__________________________________________________________Revista Cientfica, FCV-LUZ / Vol. XIII, N 5, 413-417, 2003

ESTUDIO DE RESISTENCIA DE CEPAS DE Staphylococcus aureusAISLADAS DE MASTITIS SUBCLNICA BOVINA FRENTE A CINCOANTIBITICOS EN TRES SECTORES DE LA IX REGIN DE CHILE

(NOTA TCNICA)A Study of the Resistance in Staphylococcus aureus Strains Isolated from Bovine

Mastitis to Five Antibiotics in Three Sectors of Region IX in Chile(Technical Note)

Oriana Betancourt, Cristin Scarpa y Karen Villagrn

Escuela de Medicina Veterinaria. Universidad Catlica de Temuco.Manuel Montt 56. Temuco, Chile. Fono: 205551. Fax: 227185. E-mail: obetanco@uct.cl

RESUMEN

Se determinaron las concentraciones mnimas inhibitorias depenicilina G, ampicilina, cloxacilina, neomicina y enrofloxacinopara 39 cepas de Staphylococcus aureus aisladas de leche devacas afectadas con mastitis subclnica provenientes de 3 sec-tores de la IX Regin de la Araucana (Chile), con el propsitode evaluar in vitro sus patrones de resistencia. Para ello se uti-lizaron los mtodos de difusin y dilucin en agar, segn lasrecomendaciones del NCCLS. Adems, se determin la pre-sencia de cepas productoras de b-lactamasa mediante el m-todo cromognico de nitrocefin. Se detect un alto porcentajede cepas resistentes a penicilina G y ampicilina. Cloxacilina,neomicina y enrofloxacino mostraron actividad hacia todas lascepas. La mayora de las cepas productoras de betalactamasaprovenan del sector Chivilcn. Resultados como los obtenidosaqu, fortalecen la necesidad de establecer planes de monito-reo de resistencia para tratamientos aplicados en Medicina Ve-terinaria. Esto, adquiere mayor importancia si se considera elrol del mdico veterinario en proteger la salud pblica.

Palabras clave: Mastitis bovina, Staphylococcus aureus, MIC.

ABSTRACT

Minimum inhibitory concentrations were determined for penicil-lin G, ampicillin, cloxacillin, neomycin and enrofloxacin against39 Staphylococcus aureus strains isolated from bovine sub-clinical mastitis in three locations of the IX Region of Araucana(Chile), in order to evaluate their in vitro susceptibility patterns.

Agar diffusion and dilution tests were used according toNCCLS recommendations. Strains producing betalactamasewere also determined by a chromogenic cephalosporinmethod. High resistance levels to penicillin G and ampicillinwas detected. Cloxacillin, neomycin and enrofloxacin demon-strated activity against all strains. Results obtained here em-phasize the necessity of establishing resistance plan monitor-ing for treatments applied in Veterinary Medicine. This concept,acquires greater importance considering the role of the veteri-narian in public health protection.

Key words: Bovine mastitis, Staphylococcus aureus, MIC.

INTRODUCCIN

En Chile, uno de los agentes causales predominantes enlas mastitis clnicas y subclnicas es Staphylococcus aureus [9]el que adems de provocar importantes prdidas productivasse caracteriza por desarrollar resistencia frecuente frente adistintos antibiticos [6, 12, 16].

Existe una variedad de antimicrobianos para el trata-miento de mastitis bovina cuya eleccin se basa, en el conoci-miento de las tendencias generales en susceptibilidad dentrode la prctica clnica [16]. Los ms utilizados son betalactmi-cos, aminoglicsidos, y en Chile tambin la enrofloxacina [18].

Normalmente no se realiza aislamiento ni evaluacin porantibiograma del agente causal de la infeccin intramamaria[16]. Esto, sumado al hecho de que la eleccin y suministro delfrmaco muchas veces est en manos de una persona que noes el mdico veterinario, puede hacer variar la sensibilidadbacteriana as como la recurrencia de presentacin de los mi-

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Recibido: 11 / 02 / 03. Aceptado: 31 / 07 / 03.

croorganismos asociados a esta patologa [7, 9]. El anlisis dela sensibilidad a los antimicrobianos tiene como objetivo guiarla terapia emprica teniendo presente sus caractersticas far

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macocinticas, e informar la generacin de resistencia [5]. Elfrmaco elegido no slo tiene que cumplir con las caractersti

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cas de actuar sobre el germen adecuadamente sino tambinalcanzar concentraciones mnimas inhibitorias en el sitio de lainfeccin, y asegurar un tiempo de permanencia del frmacosuficiente para determinar el desarrollo bacteriano [13].

