Introducere

Studiul enzimelor sub toate aspectele prezinta o importanta deosebita din punct de vedere fundamental, contribuind la intelegerea mecanismelor moleculare ce stau la baza transformarilor moleculare din celula vie si la dezvoltarea altor stiinte moderne si domenii interdisciplinare cum ar fi biologia moleculara, genetica si ingineria genetica, microbiologia, fiziologia animalelor, plantelor si microorganismelor, biotehnologia si altele.

Inca din antichitate omul cunostea diferite procese de transformare, realizate de catre organismele vii, in special microorganisme (obtinerea vinului, otetului, painii), mult timp insa, mecanismele moleculare ce stau la baza acestor procese, locul si rolul enzimelor in desfasurarea lor au ramas necunoscute. Chiar si astazi, multe mecanisme de actiune ale enzimelor, precum si unele procese biochimice raman inca neelucidate.

Sfasitul secolului XX a insemnat insa, o dezvoltare fara precedent a cercetarii in enzimologie, cu largi implicatii in biotehnologie – imobilizarea enzimelor, organismelor celulare si a celulelor intregi pe suporturi solide. Biocatalizatorii heterogeni astfel obtinuti si-au gasit deja largi aplicatii in medicina, industria alimentara si de medicamente, chimia analitica, epurarea apelor reziduale si alte domenii ale activitatii umane.

Dintre enzimele cunoscute pana in prezent, aproximativ 30% sunt transferaze. Reactiile catalizate de transferaze sunt reactii biomoleculare in care un substrat joaca rolul de donor iar celalalt rolul de acceptor al gruparii transferate. Din aceasta cauza denumirea sistemica a acestor enzime este de tipul donor:acceptor transferaza.

ARN-polimeraza este o enzimă din clasa transferazelor care produce acidul ribonucleic şi are functia de catalizator al procesului de transcripţie al ADN-ului în ARN.

În organismele procarionte există doar un singur fel de ARN-polimerază spre deosebire de organismele eucarionte în care se întâlnesc trei forme:

1. ARN-polimerază I care catalizează sintetizarea ARN-r (ribozomal) în nucleu2. ARN-polimerază II care catalizează sintetizarea ARN-m3. ARN-polimerază III care atalizează sintetizarea ARN-t

1

Capitolul I

I.1 Codul enzimei ARN - polimeraza: EC 2.7.7.6

I.2 Denumirea: ARN-polimeraza ADN dependenta Denumiri alternative:ARN-polimeraza ADN-dependenta.

ARN nucleotidiltransferaze (ADN-directionat).

ARN polimeraza I.

ARN-polimeraza II.

ARN-polimeraza III.

In afara de acestea mai exista si ARN polimeraza ARN dependenta. ARN-polimeraza face parte din clasa transferazelor, subclasa fosfotransferaze,subsubclasa nucleotidiltransferazelor, ceea ce inseamna ca sunt enzime care catalizeaza transferul gruparii PO4 nucleozid de la un substrat donor la un substrat acceptor.

I.3 Structura ARN polimerazei

Structura ARN polimerazei Pol II a fost determinata prin reconstituire 3D prin micrografie electronic 2D la 16 A, în laboratorul Roger Kornberg (Universitatea Stanford) de Darst si altii în 1991. Imaginea arata doua structuri diferite de molecule II-Pol de-a lungul axei molecule de ADN. Caracteristica cea mai proeminentă a structurii este o acumulare de proteine care inconjoara un canal de aproximativ 25 A, in diametru, similară cu cea constatata la ARN polimeraza Escherichiei Coli. Canalele de 25 de A in diametru se bifurca la suprafata proteinei, facand conexiunea cu un canal de 25 A in diametru, precum si cu un canal pe jumatate ca diametru. Dimensiunile generale ale unei singure molecule Pol II, în 3D sunt de aproximativ 140 x 136 x 110 Å.

