“aplicaciÓn de agua de limÓn en reemplazo del … · “aplicaciÓn de agua de limÓn en...
TRANSCRIPT
UNIVERSIDAD CENTRAL DEL ECUADOR
FACULTAD DE CIENCIAS MÉDICAS
CARRERA DE LABORATORIO CLÍNICO E HISTOTECNOLÓGICO
“APLICACIÓN DE AGUA DE LIMÓN EN REEMPLAZO DEL XILOL, PARA
COMPROBAR SU ACCIÓN DESPARAFINIZANTE EN LOS CORTES DE TEJIDO
COLOREADOS CON HEMATOXILINA EOSINA EN EL LABORATORIO DE
HISTOPATOLOGÍA DE LA FACULTAD DE CIENCIAS MÉDICAS DE LA
UNIVERSIDAD CENTRAL DEL ECUADOR ”
Trabajo de fin de Carrera previo a la obtención del Título de Licenciada en Laboratorio
Clínico e Histotecnológico
AUTORA: PICO OCAÑA VERÓNICA ELIZABETH
TUTORA: LCDA. YOLANDA DEL ROCÍO PAREDES JIMÉNEZ
QUITO, SEPTIEMBRE 2015
ii
DEDICATORIA
Dedico este proyecto de investigación a Dios, por haberme dado salud, paciencia, tiempo y
voluntad para lograr mis objetivos, además de su infinita gracia y bondad.
A mis padres porque con su amor, entrega y consejos he llegado a cumplir una meta más en
mi vida, por ellos día a día me esfuerzo y entrego todo de mí.
A mi hermano que ha sido mi compañía y alegría en todo momento y esperando que mi
esfuerzo y dedicación sea un ejemplo a imitar.
iii
AGRADECIMIENTO
Agradezco principalmente a Dios por darme la vida, y fuerza necesaria para cumplir mis
objetivos. Doy gracias a mis padres ya que son un apoyo incondicional en cada uno de los
momentos de mi vida.
A la Universidad Central del Ecuador que me abierto sus puertas para poder adquirir
conocimientos y ponerlos en práctica en mi profesión. De una manera muy especial agradezco
a la Licenciada Yolanda Paredes por su apoyo incondicional y desinteresado para guiarme en
todos los aspectos científicos del presente trabajo.
A mis familiares y amigos que de uno u otra manera han estado conmigo apoyándome.
iv
AUTORIZACIÓN DE LA AUTORÍA INTELECTUAL
Yo, VERÓNICA ELIZABETH PICO OCAÑA, en calidad de autor del trabajo de investigación
o tesis realizada sobre “APLICACIÓN DE AGUA DE LIMÓN EN REEMPLAZO DEL
XILOL, PARA COMPROBAR SU ACCION DESPARAFINIZANTE EN LOS CORTES
DE TEJIDO COLOREADOS CON HEMATOXILINA EOSINA EN EL LABORATORIO
DE HISTOPATOLOGÍA DE LA FACULTAD DE CIENCIAS MÉDICAS DE LA
UNIVERSIDAD CENTRAL DEL ECUADOR ”, por la presente autorizo a la
UNIVERSIDAD CENTRAL DEL ECUADOR hacer uso de todos los contenidos que me
pertenecen o de los que contienen en esta obra, con fines académicos o de investigación.
Los derechos que como autor me corresponde con excepción de la presente autorización
seguirán vigentes a mi favor de conformidad con lo establecido en los artículos 5.6.8.19 y demás
pertinente de la ley de Propiedad Intelectual y su Reglamento.
Quito, Septiembre 2015
Verónica Pico
C.I.: 172109716-8
v
INFORME DE APROBACIÓN DEL TUTOR
Quito, 31 de Julio de 2015
Señora Magister
Bernardita Ulloa R.
DIRECTORA DE LA CARRERA DE LABORATORIO CLÍNICO E
HISTOTECNOLÓGICO
Presente.-
De mi consideración:
Por medio de la presente pongo en su conocimiento que he finalizado satisfactoriamente la
tutoría del trabajo de Fin de Carrera de la señorita estudiante VERÓNICA ELIZABETH
PICO OCAÑA, con cédula de identidad número 172109716-8, cuyo tema es
“APLICACIÓN DE AGUA DE LIMÓN EN REEMPLAZO DEL XILOL, PARA
COMPROBAR SU ACCIÓN DESPARAFINIZANTE EN LOS CORTES DE
TEJIDO COLOREADOS CON HEMATOXILINA EOSINA EN EL
LABORATORIO DE HISTOPATOLOGÍA DE LA FACULTAD DE CIENCIAS
MÉDICAS DE LA UNIVERSIDAD CENTRAL DEL ECUADOR ” mismo que puede
continuar con el trámite respetivo para la defensa.
Atentamente,
Lcda. Yolanda Paredes
Docente
LABORATORIO CLÍNICO E HISTOTECNOLÓGICO.
vi
LISTADO DE CONTENIDO
DEDICATORIA ............................................................................................................................................ ii
AGRADECIMIENTO ................................................................................................................................... iii
AUTORIZACION DE LA AUTORIA INTELECTUAL ........................................................................................ iv
APROBACION DEL TUTOR .......................................................................................................................... v
RESUMEN .................................................................................................................................................. x
ABSTRACT ................................................................................................................................................. xi
INTRODUCCION ........................................................................................................................................ 1
CAPITULO I ................................................................................................................................................ 2
EL PROBLEMA ........................................................................................................................................... 2
PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA .................................................................................................. 2
FORMULACION DEL PROBLEMA ..................................................................................................... 3
OBJETIVOS ....................................................................................................................................... 3
OBJETIVO GENERAL ..................................................................................................................... 3
OBJETIVOS ESPECIFICOS .............................................................................................................. 3
HIPOTESIS ............................................................................................................................................ 4
JUSTIFICACION ..................................................................................................................................... 4
CAPITULO II ............................................................................................................................................... 5
MARCO TEORICO ...................................................................................................................................... 5
TÉCNICAS HISTOLÓGICAS ............................................................................................................... 5
OBTENCIÓN Y MANEJO DE MUESTRAS DE TEJIDOS ....................................................................... 6
FIJACIÓN DE TEJIDOS ......................................................................................................................... 11
Clasificación de los fijadores ..................................................................................................... 15
Criterios para obtener una buena fijación. ........................................................................... 16
PROCESAMIENTO DE TEJIDOS ........................................................................................................... 18
Deshidratación ...................................................................................................................... 18
Aclaramiento ......................................................................................................................... 20
Protocolo de procesamiento de tejidos ................................................................................ 22
Infiltración ............................................................................................................................. 24
ELABORACIÓN DE BLOQUES ......................................................................................................... 24
Inclusión ................................................................................................................................ 25
vii
Parafina .................................................................................................................................. 25
MICROTOMÍA ..................................................................................................................................... 28
Historia del micrótomo .......................................................................................................... 29
Clasificación ............................................................................................................................ 31
Baño de flotación ................................................................................................................... 33
DESPARAFINIZACION .......................................................................................................................... 35
Xilol ......................................................................................................................................... 36
Limón ...................................................................................................................................... 38
Jugo de limón ......................................................................................................................... 41
Coloración .......................................................................................................................................... 42
Principios generales de la coloración ..................................................................................... 43
Clasificación de los colorantes ............................................................................................... 45
Coloración Hematoxilina- Eosina (H-E) .................................................................................. 46
ESTUDIO DE LAS MUESTRAS AL MICROSCOPIO ................................................................................. 50
CAPITULO III ........................................................................................................................................... 52
TIPO DE ESTUDIO ................................................................................................................................ 52
Experimental para innovación de técnica ........................................................................................... 52
NIVEL DE INVESTIGACION................................................................................................................... 52
TECNICAS E INSTRUMENTOS DE INVESTIGACION .............................................................................. 52
Muestras ................................................................................................................................ 52
Procesamiento: (Paredes, 2015) ............................................................................................ 52
Elaboración de bloques .......................................................................................................... 54
Microtomía ............................................................................................................................. 54
Coloración .............................................................................................................................. 54
Montaje .................................................................................................................................. 57
Microscopía ............................................................................................................................ 57
ANALISIS DE RESULTADOS .................................................................................................................. 59
VARIABLES: ......................................................................................................................................... 60
MATRIZ VARIABLE .............................................................................................................................. 60
CAPITULO IV ............................................................................................................................................ 61
RESULTADOS ...................................................................................................................................... 61
VERIFICACION DE LA HIPOTESIS ......................................................................................................... 67
CONCLUSIONES .................................................................................................................................. 68
viii
RECOMENDACIONES ....................................................................................................................... 69
CAPITULO V ............................................................................................................................................ 70
PROPUESTA DEL PROYECTO ............................................................................................................. 70
Bibliografía ............................................................................................................................................. 77
LISTADO DE ANEXOS
Anexo 1 ................................................................................................................................... 73
Anexo 2 ................................................................................................................................... 74
Anexo 3 ................................................................................................................................... 75
Anexo 4 ................................................................................................................................... 76
LISTADO DE TABLAS
TABLA 1 .................................................................................................................................. 61
TABLA 2 .................................................................................................................................. 62
TABLA 3 .................................................................................................................................. 63
TABLA 4 .................................................................................................................................. 64
TABLA 5 .................................................................................................................................. 65
TABLA 6 .................................................................................................................................. 66
LISTADO DE GRAFICOS
ILUSTRACIÓN 1..........................................................................................................................5
ILUSTRACIÓN 2.........................................................................................................................18
ILUSTRACIÓN 3.................................................................................................................... 22
ILUSTRACIÓN 4.................................................................................................................... 23
ILUSTRACIÓN 5.................................................................................................................... 25
ILUSTRACIÓN 6.................................................................................................................... 27
ILUSTRACIÓN 7.................................................................................................................... 31
ILUSTRACIÓN 8.................................................................................................................... 35
ix
ILUSTRACIÓN 9 ...................................................................................................................... 41
ILUSTRACIÓN 10.................................................................................................................... 50
ILUSTRACIÓN 11.................................................................................................................... 53
ILUSTRACIÓN 12.................................................................................................................... 55
ILUSTRACIÓN 13.................................................................................................................... 55
ILUSTRACIÓN 14.................................................................................................................... 56
ILUSTRACIÓN 15.................................................................................................................... 57
x
Tema: “Aplicación de agua de limón en reemplazo del xilol, para comprobar su acción
desparafinizante en los cortes de tejido coloreados con hematoxilina eosina en el laboratorio de
histopatología de la facultad de ciencias médicas de la Universidad Central del Ecuador”
Autora: Pico Ocaña Verónica Elizabeth
Tutora: Lcda. Yolanda del Rocío Paredes Jiménez
RESUMEN
El xilol es un hidrocarburo aromático, inflamable y toxico muy utilizado en histopatología,
este es muy perjudicial para la salud de la persona que lo manipula, de ahí surge la necesidad
de sustituirlo con otra sustancia que cumpla la misma función pero que sea inocua para el
operador. Este trabajo se realizó en base a la información de un estudio realizado por
Anuradha A, en China 2014, en el que demuestra la utilización del agua de limón en
reemplazo de xilol, para lo cual trabaje con 20 muestras de diferentes tejidos, a los cuales se
los proceso, para obtener dos cortes iguales de cada muestra, al uno se lo desparafinizó con
agua de limón mientras que al otro corte se lo hizo con xilol y se procedió con la tinción de
hematoxilina-eosina. Las placas teñidas fueron analizadas a ciegas por un médico patólogo, en
base a cuatro parámetros: calidad de la tinción, identificación de estructuras morfológicas,
tiempo de lectura y certeza del diagnóstico. El resultado fue que el jugo de limón si cumple su
acción como agente desparafinizante.
Palabras clave: XILOL/HISTOPATOLOGÍA/LIMÓN/HEMATOXILINA/EOSINA/
DESPARAFINIZANTE.
xi
Theme: ¨Application lemon water to replace xilol, to verify the desparafinizing action of tissue
cuts stained with hematoxylin-eosin in the school of medicine of the Universidad Central del
Ecuador¨
Autora: Pico Ocaña Verónica Elizabeth
Tutora: Lcda. Yolanda del Rocío Paredes Jiménez
ABSTRACT
Xylol is an inflammable aromatic hydrocarbon and toxic, very used in histopathology; it is
deleterious for the health people handling it: hence, substituting it is necessary whit another
substance that conducts the same function, but that is not deleterious for the operator. The
current work was conducted, based on information of a study conducted by Anuradha A, in
China 2014, where the use of lemon water is used to replace xylol, 20 samples of diverse tissues
were used, which were processed to obtain two equal cuts of each sample. One of them was
desparafinized with lemon water, while for the other xylol was used, and hematoxyline-eosin
stain was used. Stained plates were blindly analyzed by a pathologist physician, based on four
parameters, staining quality, identification of morphologic structures, reading time and diagnosis
certitude. The result was that lemon juice comply its action as desparafinizing agent.