La resistencia a antimicrobianos puede ser intrnseca(pertenece a la bacteria) o adquirida. La resistencia adquiridaocurre cuando una bacteria que ha sido sensible a un antibiti-co desarrolla resistencia a ste ya sea por mutacin o por ad-quisicin de nuevo DNA. En este ltimo caso la bacteria puedeadquirir la capacidad de sintetizar una enzima, betalactamasa,la que inactiva el frmaco. La resistencia microbiana en Medi-cina Veterinaria es relevante si se consideran antecedentesque sealan que bacterias multirresistentes de origen animalpueden transferir esta cualidad a bacterias de importanciapara la medicina humana, restringiendo su uso en cuadros in-fecciosos complicados [10, 23].

La Concentracin Mnima Inhibitoria (CMI) informa sobreel nivel de resistencia a un antimicrobiano alcanzado por unapoblacin bacteriana en un lugar geogrfico particular, siendola CMI50 y la CMI90 la concentracin del frmaco que inhibe al50% y 90% de la poblacin en estudio, respectivamente.Muckle y col. [14] comparan CMI50 y CMI 90 y determinan re-sistencia cuando CMI90 es mucho mayor que CMI50 . La venta-ja de su determinacin reside en que orienta hacia las dosisclnicas del antibiticos en estudio, lo que debe complementar-se con conocimientos sobre la farmacocintica de la droga enuna especie animal determinada [17]. El presente estudio tuvocomo finalidad aportar antecedentes sobre los niveles de re-sistencia a antimicrobianos de uso en mastitis bovina presen-tadas por cepas de Staphylococcus aureus aisladas de vacascon mastitis subclnica en tres sectores de la IX Regin de laAraucana (Chile).

MATERIALES Y MTODOS

Se trabaj con 39 cepas de Staphylococcus aureus, aisla-

das de vacas con mastitis subclnica (segn California MastitisTest), de tres sectores lecheros rurales (Nigara, Pitrufqun yChivilcn, con 7, 21 y 11 cepas de cada uno) pertenecientes ala IX Regin de la Araucana, Chile. La identificacin se realizen el laboratorio de Microbiologa de la Escuela de MedicinaVeterinaria de la Universidad Catlica de Temuco. Para la iden

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tificacin de las colonias sospechosas de S. aureus desarrolla-

das en agar sangre, se realizaron las pruebas de catalasa ycoagulasa (en plasma de conejo liofilizado). Las colonias ne

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gras, sospechosas de S. aureus en agar Baird-Parker (suple-

mentado con yema de huevo y telurito de potasio, Merck), fue-

ron traspasadas a caldo Cerebro Corazn (Merck) a partir del

cual se realizaron las pruebas confirmatorias (correspondien-

tes a coagulasa y produccin de cido en aerobiosis desdefructosa, xilosa, maltosa, lactosa, sucrosa y manitol) [3].

Para la determinacin de la sensibilidad por el mtodode difusin en placa, se utiliz la tcnica de Kirby-Bauer estan-darizada por el National Committee for Clinical LaboratoryStandards [15]. Las cepas se cultivaron en caldo peptona por18 h a 37C y la suspensin se ajust a una turbidez equiva-lente a 0,5 McFarland (correspondiente a 1,5x108 UFC/ml) [1],la que fue sembrada en agar Mueller Hinton (Merck). Sobre elinculo se depositaron sensidiscos de penicilina G (10IU/IE/UI), ampicilina (10 mcg), cloxacilina (1 g), neomicina (30mcg) y enrofloxacilina (10 mcg), incubndose por 18 h a 37C.Se utiliz como cepa control S. aureus ATCC 25923. Los aisla-mientos fueron categorizados como susceptible (S), sensibili-dad intermedia (SI) y resistente (R) basado en los criterios dela NCCLS [15].

