant is not restricted to African descents but it is frequent in populations from

Southern Italy, Spain, Portugal and the Arabic Peninsula. Therefore, the

prevalence of this variant is in agreement to its distribution among the ethnic

groups that colonized Rio Grande do Sul, specially Africans, Portuguese,

Spaniards, and Italians (Pesavento, 1993).

The Mediterranean variant has also been reported in samples from Rio

Grande do Sul (Weimer et al., 1998). Nevertheless, in our study there was no

individual with the mutation C563T. It is important to notice the Italian immigrants

coming to Rio Grande do Sul were almost exclusively from Pó Valley and other

regions from Northern Italy, as Vêneto, Vicenza, Treviso, Verona and Beluno (De

Boni and Costa, 1984), where G6PD deficiency is significantly less frequent than in

Southern Italy.

In our study, two deficient individuals were negative for the mutations

screened. It is possible that they bear other mutations not screened for or even not

yet characterized. Several rare variants have been described in RS, such as G6PD

S. Borja, Anaheim, Guaíba, Minas Gerais, Porto Alegre, Seattle and Farroupilha.

Resultados

51

For many of them the molecular defect has not been described but their

electrophoretic and biochemical characteristics place them apart (Hutz et al. ,1977;

Weimer et al., 1998).

As more than 140 variants have been described (Beutler and Vulliamy,

2002), a complete analysis of all mutations would be expensive. Therefore,

screening of common mutations would be more effective, as shown by the fact that

94.4% of deficient patients were genotyped in this study analyzing G6PD A- and

G6PD Med variants.

The knowledge of local mutation frequency is also important for analysis of

females. Prevalence of G-6-PD deficiency in females has been infrequently studied

(Reclos et al., 2003). Enzyme assay may not always give a definitive answer,

regarding carrier status in females (Beutler, 2001). Molecular analysis, although

not suitable for mass screening, is an accurate method to inform about a female’s

status (Mehta et al., 2000; Lin et al., 2005). In this study, 66.7% (10/15) females

were found to be carriers. Even though molecular analysis is not sufficient to

access real risk of carriership in women, it is helpful for genetic counseling and a

better management of disease symptoms.

Acknowledgments

This work was supported by Empresa Intercientífica, SP and FIPE- HCPA,

RS.

Resultados

52

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Resultados

55

Table 1 - Primer sequences used to amplify exons 4, 5 and 6 of the G6PD Gene

Primer Sequence Annealing Temperature Reference

202 forward 5’ GTG GCT GTT CCG GGA TGG CCT TCT G 3’ 61°C Bouanga et al.,1998 202 reverse 5’ CTT GAA GAA GGG CTC ACT CTG TTT G 3’

376 forward 5’ CTG TCT GTG TGT CTG TCT GTC C 3’ 63.5°C Vulliamy et al., 1991 376 reverse 5’ GGC CAG CCT GGC AGG CGG GAA GG 3’ Cittadella et al., 1997

563 forward 5’ ACT CCC CGA AGA GGG GTT CAA GG 3’ 61°C Vulliamy et al., 1991 563 reverse 5’ CCA GCC TCC CAG GAG AGA GGA AG 3’ Cittadella et al., 1997

Resultados

56

Table 2. Restriction Enzyme Analysis for G6PD Mediterranean and A-

Mutations

Fragment Size (Base Pairs) G6PD Variant Mutation Amplified Exons Enzyme

Uncut (Normal) Cut (Mutant)

Mediterranean 563 C→T 6 MboII 543 277-119-100-26-25

A - 202 G→A 4 NlaIII 109 63-46 376 A→G 5 FokI 295 154-141

Resultados

57

Table 3. Gene and genotypic frequencies of G6PD in 70 subjects from Porto Alegre, RS, Brazil.

Mutation Deficient Non deficient Male Female Male Female

563 C→T 0 0 0 0

202 G→A 20 14 0 0

376 A→G 20 14 0 0

Negative 1 1 15 19

Total 21 15 15 19

Resultados

58

Capítulo 4

G6PD: Discrepancies between genotype and phenotype

Simone Castro, Raquel Weber, Úrsula Matte, Kenneth Pass, Tijen Tanyalcin,

George Reclos, Roberto Giugliani.

Artigo em fase final de preparação para ser submetido ao Clinical Chemistry

Resultados

59

Journal category: Hematology

Runing title:

G6PD: Discrepancies between genotype and phenotype

Simone M. de Castro1, Raquel Weber1, Ursula Matte2 , George J. Reclos 3 ,

Kenneth A. Pass4, Tijen Tanyalcin5, Roberto Giugliani 6

1- School of Pharmacy, UFRGS, Av. Ipiranga, 2752, Porto Alegre, RS, Brazil;

2- Center for Gene Therapy, HCPA, UFRGS, Rua Ramiro Barcelos, 2350, Porto Alegre,

RS, Brazil; 3- R&D DIAGNOSTICS Ltd, 41 El.Venizelou Street, 15561 Holargos, Greece

4- New York State Department of Health, Wadsworth Center, Albany, New York.

5-

6 Medical Genetics Service, HCPA, UFRGS, Rua Ramiro Barcelos, 2350, Porto Alegre,

RS, Brazil

Mailing address:

Simone Martins de Castro

Faculdade de Farmácia – UFRGS

Av. Ipiranga, 2752, Porto Alegre, RS, Brazil, 90610-000

FAX NUMBER : (+55) 51 33165434

E-mail address : scastro@adufrgs.ufrgs.br

Resultados

60

Abstract

Glucose 6-phosphate dehydrogenase (G6PD; EC 1.1.1.49) deficiency is an

X-linked disorder which is associated with drug induced, fava caused haemolytic

crises and neonatal jaundice. It is one of the most common enzymopathies

throughout the world. Diagnosis of the G6PD genotype in female subjects and

individuals with some variants is particularly problematic. There is a need for a

simple, sensitive and reliable test for G6PD deficiency for clinical laboratories to

predict more accurately the risk of a patient developing a hemolytic crisis.

Objective: We used molecular DNA analysis for the accurate classification of

G6PD genotype in correlation with a quantitative assay of the enzyme, in whole

blood samples. Results: From July 2004 to October 2005, 348 individuals were

sent for G6PD analysis. Enzyme assay detected 29 (8.3%) of these individuals

with a deficiency for the enzyme (<7.7 UgHb). Additionally, 17 individuals with

G6PD activity between 7.7 and 12.0 U/gHb were also selected for molecular

analysis, as well as 27 randomly selected non-deficient subjects. In this sample of

73 individuals, 34 were female and 39 were male. A total of 35 specimens were

found to be abnormal by the DNA assay, of which 21 were male hemizygous for

the G202A;A376G, 4 were female homozygous and 10 females were identified as

carriers for the same double mutations. One subject showed the Mediterranean

variant (C563T). In our study, two deficient individuals were negative for the

mutations screened and none of the non-deficient subjects was positive for any of

the mutations investigated. It can be concluded that Intercientífica kit is an accurate

method for detecting G6PD deficiency, giving a satisfactory guide for the severity

of G6PD deficiency in heterozygous females and even in individuals with mutations

causing less severe enzyme deficiency.

Resultados

61

Introduction

Glucose 6-phosphate dehydrogenase (G6PD; EC 1.1.1.49) deficiency is an

X-linked disorder which is associated with drug or fava bean – induced haemolytic

crises and neonatal jaundice. It is one of the most common enzymopathies

throughout the world. The disorder occurs most frequently in individuals of

Meditarrenean, African and Asian origin with an incidence as high as 20% in some

populations (1).

Although several variants of G6PD have been described in Southern of

Brazil, some of which have been characterized at the molecular level (2,3,4), there

is a homogeneous predominance of G6PD A- variant in the Brazilian population

(5). The red blood cells of individuals with this mutation show a residual enzymatic

activity between 5% and 15% as compared with normal individuals (6).