Keywords: XYLOL/HISTOPATHOLOGY/LEMON/HEMATOXYLIN/EOSIN/
DESPARAFINIZING
I certify that I am fluent in both English and Spanish languages and that I have translated the
attached abstract from the original in the Spanish language to the best of my knowledge and
belief.
Ernesto Andino
Translator
1
INTRODUCCION
El xilol, también conocido como xileno o dimetilbenceno, es un hidrocarburo aromático,
un líquido inflamable o gas incoloro con un olor dulce. El xilol es nocivo, sus vapores pueden
provocar dolor de cabeza, náuseas y malestar general. Al igual que el benceno, es un
agente narcótico. Las exposiciones prolongadas a este producto pueden ocasionar alteraciones
en el sistema nervioso central y en los órganos hematopoyéticos. (Simon, 2010)
Este es muy utilizado en el laboratorio de histopatología, como agente desparafinizante en
la tinción de hematoxilina-eosina, que se emplea para estudiar las estructuras de la célula una
vez que esta haya abandonado su hábitat natural, por lo tanto es necesario seguir una técnica
histológica que es el conjunto de procedimientos aplicados a un material biológico con la
finalidad de prepararlo y conferirle las condiciones óptimas para poder observar, examinar y
analizar sus componentes morfológicos a través del microscopio. (Montalvo, 2010).
El limón además de contener gran cantidad de vitamina C contiene ácido cítrico, málico y
el fórmico, los cuales le dan una propiedad disolvente muy similar a la del xilol por lo cual
podría ser su reemplazo como agente desparafinizante en la técnica de
histopatología.(Cardenas, 2014).
2
CAPITULO I
EL PROBLEMA
PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA
El xilol es un reactivo que se utiliza en el laboratorio de histopatología desde hace
muchos años, como un agente de eliminación y aclaración en el procesamiento de tejido
donde causa el desplazamiento máximo de alcohol y hace que el tejido quede transparente
mejorando así la infiltración de parafina y como un agente desparafinizante en la tinción.
Es extremadamente útil pero puede causar mucho daño a la salud de la persona que
lo manipula, el xilol entra en el cuerpo por medio de los pulmones y se almacena en el
tejido adiposo (debido a su solubilidad en ella), especialmente en la grasa subcutánea con
una vida media de 1 a 6 días, con la exposición a largo plazo conduce a incapacidad
permanente causada por disminución del trifosfato de adenosina mitocondrial en las células
afectadas. En el hígado, se metaboliza por oxidación de un grupo metilo y la conjugación
con glicina para producir ácido hipúrico de metilo que se excreta en la orina. (Zamorano,
2009)
3
FORMULACION DEL PROBLEMA
¿Puede el agua de limón ser el reemplazo del xilol, para comprobar su acción
desparafinizante en los cortes de tejido coloreados con hematoxilina eosina en el Laboratorio
de Histopatología de la Facultad de Ciencias Médicas de la Universidad Central del Ecuador
durante los meses de Marzo a Julio2015?
OBJETIVOS
OBJETIVO GENERAL
Comprobar la acción desparafinizante del agua de limón en los cortes de tejido a ser
coloreados con hematoxilina eosina en el Laboratorio de Histopatología de la Facultad de
Ciencias Médicas de la Universidad Central del Ecuador
OBJETIVOS ESPECIFICOS
Establecer la calidad de tinción de los cortes de tejidos previamente desparafinizados
con agua de limón, y de los desparafinizados con xilol
Determinar la facilidad o dificultad de identificación de las estructuras de los tejidos
desparafinizados con xilol, y de los tejidos desparafinizados con agua de limón
observados en el microscopio.
4
Comprobar si permite o no permite el diagnostico en el caso de las placas
desparafinizadas con agua de limón.
HIPOTESIS
El jugo de limón tiene igual acción desparafinizante que el xilol en las placas histológicas
coloreadas con hematoxilina eosina.
JUSTIFICACION
El uso del xilol es fundamental en los procesos de laboratorio de Histopatología, pero la
exposición a este reactivo, conduce a peligros para la salud de los profesionales de laboratorio
clínico, causando en ellos desde náuseas, vómitos, dermatitis de contacto y hasta la muerte. De
ahí que el presente estudio pretende sustituir el uso del xileno por jugo de limón diluido. El
jugo de limón se utiliza habitualmente para limpiar utensilios de cobre, para eliminar la grasa
como desinfectante de cocina, sanitario, limpiador de madera, y otros usos más. En la revisión
de la literatura se encontró un estudio (Anuradha A, 2014), en el cual demuestran la
aplicación del jugo de limón como una alternativa para reemplazar al xileno en la eliminación
de la parafina en las secciones de tejido por su propiedad disolvente que en este caso actuaría
entonces como desparafinizante, siendo para ellos el resultado completamente similar en las
dos técnicas.
5
CAPITULO II
MARCO TEORICO
TÉCNICAS HISTOLÓGICAS
Denominamos proceso histológico a una serie de métodos y técnicas utilizados para
poder estudiar las características morfológicas y moleculares de los tejidos. Hay diversos
caminos para estudiar los tejidos, es decir, series de técnicas que se utilizarán dependiendo
de qué característica deseemos observar. En el siguiente esquema (Ilustración 1) se
muestran los métodos y técnicas comúnmente empleados para el procesamiento de los
tejidos para su observación con el microscopio óptico. (Lens, 2014)
Ilustración 1
Ejecución de las Fases de las Técnicas Histológicas
Fuente:(Martin, 2012)
Consultado: Abril 2015
6
OBTENCIÓN Y MANEJO DE MUESTRAS DE TEJIDOS
El proceso histológico comienza con la obtención del tejido objeto que se va a estudiar,
todos los tejidos cuando se extraen de un organismo o cuando el organismo en el que están
muere, sufren dos tipos de procesos degenerativos:
Autolisis por acción de enzimas intracelulares, es decir, autodigestión,
Putrefacción por acción bacteriana.
El procesamiento histológico posterior del tejido para poner de manifiesto y observar
determinadas estructuras supone una metodología que puede degradar las estructuras
tisulares. (Fidalgo, 2014)
La calidad y la fidelidad con que una célula o un tejido muestren una imagen al
microscopio, con las características morfológicas que poseían cuando estaban con vida,
dependen esencialmente de la prontitud y el cuidado que se aplica en la obtención y manejo
de la muestra. Existen diversos procedimientos que permiten obtener las muestras de
tejidos para conseguir preparaciones histológicas de buena calidad. (Montalvo, 2010)
Las muestras de tejido que se estudian en el laboratorio de Histopatología son:
a) Biopsia: (del griego bios = vida y opsis = visión), consiste en la toma de un fragmento de
tejido u órgano de un ser vivo. Una biopsia puede obtenerse de varias formas, dependiendo
del tipo de muestra que se necesite. Los endoscopios flexibles (tubos flexibles de fibra
óptica, con un lente para la visión y luz) permiten que el cirujano observe dentro del cuerpo
a través de una incisión pequeña y que tome una muestra de tejido.
7
Las muestras de tejido son, por lo general, pequeñas y se extirpan del tejido que parece
haber sufrido cambios en su estructura, como lo son los tumores. (Montalvo, 2010)
Tipos de biopsias:
La biopsia endoscópica: Este tipo de biopsia se realiza por medio de un
endoscopio de fibra óptica (un tubo delgado y largo que tiene un telescopio de
enfoque cercano en su punta para poder observar) insertado a través de un orificio
natural (como por ejemplo el recto) o una incisión pequeña. (Lens, 2014)
El endoscopio se usa para observar el órgano en cuestión para buscar áreas
anormales o sospechosas, para poder obtener una pequeña cantidad de tejido para
estudiarlo. Los procedimientos endoscópicos reciben el nombre del órgano o parte
del cuerpo que se va a visualizar, recibir tratamiento o ambos. Los médicos pueden
insertar el endoscopio dentro del tracto gastrointestinal (endoscopia del tracto
alimenticio), en la vejiga (cistoscopia), en la cavidad abdominal (laparoscopia), en
la cavidad de una articulación (artroscopia), en la porción central del pecho
(mediastinoscopía), o en la tráquea y el sistema bronquial (laringoscopia y
broncoscopía). (Lens, 2014)
La biopsia de la médula ósea: Biopsia por aspiración y por punción de la médula
ósea - un procedimiento que comprende la extracción de una pequeña cantidad de
líquido de la médula ósea (aspiración) y, o de tejido sólido de la médula ósea
(biopsia core o por punción), generalmente de los huesos de la cadera, para estudiar
la cantidad, tamaño y madurez de los glóbulos y, o de las células anormales.
(Mendoza, 2010)
8
La biopsia excisional o incisional: Este tipo de biopsia se usa frecuentemente
cuando se necesita una porción más amplia o profunda de la piel. Usando un bisturí
(cuchillo quirúrgico, escalpelo), se extirpa una parte de la piel en su totalidad para
un examen detallado, y la herida se cose (con suturas quirúrgicas).
Cuando se extirpa todo el tumor, la técnica se llama biopsia excisional. Si se extirpa
sólo una parte del tumor, se le llama técnica de biopsia incisional. La biopsia
excisional es el método preferido cuando se sospecha la presencia de melanoma.
(Vallejo, 2013)
La biopsia de aspiración por medio de una aguja fina (su sigla en inglés es
FNA): Este tipo de biopsia incluye el uso de una aguja fina para extirpar partes muy
pequeñas de un tumor. Algunas veces se utilizan analgésicos locales para adormecer
el área, pero el examen raramente causa incomodidad y no deja cicatrices. (Komen,
2013)
La FNA no se utiliza para diagnosticar un lunar sospechoso, pero puede utilizarse
para realizar biopsias de los nódulos linfáticos grandes cercanos al melanoma para
saber si éste se ha extendido por metástasis (propagado). Puede usarse una
tomografía computarizada (su sigla en inglés es CT o CAT) - un procedimiento que
produce imágenes de cortes transversales del cuerpo - para guiar la aguja dentro del
tumor en un órgano interno como el pulmón o el hígado. (Komen, 2013)
9
Una biopsia de perforación: Las biopsias de perforación toman una muestra de
piel más profunda, con un instrumento para la biopsia que extirpa un cilindro corto
o "corazón de manzana", del tejido. Después de proporcionar anestesia local, el
instrumento se rota en la superficie de la piel hasta que corta todas las capas,
incluyendo la dermis, epidermis y las partes más superficiales del subcutis (grasa).
(Vallejo, 2013)
La biopsia de raspado: Este tipo de biopsia se realiza removiendo las capas más
superficiales de la piel raspándolas con un instrumento afilado. Las biopsias de
raspado también se realizan con anestesia local. (Laguna, 2010)
La biopsia de la piel: Las biopsias de la piel se realizan removiendo una muestra
de piel para examinarla con el microscopio y así determinar si existe melanoma. La
biopsia se realiza utilizando anestesia local. Usualmente el paciente sólo siente el
leve pinchazo de una aguja y un poco de ardor durante más o menos un minuto, con
un poco de presión, pero sin dolor. (Eder M, 1999)
Los sitios comunes para las biopsias son:
La médula ósea.
Glándula mamaria
El tracto gastrointestinal.
El riñón.
El hígado.
El pulmón.
10
Los nódulos linfáticos.
La piel.
La tiroides.
El cerebro.
b) Pieza quirúrgica: que se obtiene a través de una operación quirúrgica hecha en o
durante la intervención quirúrgica efectuada en pacientes y corroborar así un diagnóstico de
una determinada lesión. Las piezas quirúrgicas más frecuentes que se reciben en laboratorio
de histopatología son: biopsias gástricas, apéndice cecal, vesícula biliar, y útero. (Montalvo,
2010)
c) Piezas de Autopsia: las muestras se obtienen de seres muertos: En este caso es
recomendable que los tejidos y órganos se obtengan inmediatamente después de producida
la muerte. Consiste en el estudio de un cadáver mediante su observación cuidadosa, debe
incluir la apertura de sus cavidades y el examen de todos sus órganos y tejidos, con el
propósito de investigar en sus órganos la causa de la muerte o la enfermedad fundamental
que tuvo que ver con este proceso. (Rodiles, Campanón, & Laza, 2008)
Los tipos de autopsias son los siguientes:
Autopsia clínica: se realiza en los casos de muerte natural, cuando el paciente llega
a la etapa final de una enfermedad. La autopsia clínica, pone el máximo interés en
analizar los hallazgos observados con la finalidad de conocer la historia natural de
la enfermedad que provocó la muerte.
