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Evaluación de la seguridad y embriotoxicidad del Neotrofin C® y una formulación similar

antianémica para administración oralEmbryotoxicity and safety of Neotrfin C® and one similar antianemic

formulations for oral administration

Manuel Rendón M1, Jorge Reyes Esparza1, Eliza Aznar2, Raúl González2, Lourdes Rodríguez Fragoso1

1 Facultad de Farmacia, Universidad Autónoma del Estado de Morelos2 Centro Nacional de Biopreparados

ResumenEl hierro es un metal básico para la mayoría de las funciones celulares, su deficiencia o exceso se asocia con diversas patologías. Las estrategias terapéuticas actuales están dirigidas a mantener los niveles de hierro dentro de un rango que permita su biodisponibilidad, sin producir efectos tóxicos. En este trabajo se evaluó la seguridad y embriotoxicidad de dos formulaciones antianémicas en células humanas y en embriones de pollo. Las células y los embriones se trataron con las Fórmulas (0.5, 0.75, 1.0, 1.25, 1.5, 1.75 y 2.0 µg/mL) por 24 y 48 horas, respectivamente. Los resultados mostraron que ambas formulaciones no fueron citotóxicas, ni alteraron procesos como la proliferación y el ciclo celular; además no alteraron el desarrollo embrionario. Los presentes resultados mostraron que las fórmulas son seguras y no producen embriotoxicidad.

AbstractIron is an essential metal for the most cellular functions, its deficiency or excess is associated with different pathologies. Therefore, the therapeutics strategies should maintain the levels within a range to allow its bioavailability, with not toxic effects. In present work was evaluated the embryotoxicity and safety of two antianemic formulations on human cell and chicken embryo. Cells and embryos were treated with the formulations (0.5, 0.75, 1.0, 1.25, 1.5, 1.75 y 2.0 µg/mL) for 24 and 48 hours, respectively. The results showed that both products were not cytotoxics and did not alter processes as cell proliferation and cell cycle, as well as, did not alter the development of chicken embryo. Present results showed that both formulations were safe and did not produce embryotoxicity.

Trabajo Científico

Palabras clave: hierro, Neotrofin C®, citotoxicidad, proliferación, embriotoxicidad.

Keywords: iron, Neotrofin C®, citotoxicidad, proliferation, embryotoxicity.

CorrespondenciaLourdes Rodríguez Fragoso Ph.D.Chamizal 259, Fraccionamiento Insurgentes CP 62200Cuernavaca, Morelos. MéxicoTel/fax 01 777 329 7089Email: mrodriguezf@uaem.mx lorodriguez@salud.unm.edu

Fecha de recepción: 13 de abril de 2010Fecha de recepción de modificación: 2 de junio de 2010Fecha de aceptación: 10 de junio de 2010

IntroducciónLa anemia por deficiencia de hierro es uno de los problemas nutricionales de mayor magnitud en el mundo. A pesar de que se conoce tanto su etiología como la forma de enfrentarla y de que las intervenciones son de bajo costo, hoy en día hay países que no han podido resolver este problema de salud1,2.

El hierro es un elemento necesario para el funcionamiento normal de todas las células. Este elemento interviene en el transporte de energía en todas las células a través de los citocromos; es fundamental en la síntesis de ADN y ARN; juega un papel importante en la función del sistema nervioso central y del sistema inmune; y tiene funciones antioxidantes. Por lo que, la falta de hierro en el organismo puede producir expresión inadecuada de síntesis proteica, de ARN y ADN, lo cual puede tener repercusiones importantes en el funcionamiento del organismo3.

Todas las células poseen un receptor específico para la transferrina (proteína transportadora del hierro) en su superficie, pero el número varia dependiendo del tipo de célula4. Ese receptor es constante en células en reposo, pero aumenta marcadamente durante la proliferación celular. El complejo hierro-transferrina-receptor es internalizado en la célula a través de un proceso de endocitosis. Una vez en el citoplasma, el hierro puede seguir tres destinos: (1) la utilización, para las diferentes funciones celulares, (2) el almacenamiento, para asegurar la homeostasis celular y (3) la regulación, para detectar variaciones en los niveles intracelulares del metal. Existe también un sistema de captación de hierro independiente de transferrina5-7. En el entorno celular, el hierro se halla generalmente presente en estado oxidado. Sin embargo, estudios realizados en cultivos celulares utilizando iones férricos o ferrosos mostraron un incremento de la actividad de transporte de hierro, lo que indica que las células pueden incorporarlo en las dos formas8-10.

