artidentifiering av mögelsvamp med maldi-tof...

Fakulteten för hälso- och livsvetenskap

Examensarbete

Artidentifiering av mögelsvamp

med MALDI-TOF MS

Författare: Ellinor Leander

Ämne: Biomedicinsk

laboratorievetenskap

Nivå: Grundnivå

Artidentifiering av mögelsvamp med MALDI-TOF MS

Ellinor Leander

Examensarbete, Biomedicinsk laboratorievetenskap 15 högskolepoäng

Filosofie Kandidatexamen

Handledare: Medicinsk chef Klinisk mikrobiologi

Annika Wistedt och vårdhygien,

Hus 17 Länssjukhuset

391 85 Kalmar

Universitetslektor Institutionen för Kemi

Britt-Inger Marklund och Biomedicin,

Linnéuniversitetet

391 82 Kalmar

Examinator: Universitetslektor Institutionen för Kemi

Maria Bergström och Biomedicin,

Linnéuniversitetet

391 82 Kalmar

Examensarbetet ingår i Biomedicinska analytikerprogrammet 180 högskolepoäng

Sammanfattning

Snabb och korrekt artidentifiering är avgörande för effektiv behandling av

svampinfektioner, särskilt bland immunsupprimerade patienter. Matrix-assisted laser

desorption ionization time-of-flight mass spectrometry (MALDI-TOF MS) används

rutinmässigt på kliniska laboratorier för identifiering av karaktäristiska proteinmönster

hos bakterier och jästsvampar genom tolkning av proteinspektra i en masspektradatabas

för korrekt artidentifiering. Mögelsvamparnas hårda cellvägg och heterogena växtsätt

med varierande proteinuttryck beroende på mognadsstadie, försvårar identifiering med

MALDI-TOF MS. Metodens tänkbara fördelar mot traditionella metoden

mikroskopering är förkortade svarstider, säkrare artidentifiering av fler arter och mindre

beroende av subjektiv morfologisk bedömning. Studiens syfte var att undersöka om

MALDI-TOF MS kunde anpassas och användas för identifieringen av mögelsvamp i

klinisk rutindiagnostik. Fyra referensstammar (Aspergillus niger, A. fumigatus,

A.terreus, A.flavus) och ett kliniskt isolat (A.terreus) undersöktes.

Preparationsmetoderna (I) fullständig myrsyraextraktion, (II) direktapplicering och (III)

suspension i destillerat vatten användes för analys av sporer och frontmycel hos yngre

och äldre mögelkulturer. Två olika masspektradatabaser för artidentifiering jämfördes;

rutindatabasen BDAL och den specialiserade mögeldatabasen Filamentous Fungi

Library. Även plocktekniken av mögelmaterial inför analys med MALDI-TOF MS

utvärderades. Vid vissa tillfällen förbättrades artidentifieringen efter extraktion av

mögelkulturerna, medan i andra fall var direktapplicering fullt tillräcklig. Mögelmaterial

med mycket sporer tenderade ge något fler artidentifieringar i BDAL oavsett

kulturernas ålder. Filamentous Fungi Library tenderade i vissa fall ge bättre resultat

jämfört med BDAL för yngre kulturer. Fler studier krävs för att utvärdera och optimera

MALDI-TOF MS som metod för artidentifiering av mögelsvamp.

Nyckelord Mögelsvamp, artidentifiering, MALDI-TOF MS, databas

Abstract

Rapid and accurate species identification is crucial for successful treatment of fungal

infections, especially among immunosuppressed patients. Matrix-assisted laser

desorption ionization time-of-flight mass spectrometry (MALDI-TOF MS) is used

routinely at clinical laboratories to identify characteristic protein patterns of bacteria and

yeast by the interpretation of protein spectra in a database for accurate species

identification. The hard cell wall of the mold and the heterogeneous growth with

varying protein expression due to maturation, complicates identification with MALDI-

TOF MS. The potential benefits of this method compared to microscopy as traditional

method are shortened turn-around times, safer species identification of more species that

is independent on subjective morphological assessment. The purpose of the study was to

investigate whether MALDI-TOF MS could be adapted and used for the identification

of molds in clinical routine diagnostics. Four reference strains (Aspergillus niger,

A.fumigatus, A.terreus, A.flavus) and a clinical isolate (A.terreus) were examined. The

preparation methods (I) complete formic acid extraction, (II) direct application and (III)

suspension in distilled water were used for analysis of spores and frontmycelium from

younger and older mold cultures. Two different masspektradatabases for species

identification were compared; routine database BDAL and the specialized mold

database, Filamentous Fungi Library. Also the collecting technique of mold prior to

analysis with MALDI-TOF MS was evaluated. Sometimes, the species identification

improved after extraction of mold cultures, while in other cases direct application was

sufficient. Cultures with a lot of spores tended to give slightly more species

identifications in BDAL regardless of the age of cultures. Filamentous Fungi Library, in

some cases, tended to improve the performance compared to BDAL for younger

cultures. More studies are required to evaluate and optimize MALDI-TOF MS as a

method of mold identification.

Keywords Filamentous fungi, species identification, MALDI-TOF MS, database

Innehållförteckning

Introduktion _______________________________________________________ - 1 - Taxonomi för eukaryota svampar ______________________________________ - 1 - Mögelsvampars egenskaper __________________________________________ - 1 -

Reproduktion ___________________________________________________ - 1 -

Cellväggens stabilitet _____________________________________________ - 1 -

Virulensfaktorer _________________________________________________ - 1 -

Infektioner med mögelsvamp _________________________________________ - 2 - Patientfall med mögelsvamp under 2017 vid Klinisk mikrobiologi i Kalmar ____ - 3 -

Nuvarande metod för identifiering av mögelsvamp ________________________ - 4 - MALDI-TOF MS för artidentifiering av mögelsvamp inom klinisk mikrobiologisk

rutinverksamhet ___________________________________________________ - 4 - Analysprincip för MALDI-TOF MS ___________________________________ - 4 -

Syfte ____________________________________________________________ - 5 -

Material och metod __________________________________________________ - 6 - Odling ___________________________________________________________ - 6 -

Beredning av lösningar inför provsättning och analys med MALDI-TOF MS i

MicroflexTM

LT ___________________________________________________ - 6 - Standardlösning _________________________________________________ - 6 -

Bruksfärdig matrixlösning _________________________________________ - 6 -

70% myrsyra ____________________________________________________ - 6 -

Plockteknik och preparationsmetoder __________________________________ - 7 -

Fullständig myrsyraextraktion enligt Bruker (I) ________________________ - 7 -

Direktapplicering (II) _____________________________________________ - 7 -

Suspension (III) _________________________________________________ - 7 -

Identifiering med MALDI-TOF MS i MicroflexTM

LT _____________________ - 8 -

Referensdatabaser __________________________________________________ - 8 -

Kontroller ________________________________________________________ - 8 - Positiv kontroll __________________________________________________ - 8 -

Negativ kontroll _________________________________________________ - 8 -

Kalibrering _______________________________________________________ - 9 - Etik _____________________________________________________________ - 9 -

Resultat ___________________________________________________________ - 9 - Redovisning av score-resultat _________________________________________ - 9 -

Motivering till förändringar under studien _______________________________ - 9 - Referensstam A.fumigatus __________________________________________ - 10 - Referensstam A.terreus _____________________________________________ - 12 -

A.terreus kliniskt isolat _____________________________________________ - 14 - Kontroller och kalibrering __________________________________________ - 15 -

Diskussion ________________________________________________________ - 16 - Plockteknik och homogenisering av material ____________________________ - 16 - Jämförelse av suspension, direktapplicering och fullständig myrsyra-extraktion - 17 - Skillnader mellan databaser _________________________________________ - 17 -

Tillväxtfas och fördelning av mycel respektive sporer ____________________ - 18 - Kontroll _________________________________________________________ - 19 -

Problem och förbättringsförslag ______________________________________ - 19 - Slutsats _________________________________________________________ - 20 -

Tack _____________________________________________________________ - 20 -

Referenser ________________________________________________________ - 21 -

Bilagor Bilaga I: Substrat Bilaga II: Rådata

- 1 -

Introduktion

Taxonomi för eukaryota svampar

De eukaryota svamparna utgör ett av livets riken här på jorden (1). Antalet arter

uppskattas till mellan 700 000 och 1 500 000. Av nästan 100 000 kända arter har knappt

500 arter beskrivits orsaka infektion hos människa (2). Svampriket delas in i

divisionerna Zygomycota, Ascomycota eller Basidiomycota baserat på vilken typ av

sexuell (teleomorph) spor svampen producerar; zygospor, ascospor respektive

basidiospor (1). Sporer kan även ha asexuellt (anamorpht) ursprung där sporerna indelas

utifrån sättet de utvecklas på (3). De tre divisionerna klassificeras vidare in i klasser,

ordning, familj, släkte och art.

Mögelsvampars egenskaper

De mikroskopiska svamparna excisterar som encellig jästsvamp eller som multicellulära

långa och ofta förgrenade hyfer. Många hyfer tillsammans bildar mycel, vilket skapar

själva mögelkolonin. Beroende på temperatur kan en del svampar anta formen av både

jästsvamp och mögelsvamp, och kallas då dimorph (4).

Mögelsvampar växer med ett fluffigt ull-likt utseende och har aerob metabolism med

liten eller ingen förmåga att växa i anaeroba förhållanden. De flesta växer optimalt vid

30 °C där de börjar bilda vitt mycel som sedan ändrar färg när sporuleringen tar fart (5).

Reproduktion

Mögelsvampar reproducerar sig på två sätt; (I) teleomorpht där två olika haploida celler

fuserar, följt av meiotisk och mitotisk delning, vilket leder till genetisk rekombination

där avkomman blir genetiskt olik, (II) anamorpht där en haploid cell delar sig genom

mitos och avkomman blir genetiskt identisk. Mögelsvamparna använder främst

anamorph reproduktion som har fördelar kortsiktigt, medan de använder teleomorph

reproduktion i exempelvis näringsfattiga miljöer vilket kan leda till högre

överlevnadschanser. Nackdelen med teleomorph reproduktion är att väl anpassade

genetiska drag kan gå förlorade, men vägs upp av att genetisk anpassning till nya

förhållanden möjliggörs (3, 6).

Cellväggens stabilitet

Mögelsvampar har mycket större celler än bakterier och därtill robustare och hårdare

cellväggar. De främsta beståndsdelarna i cellväggen är glukaner, chitin,

galaktomannaner och lipider (7). Kompositionen av dessa varierar mellan arter. Utanför

cellväggen kan fler lager finnas t.ex. ett hydrofobt lager på både hyfer och sporer. Vissa

starkt pigmenterade arter som Aspergillus niger har även ett melaninlager på sporerna

som kan skydda mot oxidativ stress (7, 8).