Inheritance of G-6-PD shows a characteristic X-linked pattern. However,

since X-inactivation may be nonrandom, or one of the two clones may be selected

preferentially, there may be varying phenotypes, and the RBCs of heterozygotes

may exhibit normal, intermediate, or grossly deficient G6PD activity.

Because of this apparent discrepancy between phenotype and genotype,

diagnosis of the G6PD genotype in female subjects and individuals with some

variants is particularly problematic. There is a need for a simple, sensitive and

reliable test for G6PD deficiency for clinical laboratories to predict more accurately

the risk of a patient. Only when we can predict more accurately the natural course

for a patient can we make a valid risk-benefit and cost–benefit assessments for

Resultados

62

therapeutic options (7). In addition to the quantitative enzyme assay, that

measures the formation of NADPH, there are several screening tests (8). Here we

used molecular DNA analysis for the accurate classification of G6PD genotype in

correlation with a quantitative assay of the enzyme, in whole blood samples. The

accuracy of a quantitative G6PD kit employing hemoglobin normalization was

evaluated, considering DNA analysis as a gold standard.

2. Materials and Methods

2.1. Subjects recruitment

Blood samples were collected from patients under investigation for G6PD

deficiency from Porto Alegre, Southern part of Brazil. The study was conducted

between July 2004 and October 2005. Patients came to our attention because of

they reported crises of acute hemolytic anemia, a family history of G6PD deficiency

or diagnose reduced enzyme activity. Informed consent form was signed by all

subjects in this study. Data about enzyme activity and molecular analysis were

obtained from subjects. The whole blood samples were taken in EDTA tubes,

transported at 40C, and stored at this temperature for no more than 3 days before

enzyme assay and DNA extraction for molecular analysis.

Resultados

63

2.2. Detection of enzyme activity

The Interscientific Neolisa G-6-PD (Interscientific Corporation, 2700 North

29th Avenue – Suite 220, Hollywood, FL- USA Cat. Nr 3570-050) (OSMMR2000-D

kit R&D Diagnostics) was used for the quantitative measurement of G-6-PD activity

as previously described (9). The assay was performed as follows: A blood spot

paper disk with a diameter of 3/16” was placed in each well of a round bottomed 96

well microplate. Seventy five microliters of elution buffer were added per well for

the lysis of red blood cells. Upon completion of the elution stage, 15 μL of eluant

were transferred to a new round bottomed microplate and 75 μL of the work

reagent was added. Ten minutes after addition of the reagents, the whole

microplate was measured once at 405 nm to evaluate the haemoglobin (Hb)

content of each sample. After addition of color reagent, the plate was read with a

570nm optical filter in kinetic mode (ΔOD / min), for measurement of the NADPH

produced. After termination of the kinetic the samples were normalised for their Hb

content and then compared to the controls. The controls used were supplied by

Interscientific, in three levels of G-6-PD activity (Normal=15.8 U/gHb,

Intermediate=4.7 U/gHb and Deficient= 1.3 U/gHb).

Determination of average G6PD activity for our population.

The cut-off values for G6PD deficiency and the normal references values

were previously obtained from a normal group of individuals representing the

population living in the Porto Alegre area. The determination of the average activity

of G6PD in normal individuals was performed after the exclusion of all samples

Resultados

64

showing an enzymatic activity below 60%. This was done before taking into

account the value of the standard deviation of the distribution as measure of

scatter around the mean, as it is performed conventionally (ref estates). Samples

with an activity between 20% and 60% of the mean were classified as having

intermediate activity. Values lower than 20% are accepted as deficient samples.

The cut-off points for our population were set bellow 2.6 U/gHb and between 2.7

and 7.7 U/gHb for deficient and partially deficient respectively.

2.3. Mutation detection

Genomic DNA was extracted from peripheral blood leukocytes as previously

described (10). We studied the three mutations: the A- (202 G→A, 376 A→G) and

the Mediterranean (563 C→T) G6PD variants. The coding region of the G6PD

gene encompassing Mediterranean and A- mutations were analyzed by

polymerase chain reaction (PCR) using primer sets to amplify exons 6, 4 and 5

(Table 1). PCR was performed within a final volume of 25 µL using 100 ng of

genomic DNA, 1x 500mM KCl buffer (pH8.4), 1.5mM MgCl2, 2mM of dNTPset,

20pmol of each primer and 1 U Taq DNA polymerase – all reagents were

purchased from Invitrogen. For all PCRs, 10% DMSO (Merck) was added to

increase specificity. The PCR amplification consisted of DNA denaturation at 940C

for 5 min followed by 34 cycles of amplification in a termocycler (Eppendorf

Personal Cycler). Each cycle consisted of a denaturation step at 950C for 30s, an

annealing step at varying temperatures (see table 1) for 30s and an elongation

step at 720C for 45s. The final elongation step was extended for another 10 min. A

Resultados

65

sample containing only the PCR mixture was used as negative control. Finally, 10

µL of the PCR product was analyzed in a 1.5% agarose gel electrophoresis. Ten

microliters of the amplified fragments were digested overnight at 37oC using the

appropriate endonuclease (BioLabs) The digestion products were tested on a 1.5

% agarose or 12% polyacrilamide gel stained with ethidium bromide. Digestion

patterns of normal and mutant samples are summarized in Table 1.

2.4 Statistical analysis:

Statistical Packages for Social Sciences (SPSS v.12.0) software was used

to evaluate the results. Continuous variables were expressed as mean ± S.D. To

evaluate diagnostic performance we have calculated sensibility, specificity and

likelihood ratios to obtain post-test probability using Bayes’ Theorem.

Results

From July 2004 to October 2005, 348 individuals were sent to our laboratory

for G6PD analysis. Enzyme assay detected 29 (8.3%) of these individuals with a

deficiency for the enzyme (<7.7 UgHb). Additionally, 17 individuals with increased

bilirubin levels and G6PD activity between 7.7 and 12.0 U/gHb were also selected

for molecular analysis, as well as 27 randomly selected non-deficient subjects. In

this sample of 73 individuals, 34 were female and 39 were male.

A total of 35 specimens were found to be abnormal by the DNA assay, of

which 21 were male hemizygous for the G202A;A376G, 4 were female

homozygous and 10 females were identified as carriers for the same double

Resultados

66

mutations. One subject showed the Mediterranean variant (C563T). In our study,

two deficient individuals were negative for the mutations screened and none of the

non-deficient subjects was positive for any of the mutations investigated.

According to the mutation analysis, subjects were reclassified as

homozygous or hemizygous, heterozygous or normal (Fig 1).

ROC curve analysis was performed to define the sensitivity and specificity of

different levels of G6PD using molecular analysis as gold standard. Calculated

sensitivity and specificity for cut-off values established for the normal population

were: 2.9 U/gHb (11.4% and 100%), 8 U/g Hb (77.1% and 94.7%) and 11.5 U/g hb

(97.1% and 76.3%).

In order to calculate sensitivity and specificity one has to classify test results

in only two categories (normal and abnormal). For quantitative traits, however, a

test may have different “patterns” for values far low (or above) cut-off but the

critical points are those intermediate values. For this reason, we used Likelihood

Ratio (LR) to calculate post test probability in three different levels of enzyme

activity (Table 2).

It is estimated that combined deficiency of G6PD is approximately 8% in a

sample from Rio Grande do Sul. So, from a pretest probability of 8%, after enzyme

assay the odd ratio of a given person to be G6PD deficient (having enzyme levels

lower than 8 U/g Hb) becomes 55.9%. On the other hand, for enzyme levels higher

than 11.5 U/gHb, this probability goes down to 0.37% (Table 2).

Two subjects with G6PD activity below 8.0 U/gHb had negative DNA test,

but molecular analysis does not rule out the possibility of other mutations.