El complejo metabolismo del hierro y su participación en numerosos procesos a nivel celular, requiere diseñar estrategias terapéuticas para mantener los niveles intracelulares de hierro dentro de un rango que permita su biodisponibilidad para aquellas reacciones en las que es un componente fundamental, y minimizar su participación como catalizador de la producción de especies tóxicas. A este respecto, numerosos estudios han encontrado una correlación positiva entre el almacenamiento de hierro y estrés oxidativo en ciertas patologías, entre ellas algunos cánceres11. Por otro lado, la citotoxicidad por hierro ya ha sido previamente documentada en varios reportes. Por ejemplo, Rauen y cols. han mostrado que el hierro per se puede inducir daño celular y apoptosis a hepatocitos en cultivo, vía una transición en la permeabilidad mitocondrial12. Se sabe que el hierro es esencial para la función neuronal, pero en exceso genera neurodegeneración13. Se ha encontrado que

altas concentraciones de hierro reactivo puede incrementar la vulnerabilidad neuronal al estrés oxidativo y, que la acumulación de hierro puede incrementar la toxicidad de toxinas endógenas y ambientales14,15.

El tratamiento de la anemia ferropénica se realiza con suplementos de hierro por vía oral o parenteral. Si bien la administración de hierro por vía parenteral se considera una medida eficaz y segura, también ha sido más asociada con diversos efectos adversos16. Algunos estudios experimentales y modelos animales indican que un tratamiento excesivo con hierro parenteral podría generar citotoxicidad, estrés oxidativo, disfunción neutrofílica, e incluso, promover la aterosclerosis 17, 18. Asimismo, durante la exposición oral de hierro, existe también un alto potencial de presentar toxicidad puesto que muy poca cantidad de hierro es excretado por el organismo, además el hierro tiende a acumularse en los tejidos y órganos cuando sus depósitos están saturados19.

En la actualidad se cuenta con diversos productos para aumentar la absorción de hierro, los cuales están combinados con carbohidratos, sales inorgánicas, aminoácidos y vitaminas. Sin embargo, la biodisponibilidad y, por tanto, la eficacia y seguridad de esos productos varía de un producto a otro20. El Trofin® es un antianémico que se presenta en forma de suspensión oral y se obtuvo a partir de hierro hemínico de origen animal, el cual ha demostrado ser eficaz en el tratamiento y prevención de las deficiencia de hierro. La eficacia de este producto ha sido demostrada en niños, ancianos, deportistas, embarazadas, pacientes quemados en estado crítico y pacientes cancerosos sometidos a radio y quimioterapia21-24. Como ventaja fundamental, además de su origen natural, se aprecia la ausencia total de reacciones colaterales adversas en pacientes que lo consumen. Recientemente se han desarrollado nuevas formas farmacéuticas empleando las mismas materias primas del Trofin®, pero en forma de polvos obtenidos por deshidratación. A partir del polvo se elaboraron dos formulaciones (I y II) en forma de tabletas conformadas por compresión directa, las cuales contienen hierro hemínico e iónico, se le ha adicionado además otros componentes a base de proteínas, carbohidratos y vitaminas, con el objetivo de potenciar su efecto. Por lo tanto, el objetivo de este trabajo fue evaluar la seguridad y embriotoxicidad de las dos formulaciones antianémicas en líneas celulares humanas y en embriones de pollo.

Material y métodosFormulaciones I y II en forma de tabletasLa formulación I, conocida comercialmente como Neotrofin-C®, contiene como principios activos hierro hemínico en concentraciones de 20 mg y ácido ascórbico 100 mg por tableta de 700 mg. La formulación II contiene 15 mg de hierro hemínico

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y 16 mg de hierro iónico en forma de Fumarato ferroso, 50 mg de ácido ascórbico y 0.2 mg de ácido fólico por tabletas de 500 mg. Para los experimentos, las tabletas fueron trituradas en mortero y resuspendidas en agua estéril.