Virulensfaktorer

Vid de tillfällen mögelsvampar infekterar människor interagerar vissa molekyler i

cellväggen med människans immunförsvar och är således relaterade till mögelsvampars

- 2 -

virulens (7). I både hyfer och sporer kan mykotoxiner bildas som försvar mot

omgivningen. Dessa orsakar direkta skador i människor och kan påverka syntesen av

proteiner, DNA, RNA, eller ändra cellmembranet som leder till försämrade

cellfunktioner eller celldöd. De heterotrofa mögelsvamparna kan även utsöndra

extracellulära enzymer så som proteaser och hydrolaser för nedbrytning av organiskt

material som sedan absorberas genom cellväggen för användning som energi (1).

Proteaserna har en förmåga att i människor bryta ner exempelvis kollagen och elastin

som lungvävnaden till stor del består av (7).

Infektioner med mögelsvamp

Människan exponeras ständigt för mögelsvamparnas sporer som sprids naturligt främst

via luften men finns även i jorden (5, 9). Inhalation av sporer sker oftast obemärkt men

kan orsaka sjukdomar genom allergiska reaktioner, toxikos eller mykos (10).

Friska människor har naturligt skydd mot mögelsvampar genom bland annat torr och

hel hudyta med normal bakterieflora och omsättningen av hudepitelet (11). Primära

infektionsvägen är via luftvägarna. Normalt tar övre luftvägarnas ciliebeklädda epitel

och slem hand om inhalerade sporer, där slemmet innehåller skyddande antimikrobiella

peptider och surfaktanter (12). Hos immunsupprimerade patienter (t.ex.

organtransplanterade) bryts dessa barriärer med följden att mögelsvamparna kan

kolonisera och reproducera sig i människan (11, 13). Hur sjukdomen utvecklar sig beror

bland annat på mängden mögelsvamp och dess förmåga att reproducera sig i vävnaden,

vävnadsskadans storlek samt hur väl fungerande immunförsvaret är hos patienten (11).

Den vanligaste exogena och opportunistiska mögelarten i Sverige är Aspergillus

fumigatus, följt av A.flavus, A.niger och A.terreus. Släktet Aspergillus innehåller över

180 kända arter (5, 9). Mögelinfektioner namnges efter det släkte som orsakar

infektionen, t.ex. aspergillosis, ett samlingsnamn för flera sjukdomar orsakade av

Aspergillus (9). Aspergillom innebär att Aspergillus bildar bollar av hyfer som

koloniserar preformerade kaviteter så som lungor, öron och bihålor utan att angripa

vävnaden.

Aspergillus tillsammans med andra ascomyceter som Fusarium samt zygomyceterna

Rhizopus, Mucor och Rhizomucor kan orsaka disseminerad invasiv infektion framför

allt hos immunsupprimerade patienter. Vanliga symptom är plötslig feber, hosta,

bröstsmärtor och i vissa fall ischemiska cerebrovaskulära symptom (9, 14). Mortaliteten

är hög särskilt om felaktig eller ineffektiv behandling ges. Mögelsvampar uppvisar olika

känslighet mot antimykotika och vissa antimykotika är toxiska eller orsakar svåra

biverkningar. Av dessa anledningar är snabb och korrekt artidentifiering väsentlig (14,

15).

- 3 -

Patientfall med mögelsvamp under 2017 vid Klinisk mikrobiologi i

Kalmar

Klinisk mikrobiologi i Kalmar har ett upptagningsområde på 220 000 invånare. Under

2017 inkom 77110 prover för odling till laboratoriet, varav 72 var positiva för

mögelsvamp. Mest frekventa fynd var A.fumigatus (53%) isolerad från provtyperna

sputum, cornea, hörselgång, bronkoalveolärt lavage (BAL) och bronkialsköljvätska

(figur 1). A.niger (23%) isolerades ofta från sårsekret öra/hörselgångssekret och BAL.

Andra fynd identifierade till släkte var Penicillium spp (9%) isolerad från BAL, sputum

och abscess, Fusarium spp (4%) isolerad från kontinuerlig ambulatorisk peritoneal

dialys (CAPD)-vätska samt Aspergillus spp (1%) isolerad från BAL. Övriga fynd

svarades ut som trådsvamp eller svampart (7% respektive 3%) isolerade från sputum,

BAL och bronkborste.

I figur 1 presenteras fynden i ett taxonomiträd, tillsammans med exempel på

opportunistiska mögelsvampar i de andra divisionerna Zygomycota och Basidiomycota.

Fylogenin är dock ifrågasatt i nyare litteratur.

Figur 1. Taxonomiträd över släkten och arter inom Ascomycota, isolerade från prover inkomna till

Klinisk mikrobiologi i Kalmar under 2017; A.fumigatus (53%), A.niger (23%), Penicillium spp (9%),

Fusarium spp (4%). Exempel på opportunistiska mögelsvampar är presenterade i de andra två

divisionerna Zygomycota och Basidiomycota.

- 4 -

Nuvarande metod för identifiering av mögelsvamp

På Klinisk Mikrobiologi vid Länssjukhuset i Kalmar län utförs artbestämning av

mögelsvampar genom I) makroskopisk bedömning av koloniernas morfologi (färg,

struktur), tillväxthastighet och tillväxttemperatur samt II) mikroskopisk identifiering av

hyfer och reproduktiva strukturer. För att uppfylla kriterierna för artidentifikation krävs

tillräcklig tillväxt och sporulering, vilket kan ta flera dagar (16). Ibland begränsas

identifieringen till släktnivå.

Laboratoriets metod för artidentifiering av bakterier och jästsvamp är analys av

isolatens specifika proteinmönster med matrix-assisted laser desorption ionization time-

of-flight mass spectrometry (MALDI-TOF MS), en snabb och känslig

masspektrometrisk metod (17). Tänkbara fördelar med MALDI-TOF MS som framtida

rutinmetod även för artidentifiering av mögelsvamp, är förkortade svarstider, säkrare

identifiering av fler arter och ett mindre beroende av subjektiv morfologisk bedömning.

MALDI-TOF MS för artidentifiering av mögelsvamp inom klinisk

mikrobiologisk rutinverksamhet

MALDI-TOF MS har revolutionerat identifieringen av bakterier och jästsvamp, men har

hittills fungerat sämre för klinisk rutinmässig identifiering av mögelsvamp (18).

Tillämpningen av MALDI-TOF MS för identifiering av mögelsvamp har i studier

rapporterats försvåras av att mögelkolonier är fenotypiskt heterogena beroende av

samtidig växt av både hyfer och sporer (19). Beroende på mognadsstadie skiljer sig

proteinuttryck och proteinsammansättning (17, 19). Därtill har hyfer och sporer hårda

cellväggar som gör dem motståndskraftiga mot frigörande av intracellulära proteiner

(19, 20). Odlingsbetingelser och valet av preparationsmetod påverkar också kvaliteten

på spektra (21). Därutöver är databaser för mögelsvamp sämre utvecklade.

Det finns flera kommersiella MALDI-TOF MS system framtagna för rutinidentifiering

av mögelsvamp (13). Tillgängligt instrument på Klinisk Mikrobiologi i Kalmar är

Biotyper (Bruker Daltonik) och rutindatabasen som används innehåller vissa spektra för

mögelsvamp. Tillverkaren rekommenderar dock en specialiserad databas som innehåller

fler spektra från mögelsvamp. Studier talar dock för att det finns potential för

förbättringar i befintliga databaser, dels förbättras utfallen vid användning av utökade

in-house-databaser och dels kan korrekt identifiering till lägre score ofta ses (13, 18,

22).

Analysprincip för MALDI-TOF MS

En masspektrometer arbetar under vakuum och är huvudsakligen uppbyggd av en

jonkälla, en massanalysator och en detektor kopplad till ett datasystem (23).

- 5 -

Vid provsättning täcks och kristalliseras provet med en matrixlösning på en

metallprovplatta. Matrixen möjliggör joniseringssteget genom att fungera som en

protondonator då matrixen innehåller en svag organisk syra (24).

I jonkällan exciteras matrixen av en UV-laser (23). Vid övergång till gasfas överförs

protoner från matrix till proteiner som får laddningen +1 (23, 25). Eftersom MALDI är

en så kallad mjuk jonisering sker minimal fragmentering av proteinerna (23). Från

jonkällan accelereras proteinerna i ett spänningsfält mot TOF-massanalysatorn där

proteinerna separeras efter förhållandet mellan massa och laddning (m/z) innan de når

detektorn. Då proteinerna har samma laddning men olika storlek, når små proteiner

detektorn snabbare än stora proteiner. Tiden för proteinernas färd mellan acceleration i

jonkällan till detektorsignal mäts i nanosekunder som omvandlas till massa. Provets

detekterade proteinmassor sammanställs i ett masspektrum vilket jämförs mot kända

arters masspektra i en referensdatabas (23). Hur väl det okända masspektrumet liknar

referensspektra bestäms genom tre faktorer; andelen av topparna från det okända

masspektrumet som matchas mot toppar från masspektra i referensdatabasen, därefter

andelen av topparna från masspektra i referensdatabasen som matchas mot toppar från

det okända masspektrumet och slutligen beräknas överensstämmelsen av topparnas höjd

mellan okänt masspektrum och referensspektra. Resultatet efter multiplicering och

logaritmering av dessa tre faktorer är ett score-värde mellan noll och tre för att se hur

väl provets proteinspektrum stämmer överens med referensspektrum från en känd

mikroorganism (26).

Från tillverkaren rekommenderas klassificering av score-värde mellan 2,3 - 3,0 som

säker släkt- och artidentifiering, score-värde 2,0 – 2,3 som säker släktidentifiering och

trolig artidentifiering, score-värde 1,7 – 2,0 som trolig släktidentifiering och score-värde

< 1,7 som osäker identifiering. När inga masstoppar detekterats ges benämningen ”no

peaks found” (NP) (27).

Vid analys används en positiv kontroll bestående av en bakteriestam och en negativ

kontroll. Positiv kontroll direktappliceras genom att sprida en del av bakteriekolonin på

en metallprovplatta avsedd för instrumentet, som därefter täcks med samma matrix som

proverna. Negativ kontroll består av en tom provposition som täcks med matrix.

Syfte

Studiens syfte var att undersöka om på laboratoriet tillgänglig metod för artidentifiering

av bakterier och jästsvamp med MALDI-TOF MS på ett effektivt sätt kan anpassas och

användas även för identifieringen av snabbväxande mögelsvamp som isoleras från

kliniska prov.

