appl. environ. microbiol.-1987-wright-2222-5 (2)

7/31/2019 Appl. Environ. Microbiol.-1987-Wright-2222-5 (2)

1/5

1987, 53(9):2222.Appl. Environ. Microbiol.

Sara F. Wright, Joseph B. Morton and Janis E. Sworobuk

Immunosorbent AssayAntibodies in an Enzyme-LinkedMycorrhizal Fungus by Using MonoclonalIdentification of a Vesicular-Arbuscular

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2/5

A P P L I E D AND ENVIRONMENTAL M I C R O B I O L O G Y , S e p t . 1 9 8 7 , p . 2 2 2 2 - 2 2 2 5 V o l . 5 3 , N o . 90 0 9 9 - 2 2 4 0 / 8 7 / 0 9 2 2 2 2 - 0 4 $ 0 2 . 0 0 / 0C o p y r i g h t 1 9 8 7 , A m e r i c a n S o c i e t y f o r M i c r o b i o l o g y

I d e n t i f i c a t i o n o f a V e s i c u l a r - A r b u s c u l a r M y c o r r h i z a l F u n g u s b yU s i n g M o n o c l o n a l A n t i b o d i e s i n a n E n z y m e - L i n k e dI m m u n o s o r b e n t A s s a y tSARA F . W R I G H T , ' * JOSEPH B . M O R T O N,2 A N D JAN IS E . SWOROBUK1

A p p a l a c h i a n S o i l a n d W a t e r C o n s e r v a t i o n R e s e a r c h L a b o r a t o r y , A g r i c u l t u i r a l R e s e a r c h S e r v i c e , U . S . D e p a r t m e n t o fA g r i c u l t u r e , B e c k l e y , W e s t V i r g i n i a 2 5 8 0 2 - 0 8 6 7 , 1 a n d D i v i s i o n o f P l a n t a n d S o i l S c i e n c e s , W e s t V i r g i n i a U n i v e r s i t y ,M o r g a n t o w n , W e s t V i r g i n i a 2 6 5 0 6 - 6 0 5 7 2R e c e i v e d 1 0 A p r i l 1 9 8 7 / A c c e p t e d 9 J u n e 1 9 8 7

S p o r e m o r p h o l o g y i s c u r r e n t l y u s e d t o i d e n t i f y s p e c i e s o f v e s i c u l a r - a r b u s c u l a r m y c o r r h i z a l f u n g i . We r e p o r tt h e f i r s t u s e o f a h i g h l y s p e c i f i c i m m u n o l o g i c a l m e t h o d f o r i d e n t i f i c a t i o n o f a v e s i cu l a r - a rb u s c u l a r m y c o r r h i z a lf u n g u s . Two m o n o c l o n a l a n t i b o d i e s w e r e p r o d u c e d a g a i n s t G l o m u s o c c u l t u m . M o n o c l o n a l a n t i b o d i e s r e a c t e ds t r o n g l y w i t h b o t h s p o r e s a n d h y p h a e i n a n i n d i r e c t e n z y m e - l i n k e d i m m u n o s o r b e n t a s s a y . A l l o t h e rm y c o r r h i z a l ( 2 9 s p e c i e s ) a n d n o n m y c o r r h i z a l ( 5 s p e c i e s ) f u n g i t e s t e d w e r e n o n r e a c t i v e w i t h t h e m o n o c l o n a la n t i b o d i e s . A s i n g l e s p o r e o f G . o c c u l t u m w a s d e t e c t a b l e i n t h e p r e s e n c e o f h i g h n u m b e r s o f s p o r e s o f o t h e rv e s i c u l a r - a r b u s c u l a r m y c o r r h i z a l f u n g i . V a r i a t i o n i n t h e r e a c t i o n o f G . o c c u l t u m i s o l a t e s f r o m W e s t V i r g i n i a ,F l o r i d a , a n d C o l o m b i a s u g g e s t s t h a t m o n o c l o n a l a n t i b o d i e s may d i f f e r e n t i a t e s t r a i n s .

V e s i c u l a r - a r b u s c u l a r m y c o r r h i z a l (VAM) f u n g i a r e u b i q -u i t o u s a n d f o r m o b l i g a t e s y m b i o t i c a s s o c i a t i o n s w i t h am a j o r i t y o f l a n d p l a n t s . H o w e v e r , s p e c i e s a n d s t r a i n s d i f f e ri n t h e i r a b i l i t y t o i n f e c t a n d c o l o n i z e r o o t s , t o p r o m o t e p l a n tg r o w t h ( 5 ) , a n d t o t o l e r a t e d i s s i m i l a r s o i l e n v i r o n m e n t s ( 4 ) .M o s t f i e l d s o i l s c o n t a i n s p o r e s o f m o r e t h a n o n e VAMf u n g u s ( 1 ) , r e s u l t i n g i n r o o t s b e i n g c o l o n i z e d b y a m i x t u r e o fs p e c i e s . VAM f u n g i a s s o c i a t e d w i t h f i e l d - g r o w n p l a n t s h a v eb e e n i d e n t i f i e d s o l e l y b y m o r p h o l o g y o f a s e x u a l r e p r o d u c -t i v e s p o r e s o r s p o r o c a r p s ( 1 4 ) . I d e n t i f i c a t i o n i s b e c o m i n gm o r e d i f f i c u l t a s new s p e c i e s a r e d e s c r i b e d w h i c h d i f f e r o n l ys l i g h t l y i n m o r p h o l o g y . T h e d i s t r i b u t i o n a n d h a b i t a t r e q u i r e -m e n t s o f m o s t VAM f u n g i r e m a i n u n k n o w n b e c a u s e i n d i v i d -u a l s p e c i e s c a n n o t e a s i l y b e i d e n t i f i e d i n r o o t s o f i n f e c t e dp l a n t s . W i t h o n l y a f e w e x c e p t i o n s ( 1 ) , t h e m o r p h o l o g y o fm y c o r r h i z a l s t r u c t u r e s ( e . g . , h y p h a e , a r b u s c u l e s , a n d v e s i -c l e s ) i s s i m i l a r among s p e c i e s . T h e d i s c o v e r y o f s e v e r a la t y p i c a l VAM f u n g i ( 6 , 9 , 1 2 ) w h i c h f a i l t o s t a i n i nm y c o r r h i z a l r o o t s w i t h a v a i l a b l e m e t h o d s ( 3 , 1 1 ) a l s o p r e -v e n t s d e t e c t i o n i n m i x e d i n f e c t i o n s , u n l e s s s p o r e s a r e p r o -d u c e d i n s u f f i c i e n t n u m b e r s ( 8 ) . I m m u n o f l u o r e s c e n t ( 7 , 1 6 )a n d i m m u n o c h e m i c a l ( 2 ) t e c h n i q u e s h a v e b e e n a t t e m p t e d f o ri d e n t i f i c a t i o n o f h y p h a e o f i n d i v i d u a l VAM f u n g i u s i n gp o l y c l o n a l a n t i s e r a w h i c h w e r e e l i c i t e d b y c r u s h e d s p o r e o rh y p h a l a n t i g e n p r e p a r a t i o n s . Low a n t i s e r u m t i t e r s a n ds t r o n g c r o s s - r e a c t i v i t y among s p e c i e s , h o w e v e r , h a v e h a m -p e r e d f u r t h e r d e v e l o p m e n t o f t h e s e m e t h o d s . Enzyme s t a i n -i n g o f e l e c t r o p h o r e t i c p r o t e i n p r o f i l e s o f s p o r e s h a s b e e nu s e d t o c h a r a c t e r i z e G l o m u s s p e c i e s ( 1 3 ) . T h i s m e t h o d i sa p p l i c a b l e t o t a x o n o m i c s t u d i e s b u t i s n o t s u i t a b l e f o r u s ewhen l a r g e n u m b e r s o f s a m p l e s a r e t o b e e x a m i n e d .We r e p o r t t h e d e v e l o p m e n t o f a h i g h l y s p e c i f i c i n d i r e c te n z y m e - l i n k e d i m m u n o s o r b e n t a s s a y ( E L I S A ) w i t h m o n o -c l o n a l a n t i b o d i e s ( M A b s ) f o r d e t e c t i o n a n d i d e n t i f i c a t i o n o fp r o p a g u l e s o f a VAM f u n g u s , G l o m u s o c c u i l t l u m W a l k e r ( 8 ) .G . o c c u l t u i m i s a common a n d a b u n d a n t e n d o p h y t e i n h i g h l y