2

Capitolul II

Metode de determinare a activitatii ARN polimerazei

Determinarea activitatii catalitice a unei enzime poate fi evidentiata fie prin evaluarea volumului de substrat fie prin evaluarea produsului de reactive format. Pentru marea majoritate a enzimelor viteza de reactive este o functie liniara de timp doar pentru primele minute de reactive. Din aceasta cauza determinarea activitatii enzimelor se face prin efectuarea transformarii respective in conditii optime de reactii intr-un interval de timp in care aceasta dependent este liniara. Dupa scurgerea acestui interval de timp se stopeaza reactia enzimatica printr-o modalitate sau alta dupa care se determina fie concentratia substratului (substratelor) fie a produsului (produsilor) de reactive prin metode fizico-chimice specific. Crearea conditiilor optime de reactive inseamna crearea unor conditii de pH temperature, presiune osmotic, raport masic enzima / substrat etc. care sa fie cat ma apropiate de conditiile naturale, adica de conditiile pe care enzima le gaseste in vivo. In functie de proprietatile fizico-chimice, ale substratelor sau produsilor de reactie metodele de determinare a activitatii enzimelor se impart in mai multe grupe:

- Metode spectrofotometrice;- Metode fluorimetrice;- Metode titrimetrice;- Metode calorimetrice;- Metode polarimetrice.[1]

Reactivi si kit-uri pentru determinarea activitatii polimerazei:

Determinarea activitatii ARN polimerazei a facut obiectul unei inventii patentate in SUA sub numarul 5,635,350, de inventatorii: Josef Eberle, Munich, Rudolph Seibl, Penzberg, Cristoph Kessler, Dorfen, Berg, toti din Germania. Inventia se refera la metode de determinare a

3

activitatii enzimatice a polimerazei si implemetarea metodei mentionate in detectarea HIV, de determinare a efectului inhibitor a substantelor asupra activitatii polimerazei, de determinare a anticorpilor pentru polimeraza si a secventelor promoter. Redam mai jos metoda de detectare a HIV care contine si metoda de determinare a activitatii enzimatice.

II.1 Detectarea HIV:

a) preparea virusului HIV:

2-3 ml de supernatant fara celule de colonie de HIV virusi, sau solutie de virusi izolati. Centrifugare la 20.000 de rotatii pe minut, timp de 2 ore,care conduce la obtinerea de virusi granulati.

b) liza virusilor granulati:

Virusii granulati sunt dizolvati in 40 micrograme de tampon de liza care e format din :

1,4 ditioeritrit (DTT, Merck, Darmstadt), 2,5 mM, EDTA 0.75 mM, KCl 80 mM, HCl 50 mM, pH 8.0, 22 grade Celsius.

La 2 grade Celsius lizatul poate fi pastrat fara ca activitatea sa scada insignifiant.

c) incubare, reactia polimerazei:

20 microlitri de solutie urmatoare sunt adaugati lizatului:

DTT 10 mM,KCl 290 mM, MgCl2 30 mM, dTTP 8,3 micrograme, Biotin-16-dUTP 125 nM, DIG-11-dUTP 2,5 micromoli, acid poliadenilic* acid pentadecatimidilic (PoliA)*(dT)15, pH 8.00, 22 grade Celsius.

Incubare la 35 grade celsius 90 minute-24 ore in functie de sensitivitatea testului.

d) izolarea produsilor de reactie:

Mixtura de reactie este transferata in puturi streptavidin-filmate si apoi incubate 60 min la 35 grade Celsius.

e) spalare:

f) incubare cu anticorpi marcati,

g) decantare 60 min,

h) reactie colorimetrica:200 microlitri ABTS sunt pipetati pe fiecare placa a puturilor,dupa reactie coloratia e masurata la fotometru la 405-450 nm.

4

II.2 Detectarea activitatii ARN polimerazei ADN dependenta si secventelor specifice promoteri pentru ARN polimeraza asupra ADN-ului

3 fragmente AND care contin promoteri pentru fiecare ARN polimeraza, T7-ARN polimeraza sau T3-ARN polimeraza care sunt in reactive de transcriptie sunt incubate cu ribonucleotide. Mixtura contine si Dig UTP si Bio UTP si, ori SP6 RNA polimeraza, ori T7 RNA polimeraza. In ambele cazuri in care promoterii si polimerazele corespund, nucleotidele incorporate in lantul ARN sunt complementare cu ADN-ul.