11
Autopsia médico legal: se realiza en los casos de muerte violenta (homicidios,
suicidios, accidentes) o sospechoso de tal.
Trata de investigar el origen de un fallecimiento cuando existen implicaciones
penales o civiles en la causa o en las circunstancias de este; la realiza el médico
forense. Lo que se espera de esta necropsia es que ayude a determinar el momento y
las circunstancias de la muerte; información que se puede emplear como prueba en
el proceso de la acción judicial. (Komen, 2013)
Recomendaciones para la toma de las muestras. Los tejidos y los órganos provenientes
de biopsias y necropsias se seccionan empleando bisturís o navajas de afeitar nuevos, sin
hacer presión sobre ellos. No es recomendable el uso de tijeras para cortar los tejidos pues
éstas ocasionan compresiones y jalonamientos de los tejidos y órganos que distorsionar su
estructura microscópica. El tamaño de las muestras no debe exceder de 20 mm por lado con
un grosor de 5 mm. (Lens, 2014).
FIJACIÓN DE TEJIDOS
Fijar un tejido es preservar sus características morfológicas y moleculares lo más
parecidas posibles a las que poseía en su estado vivo. Es como hacer una fotografía del
tejido vivo y poder observarla, tras cierto tratamiento, con el microscopio. Esto se
consigue inmovilizando (por coagulación o precipitación) las moléculas proteínicas e
inhibiendo principalmente las enzimáticas haciéndolas insolubles. Esta acción garantiza
12
la integridad de las células y tejidos; se efectúa por mediante agentes químicos
denominados fijadores. Así, los fijadores deben evitar la autolisis, proteger frente a
ataques bacterianos, insolubilizar elementos solubles que se quieren estudiar, evitar
distorsiones y retracciones tisulares, penetrar y preparar el tejido para poder llevar a
cabo tinciones específicas posteriores, si es necesario, etcétera. (Lens, 2014)
No existe un fijador universal, ni un método de fijación único. Incluso podemos usar
varios fijadores secuencialmente según nuestras necesidades. La elección depende de las
características fijadoras que necesitemos. Por ejemplo, si queremos estudiar actividades
enzimáticas debemos usar un fijador que no nos altere el centro activo de las enzimas en
las que estamos interesados, y quizá para ello tengamos que sacrificar en cierta medida
la morfología tisular. Si queremos estudiar la ultraestructura celular debemos usar
fijadores que la preserven y que protejan a las membranas celulares durante el
procesamiento de inclusión en resinas, y quizá esto altere su apetencia por los colorantes
generales. (Molist, Pombal, & Megias, 2011).
Si queremos teñir un determinado componente celular difícilmente teñible quizá
debamos usar un fijador que lo modifique para que sea reconocido más fácilmente por
los colorantes. En cualquier caso hay características de los fijadores que tenemos que
tener en cuenta antes de su uso como: (Molist, Pombal, & Megias, 2011).
13
Velocidad de penetración. El proceso de fijación ha de ser rápido y la velocidad de
difusión de la sustancia fijadora en los tejidos es un factor determinante. Este
parámetro condiciona el tamaño de la pieza que se quiere fijar, más pequeña cuanto
menor sea la velocidad de difusión del fijador empleado, y también determina el tiempo
de fijación, mayor cuanto menor tiempo de difusión. (Tapia, 2011)
Velocidad de fijación. Esta característica no depende de la velocidad de difusión sino
de las propiedades químicas del fijador y condiciona el tiempo que debe permanecer el
tejido en contacto con el fijador. (Mendoza, 2010)
Endurecimiento. Los fijadores generalmente endurecen los tejidos, lo cual depende del
tipo de fijador y del tiempo que el tejido haya estado expuesto a él. (Paredes, 2015)
Ósmosis y pH. Es indispensable evitar cambios de volumen en las células producidos
por una osmolaridad del fijador diferente a la del tejido. Por tanto, hay que equilibrar la
osmolaridad de las soluciones fijadoras y la de los tejidos a fijar. No es necesario añadir
sustancias complejas. Por ejemplo, para los tejidos de animales terrestres basta con
añadir 0.9 % de cloruro sódico. Son sales que no afectan a la capacidad del fijador.
Normalmente se suelen usar soluciones tamponadoras a un pH semejante al del tejido e
isoosmóticas con dicho tejido. (Tapia, 2011)
14
Efecto mordiente. Algunas estructuras tisulares son difíciles de teñir puesto que tienen
poca apetencia por los colorantes. Esta apetencia puede ser incrementada con un
tratamiento previo. Algunos fijadores, además de fijar, modifican químicamente a
ciertas estructuras celulares para que posteriormente puedan unirse a ellas los colorantes.
Este tipo de modificación química se le denomina efecto mordiente.(Mejía, 2011)
Artefactos. Los procesos de fijación pueden acarrear alteraciones tisulares como
variaciones morfológicas, cristalización de compuestos, desplazamiento de sustancias,
etcétera. Estos cambios pueden producirse por las características del fijador o por un mal
uso de éste. En cualquier caso deben tenerse en cuenta para no describir como
características tisulares lo que es un artefacto introducido durante la fijación. (Molist,
Pombal, & Megias, 2011)
Efectos de la fijación
El efecto más marcado de la fijación es la desnaturalización de las proteínas, esto trae
como consecuencia que los tejidos se hagan más resistentes a los efectos del procedimiento
subsiguiente. También los tejidos se hacen más permeables que en su estado fresco natural.
Algunos fijadores tienen la desventaja de inhibir e interferir con las reacciones de los
colorantes, mientras que otros fijadores actúan como mordientes que aseguran cierto
resultado de coloración. (Rodiles, Campanón, & Laza, 2008)
15
Clasificación de los fijadores
Los fijadores se clasifican en dos grandes grupos:
a) Oxidantes: el tetraóxido de osmio (ácido ósmico), el bicromato de potasio, ácido
crómico, bicloruro de mercurio o “sublimado corrosivo”, ácido pícrico, ácido
acético.
b) Reductores: el formaldehído, el glutaraldehído, el alcohol etílico, el alcohol
metílico.
La acción oxidante o reductora de los fijadores le confieren a las células ciertas
condiciones que posibilitan una mejor aplicación de las sustancias colorantes, por
ejemplo: el alcohol etílico absoluto conserva el glucógeno, el bicloruro de mercurio
provoca que las anilinas coloreen de manera más brillante a las fibras colágenas, el
bicromato de potasio facilita la coloración de las mitocondrias. (Mendoza, 2010)
Los fijadores son:
Gaseosos: como el formaldehído
líquidos: como el ácido acético, al alcohol etílico, la acetona, etc.
sólidos: como el bicloruro de mercurio, el bicromato de potasio, etc.
16
Criterios para obtener una buena fijación.
a) Elección del fijador: La solución fijadora a utilizar depende del estudio que se quiere
realizar. Para las preparaciones de tejidos y órganos, en las que interesa un estudio
topográfico de los mismos, deben usarse fijadores con un buen poder de penetración y de
difusión. Para estos casos se recomienda utilizar los líquidos de Zenker, Boüin o Helly:
En caso contrario se empleará la solución de formol al 10% ó 15% que permite obtener
resultados satisfactorios. Líquido considerado como el “fijador universal” pues facilita el
empleo posterior de cualquier otro fijador (postfijación) capaz de complementar su
acción. (Montalvo, 2010)
b) Tamaño de las muestras: El tamaño y grosor de las muestras deben ser pequeños y
delgados, de 10 mm a 20 mm y con un espesor de 2 mm a 5 mm, especialmente si se
emplean fijadores con escaso poder de penetración y de difusión.
c) Volumen del fijador: En lo referente al volumen de fijador es necesario tener en
cuenta que para cada tipo de muestra que se va a fijar hay una relación del volumen de
fijador y el volumen de tejido que es:
Biopsias 1 al 10
Piezas 1 al 20
Autopsias 1 al 40
17
Valores que significan que por cada centímetro de tejido debe ponerse la cantidad
determinada de fijador por ejemple en la biopsia debe ponerse por cada centímetro de
tejido 10ml de fijador (1al 10) (Paredes, 2015)
d) Tiempo de fijación: El tiempo en la fijación es importante en dos aspectos, primero el
intervalo que media entre la interrupción del aporte sanguíneo y la inmersión de las
muestras en la solución fijadora. Lo deseable es que las muestras se fijen inmediatamente
después de obtenidas mediante una biopsia o que la necropsia se efectúe al poco tiempo
de producida la muerte. Mientras más largo es este lapso, los procesos autolíticos que
sufran los tejidos serán más evidentes. Segundo debe tenerse en cuenta el tiempo que
permanecerán las muestras sumergidas en los fijadores. Este tiempo varía con relación al
tipo de fijador que se utiliza; al tamaño y la naturaleza de la muestra y la temperatura de
fijación. Por lo tanto los lapsos de fijación varían en rangos muy amplios. En cualquier
circunstancia, siempre deben respetarse los tiempos recomendados para cada tipo de
fijador para garantizar la conservación de una buena estructura celular y tisular de los
tejidos. (Lens, 2014)
e) Temperatura de la fijación: A temperatura ambiente pero es recomendable en piezas
autopsias efectuar la fijación a bajas temperaturas (4 C.) dentro de un refrigerador y con la
solución fijadora enfriada previamente. Este procedimiento retardará el tiempo de fijación
pero disminuirá de manera notable la autólisis de los tejidos. (Montalvo, 2010)
18
PROCESAMIENTO DE TEJIDOS
Deshidratación
La deshidratación es el proceso mediante el cual se eliminara el agua del tejido o
muestra tisular para que el tejido pueda ser colocado de forma adecuada en los medios de
inclusión que no sean hidrosolubles. Este proceso se puede realizar utilizando cualquier
reactivo capaz de absorber el agua de los tejidos. El más utilizado es el alcohol etílico, en
tantos por cientos de menor a mayor concentración, ejemplos: 70; 80 y 90%, hasta
alcoholes absolutos. (Ilustración 2). La deshidratación debe ser gradual, ya que los tejidos
llevados de manera directa del agua o de una solución acuosa al alcohol concentrado o
viceversa, sufren la distorsión de los elementos tisulares debido a las corrientes producidas
por la mezcla de alcohol y del agua. (Eder M, 1999)
Ilustración 2
Deshidratación
Fuente: (Martin, 2012)
Consultado: Mayo 2015
19
Las desventajas son las siguientes:
Un tiempo prolongado en el deshidratador produce endurecimiento del tejido.
El tratamiento muy largo en concentraciones más altas de alcohol (por encima de
80%) hace el tejido quebradizo y difícil de cortar.
El tratamiento muy largo en concentraciones más bajas de alcohol (por debajo de
70%), macera los tejidos. (Martin, 2012)
Los deshidratadores utilizados en el laboratorio son los siguientes:
Alcohol etílico. Es el que con mayor frecuencia se usa para la deshidratación de los tejidos.
Actúa rápido, no es toxico y es confiable. El alcohol absoluto, en específico, causa sobre
endurecimiento de los tejidos. (Pérez, 2006)
Alcohol metílico. Es toxico, como es un deshidratante, se emplea para las preparaciones de
frotis e improntas de sangre y tejidos.
Alcohol isopropílico. Sustituto excelente del alcohol etílico. Es miscible con agua, xilol,
cloroformo, alcohol, éter y aceite de cedro.
Digoxan. Es un reactivo incoloro, algo toxico, que se puede usar también en el proceso de
infiltración. Es capaz de deshidratar y aclarar de forma directa desde el agua, es miscible
20
con la parafina. Cuando se utiliza alcohol absoluto como deshidratador final, el tejido se
debe desalcoholizar (por lo general en xilol) antes de la infiltración con parafina, debido a
que el alcohol absoluto no es fácilmente miscible con esta. (Bermejo, Sanchez, Perez,
Muñoz, & Garcia, 2006)
Aclaramiento
La desalcoholización, se refiere a la extracción del alcohol, mientras que el termino
aclaración se refiere de manera especial a la de hacer transparentes los elementos tisulares.