Resultados

67

Discussion

The clinical performance of any laboratory test can be determined by its

diagnostic accuracy. Diagnostic accuracy refers to the quality of the information

provided by the laboratory test. The most commonly used methods to diagnose

G6PD deficiency are able to detect totally deficient cases, but fail to detect partially

deficient cases (9,11).

Hundreds of millions of individuals are estimated to be affected by G6PD

deficiency worldwide and a large proportion of these individuals will necessarily be

heterozygotes. Only a fraction will be detected by simple screening methods or

even by enzymatic assays, in particular those patients with mutations resulting in

severe loss of enzymatic activity like the Mediterranean one. For milder cases, the

molecular analysis is more precise and allows the clinician to estimate if the

measured low enzymatic activity was transient (normal or heterozygous for mild

mutations) or permanent (heterozygous for mutations leading to severe loss of

enzymatic activity) (12).

This report describes the direct comparison between a fully quantitative kit

with a simultaneous Hemoglobin Normalization procedure and PCR-based

genotyping, based on survey results derived from real patient samples.

Using molecular techniques, we could characterize G6PD deficiency in our

sample as being mainly due to the G202A;A376G genotype, representing allele

G6PD A-. Although we have screened a small number of cases, our results are in

Resultados

68

accordance to published data (13,4,5), showing the homogeneous distribution of

the G6PD A- mutation in Brazil.

As more than 140 variants have been described (14), a complete analysis of

all mutations is cost and time consuming. Therefore, frequency-oriented studies

are more effective, as can be seen by the 94.4% of deficient patients genotyped in

this study analyzing G6PD A- and G6PD Med variants. This panel of mutations

should allow for the detection of more than 90% of complete G6PD deficiency

cases in Brazil population, and allow detection of female carriers who may be

partially deficient due to selected X chromosome inactivation.

The method used to diagnose the G6PD deficient individuals is an important

decision. The correlation between biochemically and molecularly characterized

variants is not always straightforward. Because of the apparent discrepancy

between phenotype and genotype, diagnosis of the G6PD genotype using an

enzymatic assay is particularly problematic. First the G6PD enzymatic activity

measured by any kit can be easily affected by a great number of factors, most

notably transportation, temperature and time elapsed between blood collection and

sample analysis (15,16). Second, G6PD deficiency is caused by a very large

number of mutations resulting in different degrees of enzyme deficiency (14).

As previous described by Lin et al (2005) (12) the cut-off value for the

enzymatic assay is difficult to set. Using the recommended cut-off values from our

enzymatic assay the sensitivity was 77.1%, specificity 94.7% and some partially

deficient females could be missed. It is important to stress that, as not all known

mutations have been tested in this study, the two deficient individuals may be

Resultados

69

misclassified by mutation analysis, therefore interfering with the sensitivity and

specificity test.

Using only sensitivity and specificity we have to throw away important

information or recalculate sensitivity and specificity for every cut-off point. We

recommend the LR approach because it is simpler and more efficient. LR posses

some properties which makes it a very powerful diagnostic strategy. It is more

stable than sensitivity or specificity when prevalence changes. As a result, the

likelihood ratio expresses the probability that a given level of a diagnostic test

result would be expected in a patient with (as opposed to one without) the target

disorder (17,18). From a pretest probability of 8% of deficiency in the population of

RS, after enzyme assay the probability posttest of a given person to be G6PD

deficient (having enzyme levels lower than 8 U/gHb) becomes 55.9%. On the other

hand, for enzyme levels higher than 11.5 U/gHb, this probability góes down to

0.37% (Table 2).

Because young red blood cells in patients with the A- variant of G6PD

deficiency contain relatively high enzyme levels, hemolysis usually tends to be a

mild and self-limited process (19). Thus, the risk of hemolysis as the most serious

side-effect differs greatly among the various forms of G6PD deficiency. Regardless

of the molecular data, all women showing a residual enzymatic activity less than

40% of the normal population should be treated as being equally at risk with the

totally deficient patients.

Molecular data can identify the variant of the mutation but can't indicate the

ratio of G6PD+ / G6PD- RBC populations which may result in residual enzymatic

Resultados

70

activities ranging from 30 to 60% (Naylor - see the table) (20). Thus, the

information obtained from an enzymatic method run alone, is enough to pin point

the cases which are at greater risk but can’t give definite answers about the

underlying genotype. In this respect, the complementary use of a molecular

technique for samples showing an intermediate residual enzymatic activity would

greatly enhance the efficacy of the test, providing the clinician with more conclusive

data.

It can be concluded that Intercientífica kit is particularly suitable for the

accurate evaluation of the enzymatic activity in whole blood samples, for large

scale screening in field studies and in the public health setting. It is an accurate

method for detecting G6PD deficiency, giving a satisfactory evaluation of the guide

for severity of G6PD deficiency in heterozygous females and even in individuals

with mutations causing less severe enzyme deficiency.

We propose the use of an enzymatic kit for screening the population

followed by a selective screening of intermediate cases (especially those with low

residual enzymatic activity – in the 35-50% range) using molecular techniques.

This is even more suitable in populations with common mutations such as ours.

Acknowledgments: Empresa Intercientífica,SP e FIPE- HCPA,RS

Resultados

71

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Resultados

74

the evolution of the variants A and A-. Proc Natl Acad Sci U S A

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Resultados

75

Table 1 – Parameters for detecting mutations in exons 4, 5 and 6 of the

G6PD gene.

Mutation Amplified Exons Annealing Temperature

Enzyme Reference

202 G→A 4 61°C NlaIII

(21)

376 A→G 5 63.5°C FokI

(22,23)

563 C→T 6 61°C MboII

(22,23)

Resultados

76

Table 2- Pretest Probabilities, Likelihood Ratios (LRs) of G6PD Scan

Results, and Posttest Probabilities in different levels of G6PD (U/g Hb) compared

to the molecular analysis for mutations 202, 376 and 563.

Pretest Probability (%)

G6PD (U/g Hb) DNA

Positive DNA negative Scan Result (LR)

Posttest Probability

(%) 8 <=8 27 2 14.547 55.9% 8 8 a 11.5 7 10 0.76 6.2% 8 >=11.5 1 26 0.043 0.37%

LR= likelihood Ratio; G6PD= glucose-6-phophatedehydrogenase

Resultados

77

Fig 1- Classification of subjects according to the presence or absence of

mutations tested (A- and Med).

Considerações Finais

78

III. Considerações Finais

Considerações Finais

79

A G6PD é expressa em todos os tecidos, onde catalisa a primeira etapa da

via das pentoses-fosfato. O NADPH produzido pela ação da G6PD serve como

doador de elétrons na biossíntese redutora. Pelo fato de os glóbulos vermelhos

não terem mitocôndria, a via das pentoses-fosfato é a única fonte de NADPH e

essencial para sua proteção contra o stress oxidativo (Berg, 2004).

A deficiência de G6PD é uma condição genética cuja manifestação pode

ser desencadeada por fatores ambientais tais como drogas, fava, infecções. As

principais manifestações clínicas consistem de crises hemolíticas e icterícia

neonatal (Beutler, 1994). É uma das enzimopatias mais comuns em todo o mundo,

sendo comumente associada a alguns grupos étnicos. A deficiência ocorre mais

frequentemente em indivíduos do Mediterrâneo, de origem africana ou asiática,

podendo apresentar incidência de 5 a 25% em algumas populações (Luzzato e

Mehta, 1995; Compri et al., 2000)

Vários são os métodos descritos na literatura para a determinação da

atividade da G6PD, incluindo métodos qualitativos, quantitativos e moleculares

(Sanpavat et al., 2001; Lin et al., 2005). Estes métodos apresentam diferentes

graus de sensibilidade e especificidade, assim como diferentes formas de

apresentação dos resultados. Esta variabilidade de métodos existentes dificulta a

comparação dos resultados entre os estudos. Para este estudo foi utilizado o

método quantitativo enzimático-colorimétrico para a caracterização da deficiência

de G6PD e os resultados foram expressos em deficiência total ou completa,

deficiência parcial ou intermediária ou não deficientes (Reclos et al., 2000).