* C o r r e s p o n d i n g a u t h o r .t S c i e n t i f i c a r t i c l e n o . 2 0 6 1 o f t h e W e s t V i r g i n i a A g r i c u l t u r e a n dF o r e s t r y E x p e r i m e n t S t a t i o n .

a c i d i c W e s t V i r g i n i a s o i l s , p a r t i c u l a r l y i n s o i l s d i s t u r b e d b ys u r f a c e m i n i n g o f c o a l ( 8 ) . T h i s f u n g u s wa s c h o s e n b e c a u s ei t s h y a l i n e s p o r e s a r e d i f f i c u l t t o i d e n t i f y when m i x e d w i t ho t h e r VAM f u n g a l s p o r e s w h i c h a r e e i t h e r i m m a t u r e o rh y a l i n e a t m a t u r i t y . A l s o , G . o c c u i l t u m p r o d u c e d l a r g eq u a n t i t i e s o f s p o r e s i n g r e e n h o u s e p o t c u l t u r e ( 9 ) , w h i c hf a c i l i t a t e d a n t i g e n p r e p a r a t i o n .M A T E R I A LS A N D METHODS

A n t i g e n f o r i m m u n i z a t i o n o f m ic e. S p o r e s o f G . o c c u l t u mW a l k e r ( i s o l a t e 4 1 9 ) w e r e e x t r a c t e d f r o m o v e r b u r d e n m a t e -r i a l a t a n a b a n d o n e d c o a l m i n e s i t e n e a r O s a g e , W.V. T h es o i l w a s p r e d o m i n a n t l y b l a c k s h a l e w i t h a pH o f 3 . 6 a n dc o n t a i n e d 8 . 6 mg o f b i c a r b o n a t e - e x t r a c t a b l e P p e r k g ; 0 . 1 ,0 . 2 4 , a n d 0 . 1 c m o l ( + ) o f K , M g , a n d C a , r e s p e c t i v e l y , p e r k go f s o i l ; a n d 2 . 8 c m o l ( + ) o f A l p e r k g o f s o i l . E n o u g h s p o r e sw e r e m i x e d t h o r o u g h l y w i t h a s t e r i l i z e d s o i l - s a n d m i x t u r e( 1 : 2 , v o l / v o l ) s o t h a t t h e f i n a l i n o c u l u m d e n s i t y w a s 1 0 s p o r e sp e r cm o f s o i l . T h i s m i x t u r e w a s a d d e d t o 6 - i n . ( c a . 1 8 - c m )p l a s t i c p o t s a nd s ee d ed w i t h S o r g h u m s u d a n e n s e ( P i p e r )S t a p h . a t a r a t e o f 3 0 t o 4 0 s e e d s p e r p o t . S o i l a n d r o o t s f r o mp o t c u l t u r e s w e r e h a r v e s t e d a f t e r 4 m o n t h s a n d s t o r e d a t 4 Cu n t i l n e e d e d . S p o r e s w e r e e x t r a c t e d b y f o r c i n g s o i l t h r o u g h1 5 0 - a n d 3 8 - g m - m e s h s i e v e s w i t h w a t e r , c e n t r i f u g i n g t h ef r a c t i o n o n t h e 3 8 - t m - m e s h s i e v e i n a s u c r o s e g r a d i e n t ( 1 5m l o f 20 % s u c r o s e o v e r l a i d w i t h 1 5 m l o f 60% s u c r o s e ) a t 9 5 0x g f o r 4 m i n , a n d t h e n w a s h i n g s p o r e s c o l l e c t e d i n t h e 20 %s u c r o s e f r a c t i o n i n s t e r i l e d i s t i l l e d w a t e r .

