J. Verbr.lebensm. 1 (2006): 38-50 1661·5751/06/010038-13 00110.1007/s00003-006-0008-3 © 8irkhäuserVerlag, Basel, 2006

Journal fUrVerbraucherschutz und lebensmittelsicherheit Journal of Consumer Protection and food Safety

Antibiotika-Aufnahme von Nutzpflanzen aus Gülle-gedüngten Böden - Ergebnisse eines Modellversuchs

M. Grote\ C. Schwake-Anduschus\ H. Stevens\ R. Michel\ T. Betsche2 und M. Freitag3

'Universität Paderborn. Fakultät für Naturwissenschaften, Department Chemie, Paderborn 2Bundesforschungsanstaltfür Ernährung und Lebensmittel {BFEL).lnstitutfür Biochemie von Getreide und Kartoffeln. Detmold

3FH Südwestfalen. Fachbereich Agrarwirtschaft. Soest

Korrespondenz an: Prof. Dr. Manfred Grote. Universität Paderborn Fakultät für Naturwissenschaften, Oepartment Chemie. Warburgerstraße 100, D-33098 Paderborn, Germany, Tel: 05251/60-2191, Fax: 05251/60-3549. E-mail: magrote@zitmail.upb.de

Eingegangen: 30. September 2005

Schlüsselwörter: Gülle. Chlortetracyclin. Sulfadiazin, Trimetho­prim. Boden. Antibiotika-Aufnahme. Feldsalat. Winterweizen.

Abkürzungen: anhydro-CTC = Anhydrochlortetracyclin; BFEl = Bundesforschungsanstalt für Ernährung und lebensmittel; BG = Bestimmungsgrenze; CTC = Ch lortetracycl in; EOTA = Ethy­lendiamintetraacetic acid; enol-epi-CTC = Enolform des epi­Chlortetracyclins; epi-CTC = epi-Chlortetracyclin; epi-iso-CTC = epi-Isochlortetracyclin; ESI = Electrospray Ionisation; FAl = Bundesforschungsanstalt für landwirtschaft; FEDESA = Fede­ration Europeenne de la Sante Animale; FG = Frischgewicht; HPlC = High Performance liquid Chromatography; iso-CTC = Isochlortetracyclin; ISTD = interner Standard; KGW = Körperge­wicht; keto-epi-CTC = Ketoform des epi-Chlortetracyclins; lC-MS! 'lAS = Flüssigchromatographie ! Tandem-Massenspektrometrie; LEJ = Landesamt für Ernährungswirtschaft und Jagd; MS = Mas­senspektrometrie; MS2 = Tandem-Massenspektrometrie; MRl = Maximum Residue limit; MHK = Minimale Hemmstoffkonzent­ration; MUNlV = Ministerium für Umwelt und Naturschutz. land­wirtschaft und Verbraucherschutz des Landes Nordrhein-West­falen; n = Anzahl der Messwerte; N4-SFD = N4-Acetylsulfadiazin; N(F = nicht nachgewiesen (not found); NWG = Nachweisgrenze; aTC = Oxytetracyclin; PDA = Photodiodenarraydetektor I detek­tion; PAK = polycyclische aromatische Kohlenwasserstoffe: PCB = polychlorierte Biphenyle; SFD = Sulfadiazin; SPE = Solid Phase Ex­traction; SRM = Selective Reaction Monitoring; TC = Tetracyclin; TIC=Totalionenstrom;TM=Trockenmasse;TMP= Trimethoprim; UFT = Zentrum für Umweltforschung und Umwelttechnologie. Universität Bremen; W=Wiederfindung.

Zusammenfassung; In einem Modellversuch wurde unter pra­xisnahen landwirtschaftlichen Bedingungen untersucht, ob Nutzpflanzen Antibiotika aus Böden aufnehmen, die zuvor mit belasteter Gülle gedüngt worden sind. Dazu wurden Ferkel mit Sulfadiazin (SFD). Trimethoprim (TMP) und Chlortetracyclin (CTC) oral medikamentiert. um kontrolliert Arzneistoff-belastete Schweinegülle zu erhalten. Die Gülle aus 2 Medikationen wurde

ca. 8 Monate gelagert und dann zur Düngung der Aussaat von Feldsalat und Winterweizen auf Versuchsparzellen ausgebracht_ Während der Lagerung waren CTC und SFD nur bis zu 50-60% abbaubar. daher wurden auf die Felder z.T. erhebliche Antibio­tikafrachten ausgetragen (176-284 mg CTCfm2 und 557-922 mg SFD(m2

). Bodenproben wurden in unterschiedlichen Horizon­ten sowie Pflanzenproben in verschiedenen Wachstumsstadien bis zur Beerntung genommen und analysiert. In Extrakten der oberen Bodenhorizonte (0-25 cm). die nach der ersten Güllebe­aufschlagung der Versuchsfelder beprobt wurden. sind SFD (90 }lg(kg TM) und CTC (bestimmt als iso-!epi-iso-CTC-Summen­parameter: max. 240 )lg(kg TM) nachgewiesen worden. aber nicht in tieferen Schichten bis zu 60 cm, In Parzellen, die zweimal organisch gedüngtworden waren. traten die höchsten Belastun­gen auf. Nach 3 Monaten lagen nur noch Antibiotikagehalte von ca. 10-20 )lg(kg TM vor.

Feldsalat und Winterweizen haben aus den organisch ge­düngten Böden Antibiotika über die Wurzel aufgenommen. Bei den Getreidepflanzen war die zeitliche Veränderung der SFD! CTC-Gehalte in Wurzeln (max. 0,5-1 mg/kg Trockenmasse) und Grünanteilen bis zur Erntereife verfolg bar. Im Korn von zweimalig beaufschlagten Feldern wurden an CTC -44 pg(kg Frischgewicht nachgewiesen, was als Hinweis auf einen möglichen Eintrags­pfad von Antibiotika-Rückständen aus der landwirtschaftlichen Tierhaltung in pflanzliche Lebens- und Futtermittel angesehen werden kann.

1. Einleitung

Antibiotika gehören in der Human- und Veterinärmedizin als Therapeutika zu den verordnungsstärksten Indikations­gruppen (Sattelberger, 1999; Ungemach. 1999). Nach FEDESA wurden 1997 EU-weit für clie Veterinärmedizin 5093 t und für clie Humanmeclizin 5400 t Antibiotika angewendet lnfolge zunehmender Resistenzentwicklung bei humanpathogenen

Mikroorganismen wurde die subtherapeutische Anwendung

von Antibiotika zum Zwecke der Leistungsförderung über das Futter EU-weit gestoppt (BGW. 1997). Ab 2006 dürfen Antibio­tika gemäß va 1831/2003/EEC nur noch nach tierärztlicher Ver­schreibung auf Grundlage des Arzneimiltelrechtes zur Thera­pie angewendet werden.

Die von Tieren nach Applikation ausgeschiedenen antibi­otischen Wirkstoffe (u.a. Tetracydine und Sulfonamide) und ihre Metaboliten können über die Gülle auf landwirtschaftlich genutzte Felder und dadurch in aquatische und terrestrische Systeme gelangen (HalHng-S0rensen et a1. , 1998; Thiele-Brunn, 2003; Hamscher et aL. 2002 und 2005). Diese Umwelteinträge sind bei Risikoabschätzungen zu berücksichtigen (Jörgensen und Halling-Sc1Irensen, 2000). Wie Farnleimerund Mach (2002) darlegen, sollten neben molekularbiologischen Fragestellun­gen auch Entstehung und Verbreitung von Resistenzen regio· nal und weltweit in Ökosystemen und den Vemetzungen zwi­schen Mensch, Tier, Pflanze. Mikroorganismen und Umwelt gesehen werden. Die zunehmende Brisanz der Resistenzpro­blematik verlangt neue Strategien und Monitoring-Systeme, um einen nachhaltigeren Einsatz von Veterinärantibiotika zu erreichen (Smith et a1., 2005; Ledergerber et al., 2005). Da­bei werden die traditionellen Kriterien der Risikobewertung von antibiotisch wirksamen Rückständen in Nahrungsmitteln tierischen Ursprungs (Rückstandshöchstrnengen, MRL/MHK­Werte) für den Verbraucherschutz überdacht. wobei auch die diskutierte resistenzfördemde Wirkung subinhibitorischer Konzentrationen der Antibiotika und ihrer Metabolite berück­sich tigt wird (Lederer et al., 1996; Halling-S0rensen el a1. , 2002; Langewische und Bottermann, 2003).

Tierische Lebensmittel sind ein Eintragspfad von Antibioti­ka·Rückständen in die Nahrungskette (Vockel et al .. 2004 und 2005). Falls Antibiotika aus Gülle-beaufschlagten Böden von Nutzpflanzen aufgenommen würden, wäre ein weiterer Ein­tragspfad über pflanzliche Lebensmittel gegeben. Die grund­sätzlid1e Aufnahme dieser Wirkstoffe über die Pflanzenwur­zein wurde bereits vor über 50 Jahren experimentell erkannt (Krasilnikov, 1958): Triticum aestivum (Weizen), Zea mays (Mais) und Valerianella locusta (Feldsalat) Massimilierten" Penicillin und Streptomycin und zeigten dadurch verändertes Wachs­tum (toxische und bakterizide Effekte). Wasserpflanzen kön­nen Tetracyclin (TC) und OTC aufnehmen, ein Ansatzpunkt für die Phytoremediation Antibiotika-belasteter organischer Dün· ger (Linden. 2005; Gujarathi et al., 2005). Forni et aL (2002) un­tersuchten die Aufnahme von Sulfonamiden durch Pflanzen. um Pharmaka-belastete Wässer in situ dekontaminieren zu können. Bei der Selektion gen technisch veränderter Pflanzen (GVPs) werden Antibiotika eingesetzt, was zeigt, dass zumin­dest unter in vitra-Bedingungen eine Aufnahme in die pflanz­liche Zelle erfolgen kann.'