Considerações Finais

80

Dados disponíveis na literatura são discrepantes quanto à real prevalência

da deficiência de G6PD em diferentes regiões do Brasil. Estudos anteriores

demonstraram prevalência da deficiência de G6PD em torno de 10% entre os

homens de origem africana. Já entre os homens euro-descendentes dos estados

de São Paulo e do Rio Grande do Sul foram encontradas freqüências de

deficiência em torno de 1 a 6%. (Lewgoy & Salzano, 1968; Azevedo et al., 1978;

Sena & Ramalho, 1985; Compri et al., 2000).

O presente estudo revelou uma prevalência combinada de 7,9% das duas

formas de deficiência de G6PD (completa e parcial) no Rio Grande do Sul, com

alta prevalência de pacientes parcialmente deficientes e sem correlação com

origem étnica.

Apesar da deficiência de G6PD ser classicamente associada a afro-

descendentes (Kay et al., 1992), a não correlação com a origem étnica encontrada

neste estudo deveu-se à alta prevalência da variante A- de G6PD, também

evidenciada pelo grande número de pacientes parcialmente deficientes. Sabe-se

que a variante A- não é característica de descendentes de africanos, como é

referenciado freqüentemente na bibliografia. Estas variantes também são

frequentes em populações do sul da Itália, Espanha, Portugal e península arábica

(Luzzato & Mehta, 1995). Também é importante salientar que a classificação

étnica, neste estudo, foi estabelecida por coletadores, e que no Brasil a cor da

pele não reflete ancestralidade genética (Parra et al., 2003).

Considerações Finais

81

Os grupos étnicos que contribuíram para a formação do Rio Grande do Sul

foram os índios, negros, portugueses, espanhóis, alemães, italianos, poloneses,

judeus, sírios, libaneses e japoneses (Pesavento, 1993).

Apesar do Rio Grande do Sul ter recebido imigrantes de origem

Mediterrânea no passado, a proporção de deficiência completa de G6PD foi

inferior à proporção de deficiência parcial encontrada neste estudo. Estes achados

podem ser explicados pelo fato de as ondas de imigrantes italianos que chegaram

no RS terem vindo, predominantemente, do norte da Itália, principalmente de

Vêneto, Vicenza, Treviso, Verona e Beluno (De Boni & Costa, 1984), onde a

freqüência de deficiência de G6PD é significativamente menor, em comparação à

observada na parte sul da Itália, Sardenha e Sicília (Beutler, 1994).

Além disso, o alto percentual de mulheres deficientes (7,0%) é de grande

significado, pois demonstra que apesar de ser uma doença ligada ao X, a

deficiência de G6PD não é rara entre as mulheres. Por muitos anos, a deficiência

de G6PD em heterozigotas não era considerada como sendo suscetível a

episódios hemolíticos graves, mesmo sob condições adversas. No entanto, tem

sido comprovado que heterozigotas podem desenvolver hiperbilirrubinemia

neonatal grave, da mesma maneira que os homens hemizigotos e mulheres

homozigotas (Kaplan et al., 1999; Kržely et al., 2001).

Devido à inativação do X seguir um padrão aleatório, existem uma

variedade de fenótipos, podendo os heterozigotos apresentar uma atividade de

G6PD normal, intermediária ou deficiente. A qualidade do método diagnóstico

usado para determinar a atividade de G6PD é importante porque deve detectar

Considerações Finais

82

não só os hemi ou homozigotos, como também heterozigotos e inclusive

indivíduos com deficiências enzimáticas menos severas (Kaplan et al., 1999). A

dosagem quantitativa da atividade enzimática usada neste estudo pode dar uma

orientação satisfatória da gravidade da deficiência de G6PD em mulheres

heterozigotas.

Até esta data, mais de 140 variantes moleculares e 400 variantes

bioquímicas de G6PD já foram descritas, com uma variação considerável entre os

vários grupos raciais (Luzzato & Mehta, 1995; Beutler & Vulliamy, 2002). A maioria

dos indivíduos afetados são assintomáticos. Quase todas as mutações de G6PD

afetam a seqüência codificante do gene. A grande maioria são mutações de ponto

que levam à troca de um aminoácido (mutação de sentido trocado). Algumas

destas ocorrem como uma segunda mutação, mais freqüente em combinações

com mutação polimórfica que distingue a variante não deficiente (G6PD A) da

selvagem (G6PD B). As únicas deleções vistas na seqüência do gene são

pequenas e “in-frame”. A ausência de grande deleções ou mutações tipo

“frameshift” sugere que a ausência total de G6PD deve ser incompatível com a

vida (Mehta et al., 2000).

Alguns estudos têm caracterizado uma variabilidade relativamente alta da

G6PD entre a população brasileira. Conforme esperado, têm sido descritos os

mesmos alelos comumente encontrados na população de descendentes europeus

e africanos (G6PD B, G6PD A, G6PD A- e G6PD Med) (Saad et al., 1997a;

Weimer et al., 1998, Compri et al., 2000). A G6PD no estado do Rio Grande do

Sul, no entanto, é principalmente trialélica, mostrando uma predominância do tipo

Considerações Finais

83

selvagem da enzima (G6PD B), seguido pelos alelos de origem africana, G6PD A

e G6PD A-. Outras variantes bioquímicas também foram descritas no sul do

Brasil, algumas já caracterizadas molecularmente (Hutz et al.,1977; Weimer et al.,

1993; Weimer et al., 1998).

Usando técnicas bioquímicas e moleculares, foi caracterizada a deficiência

de G6PD em amostras de Porto Alegre como sendo principalmente devidas às

mutações G202A e A376G, representando a variante G6PD A-. Apesar de termos

examinado um número pequeno de pacientes deficientes, nossos resultados estão

em concordância com os estudos anteriores (Saad et al., 1997a; Weimer et al.,

1998; Compri et. al., 2000), mostrando distribuição homogênea do padrão G6PD

A- no Brasil. A ausência da variante G6PD A nesta amostra, descrita em estudos

anteriores (Saad et al. 1997a; Weimer et al., 1998), pode ser justificada pelos

critérios de inclusão do nosso estudo. A variante G6PD A pertence à categoria IV,

não causando deficiência enzimática e neste estudo foram investigados pacientes

com suspeita de deficiência de G6PD. Uma vez que mais de 140 variantes já

foram descritas, a análise de todas as mutações é cara e trabalhosa. Estudos

orientados e baseados em relatos anteriores são mais efetivos, como pode ser

observado em nossos resultados. O painel de mutações selecionado foi capaz de

caracterizar genotipicamente 94,4% dos pacientes deficientes e permitiu detectar

66,7% (10/15) das mulheres portadoras que podem ser parcialmente deficientes,

dependendo da inativação do cromossomo X.

A presença da G6PD A e G6PD A-, provavelmente se deve à mistura entre

as etnias que ocorreu no Brasil, depois da chegada dos europeus e africanos, ou

Considerações Finais

84

devido a movimentos migratórios do gene da África até o sul da Europa antes da

colonização (Weimer et al., 1993). Sendo assim, a prevalência desta variante está

de acordo com esta distribuição entre os grupos étnicos que colonizaram o Rio

Grande do Sul, especialmente africanos, portugueses, espanhóis e italianos

(Pesavento, 2003).