S p o r e s w e r e c r u s h e d a n d l y s e d i n 3 m l o f w a t e r w i t h a0 . 5 - m l P o t t e r E l v e h j e m t i s s u e h o m o g e n i z e r , d i l u t e d i n p h y s -i o l o g i c a l s a l i n e t o a c o n c e n t r a t i o n ( o p t i c a l d e n s i t y a t 4 5 0 n m[ O D 4 5 0 ] ) o f 1 . 2 7 ( a p p r o x i m a t e l y 5 0 , 0 0 0 s p o r e s p e r m l ) , a n ds t o r e d f r o z e n .I m m u n i z a t i o n , f u s i o n , a n d ELISA p r o t o c o l s . Two 6 - w e e k -o l d f e m a l e BALB/c m i ce w e r e i n j e c t e d i n t r a p e r i t o n e a l l y w i t h1 . 0 m l o f t h e s p o r e s u s p e n s i o n o n d a y s 0 , 1 7 , a n d 3 7 a n d w i t h0 . 5 m l o n d a y 5 5 . S p l e e n c e l l s w e r e h a r v e s t e d o n d a y 5 8 a n df u s e d w i t h m u r i n e m y e l o m a c e l l l i n e P 3 / N S 1 / 1 - A g 4 - 1 ( 1 0 ) .H y b r i d o m a s w e r e c u l t u r e d i n 9 6 - w e l l m i c r o t i t e r p l a t e s . A l l1 9 6 w e l l s p l a t e d c o n t a i n e d f r o m f i v e t o e i g h t f u s e d c e l l s p e r2 2 2 2


3/5

IDENTIFICATION O F VA MYCORRHIZAE 2 2 2 3w e l l . A f t e r 1 0 d a y s o f g r o w t h , t h e h y b r i d o m a s u p e r n a t a n tw a s e x a m i n e d b y i n d i r e c t ELISA ( 1 5 ) w i t h 5 0 [ 1 I o f c r u s h e ds p o r e s u s p e n s i o n ( O D 4 5 ( ) = 0 . 0 8 9 ; a p p r o x i m a t e l y 4 0 0s p o r e s ) , d i s p e n s e d i n 9 6 - w e l l p o l y v i n y l c h l o r i d e p l a t e s( C o s t a r ) , a n d a l l o we d t o d r y o v e r n i g h t a t 3 5 C . G o a t a n t i -mouse i m m u n o g l o b u l i n G l a b e l e d w i t h h o r s e r a d i s h p e r o x i -d a s e w a s u s e d a s t h e i m m u n o c o n j u g a t e , a n d h y d r o g e np e r o x i d e a n d 2 , 2 ' - a z i n o - d i - ( 3 - e t h y l - b e n z t h i a z o l o i n e s u l f o n -a t e ) w e r e u s e d a s t h e s u b s t r a t e a n d c h r o m o g e n , r e s p e c t i v e l y( 1 7 ) . A b s o r b a n c e o f h y d r o l y z e d s u b s t r a t e w a s m e a s u r e d a t4 0 5 nm w i t h a n EIA R e a d e r ( B i o - t e k I n s t r u m e n t s , I n c . :m o d e l E 1 3 0 7 ) . The ELISA r e a c t i v i t y o f b l a n k s ( a n t i g e nr e a ct e d w i t h a l l r e a g e n t s e x c e p t MAbs) w a s s u b t r a c t e d f r o mt e s t a b s o r b a n c e v a l u e s . S u p e r n a t a n t s f r o m w e l l s t e s t i n gp o s i t i v e t o G . o c c u l t i t i n w e r e t e s t e d f o r c r o s s - r e a c t i v i t ya g a i n s t G l o m u l i i s i t i a p l i a l n l i l l m ( 5 0 p d : O D 4 5 0 = 0 . 0 9 5 ) l VAMf u n g u s w i t h s i m i l a r s p o r e c h a r a c t e r i s t i c s ( 8 ) .MAbs. C e l l l i n e s t h a t w e r e n o t c r o s s - r e a c t i v e w i t h G .d t i a p l h a n i u m t z w e r e c l o n e d t w i c e , a n d s u p e r n a t a n t s w e r e c o l -l e c t e d f r o m s u b s e q u e n t c u l t u r e s w h i c h h a d b e e n a l l o w e d t oo v e r g r o w . M A b s w e r e c h a r a c t e r i z e d a s t o s u b c l a s s b yd o u b l e i m m u n o d i f f u s i o n i n a g a r o s e o n g l a s s m i c r o s l i d e s .A n t i g e n s t e s t e d f o r c r o s s - r e a c t i v i t y . Hyphae o f G . o c c u l t i m lw e r e c o l l e c t e d b y s p r e a d i n g i n f e c t e d s u d a n g r a s s r o o t s o v e r a2 5 0 - p . m - m e s h s i e v e . Hyphae w e r e w a s h e d f r o m r o o t s o n t o a1 0 6 - p . m - m e s h s i e v e w i t h a f o r c e d w a t e r s p r a y . S i e v i n g s w e r ed e c a n t e d w i t h w a t e r i n t o a g l a s s p e t r i d i s h , a n d h y p h a e w e r eremoved f r o m r o o t f r a g m e n t s . C a r e a l s o w a s t a k e n t or e m o v e a t t a c h e d s p o r e s , w h i c h o f t e n w e r e e n m e s h e d i nh y p h a l a g g r e g a t e s . The h y p h a l m a s s wa s w a s h e d , b l o t t e dd r y , w e i g h e d , a n d c r u s h e d i n a t i s s u e h o m o g e n i z e r i n 2 0 0 p L .o f w a t e r . Hyphae ( w i t h a s s o c i a t e d s p o r e s ) o f nonmy-c o r r h i z a l f u n g i w e r e c o l l e c t e d f r o m p o t a t o d e x t r o s e a g a rp l a t e s a n d p r o c e s s e d s i m i l a r l y . N o n m y c o r r h i z a l f u n g i t e s t e dw e r e T r i c h l o d e r m n a s p . , M o u t i e r > e l l a i c a n d e l a b r u m v a r . T i e g ha n d LeMann i s o l a t e 1 0 5 6 , A l t e n a r i a t i i s o l a n i ( E l l i s a n d M a r -t i n ) S o r a u e r i s o l a t e 1 5 2 1 , E n i d o t l i i a i p a r a s i t i c a ( M u r r i l l ) A n -d e r s o n ( f r o m W. L . M a c D o n a l d , West V i r g i n i a U n i v e r s i t y ) ,a n d P h y t o p l i t h o r a i n f e s t a i n s ( M o n t a g n e ) d e B a r y ( f r o m R . J .Y o u n g , West V i r g i n i a U n i v e r s i t y ) .S p o r e s o f G l o m t u z i s ( l d b i c l i d a m W a l k e r a n d R h o d e s i s o l a t e 6 2 3 ,G . d i ( a p i l z a n a i o m n M o r t o n a n d W a l k e r i s o l a t e 3 8 8 , G . c l a r m m n zN i c o l s o n a n d S c h e n c k i s o l a t e 5 5 9 , G . c l a r o i d l e u m S c h e n c ka n d S m i t h ( f r o m H . D . S k i p p e r , C l e m s o n U n i v e r s i t y ) , G .c o n l s t r i c t i t u n T r a p p e i s o l a t e 5 9 7 , G . e t u n i ( c a l t m B e c k e r a n dGerdemann I s o l a t e 5 7 9 , G . i n t r a r a d i c i c e s S c h e n c k a n d S m i t h( f r o m N . C . S c h e n c k , U n i v e r s i t y o f F l o r i d a ) , G . g e o s p o r u m n( N i c o l s o n a n d Gerdemann) Walker i s o l a t e 5 4 6 , G .m n a c r o c a r p u l n T u l a s n e a n d T u l a s n e i s o l a t e 6 3 8 , ' " G .s p u r c u m P f e i f f e r a n d W a l k e r n o m . i n e d . i s o l a t e 5 6 7 , G .v e r s i f o ) r n e ( K a r s t e n ) B e r c h i s o l a t e 1 3 5 , G . l e p t o t i c h I t i m nS c h e n c k a n d S m i t h , " G l o n i t u s s p . O S I ' ' 3 8 6 . " G l o m I i i u s s p .B O 1 ' ' 5 9 6 , ' ' " G l o m u i s s p . J L 1 ' ' 5 9 1 . A c a u l o s p o r a b i r e t i c u l a t aR o t h w e l l a n d T r a p p e i s o l a t e 6 3 1 , A . d l e l i c a t a W a l k e r .P f e i f f e r , a n d B l o s s i s o l a t e 5 6 6 , A . c d i l t a t a t M o r t o n i s o l a t e4 9 2 , A . l a c u n i o s a M o r t o n i s o l a t e 4 6 1 , A . i - l u g o s ( i M o r t o ni s o l a t e 5 9 3 . ' A c a u l o s p o r a s p . B D 1 ' ' 4 1 7 , ' ' A c a u l o s p o r a s p .J L 5 ' ' 4 5 5 , " A c a u l o s p o r a s p . MN4' 5 7 5 . G i g a o s p o r a lg i g a i t n t e t i ( N i c o l s o n a n d G e r d e m a n n ) Gerdemann a n d T r a p p ei s o l a t e 5 8 8 , G . m a r t i J - g a r - i t a i B e c k e r a n d H a l l i s o l a t e 2 0 4 ,S c u t e l l o s p o r a h l e t e i r o g a m i n a l ( G e r d e m a n n a n d T r a p p e ) W a l k e ra n d S a n d e r s i s o l a t e 4 0 2 , S . p e l l i c i d a ( N i c o l s o n a n dSchenck) Walker and Sand er s i s o l a t e 5 5 6 , " S .d i p u r p u r e s c e n s " M o r t o n a n d K o s k e n o m . i n e d . i s o l a t e 5 5 7 .E n t r o p h o s p o r a c o l o m n b i a n a S p a i n a n d S c h e n c k i s o l a t e 5 7 1 .a n d E . i n f re q m n s Ames a n d S c h n e i d e r i s o l a t e 6 2 1 w e r e

