aplicacion y preparacion de enzimas
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Fuente de las Enzimas
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De donde se obtienen las enzimas?
(Propósito)
- Plantas- Animales
- MICROORGANISMOS
Enzimas microbianas Enzimas de Plantas Enzimas animales
glucosa isomerasa Papaina (Papaya) tripsina
β-galactosidasa ficina (Higos) lipasa (pancreas)
Proteasas bacterianas Bromeleina (piña) renina (estomago de ternero)
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90% de enzimas industriales son de origen microbiano
- Microorganismos son faciles de cultivar en condiciones controladas: Altos rendimientos de enzimas
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Consideraciones de seguridad
• Infinidad de microorganismos: Amplia variedad de enzimas
• Limitado numero de microorganismos son usados- Usar el mismo microorganismo para la obtencion de diversas enzimas
- Las condiciones de cultivo, metabolismo ya son conocidas y dan resultados exitosos
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Consideraciones de seguridad
• Usar enzimas o microorganismos aprobados por las autoridades reguladoras de produccion industrial
- GRAS (generally regarded as safe) – FDA.
• Nuevas enzimas: se debe demostrar la inocuidad
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Microorganismos geneticamente modificados
• Microorganismos que expresan un gen que proviene de otro organismo a traves de de la tecnologia del DNA recombinante.
• Microorganismos que han sido modificadso para sobre expresar la enzima deseada (productor eficiente)
Quimosina (manufactura de quesos)
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Microorganismos geneticamente modificados
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Microorganismos (celulas totales) vs enzimas purificadas
• Alta especificidad no es necesaria• Purificacion de enzima no es necesaria (Catalizador
barato)• La actividad enzimatica es mas estable dentro de la celula• La enzima puede requerir de la regeneracion del
cofactor/co-sustrato.
Entonces:- Las celulas pueden estar en reposo o muertas.- Las celulas estan vivas pero solo se mantiene el nivel
nutricional sin permitir el crecimiento
BIOCATALIZADORES
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Preparacion de enzimas• Enzimas son utilizadas en diferentes grados de pureza• Usos para propositos cientificos, medicinales o
analiticos Alta pureza (90-100%)
• Alta pureza enzimatica requiere de procesos caros:- Centrifugacion- Precipitacion- Cromatografia de afinidad- Cromatografia de intercambio ionico- Filtracion en gel (Cromatografia de exclusion molecular)- Cristalizacion
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AGENTE BIOLOGICO
SELECCION
GENETICARecombinantes
HibridosMutantes
CEPAS, LINEAS CELULARES,
CLONES
MICROBIANASVEGETALESANIMALES
SUSTRATO Medio de
cultivo
ESTERILIZACION
PREPARACION
DISEÑO Y FORMULACION
FERMENTACION
MODOS DE OPERACION
TIPO DE REACTOR
BIOTRANSFORMACION
BIOCONVERSIONDOWNSTREAM PROCESSING
ENZIMA
SEPARACION YPURIFICACION
SELECCIÓN DEOPERACIONES Y
PROCESOS
PRODUCTO
EFLUENTES
Formulación del producto
Naturales(wild-type)
ScreeningColecciones de
cultivos
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Aplicaciones tecnicas de las enzimas
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Uso técnico e industrial de las enzimas
Análisis /DiagnósticoAutoanalizadores
Tiras reactivasELISA
Biosensores
Tratamiento del papel
Transformaciones enzimaticas
Almidon
L-aminoacidos
Aspartame
Esteres, grasas y aceites
Compuestos quirales
Glucosa isomerasa
Uso medicinalTratamiento de cuero
textiles
Detergentes
Area de alimentosPanificacion
Productos lacteosJugos, vinos
Cerveza
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ANALISIS
• Ventaja: Alta especificidad enzimatica.