Muy a menudo el mismo reactivo se usa para ambos propósitos y en consecuencia el
término aclaración actualmente se emplea en ambos sentidos. (Sánchez, 2006)
Sustancias aclarantes
Después de que los tejidos han sido deshidratados con el alcohol, se emplean sustancias
aclaradoras, cuya función es desalcoholizar de forma consecuente. Estas se deben mezclar
sin dificultad con el alcohol. También debe ser un disolvente de la parafina, de manera que
facilite la penetración de este medio de infiltración. En otras palabras, se sustituye el
deshidratador por un líquido que después se mezcla con la parafina. (Laguna, 2010)
Las sustancias aclaradoras más utilizadas en el laboratorio son las siguientes:
Xilol. Es un líquido incoloro, y es el agente aclarador que con mayor frecuencia se emplea
en la actualidad. Se utiliza para aclarar, tanto en el proceso de infiltración, como enel
21
proceso de montaje, sin embargo, el tratamiento prolongado con xilol en el proceso de
infiltración. (Ilustración 3)
Benzol. Tiene el inconveniente de que se evapora muy rápido en el baño de parafina.
Produce un mínimo de encogimiento. Por lo que se debe evitar su empleo de ser posible.
Algunos autores lo prefieren como aclarador en el proceso de infiltración porque penetra y
aclara los tejidos muy rápido. (Zamorano, 2009)
Cloroformo. No es inocuo del todo, por lo que su empleo se debe evitar en lo posible. Se
utiliza para aclarar los tejidos en el proceso de infiltración, su penetración es más lenta que
el xilol, no hace el tejido tan quebradizo como este, pero produce algún endurecimiento.
(Dideval, 1996)
Toluol sus propiedades son similares a las del xilol. Aclara menos rápido que este o que el
cloroformo, pero no endurece los tejidos. Por tanto, es un buen agente aclarador en el cual
se pueden dejar los tejidos durante la noche en caso de necesidad. Es un líquido incoloro y
fácilmente miscible con la parafina. Aclara mejor a partir del alcohol absoluto. Se utiliza
para aclarar, tanto durante la infiltración, como durante el montaje. (Rodiles & Campanòn,
2008)
22
Requisitos de un aclarante:
Que no dañe el tejido
Que sea compatible con el medio de inclusión y con el agente deshidratante.
Que sea fácil de eliminar
Que posea baja toxicidad.
El método de aclaramiento consiste en la realización de baños sucesivos de agente
clarificante, variando en duración según las características del agente y del volumen de la
pieza. A menudo se utiliza previamente a los baños de clarificantes mezclas de agentes
deshidratantes en distintas concentraciones.(Montalvo, 2010)
Ilustración 3
Xileno: ventajas e inconvenientes
Fuente: (Martin, 2012)
Consultado: Mayo 2015
Protocolo de procesamiento de tejidos
El procesamiento de tejidos se realiza en un equipo automático en un tiempo
aproximado de 16 horas pasando por varios reactivos: (Ilustración 4)
23
1. Cubeta: Formol 1 hora
2. Cubeta: Formol 1 hora
3. Cubeta: Formol 1 hora
4. Cubeta: Formol 1 hora
5. Cubeta: Alcohol 70º 1 hora
6. Cubeta: Alcohol 96º 1 hora
7. Cubeta: alcohol 100º 1 hora
8. Cubeta: alcohol 100º 1 hora
9. Cubeta: Xilol 2 horas
10. Cubeta: Xilol 2 horas
11. Cubeta: Parafina 1 2horas
12. Cubeta: Parafina 2 El resto del tiempo
Ilustración 4
Procesamiento de tejidos
Fuente: (Martin, 2012)
Consultado: Mayo 2015
24
Infiltración
Después de que los tejidos han sido aclarados por completo con un agente aclarante, es
necesario infiltrarlos con un medio de soporte o sostén para poder realizar los cortes
histológicos. (Martin, 2012)
Medios de imbibición e inclusión
Los tejidos fijados no son lo suficientemente firmes, o adherentes como para permitir su
corte sin algún medio de soporte para que se mantengan las células y estructuras
intercelulares en su propia relación unas con otras. Para este fin, se cuenta con medios de
inclusión, siendo el más utilizado la parafina. También la celoidina aunque no se usa con
frecuencia, y el carbowax (cera soluble en agua). (Pumbal & Megias, 2011)
ELABORACIÓN DE BLOQUES
Una vez fijado el tejido tenemos que procesarlo para su observación con el microscopio.
Ello implica hacer secciones para teñirlas primero y posteriormente observarlas.
Como regla general se procede al endurecimiento de la muestra para poder obtener
dichas secciones ya que lo normal es que cuanto más delgada queramos una sección más
consistente debe ser la muestra de la que se obtiene.
25
Inclusión
Este término designa a todos los materiales utilizados por los técnicos para sostener y
rodear los tejidos que después serán seccionados en cortes finos, siendo esta su función.
(Ilustración 5). Por necesidad, los medios de inclusión deben ser sustancias capaces de ser
convertidas, con facilidad, del estado líquido al sólido. (Lens, 2014)
Ilustración 5
Inclusión
Fuente: (Martin, 2012)
Consultado: Junio 2015
Parafina
La parafina es un hidrocarburo saturado, blanco y homogéneo, producto de la
destilación del petróleo. Existen dos tipos de parafinas, la blanda (de 45 a 50ªC) y la dura.
26
La parafina que se utiliza en el trabajo diario es la dura con un punto de fusión entre 56
y 62ªC, ya que permite obtener cortes más finos, suministra un mejor apoyo o sostén a los
objetos duros y es adecuada para temperaturas del laboratorio. (Molist, Pombal, & Megias,
2011)
Resultan distintos tipos de parafinas a temperatura ambiente que se emplean según las
necesidades. Así, parafinas más duras a temperatura ambiente tienen un punto de fusión
mayor, mientras que las más blandas uno menor. Es recomendable una dureza mayor para
incluir muestras más duras. Las parafinas más usadas tienen un punto de fusión en torno a
los 60 ◦C. Podemos también modificar las características de las parafinas añadiendo
sustancias para variar su dureza, viscosidad, fragilidad, etc. (Rios, 2011)
La parafina no es miscible con agua, mientras que todos los tejidos están formados
principalmente por agua. Además, la mayoría de los fijadores son soluciones acuosas. Esto
implica que para que la parafina liquida pueda penetrar completamente en el tejido ha de
sustituirse el agua por un solvente orgánico. Esto se consigue mediante la deshidratación
del tejido en alcoholes, normalmente metanol, degradación creciente hasta alcohol de 100.
Posteriormente se transfiere el tejido a un líquido que sea miscible tanto con el alcohol de
100 como con la parafina, denominado sustancia intermediaria, como es el benceno, xileno,
tolueno o el óxido de propileno, entre otros. Estas sustancias son normalmente aclarantes
por lo que comprobando la translucidez de la pieza podemos cerciorarnos de la penetración
de la sustancia intermediaria en el tejido.
27
El tiempo de incubación de la pieza de algunos estos líquidos intermediarios como el
tolueno o xileno no debe ser excesivo puesto que estas sustancias endurecen la pieza y
provocar problemas hacer las secciones. (Molist, Pombal, & Megias, 2011)
Por último se pasa el tejido a parafina diluida en una estufa regulada a la temperatura
apropiada para dicho tipo de parafina. Se dan tres pasos por parafina parauna buena
impregnación. El tiempo que duran dichos pasos depende de lo volátil que sea el lıquido
intermediario y lo grande que sea nuestra pieza. Sera mayor cuanto menos volátil es el
líquido intermediario o mayor sea la muestra de tejido. Hay que tener en cuenta que un
tiempo excesivo en parafina puede endurecer el tejido. Una vez realizado esto en la
muestra se vierte parafina liquida en un molde, se introduce la muestra y se coloca según la
orientación deseada de corte y se deja solidificar a temperatura ambiente. También existen
otras sustancias que se pueden utilizar para infiltrar e incluir que son la celoidina y la
gelatina, pero son muy costosas. (Ilustración 6)
Ilustración 6
Elaboración del bloque de parafina
Fuente: (Pumbal & Megias, 2011)
Consultado: junio 2015
28
MICROTOMÍA
Es un método para la preparación de secciones delgadas de materiales. En esta etapa, los
tejidos y la parafina integran un solo bloque, el cual posee la dureza y la consistencia
suficientes para obtener secciones delgadas y transparentes. Secciones de micrótomo se
pueden hacer suficientemente delgadas como para la sección de un cabello humano a través
de su anchura, con un espesor de sección de entre 50 nm y 100 m.Las secciones delgadas o
cortes se obtienen utilizando instrumentos mecánicos diseñados para que en forma más o
menos automática, seccionen el bloque de parafina en cortes delgados y de grosor
uniforme. Los instrumentos se denominan micrótomos(Montalvo, 2010)
Un micrótomo es una herramienta utilizada para cortar rebanadas muy finas de material,
conocidos como secciones. Importante en la ciencia, micrótomos se utilizan en la
microscopía, lo que permite la preparación de muestras para la observación bajo luz
transmitida o radiación de electrones. (Ilustración 7). Micrótomos utilizan acero, vidrio, o
las hojas de diamante, dependiendo de la muestra está en rodajas y el espesor deseado de
las secciones se cortan. Cuchillas de acero se utilizan para preparar las secciones de tejidos
animales o vegetales para la luz histología microscopia. Cuchillos de vidrio se utilizan para
cortar secciones para microscopía de luz y para cortar secciones muy delgadas para
microscopía electrónica. Cuchillas de diamante de grado industrial se utilizan para cortar
materiales duros, como los huesos, los dientes y la materia de la planta, tanto para
microscopía de luz y para microscopía electrónica. (Montalvo, 2010)
29
Historia del micrótomo
En los inicios del desarrollo de microscopio de luz, las secciones de las plantas y los
animales se prepararon manualmente con hojas de afeitar. Se encontró que para observar la
estructura de la muestra en observación era importante para hacer cortes limpios
reproducibles en el orden de 100 m, a través del cual la luz puede ser transmitida. Esto
permitió la observación de muestras usando microscopios de luz en un modo de
transmisión.(Paniagua, 1997)
Uno de los primeros dispositivos para la preparación de tales cortes fue inventado en
1770 por George Adams, Jr. y desarrollado por Alexander Cummings. El dispositivo se
hizo funcionar a mano, y la muestra realizada en un cilindro y secciones creado a partir de
la parte superior de la muestra utilizando una manivela. En 1835, Andrew Prichard
desarrolló un modelo basado en la tabla que permitió la vibración que ser aislado por fijar
el dispositivo a la tabla, que separa el operador del cuchillo. En ocasiones, la atribución de
la invención del micrótomo se da al anatomista Wilhelm His, Sr., en su Beschreibungeines
Mikrotoms, Wilhelm escribió: El aparato ha permitido una precisión en el trabajo por lo
que puedo lograr secciones que la mano no me es posible crear. Es decir, que ha permitido
la posibilidad de lograr secciones ininterrumpidas de los objetos en el curso de la
investigación.(García, 1993)
Otras fuentes atribuyen aún más el desarrollo de un fisiólogo checo Jan Evangelista
Purkyne. Varias fuentes describen el modelo Purkyne como el primero en el uso práctico.
30
Los puntos oscuros en los orígenes del micrótomo son debido al hecho de que los
primeros micrótomos fueron simplemente recortando aparatos, y la fase de desarrollo de los
primeros dispositivos es ampliamente documentada. Al final de la década de 1800, el
desarrollo de muestras muy delgadas y consistentemente finas por microtomía, junto con la
tinción selectiva de los componentes importantes de las células o moléculas permitidos para
la visualización de los datos de microscopio. (Martin, 2012)
Hoy en día, la mayoría de los micrótomos son un diseño cuchillo-bloque con un
cuchillo cambiable, un soporte de la muestra y un mecanismo de avance. En la mayoría de
los dispositivos de la corte de la muestra comienza moviendo la muestra sobre el cuchillo,
donde el mecanismo de avance se mueve automáticamente hacia adelante de tal manera que
el próximo corte para un espesor elegido se puede hacer. El espesor de corte se controla
mediante un mecanismo de ajuste, lo que permite un control preciso.(Fraile, 2007)
Los micrótomos para cortar material incluido en parafina son probablemente los más
usados en los laboratorios de histología. Todos poseen varias partes comunes: una cuchilla,
un porta bloques y un sistema mecánico que permite acercar el bloque de parafina a la
cuchilla, a una distancia que se corresponde con el grosor de la sección que pretendemos
obtener, y realizar el corte. (Mendoza, 2010)
31
Ilustración 7
Micrótomo
Fuente: (Martin, 2012)
Consultado: Junio 2015
Clasificación
Los micrótomos se clasifican de acuerdo a la manera como se desplaza el bloque que
contiene el tejido incluido; así, existen:
a) Micrótomo de rotación tipo Minot. Mediante una manivela circular denominada
volante, el mecanismo que sujeta al bloque de parafina se desplaza frente al filo de
la navaja, de arriba hacia abajo y viceversa en un movimiento vertical.
b) Micrótomo de deslizamiento. El movimiento que se realiza para obtener los cortes
es horizontal, es decir de atrás hacia adelante y viceversa. Generalmente el
mecanismo que sujeta al bloque de parafina es el que se desplaza y a la navaja
permanece estática.