Im Vergleich zum Übergang von Antibiotika aus wässriger Lösung sind die Vorgänge im System Boden - Rhizosphäre -Pflanzenwurzelkomplexer. Hinweise auf Abbau. Adsorptionan Bodenpartikel und Pflanzenverfügbarkeit geben 1facerstudi­en von Langhamrner et al. (1989) mit 14C-Sulfadimidin; in Gefäß-

1 Die EU-Freisetzungs·Richtlinie (2001/18{EG) vom Oktober 2002 schränkt bereits die Freisetzung von GVPs ein, die bestimmte Antibiotikaresistenz·Marker besit­zen.

Antibiotika·Aufnahmevon Nutzpflanzen 39

versuchen mit Maispflanzen wurde eine spurenweise Verlage­rung des Sulfonamids von der Wurzel in den Sproß beobachtet. Bereits einige Jahre zuvor hatte Batchelder (1982) in Gewächs­hausversuchen verschiedene, mit CTC- und OTC-Lösung dotier­te Böden präpariert und die Einflüsse auf das Wachstum und die Aufnahme von Makronährstoffen beim Mais. Weizen und andere Nutzpflanzen nachgewiesen. Es gibt somit eine Reihe experimenteller Befunde, die auf Wechselwirkungen von An­tibiotika mit Pflanzenwurzeln in homogener und heterogener Phase schließen lassen, was zur Aufnal1rne sowie zur Transloka­tion in Pflanzen führen kann.

In dem hier beschriebenen Modellversuch unter praxisna­hen Bedingungen wurde überprüft, ob Antibiotika-Rückstän­de auch aus güllebeaufschlagten Böden von Nutzpflanzen auf­genommen werden. Dabei wurden Chlortetracyclin (CTC) und Sulfadiazin (SFD) kombiniert mit lhrnethoprirn (TMP) (Abb. 1) als repräsentative Veterinär-Wirkstoffe eingesetzt, die intensiv in der landwirtschaftlichen Schweine- und Geflügelllaltung Anwendung finden.

2. Materialien und Methoden

2.1 Genereller Versuchsverlauf Kontrolliert Arzneistoff-belastete Schweinegülle wurde auf Versuchsparzellen ausgebracht, Nutzpflanzen ausgesät und beerntet. Zur Gewinnung belasteter Gülle wurden arzneimit­telfrei aufgezogene Ferkel definiert mit SFD, TMP und CTC oral behandelt. Während der Medikation wurden Urin und Kot be­probt und dann zu Gülle vereinigt Diese wurde nach den Me­dikationsperioden bis zu 8 Monate gelagert und zur Düngung von Feldsalat und Winterweizen ausgebracht. Bodenproben wurden in unterschiedlichen Horizonten sowie Pflanzenpro­ben in verschiedenen Wachstumsstadien bis zur Beerntung genommen. Zur Analyse der Proben auf Arzneistoffrückstände wurden HPLC-UV-MSfl-Methoden angewandt.

Um das Aufnahrnepotential verschiedener Nutzpflanzen für relevante Arzneistoffkontaminanten der Gülle festzu­stellen, wurden Experimente in Hydrokultur (BFEl Detrnold) durchgeführt. Noch nicht abgesd1lossene autoradiographi­sche Messungen mit 1fitium-markierten Wirkstoffen ergän­zen diese UnterSUchungen (UFT Bremen). Über die Ergebnisse wird an anderer Stelle berichtet werden.

2.2 Gewinnung von kontrolliert Arzneistott-belasteter Gülle Am Standort Mariensee der Bundesforschungsanstalt für land­wirtschaft (FAL) wurden sechs Ferkel arzneimittelfrei aufgezo­gen und dann am FAL-Standort Braunsd1weig-Völkenrode in Stoffwechselkäfigen eingestallt. Während der beiden zehntä­gigen Medikationsphasen (1. Medikationsphase vom 16.07.01 bis 26.07.01 und 2. Medikationsphase vom 07.08.01 bis 16.08.01), unterbrochen durch eine elftägige Haltung in separaten Einzel­boxen. wurden Urin und Kot getrenntgesammeIt und beprobt. Chlortetracyclin 100 (1 kg Präparat enthält 0,1 kg CTC). Antast­mon (1 kg Präparat enthält 0.1 kg TMP und 0,5 kg SFD) wurden mit dem 'fiockenfutter verabreicht (Mischung aus Gerste, Wei­zen, Sojaschrot, Mineralstoffe, 1% w/w Sojaöl). Es wurde eine

40 M.Groteetal.

Sulfadiazin (SFD) Trimethoprim (TMP)

Chlortelracyclin (CTC)

b. 1 Strukturformeln und Symbole der applizierten Arzneiwirkstoffe.

maximale übliche therapeutische Arzneistoffdosis appliziert. d.h. 100 mg Pulver/kg KGW(Tag Chlortetracydin 100 und 50 mg Pulverjkg KGWjTag Antastmon. Die Sununen der applizier­ten Wirkstoffmengen betrugen in beiden Medikationsphasen: eTe: Phase 144.98 g, Phase 2 56.06 g; SFD:Phase 1112.60 g, Phase 2161,40 g; TMP: Phase 122,52 g. Phase 232.28 g. Die von den Ver­suchstieren während der Medikationsphasen ausgeschiedenen Mengen an Kot und Urin fI'agesmittel) wurden ermittelt.

Exkremente wurden täglich - nachProbennahme - zur Gülle vereinigt. Die aus jeder Medikationsphase resultieren.den sechs Güllebehälter wurden am Versuchsgut Merklingsen der FH Süd­westfalen. Abt. Soest zur Gesamtgülle vereinigt (ca. 200-300 I pro Medikationsphase; 1. Medikationsphase arn 02.08.2001. 2. Medikationsphase am 30.08.2001). Dort wurden sie nach übli­cher Praxis in Kübeln unter freiem Himmel gelagert. Aus beiden Güllebehältern wurde monatlich. nach nur teilwejse möglicher Homogenisierung. ejne Doppel-Probe entnommen und bis zur

!stimmung der ArzneistoIf-Rückstände sowie von Trocken­inassen, N- und P-Gehalten tiefgekühlt bei -30 oe gelagert

2.3 GÜlleausbringung. Aussaat von Pflanzen und Proben nahmen

2.3.1 Bodencharakterisierung Die Freilandversuche wurden in der Soester Börde (Nieder­börde). Flurstück 27, Bezeichnung Tünnerkamp. Höhe ca. 80 m über NN. in Merklingsen durchgeführt. Die Bodenentwick­lung, Pseudogley-Parabraunerde mit einem Humusgehalt meist unter 2%, wurde durch stark schwankenden Grundwas­serstand beeinflusst. Die Wasserkapazität des Bodens ist hoch. Nach DIN ISO 11465 wurden Trockenrückstände und Wasserge­halte bestimmt.

Die Wassergehalte der feldfeuchten Proben Jagen vor und nach der GülIebeaufschlagung jeweils zwischen -15% (Boden­horizonte 25-50 cm) und maximal 25% (Horizonte 0-25 cm). Die pH-Werte lagen im Bereich zwischen 6.5 (Horizonte 0-5 cm) und 7,0 (Horizonte 20--25 cm).

2.3.2 Düngung für Feldsalat - Bodenprobennahme Nach Entnahme der ersten Bodenproben wurde die Gülle auf drei VersuchsparzeUen von je 24 m2 ausgebracht (Tab. 1): 1. Gül-

Tab. 1 Ernteerträge von Winterweizen (86%Trockensubstanz im Korn).

Parzelle 2 3 4 5 6

Düngung: organisch/Gülle 2x 2x lx 1x 1x 1x mineralisch 1x 1x 2x 2x 2x 2x

Ertrag [dt-ha"] 85,1 92,6 101.1 93.4 93,4 104.7

lebeaufschiagung und Aussaat am 05.10.2001 (ca 400 mljm2•

entspricht 25 kg N/ha. Gülle aus 1. Medikationsphase). 2. Gülle­beaufschlagung arn 20.n.2001 (ca. 800 rnl/m2• entspricht 50 kg N/ha) nach Erscheinen des zweiten Laubblattes.

Weitere vier Einzelproben pro Parzelle und Bodenhorizont (bei einigen Parzellen von 0-25 und 25-50 cm. sonst 0-10 cm. 10-20 cm, 20-30 cm. 30-60 crn) wurden sofort nach Aussaat und danach alle vier Wochen bis zur Ernte genommen. Der Ho­rizont bis zu 25 on erfaßt die Bearbeitungstie[e eines Pfluges. Die einzeJnenBohrkeme (Bohrhülsen: 0 50 nun x 255 mm) der jeweiligen Bodenhorizontewurden zu einer Mischprobeverei­nigt. homogenisiert. in Kunststoffbeutel verpackt und tiefge­kühlt (-30°C) gelagert.

2.3.3 Düngung für Winterweizen - Bodenprobennahme Nach Aussaat des Winterweizens am 12.10.2001 auf sechs ParzeI­len (je 24 m 2

) wurde dreimal mit praxisüblichen Nährstoffmen­gen gedüngt (Tab. 1): 1. Güllebeaufschlagung am 12.03.2002 aller sechs Parzellen mit GüUe der 2. Medikationsphase (ca. 21 pro m 2• entspdcht 67 kg pflanzenverfügbarem N/ha). 2. Gülle­beaufschlagung arn 15.04.2002 der Versuchs parzellen 1 und 2 mit Gülle der 1. Medikationsphase (ca. 2.51 pro m2• entspricht 46 kg pflanzenverfügbarem Njha), mineralische Düngung am 15.04.2002 der Versuchsparzellen 3 bis 6 (46 kg Njha) und ab­schließende mineralische Düngung aller sechs Parzellen (60 kg N/ha) arn 25.05.2002.