Em estudos anteriores, a freqüência da variante Mediterrânea foi de 1% em

amostras do Rio Grande do Sul (Weimer et al., 1998). No entanto, este estudo,

não encontrou nenhum indivíduo com a mutação C563T em amostras da cidade

de Porto Alegre. É importante salientar que os imigrantes que chegaram ao Rio

Grande do Sul, vieram quase que exclusivamente do Vale do Pó e do Vêneto

italiano como Vicenza, Treviso, Verona e Beluno (De Boni & Costa, 1984; Compri

et al., 2000), onde a deficiência de G6PD é significativamente menos freqüente

que no sul da Itália. Somente um indivíduo, em todo o estudo, foi positivo para a

mutação C563T, sendo proveniente da cidade de Belo Horizonte, Minas Gerais.

Neste estudo, dois indivíduos com deficiência parcial de G6PD foram

negativos para as mutações examinadas. É possível que eles possuam outras

mutações que não foram testadas ou mesmo que ainda não tenham sido

caracterizadas molecularmente. Muitas variantes raras já foram descritas no Rio

Grande do Sul, como as G6PD São Borja, Anaheim, Guaíba, Minas Gerais, Porto

Alegre, Seattle e Farroupilha. Para a maioria delas, o defeito molecular não foi

descrito mas foi confirmado que possuem características bioquímicas e

eletroforéticas diferentes das da enzima normal (Hutz et al., 1977; Weimer et al.,

1998)

Considerações Finais

85

A escolha feita pelos laboratórios do método para diagnosticar os pacientes

deficientes de G6PD é uma decisão importante. A acurácia do método refere-se à

qualidade da informação fornecida pelo laboratório. A grande maioria dos métodos

disponíveis para detectar a deficiência de G6PD são capazes de detectar

deficiências totais, mas falham na detecção de casos de deficiência parcial

(Ainoon et al., 2003).

Devido a uma aparente discrepância entre genótipo e fenótipo, a predição

do genótipo a partir de um ensaio enzimático é particularmente problemática.

Primeiro, a determinação dos níveis de atividade enzimática pode sofrer

interferência de um grande número de fatores , tais como transporte das amostras,

temperatura e condições de armazenagem (Freer, 2005). Segundo, a deficiência

de G6PD é causada por um grande número de mutações que resultam em

variados graus de deficiência (Beutler and Vulliamy, 2002).

Freer (2005) demonstrou que a umidade e a temperatura interferem na

estabilidade de amostras coletadas em papel filtro, afetando a quantificação de

G6PD e outras enzimas tais como Galactose-1-fosfato e a biotinidase.

Tem-se observado em alguns centros de triagem neonatal um considerável

aumento de do número de amostras falso-positivas (atividade baixa da G6PD em

indivíduos normais) durante os meses de verão, o que conseqüentemente

resultava num aumento do números de recoletas (Valaes et al., 1969). A G6PD é

uma enzima sensível ao calor e gradualmente torna-se inativa quando separada

do sangue humano (Reclos et al., 2004). Isto se deve parcialmente à biologia

Considerações Finais

86

própria dos glóbulos vermelhos e a fatores ligados às condições de estocagem

(Simkins & Culp., 1999; Korgun et al., 2001).

Os resultados apresentados aqui demonstraram que as condições de

estocagem (temperatura principalmente) desempenham um papel fundamental na

atividade da G6PD, especialmente nas coletas em papel filtro. Apesar de se ter

conhecimento empírico sobre esse fato há algum tempo, não era possível estudar

este fenômeno durante as análises de rotina. (Touma et al., 1997; Neto, 1998)

Além disso, estes achados são de grande significado prático para a medida

da G6PD. Estocagem a altas temperaturas resulta em perdas rápidas de atividade

em algumas amostras, enquanto que outras apresentam alguma tolerância ao

calor. Conseqüentemente, achados de atividade baixa em várias amostras,

quando um lote de cartões é enviado pelo correio, é muito comum. Em países

onde as amostras são submetidas a altas temperaturas nos meses de verão, este

problema é freqüente. Também, observou-se que a incidência de resultados falso-

positivos é três vezes maior no verão em comparação ao inverno (Krželj et al.,

2001). Neto (1998), demonstrou este efeito, mostrando a diferença de atividade na

G6PD entre amostras coletadas no próprio laboratório, na região do Rio de

Janeiro (que chegam rapidamente ao laboratório) e em regiões fora desta área

(que levam vários dias para chegar ao laboratório). A atividade média das

amostras coletadas longe do laboratório foi significativamente mais baixa do que

das amostras coletadas dentro da região.

Os resultados apresentados aqui demonstram claramente o efeito negativo

da temperatura na atividade de G6PD das amostras. Eles também demonstram

Considerações Finais

87

que os efeitos da temperatura afetam as amostras de maneira diferente, achado

que exige investigações adicionais. Provavelmente, parâmetros individuais, como

a idade dos glóbulos vermelhos, devem contribuir para estas discrepâncias.

Além da temperatura, a única diferença entre as amostras foi relacionada

às condições de armazenagem, sugerindo que exista um fator de proteção no

sangue total, que retém a atividade da enzima. Este fator deve ser (i) inerente a

própria célula sangüínea, que deve prover a enzima, (ii) de uma proteção

microambiental, o envelhecimento das células vermelhas do sangue ou (iii) outro

fator de superfície, solúvel ou citoplasmático. Trabalhos adicionais são

necessários para investigar estas hipóteses.

Este trabalho sugere que o tempo entre a coleta e a chegada até os centros

de processamento das amostras, deve ser o menor possível. O transporte

refrigerado pode ser uma solução para prevenir a inativação da enzima pelo calor.

Além do controle dos fatores interferentes, a escolha e padronização de um

método de triagem da deficiência de G6PD deve estabelecer pontos de corte que

avaliem o real risco dos pacientes desenvolver manifestações clínicas

Conforme já descrito por Lin et al. (2005) é difícil estabelecer os valores de

cut-off dos métodos enzimáticos. Este estudo comparou um método enzimático de

medida da atividade da G6PD e normalização da hemoglobina com um método de

análise molecular de mutações no gene da G6PD.

As sensibilidades e especificidades calculadas para os valores de cut-off

estabelecido em uma população normal foram: para 2,9 U/gHb ( 11,4% e 100%),

para 8 U/g Hb (77,1% e 94,7%) e para 11,5 U/g Hb (97,1% e 76,3%). Estes

Considerações Finais

88

valores podem estar falsamente diminuídos, uma vez que não foram testadas

todas as variantes de G6PD já descritas e dois pacientes deficientes pelo ensaio

enzimático podem estar mal classificado.

Na determinação da acurácia de ensaios quantitativos, calculando-se

somente sensibilidade e especificidade nos valores de cut-off, perde-se

informações importantes dos diferentes níveis de quantificação, pois classificam-

se os resultados do teste em duas categorias (normal e anormal) (Jaeschke et

al.,1994a,b). Por esta razão, neste estudo calculamos a razão de chance (LR) nos

diferentes pontos de cut-off para obtermos as diferente probabilidades pós-testes

em três diferentes níveis de atividade enzimática. O cálculo do LR é simples e esta

informação é mais eficiente e mais homogênea (menos sujeita a interferentes) do

que a sensibilidade e a especificidade, pois não sofre influência pela alteração da

prevalência (Jaeschke et al.,1994a,b). Estima-se que a deficiência de ambas as

formas combinadas de G6PD seja de aproximadamente 8% numa amostra do RS.

A partir de uma probabilidade pré-teste de 8,0%, após a realização do ensaio

enzimático, a probabilidade pós-teste de uma pessoa ser deficiente de G6PD com

nível enzimático inferior a 8 U/g Hb passa a ser 55,9%. Ao passo que para níveis

superiores a 11,5 U/g Hb esta probabilidade de deficiência diminui para 0,37%.