e x t r a c t e d f r o m g r e e n h o u s e p o t c u l t u r e s b y t h e s ame m e t h o du s e d f o r G . o c c u l t u m n . T h i r t y s p o r e s o f e a c h f u n g u s werec o l l e c t e d , c r u s h e d i n 3 0 0 . I o f w a t e r , a n d d i s p e n s e d i n 5 0 - p . ls a m p l e s t o e a c h o f s i x w e l l s .S e n s i t i v i t y o f t h e E L I S A . T h e s e n s i t i v i t y o f t h e ELISA t od e t e c t s p o r e s o f G . o c c u l t i u m i n a m i x t u r e w i t h o t h e r VAMf u n g i w a s e x a m i n e d b y c r u s h i n g d i f f e r e n t n u m b e r s o f s p o r e so f G . o c c m u l t u m a l o n e o r i n c o m b i n a t i o n w i t h s p o r e s o f o t h e rVAM f u n g i i n 2 0 0 p L . o f w a t e r a n d a d d i n g 5 0 . I o fh o m o g e n a t e t o e a c h o f f o u r w e l l s .S p o r e s f r o m 1 5 i s o l a t e s t h a t were m o r p h o l o g i c a l l y c o n s i s t -e n t w i t h G . o c c u l t u i m ( 8 ) were t e s t e d b y E L I S A . S p o r e s o fi s o l a t e s f r o m W e s t V i r g i n i a were c o l l e c t e d f r o m v a r i o u sp l a n t s i n 1 0 l o c a t i o n s . S p o r e s o f i s o l a t e s f r o m F l o r i d a( c o u r t e s y o f N . C . S c h e n c k ) a n d C o l o m b i a ( c o u r t e s y o f E .S i e v e r d i n g ) w e r e f r o m p o t c u l t u r e s o f t h e o r i g i n a l s a m p l e s .A u t o c l a v e d L i l y s o i l ( F i n e - l o a m y , s i l i c e o u s , mesic T y p i cH a p l u d u l t s ) i n " D - p o t s ' ' ( 6 b y 2 5 c m ) ( M c C o n k e y a n d C o . ,S u m n e r , W a s h . ) w e r e i n o c u l a t e d w i t h s p o r e s w h i c h w e r em i x e d i n t h e u p p e r 6 cm o f s o i l . P o t s were s e e d e d w i t hs u d a n g r a s s ( 6 t o 8 s e e d s p e r p o t ) w h i c h wa s g r o w n f o r 1 2w e e k s a t 2 2 t o 2 8 C u n d e r a r t i f i c i a l l i g h t ( c o m b i n e d f l u o r e s -c e n t a n d i n c a n d e s c e n t l a m p s a t 1 6 3 p . E / m 2 per s f o r 1 2 h p e rd a y ) . S p o r e s w e r e e x t r a c t e d a s d e s c r i b e d a b o v e .C h a r a c t e r i z a t i o n o f e p i t o p e . C r u s h e d s p o r e s were e x p o s e dt o t e m p e r a t u r e s r a n g i n g f r o m 2 5 t o 1 0 0 C , 4 % ( w t / v o l )s o d i u m d o d e c y l s u l f a t e , a n d 5% ( v o l / v o l ) F o r m a l i n a n d t h e nt e s t e d b y E L I S A . W a t e r - s o l u b l e a n d w a s h e d s p o r e w a l lf r a g m e n t s f r a c t i o n a t e d f r o m c r u s h e d s p o r e s were t e s t e d b yE L I S A .