Die Bodenbeprobung erfolgte wie bei der Aussaat des Feldsalats. Für die Versuchsparzellen 1 und 2 wurden nach der zweiten Güllebeaufschlagungbis zur Ern te weitere Proben ent­nornmen. Die Bohrkerne wurden in 5-cm-Segmente unterteilt, homogenisiert und dunkel gelagert. Nach Beemtung wurden die letzten Bodenproben am 20.08.2002 gezogen.

2.4 Pflanzenprobennahme 2.4.1 Feldsalat (Cirifla SZ der Saatzucht Rigk Zwaan) Die ersten Feldsalatproben wurden nach Erscheinen des zwei­ten Laubblatles am 05.TI.2001 genommen. weitere Proben nach der zweiten Güllebeaufschlagung am 03.12.2001 (Vierblattsta­dium). AuJgrund der nassen und kühlen Witterung konnten sich die Pflanzen nicht voll entwickeln. Am 13.03.2002 wurden von jeder Parzelle Ernteproben genommen. Alle Pflanzen wur­den mit bidest. Wasser gewaschen und umgehend eingefroren (-80°C).

2.4.2 Winterweizen (Drifter) Die Beprobung des Winlerweizens erfolgte am 15.04.29.04. und 02_08.2002 (Emte). Dabei wurden vor dem Mähdmsch Ganzpflanzenproben von den Versuchsparzellen gezogen. Die Pflanzen wurden in Wurzeln und Halme getrennt Etwa 1 crn

des Wurzel-Halm-ÜbergangsbereidlS wurde abgetrennt wld verworfen. um sicherzustellen, dass kein WurzeJmaterIal in Halmproben gelangt Wurzeln und Halme wurden grundlirn mit bidest_ Wasser gespült, trocken getupft und in ca 0.5 cm lange Stücke geschnitten und tieIgekühltgelagert (-80°C).

Die Kembeemtung der Versuchsparzellen erfolgte mit einern Parzeilenmähdrescher_ Dabei wurde der gedrosdlene Teil des Weizens als Probe aufgefangen und aus der ermittel­ten Erntemenge auf den Ertrag pro ha geschlossen (Tab. 1). Auf dem gesamten Schlag wurden einschließlich der Parzellenauf­wüchse 97.1 dt/ha geerntet. dies entspricht den üblichen Erträ­gen aus dem konventionellen Anbau. Kom lmd Stroh proben wurden tiefgekühlt gelagert (-80°C).

2.5 Wetterdaten Von September 2001 bis August 2002, also während des Zeitrau­mes der Düngerausbringung. Aussaat und Beerntung sowie Entnahme der Bodenproben, wurden kontinuierlich Nieder­schlagsmengen und Lufttemperatur registriert. Hervorzuhe­ben ist die anhaltende Sdllechtwetterperiode narn der Aus­saat des Feldsalates. die auf Grund der nassen WitteTung erst im Oktober 2001 erfolgte. Starkregen während und nach der 2. Begü llung der Winterweizenparzellen am 15. April 2002 könn­te Auswascheffekte der mit der Gülle in den Boden eingetrage­nen Antibiotikarückstände zur Folge gehabt haben.

2.6 Analytik der Arzneistoffrückstände AuIgrund der durchgeführten Medikationen mit CTC und SFD kombiniert mitTMP waren in der gewonnenen Gülle und dem Gülle-beaufschlagten Boden folgende Arzneistoff-Rückstände vom Tier eliminierte. unveränderte Wirkstoffe CTC, SFD und TMP und Metaboliten, wie N4-Acetylsulfadiazin (N4-SFD), so­wie mögliche Umwandlungs- und Abbauprodukte des CTC zu erwarten (Grote et al., 2004). die hier ebenfalls vereinfachend als wMetabolite" bezeichnet werden. Für die Wirkstoffgrup­pen der Tetracycline und Sulfonamide sind dabei die bekann­ten pharmakokinetischen Charakteristika zu berücksichtigen (Kroker. 1983; Frey und Löscher, 2002): Sulfonamide: Eliminie­rung hauptsächlich über Harn. Biotransformation bis zu 40%. als Hauptmetaboliten rreten die N4-Acetylderivate am. gerin­ge Wasserlöslichkeit, unter anaeroben Bedingungen relativ stabil. Tetracydjne: geringe Biotransformation. Eliminierung über Faeces bis zu 80% und höher, ein Teil wird über Harn aus­geschieden, weitere SpurenIilckstände verbleiben im Sdllacht­körper (Kroker. 1983; Frey und Löscher, 2002; Vockel, 2005).

Zu innerpflanzlichen Metabolismus-Reaktionen von Xe­nobiotika zählen 'Iranstormation, Konjugation und Kompar­timentierung in Vakuole oder Zellwand (Komossa et a1., 1995). Fluorchinolone. die in Hydrokultur von Gemüsepflanzen auf­genommen wurden. sollen ähnlich metabolisiert werden wie im Tier (Migliore el al., 2003). Analoge Erkenntnisse zu den in diesem Modellversuch eingesetzten Antibiotika sind denAuto­ren nicht bekannt.

Für die Analytik sind weiterhin stoIfspezifische Besonder­heiten der Tetracydine relevant. die eine zuverlässige Bestim­mung mit der HPLC erschweren. Dazu zählen insbesondere die Instabilität in Abhängigkeit von Temperatur, Lichteinlluß, pH-Wert und Lösemittel, die Tendenz zur EpimeTisierung.

Antibiotika-Aufnahmevon Nutzpflanzen 41

Tautomerisierung und Chelatisierung von Metallionen. Die dlemische Variabilität des ChlortetracycLins wirkt sich un­ter in-vivo-Bedingungen anders aus als in-vitro während der Proben vorbereitung mit Flüssig-Fest-Extraktion und SPE-An­reicherung (Jacobson et aL 2004; Grote et al., 2004; Vockel et a1.. 2004 und 2005; Anderson, 2005). was sicherlich auch für die analYSierten GÜlle-. Boden- und Pflanzenproben gilt. Die unterSchiedlichen. der jeweiligen Probenart anzupassenden Extraktionsbedingungen führen daher auch zu nidlt direkt vergleichbaren Konzentrationsprofilen an KChlortetracyclin­Komponenten". Konsequenzen für die chromatographische Methodenentwicklung sind untersucht worden (Grote et al .. 2004; Vockel, 2005).

Über die Verwendung eines internen Standards bei der Sul­fonamidbestimmung in Pflanzenproben mit HPLC berichten Form et al. (2002). Zur Absicherung der Ana\yt-Identifizierung in angereicherten SPE-Extrakten aus Proben mit komplexer Matrix ist die LC-MS-Methode im MS2_ bzw. MS3-Modus erfor­derlirn. Die Problematik von Matrixeffekten bei der Elektro­spray-ionisierung (ESI) und Möglichkeiten ihrer Reduzierung beschreiben Kloepfer et al. (2005). Alternativ dazu entwkkel­ten Pfeifer et a1. (2002) eine Methode Zill Bestimmung von Sul­fonamiden und 1fimethoprbn in Gülle mit der atmospheric pressme chemical ionization (APCI) Ionisierung.

2.7 Probennahme und Aufbereitung 2.7.7 Gülle Über die Analyse der Gülleproben wurde bereits ausführlich belichtet (Grote et al., 2004). Die allgemeine Vorgehenswelse bei der Probenaufbereitung bestand aus den Arbeitsschritten der Homogenisierung von 5 g frisch aufgetauter Gülle, Sus­pendierung/Extraktion mit McIllvain-Pu ffer (Citrat/EDTA p H 4), Zentrifugation, Festphasenextraktion (Gasis HLB-Kartuschen). Gefriertrocknung (lager fähiger Extrakt) und dem Aufnehmen des Rückstandes mit Laufmittel A (s.u.) und nachfolgender chromatographischer Analyse mit HPLC-UV-Msn. Diese prin­zipielle Vorgehensweise wurde auf die anderen Probenarten (Boden, Pflanzen) angepaßt und entsprechend optimiert.

2.72 Boden Für den untersurnten Boden der Soester Börde wurde die effek­tivste Extraktion mit ammoniakalischem EDTA-Puffer. pH 10. erreicht: 20 ml einer O,05-mol-Ammoniumchloridlösung wer­den mit35 mJ kouz. Ammoniaklösung (25%w/w) vermischt, mit 3.7244 g Di-NatrIumsalz-Dihydrat EDTA (0.01 mol) versetzt und mit bidest. Wasser auflOO rnl aufgefüllt

Einwaagen von 5 g des lufttrockenen Bodens wurden in ei­nem 50 mJ Zentritugenglas eingewogen. mit 10 ml Ammoniak­EDTA-Puffer versetzt und 30 min auf dem Schüttler (275 V/rnin) äquilibriert und dann zentrifugiert (Hettich Rotofix 32, 4000 U/min. 10 min). Die Überstände wurden in ein weiteres 50 ml Zentrifugenglas überführt und weilere 10 ml des Extraktions­mittels den Bodenproben zugegeben. Die Rückstände wurden amgesdUäIDmt und wieder 30 min geschüttelt. Anschließend wurde erneut zentrifugiert (s.o.) und der Überstand zur ersten Charge gegeben. Der Extrakt, der neben SFD die in iso- und epi­iso-eTC umgewandelten Chlortetracycline enthält, wird mit 25% (wlw) Salzsäure auf pR 4 eingestellt und ein weiteres Mal

42 M. Grote et al.

bei 4000 U/min 10 rnin zentrifugierL DasZentrifugatwird dann der Festphasen-Extral<tion [Solid Phase EXlraction, SPE) unter­zogen und das angereicherte Eluat analysiert [S.lL)_

2.Z3 Batch-50rptionsversuch Zur Untersuchung der Adsorbierbarkeit ausgewählter Arz­neistoffe durch Oberboden der Versuchsparzellen wurden 5 9 Einwaage einer "Nullprobe" (Probenahme vor der ersten Gill­ledüngung am 12.03.02, Bodenhorizont: 0-25 cm) mit 20 m1 einer wässrigen Mischstandardlösung versetzt. Diese enthielt jeweils 10 mg/l an CTC, iso-CTC, anhydro-CTC. SFD, TMP und N4-SFD. Die Suspensionen wurden für 2 h geschüttelt, in Zeitin­tervaLlen Aliquote der wässrigen Phase entnommen und dann analysiert.

