aptameri a dna: materiali innovativi per l'analisi di...
TRANSCRIPT
IV Congresso NazionaleIV Congresso NazionaleLe Micotossine nella Filiera AgroLe Micotossine nella Filiera Agro--AlimentareAlimentaregg
Aptameri a DNA:
materiali innovativi per
l'analisi di micotossine
Annalisa De Girolamo, Roberto Schena, Angelo Visconti
Istituto di Scienze delle Produzioni Alimentari (ISPA)
Roma, 11-13 Giugno 2012
Istituto di Scienze delle Produzioni Alimentari (ISPA)Consiglio Nazionale delle Ricerche (CNR)
AnticorpiAnticorpi
Vantaggi
Elevata selettività e specificità di riconoscimento
Vasto campo di applicazione
Svantaggi
Produzione in-vivoProduzione in vivo
Suscettibilità alla denaturazione
Va iabilità t a i lotti di p od ioneVariabilità tra i lotti di produzione
Costi elevati
MaterialiMateriali innovativiinnovativi per per l’analisil’analisi didimicotossinemicotossine
Polimeri sintetici (Molecularly Imprinted Polymers, MIP)
Frammenti di anticorpi
Tratto da: Maragos, 2009. Anal Bioanal Chem395:1205
Peptidi sintetici AptameriCiclodestrine
Tratto da: Giraudi et al., 2007. J Chromatog A 2:174
Tratto da: Maragos et al., 2008. Food Addit Contam Part A, 25:164
CosaCosa sonosono gligli aptameriaptameri??
Brevi catene oligonucleotidiche a singolo
filamento (ssDNA or RNA)
Sintetizzati mediante un processo di selezione e
amplificazione in vitro chiamato SELEX
(Systematic Evolution of Ligands by EXponential
enrichment)
Sono in grado di legare con elevata specificità edg g p
affinità la molecola bersaglio (proteine, vitamine,
cellule intere, antibiotici, micotossine).cellule intere, antibiotici, micotossine).
Le interazioni tra aptamero e molecola bersaglio sono di
tipo non-covalente (legami idrogeno interazioni elettrostatichetipo non covalente (legami idrogeno, interazioni elettrostatiche,
forze di van der Waals).
AptameriAptameri vsvs anticorpianticorpi
Produzione in-vitro
Lunga “shelf-life”
Elevata riproducibilità tra i lotti di produzione
Elevata stabilità (presenza di solventi, bassi pH)
Denaturazione reversibile senza perdita di specificitàDenaturazione reversibile senza perdita di specificità
Costi di produzione contenutip
Facilmente modificabili con traccianti o fluorofori senza
perdita di selettività e specificità
ProcessoProcesso didi selezioneselezione SELEXSELEX
1 Lib i d di t i
Sequenza fissa (18-20 nt)
Regione random(20-80 nt)
Sequenza fissa (18-20 nt)
-3’5’-
1. Libreria random di aptameri(1013-1015 aptameri)
2 Legame
5. Amplificazione
Prodotto amplificato
PCRMolecola bersaglio 2. Legame
Aptameri specifici
3. Lavaggio 4. Eluizione
Aptameri non specifici
ProcessoProcesso didi selezioneselezione SELEXSELEX
6 Clonaggio6. Clonaggio
7. Sequenziamento
8. Studi di affinità
2 Legame
5. Amplificazione
Prodotto amplificato
PCRMolecola bersaglio 2. Legame
Aptameri specifici
Cicli SELEX(da 6 a 20)
3. Lavaggio 4. Eluizione
Aptameri non specifici
Selezione negativa
Molecole simili
AptameriAptameri specificispecifici per per micotossinemicotossine
Ocratossina A (OTA)
- Cruz-Aguado JA and Penner G., 2008. J Agric Food Chem,
56:10456
- Barthelmebs L, Jonca J, Hayat A, Prieto-Simon B, Marty JL 2011.
Food Control 22:737–743
Fumonisina B1 (FB1)
McKeague M, Bradley CR, De Girolamo A, Visconti A, Miller
DJ, DeRosa MC, 2010. Int. J. Mol. Sci. 11:4864
Aflatossina B1 (AFB1) e Zearalenone (ZEA)
Lee LC, Cruz-Aguado JA, Penner GA (2010) PCT Patent Application,
WO 2011/020198.