- 6 -

Material och metod

Till studien valdes referensstammarna A.fumigatus, A.terreus, A.flavus och A.niger då

Aspergillus spp är vanligast förekommande i kliniska prover på mikrobiologen i

Kalmar. Valda isolat har under åren 2015-2017 ingått i UK NEQAS externa

kontrollutskick och fanns nedfrysta (-70 °C) på laboratoriet. Till studien valdes ett av de

senast infrysta isolaten av respektive art.

I studien inkluderades också ett isolat från ett patientprov taget från öronsekret där

mögelsvamp växte. Isolatet artbestämdes till A.terreus i faskontrastmikroskop enligt

laboratoriets rutinmetodik av ordinarie personal på laboratoriet. Isolatet användes i

studien som jämförelse mot referensstam A.terreus.

Odling

Mögelsvampmaterial erhölls dels genom odling av nedfrysta sporer eller så spreds

sporer från äldre koloni på det fasta substratet Sabouraud Dextrose Agar med tillsatt

benzylpenicillin och streptomycin (SAB) (bilaga I). Odlingarna inkuberades aerobt

30 °C (± 1°C) fram till analystillfället.

Beredning av lösningar inför provsättning och analys med MALDI-

TOF MS i MicroflexTM

LT

Nya lösningar bereddes i dragskåp inför varje försök.

Standardlösning

I eppendorfrör blandades 475 μL ultrarent vatten (LOTnr BCBH3697V, Sigma-

Aldrich), 25 μL 99 % trifluorättiksyra (TFA, LOTnr STBG1988V, Sigma-Aldrich) och

500 μL 99,9 % acetonitril (LOTnr SZBC278AV, Sigma-Aldrich) enligt anvisningar från

Bruker Daltonik.

Bruksfärdig matrixlösning

Till frystorkad α-cyano-4-hydroxycinnamic acid (HCCA; LOTnr 278008, Bruker

Daltonik GmbH) sattes 250 μL standardlösning enligt anvisningar från Bruker Daltonik.

HCCA-matrixlösningen blandades homogen.

70% myrsyra

I eppendorfrör blandades noggrant 700 μL av 100 % myrsyra (LOTnr SZBB2650V,

Sigma-Aldrich) med 300 μL ultrarent vatten enligt anvisningar från Bruker Daltonik.

- 7 -

Plockteknik och preparationsmetoder

Plocktekniken av mögelmaterial från SAB-plattorna utvärderades genom att använda

plastplatinös 1 μL (VWR, Italien), skalpell (Swann-Morton, England) eller träpinne

(2mm x 14 cm; Oxoid LTD, Storbritannien). Under försöken utvärderades tre olika

preparationsmetoder; (I) fullständig myrsyraextraktion enligt Bruker baserad på deras

Standard Operation Procedure (SOP) för odling och provpreparering av mögelsvamp

(28), (II) direktapplicering av mögelmaterial till provpositioner på en Micro SCOUT

Plate (MSP) 96-brunnars polished steel MALDI provplatta (Bruker Daltonik GmbH).

(29), (III) suspension i ultrarent vatten, baserat på protokoll från Umeå universitet

(personlig kommunikation). Dessa tre preparationsmetoder beskrivs detaljerat i ett

senare avsnitt.

Resultat från frontmycel (kanten på mögelkolonin,

figur 2) jämfördes mot resultat från den centrala

kolonidelen där sporer hade utvecklats i större

utsträckning. Dessa två stadier analyserades hos både

yngre kulturer (1-2 dagar) som äldre kulturer (5-6

dagar). Olika metoder för applicering på MALDI-

provplattan genomfördes.

Fullständig myrsyraextraktion enligt Bruker (I)

Från mögelkolonin suspenderades material i ungefärlig storlek av ca 4-6 mm i diameter

i 300 μL ultrarent vatten (28). För inaktivering av mögelsvampen tillsattes 900 μL 99,5

% etanol (CCS Healthcare AB, Borlänge, Sverige) följt av blandning och centrifugering

(Sigma 1-15, Labex instrument AB, Helsingborg) i två minuter vid 13000 rpm (15200

g) (30). Supernatanten avlägsnades försiktigt genom pipettering följt av centrifugering i

några sekunder. Kvarvarande vätska efter den andra centrifugeringen avlägsnades med

pipett och pelleten torkades vid rumstemperatur. Beroende på pelletens storlek tillsattes

20-50 μL 70 % myrsyra som frigör proteiner genom att penetrera och lösa upp

cellväggen (30). Pelleten suspenderades och därefter tillsattes samma volym 99,9 %

acetonitril (Sigma-Aldrich) för extraktion av proteinerna som därefter suspenderades

(30). Lösningen centrifugerades två minuter vid 13000 rpm. Till en position på

MALDI-provplattan överfördes 1 μL supernatant som efter torkning täcktes med 1 μL

bruksfärdig matrixlösning.

Direktapplicering (II)

En del av mögelkolonin, i storlek av ca 3-4 mm diameter, överfördes direkt till MALDI-

provplattan med 1 μL plastplatinös, skalpell eller träpinne (29). En provposition täcktes

med 1 μL 70 % myrsyra som efter torkning täcktes med 1 μL bruksfärdig matrixlösning.

Suspension (III)

Vid suspensionen doppades en bomullspinne i ultrarent vatten och gnuggades på

mögelkolonin. Mögelmaterialet från bomullspinnen suspenderades i 300 μL ultrarent

vatten förberett i eppendorfrör och blandades. En provposition på MALDI-provplattan

- 8 -

täcktes med 1 μL av suspensionen. Provet täcktes efter torkning med 1 μL 70 %

myrsyra, som efter torkning täcktes med 1 μL bruksfärdig matrixlösning.

Identifiering med MALDI-TOF MS i MicroflexTM

LT

Identifieringen av mögelsvamparna utfördes med en MALDI-TOF MicroflexTM

LT

masspektrometer (Bruker Daltonik GmbH) utrustad med en nitrogenlaser som

emitterade UV-ljus vid 337 nm och en linjär detektor. Analyserna utfördes med

standardinställningar (40 laserpulser per sekund; totalt 240 pulser för en provposition,

vacuum < 5,0e-6

mbar för analys och ett m/z intervall på 2-20 kDa lämpligt för

detektion av mögelsvamparnas proteiner) (31-33). Programvaran FlexControl Version

3.4 (Bruker Daltonik GmbH) användes för att sätta in och ta ut MALDI-provplattan

samt för avläsning av vacuum. Programvaran Maldi Biotyper RTC Version 3.1 (Bruker

Daltonik GmbH) användes för analys av proverna och bearbetning av resultat.

Referensdatabaser

Erhållna spektra jämfördes mot referensspektra i databasen MALDI Biotyper BDAL

6903 (Bruker Daltonik GmbH) som innehåller två spektra från A.flavus, fem från

A.fumigatus, sex från A.niger och två från A.terreus.

Vid ett tillfälle skickades erhållna spektra (försök 1-6) till Bruker Daltonik i Danmark,

som var behjälpliga och utförde jämförelse mot referensspektra i MALDI Biotyper

Filamentous Fungi-library Version 1.0 (Bruker Daltonik GmbH) som innehåller 364

spektra från 110 mögelarter.

Kontroller

I samband med analys av mögelsvamparna analyserades även en positiv och en negativ

kontroll.

Positiv kontroll

Referensstammen Staphylococcus aureus CCUG 15915 spreds med steril plastplatinös

1 μL på blodagarplatta och inkuberades aerobt över natt i 37 °C. Vid analys

direktapplicerades dagsfärsk koloni på en provposition på MALDI-provplattan och

täcktes med 1 μL bruksfärdig matrixlösning inom tio minuter. Analys utfördes med

MALDI-TOF MS i MicroflexTM

LT i samband med försök 1-8 för kontroll av

instrumentet.

Negativ kontroll

Vid försök 1-6 användes ingen negativ kontroll. Vid försök 7 och 8 pipetterades 1 μL

70% myrsyra och 1 μL bruksfärdig matrixlösning till varsin position för att utesluta

kontamination av använda lösningar samt dåligt tvättade MALDI-provplattor.

- 9 -

Kalibrering

MicroflexTM

LT kalibreras en gång i veckan mot Bacterial Test Standard (BTS; Bruker

Daltonik, bestående av frystorkad Escherichia coli DH5 α samt proteinerna RNase A

och myoglobin), enligt rutiner på laboratoriet. Kalibrering utfördes således inte specifikt

för studien.

Etik

Klinisk stam identitetsmärktes utan koppling till patientdata efter artbestämning i

mikroskop. Detta för att skydda patientens integritet. Provet destruerades enligt rutiner

på laboratoriet.

Resultat

Redovisning av score-resultat

Även lägre score än de som tillverkaren rekommenderar för artidentifiering redovisas i

resultaten (tabell II-IV). Instrumentet anger score-värden med tre decimaler. I tabellerna

presenteras faktiskt uppnått score-värde med en decimal. För prover som inte givits

någon tolkning på grund av avsaknad av tolkningsbart spektrum anges resultatet NP.

Vid en sammantagen bedömning av resultatet utan att ta hänsyn till databas,

plockteknik, preparationsmetod, kulturernas ålder och fördelning mellan sporer och

frontmycel blev 46/53 artbestämningar med score 1,4 korrekta medan 26/26 av

artbestämningarna var korrekta med score 1,5 och 1,6. Träffar som inte nådde score 1,5

redovisades därför inte utan anges som ”L” (låg score) i resultattabellerna (tabell II-IV).

För score 1,6-2,0 var 91/91 av artbestämningarna korrekta. För score > 2,0, vilket är

tillverkarens gräns för artidentifiering, var 20/20 av angiven artmatchning med högsta

score korrekt för de fyra analyserade arterna.

Motivering till förändringar under studien

I försök 1-2 jämfördes direktapplicering (II) mot suspension i ultrarent vatten (III) på 1,

2 och 3 dagars kulturer av de fyra referensstammarna A.fumigatus, A.terreus, A.niger

och A.flavus. Varken direktapplicering (II) eller suspension (III) av 1 och 2 dagars

kulturer erhöll något spektra (NP) (tabell V-VI; bilaga II). Identifieringen av 3 dagars

kulturer blev korrekt för referensstammarna A.fumigatus och A.terreus, men felaktig för

referensstammarna A.niger och A.flavus (tabell V-VI; bilaga II).

Utifrån dessa resultat beslutades att korrekt identifierade arter (A.terreus och

A.fumigatus) skulle ingå i fortsatta försök tillsammans med det kliniska isolatet

A.terreus. Då direktappliceringen (II) gav något fler identifieringar och högre score

jämfört med suspension i ultrarent vatten (III), valdes direktapplicering (II) till fortsatta

- 10 -

försök, som en ”snabbare” preparationsmetod att jämföra mot fullständig

myrsyraextraktion (I).