Líneas celularesPara el estudio se utilizaron 3 líneas celulares humanas: 293Q , WRL-68, y KHOS. Las células 293-Q son células epiteliales renales humanas (Catálogo ATCC No. CRL-1573), las células WRL-68 son células hepáticas humanas (Catálogo ATCC No. CL-48) y las células KHOS-240S son células de hueso humano (Catálogo ATCC No. CRL 1545). Las células se cultivaron en platos de 100-mm (106 células/plato) en Medio Mínimo Esencial (MEM) (GIBCO BRL) suplementado con 10% suero fetal bovino (SFB) (GIBCO BRL), 2mM L-glutamina (GIBCO BRL), 0.1mM de aminoácidos no esenciales (Sigma) y 1.0 mM de piruvato de sodio (In vitro, S.A). Las células se cultivaron bajo una atmósfera de 5% CO2 y temperatura de 37 oC.

Evaluación de la viabilidad celularPara los estudios de citotoxicidad en células 293Q , WRL-68, y KHOS-240S se empleó la técnica de bromuro de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difenil tetrazolio (MTT), la cual se basa en la conversión de dicho colorante a un precipitado insoluble llamado formazán25. Se sembraron aproximadamente 10,000 células (200 µL) en placas de 96 pozos (Corning Incorporated Costar) en medio MEM suplementado durante 24 horas. Después de ese tiempo, las células fueron tratadas con una solución de la Formulación I o II en una dosis equivalente a una concentración de 0.5, 0.75, 1.0, 1.25, 1.5, 1.75 y 2.0 µg/mL de hierro en un volumen de 200 µL, durante 24h. Se incluyo un grupo solo con medio y se considero como control. Una vez transcurrido el tiempo, se aspiró cuidadosamente el medio y se reemplazó con 200 µL de medio nuevo y se agregaron 50 µL de MTT (5mg/mL) para tener un volumen total de 250 µL. Posteriormente se incubaron durante 4 h a 37 ºC con 5% CO2. Posteriormente, se removió cuidadosamente el medio con MTT y se agregaron 200 µL de DMSO y 25 µL de una solución amortiguadora de Sorensor (0.1M glicina, 0.1M NaCl a pH 10.5) a cada pozo, después se mezcló la placa hasta que los cristales de formazán se disolvieron, y por último se leyó en un lector de placas (Microplate Limaning System Modelos Ultramark, Biorad) a una longitud de onda de 550 nm.

Evaluación de la proliferación celularSe sembraron 5000 células en placas de 96 pozos en medio MEM suplementado y se cultivaron durante 24 horas. Para inducir la proliferación celular, las células fueron estimuladas con factores de crecimiento específicos. Se empleó el factor de crecimiento epidérmico (EGF, 20 µg/mL) para las células 293Q , el factor de crecimiento transformante beta 1 para las células KHOS (TGF-β1, 10 ng/mL), y el factor de crecimiento del hepatocito para las células WRL-68 (HGF, 10 ng/mL), concentraciones finales

contenidas en 200 µL. Las células fueron tratadas con diferentes concentraciones de las formulaciones I y II (equivalente a 0.5, 0.75, 1.0, 1.25, 1.5, 1.75 y 2.0 µg/mL de hierro) en un volumen de 200 µL, durante 24 h. Se dejaron células tratadas solo con los factores de crecimiento para utilizarlas como control. El análisis de la proliferación celular se realizo mediante la técnica de MTT de (3-[4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5- bromuro difeniltetrazolio), como se describió previamente.