RESULTS AND DISCUSSIONT h e f u s i o n y i e l d e d two c e l l l i n e s ( B 5 a n d F 8 ) w h i c hp r o d u c e d a n t i b o d i e s s p e c i f i c f o r G . o c c u l t u m a . B o t h a n t i b o d -i e s w e r e s u b c l a s s i m m u n o g l o b u l i n G 2 b . T h e a n t i b o d y t i t e r o fs u p e r n a t a n t f r o m e a c h h y b r i d o m a c e l l l i n e , u s i n g f i v ec r u s h e d s p o r e s o f G . o c c u l t u m n p e r w e l l , was 1 : 5 1 2 a n d1 : 1 , 0 2 4 f o r B 5 a n d F 8 , r e s p e c t i v e l y . F o r f u r t h e r ELISAt e s t s , B 5 a n d F 8 w e r e d i l u t e d 1 : 1 6 a n d 1 : 3 2 , r e s p e c t i v e l y .MAbs p r o d u c e d f r o m c e l l l i n e s B 5 a n d F 8 were h i g h l ys p e c i f i c a g a i n s t s p o r e s a n d h y p h a e o f G . o c c u l t u m n ( T a b l e 1 ) .O n l y s p o r e s o f G . g i g a i n i t e a r e a c t e d w i t h a n O D 4 0 5 o f > 0 . 2 0a g a i n s t b o t h M A b s . H o w e v e r , t h e a v e r a g e v o l u m e o f e a i c hG . g i g a i n i t e a s p o r e wa s 2 1 6 t i m e s t h a t o f a n a v e r a g e G .o c c m d l t a m n s p o r e . Mean d i a m e t e r s o f s p o r e s o f G . o c c i ( d t u m ,G . e t m u n i c a t u m , A . r u g o s a , a n d G . g i g a n l E t e a a re 6 5 , 1 2 0 , 9 2 .a n d 3 9 0 p . m , r e s p e c t i v e l y , g i v i n g s p h e r i c a l v o l u m e s o f1 4 3 . 7 2 0 , 9 0 4 , 3 2 0 , 4 0 7 , 5 1 3 , a n d 3 1 , 0 4 3 , 6 1 0 p . m 3 , r e s p e c t i v e l y .C r u s h e d s p o r e s o f o t h e r VAM f u n g i a l s o p r o d u c e d s i g n i f i -c a n t r e a c t i o n s ( O D 1 4 0 5 > 0 . 2 0 ) when s p o r e n u m b e r s werei n c r e a s e d t o a b i o m a s s s i m i l a r t o t h a t o f G . g i g a i n i t e ( a ( T a b l e2 ) . S i n g l e s p o r e s o f G . o c c u l t i t u n we re s t i l l d e t e c t a b l e i ns p o r e m i x t u r e s b y u s i n g a maximum b a c k g r o u n d b i o m a s s

c o n t r o l w i t h a n O D 4 0 5 o f 0 . 3 0 ( T a b l e 2 ) . R e a c t i v i t y o f G .o c c u l t i u m n w i t h o t h e r VAM f u n g i was a d d i t i v e or e n h a n c e da b o v e t h a t o f G . o c c u l t u m n s p o r e s a l o n e . S p o r e c o n t e n t s o ft h e o t h e r VAM f u n g i may h a v e e n h a n c e d t h e a t t a c h m e n t o ft h e t a r g e t a n t i g e n t o w e l l s u r f a c e s . T h e s e r e s u l t s s u g g e s t t h a ta s b i o a s s a y s a r e d e v e l o p e d t o d e t e c t G . o c c u l t i u ) n i n s o i l orr o o t s , m i x t u r e s o f VAM f u n g i w i l l n o t i n t e r f e r e w i t h t h es e n s i t i v i t y o f t h e t e s t s .We h a v e p r e l i m i n a r y e v i d e n c e t o s u g g e s t t h a t MAb sa g a i n s t G . o c c u l t u m n a l s o may b e a b l e t o d i f f e r e n t i a t e s t r a i n s .T e n i s o l a t e s o f t h e f u n g u s f r o m d i f f e r e n t l o c a t i o n s i n W e s tV i r g i n i a w e r e c o m p a r e d . A l l r e a c t e d p o s i t i v e l y t o b o t h

V o t - . 5 3 , 1 9 8 7


4/5

2 2 2 4 WRIGHT E T AL.T A B L E 1 . A b s o r b a n c e v a l u e s f o r ELISA r e a c t i o n s o fG . o c c u l t u m MAbs B 5 a n d F 8 w i t h c r u s h e d s p o r e s a n dh y p h a e o f m y c o r r h i z a l a n d n o n m y c o r r h i z a l f u n g i

O D 4 0 _ , o f M A b "A n t i g e n B 5 F 8G l o m u s o c c u l t u mC r u s h e d spores ( 5 ) b

H y p h a e ( 0 . 2 5 m g )C r u s h e d spores ( 5 ) o f ' :G l o m u s a l b i d u m

G. d i a p h a n u mG. c l a r u mG. c l a r o i d e u mG. c o n s t r i c t u mG. e t u n i c a t u mG . i n t r a r a d i c e sG. geosporumG. macrocarpum"G. s p u r c u m "G. v e r s i f o r m eG . l e p t o t i c h u m"Glomus s p . OS1""Glomus s p . B 0 1 "" G l o m u s s p . J L 1 "A c a u l o s p o r a b i r e t i c u l a t aA . d e l i c a t aA . d i l a t a t aA . l a c u n o s aA . r u g o s a" A c a u l o s p o r a s p . BD1"" A c a u l o s p o r a s p . J L S "" A c a u l o s p o r a s p . M N 4 "G i g a s p o r a g i g a n t e aG. m a r g a r i t aS c u t e l l o s p o r a h e t e r o g a m aS . p e l l u c i d a" S . d i p u r p u r e s c e n s "E n t e r o s p o r a c o l o m b i a n aE . i n f r e q u e n s

Hypha a n d spore m i x t u r e( 0 . 2 5 m g ) f r o m :Glomus d i a p h a n u mT r i c h o m d e r m a s p .M o r t i e r e l l a c a n d e l a b r u mA l t e r n a r i a s o l a n iE n d o t h i a p a r a s i t i c aP h y t o p h t h o r a i n f e s t a n s

0 . 7 6 30 . 7 3 20 . 0 7 00 . 0 7 90 . 0 3 60 . 0 5 30 . 0 5 50 . 0 6 90 . 0 4 90 . 0 3 80 . 0 2 60 . 0 1 30 . 0 3 90 . 0 2 70 . 0 9 60 . 0 5 10 . 0 4 20 . 0 6 20 . 0 2 10 . 0 1 80 . 0 3 10 . 0 4 20 . 0 3 50 . 0 5 60 . 0 1 70 . 2 2 40 . 0 8 80 . 0 7 80 . 0 9 20 . 1 0 40 . 0 7 40 . 0 5 2