Las cepas que resultaron resistentes a penicilina y am-picilina a la vez (14), fueron probadas para produccin debetalactamasa utilizando el mtodo del Nitrocefin (Oxoid),para lo cual una muestra de cada cepa se deposit en el ex-tremo de una tira impregnada con Nitrocefin, una cefalospo-rina cromognica, que vira de amarillo a rojo en presenciade la enzima.

Para la determinacin de las CMI se utiliz el mtodo dedilucin en placa estandarizado por la NCCLS [15]. Se prepa-raron las soluciones madre de penicilina G, ampicilina, cloxaci-lina, neomicina y enrofloxacino de acuerdo a la frmula Canti-dad de frmaco (mg) =100 ml x 2000 g/ml (2000 UI/ml) / Po-tencia de la droga (g o UI/mg), y los diluyentes sealadospor la NCCLS [15] que se indican a continuacin.

Droga pura Solvente Diluyente

Penicilina Gpotsica

Agua destilada estril Agua destilada estril

Cloxacilina Agua destilada estril Agua destilada estril

Ampicilina Buffer fosfato pH 8;0,1 M

Buffer fosfato pH 6;0,1 M

Neomicina Agua destilada estril Agua destilada estril

Enrofloxacina vol. Agua + gotasNaOH

Agua destilada estril

Posteriormente se agreg 2 ml de cada dilucin a untubo que contena 18 ml de agar Mueller Hinton fundido que

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dando en proporcin droga: medio de cultivo de 1:10. Se deja-

ron 2 placas sin antibitico como control, una de las cuales sesembr con la cepa S. aureus ATCC 25923. Posteriormentese inocularon las placas con las suspensiones estandarizadasde las cepas (0,5 unidades Mc Farland) por medio de un in

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culo-replicador de Steers (700 l de suspensin/depsito). Seconsider como CMI50 y CMI90 aquella dilucin del antibiticoque inhibi el crecimiento bacteriano en un 50 y 90% respecti

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vamente, a las 18 h a 37C. Para interpretar los resultados deCMI, stos se compararon con los estandarizados por laNCCLS [15] como se presenta en la TABLA II.

RESULTADOS Y DISCUSIN

En Chile, varios agentes antimicrobianos son corriente-mente administrados para el tratamiento de mastitis bovinas, in-cluyendo betalactmicos, aminoglicsidos y fluoroquinolonas. Elmtodo ms utilizado para determinar si un aislamiento prove-niente de la glndula mamaria es susceptible o resistente a unantimicrobiano, corresponde al mtodo de difusin en agar o deKirby Bauer. Las 39 cepas provenientes de mastitis subclnicade este estudio mostraron diversidad en los porcentajes de sen-sibilidad frente a los antimicrobianos probados por este mtodo(TABLA I). De las 14 cepas que mostraron resistencia a los be-talactmicos penicilina G y ampicilina por este mtodo, 12 resul-taron positivas a betalactamasa, 9 de las cuales fueron de Chi-vilcan y 2 de Pitrufqun. Watts y Salmon [24] informan resulta-dos similares utilizando el mismo mtodo. La relacin entre pre-sencia de betalactamasa y resistencia a penicilinas ha sido co-rroborada por otros autores [6, 24] y es predictivo de resistenciatanto a penicilinas como amino-, carboxi- y ureido-penicilinas[15]. En el caso de cloxacilina, penicilina antiestafiloccica quepertenece al grupo de la oxacilina, nafcilina y meticilina [15], lasensibilidad (97,4%) no fue tan afectada como en el caso de lasotras penicilinas. Cepas productoras y no productoras de beta-lactamasa mostraron sensibilidad frente a cloxacilina lo queconcuerda con resultados de Gutirrez [8]. Esto podra debersea la estabilidad de esta penicilina semi-sinttica, frente a la enzi-ma. Este resultado justificara la eleccin de cloxacilina en tera-pia intramamaria en casos de mastitis originados por esta bac-teria en todos los sectores muestreados.