Análisis del ciclo celularPara el análisis del ciclo celular se utilizo el método descrito por Darzynkiewicz26. Para esto se sembraron 50,000 células en placas de 24 pozos en las condiciones anteriormente descritas. Después de 24 horas de incubación se trataron con las diferentes concentraciones de las formulaciones I y II (0.5, 0.75, 1.0, 1.25, 1.5, 1.75 y 2.0 µg/mL) durante 24 horas. Después de ese tiempo se colectó el medio con las células y se procedió a centrifugar a 2000 rpm durante 10 minutos para obtener las células. Las células se fijaron con alcohol etílico al 80% a 4ºC. Las células permanecieron a una temperatura de menos 4 ºC hasta su uso. Posteriormente, las células fueron rehidratadas con 1.5 mL agua destilada y centrifugadas a 2000 rpm durante 10 minutos a temperatura ambiente, transcurrido éste se decantó hasta eliminar el sobrenadante. Las células fueron lavadas con una solución de fosfatos y resuspendidas en 1% de NP40 (Nonidet P40, Biochimica Fluka) y 10 µg/mL ARNasa (Ribonucleasa A, preparación libre de ADNasa). Ioduro de propidio fue adicionado (concentración final de 5 mg/mL) y se dejó reposar durante 15 minutos en oscuridad a 4ºC, posteriormente se leyeron y analizaron las muestras en un Citómetro de Flujo (Becton Dickinson Modelo Facsc Calibur con lasser de 480 nm de argón).

Estudios de embriotoxicidadSe utilizaron 50 huevos de pollo fértiles obtenidos de A.L.P.E. S.A. (Puebla, México) y se almacenaron a 6 °C. Los huevos se pesaron, esterilizaron y se dividieron en 8 grupos. El primer grupo sirvió como control no tratado. Los siguientes 6 grupos recibieron las formulaciones I y II (0.5, 1.25 y 2.0 µg/mL). El último grupo recibió cafeína (10 mg/mL) y fue usado como control positivo. Un ensayo de teratogenicidad se realizo como fue descrito por Jelinek y Marthan27. Para tratar los embriones se perforo el cascaron y las soluciones a evaluar (1 mL) fueron adicionadas al saco de aire bajo condiciones de esterilidad, después los hoyos fueron sellados inmediatamente con parafina líquida. Los huevos fueron transferidos y mantenidos en una incubadora a 37.5 °C con una humedad relativa del 55% hasta que los embriones alcanzaron la etapa de desarrollo deseada (48 h). Para determinar el efecto de las fórmulaciones I y II, se realizo un análisis histológico. Para esto, los embriones fueron fijados en una solución amortiguadora de formol salino (pH 7.4), se deshidrataron y se embebieron en bloques de parafina. Se cortaron secciones de tejido de 6 µm y fueron teñidos con acetocarmin para hacer un examen histológico de rutina. Los

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embriones se observaron mediante un microscopio estereoscopio y se hizo un análisis morfológico comparativo de estructuras del sistema nervioso central, somitas, sistema cardiovascular, ectodermo y endodermo, enfatizando en las estructuras embrionarias desarrolladas de acuerdo al estadio, tanto de los embriones control como de aquellos embriones que recibieron los diferentes tratamientos. Los embriones se examinaron y se determinó su estadio embrionario de acuerdo a los criterios morfológicos establecidos por Hamburger y Hamilton28. Las etapas embrionarias al final del tratamiento con las formulaciones I y II variaron de 40-45.

Análisis estadísticosTodos los valores fueron expresados como el promedio ± el error estándar de la media de los valores obtenidos en 2 experimentos conducidos por cuadruplicado. El análisis estadístico se hizo utilizando la prueba de Fisher, en donde valores de p< 0.05 fueron considerados significativos.

Resultados y discusiónEn la actualidad existen múltiples formulaciones a base hierro en el mercado, y aunque, hay preocupación relacionada a su potencial toxicidad, no existen evidencias directas de la seguridad in vitro de esos agentes. El presente estudio fue enfocado a evaluar la seguridad de dos formulaciones a base de hierro y vitaminas en forma de tabletas en modelos in vitro e in ovo.

La toxicidad por hierro ya ha sido previamente documentada29, particularmente en órganos como el hígado, riñón y hueso. El hígado juega un papel central en el mantenimiento de la homeostasis del hierro en el organismo; sin embargo, un exceso en su depósito conduce a daño celular e insuficiencia funcional debido a la alta producción de especies reactivas de oxígeno30,31. Por otro lado, ha sido reportado que el exceso de hierro inhibe la proliferación y diferenciación de osteoblastos32. Mientras que, Mandalunis y Ubios han encontrado que el hierro es un factor más, involucrado en la pérdida de la homeostasis del metabolismo óseo en pacientes con falla renal tratados con hierro33, debido a un alto contenido de hierro por la disfunción renal34.