Dupa incubare solutiile sunt transferate in puturile streptavidin-filmate cu placi ELISA. Rezidurile de biotina incorporate sau neincorporate se vor lega de streptavidin.

Activitatea ARN polimrazei poate fi detectata prin detectarea de digoxigenin nucleotide care sunt covanlent legate de biotin-nucleotide cu ajutorul antidigoxigenin-anticorpilor.

5

Reactiilor de transcriptie li s-au adaugat 10 mmoli/l Tris HCl, 1 mmol EDTA, la pH 8.0. Portiuni de 20 microlitri de de dilutie din reactiile de transcriptie sunt pipetate pe fundul placilor puturilor streptavidin-filmate si 180 microlitri de 0,05 % (vol/vol) sol Tween 20. Totul se acopera cu capacele pentru a se efectua reactia de legare. Se agita. Reactiile in care componentele nu s-au legat sunt inlaturate in 6 pasi de spalare cu 300 microlitri de 0,9% solutie NaCl.

Detectarea cu un conjugat antidegoxigenin-anticorp si reactia de culoare: Se adauga sol antidigoxigenin-POD (200U/I, Cat, no.1207733 Boehringer Mannheim) dupa 60 min, se face spalare cu NaCl.

1200 ml ABTS solutie de substrat sunt incubati la 37 grade Celsius timp de 5-60 min si coloratia este masurata cu fotometrul la 405 nm.

Capitolul III

III.1 Functiile ARN polimerazei:

Atat ARN cat si ADN polimeraza isi pot adauga nucleotide la lantul initial marindu-si lungimea. Dar exista o mare diferenta intre cele doua, ARN polimeraza poate intia un nou lant in timp ce ADN polimeraza nu il poate initia.

6

In timpul replicarii, o oligonucleotida (primer) trebuie sa fie sintetizata de o enzima diferita. Nucletotidele utilizate pentru a extinde un lant ARN sunt ribonucleotzidele trifosfat (NTPs). Doua grupuri de fosfat sunt eliberate ca pirofosfat (PPi) in timpul reactiei. Alungirea lantului se face in directia 5’-3’.

Reactia chimica catalizata de ARN polimeraza

7

Prezentarea elongatiei lantului: liniile verticale reprezinta pentozele iar cele orizontale legaturile difosfodiesterice

Transcriptia cu ajutorul ARN polimerazei:

In procesul de transcriptie exista trei mari etape:

1)Initierea-construirea complexului ARN polimeraza cu ajutorul factorilor de transcriptie

2)Elongatia-transcriptia propriu-zisa a majoritatii genelor intr-o secventa de ARN

3)Terminatia-incetarea transcriptiei si dezasamblarea complexului ARN polimeraza

Initierea transcrierii

Legarea ARN polimerazei la situsul promoter

Promotorii sunt secvente specific continute in AND si care sunt recunoscute de ARN polimeraza. Dimensiunile secventei promoter sunt variabile. Enzima “miez” singura nu poate recunoaste regiunile promotor, subunitatea sigma fiind esentiala in acest sens. Pe parcursul legarii ARN polimerazei de ADN evenimentele se succed in umatoarea ordine:

- subunitatea sigma ARN polimerazei recunoaste secventa promotor- ARN polimeraza desface structura dublu helicoidala si deschide molecula de ADN- ARN polimeraza initiaza sinteza ARN pe tiparul de ADN monocatenar astfel

obtinut

Caracteristicile secventei promotor

Caseta Pribnow este o secventa continuta in toate secventele promotor de la toate procariotele. Este situata la 5 – 10 baze la stanga (in amonte) de prima baza ce va fi copiata in ARN. Ea orienteaza ARN polimeraza ca directie si ca punct de start a sintezei. Caseta Pribnow contine secventa nucleotidica 5’TATAAT3’. Caseta “-35” reprezinta un al doilea situs de recunoastere in multe secvente promotor (in amonte de secventa Pribnow). Ea pare sa fie situsul initial de legare a subunitatii sigma a ARN polimerazei. Caseta “-35” cuprinde secventa 5’ TTGACA3’. In regiunea “-35” ARN polimeraza se leaga slab la acest promotor formand complexul inchis de initiere. Prin conventie punctul de start al transcrierii este notat cu +1 si va dicta capatul 5’ al transcriptului primar. Promotorii sunt situati in amonte si se noteaza cu semnul “-“. Secventele din aval fata de +1 se noteaza cu “+”. Datorita dimensiunii foarte mari ARN polimeraza aluneca catre caseta Pribnow si in momentul in care ajunge la ea se disociaza de situsul initial de recunoastere. In aceasta etapa se formeaza complexul deschis de initiere. Complexul ADN deschis – promotor care este un intermediar activ in intierea sintezei ARN. ARN polimeraza contine doua situsuri specifice pentru legarea nucleozidelor trifosforizate (NTP).

8

Primul NTP ce urmeaza a fi incorporate in structura ARN se leaga de situsul de initiere al ARN polimerazei si formeaza punti de hidrogen cu baza complementara de pe ADN din cadrul complexului ADN deschis promotor. Acest situs leaga numai NTP purinice (majoritatea transcriptelor ARN incep cu baza A). Al doilea NTP ce urmeaza a fi incorporat in structura ARN se leaga in situsul de elongare al polimerazei. Alegerea celui de al doilea NTP ce va intra in structura ARN se face pe baza capacitatii sale de a forma leghatuiri de hydrogen cu baza complementara din structura ADN a complexului ADN deschis. ARN polimeraza catalizeaza formarea primei legaturi fosfat diesterice intre nucleotidul +1 aflat in situsul de initiere si nucleotidul +2 aflat in situsul de elongare. ARN polimeraza initiaza sinteza catenelor poliribonucleotidice fara a avea nevoie de primeri. Dupa formarea primelor legatuiri fosfat diesterice subunitatea sigma disociaza din complexul ARN polimeraza – ADN – ARN si se asociaza unei alte ARN polimeraze “miez”, reluand un nou ciclu in procesul de transcriere.

9

10

[2]

III.2 Raspandire

ARN polimeraza AND dependent se gaseste in toate organismele eucariote si procariote. Alaturi de ARN polimeraza ADN dependenta, exista si ARN-polimeraza ARN dependenta (RdRP), sau replicatorul ARN, care este o enzimă ce catalizează replicarea ARN pornind de la un ARN şablon. Acest tip de ARN polimeraza este in contrast cu ARN polimeraza ADN dependenta care catalizeaza replicarea ARN pornind de la un sablon ADN.

RdRP viral a fost descoperit la începutul anilor 1960 datorita unor studii privind meningovirusul si virusul poliomielitei, atunci când s-a observat că aceste virusuri nu au fost sensibile la actinomicin D, un medicament care inhibă sinteza AND-ului celular. Lipsa de sinsibilitate a acestor virusi a sugerat că există un virus specific, o enzima care ar putea copia ARN-ul pornind de la un şablon ARN, şi nu de la un sablon ADN.

11

Cel mai celebru exemplu de RdRP este virusul poliomielitei. Virusul este format din ARN, care intră în celule prin endocitoză receptor-mediată. De acolo, ARN-ul este capabil să acţioneze ca un şablon pentru sinteza ARN complementar, imediat. Componentele complementare sunt apoi, ele insele, capabile să acţioneze ca un şablon pentru producerea de genomi virali noi, care sunt în continuare ambalati şi eliberati din celula, gata de a infecta alte celule gazdă. [3]

III.3 Utilizari:

ARN polimeraza poate fi folosita pentru tratarea unor boli imunologice si ca o sonda enzimatica a structurii nucleosomale sau mai poate fi folosita la analiza expresiei genelor.

