RNA-Seq-based analysis of the physiologic cold shock-induced changes in Moraxella catarrhalis gene expression.

Autores: Spaniol V., Wyder S., Aebi C.

Apresentação: Vitor Lima Coelho

Laboratório Nacional de Computação CientíficaMinistério de Ciência, Tecnologia e InovaçãoPetrópolis, Rio de Janeiro - Brazil

Tópicos• Introdução• Metodologia• Resultados e Discussão• Considerações finais

INTRODUÇÃO

Moraxella catarrhalis• Encontrada no trato respiratório superior

• Causadora de infecções:• Sinusite, conjuntivite, bronquite crônica, etc.

• Estudos clínicos revelam a sazonalidade das infecções e sua intensificação em períodos de inverno

Moraxella catarrhalis• A flora da nasofaringe humana é exposta

repetidamente à alterações súbitas de temperatura

• Choque frio pode ser clinicamente relevante durante períodos de clima frio pelo aumento temporário da virulência do organismo

Fonte: http://www.bacteriainphotos.com/Moraxella%20catarrhalis%20light%20microscopy.html

METODOLOGIA

Cepas da bactéria e condições de culturaRNA: preparaçãoAnálise de dados de RNA-SeqAnálise estatística

Cepas da bactéria e condições de cultura

• M. catarrhalis O35E• M. catarrhalis isolada clinicamente 415• Cultura:• 37º C• 200 rpm em BHI (DifcoTM) ou placas de ágar em uma atmosfera

contendo 5% CO2

• Alteração de temperatura da cultura:• Culturas expostas a 26oC e 37oC• Duração: 3 horas

RNA: preparação• Isolamento:• Rneasy Kit (Quiagen)

• Remoção de DNA:• Dnase I

• Análise de integridade:• Agilent bioanalyzer (Agilent technologies)

• Remoção de rRNA:• Ribo-zero rRNA removal kit

• Construção da biblioteca e sequenciamento:• TruSeq RNA sample preparation v2 (illumina)

Análise dos dados de RNA-Seq• Qualidade: • FASTQC

• Anotação: • RefSeq e PATRIC

• Alinhamento: • algoritmo BWA

• Quantificação de transcritos: • BEDTools

• Normalização e expressão diferencial: • DESeq

Análise dos dados de RNA-Seq• Quantidade de reads para cada gene:• Combinação dos dados de três réplicas biológicas

• Cálculo e ajuste dos P-values:• FDR (False Discovery Rate)

• Classificação funcional dos genes projetada a partir do genoma da M. catarrhalis RH4:• Identificação das proteínas ortólogas entre diferentes cepas

usando o melhor blast hit recíproco

Análise estatística• Desvio padrão médio: ± 1• Diferenças entre grupos:• Análise de variância one-way com correção de Bonferroni

(software Prism 5.01)• P < 0,05 foi considerado como significante estatisticamente

RESULTADOS E DISCUSSÃO

Genes diferencialmente expressos envolvidos em:• Transcrição e replicação• Metabolismo de lipídio• Biossíntese do envelope proteico• Metabolismo de nitrogênio• Aquisição de ferro• Metabolismo de fosfato• Metabolismo de enxofre• Stress oxidativo• Metabolismo de nucleotídeos

Sequenciamento da M. catarrhalis após exposição a 26oC e 37oC • RNA-Seq foi executado para 3 réplicas biológicas

• Crescimento em diferentes temperaturas utilizando Illumina HiSeq 2000 system.

Sequenciamento da M. catarrhalis após exposição a 26oC e 37oC • Total de reads• = 183 milhões

• Total de reads de mapeamento único• = 47.900.062

• Reads alinhados com regiões de non-rRNA para cada amostra • = 3,2-14,5 milhões (25% do total de reads)

Sequenciamento da M. catarrhalis após exposição a 26oC e 37oC

Amostra Reads alinhados Reads ≠ rRNAReads de mRNA (% de

todos os reads mapeados)

26°C_1 13.807.058 3.214.746 23%

26°C_2 27.880.294 9.966.862 36%

26°C_3 17.127.887 5.791.186 34%

37°C_1 19.038.969 5.038.161 26%

37°C_2 66.832.479 14.576.839 22%

37°C_3 38.898.117 12.527.014 32%

Sequenciamento da M. catarrhalis após exposição a 26oC e 37oC • Alta similaridade dos níveis de expressão de RNA entre as duas

condições• R² > 0,97 e R² > 0,99, respectivamente

• 831 genes foram diferencialmente expressos de forma significativa, maior que 1.5-fold a 26oC• 429 genes regulados positivamente (RP)• 402 genes regulados negativamente (RN)