Como se puede apreciar en la Figura 1 ambas formulaciones no produjeron efectos citotóxicos a las células renales, hepáticas, y óseas. Las formulaciones I y II son dos productos farmacéuticos con hierro, aminoácidos, proteínas, vitamina C, ácido fólico, propóleos y miel de abeja. La compleja mezcla de componentes de estos productos restaura los niveles séricos de hierro, pero además parecen ejercer cierta citoprotección. Lo anterior no es de extrañar, ya que al hierro se le han atribuido efectos citoprotectores35; además, la miel y el propóleo son productos originados en la colmena que poseen varias propiedades biológicas, entre ellas antioxidantes, por su alto contenido de

flavonoides36. El uso de hierro combinado con, por ejemplo, carbohidratos y vitamina C, ya ha sido previamente descrita para el tratamiento de pacientes con anemia y daño renal, sin producir efectos adversos37-39.

El hierro es un componente esencial de muchas proteínas y enzimas que están involucradas en el crecimiento y replicación celular40. El ciclo celular de células de mamífero es altamente controlado, y su alteración puede llevar al desarrollo tumoral. El ciclo celular es principalmente regulado por factores de crecimiento y hormonas; sin embargo, existen nutrientes específicos, los cuales funcionan como fuentes de energía o regulan la producción y/o función de proteínas necesarias para que las células avancen a través de un ciclo replicativo, entre ellas el hierro41. El hierro es esencial para el crecimiento celular debido a su papel como un cofactor en proteínas involucradas en la respiración mitocondrial y síntesis de ADN. Células proliferantes son particularmente sensibles cuando hay una depleción de hierro, debido a que este altera la expresión de la ciclina D, la cinasa dependiente de ciclina 2 (CDK 2) y el inhibidor p21 de CDK, los cuales están involucrados en la progresión del ciclo celular de la fase G1 a S42,43. Por lo tanto, los niveles de hierro deben mantenerse en concentraciones adecuadas para que la maquinaria del ciclo celular funcione adecuadamente. En este estudio mostramos que las formulaciones I y II no modificaron ninguna fase del ciclo celular en las tres líneas celulares a las concentraciones empleadas (Figura 2). Considerando la importancia del hierro en procesos celulares vitales como la síntesis de ADN, no es sorprendente que el ciclo celular sea ajustado a la disponibilidad de hierro.

Muchas proteínas del metabolismo de hierro muestran un alto grado de expresión en células tumorales, indicando que el hierro juega un papel importante en la tumorigénesis y desarrollo44. Las células neoplásicas requieren una mayor cantidad de hierro

Figura 1. Efecto de las formulaciones I y II sobre la viabilidad celular. Los resultados son expresados como el promedio + D.S., de tres experimentos independientes.*p < 0.05 comparado con el grupo control.

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debido a que ellas proliferan a una mayor velocidad que su contraparte normal45. En el presente estudio se evaluó el efecto de diferentes concentraciones de las formulaciones I y II en la proliferación inducida por diferentes factores de crecimiento. Como podemos observar en la Figura 3, las formulaciones I y II a las diferentes concentraciones evaluadas ni aumentaron ni redujeron la proliferación inducida por factores de crecimiento en las líneas celulares empleadas. Aunque ha sido señalado que el hierro causa alteraciones e inhibe la síntesis de ADN solamente en células proliferantes46,47, en nuestro estudio no indujo cambios significativos en la proliferación celular. Este hecho es un punto a su favor, ya que no sería contraproducente su uso en pacientes oncológicos.