32
Los micrótomos tipo Minot son los de uso más frecuente en cualquier laboratorio donde
se realiza técnica histológica, especialmente cuando los tejidos están incluidos en parafina.
Los micrótomos de deslizamiento, en cambio, se emplean cuando los tejidos están incluidos
en celoidina o cuando la inclusión en parafina contiene porciones voluminosas de tejidos y
órganos. (Peraza, 2013)
Los micrótomos tipo Minot permiten obtener secciones delgadas, del orden de 4 a 7m
de espesor. Producen cortes seriados, es decir, cuando se obtiene un corte, éste queda
adherido por su borde anterior al borde posterior del que lo precedió; formándose de esta
manera una cinta de cortes que va descendiendo por la superficie anterior de la navaja. Los
cortes seriados se emplean cuando se desea realizar reconstrucciones tridimensionales del
órgano procesado, cuando se requieren comparar secciones vecinas, del tejido u órgano,
coloreadas por diversas técnicas de tinción o cuando se hace el estudio microscópico
topográfico en embriones y fetos. (Peraza, 2013)
Existen dos condiciones indispensables que garantizan la obtención de secciones
delgadas, uniformes y seriadas:
Que la deshidratación, impregnación e inclusión hayan sido realizadas
correctamente.
El empleo de una navaja o cuchilla muy bien afilada y asentada y que el filo de la
misma ofrezca la inclinación adecuada hacia la superficie del bloque.
33
Las navajas o cuchillas de microtomía requieren de un afilado y un asentado muy
cuidadoso, pues el mantenimiento del filo de ellas depende que se obtengan, con éxito,
buenos cortes. Las navajas se afilan utilizando afiladores automáticos que efectúan la
operación en forma rápida y garantizan un afilado uniforme. Para el afilado de las cuchillas
se requieren una placa de vidrio despulida finamente y sustancias abrasivas. (Pumbal &
Megias, 2011)
Existen varios modelos de afiladores automáticos, pero todos ellos funcionan bajo
ciertos mecanismos:
a) movimiento y deslizamiento de las cuchillas sobre la superficie del vidrio despulido
(movimiento rotatorio o de atrás hacia adelante y viceversa)
b) movimiento y rotación periódica de las dos superficies de la cuchilla para
enfrentarse de manera alternativa y similar a la superficie del vidrio con el abrasivo
c) en ciertos modelos, la placa de vidrio también puede realizar movimientos
restringidos de rotación (Laguna, 2010)
Baño de flotación
El baño de flotación debe estar a una temperatura unos cuantos grados por debajo del
punto de fusión de la parafina. El uso de agua destilada en el baño de agua ayuda a eliminar
burbujas de aire. Puede usarse sin embargo, agua corriente. Una vez comenzado el corte de
nuestra muestra se obtienen tiras de secciones unidas por las caras paralelas a la cuchilla.
34
Estas tiras se suelen manipular con pinceles o lancetas y, antes de su fijación definitiva
en la superficie de un portaobjetos, han de estirarse para que nuestro tejido quede
perfectamente extendido. (Ilustración 8). La cinta se coloca suavemente en el baño de
flotación para eliminar arrugas y aire atrapado debajo. Se separan luego las secciones
individualmente y se colocan en las láminas limpias previamente marcadas. Las láminas se
dejan escurrir verticalmente por varios minutos antes de colocarlas dentro de la estufa o
microondas a una temperatura entre 37°C y 40°C por 5 o 10 minutos (en la estufa) o 2
minutos y 30 segundos en el microondas. Si las láminas no se dejan escurrir, habrá burbujas
de aire bajo el tejido y la adhesión de la sección de tejido a la lámina va a disminuir. Una
vez secos, los portaobjetos con las secciones están listos para el procesamiento posterior.
(Ross, 2005)
Pasos a seguir para obtener cortes en parafina:
1. Antes de cortar un bloque hay que examinarlo y saber cómo va a ser orientado en el
portabloque.
2. Remover el exceso de parafina de los lados.
3. Colocar el bloque en el porta bloque.
4. Ajuste preciso con los tornillos del porta bloque.
5. Orientar y ajustar con los tornillos de direccionamiento (laterales y verticales) hasta
que el bloque quede completamente paralelo al porta cuchilla.
6. Colocar la cuchilla.
7. Proceder a tomar rebanadas gruesas hasta visualizar por completo el tejido (10 a 15
micras).
35
8. Una vez que la superficie tisular entera este expuesta reajustar las micras (el número
de estas es de acuerdo al tipo de tejido que estemos trabajando).
9. Tomar el corte con agujas histológicas y colocarlas en el baño de flotación o bien
sea en plancha de calentamiento hasta que los cortes queden completamente
estirados y sin burbujas.
10. Recoger con el porta objeto el corte y colocarlo en la estufa.
Ilustración 8
Cortes de tejido en parafina
Fuente: (Molist, Pombal, & Megias, 2011)
Consultado: julio 2015
DESPARAFINIZACION
Recogidos los cortes, éstos aún se pueden orientar aprovechando de la capa de líquido
que queda entre el portaobjetos y los cortes. Posteriormente las láminas se apoyan en forma
oblicua para que escurra el líquido sobrante y luego se colocan horizontalmente dentro de
una estufa o encima de una plancha caliente ( a 50o C aproximadamente).
36
Después de unas 3 a 4 horas, el líquido se habrá evaporado totalmente y la sustancia
adhesiva unirá firmemente el corte al portaobjetos para que estos puedan ser
desparafinizados con el xilol. (Montalvo, 2010)
Xilol
Nombre químico: Xileno Fórmula química: C6H4 (CH3)2 Sinónimos: Xilol; Dimetil -
benceno; Metil-tolueno Familia química: Hidrocarburos aromáticos.
Clasificación de riesgo del producto químico
a) Peligro para la salud: Los vapores causan olor de cabeza y mareos. El líquido irrita los
ojos y la piel. Si llega a los pulmones causa tos fuerte con rápido desarrollos de edema
pulmonar. Si se ingiere, causa náusea, vómitos, dolor de cabeza y como. Puede ser fatal.
Pueden ocurrir daños a los riñones y al hígado. Sobreexposición: Inhalación: Puede causar
dolor de cabeza, respiración dificultosa, o pérdida de la conciencia. Contacto con la piel:
Causa irritación a la piel. Ingestión: Irritación tracto digestivo, nausea, vómito, convulsión,
coma.
b) Peligro medio ambiente: Contaminación del agua.
c) Peligro especial: El mayor peligro es su inflamabilidad.
37
Manipulación y almacenamiento
Recomendaciones técnicas: Almacene los contenedores en lugares bien ventilados, en lo
posible al aire libre. El almacenamiento en el interior de los edificios debe ser un lugar
especialmente acondicionado para el almacenamiento de inflamables. (Zamorano, 2009)
Precauciones: Tome las precauciones normales para almacenar inflamables: lugares bien
ventilados, con iluminación a prueba de explosión, con equipamiento cercano para el
combate de incendios.
Condiciones de almacenamiento: El lugar debe ser bien ventilado, ojalá al aire libre. En
el interior, debe cumplir con las exigencias normales de un almacenamiento de líquidos
inflamables.
Envase adecuado y no adecuado: Los contenedores deben ser de material aprobado, no
se permite envases de vidrio, excepto para productos de laboratorio o análisis.
Propiedades físicas y químicas
Estado físico: Líquido claro e incoloro.
Apariencia y olor: Olor aromático característico.
Punto de inflamación: Entre 27 y 32 ºC
38
Temperatura de autoignición: Alrededor de 463 º C.
Límites inflamables: 1% mínimo, 7% máximo (volumen aire).
Peligros de explosión: Explosión en recintos cerrados. Leve en recipientes cerrados.
Presión de vapor: Menor que 15,8 kPa (2 psi).
Gravedad específica: 0,84 a 0,90
Densidad vapor: 3 a 4 veces más pesado que el aire.
Solubidad en agua: Insoluble.
Estabilidad: Estable. Incompatibilidad con materiales: No usar con materiales solubles a los
hidrocarburos. Productos peligrosos de la descomposición: Toxicidad propia. (Dideval,
1996)
Limón
Los cítricos en general son considerados plantas tropicales y subtropicales, con cierta
variación en las exigencias específicas de temperaturas máxima, mínima y óptima de
acuerdo con las especies y dentro de ella, las variedades y cultivares. El limón es un
producto de amplio cultivo en el Ecuador, sus exportaciones han sido crecientes y tiene un
muy buen potencial en los mercados internacionales durante todo el año. (Medina, 2007)
Se los puede encontrar además en los valles cálidos de la Sierra, valles secos de la Costa
y ciertas zonas amazónicas: Portoviejo, Echeandía, Santa Isabel, Puerto Quito, Chota,
Guayllabamba, San José de Minas, Tumbaco, Puyo, Nueva Loja.
39
Composición:
El limón dentro de su composición tiene un alto contenido de Vitamina C. Esta
sustancia se encuentra en una proporción de 500 miligramos por litro de jugo de limón.
Además, entre los componentes del limón se destaca el ácido cítrico, el cual se
encuentra en una proporción de 50 gramos por litro.
También posee varios ácidos, como el málico y el fórmico.
contiene además, hesperidita y pectinas.
posee aceites esenciales, principalmente d-limoneno, citroneal y felandreno.
se encuentran varias sales minerales, entre las que se destacan por abundancia o
importancia las de potasio, fósforo y magnesio.
Por otra parte, presenta un alto contenido de agua, fibras, carbohidratos y calorías.
Limón sutil
Reino: Vegetal
Clase: Angiospermas
Subclase: Dicotiledónea
Orden: Rutae
Familia: Rutaceae
Género: Citrus
Subgénero: Eucitrus
Especie: Citrus aurantifolia Swingle
40
Nombres comunes: Limón criollo, lima mexicana, lima ácida, lima chica, lima boba,
limón chiquito, limón corriente, limón agria
El limón sutil es un árbol pequeño o arbusto de 4 a 5 m de altura, con tronco a menudo
torcido y ramas con espinas axilares cortas y duras. (Ilustración 9). Hojas oblongo-ovales o
elíptico-ovales de 2.5 a 9 cm de longitud y 1.5 a 5.5 cm de ancho. Base redondeada y ápice
ligeramente recortado. Márgenes ligeramente crenulados. Pecíolos notablemente alados. 6
Flores blancas de 1.5 a 2.5 cm de diámetro, fragantes, que se disponen en inflorescencias
axilares de 1 a 7 flores. Frutos ovales o globosos con un ápice ligeramente deprimido, de
color verde oscuro al principio pasando a verde amarillento o amarillo en la madurez. Mide
a 5 cm de diámetro o más. Su piel es delgada y se rompe fácilmente. La pulpa
es verdosa, jugosa, muy ácida. Semillas pequeñas, ovales altamente
poliembriónicas (producen dos o más plantas por semilla). Fue introducida en
América desde los primeros viajes de Colón.
Exigencias en clima y suelo Según Sánchez (2005):
Clima: Cálido y templado
Temperatura: Desde 18 a 29º C promedio
Humedad: Entre 40 a 70%
Precipitación: Entre 900 a 1 200 mm anuales bien distribuidos son suficientes
Altitud : De 40 a 1 500 m.s.n.m. para evitar enfermedades de raíces
41
Tipo de Suelo: Suelos profundos, bien aireados franco arenosos, con alto contenido
de materia orgánica.
pH: Neutro a ligeramente ácido ( 5.5 a 6.5 )
Ilustración 9
Limón
Fuente: (Llumiquinga, 2010)
Consultado: Julio 2015
2.7.3 Jugo de limón
El jugo de limón es una sustancia versátil con aplicaciones diversas, desde el cuidado
del cabello hasta la repostería y la limpieza del hogar. El jugo de limón puede aclarar el
cabello, acidificar la leche y aliviar un dolor de garganta. Es un elemento básico de la casa
y está presente en muchos productos, ya sea por sus propiedades químicas o su aroma
fresco.(Cardenas, 2014)
42
Características
Bajo pH: Una de las principales propiedades químicas del jugo de limón es su bajo pH.