7.4 Feldsalat bJolge der ungünstigen Witterungsbedingungen (s.o.) hat­ten sich die Feldsalatpflanzen nicht voll entwickelt.. Daher war mangels Probenmasse eine Trennung zwischen WUTZel und Blatt nicht möglich. Die Pflanzen proben enthielten somit ei­nen Glünanteil, der mit Wurzelmasse vermengt war.

Der tiefgekühlt gelagerte Feldsalat wurde zunächst ly­ophilisiert (Gefriertrocknungsanlage Christ alpha 1-4). Die Wassergehalte lagen zwischen 60 und 70%. Anschließend wur­de das Pflanzenmaterial in einer Schwingmühle (Retsch MM 200) zerkleinert und Einwaagen von 2,5 9 mit 20 m1 Mcillvain -Citratpuffer2 pH 4,1 extrahiert (5 min Ultraschallbad, 10 min Zentrifugation bei 4000 U/min). Der Überstand wurde in ein 50 rnI- Zentrifugenglas überführt. der Rückstand nochmal in Pufferlösung (10 mJ) aufgeschlämmt, erneut mit Ultraschall be­handelt (5 minI und zentrifugiert. Die Extrakte wurden verei­nigt, zentrifugiertund anschließend zur Festphasenextraktion eingesetzt

2.7.5 Winterweizen r Lyophilisation der Wurzeln wurden 25 9 des tiefgekühlten

'probenmaterials eingesetzt. Die Wassergehalte der Wurzeln lagen zwischen 46% und 56%, die der GrÜllanteile (Blatt und Halm) zwischen 53% und 63%. Die weitere Probenvorbereitung erfolgte wie beim Feldsalat (Extraktion mit Mclllvain-Puffer, SPEI mit Einwaagen von 2,5 g.

Das lufLtrockene Stroh wurde vor der Extraktion in einer Siebmühle zerkleinert (PartikelJänge ~ 1 rnm). Die maximale Probeneinwaage zur Extraktion mit Citratpuffer betrug 1,5 g. Höhere Einwaagen führten bei einem Gesamtvolumen von 30 ml PuUer zu einem inakzeptablen Verlust des Exrraktionsmit­tels.

Das tiefgekühlte (-80°C) Kom wurde in einer automati­schen Labormühle (Fritsch Pulverisette) zerkleinert. Es folg­te die Fraktionierung mit einer analytischen Siebmaschine [Retsch). Die Feinkomfraktion (Siebrnaschenweite < 0,106 mm) wurde zur weiteren Probenvorbereitung (Extraktion, SPEI ver­wendel bei Einwaagen von 2,5 g.

2 Mclllvain.Puffer pH 4.1: 620 mI einerwässrigen O.l-mol/L·Cittonensäure-wsung werden mit 380 ml einer 0.2 mol NatriumhydrogenphosphatlOsung gemischt. Darin werden 37,244 9 (0,1 mol) Dinatriumsalz·Dihydral- EDTAgelösL

2.7.6 Festphasen-Extraktion (5PE) Die vereinigten McIllvain-Extrakte wurden auf eine mit 1 ml Methanol konditionierte und mit 1 rnl bidest Wasser äquilib­rierle Festphasen-Kartusche (Water Oasis HIB 3cc. Boden: 6cc) gegeben und langsam (35-40 Tropfen Imin) durdlgesaugt. Die Kartusche wird mit 3 ml MeOHfbidest. ~O (5/95 v/v) und 3 ml bidest. Hp gespült und anschließend die Festphase unter einem Luftstrom kurz getrocknet. Die Analyten werden lang­sam tropfenweise mit 3 m1 Methanol in ein lO-rnl-Reagenzglas eluiert..

Das Eluat wird im Metallblock-Thermostaten bei 30°C un­ter leichtem LuItstrom bis zur Trockene eingeengt. Der Rück­standwirdin500].11 Laufrnittel A (s.u.) aufgenommen, in ein 1,5 ml Eppendorf-Reaktionsgefäß überführt und bei -32°C bis zur Analyse gelagert. Dazu werden die Proben bei Raumtempera­tur aufgetaut, auf einem SchüttIer (IKA Vibrax VXE basic) ho­mogenisiert, in Autosamplervials (Braunglas mit integriertem Gla~einsatz, 500].1l Volumen) umgefüllt und mit einer A1umini­u mkappe mit integriertem Septum verschlossen.

2 .8 HPlC-UV-MS" -Analytik Es wurde ein HPLC-Komplettsystem (Thermo FinniganfThermo Electron) mit dem massenselektivem Detektor LCQ-Advantage ESI-lon-Trap verwendet. Die Datenauswertung erfolgte mit Xcalibur-Sottware.

Zur Absicherung der Befunde im Winterweizen wmden zusätzlich Messungen mit dem empfindlicheren Linear-Ion­Trap-Massenspektrometer .Finnigan LTQ" (Thermo Electron, Dreieich) durchgefilllrt.

HPLC-System (Spectra): Degasser: SCM 1000 Vakuum Mem­brane Degasser; Pumpe: P 4000 Gradient Pumpe; Injektions­automat: AS 3000, Autosampier (gekühlt: 10 0c) mit integrier­tem Säulenofen (temperiert: 30 oe); UV-Oetektor: UV 6000 LP; Messberelch: 190-800 nm, DetektionswelJenlänge: 267 nm; lnjektionsvolumen: 20-40 ].11; Fluss: 0.4 rnl/min; lIennsäule für Pflanzenproben: YMC-Pack ODS-AM, 150 x 3,0 rnrn Ld., S 5 ).1m (Vorsäule: YMC-Pack OOS-AM (19 x 3 rnmrn, 5 pm)]; Trennsäule für Gülle- oder Bodenproben: Phenomenex 250 x 2,0 mm, Sy­nergi 4).1 Hydro-RP; Laufroiltel A: Acetonitril/Wasser/Ameisen­säure 10/89.9/0,1 (v/viv); Laufmittel B: Acetonitril/Wasser/Amei­sensäure 60/39,9/0,1 (vIvIv).

Gradientenprogramm:

Zeit[min] LauIrnittel A [%] Laufrnittel B [%)

0 90 10 1..5 80 20

10 60 40 17 0 100 21 0 100 24 90 10 35 90 10

Retentionszeiten (Standardlösung 5 mg/I, in Laufrnittel A): YMC-SäW: SFD (5,14 min). epi-iso-CTC (7,29), keto-epi-CTC (7,84), iso-CTC (8,93), enol-epi-CTC (9,66), CTC (11,46); Pheno­menex-Säule: SFD (4,59), N4-SFD/TMP (5,6), iso-CTC (7,83), CTC (10,17).

Antibiotika-Aufnahme von Nutzpflanzen 43

Tab. Z Summe antibiotisch aktiver (CTC. epi·CTC, anhydro-CTC) und nicht-aktiver Rücl<ständevon CTC (iso·CTC, epi-iso-CTC) und ihr Massenverhältnis In gelagerterGOlle.

Datum 1. Medikation 2. Medikation

mg/kgGülle g/kg N Quotient mg/kgGülle g/kg N Quotient

aktiv aktiv nicht aktiv aktiv nicht aktiv nicht aktiv

aktiv nicht aktiv aktiv nicht aktiv aktiv

nicht aktiv

02.08. 30_08. 27.09. 3UO. 29.11. 12.03.

Analyt

87.5 78,6 41.9 47,1 28,4 16.8

27,1 48,4 47,7 47,4 37,2 26,3

14,0 4,4 10,6 6,5

5,2 5,9 6,5 6,5 3.9 5.2 5,6 8.7

Precursor-Ion

3,18 1,63 0,88 1,00 0,75 0,64

Stoß-

69,1 79,7 73,6 76,3 36,0

33,4 43,0 50,S 66.9 52,2

Produkt-Ionen

10.3 11,3 14,0 15,6 7,0

5.0 6,1 9.6 13.8 10.2

2.06 1.85 1,45 1.13 0.69

M, (glmol) [M+H]+ energie

Tab. 3 Massenspektroskopische Kenngrößen der Analyten (LCQ Advantage. Ion Trap. ESI-MS2). (m/z) (%)

SFD 251,06 251,1 38

N4-SFD 292,31 293.1 38

TMP 290,32 291,2 45

epi-iso-CTC 478.89 479.1 28

epi-keto-CTC 478,89 479.1 28

iso-CTC 478.89 479.1 28

epi-enol-CTC 478.89 479.1 28

CTC 478.89 479.1 28

2.9 l CQ-Advantage Ion-Trap Ionisierungsmethode: Electrospray JODization (ESI) , positiv­Mode [M+HJ+, MS/MS-Stoßexperimente (He), Precursor- und Produkt-Ionen (Tab. 3).

Tune-Page-Parameter: Mass Range: 80-2000 [m/z]; She­at Gas Flow Rate: 47 [arb]; Auxillary Gas Flow Rate: 0 [arb]; Ion Spray Voltage: 5 kV; Capillary Temperature: 250°C; Capillary Voltage: 9 V; 'TUbe Lens Of:fset: -5.0 V; Multipole 1 Offset: -1,5 V; Lens Voltage: -32 V; Multipole 2 Oflset: -5,5 V.