0 . 0 8 70 . 0 2 60 . 0 2 10 . 1 0 40 . 0 7 90 . 0 6 0

0 . 0 7 50 . 0 6 20 . 0 6 30 . 0 7 10 . 0 9 60 . 0 8 20 . 0 7 90 . 0 3 20 . 0 3 50 . 0 1 60 . 0 2 70 . 0 3 30 . 0 2 00 . 1 1 90 . 0 5 80 . 0 4 10 . 0 5 30 . 0 4 90 . 0 4 00 . 0 5 60 . 0 2 60 . 0 9 20 . 0 4 90 . 2 1 80 . 0 3 90 . 0 8 30 . 1 2 20 . 0 7 50 . 1 2 00 . 0 3 2

0 . 1 1 90 . 0 4 10 . 0 3 20 . 0 8 40 . 1 0 20 . 0 9 1" V a l u e s a r e m e a n s o f t h r e e r e p l i c a t e a s s a y s .N u m b e r s i n p a r e n t h e s e s ar e t h e n u m b e r o f spores or t h e w e i g h t o f h y p h a ea n d h y p h a - s p o r e m i x t u r e s i n 5 0 , u l o f water u s e d t o c h a r g e e a c h r e p l i c a t eELISA p l a t e w e l l ."S e e t h e t e x t f o r a u t h o r i t i e s o f c u l t u r e s .

MAbs, b u t OD v a l u e s d i f f e r e d s i g n i f i c a n t l y ( P =0 . 0 1 ) amongi s o l a t e s ( F i g . 1 ) . C o m p a r i s o n among spore s o f i s o l a t e s f r o mF l o r i d a a n d C o l o m b i a , w h i c h were p r o d u c e d u n d e r a u n i -f o r m h o s t - s o i l e n v i r o n m e n t , s u g g e s t s t h a t t h e MAb s a r e a b l et o d i f f e r e n t i a t e among s t r a i n s . E i t h e r c o n c e n t r a t i o n o f t h ee p i t o p e ( s ) i n spores or a f f i n i t y b e t w e e n MAb a n d e p i t o p ev a r i e d among t h e s e i s o l a t e s o f G . o c c u l t u m . V a r i a t i o namong t h e W e s t V i r g i n i a i s o l a t e s m u s t b e e v a l u a t e d f o rd i f f e r e n c e s i n r e a c t i v i t y a s s o c i a t e d w i t h h o s t a n d s o i l f a c t o r s .W a t e r - s o l u b l e a n d w a s h e d s p o re w a l l f r a g m e n t s f r a c t i o n -a t e d f r o m c r u s h e d s p o res were b o t h r e a c t i v e . A b s o r b a n c ewas s t r o n g e r f o r t h e s o l u b l e f r a c t i o n ( O D 4 0 5 =1 . 0 6 0 ) t h a nc e l l w a l l f r a g m e n t s ( O D 4 0 5 =0 . 6 6 3 ) . T h i s e v i d e n c e suggestst h a t t h e e p i t o p e may b e a s o l u b l e p r o t e i n a s s o c i a t e d e i t h e r

w i t h c e l l m e m b r a n e or o t h e r p a r t i c u l a t e f r a c t i o n s i n s p o r e sa n d h y p h a e o f G. o c c u l t u m . U s i n g i m m u n o f l u o r e s c e n c e ,o t h e r w o r k e r s f o u n d t h a t l e s s s p e c i f i c p o l y c l o n a l a n t i s e r u ma g a i n s t c r u s h e d s p o r e s or h y p h a e o f p a r t i c u l a r VAM f u n g ia l s o r e a c t e d w i t h a n t i g e n s a s s o c i a t e d w i t h i n n e r c e l l w a l l s o rc e l l m e m b r a n e s ( 7 , 1 6 ) .R e a c t i o n s o f b o t h MAbs were c o n s i s t e n t l y t h e same. B o t hl o s t a c t i v i t y a g a i n s t c r u s h e d s p o r e s e x p o s e d t o t e m p e r a t u r e sa b o v e 8 0 C , 4 % s o d i u m d o d e c y l s u l f a t e , or 5 % F o r m a l i n .C h a r a c t e r i z a t i o n o f t h e e p i t o p e w i l l r e q u i r e c a r e f u l m a n i p u -l a t i o n t o p r e v e n t l o s s o f a n t i g e n i c i t y . M o r e o v e r , t h e s e r e s u l t si n d i c a t e t h a t s p o r e s p r e s e r v e d i n F o r m a l i n a r e n o n r e a c t i v e .B a s e d upon r e s u l t s o f t h i s s t u d y , MAbs overcame t h eo b s t a c l e o f c r o s s - r e a c t i v i t y among s p e c i e s o f VAM f u n g i .O n l y i s o l a t e s w i t h m o r p h o l o g y c o n s i s t e n t w i t h t h a t o f G.o c c u l t u m e x h i b i t e d ELISA r e a c t i v i t y , a n d ELISA r e a c t i v i t ywas a l w a y s > 0 . 3 0 ( T a b l e 1 ) . T h i s e s t a b l i s h e s a f i r m t a x o -n o m i c b a s i s f o r d i s t i n g u i s h i n g G . o c c u l t u m f r o m o t h e r VAMf u n g a l s p e c i e s w i t h s i m i l a r s p o r e c h a r a c t e r i s t i c s . A p p l i c a t i o no f t h e i n d i r e c t ELISA t o d e t e c t a n d q u a n t i f y m y c o r r h i z a ea n d e x t e r n a l h y p h a e d e v e l o p m e n t o f G . o c c u l t u m i n t h eT A B L E 2 . A b s o r b a n c e v a l u e s f o r ELISA r e a c t i o n s w i t h M A b F 8a n d G . o c c u l t u m s p o r e s a l o n e o r w i t h s p o r e s o f o t h e r VAM f u n g i "