Con un pH de 2, de alta acidez, el jugo de limón se ubica justo por debajo del ácido
estomacal en la escala de pH. Su alta acidez significa que tiene una alta concentración de
iones hidrógeno. Como otras sustancias ácidas, el jugo de limón es agrio y puede corroer
los metales. Sus propiedades corrosivas los convierten en un ingrediente útil en los
productos de limpieza, ya que ablanda los minerales del agua dura, permitiendo que los
agentes de limpieza actúen más eficazmente. (Medina, 2007)
Fuente de vitamina C: El jugo de limón contiene altos niveles de vitamina C. En
promedio, los limones contienen aproximadamente dos veces más vitamina C que las
naranjas. Los médicos descubrieron esta característica en el siglo XVII, cuando hallaron
que consumir jugo de limón todos los días podría prevenir los brotes de escorbuto. Sin
embargo, los grandes niveles de vitamina C de los limones se pierden si el jugo queda
expuesto al aire durante un período de tiempo prolongado. (Medina, 2007)
Coloración
La mayoría de las células y matrices extracelulares no poseen un color propio por lo
que su observación directa al microscopio óptico no permite observar sus características
morfológicas.
43
Para poder observarlos se emplean colorantes, sustancias dotadas de color que se unen
de manera más o menos específica a determinadas estructuras del tejido. (Mendoza, 2010)
Principios generales de la coloración
En términos genéricos, los tejidos de origen animal son incoloros, la finalidad de utilizar
coloraciones en los preparados histológicos es poder contrastar y diferenciar estructuras que
por lo general no poseen color propio. El fundamento de cualquier método de tinción radica
en la propiedad que poseen todos los tejidos para incorporar y fijar de modo variable
diversas sustancias coloreadas llamadas colorantes. Una agrupación atómica aromática
incapaz de colorear cuando se une desde el punto de vista químico con un cromóforo se
convierte en un cromógeno, que posee color propio y es capaz de transferir ese color a
cualquier estructura celular que posea afinidad o atracción por esa sustancia colorante. Los
principales grupos cromóforos conocidos son los radicales etileno (>C=C<), carbonilo
(>C=O), tiazólico (>C=S), imino (>C=N), azoico (–N=N–), nitroso (–N=O), nitro (–NO2) y
en general cualquier anillo derivado de las quinonas. (García, 1993)
La conversión de un cromógeno en colorante está vinculada a la adición sobre la
molécula aromática, de otros grupos atómicos que le confieren la propiedad de disociarse
de manera electrolítica o de formar sales con los tejidos. Estos radicales reciben la
denominación genérica de grupos auxocromos (potenciadores de color). Según la
naturaleza de la vinculación molecular entre los colorantes y los tejidos, existen tres
mecanismos generales: de carácter físico, fisicoquímico o histoquímico.
44
Estos mecanismos combinados entre sí en distinta medida explican las particularidades
de las principales técnicas de tinción en histología. Los mecanismos de carácter puramente
físico están ligados a las propiedades de disolución (solubilidad) e impregnación
(adsorción) del colorante sobre el tejido. En el primer caso, el colorante es más soluble en
el tejido que en el solvente que actúa como medio de transporte, de forma que tiende a
pasar desde el solvente hasta el tejido. (García, 1993)
En el caso de la impregnación, el colorante, por su gran volumen molecular o por una
precipitación selectiva en forma de agregados insolubles, queda atrapado entre la malla de
células y fibras que constituyen los tejidos. Las tinciones ligadas a un mecanismo
principalmente químico están basadas en el desarrollo de una reacción química entre el
colorante y la estructura objeto de la tinción de forma que al interaccionar ambos se
produce un nuevo cromógeno responsable del color obtenido.(Laguna, 2010)
Los mecanismos fisicoquímicos de coloración tisular están vinculados a la formación
de uniones intermoleculares por atracción electrostática (principalmente las fuerzas de van
der Waals) o por fuerzas de tensión superficial. Los primeros se basan en la propiedad de
ligarse entre sí moléculas con carga eléctrica contraria, de manera que los colorantes de
carácter ácido tiñen las estructuras básicas, y viceversa. Los fenómenos de tensión
superficial, responsables de la interacción molecular en los líquidos, son debidos a las
fuerzas de gravitación generadas al disponerse las moléculas muy próximas entre sí.
45
Este tipo de mecanismo tintorial está implicado fundamentalmente en coloraciones que
utilizan moléculas en dispersión coloidal para interaccionar con agregados moleculares
dispuestos en la superficie de la estructura a colorear. La absorción luminosa de las
sustancias coloreadas se debe a la resonancia, conocida como un factor de entrecruzamiento
para la estabilidad molecular. (García, 1993)
Clasificación de los colorantes
De acuerdo al origen, se clasifican en naturales y sintéticos, éstos últimos derivados de
la anilina. Desde el punto de vista químico se clasifican en básicos y ácidos. Los colorantes
básicos, son electropositivos, se caracterizan por poseer átomos de nitrógeno y las
propiedades tintoriales se deben a la presencia de grupos amino (NH2). Los colorantes
ácidos son electronegativos, poseen átomos de oxígeno y las propiedades tintoriales se
deben a la existencia de grupos hidroxilo (OH) y sulfidrilo (SH). (García, 1993)
Basofilia
Se define como basofilia, la afinidad de ciertas estructuras celulares y tisulares de
naturaleza química ácida por colorantes básico. Por ejemplo, el núcleo celular en donde se
encuentran los ácidos nucleicos ADN y ARN, es una estructura basófila, de igual manera,
en aquellas células ricas en ARN ribosomal en el citoplasma como los plasmocitos o
células plasmáticas, éste tiende a ser basófilo. (Cajal SR, 1966)
46
Acidofilia o Eosinofilia
Por el contrario, la acidofilia es la característica tintorial definida como la afinidad que
poseen ciertas estructuras celulares y tisulares, por lo general de naturaleza química básica
por colorantes de naturaleza química ácida. Por ejemplo, las proteínas citoplasmáticas se
comportan como bases al pH en el que se realiza la coloración con hematoxilina y eosina,
por lo que son afines al colorante ácido, que en este caso es la eosina. (Cajal SR, 1966)
Coloración Hematoxilina- Eosina (H-E)
La tinción de hematoxilina eosina se conoce desde la segunda mitad del siglo XIX.
Sin embargo existen diversas variaciones, cambiando el tipo de eosina (existen la eosina
Y, llamada amarilla o yellow y la eosina B, azul o blue) y de hematoxilina (existen la
hematoxilina de Harris, de Mayer) específica para obtener resultados más nítidos
dependiendo del tejido a tratar.
Una de las ventajas de esta tinción es que resulta fácil de llevar a cabo y requiere poca
instrumentación. Primeramente si la muestra está incluida en parafina debe hidratarse.
Usualmente se emplea la parafina para incluir la muestra de forma que puedan realizarse
cortes de microtomía, obteniéndose cortes muy finos. (Cajal SR, 1966)
47
Hidratación
La muestra se sumerge en baños sucesivos de etanol en concentraciones descendentes
desde los 100º a los 70º y finalmente en agua.
alcohol absoluto (100°) ------3 minutos
alcohol absoluto (100°) ------ 3 minutos
alcohol de (95°) ---------------- 3 minutos
alcohol de (95°) ---------------- 3 minutos
alcohol de (70°) ---------------- 3 minutos
agua corriente ------------------ 5 minutos.
agua destilada (2 baños)-------1 minuto (cada uno)
Aplicación de los colorantes
Colorear con la solución de hematoxilina. Este compuesto se extrae de Haematoxylum
campechianum, una planta leguminosa originaria de la península de Yucatán, México.
Como curiosidad, el nombre de esta planta significa madera que sangra. De la planta se
obtiene una sustancia que al oxidarse adquiere un color morado. Para aumentar su
capacidad colorante se combina con iones metálicos de hierro o aluminio, consiguiéndose
así la hematoxilina. La hematoxilina se une intensamente a las cargas negativas (aniones),
como los ácidos. Es por esto que se une fuertemente al ADN (ácido desoxirribonucleico).
La tinción con hematoxilina tiñe de color azul los núcleos. (Lens, 2014)
48
En este paso es conveniente respetar el tiempo de coloración que recomienda cada
tipo de solución de hematoxilina. Dependiendo de la fórmula de preparación el tiempo
puede variar de 3 a 20 minutos. La hematoxilina de uso más frecuente es la:
hematoxilina alumínica de Harris --------- 3 a 5 minutos
lavado en agua destilada (2 baños) ------ 1 minuto (cada uno)
Diferenciar, para eliminar el exceso de colorante, se emplea el alcohol ácido, hasta que
los núcleos y los componentes basófilos de las células sean los únicos que permanezcan
teñidos.
lavar en agua corriente ----------------- 2 minutos
Virar al color azul, empleando soluciones de:
Sustancias alcalinas como agua amoniacal
Solución de bicarbonato de sodio al 2%
Carbonato de litio al 1%.
lavar en agua corriente -------------------- 5 minutos
lavar en agua destilada (2 baños ) ------- 1 minuto (cada uno)
Colorear con una solución alcohólica o acuosa de eosina. Las diferencias prácticas en
el uso de la eosina amarilla o azul son mínimas, siendo más utilizada la eosina Y. Ambos
compuestos se obtienen de la interacción del bromo con la fluoresceína.
Eosina ------------------------------------------ 3 a 5 minutos
49
Deshidratación:
Proceso mediante el cual se eliminara el agua
alcohol de 70o ------------------------------ 1 minuto
alcohol de 95o ------------------------------ 1 minuto
alcohol de 95o ------------------------------ 1 minuto
alcohol absoluto (100o ) ------------------ 1 minuto
alcohol absoluto (100o ) ------------------ 2 minutos
Diafanizar o aclarar
Empleando xilol
xilol ------------------------------------------- 1 minuto
xilol ------------------------------------------- 2 minutos
Montaje
Concluido el proceso de la tinción de los cortes, éstos se deben colocar en condiciones
de protección y de poderlos utilizar infinidad de veces sin que se deterioren. Para alcanzar
tales propósitos se recurre al último procedimiento que es el montaje (Ilustración 10).
Consiste en colocar sobre el corte histológico ya coloreado un cubreobjetos, el cual se
adhiere con un adhesivo transparente conocidos como medios de Montaje. Son una
sustancia líquida que con el aire cristaliza, y forman un conjunto estable y duradero. El
medio de montaje suele ser una sustancia hidrófoba, por lo que los cortes antes de ser
montados han de ser deshidratados La preparación montada se deja secar unas horas y se
guarda en oscuridad para evitar que la luz degrade los colores. (Vallejo, 2013)
50
Un buen medio de montaje debe ser:
Rápido
Capaz de conservar duraderamente la preparación
Químicamente neutro
Transparente
No alterarse con el tiempo
Ilustración 10
Coloración y Montaje
Fuente: (Martin, 2012)
Consultado: Julio 2015
ESTUDIO DE LAS MUESTRAS AL MICROSCOPIO
Las estructuras biológicas son estructuras tridimensionales, y habitualmente complejas,
de las cuales, al microscopio, solamente se pueden ver secciones planas (en dos
dimensiones). Se observara con el objetivo más pequeño (4x) y navegar por toda la
preparación localizando las áreas de interés y elementos singulares.
51
Con las áreas de interés localizadas, ir utilizando progresivamente los objetivos de
mayor aumento, en cada una de estas áreas, hasta distinguir los elementos estructurales,
tejidos y tipos celulares propios de la muestra estudiada. (Montalvo, 2010)
Resultados:
Glucógeno, mucinas y algunas membranas basales de rojo a púrpura.
Núcleos azules
52
CAPITULO III
METODOLOGÍA
TIPO DE ESTUDIO:
Experimental para innovación de técnica
NIVEL DE INVESTIGACION
Analítico Descriptivo
TECNICAS E INSTRUMENTOS DE INVESTIGACION
Muestras:
Se tomó 20 muestras de tejidos entre los cuales fueron: 11 vesículas biliares, 6 úteros, 2
Biopsias gástricas y 1 apéndice cecal; seleccionamos estos ya que son las muestras que con
más frecuencia se procesan en el Laboratorio de Histopatología.