Todas las cepas fueron sensibles a neomicina. El 89,7%fu sensible a enrofloxacino, resultado similar al informado porLen [9] para el sur de Chile y por Salmon y col. [18], para ce-

pas provenientes de Nueva Zelandia. San Martn y col. [20] yGutierrez [8], describen valores similares de sensibilidad a es

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tos antimicrobianos en las Regiones V y Metropolitana (Chile,zona central).

Al analizar el comportamiento de las poblaciones de ce-pas frente a los antibiticos estudiados por sector (TABLA II), seobserv que los patrones de sensibilidad a penicilina y ampicili-na presentaban variaciones que diferenciaran su eleccin tera-putica por sector. En Nigara (7 cepas analizadas) se encon-traron CMI90 de 0,5 g/ml para penicilina G y 0,25 g/ml paraampicilina. En Chivilcn se observ la mayor proporcin de ce-pas resistentes de un total de 11, obtenindose CMI90 de 16g/ml y de 8 g/ml para los mismos antimicrobianos, respectiva-mente. En el sector Pitrufqun, las 21 cepas aisladas requirie-ron CMI90 de 0,13 g/ml para penicilina G y 8 g/ml para ampicili-na. Estos CMI90 estn por sobre los 0,25 y 0,5 g/ml, respecti-vamente, utilizados para categorizar estfilococos como resis-tentes a esos compuestos [15], excepto en el caso de las cepasprovenientes de Nigara frente a la ampicilina. La penicilina ge-neralmente exhibe buena actividad contra cocos Gram positivospero es afectada por la actividad betalactamasa. S. aureus esuna bacteria que desarrolla rpidamente resistencia a antibiti-cos como la penicilina, sobre todo posterior a su uso teraputicoen terreno como el caso de los tratamientos de mastitis bovina,debido al aumento de la presin de seleccin sobre las suscep

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tibles lo que es de gran preocupacin en Medicina Veterinaria[6, 11, 23]. La ampicilina pertenece a un extenso grupo de peni

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cilinas conocido como aminopenicilinas, similares en espectrode actividad a las penicilinas naturales, pero ms resistente abetalactamasa [18, 24]. As, los resultados muestran que la acti

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vidad de este antimicrobiano fue menos afectada que la de lapenicilina G, lo que concuerda con otros autores [6, 11].

Los CMI90 para cloxacilina, neomicina y enrofloxacino(CMI90 0.5-1 g/ml) indicaran ausencia de resistencia en lastres localidades, ya que estn por debajo de los puntos de cor-tes sealados por la NCCLS [15], y concuerdan con resultadosde Zurich [25], por lo que pueden ser utilizados en terapia demastitis por S. aureus en esos sectores geogrficos. Ancuando no est totalmente aprobada para su uso en tratamien-

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TABLA ISENSIBILIDAD IN VITRO DE 39 CEPAS DE STAPHYLOCOCCUS COAGULASA POSITIVA

FRENTE A DIFERENTES ANTIMICROBIANOS (MTODO KIRBY- BAUER)Droga S1 MS R

N % N % N %

Penicilina G 25 64,1 14 35,9Ampicilina 25 64,1 14 35,9

Cloxacilina 38 97,4 1 2,6 Neomicina 39 100

Enrofloxacino 35 89,7 4 10,3 1S sensible; SI sensibilidad intermedia; R resistente.

tos de mastitis bovina, enrofloxacino (fluoroquinolona que inhi-be la subunidad gyrA de la DNA girasa) se ha venido incorpo-rado en la terapia de secado y se ha sugerido su uso paramastitis clnica por S. aureus [16, 18, 25]. Los resultados aquobtenidos contribuiran a esta eleccin. No obstante, mientraspermanecen en estudio los Lmites Mximos de Residuo(LMR) para este antimicrobiano y se aclara su efecto residual,su uso debiera vigilarse.