En este trabajo se realizó también un estudio de embriotoxicidad utilizando para ello el modelo de embrión de pollo para evaluar el potencial teratogénico de las formulaciones I y II. Se sabe que en la etapa embrionaria, las células están en constante duplicación para la formación de tejidos, órganos y estructuras importantes para el desarrollo, como el eje neural que guiará al sistema nervioso central y cardiovascular, entre otros. Los requerimientos de hierro en el desarrollo embrionario han sido señalados previamente y está bien documentado el papel que el hierro juega en el desarrollo embrionario y fetal48,49; asimismo, ha sido señalado que puede ser tóxico si el embrión se expone a concentraciones muy elevadas41. Nuestros resultados mostraron que ambas formulaciones no produjeron efectos embriotóxicos a las concentraciones 0.5, 1.25 y 2 µg/mL. La ausencia de efectos embriotóxicos no es raro si consideramos que otros productos equivalentes (Trofin® y Neotrofin®) que están suplementados también con propóleos y proteínas ya han sido empleados en mujeres embarazadas y en ratas preñadas, sin producir efectos

embriotóxicos y teratogénicos21. Aunque, este grupo reportó previamente la toxicidad del Trofin®, utilizando el modelo de embrión de pollo, los hallazgos previos encontrados en ratas preñadas sugieren que el organismo a través de la barrera digestiva no permite su incorporación al sistema circulatorio y ello explica que a los embriones provenientes de madres gestantes que lo consumen por vía oral no presenten alteración alguna 50. En la actualidad el Trofin® es utilizado para consumo diario de la población Cubana, incluidas mujeres embarazadas, y no hay reportes de teratogenicidad.

En el presente estudio se muestran evidencias de que ambas formulaciones no produjeron efectos tóxicos ni alteraron el ciclo celular de las líneas celulares humanas estudiadas; no incrementaron la proliferación celular inducida por factores de crecimiento. Además no produjeron ningún efecto tóxico en el modelo de embrión de pollo. Si bien los presentes resultados aportan evidencias de la inocuidad en los modelos estudiados, y dado que hay antecedentes de toxicidad inducida por el hierro, no se descarta la posibilidad de desarrollar efectos adversos in vivo, en particular si ocurre una sobreexposición a las formulaciones.

Nuestros resultados mostraron que ambas formulaciones no produjeron efectos embriotóxicos a las concentraciones 0.5, 1.25 y 2 µg/mL (Figura 4). La ausencia de efectos embriotóxicos no es raro si consideramos que otros productos equivalentes (Trofin® y Neotrofin®) que están suplementados también con propóleos y proteínas ya han sido empleados en mujeres embarazadas y en ratas preñadas, sin producir efectos embriotóxicos y teratogénicos21. Aunque, este grupo reportó previamente la toxicidad del Trofin®, utilizando el modelo de embrión de pollo,

Figura 2. Porcentaje de células en fases G1, S, y G2/M del ciclo celular posterior al tratamiento con las formulaciones I y II durante 24 h. Los resultados son expresados como el promedio + D.S., de tres experimentos independientes. FI= Formulación 1; FII= Formulación II. *p < 0.05 comparado con el grupo control.

Figura 3. Efecto de las formulaciones I y II sobre la proliferación celular inducida por factores de crecimiento. Los resultados son expresados como el promedio + D.S., de tres experimentos independientes. *p < 0.05 comparado con el grupo control,# p < 0.05 comparado con el grupo con factor de crecimiento.

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los hallazgos previos encontrados en ratas preñadas sugieren que el organismo a través de la barrera digestiva no permite su incorporación al sistema circulatorio y ello explica que a los embriones provenientes de madres gestantes que lo consumen por vía oral no presenten alteración alguna50. En la actualidad el Trofin® es utilizado para consumo diario de la población Cubana, incluidas mujeres embarazadas, y no hay reportes de teratogenicidad.

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ConclusionesLa evaluación de la seguridad y embriotoxicidad de las formulaciones I y II mostró que estos compuestos fueron seguros en las líneas celulares renales y hepáticas, así como en el embrión de pollo. Aunque los presentes resultados muestran que ambas formulaciones no son tóxicas, los autores consideran importante realizar más estudios toxicológicos en modelos in vivo para corroborar la seguridad de ambas formulaciones.

Figura 4. Apariencia morfológica del embrión de pollo tratado con diferentes concentraciones de las formulaciones I y II; a, b, c: embriones tratados con la formulación I; d,e,f: embriones tratados con la formulación II. Los embriones fueron tratados con 0.5, 1.5 y 2 µg/mL de la formulación I o II durante 48 horas. Los embriones muestran una morfología parecida al embrión normal. Se utilizó cafeína (10 mg/mL) como control positivo de teratogenicidad.

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