Pode-se concluir que o método empregado (kit Intercientífica) foi adequado

para avaliar a atividade enzimática de G6PD em amostras de sangue total. É um

método capaz de detectar a deficiência de G6PD, demonstrando de forma

satisfatória o grau de deficiência em indivíduos que possuem mutações que

causam deficiência enzimática menos severa, inclusive mulheres heterozigotas. A

Considerações Finais

89

análise molecular pode identificar o tipo de variante mas não pode indicar o risco

real para as mulheres portadoras, que é diretamente estimado pelo nível de

atividade enzimática. A informação obtida pelo método enzimático sozinho é

suficiente para detectar os casos que estão sob maior risco, mas não pode dar

uma resposta definitiva sobre o genótipo do paciente.

Técnicas moleculares podem aumentar a eficácia dos testes enzimáticos,

podendo ser usadas como uma ferramenta complementar, principalmente em

amostras que apresentam atividades enzimáticas intermediárias, informando aos

médicos dados mais conclusivos.

A possibilidade de casos de deficientes de G6PD poderem manifestar

anemia hemolítica aguda importante, até mesmo fatal, na presença de fatores

oxidantes fortes (Saad et al., 1997b) e a associação entre a deficiência de G6PD

e a icterícia neonatal (Garlipp & Ramalho, 1988) justificam a importância da

detecção e da orientação preventiva dos enzimopênicos nas populações,

sobretudo naquelas em que a probabilidade de encontro da variante Mediterrânea,

mais grave, for maior.

É possível constatar grande homogeneidade da população brasileira quanto

à preponderância da mutação A- de G6PD, conforme identificado neste estudo.

Tal homogeinedade só é observada na África Tropical, uma vez que na maioria

das áreas de alta prevalência dessa enzimopenia, como é o caso do

mediterrâneo, da Índia, do Sudeste Asiático e da China, são encontrado múltiplos

alelos polimórficos (Luzzato & Mehta, 1995).

Considerações Finais

90

O risco de hemólise, como principal efeito da presença da mutação nos

pacientes, varia muito entre as várias formas de deficiência de G6PD. Estudos

realizados em Salvador (Azevedo et al., 1978) e Campinas (Saad et al., 1997a)

demonstraram uma baixa mortalidade da deficiência de G6PD devido ao fato, em

grande parte, da maioria dos deficientes examinados apresentar a variante A- da

enzima. Esta variante é mais benigna, pois a deficiência enzimática está limitada

às hemácias com mais de cinqüenta dias. Estas hemácias possuem níveis

relativamente alto de enzima, por isso os episódios de hemólise usualmente

tendem a ser leve e auto-limitados (Beutler, 1994). Entretanto, mesmo para os

indivíduos A- há o risco de crises hemolíticas, o que justifica a sua detecção.

Concluindo, este trabalho demonstrou uma prevalência combinada de 7,9%

das duas formas de deficiência de G6PD no estado do Rio Grande do Sul, com

um predomínio da variante de G6PD A- (202/376) na cidade de Porto Alegre.

Estes resultados estão de acordo com outros estudos brasileiros mostrando

distribuição homogênea do padrão G6PD A- no Brasil.

Os resultados demonstraram o efeito negativo da temperatura e das

condições de armazenamento na atividade da G6PD, principalmente em papel

filtro. No entanto, o método empregado (kit intercientífica) foi adequado para

avaliar a atividade enzimática da G6PD em amostras de sangue total,

demonstrando de forma satisfatória o grau de deficiência em mulheres e em

indivíduos com mutações que causam deficiência menos severa.

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IV. Referências Bibliográficas

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Anexos

106

V- Anexos

Anexos

107

LISTA DE ANEXOS Anexo 1 – Lista de Figuras e Tabelas 108 Anexo 2 – Termo de Consentimento 109 Anexo 3 – Técnica de Extração de DNA 110 Anexo 4 – Técnica da G6PD 111 Anexo 5 – Curva ROC 112 Anexo 6 – Genótipo dos Pacientes Estudados 113 – 115 Anexo 7 – Cálculo da probabilidade pós-tese 116 - 117 Anexo 8 – Protocolos da PCR 118 Anexo 9 – Enzimas de Restrição e condições de digestão 119

Anexos

108

LISTA DE FIGURAS E TABELAS

Figura 1 – A G6PD e a via das Pentoses Fosfato 3 Figura 2 – Processo de eliminação dos peróxidos 5 Figura 3 – Distribuição Mundial da deficiência da G6PD 15 Figura 4 – Polimorfismos de restrição do gene da G6PD envolvidos com a deficiência 23 Tabela 1 – Drogas e Químicos Associados com hemólise em indivíduos com deficiência da G6PD, segundo Luzzato & Mehta, 1995 8 Tabela 2 – Classificação das variantes de G6PD (Luzzato & Mehta,1995) 17

Anexos

109

TERMO DE CONSENTIMENTO LIVRE E ESCLARECIDO :

CARACTERIZAÇÃO MOLECULAR DO GENE DA GLICOSE-6-FOSFATO DESIDROGENASE (G6PD) EM

AMOSTRAS DE PORTO ALEGRE

A Deficiência de G-6-PD é uma doença hereditária, havendo evidências que essa doença seja bastante frequente em nosso País. Trata-se da deficiência de uma enzima responsável pela proteção de uma célula conhecida como “Hemácia” (glóbulo vermelho). Essa célula é responsável pelo transporte do oxigênio para os tecidos. Os sintomas por muitas vezes não se apresentam de forma clara, mas podem trazer problemas, como a anemia. Se a doença for descoberta e os cuidados forem tomados, esses problemas poderão ser evitados. O tratamento é simples, consistindo em evitar entrar em contato com certas substâncias agressivas a essas células deficientes, que na sua maioria são medicamentos os quais o paciente deficiente de G-6-PD deve evitar contato. Existem também algumas poucas ervas, substâncias químicas e alimentos que devem ser evitados.

Estamos realizando uma pesquisa que poderá detectar a deficiência de G-6-PD. Os principais objetivos da pesquisa são a determinação de pacientes que apresentam a Deficiência de G-6-PD em Porto Alegre, assim como o tipo de deficiência, oferecendo a esses a oportunidade de receberem o tratamento adequado o quanto antes. A pesquisa será realizada em sangue total, sem acarretar nenhum risco adicional. O tratamento será oferecido para os casos confirmados da Deficiência. Se você optar por não realizar esta pesquisa isso não prejudicará em nada o seu atendimento.

Eu, abaixo assinado, fui informado dos objetivos e dos procedimentos da pesquisa, e autorizo eu ou meu filho __________________________________________, sermos avaliados para Deficiência de G-6-PD, assim como nosso material seja utilizado para análises moleculares posteriores. P.A. ____/____/____ Endereço/telefone:______________________________________________ Responsável: _________________________________

Pesquisadora Responsável: Dra. Roberto Giugliani/Simone Castro 99873751

Testemunha: __________________________________

Anexos

110

Técnica - Extração de DNA (Miller et al., 1988)

1. Transferir o sangue para o tubo Falcon de 15 mL, previamente identificado. Lavar o tubo primário com água milli-q até completar o volume de 14 mL no Falcon. Fechar o Falcon.

2. Homogeneizar, vertendo o Falcon antes de colocá-lo na centrífuga.

3. Centrifugar a 3500rpm durante 20 min.

4. Remover o sobrenadante, invertendo o tubo na horizontal. O pellet deve ficar no Falcon. Não reinverter o tubo. Caso seja necessário, centrifugar novamente.

5. Adicionar 10 mL de Triton X-100 0,1%. Agitar no vortex até remover o pellet do fundo do tubo.

6. Centrifugar a 3500 rpm durante 20 min.

7. Descartar o sobrenadante, virando o Falcon na horizontal.

8. Adicionar 1,5 mL de tampão de lise nuclear. Agitar no vortex até fragmentar o pellet.

9. Adicionar 150 μL de SDS 10% e 60 μL de Proteinase K. Sem agitar, incubar em banho-maria a 37°C por 10 h ou “over-night”.