AptameriAptameri specificispecifici per per micotossinemicotossine
Ocratossina A (OTA)
13 cicli SELEX36 basiAffinità di legame verso OTA (kd): 200 nMAffinità di legame verso OTA (kd): 200 nMCross-reattività verso OTB: 1%
ssDNA Buffer di lavoro
Cations+ +
10 mM TRIS (pH 8.5)
120 mM NaCl
OTA
+ + 5 mM KCl
20 mM CaCl2OTA 20 mM CaCl2
ColonneColonne ad ad affinitàaffinità ((aptamericheaptameriche):):proceduraprocedura propostapropostaproceduraprocedura propostaproposta
Incubazione
Coniugazione
Cross-linker(EDC)
+ DADPA
AptameroOTA
Resina di agarosio(diammino dipropilammina)
Fase stazionaria(0,08 nmol DNA/µL resina)
100 µL fase stazionaria (colonne da 1-mL)Preparazione
colonne
µ ( )
200 µL fase stazionaria (colonne da 1-mL)
200 µL fase stazionaria (colonne da 3-mL)
300 µL fase stazionaria (colonne da 3-mL)
De Girolamo A, McKeague M, Miller DJ, DeRosa MC, and Visconti A, 2011. Food Chem., 127:1378
OTA OTA nelnel frumentofrumento duroduro::colonnecolonne aptamericheaptameriche/HPLC/HPLC--FLDFLDcolonnecolonne aptamericheaptameriche/HPLC/HPLC FLDFLD
Estrazione(metanolo:acqua)
Campione naturalmente contaminatocon 1.5 µg/kg OTA
Agitazione, 5 min
Filtrazione (Whatman Nº 4)
Diluizione (1:5) con buffera
Filtrazione (Whatman GF/A)Campione bianco
Purificazione
su colonne aptameriche
Lavaggio
Eluizione con metanolo
Determinazione Determinazione HPLC/FLD HPLC/FLD (λec = 333 nm, λem = 460 nm)
De Girolamo A, McKeague M, Miller DJ, DeRosa MC, and Visconti A, 2011. Food Chem., 127:1378
aBuffer di lavoro = 10 mM TRIS (pH 8.5), 120 mM NaCl, 5 mM KCl, 20 mM CaCl2.
PrestazioniPrestazioni analiticheanalitiche del del metodometodo sviluppatosviluppato
LOQ: 0,08 µg/kg12
)
y = 0.891 x – 0.09r = 0.990Q , µg/ g
8
10
ean
-up
(ng
/g
PTA
/H
PLC
)
Accuratezza: 84%
Precisione: ≤ 8% 4
6
pta
mer
SP
E c
le
Limite di legge
[µg
/kg
], (
AP
Applicabilità: 0,08 - 50 µg/kg0
2
OTA
by
ap
OTA
[
Validazione: 33 campioni di frumento
0 2 4 6 8 10 120
OTA by IMA clean-up (ng/g)OTA [µg/kg], (IMA/HPLC)
(IMA/HPLC vs APTA/HPLC)
RiutilizzoRiutilizzo:: fino a 5 volte (recuperi 92-105%, RSD 2-7%)( p , )
De Girolamo A, McKeague M, Miller DJ, DeRosa MC, and Visconti A, 2011. Food Chem., 127:1378
OTA OTA nelnel frumentofrumento duroduro: : Sistema innovativo di rivelazione a fluorescenzaSistema innovativo di rivelazione a fluorescenza
OTA-Sense® system
++
Colonne aptameriche
(OTA-Sense® Affinity column)
Soluzione fluorescente di terbio
(OTA-Sense® buffer solution)
Soluzione di
aptamero per OTA(OTA Sense Affinity column) (OTA Sense buffer solution) aptamero per OTA
Fluorescenza Risolta nel Tempo/
T f i t di E i RiTrasferimento di Energia per Risonanza
De Girolamo A, Lee L, Penner G, Schena R, Visconti A, 2012. Anal Bioanal Chem, in stampa.
FFluorescenza luorescenza RRisolta nel isolta nel TTempo eempo eTrasferimento di Energia per Risonanza Trasferimento di Energia per Risonanza
hh�
Fluorescenza Risolta nel Tempo (TRF)
OTA
Alcuni lantanidi
Terbio (Tb)
Fluorescenza Risolta nel Tempo (TRF)
Terbio (Tb)
Lantanio (La)
Samario (Sm)
Europio (Eu)
….Trasferimento di Energia per Risonanza (FRET)
TRF del TRF del complessocomplesso didi coordinazionecoordinazioneTerbioTerbio--OTAOTATerbioTerbio OTAOTA
Selezione della λem*
700
800 Soluzione standard OTA (100 nM)
Soluzione Terbio (3 M)
λem = 540 nm
500
600
)(3 mM)
Complesso Terbio-OTA
400
500
cen
za
(R
FU
200
300
Flu
ore
s
0
100
450 475 500 525 550 575 600 625 650
*λec = 370 nm
Lunghezza d'onda di emissione (nm)
TRF del TRF del complessocomplesso didi coordinazionecoordinazioneAptameroAptamero--TerbioTerbio--OTAOTAAptameroAptamero TerbioTerbio OTAOTA
Ottimizzazioneconcentrazione terbioconcentrazione terbio
60000U
)
40000
50000
ela
tiva (
RFU
30000
esc
en
za re
10000
20000
Flu
ore Aptamero-Terbio-OTA
(soluzione standard)*
Aptamero-Terbio-OTA (in matrice)**
00 5 10 15 20 25
[Terbio] mM
(in matrice)**
Dati normalizzati rispetto al segnale di background del complesso Aptamero-Terbio.