2.10 Identifizierung und Quantifizierung Die Identifizierung der Arzneistoffe erfolgt über die Massen­spuren der MS2 -Fragmentionen (Winterweizen-Kom auch MS3 -Modus; Tab. 6), ihre relativen Intensitäten und Reten­tionszeiten. In Tab. 3 sind die im SRM-Modus gemessenen Übergänge (Precursor- und Produktionen) aufgeführt. Zur Quantifizierung wurde die Summe der MS2 -Signalintensitäten korrespondierender Produktionen verwendet.

Nicht alle Standardverbindungen sind kommerziell er­hältlich. N4-Acetylsulfadiazin wurde synthetisiert (Universität Paderborn). epi-Isochlortetracyclin in Lösung durch Epimeri­sierung von lsochlortetracydin (Stammlösung) gebildet. Stan­dardlösungen wurden durch Verdünnung von StammlösUll-

m/z (Intensität ... . %)

156,0 (84-100) 173.9 (80-100)

136,0 (60-85) 197.9 (100) 227.0 (22-50)

123,0 (30-60) 230,1 (100) 227,0 (22-50)

462.0 (100)

444,0(5) 461.9 (100)

462.0 (100)

444.0 (50-80) 461.9 (100)

444,0 (68-84) 461,9(100)

gen mit Laufmittel A erhalten (Grate et aL, 2004; Vockel et al., 2004; Vockel, 2005).

In der Regel wurde extern kalibriert und dazu Mischstan­dards der Konzentrationen 0.05 mg/I, 0,1 mg/I, 0,2 mg/I, 0,5 mgl 1,1 mg/i. 2 mg/I und 5 mg/I verwendet. Die Meßpräzision (srol' n = 10) lag für die einzelnen Wirkstoffe im Bereich von 3,5%- 6% (5 mg/I), 6%-13% (0,1 mg/l TMP, CTC{ iso-CTC). beim SFD höher (-18%).

In den Chromatogrammen der angereicherten Extrakte aus Boden und Pflanzen wurden im Vergleich zu den Stan­dardlösungen verkürzte Retentionszeiten registriert. Dieses war besonders ausgeprägt für CTC-Komponenten (0,5-0,7 minI in Grünteil-Extrakten, am geringsten in Extrakten von Wurzel und Korn (0,2-0,3 minI. Beim zuerst eluierenden SFD waren mit Sulfamethoxypyridazin als internem Standard (ISTD) derartige, ohnehin schwächer ausgeprägte Effekte über die Berechnung relativer Retentionszeiten ausgleichbar (For­m et al.). Für die Chlortetracydine erfüllt das versuchsweise eingesetzte Demeclocyclin nicht die Kriterien eines ISTD, was in der chemischen Variabilität dieser Stoffklasse begründet ist (Vockel,2005).

OffensichtliCh wirken sich Suppressionseffekte in der ESI­Quelle auf die MS-Signalintensitäten des SFD in Grünteil-Ex-

44 M. Grate et al.

Zusatz SFD epi-iso-CTC iso-CTC keto-epi-CTC enol-epi-CTC CTC Tab. 4 Wiederfindung (%) von Arzneistoffen in Weizenkorn'

[l1g) und Feldsalat'

Korn (Dotierung mit Mischstandard,

0,05 115 n.b. 66 n.b. 73 106 Doppelbestimmung, n =3).

0,25 73 157 63 101 91 106

0,50 41 120 53 113 102 95

1,00 43 114 47 117 96 102

Feldsalat

0,05 n.b. 110 63 n.b. 28 33

0,25 n.b. 50 42 141 65 74

0,50 n.b. 58 43 151 101 75

1.00 n.b. 63 44 120 131 62

• Weizen- und Salatproben ohne nachweisbare Arzneistoffrückstände; n.b.: nicht bestimmbar (MS·Signale < NWGJ BG), externe ·'alibrierung.

[mgjkgTM} Tab. 5 Arzneistoffgehalte im

Probe epi-iso-CTC iso-CTC keto-epi·CTC enol-epi-CTC CTC SFD Feldsalat (n = 4).

FF-1-1 <BG 0,051 NjF <BG 0,136 NjF (0,045) (0,024)

FF-1-2 0,052 0,061 N/F <BG 0,072 N/F (0,032)

FF-1-3 ~NWG :S;NWG N/F N/F :S;NWG N/F

FF-2-1 N/F N/F N/F N/F N/F N/F

FF-2-2 ~NWG <BG :S;NWG .:s;NWG <BG NIF (0,025)

FF-2·3 NfF N/F NjF N/F

FF·3-1 :S;NWG :S;NWG N/F N/F

FF-3·2 ~NWG ~NWG N/F N/F

FF·3-3 NfF NfF N/F N/F

FF: Feldprobe Feldsalat

FF·1 : Parzelle1

-·1·x: x=l: Probennahme-Termine: 20.11.01; 2: 03.12.01; 3: 12.03.02.

trakten aus. Derartige matrixbedingte Einflüsse können Ur­sache für sinkende Wiederfindungen (Tab. 4) mit steigender Dotierung sein, was u.a. bei CTC-dotierten Schlachtproben nachgewiesen wurde (Vockel et al. 2005; Vockel. 2005). Ergän­zende SFD-Bestimmungen an Feldsalat und Möhren (aus Hy­drokultur) bestätigen Literaturangaben (Kloepfer et al., 2005), wonach das aufwendigere Standardadditionsveriahren vor­teilhaft sein kann.

Die Chlortetracyclin-Kornponenten verhielten sich sehr unterschiedlich (Tab. 4). Zu hohe Werte für das epi-iso-CTC und der Keto-Forrn des epi-CTC sind teilweise auf Peaküber­lagerungen zurückzuführen. Im Vergleich zu den Grünteilen waren aber die Matrixeinflüsse der Korn-Extrakte - ähnlich wie bei den Bodenproben - deutlich geringer. Derzeit wird das .Clean up" weiter optimiert. um die beschriebenen Effekte zu reduzieren.

Die aus den Signal zu Rauschverhältnissen abgeschätzten Nachweisgrenzen (NWG: S/N = 3:1) lieg en für SFD zwischen 10 p g/kg TM (Boden) und 25-30 p.g/kg TM/FG (Weizenwurzel. Grün­Lei!. Korn), für eTe zwischen 10 )lg{kg TM/FG (Boden. Korn) und

(0,041)

N/F N/F

~NWG NjF

~NWG N/F

N/F N/F

25 jlg/kg TM (Wurzel. Grünteil). Die Bestimmungsgrenzen (BG: S/N = 10:1) liegen für CTC zwischen 25-30 }lg/kg TM/FG (Boden. Korn) und für CTC und SFD bei 50 }lg/kg TM (Wurzel, Grünteil).

3. Ergebnisse und Diskussion

3.1 Antibiotika in der Gülle Während der beiden Medikationsphasen wurden die von den Versuchstieren täglich über Urin und Faeces ausgeschiedenen Chlortetracyclin-Mengen ermittelt (Freitag et a1., 2003; Grote et a1., 2004). Die Werte dienten in Verbindung mit Rückstands­analysedaten von Schlachtproben auch der Massenbilanzie­rung (Vockel. 2005). Nach beendeter Medikation wurden von den gewonnenen Gülleproben beider Medikationsphasen zu Beginn und am Ende der mehrmonatigen Lagerzeit folgende Kenngrößen bestimmt: pH-Wert: 7,0-7.3; Trockensubstanz zu Beginn: 8-10% (nach 8 Monaten: 3-5 %); Gesarntstickstoff (Gül­le): 1. Medikation: 0,58-0.77% (0,30%),2. Medikation: 0,47-0,64% (0,51%), Gesarntphosphor (Kot): 0,7-1,1 mg{g.

Während der 7- bzw. 8-monatigen Lagerung der Gülle traten erhebliche Veränderungen der Arzneistoffgehalte auf (Grote etaL2004; Vockel et al.. 2005). TMPwurde nurzu Begjnn der Lagerung in geringen Konzentrationen nachgewiesen. Zu diesem Zeitpunkt dominiert in hoher Massenkonzentration N4-SFD (um 300 mg/kg Gülle). der HauplmetaboHt des Sulfo­namids. Offensichtlich wird er aber innerhalb eines Monats rasch mikro biologisch deacyliert, da ilie Konzentration des Wirkstoffes SFD zunächst relativ ansteigt. 1m weiteren Verlauf bleibt ein hohes Konzentrationsniveau für SFD erhalten (> 100 mg/kg), während der Metabolil nur noch in gerirrgen Mengen nachweisbar ist (ca. 10-20 mgfkg). Diese Konzentrationsverläu­fe entspredlen tendenziell den Ergebnissen früherer Unter­suchungen (Berger et a!.. 1986). Offensichtlich land während der Güllelagerung nur ein begrenzter Abbau der Sulfonamid­Rückstände statt.

- Die anfangs relativ hohen Gehalte an Chlortetracyclinen (30-50 mg/kg CTC, iso-CTC u.a. Umwandlungs- und Abbau­produkte) waren nach ca. 7 Monaten auf - 60% gesunken (Abb. 2). Neben CTC wurden die antibiotisch aktiven Substanzen epi-CTC und anhydro-CTC sowie die nicht-aktiven iso-CTC und epi-iso-CTC nachgewiesen. Dabei haben sich im laufe der mehrmonatigen Lagerung allmählich die AnteUe der mikro­biell aktiven zugunsten der inaktiven Derivate iso-CTC und epi-iso-CTCverschoben (Tab. 2). Durch die Beaufschlagung der VerslIchsparzellen mit Gülle aus den zwej Medikationsphasen sind also z.T. erhebliche Frachten an SUlfonamid (557-922 mg SFD/m2) und - entsprechend der geringeren Wirkstoff-Dosie­rung - geringere an Chlortetracyclinen (176-284 mg CTCfm2

)

ausgetragen worden.