La descripcin de la actividad de los antibiticos slo tie-ne carcter orientador, dado que la susceptibilidad de las ce-pas depende de variados factores siendo los ms importantes,entre otros, las concentraciones en el sitio de localizacin de labacteria, capacidad del antimicrobiano de penetrar la bacteriay ulterior unin a protenas especficas de los grmenes [21].Desde el punto de vista epidemiolgico, la resistencia varaentre regiones geogrficas e, incluso, entre predios de unamisma regin [19]. Resulta importante realizar estudios in vitrode la sensibilidad y CMI de estos antibiticos frente a S. au-reus para as obtener antecedentes cuantitativos que sumadosa trabajos farmacocinticos permitan reproducir CMI efectivasen el animal de acuerdo a ajustes posolgicos adecuados ase-gurando as el xito de las terapias. Resultados diferentes enCMI por localidad a los distintos antibiticos son explicables yaque el CMI se considera una respuesta individual de cadacepa y no de la especie.

El mantenimiento de altos niveles de sensibilidad a distin-tos antimicrobianos y la vigilancia de la aparicin de resistenciaen el tiempo y en diferentes localidades geogrficas adquiere vi-tal importancia en Medicina Veterinaria. El patrn de sensibilidada distintos antibiticos puede ser diferentes para localidades geo-grficas distintas, aunque sean vecinas. Es primordial llevar re-gistros de los antibiticos utilizados en cada predio y asegurar suuso correcto, as como mantener una rotacin de los frmacospor sectores (disminuye la presin de seleccin), conservndosela susceptibilidad a stos en distintas localidades. La tendenciaactual aconseja usar antimicrobianos de espectro reducido, sobre

todo aquellos que son de primera lnea de eleccin en infec-ciones graves en medicina humana [2, 22, 23].

El monitoreo de la resistencia por s solo no provee la in-formacin necesaria para una intervencin bien dirigida haciael control de este problema, ya que se requiere informacindetallada tanto sobre la generacin de resistencia como sobreel uso que se hace de los distintos antimicrobianos [2]. Ade-ms, orienta la eleccin teraputica pero no asegura el xitode la misma ya que deben considerarse adems las interrela-ciones con el ambiente interno del hospedero [4].

CONCLUSIONES

Estos resultados sustentan la necesidad de investigarexhaustivamente el uso de antimicrobianos de uso potencialas como los patrones de resistencia que las cepas de S. au-reus estn desarrollando a ellos en la IX Regin de Chile. Estodebido a que, an cuando se trat de un nmero de cepaspoco representativo, un porcentaje importante de cepas inhibisu crecimiento a CMI de penicilina G y ampicilina superiores alpunto de corte establecido por la NCCLS (indicando resisten-cia) observndose diferencias por sector geogrfico. Se confir-ma la necesidad de establecer en Chile planes de monitoreode resistencia para tratamientos aplicados en Medicina Veteri-naria con el fin de vigilar el uso racional de antimicrobianos yproteger la salud pblica.

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TABLA IICONCENTRACIONES INHIBITORIAS MNIMAS CIM (g/ml) Y PUNTOS DE CORTE PARA PENICILINA G, AMPICILINA,CLOXACILINA, NEOMICINA Y ENROFLOXACINO SOBRE CEPAS AISLADAS EN LOS SECTORES DE NIGARA (n=7),

CHIVILCN (n=11) Y PITRUFQUN (n=21) PERTENECIENTES A LA IX REGIN DE CHILENIAGARA

g/mLCHIVILCAN

g/mLPITRUFQUEN

g/mLCIM4Punto

Droga Rango CIM502 CIM903 Rango CIM50 CIM90 Rango CIM50 CIM90 Corte

Penicilina G1 0,063 a 0,5 0,25 0,5 8 a 16 8 16 0,063 a 64 0,13 16 0,25

Ampicilina 0,13 a 0,25 0,25 0,25 4 a 8 4 8 0,13 a 8 0,25 8 0,5

Cloxacilina 0,25 a 0,5 0,5 0,5 0,5 a 0,5 0,5 0,5 0,25 a 1 0,5 1 4

Neomicina 0,5 a 1 1 1 0,25 a 1 1 1 0,5 a 1 1 1 64

Enrofloxacino 0,25 a 1 0,25 1 0,25 a 1 0,25 1 0,25 a 1 0,5 0,5 >41Expresado en UI/mL. 2CIM50 Mnima concentracin que inhibe el 50% de los aislamientos probados. 3CIM90 Mnima concentracin que inhibe el90% de los aislamientos probados. 4Segn NCCLS [13].

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