Procesamiento: (Paredes, 2015)
Se llevó a cabo el procesamiento de diferentes tejidos para lo cual previamente se los
fijo con formol al 10%bufferadoph neutro y se realizó el siguiente protocolo: (Ilustración
11)
formol ------------------------------------- 1 hora
53
alcohol 50%------------------------------. 1 hora
alcohol 70%------------------------------- 1 hora
alcohol 95%------------------------------- 1 hora
alcohol 100%----------------------------- 1 hora
alcohol 100%----------------------------- 1 hora
alcohol 100%----------------------------- 1 hora
xilol --------------------------------------- 1 hora
xilol--------------------------------------- 1 hora
parafina ------------------------------------ 1 hora
parafina ------------------------------------1 hora
parafina ------------------------------------ 1 hora
parafina ------------------------------------ 1 hora
Ilustración 11
Equipo de Procesamiento de tejidos
Fuente: LHP. UCE.FCM. junio 2015
Elaborado por: Pico Verónica
54
Elaboración de bloques
Se elaboró 20 bloques de las muestras seleccionadas de tejido, los mismos que se
colocaron en la plancha fría a -5°C para desmoldarlos y para posteriormente realizar los
respectivos cortes histológicos en el micrótomo
Microtomía
Para realizar los cortes se usó el micrótomo rotatorio de marca SLEE, con cuchillas de
bajo perfil, después de obtener la cinta de tejido se colocó primero en una placa
portaobjetos con alcohol al 50% para eliminar las arrugas y poder extender la cinta en el
baño de flotación y así proseguir con la pesca del mismo en la placa portaobjetos
previamente identificada. Se dejó escurrir el excedente de agua de la placa con el corte de
tejido y luego se colocó en la plancha caliente para desparafinizar el corte de tejido
primero por acción del calor y luego utilizando xilol en unas placas y agua de limón en
otras placas pero de los mismos tejidos, para continuar con el proceso de coloración
Coloración
Para Desparafinizar las placas se utilizaron dos métodos:
El método tradicional con xilol: (Ilustración 12)
xilol ------------------------------------------- 10 minutos
xilol ------------------------------------------- 5 minutos
55
Ilustración 12
Batería de coloración tradicional con xilol
Fuente: LHP. UCE.FCM. junio 2015
Elaborado por: Pico Verónica
El método innovador de desparafinización se hizo con agua de limón recién preparada.
Preparación del agua de limón
Se utilizó limón sutil al 95%, para lo cual se preparó jugo de limón puro a este se le
añadió agua destilada en mínima cantidad: por cada 95 ml de jugo de limón recién
exprimido se completó con 5 ml de agua destilada. (Ilustración 13)
Ilustración 13
Preparación del jugo de limón al 95%
Fuente: LHP. UCE.FCM. junio 2015
Elaborado por: Pico Verónica
56
El jugo de limón se colocó en dos recipientes distintos, rotulados como limón 1 y limón
2, en sustitución de los dos xiloles utilizados en la técnica convencional de
desparafinización. Las placas después de haber pasado en la plancha, fueron sumergidas en
cada uno de los recipientes de la siguiente manera: (Ilustración 14)
limón ------------------------------------------- 10 minutos
limón ------------------------------------------- 5 minutos
Ilustración 14
Batería de coloración innovadora con jugo de limón
Fuente: LHP. UCE.FCM. junio 2015
Elaborado por: Pico Verónica
Después de Desparafinizar las placas se continuó con la coloración de acuerdo al siguiente
protocolo: (Ilustración 15)
alcohol 100% ------------------------------ 30 inmersiones
alcohol 100%------------------------------.30 inmersiones
alcohol 80%-------------------------------- 30 inmersiones
hematoxilina de Harris -------------------7 minutos
alcohol acido -------------------------------1 segundo
57
carbonato de Litio ------------------------- 3 segundos
eosina ---------------------------------------5 minutos
alcohol 80%-------------------------------30 inmersiones
alcohol 100%----------------------------- 30 inmersiones
alcohol 100% ---------------------------- 30 inmersiones
xilol ---------------------------------------- 1 minuto
xilol---------------------------------------- 1 minuto(Paredes, 2015)
Montaje
Se llevó a cabo el montaje con permount y cubreobjetos
Microscopía
Se obtuvieron 2 placas coloreadas de cada tejido haciendo un total de 40 placas, que
fueron observadas y analizadas por el Dr. Milton Tapia, Médico Patólogo del laboratorio
de histopatología, bajo los parámetros de lectura que se establecieron previamente en el
protocolo del trabajo de fin de carrera.(Anexo 1 y 2)
Ilustración 15 Placas coloreadas con H-E listas para la lectura
Fuente: LHP. UCE.FCM. julio 2015
Elaborado por: Pico Verónica
58
Para evaluar la calidad de las placas se estableció parámetrosy se requirió la ayuda del
médico patólogo mencionado, quien realizó la lectura de las mismas al microscopio y las
valoró, datos que fueron consignados tanto para la técnica de desparafinización tradicional
con xilol como para el método innovador con jugo de limón. Desde luego esta lectura
microscópica fue hecha por el patólogo sin conocer que método de deparafinizacion tuvo
cada una de las placas coloreadas. Los parámetros de evaluación de las placas histológicas
se valoraron de acuerdo a 4 patrones dentro de los cuales se limitó cuatro categorías en una
escala del 1 al 4 cada uno, dando en total 16 puntos equivalentes al 100%, de la siguiente
manera:
1.- Calidad de tinción:
Excelente (4): Buen contraste: núcleos de color morado, citoplasma rosado
Bueno (3): Contraste medio: citoplasma rosado y núcleos pálidos
Regular (2): Contrate bajo: citoplasma y núcleos muy pálidos
Malo (1): Sin contraste: no se distingue núcleos ni citoplasma.
2.- Identificación de patrones morfológicos:
Excelente (4): Facilidad en analizar todas las estructuras histológicas
Bueno (3): Facilidad en analizar algunas de las estructuras histológicas
Regular (2): Dificultad en analizar algunas estructuras histológicas
Malo (1): Dificultad en analizar todas las estructuras histológicas
59
3.- Tiempo de lectura microscópica de las placas histológicas: tiempo estimado hasta 10
minutos
Excelente (4) Menor a 3 minutos
Bueno (3) Entre 3 y 5 minutos
Regular (2) Entre 6 y 9 minutos
Malo (1): Mayor a
10 minutos 4.-Certeza del
diagnóstico
Excelente (4) Permite diagnóstico completamente seguro
Bueno (3) Diagnostico pero no con claridad
Regular (2) Diagnostico muy poco seguro
Malo (1) No permite diagnóstico
ANALISIS DE RESULTADOS
Luego que se tuvo los resultados de cada una de las placas observadas al microscópico
se elaboró una matriz comparativa para procesar los resultados obtenidos, en base a los 4
parámetros de lectura y fundamentalmente al método de desparafinización que se realizó en
las dos placas iguales de cada tipo de tejido.
60
VARIABLES:
Independiente;
Técnicas
Dependientes
Cuatro parámetros:
Calidad de la tinción
Identificación de patrones morfológicos
Tiempo de lectura microscópica de las placas histológicas
Certeza del diagnóstico
MATRIZ VARIABLE
DEPENDIENTES
61
CAPITULO IV
4.1 RESULTADOS
Tabla 1
ACCION DESPARAFINIZANTE DE LAS DOS TECNICAS DE
DESPARAFINIZACION EN LA COLORACIÓN H-E
Limón Xilol
COLORACION 79,7 98,8
ACCION DESPARAFINIZANTE DE LAS DOS TECNICAS DE
DESPARAFINIZACION EN LA COLORACIÓN H-E
Gráfico 1
Fuente: LHP. UCE.FCM.
Elaborado por: Pico Verónica (julio 2015)
Análisis: Comparando las dos técnicas de desparafinización que se realizaron en los cortes
de tejidos de las 20 muestras seleccionadas se observó que el xilol cumple un 98,8 % en su
acción desparafinizante, mientras que en la desparafinización con agua de limón es de un
79.9 % en la valoración final de la calidad de las placas histológicas.
100,0
COLORACION
98,8 79,7
50,0 Limón
Xilol
0,0 Limón Xilol
62
Tabla 2
EVALUACION DE LA CALIDAD DE TINCION
EVALUACION DE LA CALIDAD DE TINCION
Gráfico 2
Fuente: LHP. UCE.FCM.
Elaborado por: Pico Verónica (Julio 2015)
Análisis: La calidad de la tinción evidencia un 91% de buen contraste en las placas
desparafinizadas con xilol, mientras que las placas desparafinizadas con limón alcanzan un
78% de buen contraste de tinción H-E
90%
LIMON 100%
XILOL
XILOL
LIMON
85% 90% 95% 100%
63
Tabla 3
EVALUACION DE LA IDENTIFICACION DE PATRONES MORFOLOGICOS
EVALUACION DE LA IDENTIFICACION DE PATRONES MORFOLÓGICOS
Gráfico 3
Fuente: LHP. UCE.FCM.
Elaborado por: Pico Verónica (Julio 2015)
Análisis: La identificación de patrones morfológicos presentó un 97,5% en la facilidad de
analizar las estructuras histológicas en las placas desparafinizadas con xilol, en
comparación de las placas desparafinizadas con limón que alcanzaron un 81,2% en la
facilidad de analizar las estructuras histológicas del tejido coloreado
81,2%
LIMON 97,5%
XILOL
XILOL
LIMON
0,0% 50,0% 100,0%
64
Tabla 4
EVALUACION DEL TIEMPO DE LECTURA
EVALUACION DEL TIEMPO DE LECTURA
Gráfico 4
Fuente: LHP. UCE.FCM.
Elaborado por: Pico Verónica (Julio 2015)
Análisis: El tiempo de lectura en analizar las placas histológicas fue menor a 10 minutos
en las placas que fueron desparafinizadas con xilol, por tanto evidenció un 100% de
facilidad y rapidez en la lectura, mientras que en las placas desparafinizadas con limón el
tiempo de lectura sobrepasó los 10 minutos y se obtuvo un 66,2% , lo que evidencia que la
relación de la lectura en cuanto al tiempo es a la mitad, esto significaría una desventaja en
la innovación de la técnica.
66,2%
LIMON 100%
XILOL
XILOL
LIMON
0% 50% 100%
65
Tabla 5
EVALUACION DE LA CERTEZA DE DIAGNOSTICO
EVALUACION DE LA CERTEZA DE DIAGNOSTICO
Gráfico 5
Fuente: LHP. UCE.FCM.
Elaborado por: Pico Verónica (Julio 2015)
Análisis: La certeza del diagnóstico en las placas desparafinizadas con xilol alcanzó u 97,5
%, en comparación con la certeza diagnóstica que brindaron las placas desparafinizadas
con limón que correspondió a un 81,2 %, lo que establece un pequeño porcentaje de
diferencia, que puede ser disminuido en subsecuentes trabajos de experimentación sobre
este tema.
81,2%
LIMON 97,5%
XILOL
XILOL
LIMON
0,0% 50,0% 100,0%
66
Tabla 6
COMPARACION DE LOS CUATRO PATRONES EVALUADOS EN LAS DOS
TECNICAS
Limón Xilol
CALIDAD DE TINCION 47% 53%
IDENTIFICACION DE
PATRONES
45%
55%
TIEMPO LECTURA 40% 60%
CERTEZA DE
DIAGNOSTICO
45%
55%
COMPARACION DE LOS CUATRO PATRONES EVALUADOS EN LAS DOS
TECNICAS
Gráfico 6
Fuente: LHP. UCE.FCM.
Elaborado por: Pico Verónica (Julio 2015)
Análisis: Se observa que en todos los parámetros analizados siempre predomina la acción
del xilol como agente desparafinizante para la tinción de los cortes de tejido, a diferencia
de los cortes de tejido desparafinizados con agua de limón, que demuestra menor acción de
acuerdo a los valores alcanzados en los diferentes parámetros, los que determinan un rango
diferencial que va desde el 6% en la calidad de la tinción hasta el 20% en el tiempo de
lectura.
CERTEZA DE DIAGNOSTICO 55%
45%
TIEMPO LECTURA 60%
40%
IDENTIFICACION DE PATRONES
55% 45%
Xilol
Limón
CALIDAD DE TINCION 53%
47%
0% 20% 40% 60% 80%
67
VERIFICACION DE LA HIPOTESIS
Después de haber realizado todos los procedimientos empleando las dos técnicas (xilol y
limón) se obtuvieron los siguientes resultados:
Técnica de desparafinizacion con xilol:
Numero de placas de tejidos = 20
Puntos a evaluar por cada placa = 16
Total = 320 puntos
Total de puntos obtenidos =316
Acción desparafinizante del xilol cumple un 98.8 %
Técnica de desparafinizacion con limón:
Numero de placas de tejidos = 20
Puntos a evaluar por cada placa = 16
Total = 320 puntos
Total de puntos obtenidos =255
Acción desparafinizante del limón cumple un 79.7 %
En cuanto a la acción desparafinizante obtenida con el agua de limón a la conseguida con el
xilol hay una diferencia pequeña del 19 %, esto indica que el jugo de limón es similar al
xilol.
68
CONCLUSIONES
De acuerdo a los resultados obtenidos se concluye que:
La acción desparafinizante obtenida con el agua de limón a la conseguida con el
xilol son muy similares.