* [OTA] = 2,5 ng/mL** [OTA] = 2,2 µg/kg
TRF del TRF del complessocomplesso didi coordinazionecoordinazioneAptameroAptamero--TerbioTerbio--OTAOTAAptameroAptamero TerbioTerbio OTAOTA
Valutazione Valutazione effetto matrice*
80000
stabilità complesso*
50000
60000
70000
(R
FU
)
20000
30000
40000
Flu
ore
sce
nza
soluzione std OTA
3.5 mg matrice
7 t i
0
10000
0,00 0,50 1,00 1,50 2,00 2,50
[OTA] ng/mL
7 mg matrice
14 mg matrice
[OTA] ng/mL
*Test del parallelismo e della posizione delle rette: tcalcolato < tStudent
OTA OTA nelnel frumentofrumento duroduro: : OTAOTA--SenseSense®® system system (colonne (colonne aptamericheaptameriche/TRF)/TRF)
Estrazione(acetonitrile:acqua)
OTAOTA SenseSense system system (colonne (colonne aptamericheaptameriche/TRF)/TRF)
(acetonitrile:acqua)Agitazione, 5 min
Filtrazione (Whatman Nº 4)
Purificazione su colonne
Diluizione (1:20) con buffera
Filtrazione (Whatman GF/A)
Purificazione su colonne
aptameriche (OTA-Sense®)
LavaggioLavaggio
Eluizione con metanolo
Diluizione (1:2) con soluzione fluorescente di terbio (OTA-Sense®fluorescente di terbio (OTA Sensebuffer solution)
Aggiunta dell’aptamero
Determinazione Determinazione TRF/FRETTRF/FRET(λec = 370 nm, λem = 540 nm)
OTAOTA--SenseSense®® systemsystem: : prestazioni analitiche del metodoprestazioni analitiche del metodo
LOQ: 0,5 µg/kg y = 0,918x - 0,100r = 0 98514
16
)
prestazioni analitiche del metodoprestazioni analitiche del metodo
Accuratezza: 77%
r = 0,985
10
12
14
en
se®/TR
F)
Precisione: ≤ 6%6
8
10
kg (
OTA
-Se
Linearità: 2,5 - 100 µg/kg2
4
6
[OTA
] µ
g/k
Limite di legge
0
2
0 2 4 6 8 10 12 14 16[OTA] µg/kg (IAC/HPLC-FLD)
Tempo di analisi: < 30 min
Validazione: 29 campioni di frumento naturalmente contaminato
(IMA/HPLC vs OTA-Sense® System)( y )
De Girolamo A, Lee L, Penner G, Schena R, Visconti A, 2012. Anal Bioanal Chem, DOI 10.1007/s00216-012-6076-6
ConclusioniConclusioni II
Sono note in letteratura le sequenze di aptameri a DNA
ifi i t i A f i i B fl t i Bspecifici per ocratossina A, fumonisina B1, aflatossina B1 e
zearalenone.
E’ stata messa a punto una metodica ad hoc per la
preparazione di colonnine ad affinità basate sull’impiegopreparazione di colonnine ad affinità basate sull impiego
dell’aptamero per ocratossina A.
E’ possibile utilizzare le colonne aptameriche in combinazione
con HPLC/FLD per la determinazione di ocratossina A nel
frumento.
Le prestazioni analitiche delle colonne aptameriche sonoLe prestazioni analitiche delle colonne aptameriche sono
comparabili a quelle delle colonne ad immunoaffinità.
ConclusioniConclusioni IIII
E’ stato utilizzato un sistema di rivelazione TRF/FRET basato
sull’interazione ocratossina A – terbio - aptamero per
aumentare la sensibilità del metodo di rivelazione
dell’ocratossina A in campioni di frumento.
Il metodo ha mostrato buone prestazioni analitiche ed una
buona affidabilità. Il metodo è inoltre idoneo all’analisi
parallela di numerosi campioni di frumento.
l i lid l i ll’ lGli aptameri rappresentano una valida alternativa all’utilizzo
degli anticorpi per l’analisi delle micotossine in prodotti
alimentari.
Basilica di S. Nicola, Bari Castel del Monte, BAT
NeoVenturesNeoVenturesBiotechnology Inc.
Linda Lee Maria C. DeRosaGregory Penner David J. Miller
Maureen McKeague