I försök 3-8 jämfördes således direktapplicering (II) mot fullständig myrsyraextraktion

(I) på yngre (1-2 dagar; tabell II-IV a) och äldre (5-6 dagar; tabell II-IV b) kulturer av

referensstammarna A.fumigatus, A.terreus samt det kliniska isolatet A.terreus.

Fullständig myrsyraextraktion (I) tillämpades först efter uteslutning av A.niger och

A.flavus.

Referensstam A.fumigatus Yngre kulturers direktöverförda (II) sporer av referensstam A.fumigatus

artidentifierades i 8 fall av 18 (44%) med BDAL, 3/12 fall (25%) med Fungi-library

(tabell II a). Fullständig myrsyraextraktion (I) av sporer artidentifierades i 8/24

positioner (33%) med BDAL, 4/16 fall (25%) med Fungi-library. Direktöverfört (II)

frontmycel artidentifierades i 1/18 positioner (6%) med BDAL, 1/12 (8%) med Fungi-

library, fullständig myrsyraextraktion (I) av frontmycel identifierades i 1/20 fall (5%)

med BDAL, 1/12 (8%) identifierades med Fungi-library.

Äldre kulturers direktöverförda (II) sporer av referensstam A.fumigatus artidentifierades

korrekt i 6 fall av 18 (33%) med BDAL-databasen men inte alls med Fungi-library

(tabell II b). Fullständig myrsyraextraktion (I) av sporer artidentifierades varken med

Tabell II a. Yngre kultur (1-2 dagar) referensstam A.fumigatus med score-värden och tolkningar av

resultaten. Vid direktöverföringen sattes sporer och frontmycel i triplikat på MALDI-provplattan.

Fullständig myrsyraextraktion enligt Bruker utfördes parallellt i dubbla rör och varje rörs suspension

sattes i duplikat på MALDI-provplattan. Identifiering med score ≥ 1,5 är grönmarkerat. Score < 1,5

anses vara osäker artidentifiering och har ersatts med ”L” (låg). NP står för No Peaks found och innebär

att inget spektrum erhållits. Ej utförd analys har lämnats blankt. Den direktapplicerade positiva

kontrollen S.aureus CCUG 15915 är presenterad med erhållet score-värde från försök 3-8.

Notering:

Försök 3: Supernatanten dekanterades efter första centrifugeringen. Försök 4: Mer material erhölls än i övriga försök.

2 dagar kulturer i försök 3, 6, 7, 8

1 dagars kulturer i försök 4 och 5

Kontroll

Plockteknik Försök Databas

BDAL 1,6 1,6 1,8 NP NP NP 1,7 NP NP 1,7 NP NP NP NP

Fungi-library L L L NP NP NP L NP NP L NP NP NP NP

BDAL NP NP NP NP NP NP NP NP NP NP

Fungi-library NP NP NP NP NP NP NP NP NP NP

BDAL NP NP NP NP NP NP 1,8 NP 1,7 1,9 1,5 NP NP NP

Fungi-library NP NP NP NP NP NP 2,3 NP 2,3 2,3 1,7 NP NP NP

BDAL 1,5 1,6 L NP 1,7 NP L 1,6 1,7 L NP NP NP NP

Fungi-library 1,6 1,5 1,5 NP 2,3 NP L L 1,6 L NP NP NP NP

BDAL 1,5 NP NP NP NP NP NP 1,8 L L NP NP NP NP

Fungi-library

BDAL L 1,7 1,7 NP NP NP L L L L NP NP NP NP

Fungi-library

2,4

2,5

2,4

2,2

2,1

2,4

Front extraktion

Rör 1 Rör 2 Rör 1 Rör 2

8

Spor direkt Front direkt Spor extraktion

3

4

5

6

7

Yngre kultur A.fumigatus

Träpinne

Träpinne

Platinös

Skalpell

Träpinne

Träpinne

- 11 -

BDAL eller Fungi-library. Direktöverfört (II) frontmycel identifierades i 8/15 positioner

(53%) med BDAL men inte med Fungi-library (0/9). Fullständig myrsyraextraktion (I)

av frontmycel identifierades vid några tillfällen 3/16 (19%) med BDAL, respektive 1/8

(13%) med Fungi-library.

Tabell II b. Äldre kultur (5-6 dagar) referensstam A.fumigatus med score-värden och tolkningar av


Fullständig myrsyraextraktion enligt Bruker utfördes parallellt i dubbla rör och varje rörs suspension sattes

i duplikat på MALDI-provplattan. Identifiering med score ≥ 1,5 är grönmarkerat. Score < 1,5 anses vara

osäker artidentifiering och har ersatts med ”L” (låg). NP står för No Peaks found och innebär att inget

spektrum erhållits. Ej utförd analys har lämnats blankt. Den direktapplicerade positiva kontrollen S.aureus

CCUG 15915 är presenterad med erhållet score-värde från försök 3-8.

Notering:

- Försök 3: Supernatanten dekanterades efter första centrifugeringen.

- Försök 4: Mer material erhölls än i övriga försök. - 6 dagar kulturer i försök 3, 4, 6, 8

- 5 dagar kulturer i försök 5 och 7

Kontroll


BDAL L 1,6 L L L L L L NP NP

Fungi-library L L L L L L L L NP NP

BDAL 1,6 L 1,5 L NP NP NP

Fungi-library L L L L NP NP NP

BDAL 1,6 L 1,5 L 1,6 1,7 L L L L 1,5 L L L

Fungi-library L L L L L L L L L L 1,6 L L L

BDAL NP NP NP 1,6 1,8 NP L L L L L L 1,6 NP

Fungi-library NP NP NP L L NP L L L L L L L NP

BDAL NP NP NP L 1,7 1,7 L L L L NP 1,5 L L

Fungi-library

BDAL 1,6 L L L 1,7 1,5 L L L L NP NP L L

Fungi-library2,1

2,4

2,4

2,5

2,4

2,2

Front extraktion


8

Spor direkt Front direkt Spor extraktion

3

4

5

6

7

Träpinne

Träpinne

Träpinne

Träpinne

Platinös

Äldre kultur A.fumigatus

Skalpell

- 12 -

Referensstam A.terreus

Yngre kulturers direktöverförda (II) sporer av referensstam A.terreus artidentifierades i

4/18 fall (22%) med BDAL och i 1/12 fall (8%) med Fungi-library (tabell III a).

Fullständig myrsyraextraktion (I) av sporer artidentifierades i 12/24 fall (50%) med

BDAL och i 5/16 fall (31%) med Fungi-library. Direktöverfört (II) frontmycel

artidentifierades varken med BDAL eller Fungi-library. Fullständig myrsyrextraktion (I)

av frontmycel artidentifierades inte alls med BDAL (0/20), medan 3/12 (25%)

artidentifierades med Fungi-library.

Tabell III a. Yngre kultur (1-2 dagar) referensstam A.terreus med score-värden och tolkningar av


Fullständig myrsyraextraktion utfördes parallellt i dubbla rör och varje rörs suspension sattes i duplikat

på MALDI-provplattan. Identifiering med score ≥ 1,5 är grönmarkerat. Score < 1,5 anses vara osäker

artidentifiering och har ersatts med ”L” (låg). NP står för No Peaks found och innebär att inget

spektrum erhållits. Ej utförd analys har lämnats blankt. Den direktapplicerade positiva kontrollen

S.aureus CCUG 15915 är presenterad med erhållet score-värde från försök 3-8.

Notering: Försök 3: Supernatanten dekanterades efter första centrifugeringen.

Försök 4: Mer material erhölls än i övriga försök.

2 dagar kulturer i försök 3, 6, 7, 8 1 dagars kulturer i försök 4 och 5

Kontroll


BDAL NP L 1,7 NP NP NP 1,6 1,6 1,7 1,7 NP NP NP NP

Fungi-library NP L L NP NP NP L L L L NP NP NP NP

BDAL NP NP NP NP NP NP L L L L

Fungi-library NP NP NP NP NP NP 2,2 2,2 2,3 2,3

BDAL NP NP L NP NP NP NP NP NP NP L NP L L

Fungi-library NP NP 2,2 NP NP NP NP NP NP NP 2,1 NP 2,2 2,2

BDAL NP NP NP NP NP NP NP NP L 1,6 NP NP NP NP

Fungi-library NP NP NP NP NP NP NP NP 1,6 L NP NP NP NP

BDAL 1,6 1,5 L NP NP NP 1,5 L 1,8 1,6 NP NP NP NP

Fungi-library

BDAL L 1,5 L NP NP NP 1,5 1,6 1,5 1,5 L NP NP NP

Fungi-library

2,4

2,2

2,1

2,4

2,4

2,5

Spor direkt

3

4

5

6

Front direkt Spor extraktion Front extraktion


Yngre kultur A.terreus

Platinös

7

8Träpinne

Skalpell

Träpinne

Träpinne

Träpinne

- 13 -

Äldre kulturers direktapplicerade (II) sporer av referensstam A.terreus artidentifierades i

13 fall av 18 (72%) med BDAL men inte alls med Fungi-library (0/12) (tabell III b).

Fullständig myrsyraextraktion (I) av sporer artidentifierades i 16/24 fall (67%) med

BDAL, men inte alls med Fungi-library (0/16). Direktapplicerat (II) frontmycel

identifierades i 8/15 fall (53%) med BDAL och 2/9 (22%) identifierades med Fungi-

library. Fullständig myrsyraextraktion (I) av frontmycel artidentifierades i 9/16 fall

(56%) med BDAL och i 3/8 fall (38%) med Fungi-library.

Tabell III b. Äldre kultur (5-6 dagar) referensstam A.terreus med score-värden och tolkningar av




artidentifiering och har ersatts med ”L” (låg). NP står för No Peaks found och innebär att inget spektrum

erhållits. Ej utförd analys har lämnats blankt. Den direktapplicerade positiva kontrollen S.aureus CCUG

15915 är presenterad med erhållet score-värde från försök 3-8.

Notering:

- Försök 3: Supernatanten dekanterades efter första centrifugeringen.