En cuanto a los cuatro parámetros analizados podemos ver que el mejor resultado de
la técnica de desparafinización con agua de limón se da en la calidad de la tinción
produciendo un buen contraste.
Las placas desparafinizadas con agua de limón dan una desventaja en cuanto al
tiempo de lectura presentando dificultades para ser analizadas por lo cual el tiempo
para leer cada placa sobrepasa los 10 minutos
Fue posible diagnosticar con certeza observando las placas desparafinizadas con
agua de limón
69
RECOMENDACIONES
El agua de limón como agente desparafinizante no consiguió ser igual que la de xilol, pero
si muy similar por lo cual esta técnica puede ser mejorada en próximos estudios quizá
probando con diferentes clases de limón, aumentando la concentración del jugo y
cambiando los tiempos en que se sumerge las placas en la batería
Se recomienda probar esta innovadora técnica con una mayor variedad de tejidos, ya que en
algunos tejidos su acción es mejor que en otros.
Este trabajo de investigación podría ser el precursor de nuevos estudios en el área de
Histopatología.
70
CAPITULO V
PROPUESTA DEL PROYECTO
El xilol es un reactivo que se utiliza a diario en el laboratorio de histopatología, este es
extremadamente útil pero muy perjudicial para la salud, por eso a necesidad de sustituirlo
utilizando algún otro compuesto, por lo cual se probó sustituirlo con agua de limón a 95%
como agente desparafinizante, aunque no se alcanzó el nivel de eficacia en su totalidad, se
demostró que si puede ser utilizado e implementarlo en la técnica de rutina del Laboratorio
de Histopatología, pero es necesario seguir investigando y mejorando la técnica en estudios
posteriores.
Los beneficiarios seriamos todos los profesionales que laboramos en el laboratorio, ya que
así cuidaríamos nuestra salud, evitando la exposición a este reactivo que con el tiempo
puede desencadenar patología severas en nuestro organismo que podrían incluso causarnos
la muerte. Otro factor beneficioso es que se obviaría la dificultad o casi la imposibilidad de
adquirir el xilol que es un compuesto controladopor el CONSEP y a su vez es muy
costoso, mientras que el limón es económico y se puede comprar fácilmente.
71
72
73
ANEXOS ANEXO 1
INFORME FINAL (TECNICA CON LIMON)
Nº
TEJIDO
CALIDAD DE
TINCION
IDENTIFICACION DE
PATRONES
TIEMPO
LECTURA
CERTEZA DE
DIAGNOSTICO
TOTAL
/4 /100 /4 /100 /4 /100 /4 /100 /16 /100
1 Apéndice cecal 4 100 4 100 1 25 3 75 12 75,0
2 Biopsia gástrica 3 75 3 75 1 25 3 75 10 62,5
3 Vesícula biliar 3 75 3 75 1 25 3 75 10 62,5
4 Miometrio Endometrio 3 75 3 75 1 25 3 75 10 62,5
5 Biopsia gástrica 3 75 4 100 4 100 3 75 14 87,5
6 Vesícula biliar 4 100 4 100 4 100 4 100 16 100,0
7 Miometrio Endometrio 3 75 3 75 4 100 3 75 13 81,3
8 Miometrio Endometrio 4 100 4 100 4 100 3 75 15 93,8
9 Miometrio Endometrio 4 100 4 100 4 100 4 100 16 100,0
10 Vesícula biliar 4 100 3 75 1 25 3 75 11 68,8
11 Miometrio Endometrio 3 75 2 50 4 100 3 75 12 75,0
12 Vesícula biliar 4 100 3 75 1 25 3 75 11 68,8
13 Vesícula biliar 3 75 2 50 4 100 3 75 12 75,0
14 Vesícula biliar 4 100 4 100 4 100 4 100 16 100,0
15 Vesícula biliar 4 100 4 100 1 25 4 100 13 81,3
16 Vesícula biliar 3 75 2 50 4 100 2 50 11 68,8
17 Trompas uterinas 4 100 4 100 4 100 4 100 16 100,0
18 Vesícula biliar 4 100 3 75 4 100 3 75 14 87,5
19 Vesícula biliar 4 100 3 75 1 25 3 75 11 68,8
20 Vesícula biliar 4 100 3 75 1 25 4 100 12 75,0
T 72 65 53 65 255 79,7
74
ANEXO 2
INFORME FINAL (TECNICA CON XILOL)
Nº
TEJIDO
CALIDAD DE
TINCION
IDENTIFICACION DE
PATRONES
TIEMPO
LECTURA
CERTEZA DE
DIAGNOSTICO
TOTAL
/4 /100 /4 /100 /4 /100 /4 /100 /16 /100
1 Apéndice cecal 4 100 3 75 4 100 3 75 14 87,5
2 Biopsia gástrica 4 100 3 75 4 100 3 75 14 87,5
3 Vesícula biliar 4 100 4 100 4 100 4 100 16 100,0
4 Miometrio Endometrio 4 100 4 100 4 100 4 100 16 100,0
5 Biopsia gástrica 4 100 4 100 4 100 4 100 16 100,0
6 Vesícula biliar 4 100 4 100 4 100 4 100 16 100,0
7 Miometrio Endometrio 4 100 4 100 4 100 4 100 16 100,0
8 Miometrio Endometrio 4 100 4 100 4 100 4 100 16 100,0
9 Miometrio Endometrio 4 100 4 100 4 100 4 100 16 100,0
10 Vesícula biliar 4 100 4 100 4 100 4 100 16 100,0
11 Miometrio Endometrio 4 100 4 100 4 100 4 100 16 100,0
12 Vesícula biliar 4 100 4 100 4 100 4 100 16 100,0
13 Vesícula biliar 4 100 4 100 4 100 4 100 16 100,0
14 Vesícula biliar 4 100 4 100 4 100 4 100 16 100,0
15 Vesícula biliar 4 100 4 100 4 100 4 100 16 100,0
16 Vesícula biliar 4 100 4 100 4 100 4 100 16 100,0
17 Trompas uterinas 4 100 4 100 4 100 4 100 16 100,0
18 Vesícula biliar 4 100 4 100 4 100 4 100 16 100,0
19 Vesícula biliar 4 100 4 100 4 100 4 100 16 100,0
20 Vesícula biliar 4 100 4 100 4 100 4 100 16 100,0
T 80 2000 78 80 78 316 98,8
75
Anexo 3
CRONOGRAMA DE ACTIVIDADES
N° Actividad Tiempo
Mes Enero Febrero Marzo Abril Mayo Junio Julio
Semana 1 2 3 4 1 2 3 4 1 2 3 4 1 2 3 4 1 2 3 4 1 2 3 4 1 2 3 4
1 Preparación o
Selección del tema de
Investigación
X
X
X
X
2 Elaboración del
Protocolo de
investigación
X
X
X
X
X
X
X
X
3 Elaboración del
Marco Teórico
X
X
X
X
X
X
X
X
4 Actividad Práctica X X X X
5 Análisis y Evaluación
de Placas, y
Elaboración de
Informe Final
X
X
X
X
76
Anexo 4. PLACAS DE CORTES DE TEJIDOS DESPARAFINIZADOS CON XILOL Y CON AGUA DE
LIMÓN Y TEÑIDOS CON HEMATOXILINA-EOSINA
CON XILOL
CON XILOL
CON XILOL
CON AGUA DE LIMON
CON AGUA DE LIMON
CON AGUA DE LIMON
77
Bibliografía
1. Anuradha A, S. N. (8 de Enero de 2014). Scientifica. Obtenido de
http://www.hindawi.com/journals/scientifica/2014/707310/
2. Bermejo, J., Sanchez, E., Perez, M., Muñoz, D., & Garcia, L. .. (2006). Tecnico
Especialista en Anatomia Patologica. En Temario materia especificas Volumen 1 (págs.
327-329). España: Mad S.l.
3. Cajal SR, M. J. (1966). Elementos de Histología Normal y de Técnica Micrográfica.
Mexico: Nacional .
4. Cardenas. (2014). Propiedades del Limon. Obtenido de http://www.botanical-
online.com/limon.htm
5. Dideval. (1996). Xileno. Obtenido de http://ge-iic.com/files/fichas%20productos/Xileno.pdf
6. Eder M, G. P. (6 de Agosto de 1999). Manual de patologia general. Obtenido de
http://lacelula.udl.es/aprendre/casos/pdf/bipsi.pdf
7. García, d. M. (1993). Laboratorio de Anatomía Patológica. Madrid: Interamericana
McGraw-Hill.
8. Komen, S. (2013). Datos para la vida. Obtenido de
https://ww5.komen.org/uploadedFiles/Content_Binaries/806-380-SP.pdf
9. Laguna, C. E. (2010). Histologia Medica. Obtenido de
www.medic.ula.ve/histologia/anexos/microscopweb/.../cursolabo.doc
78
10. Lens, D. (30 de mayo de 2014). Atlas de histología vegetal y animal. Recuperado el 6 de
marzo de 2015, de http://webs.uvigo.es/mmegias/6-tecnicas/1-proceso.php
11. Llumiquinga, J. (Junio de 2010). Universidad Politecnica Salesiana Sede Quito. Obtenido
de http://www.dspace.ups.edu.ec/bitstream/123456789/4512/1/UPS-QT02199.pdf
12. Martin, V. (07 de junio de 2012). We Sapiens.org. Obtenido de
http://www.wesapiens.org/es/class/4933003/file/2/T%C3%A9cnicas+histol%C3%B3gicas
13. Medina, B. V. (Enero de 2007). DETERMINACIÓN DE LAS CARACTERÍSTICAS
FÍSICAS Y QUÍMICAS. Obtenido de
http://repositorio.utn.edu.ec/bitstream/123456789/421/1/03%20AGI%20205%20TESIS.pdf
14. Mendoza, G. C. (2010). Tecnicas Histologicas. Obtenido de
www.medic.ula.ve/histologia/anexos/microscopweb/.../cursolabo.doc
15. Molist, P., Pombal, M., & Megias, M. (Noviembre de 2011). ATLAS de HISTOLOGIA.
Obtenido de TECNICAS HISTOLOGICAS:
http://mmegias.webs.uvigo.es/descargas/tecnicas-inclusion.pdf
16. Montalvo, A. C. (Agosto de 2010). Tecnice Histologica. Obtenido de
http://histologiaunam.mx/descargas/ensenanza/portal_recursos_linea/apuntes/3_tecnica_his
tologica.pdf
17. Paniagua, R. N.-U. (1997). Citología e histología vegetal y animal. Obtenido de
http://mmegias.webs.uvigo.es/6-tecnicas/4-mparafina.php
18. Paredes, Y. (2015). Protocolos de Histotecnologia. Universidad Central del-Ecuador.
79
19. Peraza, M. (2013). SlideShare. Obtenido de
http://es.slideshare.net/marleneperaza48/micrtomo
20. Pumbal, M., & Megias, G. (noviembre de 2011). ATLAS de HISTOLOGIA. Obtenido de
http://mmegias.webs.uvigo.es/descargas/tecnicas-inclusion.pdf
21. Rios, J. (2011). Biologia animal y vegetal. Obtenido de
http://www.euita.upv.es/varios/biologia/tecnicas_de_histologia_vegetal/Documentos/Inclus
ion_p.htm
22. Rodiles, H., & Campanòn, L. y. (2008). Citohistopatología Procedimientos Básicos. La
Habana: Ciencias Médicas.
23. Rodiles, M. H., Campanón, L. J., & Laza, C. C. (2008). Citohistopatologia. En
Procedimientos Basicos (pág. 19). La Habana: Ecmed.
24. Ross, M. K. (2005). Texto y atlas color con biología celular y molecular. Obtenido de
http://mmegias.webs.uvigo.es/6-tecnicas/4-mparafina.php
25. Simon, M. y. (2010). Diccionario Enciclopédico Hispano-Americano, Barcelona. Obtenido
de http://www.atsdr.cdc.gov/es/toxfaqs/es_tfacts71.html
26. Tapia. (2011). SlideShare. Obtenido de http://es.slideshare.net/andriustapia/fijacin
27. Vallejo, R. (23 de Octubre de 2013). slideshare. Obtenido de Coloraciom hematoxilina
eosina y medios de montaje: http://es.slideshare.net/RosiVallejo/coloraciom-hematoxilina-
eosina-y-medios-de-montaje
80
28. Zamorano, C. (2009). Riesgo ocupacioal de tecnologos . Obtenido de
http://www.tecmed.cl/pdf/invitado/czv/Riesgo_ocupacional_TM_por_exposicion_a_Xilol.
29. Laboratorio de Histopatología de la Universidad Central del Ecuador (2015)