VAM f u n g u s , O D 4 0 5n o . o f s p o r e s " Mean R a n g eG l o m u s o c c u l t u m1 0 . 3 6 5 0 . 3 3 1 - 0 . 3 9 22 0 . 3 5 8 0 . 3 3 4 - 0 . 4 2 63 0 . 6 1 6 0 . 5 2 2 - 0 . 6 7 84 0 . 6 5 7 0 . 5 4 6 - 0 . 7 1 35 0 . 7 2 3 0 . 6 4 1 - 0 . 8 7 41 0 1 . 1 6 4 0 . 9 8 7 - 1 . 3 7 22 0 1 . 6 3 7 1 . 4 9 3 - 1 . 7 2 44 0 > 2 . 0 0 0 1 . 7 8 4 - > 2 . 0 0 0G l o m u s e t u n i c a t u m5 0 . 0 8 2 0 . 0 5 9 - 0 . 1 0 24 0 0 . 2 4 8 0 . 2 3 2 - 0 . 2 8 5

8 0 0 . 2 7 6 0 . 2 4 1 - 0 . 3 2 2G i g a s p o r a g i g a n t e a1 0 . 0 2 8 0 . 0 1 8 - 0 . 0 3 63 0 . 1 6 9 0 . 0 6 4 - 0 . 2 1 55 0 . 2 1 8 0 . 1 4 3 - 0 . 2 9 11 0 0 . 2 9 2 0 . 1 5 6 - 0 . 3 2 82 0 0 . 2 7 7 0 . 1 6 7 - 0 . 3 3 4A c a u l o s p o r a r u g o s a5 0 . 0 5 6 0 . 0 3 2 - 0 . 0 9 31 0 0 . 0 4 1 0 . 0 2 6 - 0 . 1 0 44 0 0 . 1 3 4 0 . 0 6 4 - 0 . 1 8 88 0 0 . 2 1 8 0 . 1 7 7 - 0 . 2 5 2G . e t u n i c a t u m p l u s G . o c c u l t u m4 0 + 1 0 . 5 9 7 0 . 5 2 4 - 0 . 6 3 84 0 + 3 0 . 8 9 2 0 . 7 6 1 4 . 9 6 74 0 + 5 1 . 0 9 4 0 . 9 1 7 - 1 . 1 4 2G . g i g a n t e a p l u s G . o c c u l t u m1 + 1 0 . 7 8 9 0 . 7 0 2 - 0 . 8 2 61 + 5 1 . 1 2 9 1 . 0 0 3 - 1 . 2 1 45 + 1 1 . 2 7 3 1 . 1 4 1 - 1 . 3 5 55 + 5 1 . 7 7 8 1 . 6 4 2 - 1 . 8 3 0A . r u g o s a p l u s G . o c c u l t u m5 + 1 0 . 6 4 9 0 . 6 1 0 - 0 . 7 0 75 + 5 1 . 1 1 8 1 . 1 0 3 - 1 . 2 3 94 0 + 1 0 . 5 2 7 0 . 4 2 1 - 0 . 6 3 84 0 + 3 0 . 9 0 1 0 . 8 1 8 - 1 . 0 1 24 0 + 5 1 . 2 6 0 1 . 1 4 3 - 0 . 3 1 6" V a l u e s g r e a t e r t h a n 0 . 3 0 a r e c o n s i d e r e d p o s i t i v e . V a l u e s a r e m e a n s o f a tl e a s t f o u r r e p l i c a t e a s s a y s .b S p o r e s w e r e c r u s h e d i n 5 0 , l o f w a t e r a n d p l a c e d i n t o ELISA p l a t e w e l l s .

A P P L . E N V I R O N . M I C R O B I O L .


5/5

I D E N T I F I C A T I O N O F VA MYCORRHIZAE 2 2 2 5

*1.0ct6-

0

0.4-

0.2-

W e s t V i r g i n i a L F l o r i d a j L C o t o m b i a jlofIs olates I s o l a t e sF I G . 1 . ELISA r e a c t i o n s w i t h G. o c c u l t i t i n M A b s B5 a n d F 8w i t h c r u s h e d spo res o f G. o c c i u l t u i n i s o l a t e s f r o m d i f f e r e n t s o i l s inW e s t V i r g i n i a a n d s po res o f i s o l a t e s f r o m F l o r i d a a n d C o l o m b i ap r o d u c e d i n p o t c u l t u r e s w i t h u n i f o r m s o i l a n d p l an t c o n di t i o ns .E a c h v a l u e i s t h e mean o f s i x r e p l i c a t e w e l l s ( e i g h t s po res per w e l l )f o r e a c h MAb, w i t h a b s o r b a n c e r e a d i n g s f o r b o t h M A b s p o o l e d . Th ei s o l a t e u s e d t o p r o d u c e t h e MAb s i s m a r k e d w i t h an a s t e r i s k .D i f f e r e n c e s among means were s i g n i f i c a n t a t P = 0 . 0 1 . T h e s t a n d a r d

error o f t h e mean a s s a y v a l u e f o r e a c h i s o l a t e d i d n o t e x c e e d t h es t a n d a r d error b a r .presence o f c o m p e t i n g VAM f u n g i a ppea rs p ro mi s ing, asd o e s u s e o f t h e ELISA t o d i f f e r e n t i a t e s t r a i n s o f G. oc -c u l t i t i n . I d e n t i f i c a t i o n o f G. o ( c c u l t I l o n i n i n t a c t r o o t s a n dh y p h a e w i t h f l u o r e s c e n t a n t i b o d y t e c h n i q u e s w i l l b e f e a s i b l ei f M A b s r e a c t w i t h i n t e r n a l e p i t o p e s l o c a l i z e d nea r t h e c u te n d s o f h y p h a e ( 7 , 1 6 ) .

ACKNOWLEDGMENTT h i s r e s e a r c h was p a r t i a l l y s u p p o r t e d w i t h f u n d s a p p r o p r i a t e du n d e r t h e H a t c h A c t .