3 .. 2 Antibiotika im Boden nach der Düngung 3.2.1 Optimierung der Probenaufbereitung Der Nachweis von Tetracyclinen in Böden erfordert zunächst die Extraktion dieser Antibiotika einschließlich der Metabolite aus der Bodenmatrix. Tetracycline können an Bodenpartil<el u.a. über Koordination von Metallionen (z.B. Ca2+, Mg 2~. FeJ+) und an Humusfraktionen gebunden sejn. Daraus resultieren mitunter. in Abhängigkeit von der jeweiligen Bodenzusam­mensetzung. niedrige Wiederfindungswerte «< 30%). die zu­sätzlich durch Alterungsprozesse über .. bound residues" noch begünstigL werden (langhammer et al, 1990; Thiele-Bruhn, 2003; Hamscher etal .. 2002 und 2005).

Bei unseren Vorversuchen wurden Erfahrungen anderer Arbeitskreise genutzt (z.B. Hamscher et al .• 2002). Verwendet wurden Bodenproben aus einem Versuchsfeld, auf dem Wm­terweizen angebaut worden war (Horizont 0-25 cm, 5 ern-Seg­mente). Als ExtraktionsmitteJ wurden u.a erprobt: Citratpuf­fer verschiedener pH-Werte. ohne und mjt EDTA-Zusatz, ohne und mit Mikrowellenunterstützung. verdünnte Salzsäure. mit und ohne Methanolzusatz, bei Raumtemperatur und unter Erwärmen sowie Essigsäureethylester zur ergänzenden Sol­ventextraklion organisch gebundener Tetracycline. In kejnem der gewonnenen Bodenextrakte ließen sich Arzncistoffspuren nachweisen. Bei nachfolgenden Oplimierungsversuchen wur­de der pR-Wert varüert. Methanol zugesetzt und auch zwei­stufig mit verschiedenen Mitteln extrahiert Die Ergebnisse belegen, dass nur Sulfadiazin in mäßigen Ausbeuten durch

Antibiotika·Aufnahme von Nutzpflanzen 4!

i 600 -500

;,.

E • Anhydro-crc !i 400 ,"

Oe-iso-erc a; .. 300 co _Iso·crc " ~ 200

Oe·CTC 100 acrc

0 ..; " N-SFD ci> ci> ii :;;i ,; ,;

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Abb_ 2 Veränderung der Gesamt-Arzneistoffgehalte in Gülle während der Lagerung. (Medikationsphase 1). TMP (nicht aufgeführt): nur in der ersten Probe nachweisbar.

angesäuertes Methanol aus dem dotierten Boden extrahierbar ist, aber nicht1l:imethoprim und rue Chlortetracydine.

Eine eingesetzte NH)NHqCI-EDTA-lösung (pH 10) führt bei SFD und TMP zu Wiederlindungen zwischen ca. 35 und 50%. Für das dotierte CTC wird im ammoniakalischen Mmeu eine re­lativ hohe Wiederfindung erreicht (Summe CTC ~ 40%). Unter diesen Berungungen wird CTC aber vollständig isomerisiert so dass das gebildete Epimerenpaar iso-CTC}epi-iso-CTC als quan­tifizierbarer CTC-Summenparameter die extrahierbaren An­teile Chlortetracyclin-be1asteter Bodenproben repräsentiert. Dieses Extraktionsverfahren wurde schließlich zur Analyse der Bodenkeme aus den güllebeaufschlagten Versuchsparzellen angewendet.

3.2.2 Ergebnisse der Bodenanalysen In den ammoniakalischen Extrakten der Bodenhorizonte waren weder ltimethoprirn noch N4-Acetylsulfadiazin nach­zuweisen. Dagegen ließen sich SFD (Abb. 3) und CTC-Kompo­nenten als Summenparameter (Abb. 4) innerhalb der Bearbei­tungstiefe eines Pfluges (0-25 cm) quantifizieren, aber nicht in tieferen Schichten bis 60 cm. Die gefundenen Massenanteile lagen für CTC erheblicb höher (max. 240 ).1g!kg lfockenmasse. TM) als für SFD (max. 90 ).1g/kg). Der im Boden gefundene, ex­trahierbare Gehalt an Sulfadiazin ist also relativ gering, vergli­chen mit dem sehr hohen Gehalt in der Gülle, wo SFD überwie­gend in der flüssigen Phase vorliegt.

Die untersch.iedlichen Bodenbelastungen sind u.a. durch die unterschiedliche Adsorbierbarkeit der ausgetragenen Arz­neistoffe erklärbar. Batch-Versuche unter statisdlen Bedingun­gen mit unbelastetem Oberboden einer Versuchsparzelle und einer Mischstandardlösung der Arzneistoffe zeigten, dass sich die Sorptionsgleichgewichte in wenigen Minuten einstellen. Aus dem jeweiligen Sorptionsgrad wurde folgende Affinitäts­reihe ermittelt: CTC<::: anhydro-CrC <::: TMP > iso-CTC > > SFD > N4-SFD. Danach sind SFD und N4-SFD nur geringfügig vom Bo­den adsorbiert worden. TMP und rue Chlortetracyclinderivate aber in hohem Maße. Die ebenfalls überprüfte Auswaschbar­keit des beladenen Bodens mit Wasser (nStarkregensirnulati­on~) verhält sich erwartungsgemäß reziprok zum Adsorptions­grad.

Aus den vorliegenden Wetterdaten geht hervor. dass es während und nach der Gülleausbringung starke Niederschlä-

46 M. Grote et al.

Q) 0l1ll .><: ro -- E Olc:: 3<1l C::'><: o Co)

+=i e ~t:.. c:: c:: <1l <1l N~ c:: 0 °eo ~ .§

90

80

70

60

50

40

30

20

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x

x

+

+ x

10 x ~

+ o+-~.-~~-.~-,~-.~,-~,-~.-~

o 20 40 60 80 100 120 140 160 180 1, Gülleaufbringung (Tag 1) 2, Gülleaufbringung (Tag 35) Zeit [Tage]

Abb.3 SFD-Gehalte in Bodenproben: .. Winterweizen, Feld 1, Bodentiefe o em - 25 em" (Weitere Erläuterungen im Text) .

260

240 + 220

Ci) 200

'Ol1ll + .><: ro 180 -- E x Olc:: 160 3<1l c::.>t!. 140 + x o Co)

'.;J e 120 jgt:: c:: c:: 100 <1l <1l N~ 80 x c:: 0 ~OJ 60 x + ,E

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: 0

0 20 40 60 80 100 120 140 160 180 1. Gülleaufbringung (Tag 1) . 2. Gülleaufbringung (Tag 35) Zelt [Tage]

Abb. 4 CTC-Gehalte (Summe iso-CTC/e-iso-CTC) in Bodenproben ["Win­terweizen", Feld 1, Bodentiefe 0 em -25 em; weitere Erläuterungen im Text].

ge gab, wodurch vermutlich der größte Teil des SFD in Boden­schichten unterhalb der Beprobungstiefe und dadurch Rich­tung Grundwassersohle ausgetragen wurde. Allgemein ist die Mobilität von Sulfonamiden im Boden durch Studien belegt und eine Ursache für das Auftreten in Oberflächen- und Grund­wässern (Hirsch et al., 1999; Boxall et al., 2002; Thiele-Bruhn, 2003; Hamscher et al., 2005; Kay et al. 2005).

Unsere Untersuchungsergebnisse zeigen ferner, dass infol­ge der sehr starken Adsorption der CTC-Komponenten an der Bodenmatrix ein Transport über die flüssige Phase in tiefere Bo­denschichten sehr unwahrscheinlich ist. Hamscher et al. (2002) untersuchten mit belasteter Gülle gedüngten Boden und fan­den ebenfalls nur in einer Bodentiefe bis zu 30 cm (Pflugtiefe) Tetracycline, in tieferen Bodenschichten und im Grundwasser aber nicht. Zu berücksichtigen ist weiterhin, dass Tetracycline überwiegend partikelgebunden mit Faecesbestandteilen der

Gülle (s.o.) auf den Boden gelangen. Entsprechend wurden hohe Tetracyclin-Konzentrationen hauptsächlich an der Bo­denoberfläche in getrockneter Gülle gefunden (Hamscher et al., 2002 und 2005).

Erwartungsgemäß haben sich somit die in der Gülle vor­liegenden Chlortetracyclin-Komponenten nach der Güllebe­aufschlagung in den oberen Bodenhorizonten angereichert. Die höchsten Arzneistoff-Werte traten jeweils nach der 2. Be­güllung auf. Dieser Aufstockeffekt war aber nicht erkennbar, wenn die 2. Düngung mineralisch war. Innerhalb von 3 Mo­naten nach der 2. Gülleaufuringung nahmen die Konzentrati­onen der extrahierbaren Arzneistoffrückstände bis in den Be­reich der Nachweis- bzw. Bestimmungsgrenzen ab (Abb. 3 und 4). Die Abschätzung der Gesamtbelastung ist aber unsicher, da mit der Zeit der Anteil nicht-extrahierbarer Arzneistoffanteile im Boden zunehmen kann (Hamscher, 2005).

Die Ergebnisse unserer Studien belegen, dass bereits eine einmalige Düngung eines unbelasteten Bodens mit Antibioti­ka-haltiger Gülle zu einer mehrmonatig nachweisbaren Kon­tamination der oberen Bodenschichten führt. Daraus kann u.a. eine signifikante Zunahme Tetracyclin-resistenter Boden­bakterien resultieren (Rysz et al., 2004; Halling S0rensen et al., 2005). Die Verwendung (stark) Antibiotika belasteter Gülle als Wirtschaftsdünger birgt also ein zusätzliches Risiko zur Ver­breitung von Resistenzen in terrestrischen Kompartimenten.