10. Adicionar 500 μL da solução de Acetato de Amônia 9,6M, para promover a precipitação das proteínas.

11. Agitar no vortex até formar uma camada de espuma (aproximadamente 30s). Deixar 15 min reagindo.

12. Centrifugar a 3500 rpm durante 20 min.

13. Transferir o sobrenadante para o tubo de vidro. No sobrenadante está o DNA e no pellet encontram-se as proteínas. Caso o pellet de proteínas não fique bem sedimentado, transferir o líquido para uma seringa com gase para filtrar.

14. Colocar o etanol pelas bordas do tubo de vidro até verificar a precipitação do DNA (3 x o volume do sobrenadante).

15. Fechar com parafilme e inverter 2 vezes o tubo. Pescar o DNA com auxílio de um capilar com a extremidade previamente fechada. Fazer movimentos circulares.

16. Tirar o excesso de álcool do capilar e colocá-lo no eppendorf. Aguardar um tempo aberto para evaporar o álcool.

17. Adicionar o TE 0,1 M de acordo com a quantidade de DNA (100 a 300 μL de TE).

18. Deixar o eppendorf a temperatura ambiente para solubilizar bem o DNA. Após, congelá-lo.

Anexos

111

Técnica - G-6-PD (Screening Test Kit – cat.no.3570-050 Interscientific

Corporation)

1. Picotar as amostras, utilizando um picotador de 3/16 “de sangue seco (ou 2x 2/18

– 3.0 mm)”. numa placa de fundo “U”. Como método alternativo poderão também

ser utilizadas amostras de sangue total com EDTA, no volume de 5 µL. Utilizar as

posições A1/A2 - Controle Normal, A3/A4 – Controle Intermediário e A5/A6 para o

Controle Deficiente (não incluso no kit).

2. Adicionar 75 µL de REAGENTRE DE ELUIÇÃO para cada orifício;

3. Colocar a placa de microtitulação em um agitador orbital por 20 minutos à

temperatura ambiente;

4. Durante a eluição, reconstituir o REAGENTE DE TRABALHO;

5. Transferir 15 µL do eluente para cada orifício de uma placa de microtitulação de

fundo chato.

6. Adicionar 75 µL de REAGENTRE DE TRABALHO em cada orifício da placa de

ensaio;

7. Colocar a placa no agitador orbital por 10 minutos;

8. Realizar a leitura em 405-410 nm, modo de ponto-final;

9. Preparar o Reagente de Cor na proporção 1:10 (CRB + Reagente de Cor);

10. Adicionar 100 µL do Reagente de Cor preparado;

11. Realizar a leitura em 550-570 nm, (modo cinético) durante 10 minutos, com 60

segundos de intervalo entre as leituras;

Anexos

112

Medida da sensibiidade e especificidade, a partir de uma curva ROC, de um teste quantitativo de medida da atividade da G6PD (U/g Hb) de 73 indivíduos classificados molecularmente como homo,hemi ou heterozigotos e negativos para as variantes A- (202/376) e mediterrânea (563) de G6PD.

Anexos

113

Genótipo dos pacientes homozigotos, hemizigotos, heterozigotos e negativos para as mutações 202, 376 e 563.

Identificação Sexo Atividade G6PD (U/gHb)

Mutação 376 Enzima Fok I

Mutação 202 Enzima NIA III

Mutação 563 Enzima MbO II Genótipo

1 HC M 2,2 1 1 3 Gd*A-

2 RN SMF F 5,7 1 1 3 Gd*A-

3 WL M 4,3 1 1 3 Gd*A-

4 RN CT M 9,8 1 1 3 Gd*A-

5 HDSO M 5,7 1 1 3 Gd*A-

6 AW M 3,4 1 1 3 Gd*A-

7 28HCPA M 6,3 1 1 3 Gd*A-

8 JLD M 3,8 1 1 3 Gd*A-

9 CM M 4,9 1 1 3 Gd*A-

10 RN VMA M 6,1 1 1 3 Gd*A-

11 MAG M 4,7 1 1 3 Gd*A-

12 RN JQL F 5,8 1 1 3 Gd*A-

13 RN ICV F 7 1 1 3 Gd*A-

14 RN PCF M 2,7 1 1 3 Gd*A-

15 RN GSD M 2,7 1 1 3 Gd*A-

16 MCT F 3,4 1 1 3 Gd*A-

17 JCCS M 5 1 1 3 Gd*A-

18 JCBM M 4,5 1 1 3 Gd*A-

19 MAG M 4,7 1 1 3 Gd*A-

20 GMS M 4,1 1 1 3 Gd*A-

21 RN ISS M 3,2 1 1 3 Gd*A-

22 LRDS M 2.9 1 1 3 Gd*A-

23 JPMS M 6 1 1 3 Gd*A-

24 GFS M 2,82 1 1 3 Gd*A-

25 PLGM M 2,9 3 3 1 Gd*Med M = masculino F = feminino 1 = homozigoto/hemizigoto 3 = negativo Gd*A- = variante de G6PD A- (202/376) Gd*Méd = variante de G6PD mediterrânea (563)

Anexos

114

Genótipo dos pacientes homozigotos, hemizigotos, heterozigotos e negativos para as mutações 202, 376 e 563.

Identificação Sexo Atividade G6PD (U/gHb)

Mutação 376 Enzima Fok I

Mutação 202 Enzima NIA III

Mutação 563 Enzima MbO II Genótipo

1 MS F 5,6 2 2 3 Gd*A-

2 TF WL 04 F 5,9 2 2 3 Gd*A-

3 RN KBC F 10,3 2 2 3 Gd*A-

4 RN JGF F 9,7 2 2 3 Gd*A-

5 FC F 7,2 2 2 3 Gd*A-

6 RDB F 8,9 2 2 3 Gd*A-

7 FRL F 11,4 2 2 3 Gd*A-

8 DM F 10,4 2 2 3 Gd*A-

9 MCMS F 11,4 2 2 3 Gd*A-

10 KSG F 13,2 2 2 3 Gd*A- M = masculino F = feminino 2 = heterozigota 3 = negativo Gd*A- = variante de G6PD A- (202/376) Gd*Méd = variante de G6PD mediterrânea (563)

Anexos

115

Genótipo dos pacientes homozigotos, hemizigotos, heterozigotos e negativos para as mutações 202, 376 e 563.

Identificação Sexo Atividade G6PD (U/gHb) Mutação 376 Enzima Fok I Mutação 202 Enzima NIA III Mutação 563

Enzima MbO II Genótipo

1 RN EM M 20,8 3 3 3 negativo

2 FRS F 17,2 3 3 3 negativo

3 TVE M 19,5 3 3 3 negativo

4 VV F 10,9 3 3 3 negativo

5 AW M 15,2 3 3 3 negativo

6 GAMR M 10,4 3 3 3 negativo

7 PCW F 23,5 3 3 3 negativo

8 FD M 13,9 3 3 3 negativo

9 MFL F 22,5 3 3 3 negativo

10 RN RIVS M 20,4 3 3 3 negativo

11 IDT F 9,4 3 3 3 negativo

12 EL F 16,1 3 3 3 negativo

13 GBC F 20,8 3 3 3 negativo

14 JMC F 18,7 3 3 3 negativo

15 FB M 25,9 3 3 3 negativo

16 NAF F 6,5 3 3 3 negativo

17 MA F 11,8 3 3 3 negativo

18 SBB F 10,7 3 3 3 negativo

19 MCEP F 10,2 3 3 3 negativo

20 JCFL M 15 3 3 3 negativo

21 RSW M 3,42 3 3 3 negativo

22 SS F 11,1 3 3 3 negativo

23 S1075 F 22,5 3 3 3 negativo

24 A1057 M 23 3 3 3 negativo

25 A 15,9 3 3 3 negativo

26 CV1098 M 27,3 3 3 3 negativo

27 B1077 F 22,8 3 3 3 negativo

28 HE M 22,3 3 3 3 negativo

29 001 - TP F 12,7 3 3 3 negativo

30 TA F 11,6 3 3 3 negativo

31 JM M 9.9 3 3 3 negativo

32 RN MCS F 11.6 3 3 3 negativo

33 LHDS M 13.8 3 3 3 negativo

34 EGM M 14,5 3 3 3 negativo

37 AL F 16,6 3 3 3 negativo

38 TE F 20,3 3 3 3 negativo

39 EU M 20,4 3 3 3 negativo

Anexos

116

Cálculo das diferentes probabilidades pós-teste a partir de uma probabilidade pré-teste de 8,0%, em diferentes níveis de atividade de G6PD (U/gHb).