- Försök 4: Mer material erhölls än i övriga försök. - 6 dagar kulturer i försök 3, 4, 6, 8

- 5 dagar kulturer i försök 5 och 7

Kontroll


BDAL L 1,6 1,7 1,5 1,7 L 1,6 L NP NP

Fungi-library L L L L L L L L NP NP

BDAL 1,5 1,8 1,5 1,7 NP 1,6 1,7

Fungi-library L L L L NP L L

BDAL 2,0 1,9 1,9 L L L 1,8 1,9 1,8 1,8 1,6 L L L

Fungi-library L L L 1,7 1,5 L L L L L 1,6 L L 1,8

BDAL NP 1,6 1,7 1,6 L NP 1,9 1,7 1,6 1,7 1,8 1,7 1,8 1,8

Fungi-library NP L L L L NP L L L L L L 1,5 L

BDAL L NP NP NP 1,7 1,6 NP NP NP NP L L L L

Fungi-library

BDAL 1,9 1,9 1,7 1,7 1,7 1,5 1,6 1,7 1,8 1,7 1,6 1,5 1,7 1,6

Fungi-library2,1

2,4

2,4

2,5

2,4

2,2

Spor extraktion

Rör 1 Rör 2

Spor direkt Front direkt Front extraktion

Rör 1 Rör 2

3

Äldre kultur A.terreus

Platinös

5

6

7

8

Träpinne

Träpinne

Träpinne

4Skalpell

Träpinne

- 14 -

A.terreus kliniskt isolat

Yngre kulturers direktapplicerade (II) sporer av det kliniska isolatet A.terreus

artidentifierades varken med BDAL eller Fungi-library (tabell IV a). Fullständig

myrsyraextraktion (I) av sporer identifierades inte med BDAL (0/24), men med Fungi-

library i 8/16 fall (50%). Direktapplicerat (II) frontmycel identifierades i varken BDAL

eller Fungi-library. Fullständig myrsyraextraktion (I) av frontmycel identifierades aldrig

med BDAL (0/16), men i 1/8 fall (13%) med Fungi-library.

Tabell IV a. Yngre kultur (1-2 dagar) A.terreus kliniskt isolat med score-värden och tolkningar av




artidentifiering och har ersatts med ”L” (låg). NP står för No Peaks found och innebär att inget



Notering:

Försök 3: Supernatanten dekanterades efter första centrifugeringen. Försök 4: Mer material erhölls än i övriga försök.

2 dagar kulturer i försök 3, 6, 7, 8

1 dagars kulturer i försök 4 och 5

Kontroll


BDAL NP L NP NP NP NP NP NP NP NP

Fungi-library NP L NP NP NP NP NP NP NP NP

BDAL NP NP NP L NP NP L NP NP NP

Fungi-library NP NP NP L NP NP 2,0 NP NP NP

BDAL NP NP NP L NP NP L L L L L NP NP NP

Fungi-library NP NP NP NP NP NP 2,3 2,3 2,3 2,3 2,1 NP NP NP

BDAL NP NP NP NP NP NP L L NP L NP NP NP NP

Fungi-library NP NP NP NP NP NP 1,9 1,9 NP 2,0 NP NP NP NP

BDAL NP NP NP NP NP NP L NP L NP NP NP NP NP

Fungi-library

BDAL NP NP NP NP NP NP L L NP NP NP L NP NP

Fungi-library2,1

2,4

2,4

2,5

2,4

2,23

4

5

6

7

8

Träpinne

Träpinne

Träpinne

Skalpell

Träpinne


Platinös

Spor direkt Front direkt Spor extraktion Front extraktionYngre kultur A.terreus prov

- 15 -

Äldre kulturers direktapplicerade (II) sporer av det kliniska isolatet A.terreus

artidentifierades i 3 fall av 18 (17%) med BDAL men inte alls med Fungi-library (0/12)

(tabell IV b).Fullständig myrsyraextraktion (I) av sporer artidentifierades i 1/24 fall

(4%) med BDAL men inte med Fungi-library (0/16). Direktapplicerat (II) frontmycel

identifierades med varken BDAL eller Fungi-library. Fullständig myrsyraextraktion (I)

av frontmycel identifierades aldrig med BDAL (0/16) men i 3/8 fall (38%) med Fungi-

library.

Kontroller och kalibrering

Den positiva kontrollen S.aureus CCUG 15915, analyserad i försök 1-8, gav score > 2,0

vid samtliga analyser (tabell I). Resultatet från försök 3-8 presenteras även i

resultattabell II-IV som visar resultatet från analys av mögelsvamparna. Negativ

kontroll av matrix och myrsyra i försök 7 och 8 gav resultatet NP. Negativ kontroll

analyserades inte i försök 1-6. Kalibrering av MicroflexTM

LT noterades godkänd innan

analys.

Tabell IV b. Äldre kultur (5-6 dagar) A.terreus kliniskt isolat med score-värden och tolkningar av

resultaten. Vid direktappliceringen (II) sattes sporer och frontmycel i triplikat på MALDI-provplattan.

Fullständig myrsyraextraktion (I) utfördes parallellt i dubbla rör och varje rörs suspension sattes i

duplikat på MALDI-provplattan. Identifiering med score ≥ 1,5 är grönmarkerat. Score < 1,5 anses vara

osäker artidentifiering och har ersatts med ”L” (låg). NP står för No Peaks found och innebär att inget



Notering: - Försök 3: Supernatanten dekanterades efter första centrifugeringen.

- Försök 4: Mer material erhölls än i övriga försök.

- 6 dagar kulturer i försök 3, 4, 6, 8 - 5 dagar kulturer i försök 5 och 7

Kontroll


BDAL NP NP L NP NP NP NP L L L

Fungi-library NP NP L NP NP NP NP L L L

BDAL L 1,5 NP L L L L L NP NP

Fungi-library L L NP L L L L L NP NP

BDAL L L L NP NP NP L L L L NP NP NP L

Fungi-library L L L NP NP NP L L L L NP NP NP L

BDAL L NP NP NP NP NP L L L L L L L L

Fungi-library L NP NP NP NP NP L L L L 1,7 1,8 1,7 L

BDAL L L 1,5 L L L 1,6 L L L L NP NP NP

Fungi-library

BDAL 1,5 L L NP NP NP L L L L L L L L

Fungi-library2,1

2,4

2,4

2,5

2,4

2,2

4

5

Platinös

Skalpell

Träpinne

7

8

6Träpinne

Träpinne

Träpinne


3

Spor direkt Front direkt Spor extraktion Front extraktionÄldre kultur A.terreus prov

Tabell I. Score-värden över positiva kontrollen S.aureus CCUG 15915 analyserad i

försök 1-8.

Försök 1 Försök 2 Försök 3 Försök 4 Försök 5 Försök 6 Försök 7 Försök 8

2,4 2,3 2,2 2,4 2,5 2,4 2,4 2,1

Positiv kontroll S.aureus CCUG 15915

- 16 -

Diskussion

Trots att MALDI-TOF MS snabbt har blivit rutinmetod för artidentifiering av bakterier

och jästsvamp på kliniska laboratorier används tekniken ännu inte för mögelsvamp på

de flesta kliniska mikrobiologiska laboratorierna i Sverige. Studien syftade till att

undersöka och försöka påverka faktorer som försvårar användningen av just MALDI-

TOF MS för identifierng av mögelsvamp.

I början av studien (försök 1-2) testades fyra referensstammar. Utifrån resultaten från

dessa två försök beslutades att fortsättningsvis använda de arter som blivit korrekt

identifierade (referensstammarna A.fumigatus och A.terreus). Referensstammarna

A.niger och A.flavus blev felaktigt identifierade i båda försöken och uteslöts därmed för

fortsatta studier.

Plockteknik och homogenisering av material

Från resultaten i försök 1-2 där direktapplicering (II) jämfördes mot suspension i

ultrarent vatten (III), beslutades att utesluta suspension i fortsatta försök då något sämre

resultat erhållits med denna preparationsmetod.

Största problemet under studien var att få upp material från mögelodlingar på

agarplattor, i andra hand att få mögelmaterialet homogent fördelat vid direktapplicering

och extraktion. Kolonimaterial togs med hjälp av plastplatinös, skalpell och träpinne.

Subjektivt var det mest tillfredsställande verktyget träpinnen. Kolonimaterialet

ansamlades och fångades upp lättare med träpinnens breda yta och den var lättare att

manövrera än en böjlig plastplatinös. Likvärdiga resultat kunde iakttas med

plastplatinös, men det är svårbedömt då platinösen utvärderades vid färre tillfällen. Viss

progression sågs genom försöken och berodde delvis på den mänskliga faktorn, där

erfarenhet och träning gällande plockning av material gav förbättrade resultat över tid.

Skalpellen testades i ett försök att erhålla mer material än vad som erhölls med platinös.

Med skalpell var det lättare att ta upp större mängder kolonimaterial men mera

tidskrävande. Det var även svårt att undvika agar som kan störa i analysen (16).

Den morfologiska skillnaden mellan referensstam A.terreus och kliniskt isolat A.terreus

märktes vid upptagningen av kolonierna från odlingsplattan. Kliniska isolatet A.terreus

var enkel att plocka med sammanhängande sjok av mycel, men svårare att

homogenisera vid prepareringen. Referensstam A.terreus var tvärtom svårare att plocka

men lättare att homogenisera. Mellan de två isolaten av A.terreus kunde ses att

referensstammen gav betydligt fler träffar än det kliniska isolatet, framför allt vid

jämförelse av de äldre kulturerna. Sämre resultat för kliniskt isolat kan bero på den

morfologiska skillnaden som förmodligen kommer av olika proteinuttryck. Dock gav

yngre kultur av kliniskt isolat i försök 5 höga score, över 2,0, med Fungi Library, vilket

kan tyda på att plockning och preparering förmodligen spelar stor roll för resultatet.

- 17 -

Referensstam A.fumigatus var svår att plocka men något lättare att homogenisera vid

prepareringen. Svårigheter att plocka kolonimaterial är främsta anledningen att flertalet

provpositioner överlag gav resultatet NP. Annars kan NP ha uppstått på grund av ojämn

provsättning på MALDI-provplattan som medförde för lite proteiner till detektion.

Sammanfattningsvis har svårigheterna att samla tillräckligt med kolonimaterial och att

fördela det i lämplig mängd och homogent över MALDI-provplattan gett mycket

varierande resultat. Detta gör att utvärderingen av andra parametrar endast är

preliminär.

Jämförelse av suspension, direktapplicering och fullständig myrsyra-

extraktion

Efter de två första försöken, som jämförde direktapplicering (II) och suspension i

ultrarent vatten (III), beslutades att suspension i ultrarent vatten togs bort som

preparationsmetod för fortsatta försök i denna studie. Direktapplicering (II) valdes som

den ”snabbare” preparationsmetoden att jämföra mot fullständig myrsyraextraktion (I).

I början av studien (försök 1-2) testades fyra referensstammar. Utifrån resultaten

bestämdes att använda korrekt identifierade arter (referensstammarna A.fumigatus och

A.terreus) tillsammans med kliniskt isolat A.terreus. A.niger och A.flavus uteslöts då de

blev felaktigt identifierade och preparerades således aldrig med fullständig

myrsyraextraktion (I). Möjligen skulle A.niger och A.flavus kunna bli korrekt

identifierade genom fullständig myrsyraextraktion, eftersom denna preparationsmetod

rekommenderas av tillverkaren i de fall direktapplicering inte fungerar.