Genes diferencialmente expressos por função biológica

Validação por qRT-PCR

Transcrição e replicação• Indução da expressão por choque frio:• Vários genes (infB, rho, nusAB) envolvidos na modulação da

tradução foram induzidos por choque frio.• Fatores de transcrição (dksA, rho, nusA/B, nadR)• DNA-depent RNA polymerases (rpoA, rpoC)• Genes envolvidos na replicação de DNA, Recombinação e

reparo (dnaA/E, recN/G, topA)

Metabolismo de energia e carbono• Maior expressão a 37oC:• Enzimas glicolíticas (fbp, gapA, gpmI, eno, ppsA, aceE)• D-lactase dehydrogenase (dld)• L-lactase dehydrogenase (lldD)• Acetate kinase, necessário para conversão de acetato em acetyl-

CoA• Malic enzyme, que converte malato em piruvirato

• Regulados positivamente a 26oC:• Triose-phosphate isomerase (tpiA), catalisadora da conversão

reversível de glyceraldehyde-3-phosphate e dihydroxyacetone• Glucose-6-phosphate isomerase (pgi)

Metabolismo de energia e carbono• Regulados positivamente a 26oC:• Enzimas do ciclo de Krebs• Genes codificantes de succinate dehydrogenase (sdhA), aconitate

hydratase (acnB) e enzima do glyoxylate bypass (aceB)• Necessários para glucogênese

Metabolismo de Lipídeos• Indução a 26oC:• Genes codificantes de enzimas envolvidas na degradação de

ácidos graxos (fadJ, fadD/fadK, pgpA)• Expressão reduzida a 26oC:• Genes envolvidos na codificação de enzimas ou reguladores da

biossíntese de ácidos graxos (fabB, fabH, accABCD)• Indução após a exposição a 37oC:• ompE, putative Fadl homolog e long-chain-fatty-acid transporter

Biossíntese do envoltório celular• Os níveis de expressão de vários genes envolvidos na

biossíntese de LOS (lpxB, lpxX, kdtA e lgt6) foi elevado por choque frio.

• A expressão de genes codificadores de LpxB e LpxL acytransferases foram elevados a 37oC (incorporação de cadeias secundárias de acyl em lipídeo A)

• No entanto, verificou-se que 26oC pode não ser suficientemente baixo para induzir mudanças notáveis na estrutura LOS ou a ação recíproca da LpxB e LpxL acytransferases podem compensar esse efeito

Metabolismo de nitrogênio• Genes induzidos por choque frio:• Genes da via de desnitrificação (transformação de nitratos e

outras substâncias em gás nitrogênio): • Nitrite reductase (aniA), Nitric oxide reductase (norB), Nitrate ABC

transporter complex (nrtABCD)

• Gene repressor nsrR, indicando uma forma de prevenir a super-expressão descontrolada dos genes da via de desnitrificação

• Glutamine synthetase (glnA), envolvida na assimilação de nitrogênio

Aquisição de ferro• Regulação positiva em 26oC:• Genes codificadores de proteínas de ligação de transferrina

(tbpA/B) e lactoferrina (lbpA/B)• afeBCD gene cluster, envolvido na aquisição de ferro quelado

• Regulação negativa em 26oC:• Bacterioferritins A/B (bfrA/B) envolvida no armazenamento

intracelular de ferro (5.5 e 6.2-fold)

Metabolismo de fosfato• Os níveis de expressão de genes envolvidos no transporte de

fosfato e utilização tiveram um aumento significativo a 26oC em comparação com 37oC. Exemplo:• PstS -> Phosphate ABC transporter periplasmic phosphate-

binding protein (110-fold)• PstC -> Phosphate transport system permease protein (63-fold)

Metabolismo de enxofre• A transcrição dos genes envolvidos na via de assimilação de

enxofre (cys DHNI) foi regulada positivamente depois da exposição ao choque frio.• Via essencial para sobrevivência e expressão da virulência em

muitas bactérias patógenas.

Stress oxidativo

• Expressão gênica elevada a 37oC:• Genes envolvidos na resposta ao stress oxidativo:

superoxide dismutase A (sodA), catalase (katA), alkyl hydroperoxide reductase (ahpC/F), etc.• Indica tolerância ao stress oxidativo a 37oC

Metabolismo de nucleotídeos

• Nucleotídeos são importantes substratos para síntese e reparo de DNA

• A exposição a 37oC induz a expressão de genes associados ao metabolismo de nucleotídeos• Maioria dos genes envolvidos na biossíntese de purina

(purCHMN, guaB, prsA) e pirimidina (pyrBDE, carA)

Considerações Finais• É concebível que o choque frio promova a virulência da M.

catarrhalis

• Por exemplo:• Ativa a expressão do gene uspA1, que aumenta a aderência da

bactéria nas células epiteliais da faringe

• Diversas vias metabólicas associadas à resposta ao stress são ativadas

• Indução de um complexo de mecanismos adaptativos

OBRIGADO!