3.2.3 Antibiotika-Aufnahme der Nutzpflanzen Die umfangreich untersuchte Aufnahme organischer Xeno­biotika (PAK, PCB u.a.) aus Böden über die Wurzel in Pflanzen hängt u.a. von der Mobilität im Bodenwasser und den unter­schiedlichen Transferfaktoren bei den verschiedenen Pflan­zenarten, wie Blatt-, Wurzelgemüse und Getreide ab (Trapp et al. 2000; Trapp, 2004). Grundlagenuntersuchungen zur Phyto­remediation lassen u.a. Einflüsse der Protolyse eigenschaften von Bodenmatrix und organischer Kontaminante erkennen (Briggs et al.,1987; Schnoor et al., 1995; Trapp, 2000). So werden schwache organische Säuren bevorzugt aus saurem Boden und schwache Basen aus alkalischem Milieu aufgenommen. Eine erste Abschätzung der Pflanzenverfügbarkeit ist über die Lipo­philie von Xenobiotika (Verteilungs koeffizient Oktanol/Was­ser: 10gKow-Werte) möglich (Trapp, 2000 und 2004).

Für SFD, CTC und iso-CTC, die über acide bzw. basische Substituenten verfügen, liegen die kalkulierten 10gKow-Werte ("ACD/I-Lab service"; ACD/LogP v6.0, www.acdlabs.com) im Bereich von 0 bis 2. Daraus ist grundsätzlich eine Aufnahme dieser Verbindungen von Pflanzen über die Wurzel zu erwar­ten. Relativ unerforscht ist der Einfluß von Wurzelexudaten und Bakterien auf organische Fremdstoffe in der Rhizosphäre. Linden et al. (2005) erkannten, dass "reactive oxygen species" (ROS) in Wurzelexudaten in der Lage sind, Oxytetracyclin che­misch umzusetzen, so dass die antibiotische Aktivität verrin­gertwird.

Nach den o.a. Abschätzungen wären Sulfadiazin und Chlortetracyclin-Komponenten auch als Xylem- und/oder Phloem-mobil zu klassifizieren, was wiederum die Transloka­tion in Stamm, Blätter und Früchte erwarten ließe. Unter den möglichen Metabolisierungsreaktionen (s.o.) ist die Komparti­mentierung für die angewandten Methoden der Rückstandsa-

nalytik von besonderer Bedeutung, da nur extrahierbare, also überwiegend in Zellvakuolen vorliegende oder (an der Wur­zel) adsorbierte Arzneistoffe zu erfassen sind.

3.2.4 Ergebnisse der Feldpflanzen-Analysen 3.2.4.1 Feldsalat lniolge der ungünstigen Witterungsbedingungen vor der Aus­saat und während der gesamten Wachsrumsperiode hatten sich die Feldsalatpflanzen nicht von entwickelt. Die analysier­ten Pflanzen bestanden daher aus einem GrÜDanteil, der mit Wurzel masse vermengtwar.

In keinem Massenchromatogramm der Salat-Extrakte tra­ten Signale für Sulfadiazin und 'frimethoprim. auf. Es wurden aber in Pflanzen der Versuchsparzellen 1 und 2 deutliche Peaks detektiert, die verschiedenen Chlortetracyclin-Komponenten zuzuordnen sind.

Die Signale mit Retentionsze.it.en von tR = 7,0 (epi-iso-CTC), 8,7 (iso-CTC) und 11,0 min (CTC) erlauben eine Identifizierung der CTC-Komponenten über die zu fordernden Übergänge im MSz·Modus. Die quantitative Auswertung läßt erkennen (Tab. 5), dass die Pflanzen der Parzelle 1 nach der ersten und zweiten Güllebeaufschlagung crC-Summengehalte ~ 0,17 mgfkg TM aufweisen. Drei Monate später zur Erntezeit waren die crC-Ge­halte jedoch deutlich gesunken. Die schwächeren Signale an der Nachweisgrenze (NWG - 25119/kg CTC, SIN-Verhältnis 3:1) sind aber noch als qualitative Hinwe.ise auf CfC, iso-CfC und epi-iso-CTC zu werten.

Positive Befunde ergaben sich auch für den Feldsalat von Parzelle 2, entnommen nach der zwe.iten Güllebeaufschla­gung (- 0,06 mg{kg TM). Die Analyse des Feldsalats aus Parzelle 3, beprobt jeweils nach der organischen Düngung. ergab qua­litative Hinwe.ise auf CTC-Komponenten im Bereich der NWG. In den erntereifen Pflanzen waren aber keine Arzne.istoffrück­stände nachzuweisen. Diese Ergebnisse können als Indiz dafür gewertet werden, dass die Mehrfachbeaufschlagung der Ver­suchsparzellen mit Antibiotika-haltigerGüUe zu einer höheren Belastung des Feldsalats fuhren kann. Im Vergleich zu den Ver­suchsparzellen mit ausgesätem Winterwe.izen war die ausge­brachte Güllemenge wesentlich geringer.

3.2.4.2 Winterweizen Ganzpflanzenproben wurden von Parzelle 1 nach der 2. Gülle­beaulschlagung gezogen. die nächsten Pflanzen ca. 4 Wochen später und die letzten vor der Ernte des Korns im August 2002. Wurzel und GrÜllante.i1 der Ganzpllanzen wurden getrennt und analysiert. Ebenso sind Strobproben während der Beern­tung der Parzellen genommen worden.

Sulfadiazin wurde in den Wurzeln sich entwickelnder Pflanzen aus der ersten und zweiten Probennahme nachge­wiesen, in den Wurzeln der Ernteproben aber nicht mehr. Die Maximalwerte liegen bei 0,5 mgfkg TM (Abb. 5). Chlortetracy­cline fanden sich in allen Wurzel proben_ Eine leichte Akkumu­Iierung des Gesamt-CTC-Gehaltes auf> 1 mgfkg TM) ca. 2 Wo­eben nach der 2. BegülJung im Monat April wurde festgestellt Bis zur Emte im August sanken die extrahierbaren CTC-Anteile auf ca.l{lO der Maximalwerte (- 0,1 mgfkg TM). Dabei sind die Sumrnengehalte für die crC-Komponenten stets höher als für das Sulfonamid. Unter den Chlortetracyclinen dominieren in

400

~ 350 I ~

'" } 300

j 2SO I ~200 Lso j " 100 ,

so l o

Antibiotika-Aufnahme von Nl.ltzpflanzen 47

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D Iso-erc

IDfp;'lso-CTC I • Kelo·fp;.erc

o Eno~fp"CTC

--~ .... _~-12.03.02. 15 04.02 nach 29.04.02 02.08.02 6"nte

1.Robemahrre 2. Robennallrre 3. A"obennahrre 1. GOllung 2. Gattung

Abb.5 Zeitliche Veränderung der Arzneistoffrückstände in Winterwei· zen-Wurzeln (Feld 1) (Weitere Erläuterungen im Text).

den Wurzeln zunächst CfC und das Epimer als Keto- und Enol­Tautomer. Während der Wachstumszeit scheinen sich aber im Verhältnis zum CTC/epi-CTC nahezu äquivalente Anteile des iso-CTC-Epimerenpaares zu bilden. Auf die grundlegende Problematik der in-vivo-lin-vilTo-Bildung dieser Komponenten wurde bereits hingewiesen.

Die GrünteHe. bestehend aus Halmen und Blättern der Winterwe.izenpflanzen aus der 2. Probennallme. enthielten durchschnittlich etwas geringere Mengen extrahierbarer Chlortetracycllne (0.6-1,1 mg/kg TM) als die Wurzeln. SFD bitt in erheblich geringerer Konzentration auf (- 0,05 mgfkg TM). Im Vergleich zu den Wurzeln waren damit die Sulfonamid-Ge­halte in den GTÜnanteilen um den Faktor 10 geringer. Dieser Befund könnte auf eine im Vergleich zu den CTC-Komponen­ten geringer ausgeprägte Translokation oder schnelleren Me­tabolisierung des SFD in der reifenden Winterwe.izenpflanze beruhen. Damit ze.igt der Winterweizen unter den Bedingun­gen des Feldversuches ein tendenziell ähnliches Verhalten wie in den durchgeführten Hydrokultur-Experimenten.

1m Stroh waren keine Arzneistoffrückstände nachweisbar. Dieses Ergebnis erscheint plausibel, da im Zeitraum nach der 2. Begüllung bis zur Erntezeit die Antibiotika-Anteile in den Wurzeln des Winterweizens erheblich zurückgegangen wa­ren (Abb. 5). Bei e.inzelnen Proben traten intensitätsschwache MS-Signale auf, die als Hinweis auf CTC-Spuren gewertet wer­den könnten. Inwieweit Einlagerungsprozesse in lignifizierte Zellwände und Abbaureaktionen in den Getreidepflanzen zur drastischen Reduktion der extrahierbaren Arzneistoff-AnteHe beitragen. kann zur Zeit nicht beantwortet werden. Weitere Aufschlüsse werden von den Ergebnissen mit radioaktiven Tra· cern (Mikro-Autoradiographie) erwartet.

Sulfadiazin und Trimethoprim wurden in ke.iner Kompro­be nachgewiesen. Nach Negativbefunden für CTC in Extrakten grobkörniger Fraktionen vom Korn der zwe.ifach begüllten Parzelle 1 gelangen positive Befunde durch Aufarbeitung von Feinkomfraktionen (d < 0,106 mm). Abb. 6 belegt mit der unte­ren Massenspur im SRM-Modus (m/z = 479.1) und den charakte-

48 M. Grote et al.

RT 0 .00- 35 .04 281

80000" -:! 6.37

60000 - J 7 .06 => - 1 99 r 4 .7 1 ,1 9 .79 16 .0 3 1703

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N L 8 .2 8 E4 Total Scan POA FWK-1-1-1-o1

~L 1 .60E4 TtC F : ... e ES1 SRM m s2 251 1 Q@38 .00 ( 155.00 · 157 .00.