Ingen större skillnad i score-värden mellan frontmycel och sporer erhölls vid

direktappliceringen, mer än att frontmycel oftare inte gav något spektrum, troligen

beroende på för lite material. Vid vissa tillfällen hjälpte extrahering (exempelvis yngre

kulturer för båda isolaten A.terreus; tabell IIIa och IVa) medan i andra fall var

direktapplicering tillräcklig (exempelvis äldre kultur referensstam A.fumigatus; tabell

IIb).

Då referensspektra i både BDAL och Filamentous Fungi library skapats genom

fullständig proteinextraktion förväntades högst överensstämmelse av spektra från

mögelsvampar som preparerats med just fullständig myrsyraextraktion (20). Score ≥ 2,0

erhölls i högre utsträckning med extraktion, men uppnåddes i enstaka fall även vid

direktapplicering. Den fullständig myrsyraextraktionen är ett lämpligt val vid fortsatta

försök gällande plocktekniken, eftersom preparationen påverkar kvaliteten på spektra

(22).

Skillnader mellan databaser

En intressant iakttagelse var att säkerheten i träffarna varierade mellan BDAL och

Fungi-library, exempelvis för yngre kultur referensstam A.terreus (försök 3 och 4; tabell

- 18 -

III a), yngre kultur referensstam A.fumigatus (försök 3 och 5; tabell II a), yngre kultur

A.terreus kliniskt isolat (försök 4-6; tabell IV a) samt äldre kultur referensstam

A.terreus (försök 5 och 6; tabell III b). Skillnaden kan bero på att spektra i BDAL

respektive Fungi-library är från mögelkulturer med olika odlingsbetingelser. Enligt

personlig kommunikation med representant för tillverkaren har konstaterats att spektra i

BDAL är från mögelkulturer odlade på agarplattor medan spektra i Fungi-library är från

mögelkulturer odlade i buljong. Buljongodlingens fördel är att homogen växt av mycel

erhålls med liten produktion av sporer, medan agarplattor ger fler växtfaser. Olika

växtfaser ger i sin tur oftast olika spektra (22).

Vid försök till sporpreparation från de yngsta kulturerna (1 dagar) kan materialet ändå

till stor del ha bestått av mycel. Detta kan förklara varför överensstämmelse med Fungi-

library var bättre då databasen är baserad på proteinmönster från ungt mycel.

Spektra som erhållit lägre score mellan 1,5 och 1,7 skulle kunna vara av god kvalitet,

men matchar inte referensspektra i databasen BDAL och/eller Fungi Library, vilket kan

tyda på att databaserna behöver utökas med fler spektra över och inom arter (27).

Avsaknad av tillräckligt antal spektra från mögelsvamp är en nackdel som försvårar

identifiering av kliniska isolat med MALDI-TOF MS. Då en stor andel av proverna fick

resultatet NP finns en viss osäkerhet i bedömningen av databaserna.

Den av tillverkaren rekommenderade cut-off gränsen för artidentifiering är satt till score

≥ 2,0. Studier visar att en sänkning av cut-off från 2,0 till 1,7 kan användas för

artidentifiering och ökar antalet korrekta artidentifieringar för vissa isolat (13, 16).

Resultaten i denna studie visade att score 1,5 till och med 1,7 för just dessa fyra

stammar gav rätt artidentifiering. Det kan vara av intresse att utvärdera den kliniska

betydelsen av lägre score-gränser för tidig rapport av preliminära resultat.

Tillväxtfas och fördelning av mycel respektive sporer

Det klinska isolatet A.terreus och referensstam A.terreus skiljde sig åt morfologiskt

gällande koloniernas struktur och färgnyans, samt att kliniskt isolat A.terreus hade

bredare frontmycel. Referensstam A.fumigatus hade smalast frontmycel med snabbare

sporulering. Generellt resulterade detta i att sporer mestadels analyserades tillsammans

med frontmycel på äldre kulturer. Vid lägre mängd inokulat sågs viss tendens till

bredare frontmycel eller frontmycel under något längre tid.

Frontmycel gav generellt färre träffar än sporer vid både direktapplicering och

extraktion av äldre och yngre kultur, förmodligen främst beroende på att för lite material

erhållits till analys. Med äldre kulturer, exempelvis referensstam A.fumigatus försök 6

och 7; tabell II b, sågs enstaka fall där frontmycel gav bättre resultat än sporer. Orsaken

till detta är oklart. Oberoende av preparationsmetod var äldre sporer benägna att

artidentifieras i BDAL till lägre score men identifierades inte i Fungi-library.

Yngre kulturers sporer erhöll oftast över score 2,0 med Fungi-library, men lägre score

med BDAL, eller blev inte alls identifierade med någon av databaserna. Detta kan bero

- 19 -

på att yngre kulturers sporer snarare främst bestod av frontmycel med olika grad av

sporulering och att erhållna spektra därför stämmer bättre överens med referensspektra i

Fungi-library. Detta kunde studeras vid mikroskopering, utförd under enstaka tillfällen

för de olika mognadsstadierna. Score > 2,0 sågs endast för de allra yngsta sporerna (1

dag) analyserad med Fungi-library. Det analyserade sporstadiet bestod snarare av mycel

och de höga score-värdena kommer antagligen av god överensstämmelse mot spektra i

Fungi-library som är framtagna på ungt mycel. De två dagar gamla sporerna gav

generellt lägre score.

En avvikande resultat sågs i försök 3 (tabell II a, III a) där score-värdet för yngre sporer

blev sämre med Fungi-library, vilket kan ha berott på att kvarvarande etanol från

extraheringen störde analysen. Fenomenet kunde dock inte förklaras av samma orsak i

direktappliceringen, eftersom ingen etanol användes. Orsaken till sämre resultat med

Fungi-library förblev oklar.

Kontroll

Den direktapplicerade positiva kontrollen S.aureus CCUG 15915 fick score-värde > 2,0

(tabell I) i samtliga analyser. Detta utesluter instrumentella fel som orsak till de sämre

resultat som erhölls vid analys av mögelsvamparna.

Problem och förbättringsförslag

En del problem tillstötte under studien som att stor del av mögelkulturerna

kontaminerades och att stora svårigheter fanns i att plocka upp mögelmaterial och

samtidigt undvika agar. Kontamineringarna löstes med förbättrad arbetsstruktur vid

odling och provsättning på MALDI-provplatta och plocktekniken optimerades med

träpinnen. Agar var vid en del tillfällen svårt att undvika och kan, som tidigare nämnts,

mycket väl ha stört analyserna.

För att eliminera misstänkt ojämn provsättning på MALDI-provplattan skulle upprepade

analyser på samma applicerade material kunna utföras, exempelvis där score < 1,7

erhållits. Extraktionen i denna studie har endast använt 70% myrsyra för att lysera

cellväggen hos mögelsvampar. Olika koncentrationer skulle kunna testas då arter

kanske kräver olika koncentration med tanke på kompositionsskillnader i cellväggen.

TFA, som Bruker rekommenderar för sporbildande mikroorganismer, skulle kunna

testas i olika koncentrationer (29).

Vid fortsatta studier kan optimering för en art vara aktuellt. En fungerande metod kan

sedan testas på fler kliniska stammar och en bredare kollektion av kliniskt relevanta

arter. För att förkorta svarstiderna borde optimering utföras på yngre kolonier,

exempelvis 1 och 2 dagar. Eventuellt skulle suspension i destillerat vatten (III) kunna

utvärderas vidare tillsammans med direktapplicering (II), då det är intressant för

laboratoriet att använda en mindre tidskrävande metod än fullständig myrsyraextraktion

(I). Studier bör utföras som värderar betydelsen av olika beslutsregler för identifiering,

- 20 -

t.ex. vad gäller score-gränser, antal träffar per art och värdering av blandade träffbilder.

Först därefter kan en klinisk rutinmetod anpassad till förhållandena vid det kliniskt

mikrobiologiska laboratoriet i Kalmar utarbetas, samt utvärdera fördelar och risker med

denna metod jämfört med nuvarande metodik.

Slutsats

I studien undersöktes hur artidentifieringen av mögelsvamp påverkas från val av olika

preparationsmetoder och användning av olika databaser. Med BDAL tenderade sporer

generera fler identifieringar än frontmycel oavsett ålder på kulturen. Med Filamentous

Fungi Library visades en tendens till bättre score, framför allt för yngre kulturer. Detta

kan ha stor klinisk betydelse eftersom tiden till artdiagnos förkortas om analys kan

utföras utan en lång tillväxt- och mognadsfas. Fler försök krävs för optimering av

MALDI-TOF MS, främst vad gäller provpreparering men även eventuellt

införskaffande av Filamentous Fungi library, innan metoden kan tas i bruk för

identifiering av mögelsvamp på Klinisk mikrobiologi i Kalmar.

Tack

Jag vill tacka avdelningen för Klinisk mikrobiologi och vårdhygien vid länssjukhuset i

Kalmar som öppnade plats för mitt examensarbete. Särskilt tack till Annika Wistedt för

din handledning på plats. Tack till Britt-Inger Marklund för den feedback du gett i mitt

skrivande. …………………………………………….

- 21 -

Referenser 1. Kavanagh K. Fungi : biology and applications. 2nd ed. Hoboken, NJ: John Wiley & Sons; 2011.

2. Liu D. Molecular Detection of Human Fungal Pathogens. 2011.

3. Schaechter M. Encyclopedia of microbiology. 3rd ed. Amsterdam ; Boston: Elsevier/Academic

Press; 2009.

4. Webster J, Weber RWS. Introduction to fungi. 3rd ed. Cambridge: Cambridge University Press;

2007.

5. Larone DH. Medically important fungi : a guide to identification. 5th ed. Washington, DC: ASM

Press; 2011.

6. Ene I, J Bennett R. The Cryptic Sexual Strategies of Human Fungal Pathogens. 2014.

7. Abad A, Fernandez-Molina JV, Bikandi J, Ramirez A, Margareto J, Sendino J, et al. What

makes Aspergillus fumigatus a successful pathogen? Genes and molecules involved in invasive

aspergillosis. Rev Iberoam Micol. 2010 Oct-Dec;27(4):155-82.

8. Rizzato C, Lombardi L, Zoppo M, Lupetti A, Tavanti A. Pushing the Limits of MALDI-TOF

Mass Spectrometry: Beyond Fungal Species Identification. Journal of Fungi. 2015

9. Chryssanthou E. Referensmetodik för laboratoriediagnostik vid klinisk mikrobiologiska

laboratorier: I 10. Svampinfektioner [Internet]. Folkhälsomyndigheten; 2003 [cited 12 mars

2018]. 2:a:[Available from:

http://referensmetodik.folkhalsomyndigheten.se/w/Infektioner_med_tr%C3%A5dsvampar.