Determinacion de un analito (sustrato)
No requiere procesos de separacion
Sustrato (+ Cosustrato ox/red) Producto (+ Cosustrato ox/red) + ∆H
Analito puede ser cuantificado por:
-Siguiendo la velocidad de conversion (Metodo cinetico)
- Determinando la concentracion despues de una conversion completa (metodo de punto final)
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• Sustrato o Producto poseen espectros altos de absorbancia, conviene medir consumo de sustrato o formacion de producto
Azucares, Proteinas, Lipidos
CH2 CH2 CH2
O O OAG AG AG
CH2 CH2 CH2
Lipasa + Agua
OH
OH OH
Glicerol
R COOH
R COOH
R COOH
+
Acidos grasos libres
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Areas del Analisis enzimaticoArea Clinica
Determinacion de metabolitos
Plasma, Suero, Orina, LCR, etc Area de alimentos
Area de analisis ambiental
Biociencias: Bioquimica y Microbiologia
Cuatro tecnologias:
Autoanalizadores
Inmunoensayos (ELISA)
Tiras reactivas
Biosensores
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Analisis con autoanalizadores• Seguimiento de la reaccion por
espectrofotometria• Cambios en la absorcion molar NAD+/NADH.
Determina reactantes < 20 μM
Etanol + NAD+ Acetaldehido + NADH + H+Alcohol deshidrogenasa
Reaccion 1
Glucosa + ATP Glucosa-6-P + ADP
Reaccion 2
Glucosa-6-P + NADP+ 6-P-gluconato + NADPH + H+
Hexoquinasa
Glucosa 6-P-deshidrogenasa
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Inmunoensayos - ELISA
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Tiras reactivas• Analisis de glucosa
en orina y sangre
• Estimacion de colesterol
• Test de embarazo
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Transformaciones enzimaticas• Preparacion de productos tales como:
- L-aminoacidos- Grasas modificadas- Edulcorantes artificiales
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Biotransformaciones industriales
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Produccion de penicilinas semisinteticas
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Produccion de L-aminoacidos
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Produccion de Aspartame
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Produccion de detergentes
Ventajas del uso de enzimas- Bajas temperaturas de
lavado- Evitar el uso de sustancias
blanqueadoras y polifosfatos
- Mejorar la calidad del color de la ropa
Enzima tipica de lavanderia :- pH 10 -11- 40 – 60 ºC- Agentes blanqueadores
(perborato + activadores TAED)
- Agentes tensioactivos/agitacion
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Produccion de detergentes
Enzimas usadas y sus funciones• Proteasas (siempre):• Lipasas (frecuentemente)• Amilasas (frecuentemente)• Celulasas (algunas veces)
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Alimentos y areas relacionadasFabricacion de leche libre de
lactosa
Lactosa
(galactosa+glucosa) galβ(1-4)glc
β-galactosidasa
Galactosa Glucosa
Leche UHT(Industria lechera)
Lactasa microbiana
Transporte de leche Leche libre de lactosaConsumidor final
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Fabricacion de cerveza light
-Cerveza normal tiene alto contenido calorico
alcohol y polisacaridos no hidrolizados en los procesos de malteado y produccion de mosto
-Añadir una enzima 1,6 exoglucanasa (Pululanasa) disminuye la cantidad de polisacaridos : ↑contenido alcoholico
-Cerveza debe ser diluida hasta alcanzar el grado alcoholico requerido
- Cerveza de 30% menos en calorias
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Fabricacion de vinos y jugos
pectinasas pectinasas
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Fabricacion de papel
celulasas xilanasasEnz ligninoliticas
Pulpa de papelCelulasas en clarificacion
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Enzimas en el tratamiento de cuerosPelambre
Remojo de cuero
DesgrasadoProteasas
Lipasas
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Producción anaerobica de enzimas a partir de bacterias extremofilas
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Producción anaerobica de enzimas a partir de bacterias extremofilas
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Producción aeróbica de enzimas a partir de hongos
23% proteasas17% amilasas 19% pectinasas
16% celulasas 13% lipasas 7% xilanasas
5% enzimas ligninolíticas
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