GRUPO (mutação 202e/ou376 e/ou 563)

G6PD 1 molecular (+)

molecular (-) sens. spec.

Likelihood Ratio ( LR ) odds x LR

(odds x LR)/(1 + (odds x LR))

< 7.1 26 2 74,3 94,7 14,01886792 1,219641509 54,9% 7.1 - 11.50 8 7

> 11.50 1 29 97,1 76,3 0,038007864 0,003306684 0,3%

Total 35 38

G6PD 2 molecular (+)

molecular (-) sens. spec.

Likelihood Ratio ( LR ) odds x LR

(odds x LR)/(1 + (odds x LR))

< 8.05 27 2 77,1 94,7 14,54716981 1,265603774 55,9% 8.05 - 11.50 7 7

> 11.50 1 29 97,1 76,3 0,038007864 0,003306684 0,3%

Total 35 38

G6PD 3 molecular (+)

molecular (-) sens. spec.

Likelihood Ratio ( LR ) odds x LR

(odds x LR)/(1 + (odds x LR))

< 9.15 28 2 80 94,7 15,09433962 1,313207547 56,8%9.15 - 11.50 6 7

> 11.50 1 29 97,1 76,3 0,038007864 0,003306684 0,3%

II

Total 35 38

G6PD 4 molecular (+)

molecular (-) sens. spec.

Likelihood Ratio ( LR ) odds x LR

(odds x LR)/(1 + (odds x LR))

< 9.85 30 3 85,7 92,1 10,84810127 0,94378481 48,6% 9.85 - 11.50 4 6

> 11.50 1 29 97,1 76,3 0,038007864 0,003306684 0,3%

Total 35 38

G6PD 5 molecular (+)

molecular (-) sens. spec.

Likelihood Ratio ( LR ) odds x LR

(odds x LR)/(1 + (odds x LR))

< 7.1 26 2 74,3 94,7 14,01886792 1,219641509 54,9% 7.1 - 12.95 8 12

> 12.95 1 24 97,1 63,2 0,045886076 0,003992089 0,4%

Total 35 38

G6PD 6 molecular (+)

molecular (-) sens. spec.

Likelihood Ratio ( LR ) odds x LR

(odds x LR)/(1 + (odds x LR))

< 8.05 27 2 77,1 94,7 14,54716981 1,265603774 55,9% 8.05 - 12.95 7 12

> 12.95 1 24 97,1 63,2 0,045886076 0,003992089 0,4%

Total 35 38

Anexos

117

G6PD 7 molecular (+)

molecular (-) sens. spec.

Likelihood Ratio ( LR ) odds x LR

(odds x LR)/(1 + (odds x LR))

< 9.15 28 2 80 94,7 15,09433962 1,313207547 56,8% 9.15 - 12.95 6 12

> 12.95 1 24 97,1 63,2 0,045886076 0,003992089 0,4%

Total 35 38

G6PD 8 molecular (+)

molecular (-) sens. spec.

Likelihood Ratio ( LR ) odds x LR

(odds x LR)/(1 + (odds x LR))

< 9.85 30 3 85,7 92,1 10,84810127 0,94378481 48,6% 9.85 - 12.95 4 11

> 12.95 1 24 97,1 63,2 0,045886076 0,003992089 0,4%

Total 35 38

G6PD 9 molecular (+)

molecular (-) sens. spec.

Likelihood Ratio ( LR ) odds x LR

(odds x LR)/(1 + (odds x LR))

< 7.1 26 2 74,3 94,7 14,01886792 1,219641509 54,9% 7.1 - 13.50 9 12

> 13.50 24 100 63,2 0 0 0,0%

Total 35 38

G6PD 10 molecular (+)

molecular (-) sens. spec.

Likelihood Ratio ( LR ) odds x LR

(odds x LR)/(1 + (odds x LR))

< 8.05 27 2 77,1 94,7 14,54716981 1,265603774 55,9% 8.05 - 13.50 8 12

> 13.50 24 100 63,2 0 0 0,0%

Total 35 38

G6PD 11 molecular (+)

molecular (-) sens. spec.

Likelihood Ratio ( LR ) odds x LR

(odds x LR)/(1 + (odds x LR))

< 9.15 28 2 80 94,7 15,09433962 1,313207547 56,8%9.15 - 13.50 7 12

> 13.50 24 100 63,2 0 0 0,0%

I

Total 35 38

G6PD 12 molecular (+)

molecular (-) sens. spec.

Likelihood Ratio ( LR ) odds x LR

(odds x LR)/(1 + (odds x LR))

< 9.85 30 3 85,7 92,1 10,84810127 0,94378481 48,6% 9.85 - 13.50 5 11

> 13.50 24 100 63,2 0 0 0,0%

Total 35 38

Anexos

118

Anexos

119

Anexos

120

Anexos

121

Anexos

122

Protocolos da PCR e condições de migração para cada sistema investigado.

Região Investigada

Água Tampão PCR-10x

DNTPs 1,25mM

Iniciadores 1,25mM

Taq 5U/μl

DNA 100ng/μl

Ciclos Programas Conc. Gel

Voltagem Total

Éxon 4

16,5μl

2,5μl

2,0μl

1,5μl

0,2μl

1,0

35

94oC 56oC 72oC

10%

600 V

Éxon 5

16,5μl

2,5μl

2,0μl

1,5μl

0,2μl

1,0

35 94oC 63oC 72oC

7%

1.000 V

Éxon 6

16,5μl

2,5μl

2,0μl

1,5μl

0,2μl

1,0

35 94oC 60oC 72oC

5%

1.200 V

Sequências dos iniciadores e tamanho dos fragmentos amplificados

Denominação dos primers

Sequências dos iniciadores Fragmento Amplificado(pb)

Referências

202 5’ GTG GCT GTT CCG GGA TGG CCT TCT G 3’ 5’ CTT GAA GAA GGG CTC ACT CTG TTT G 3’

109

Bonanga et al., 1998

FOK I 5’ CTG TCTGTG TGT CTG TCT GTC C 3’ 5’ GGC CAG CCT GGC AGG CGG GAA GG 3’

295

Vulliamy et al., 1991b Cittadella et al., 1997

Mbo II 5’ ACT CCC CGA AGA GGG GTT CAA GG 3’ 5’ CCA GCC TCC CAG GAG AGA GGA AG 3’

547

Vulliamy et al., 1991b Cittadella et al., 1997

Enzimas de restrição e condições de digestão

Condições de Digestão Regiões

Digeridas

Mutações

Investigadas

Enzimas

Água Tampão(10x) Enzima PCR Temperatura

Fragmentos Resultantes

(pb) Éxon 4 202G→A Nla III 3,5μl 1,0μl 10U 5,0μl 37oC 63-46

Éxon5

376A→G

Fok I

7,0μl

2,0μl

4U

10,0μl

37oC

154-141

Éxon 6

563C→T

Mbo II

7,0μl

2,0μl

4U

10,0μl

37oC

277-119-100