10. Bauman RW, Machunis-Masuoka E. Microbiology. With diseases by taxonomy. 4th ed. Boston:

Pearson; 2014.

11. Kobayashi GS. Disease Mechanisms of Fungi. In: S B, editor. Medical Microbiology. 4th ed.

Galveston TX: University of Texas Medical Branch at Galveston; 1996.

12. Wiesner DL, Klein BS. Lung Epithelium: Barrier Immunity to Inhaled Fungi and Driver of

Fungal-associated Allergic Asthma. Current opinion in microbiology. 2017 10/27;40:8-13.

13. Sanguinetti M, Posteraro B. Identification of Molds by Matrix-Assisted Laser Desorption

Ionization–Time of Flight Mass Spectrometry. Journal of Clinical Microbiology. 2017

01/25;55(2):369-79.

14. Profylax och behandling av invasiv svampinfektion vid hematologisk sjukdom

samt efter stamcellstransplantation. uppdaterad rekommendation: Läkemedelsverket; 2011.

15. De Carolis E, Posteraro B, Lass-Florl C, Vella A, Florio AR, Torelli R, et al. Species

identification of Aspergillus, Fusarium and Mucorales with direct surface analysis by matrix-

assisted laser desorption ionization time-of-flight mass spectrometry. Clin Microbiol Infect.

2012 May;18(5):475-84.

16. Schulthess B, Ledermann R, Mouttet F, Zbinden A, Bloemberg GV, Böttger EC, et al. Use of the

Bruker MALDI Biotyper for Identification of Molds in the Clinical Mycology Laboratory.

Journal of Clinical Microbiology. 2014

17. Clark AE, Kaleta EJ, Arora A, Wolk DM. Matrix-assisted laser desorption ionization-time of

flight mass spectrometry: a fundamental shift in the routine practice of clinical microbiology.

Clin Microbiol Rev. 2013 Jul;26(3):547-603.

18. Amiri-Eliasi B, Fenselau C. Characterization of protein biomarkers desorbed by MALDI from

whole fungal cells. Anal Chem. 2001 Nov;73(21):5228-31.

http://referensmetodik.folkhalsomyndigheten.se/w/Infektioner_med_tr%C3%A5dsvampar

- 22 -

19. Wieser A, Schneider L, Jung J, Schubert S. MALDI-TOF MS in microbiological diagnostics—

identification of microorganisms and beyond (mini review). Applied Microbiology and

Biotechnology. 2012;93(3):965-74.

20. Bader O. MALDI-TOF-MS-based species identification and typing approaches in medical

mycology. Proteomics. 2013 Mar;13(5):788-99.

21. Lima N, Santos C. MALDI-TOF MS for identification of food spoilage filamentous fungi.

Current Opinion in Food Science. 2017 2017/02/01/;13:26-30.

22. Cassagne C, Ranque S, Normand A-C, Fourquet P, Thiebault S, Planard C, et al. Mould Routine

Identification in the Clinical Laboratory by Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization Time-

Of-Flight Mass Spectrometry. PLoS ONE. 2011

23. Wilson K, Walker JM. Principles and techniques of biochemistry and molecular biology. 7th ed.

Cambridge: Cambridge University Press; 2010.

24. Carbonnelle E, Mesquita C, Bille E, Day N, Dauphin B, Beretti JL, et al. MALDI-TOF mass

spectrometry tools for bacterial identification in clinical microbiology laboratory. Clin Biochem.

2011

25. MALDI theory. Mass Spectrometry. Bremen, Germany: Bruker Daltonik GmbH; 2004.

26. Cramer R. Advances in MALDI and laser-induced soft ionization mass spectrometry. Cham:

Springer; 2016.

27. Kostrzewa M, Schubert Sr. MALDI-TOF mass spectrometry in microbiology. Norfolk, UK:

Caister Academic Press; 2016.

28. MALDI Biotyper. Standard Operating Procedure Cultivation and Sample preparation for

Filamentous Fungi. Tyskland: Bruker Daltonik GmbH; 2015.

29. MALDI Biotyper User Manual. Tyskland: Bruker Daltonik GmbH; 2011.

30. Murray PR. What Is New in Clinical Microbiology—Microbial Identification by MALDI-TOF

Mass Spectrometry: A Paper from the 2011 William Beaumont Hospital Symposium on

Molecular Pathology. The Journal of Molecular Diagnostics : JMD. 2012.

31. Welham KJ, Domin MA, Johnson K, Jones L, Ashton DS. Characterization of fungal spores by

laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry. Rapid Commun Mass Spectrom.

2000;14(5):307-10.

32. Chalupová J, Raus M, Sedlářová M, Šebela M. Identification of fungal microorganisms by

MALDI-TOF mass spectrometry. Biotechnology Advances. 2014 20101/01/;32(1):230-41.

33. Santos C, Paterson RRM, Venâncio A, Lima N. Filamentous fungal characterizations by

matrix‐assisted laser desorption/ionization time‐of‐flight mass spectrometry. Journal of Applied

Microbiology. 2010;108(2):375-85.

Bilagor

Bilaga I: Substrat

Innehåll i SAB-plattorna, odlingsmedium för mögelsvamparna i studien.

Ingredienser Fabrikat/Art nr Stamlösning Normalsats

Sabouraud dextrose agar Oxoid CM 41 260 g

MilliQ-vatten 4000 mL

Benzylpenicillin Apoteket 0,6 g i 125 mL MilliQ-vatten 20 mL stamlösning

Streptomycinsulfat 5,0 gi 156 mL MilliQ-vatten 20 mL stamlösning

Innehåll i blodagarplattorna, för odling av S.aureus CCUG 15915 använd som positiv

kontroll.

Ingredienser Fabrikat/Art nr Normalsats

Columbia Blood Agar Base Acumedia 7125 344 g

MilliQ-vatten 8000 mL

Hästblod defibrinerat Håtunaholm 640 mL

Bilaga II: Rådata

______________________________________________________________________________________________________________________

Tabell V a. Rådata från direktöverföring i Försök 1. Högst rankat score-värde

från varje provposition är presenterat. R = rätt artidentifiering. F= felaktig

artidentifiering. NP = no peaks.

Art Databas 1d 2d

BDAL NP x3 NP x2 1,344 F 1,401 F 1,297 F

Fungi-library NP x3 NP x2 1,009 F 1,138 F 1,206 F

BDAL NP x2 NP x2 1,665 R 1,697 R

Fungi-library NP x2 NP x2 0,912 F 1,434 R

BDAL NP x2 NP x2 1,685 R 1,601 R

Fungi-library NP x2 NP x2 1,218 F 1,183 F

Direktöverföring (utan slam)

A.niger

A.terreus

A.fumigatus

3d

Tabell V b. Rådata från suspenderingen i Försök 1. Högst rankat score-

värde från varje provposition är presenterat. R = rätt artidentifiering. F=

felaktig artifentifiering. NP = no peaks.

Art Databas 1d 2d

BDAL NP x3 NP x3

Fungi-library NP x3 NP x3

BDAL NP x3 NP x3 NP x2 1,51 R

Fungi-library NP x3 NP x3 NP x2 1,127 F

BDAL NP x3 NP x3


Slamning

A.niger

A.terreus

A.fumigatus

3d

NP x3

NP x3

NP x3

NPx3

Tabell VI a. Rådata från direktöverföring i Försök 2. Högst rankat score-värde



Art Databas 1d 2d

BDAL NP x3 NP x3 1,197 F 1,248 F 1,297 F


BDAL NP x3 NP x3 1,861 R 1,635 R 1,965 R


BDAL NP x3 NP x3 1,546 R 1,424 R 1,498 R

Fungi-library NP x3 NP x3 1,249 F 1.130 F 1,155 F

BDAL NP x3 NP x3 1,465 F 1,421 F 1,474 F


A.terreus

3d

Direktöverföring (utan slam)

A.niger

A.fumigatus

A.flavus

Tabell VI b. Rådata från suspenderingen i Försök 2. Högst rankat score-värde



Art Databas 1d 2d

BDAL NP x3 NP x3


BDAL NP x3 NP x3 1,732 R 1,696 R 1,676 R


BDAL NP x3 NP x3 1,544 R 1,546 R 1,395 R


BDAL NP x3 NP x3


NP x3

NP x3

A.terreus

A.niger

Slamning

NP x3

NP x3A.flavus

A.fumigatus

3d

Tabell VII a. Rådata från direktöverföring i Försök 3. Högst rankat score-värde från varje provposition är presenterat. R = rätt artidentifiering. F= felaktig


Art Databas 2d frontmycel

BDAL 1,458 R 1,628 R 1,748 R 1,571 R 1,710 R 1,404 R NP 1,434 R 1,715 R NP x3

Fungi-library 1,062 F 1,077 F 1,184 F 1,082 F 1,030 F 0,925 F NP 1,250 F 1,135 F NP x3

BDAL 1,450 R 1,632 R 1,487 R 1,425 R 1,446 R 1,444 R 1,698 R 1,699 R 1,805 R NP x3

Fungi-library 1,062 R 1,182 F 1,281 F 0,933 R 0,985 F 1,146 R 0,983 F 1,008 F 1,158 R NP x3

BDAL NP NP 1,441 F NP NP NP NP 1,243 F NP NP x3

Fungi-library NP NP 1,092 F NP NP NP NP 1,263 R NP NP x3

A.terreus

Direktöverföring

6d frontmycel6d sporer 2d sporer

A.terreus

prov

A.fumigatus

Tabell VII a. Rådata från fullständig myrsyraextraktion enligt Bruker i Försök 3. Högst rankat score-värde från varje provposition är presenterat. R = rätt artidentifiering.

F= felaktig artidentifiering. NP = no peaks. Ej utförd analys är markerad med -.

BDAL 1,672 R 1,468 R NP NP 1,627 R 1,666 R 1,753 R 1,749 R NP NP NP NP

Fungi-library 1,033 F 1,052 F NP NP 1,052 F 0,988 F 1,244 F 1,196 F NP NP NP NP

BDAL 1,206 R 1,440 R NP NP 1,721 R NP NP 1,728 R NP NP NP NP

Fungi-library 0,995 R 1,024 F NP NP 1,113 F NP NP 1,235 R NP NP NP NP

BDAL NP 1,413 R 1,467 R 1,45 R NP NP NP NP - - - -

Fungi-library NP 1,213 R 1,028 R 1,061 F NP NP NP NP - - - -

Art

Brukers myrsyraextraktion

Rör 1 Rör 2

2d frontmycel2d sporer

Rör 1 Rör 2

A.terreus

prov

A.terreus

A.fumigat

us

Databas Rör 1 Rör 2

6d sporer

Tabell VIII a. Rådata från direktöverföring i Försök 4. Högst rankat score-värde från varje provposition är presenterat. R = rätt artidentifiering. F=

felaktig artidentifiering. NP = no peaks. Ej utförd analys är markerad med -.