LITERATURE C I T ED1 . A b b o t t , L . K . 1 9 8 2 . C o m p a r a t i v e anatomy o f v e s i c u l a r -

a r b u s c u l a r m y c o r r h i z a s f o r m e d on s u b t e r r a n e a n c l o v e r . A u s t . J .B o t . 3 0 : 4 8 5 - 4 9 9 .2 . A l d w e l l , F . E . B . , I. R . H a l l , a n d J . M. B . S m i t h . 1 9 8 3 .E n z y m e - l i n k e d i m m u n o s o r b e n t assay ( E L I S A ) t o i d e n t i f y e n d o -m y c o r r h i z a l f u n g i . S o i l B i o l . B i o c h e m . 1 5 : 3 7 7 - 3 7 8 .3 . B u n d r e t t , M . , Y . P i c h e , a n d R . L . P e t e r s o n . 1 9 8 4 . A new methodf o r o b s e r v i n g t h e m o r p h o l o g y o f v e s i c u l a r - a r b u s c u l a r mycor-

r h i z a e . C a n . J . B o t . 6 2 : 2 1 2 8 - 2 1 3 4 .4 . G i l d o n , A . , a n d P . B . T i n k e r . 1 9 8 3 . I n t e r a c t i o n s o f v e s i c u l a r -a r b u s c u l a r m y c o r r h i z a l i n f e c t i o n a n d h e a v y m e t a l s . I . T h ee f f e c t s o f h e a v y m e t a l s o n t h e d e v e l o p m e n t o f v e s i c u l a r -a r b u s c u l a r m y c o r r h i z a s . New P h y t o l . 9 5 : 2 4 7 - 2 6 1 .5 . H a a s , J . H . , a n d J . K r i k u n . 1 9 8 5 . E f f i c a c y o f e n d o m y c o r r h i z a lf u n g u s i s o l a t e s a n d i n o c u l u m q u a n t i t i e s r e q u i r e d f o r g r o w t hr e s p o n s e . New P h y t o l . 1 0 0 : 6 1 3 - 6 2 1 .6 . H e t r i c k , B . A . , J . B l o o m , a n d S . M. F e y e r h e r m . 1 9 8 5 . R o o tc o l o ni z a t i o n o f G l o t t i i u s e p i g a e i u m i n n i n e h o s t s p e c i e s .M y c o l o g i a 7 7 : 8 2 5 - 8 2 8 .7 . K o u g h , J . , N . M al a j cz u k, a n d R . G . L i n d e r m a n . 1 9 8 3 . U s e o fi n d i r e c t i m m u n o f l u o r e s c e n t t e c h n i q u e t o s t u d y t h e v e s i c u l a r -a r b u s c u l a r f u n g u s G l o r n i s e p i g a e l u t n a n d o t h e r G l o i n u s s p e c i e s .N ew P h y t o l . 9 4 : 5 7 - 6 2 .8 . M o r t o n , J . B . 1 9 8 5 . V a r i a t i o n i n m y c o r r h i z a l a n d s p o r e m o r -p h o l o g y o f G l o t i u i i s o c c ( I u l t u m a n d G l o i n i s d i a p l a n t z u i n a s i n f l u -e n c e d b y p l a n t h o s t a n d s o i l e n v i r o n m e n t . M y c o l o g i a 7 7 :1 9 2 - 2 0 4 .9 . M o r t o n , J . B . 1 9 8 5 . U n d e r e s t i m a t i o n o f m o s t p r o b a b l e n u m b e r so f v e s i c u la r - ar b u s cu l a r e n d o p h y t e s b e c a u s e o f n o n s t a i n i n gm y c o r r h i z a e . S o i l B i o l . B i o c h e m . 1 7 : 3 8 3 - 3 8 4 .1 0 . O i , V . T . , a n d L . A . H e r z e n b e r g . 1 9 8 0 . I m m u n o g l o b u l i n -p r o d u c i n g h y b r i d c e l l l i n e s , p . 3 5 1 - 3 7 2 . I n B . B . M i s h e l l a n dS . M . S h i i g i ( e d . ) , S e l e c t e d m e t h o d s i n i m m u n o l o g y . W. H .F r e e m a n & C o . . S a n F r a n c i s c o .

1 1 . P h i l l i p s , J . M . , a n d D . S . H a y m a n . 1 9 7 0 . I m p r o v e d p r o c e d u r e sf o r c l e a r i n g r o o t s a n d s t a i n i n g p a r a s i t i c a n d v e s i c u l a r - a r b u s c u l a rm y c o r r h i z a l f u n g i f o r r a p i d a s s es s m e n t o f i n f e c t i o n . T r a n s . B r .M y c o l . S o c . 5 5 : 1 5 8 - 1 6 0 .1 2 . S c h e n c k , N . C . , a n d G . S . S m i t h . 1 9 8 2 . A d d i t i o n a l new a n du n r e p o r t e d s p e c i e s o f m y c o r r h i z a l f u n g i ( E n d o g o n a c e a e ) f r o mF l o r i d a . M y c o l o g i a 7 4 : 7 7 - 9 2 .1 3 . S e n , R . , a n d C . M. H e p p e r . 1 9 8 6 . C h a r a c t e r i z a t i o n o f v e s i c u l a r -a r b u s c u l a r m y c o r r h i z a l f u n g i ( G l o m i i s s p p ) b y s e l e c t i v e enzymes t a i n i n g f o l l o w i n g p o l y a c r y l a m i d e g e l e l e c t r o p h o r e s i s . S o i l B i o l .B i o c h e m . 1 8 : 2 9 - 3 4 .1 4 . T r a p p e , J . M. 1 9 8 2 . S y n o p t i c k ey s t o t h e g e n e r a a n d s p e c i e s o fz y g o m y c e t o u s m yc o r r h i z a l f u n g i . P h y t o p a t h o l o g y 7 2 : 1 1 0 2 -1 1 0 8 .1 5 . V o l l e r , A . , D . B i d w e l l , a n d A . B a r t l e t t . 1 9 8 0 . E n z y m e - l i n k e di m m u n o s o r b e n t a s s a y , p . 3 5 9 - 3 7 1 . I n N . R . R o s e a n d H .F r i e d m a n ( e d . ) , M a n u a l o f c l i n i c a l i m m u n o l o g y , 2 n d e d . A m e r -i c a n S o c i e t y f o r M i c r o b i o l o g y , W a s h i n g t o n , D . C .1 6 . W i l s o n , J . M . , M. J . T r i n i c k , a n d C . A . P a r k e r . 1 9 8 3 . T h ei d e n t i f i c a t i o n o f v e s i c u l a r - a r b u s c u l a r m y c o r r h i z a l f u n g i u s i n gi m m u n o f l u o r e s c e n c e . S o i l B i o l . B i o c h e m . 1 5 : 4 3 9 - 4 4 5 .1 7 . W r i g h t , S . F . , J . G . F o s t e r , a n d 0 . L . B e n n e t t . 1 9 8 6 . P r o d u c t i o na n d u s e o f m o n o c l o n a l a n t i b o d i e s f o r i d e n t i f i c a t i o n o f s t r a i n s o fR h l i i o b i i u m t - i f l i i . A p p l . E n vi r o n . M ic r o b i o l . 5 2 : 1 1 9 - 1 2 3 .

V O L . 5 3 , 1 9 8 7

appl. environ. microbiol.-1987-wright-2222-5 (2)

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