Bacteriofagul T7 ARN polimeraza se utilizeaza ca si catalizator direct-selectiv la nivel înalt, de gene clonate.

12

IV CONCLUZII

1.Studiul activitatii catalitice a enzimelor, a mecanismului de actiune, cineticii reactiilor enzimatice prezinta o importanta teoretica de necontestat pentru studiul metabolismului substantelor si energiei in organismele vii, reglarea si controlul acestora, intelegerea anomaliilor metabolice etc.

2.Cel mai nou domeniu stiintific, care prezinta totodata si cele mai largi perspective pentru viitorul imediat sic el indepartat, il reprezinta biotehnologia. In ultimul timp, tot mai multi oameni de stiinta impartasesc idea ca asa cum secolul XX a apartinut electronicii, in acelasi mod secolul XXI va apartine biotehnologiei. In ceea ce priveste importanta enzimologiei pentru cercetarea si productia biotehnologica, actualmente se disting doua posibilitati de valorificare a cunostintelor in acest domeniu:

-aplicarea cunostintelor teoretice si practice de enzimologie in vederea realizarii unor procese de biotransformare in industria de sinteza si semisinteza precum si in optimizarea unor procese tehnologice din industria de medicamente, panificatie, industria vinului, a berii si a bauturilor spirtoase , industria de prelucrare a laptelui,de cofetarie, etc.

-imobilizarea enzimelor, structurilor subcelulare si a celulelor intregi si utilizarea preparatelor obtinute in medicina, chimia analitica, industria usoara etc.

3.Determinarea activitatii unor enzyme este extreme de importanta in diagnosticul unor boli, atat la om cat si la animale, dat fiind interdependent dintre activitatea enzimatica si procesul normal si pathologic al diferitelor secvente metabolice.

4.Enzimele se utilizeaza de multa vreme cu success in diferite procese de biosinteza. Specificitatea de actiune a acestora , viteza mare de reactive, posibilitatea realizarii proceselor de biotransformare in conditii blande de reactie , lipsa compusilor secundari indezirabili constituie o parte din factorii care faciliteaza utilizarea enzimelor in calitate de catalizatori ai multor procese de biotransformare.In organismul viu au loc zeci de mii de reactii enzimatice diferite. Problema obtinerii anumitor produsi ai acestor reactii in vitro este pe deplin realizabila.

13

CUPRINS:

Introducere……………………………………………………………………………pag 2

Capitolul I……………………………………………………………………………..pag 3

I.1 Codul enzimei………………………………………………………………pag 3

I.2 Denumirea enzimei………………………………………………………pag 3

I.3 Structura ARN-polimerazei…………………………………………….pag 3

Capitolul II……………………………………………………………………………..pag 4

Metode de det a activitatii ARN polimerazei………………………….pag 4

II.1 Detectarea HIV……………………………………………………………pag 5

II.2 Detectarea activitatii ARN pol ADN dependenta si secventelor specifice promoteri pentru ARN polimeraza asupra ADN-ului………….pag 6

Capitolul III……………………………………………………………………………pag 7

III.1 Functiile ARN polimerazei………………………………………….pag 7

III.2 Raspandire…………………………………………………………………pag 12

III.3 Utilizari………………………………………………………………………pag 13

IV CONCLUZII………………………………………………………………….…..pag 14

14

BIBLIOGRAFIE

Internet:

http://www.freepatentsonline.com/5635350.pdf

http://en.wikipedia.org/wiki/RNA-dependent_RNA_polymerase

http://www.web-books.com/MoBio/Free/Ch4B1.htm

http://en.wikipedia.org/wiki/RNA_polymerase_I

Referinte:

1.Cojocaru D.C., Enzimologie generala, Editura Tehnopress, Iasi 2007,pag 448-453

2.Atanasiu V, Biochimie medicala, Editura universitara “Carol Davila”, Bucuresti 2006, pag 228-232

3.Rusu L,Enzimologie industriala, Editura Alma Mater , Bacau 2007, pag 151-176

15