Art Databas 1d sporer

BDAL 1,576 R 1,820 R 1,567 R NP x3

Fungi-library 1,061 F 0,936 F 0,970 F NP x3

BDAL 1,625 R 1,423 R 1,576 R NP x3

Fungi-library 1,115 R 0,968 F 1,040 F NP x3

BDAL 1,286 F 1,529 R NP 1,266 F 1,040 F 1,210 F NP x3 1,300 F NP NP

Fungi-library 0,932 F 1,085 R NP 0,949 F 0,584 F 0,577 F NP x3 0,979 F NP NP

A.terreus

prov

-

-

-

-

A.terreus

6d frontmycel

Direktöverföring

6d sporer

A.fumigatus

NP x3

NP x3

NP x3

NP x3

1d frontmycel

Tabell VIII b. Rådata från fullständig myrsyraextraktion enligt Bruker i Försök 4. Högst rankat score-värde från varje provposition är

presenterat. R = rätt artidentifiering. F= felaktig artidentifiering. NP = no peaks.

BDAL 1,718 R NP 1,650 R 1,788 R 1,222 F 1,317 F 1,186 F 1,459 F

Fungi-library 1,109 F NP 1,027 F 0,964 F 2,202 R 2,251 R 2,304 R 2,377 R

BDAL 1,472 R NP NP NP NP NP NP NP

Fungi-library 1,095 R NP NP NP NP NP NP NP

BDAL 1,322 F 1,185 F NP NP 1,349 F NP NP NP

Fungi-library 1,087 R 0,933 F NP NP 2,075 R NP NP NP

Art Databas

A.terreus

A.fumigatus

A.terreus

prov


6d sporer 1d sporer

Rör 1 Rör 2Rör 1 Rör 2

Tabell IX b. Rådata från fullständig myrsyraextraktion enligt Bruker i Försök 5. Högst rankat score-värde från varje provposition är presenterat. R = rätt artidentifiering. F=

felaktig artidentifiering. NP = no peaks.

BDAL 1,824 R 1,947 R 1,870 R 1,841 R 1,674 R 1,490 F 1,185 F 1,246 F NP NP NP NP 1,273 F NP 1,278 F 1,286 F

Fungi-library 1,144 F 1,250 F 1,158 F 1,185 F 1,600 R 1,489 R 1,314 R 1,833 R NP NP NP NP 2,172 R NP 2,230 R 2,270 R

BDAL 1,395 R 1,378 R 1,204 R 1,220 R 1,596 R 1,259 R 1,285 R 1,088 F 1,853 R NP 1,754 R 1,912 R 1,535 R NP NP NP

Fungi-library 1,023 F 1,078 F 0,861 F 0,918 F 1,692 R 1,452 R 1,030 F 1,080 F 2,381 R NP 2,385 R 2,390 R 1,794 R NP NP NP

BDAL 1,341 R 1,194 F 1,283 F 1,452 R NP NP NP 1,239 F 1,313 F 1,236 F 1,303 F 1,281 F 1,317 F NP NP NP

Fungi-library 1,340 F 1,259 F 1,216 F 1,357 F NP NP NP 1,240 R 2,389 R 2,340 R 2,377 R 2,339 R 2,151 R NP NP NP

Rör 1 Rör 2Databas


1d sporer

Rör 1 Rör 2

A.fumigatus

A.terreus

A.terreus

prov

1d frontmycel

Rör 1 Rör 2

5d frontmycel

Rör 1Art

Rör 2

5d sporer

Tabell IX a. Rådata från direktöverföring i Försök 5. Högst rankat score-värde från varje provposition är presenterat. R = rätt artidentifiering. F= felaktig


Art Databas

BDAL 2,052 R 1,914 R 1,945 R 1,334 R 1,353 R 1,390 F NP NP 1,308 F

Fungi-library 1,172 F 1,312 F 1,156 F 1,721 R 1,526 R 1,353 R NP NP 2,210 R

BDAL 1,608 R 1,303 R 1,584 R 1,377 R 1,622 R 1,788 R

Fungi-library 1,126 R 0,805 F 1,137 F 0,959 R 1,110 F 1,064 R

BDAL 1,397 R 1,297 F 1,266 F 1,300 F NP NP

Fungi-library 1,030 F 1,103 F 1,043 F NP NP NP

A.terreus

NP x3

NP x3

A.fumigatus

A.terreus

prov NP x3NP x3

NP x3

NP x3

NP x3

NP x3

NP x3 NP x3

5d frontmycel 1d sporer 1d frontmycel5d sporer

Direktöverföring

Tabell X a. Rådata från direktöverföring i Försök 6. Högst rankat score-värde från varje provposition är presenterat. R = rätt artidentifiering. F= felaktig artidentifiering.

NP = no peaks.

Art Databas

BDAL NP 1,660 R 1,738 R 1,655 R 1,406 R NP

Fungi-library NP 1,057 F 1,136 F 0,929 F 1,306 R NP

BDAL 1,690 R 1,837 R NP 1,579 R 1,621 R 1,447 R NP 1,721 R NP

Fungi-library 1,172 F 1,177 R NP 1,624 R 1,593 R 1,541 R NP 2,386 R NP

BDAL 1,420 F NP NP

Fungi-library 1,098 F NP NP

Direktöverföring

NP x3

A.terreus

A.fumigatus

A.terreus

prov

NP x3

NP x3

NP x3 NP x3NP x3

NP x3NP x3

NP x3

NP x3 NP x3

6d frontmycel6d sporer 2d frontmycel2d sporer

NP x3

Tabell X b. Rådata från fullständig myrsyraextraktion enligt Bruker i Försök 6. Högst rankat score-värde från varje provposition är presenterat. R = rätt artidentifiering. F=


BDAL 1,914 R 1,703 R 1,686 R 1,711 R 1,809 R 1,752 R 1,876 R 1,889 R NP NP 1,497 R 1,647 R NP NP NP NP

Fungi-library 1,121 F 1,006 F 0,998 F 1,234 F 1,163 F 0,933 F 1,559 R 1,450 R NP NP 1,664 R 1,327 R NP NP NP NP

BDAL 1,498 R 1,351 R 1,315 R 1,269 R 1,184 R 1,293 R 1,656 R NP 1,387 R 1,673 R 1,701 R 1,489 R NP NP NP NP

Fungi-library 0,992 F 0,911 R 1,127 F 0,991 F 1,015 F 1,048 F 0,941 F NP 1,392 R 1,480 R 1,620 R 1,425 R NP NP NP NP

BDAL 1,272 R 1,305 R 1,380 R 1,321 F 1,213 F 1,309 F 1,247 F 1,327 F 1,357 F 1,226 F NP 1,120 F NP NP NP NP

Fungi-library 0,940 F 0,982 F 0,947 F 1,038 F 1,765 R 1,819 R 1,793 R 1,497 R 1,998 R 1,906 R NP 2,027 R NP NP NP NP

2d sporer6d frontmycel6d sporer 2d frontmycel


Art DatabasRör 1 Rör 2

A.terreus

A.fumigatus

A.terreus

prov

Rör 2Rör 1 Rör 2Rör 1 Rör 2 Rör 1

Tabell XI a. Rådata från direktöverföring i Försök 7. Högst rankat score-värde från varje provposition är presenterat. R = rätt artidentifiering. F= felaktig


Databas Art

A.terreus 1,246 F NP NP NP 1,772 R 1,660 R 1,619 R 1,551 R 1,479 R NP NP NP

A.fumigatus NP NP NP 1,490 R 1,759 R 1,713 R 1,572 R NP NP NP NP NP

A.terreus prov 1,444 R 1,494 R 1,548 R 1,311 F 1,291 F 1,291 F NP NP NP NP NP NP

BDAL

5d frontmycel5d sporer 2d frontmycel2d sporer

Direktöverföring

Tabell XI b. Rådata från fullständig myrsyraextraktion enligt Bruker i Försök 7. Högst rankat score-värde från varje provposition är presenterat. R = rätt artidentifiering. F=


A.terreus NP NP NP NP 1,492 R 1,363 R 1,390 R 1,430 R 1,575 R 1,473 R 1,812 R 1,662 R NP NP NP NP

A.fumigatus 1,309 F 1,363 R 1,188 R 1,442 R NP 1,53 R 1,473 R 1,318 R NP 1,835 R 1,362 R 1,336 R NP NP NP NP

A.terreus prov 1,633 R 1,371 F 1,483 R 1,377 F 1,298 F NP NP NP 1,482 F NP 1,320 F NP NP NP NP NP

BDAL

Rör 2 Rör 1 Rör 2Databas

Rör 1 Rör 2


Art5d frontmycel5d sporer 2d frontmycel2d sporer

Rör 1 Rör 2Rör 1

Linnéuniversitetet Kalmar Växjö

Lnu.se

Tabell XII a. Rådata från direktöverföring i Försök 8. Högst rankat score-värde från varje provposition är presenterat. R = rätt artidentifiering. F= felaktig


Databas Art

A.terreus 1,932 R 1,940 R 1,769 R 1,785 R 1,755 R 1,546 R 1,459 R 1,513 R 1,464 R NP NP NP

A.fumigatus 1,610 R 1,481 R 1,425 R 1,489 R 1,795 R 1,574 R 1,476 R 1,780 R 1,726 R NP NP NP

A.terreus prov 1,501 R 1,485 R 1,363 F NP NP NP NP NP NP NP NP NP


Direktöverföring

BDAL


Tabell XII b. Rådata från fullständig myrsyraextraktion enligt Bruker i Försök 8. Högst rankat score-värde från varje provposition är presenterat. R = rätt artidentifiering.

F= felaktig artidentifiering. NP = no peaks.

A.terreus 1,643 R 1,748 R 1,881 R 1,765 R 1,649 R 1,570 R 1,726 R 1,606 R 1,508 R 1,612 R 1,557 R 1,595 R 1,222 F NP NP NP

A.fumigatus 1,285 F 1,249 F 1,273 F 1,326 R NP NP 1,161 F 1,103 F 1,277 F 1,038 F 1,413 R 1,398 R NP NP NP NP

A.terreus prov 1,353 F 1,409 R 1,345 R 1,185 F 1,408 F 1,406 F 1,316 F 1,375 F 1,242 F 1,333 F NP NP NP 1,292 F NP NP

Rör 2 Rör 1 Rör 2Databas

BDAL

Art6d frontmycel6d sporer 2d frontmycel2d sporer

Rör 1 Rör 2Rör 1 Rör 1 Rör 2


artidentifiering av mögelsvamp med maldi-tof...

Documents