Abb. 6 HPLC-UV-MS/MS Chroma­togramme einer Kornprobe von Winterweizen (Feld 1) [al UV-PDA total Scan, b) nc (mjz=251,l): SFD.c)TIC(mjz=291,l ):TMP,d) nc (mjz = 479,1): CTC-Kompo­nenten]

~ 40 3.9S 5.79 i 20 0 _11 I J ~ J

30 .88 172.90·174 .90] M$ . 10.44 13.18 1975 2';30, 2668 2 I FWK· l -1- 1-01

,'I,' 'I' \. I 1 8 .29 2.4.03 ; 8.23 34 16

~ 01 L ... n'.\' t tl. ' " }'I'o0 I,{,'

100

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60 4 0 0 ,77

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5 .4 4 4 _26

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6 .66

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2004

16_30

11 83 1 2,28 23_4 1

10.28 1 19 _8 7 22 ,4 1 , , , I ,. . , I"~

00' " 10 _86

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12.32 14 .33 18 . 16 20_53 ,_ • .J\.,

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TIme (m ln )

• 2 4 .23

, "

ristischen MS2~Stoß-Fragmentierungen die Identifizierung von Chlor tetracyclin (~ = 11,1 min) und epi-iso-Chlortetracydin (6,9 min).In einigen Proben erschien zusätzlich. aber mit noch ge­ringerer Intensität, der Peak des iso-Chlortetracyclins (8.7 min).

Die Identifizierung der CTC-Komponenten in Extrakten des WlI1terweizen-Korns wurde massenspektrometrisch mit dem LCQ-Advantage lon-l'rap-System erreichL Matrixbedingte Beeinflussungen der Retentionszeiten, die im Falle der Sulfo­namidbestimrnung mit Suliarnethoxypyridazin als internem Standard und Berechnung relativer Retentionszeiten korri­gierbar sind, könnten ein Unsicherheitsfaktor sein, zurnal sich im MS2 -Modus die Produkt-Ionen und Intensitäten des epi-CTC nur wenig von denen der Keto-Form und des epi-iso-CTC unter­scheiden (Tab. 3).

Daher wurden zur weiteren Absicherung der Ergebnisse die Extrakte zusätzlich mit einem erheblich empfindlicheren LC-MSO-System analysiert, das mit dem Linear-Ion-lTap-Mas­senspektrometer .Finnigan LTQ" (Thermo Electron. Dreieich) ausgestattet ist. Dieses System erlaubt auch bei sehr niedrigen CTC-Konzentrationen «< 1 Jlg/l) die Anwendung des MS3 -Mo­dus, was die massenspektrometrische Unterscheidung von Epi­meren und Keto-Enol-Tautomeren ermöglichte (Tab. 3 und 6) und unsere ursprüngliche Zuordnung bestätigte.

Zur QuantiIizierung mit dem LCQ-Advantage konnten auf Grund des zu fordernden Signal/Rauschverhältnisses von 10:1 nur die MS/MS-Signale des CTC ausgewertet werden. Durch­schnittlich wurden im Winterweizen. der auf Parzelle 1 mit zweifacher Güllebeaufschlagung aufgewachsen ist, 44 Ilg/kg FG Chlortetracydin gefunden (Tab. 7). Rein qualitativ wurden auch im Kom von Feld 2 CTC-Rückstände mit beiden LC-MS­Systemen (LCQ Advantage und Finnigan LTQ) nachgewiesen. Dagegen ließen sich im Weizen vom Feld 4, das nur einmal or­ganisch und einmal mineralisch gedüngt worden war, keine

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29.6'2 3 1 .99 229.1()-23" 10 , 2 57 ,00·259 00) MS

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Chlortetracycline detektieren. Auch in homogenisierten Wei­zen-Sammebnustern (Sorte Drifter, Herkunft NRW. Kreis Her­ford) aus der uBesonderen EmteermittJung" der BFEL Detmold waren Arzneistoffrüc1<stände nicht nachzuweisen.

Wie bereits beim Feldsalat festgestellt wurde, begünstigt offensichtlich auch beim Winterweizen die höhere Antibio-

Tab. 6 MS2 und MS3.. Produktionen von CTC-Komponenten (Finnigan lTQ. ES1-lineare Ion-Trap).

Analyt

epi-keto-CTC

epi-enol-CTC

iso-CTC

epi-iso-CTC

CTC

MS2 (mjz)

462,'

444,1

462,1

462.1

462.1

444,1

462,1

Stoß­Energie

(%)

22

22

22

22

22

22

22

MSJ m{z (Intensität,.,. %)

366.2(30) 417.1(50) 434.1 (20) 444.1 (100)

355,1 (50) 381,0(50) 399,1 (50) 425,1 (100)

444,1 (100)

373,1 (20) 416.1 (50) 434,7(70) 444,1 (100)

197,0(40) 417,1 (100) 434,1(50) 444.1 (50)

154.0 (lOO) 371,1 (40) 399,1 (30) 426,1 (30)

444,1 (100)

Antibiotika-Aufnanmevon Nutzpflanzen

[mg/kg FG) Tab. 7 Arzneistoffgehalte im Kom vom Winterweizen

enol keto epi-iso· SummeCTC (Feld', Probennahme am

Probe CTC iso-CTC Mittelwert SFD epi-CTC epi-CTC CTC

(n=3) Erntetag. 0.2.0.8.20.0.2).

FWK-'-'-'-01 0.,0.43 N/F N/F N/F ~NWG N{F

FWK-1+1-o.2 0.,0.43 NjF N/F N/F ~NWG 0..0.40. N/F

FWK-,-,-,-o.3 0..0.35 N/F N/F N/F 5-NWG N/F

FWK-1-1-2-o.l 0..0.41 N/f N/F N/F 5-NWG N/F FWK-l-1-2-02 0.0.69 N/F N/F Nlf 5-NWG 0,057 NjF

FWK-1-1·2-03 0..0.60 N/F N/F N/F ~NWG N/F

FWK-'-'-3-01 0,051 N/F NJF N/F N{F N{F

FWK-1-1-3-02 0.042 NJF N/F N/F NjF 0.052 NIF

FWK+'-3-03 0.062 N/F NIF N{F N/F N/F FWK-H4-01 0,033 N/F NIF ~NWG NIF N/F

FWK-'-'-4-02 0.,030. N/F N/F ~NWG ~NWG 0..029 N/F

FWK-1-1-4·o.3 0..026 N/F N{F ~NWG ~NWG NIF

Probenbezeichnung: FWK·1- = Feldprobe/ Winterweizen/Korn {Feld 1; FWK-1-1- = Proben nah me 1; FWK-1-H = laufende Nr. der Pro-benvorbereitung; FWK-1·2-1-01 = lautende Nr. der Messproben·lnjektion.

tikafracht durch Zweifachbeaufsch1agung und die dadurch bedingte höhere Belastung der oberen Bodenschichten mit Chlortetracyclin en den Transfer Boden-Pfianze.Experimentein Hydrokultur (BFEL Detrnold). unter denen es nicht zur Bindung der Arzneistofte an Bodenpartikel kommen kann. demonstrie­ren das Aufnahmepotenzial der Nutzpflanzen. So werden SFD, CTC und iso-CTC - die :epräsentativen Kontaminanten der be­aufschlagten Gülle - aus dotierter Nährlösung von Feldsalat, Winterweizen (und Möhren) über die Wurzel aufgenommen und in der Pflanze transportiert. Diese Befunde der Rück­standsanalysen entsprechen Ergebnissen der 1i"acerstudien (UFT-Bremen) mit 3 H-Sulfamethazin und 3 H-Tetracydin. Wei­tere Aufklärung der pflanzenphysiologischen Aufnahme- und 1i"anslokationsvorgängewird vonmikroautoradiographischen Messungen erwartet.

3 .3 Fazit Feldsalat und Winterweizenkönnenaus Boden. dermitAntibi­otika-belasteter Gülle gedüngt wurde, Sulfadiazin und Chlor­tetracyclin-Komponenten über die Wurzel aufnehmen. Die unter Freilandbedingungen (und in Hydrokultur) vom Winter­weizen aufgenommenen Veterillärphannaka werden in der Pfianze unterschiedlich transportiert oder metabolisiert.

1m Getreide-Korn wurden Spuren von Ge und seinen Umwandlungsprodukten eindeutig nachgewiesen - dem Kenntnisstand der Literatur nach erstmalig. Bisher publizierte Analysen von FTÜhjahrsgerste, die auf dänischen Ackerböden angebaut wurden, führten zu negativem Befund (Jacobson et al.,2004).

Jüngste Ergebnisse aus Gewächshausstudien (Kumar et aL, 2005) zeigen, dass auch Mais, Kohl und Zwiebeln aus Gülle­gedüngten Böden Chlortetracyclin aufnehmen. Diese und die Ergebnisse unserer Modellstudie zeigen, dass allgemein mit ei­nem U'ansfer antibiotisch aktiver Pharmaka-Rückständen aus Wirtschafts düngern in pflanzliche Lebens-und Futtermittel zu rechnen ist. Unklar ist noch. ob dieser ltansfer in der konventi­onellen landwirtschaftlichen Praxis, besonders in viehstarken Regionen, signifikant ist FOlgeuntersuchungen sind in Vor-

bereitung, um die reale Belastungssituation bei Getreide und anderen Nutzpflanzen beurteilen zu können und Antibiotika­Einträge in die Nahrungskette über den Pfad Boden - Pflanze und die daraus resultierenden Risiken für den Verbraucher abzuschätzen.

Danksagung Die Autoren danken dem Ministerium für Umwelt und Na­tursd1Utz. Landwirtschaft und Verbraucherschutz des Landes Nordrhein-Westlalen (MUNLV) für die finanzielle Unterstüt­zung des Projektes "Antiinfektivaeinträge aus der Tierproduk­tion in terrestrische und aquatische Kompartimente".

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