Antibiogram

Antibiogram

Postupak ispitivanja osetljivosti mikroorganizma na antibiotike ili hemioterapeutike izlaganjem standardne koncentracije mikroorganizma specifičnim koncentracijama antibiotika.

Osetljivost se može ispitivati na bakterijama, gljivicama i virusima.

Za neke mikroorganizme se prema oetljivosti na jedan lek, može predvideti osetljivost na slične lekove.

Zbog toga se ne ispituje osetljivost baš na sve lekove koji dolaze u obzir.

Pojedini mikroorganizmi su rezistentni na određene antibiotike

(npr.: Enterococcus spp. je rezistentan na cefalosporine, Gram-negativne bakterije na vankomicin...).

MRSA (meticilin-rezistentni Staphylococcus aureus)

VRE (vankomicin-rezistentni enterokok)

MBL (metalo- -laktamaze)

ESBL ( -laktamaze proširenog spektra delovanja)

Metode određivanja antibiograma

* Kvalitativne metode

1. Difuziona (disk) 2- Diluciona (razblaženja) 3- Kombinovana (E-test)

* Semi–kvantitativne

* Metoda na osnovi nukleinskih kiselina.

Kvalitativna metoda

Rezultati se očitavaju kao:

osetljiv (susceptible = S)

srednje osetljiv (intermediate = I) ili

otporan (resistant = R).

metoda difuzije na disku (Kirby– Bauerov test) pogodna je za brzo rastuće mikroorganizme.

Tom metodom se na podloge od agara inokulirane s ispitivanim uzročnikom stavljaju antibiotikom natopljeni diskovi.

Nakon inkubacije (16–18 h) se meri promer zone inhibicije oko svakog diska.

Svaka kombinacija mikroorganizma i antibiotika ima različiti promer, što se označava sa S, I ili R.

Disk-difuziona metoda

Zasniva se na principu difuzije antibiotika kroz čvrstu hranljivu podlogu (agar) prethodno zasejanu ispitivanom bakterijskom kulturom

Pravi se suspenzija od nekoliko bakterijskih kolonija izolovanih sa podloge

Omogućava istovremeno ispitivanje osetljivosti na veći broj antibiotika

Jednostavna metoda

relativno brza (24 h)

Postupak disk difuzione metode

Pravi se suspenzija od nekoliko bakterijskih kolonija izolovanih sa podloge i upoređuje sa standardom određene gustine

Postupak

Bris natopiti suspenzijom bakterija i ocediti višak tečnosti lakim pritiskom o zidove epruvete i naneti brisom na površinu agara (najčešće Mueller-Hinton) da bi se dobio konfluentan porast

o

Disk difuzioni metod antibiograma

Stavljanje diskova sa određenim (standardnim) koncentracijama antibiotika

Inkubacija u termostatu na 37°C od 16 - 24 h

Rezultat antibiograma

Zona inhibicije rasta: okrugla zona oko diska sa antibiotikom u kojoj nema vidljivog porasta bakterija

Merenje prečnika zone inhibicije

Koncentracija antibiotika postepeno i radijalno opada sa udaljavajnem od diska sve do tačke gde više nije inhibitorna i gde se pojavljuje porast bakterija.

Očitavanje rezultata antibiograma

S-senzitivan (osetljiv) I-irezistentan (umereno osetljiv) R-rezistntan (otporan)

Uporediti izmerene prečnike zona inhibicije ispitivane bakterije sa standardnim preporučenim zonama za određenu bakteriju i određeni antibiotik

Tumačenje rezultata disk difuzionog metoda

Staphylococcus aureus S I RAmpicilin ≥29 ≤28

Imipenem ≥16 14-15 ≤13Meticilin ≥14 10-13 ≤9Hloramfenikol ≥18 13-17 ≤12Gentamicin ≥15 13-14 ≤12Ciprofloksacin ≥21 16-20 ≤15Trimetoprim+sulfametoksazol

≥16 11-15 ≤10

Vankomicin ≥15 / /Escherichia coli S I RAmpicilin ≥17 14-16 ≤13Imipenem ≥16 14-15 ≤13Meticilin / / /Hloramfenikol ≥18 13-17 ≤12Gentamicin ≥15 13-14 ≤12Ciprofloksacin ≥21 16-20 ≤15Trimetoprim+sulfametoksazol

≥16 11-15 ≤10

Vankomicin / / /

Semikvantitativne metode

Određuju minimalnu koncentraciju leka koja in vitro inhibira rast određenog mikroorganizma(MIK)

minimalna inhibitorna koncentracija (MIK) se iznosi kao brojčana vrijednost

Antibiotik se može razrediti agarom ili bujonom.

Razređivanje bujonom je zlatni standard, ali je naporno jer se po epruveti može testirati samo jedan lek.Bolje je koristiti traku poliestera impregniranu antibiotikom u koncentracijskom gradijentu uzduž njene dužine.

Traka se položi na podlogu agara koja sadrži inokulum a MIK se određuje prema mestu na traci na kojem započinje inhibicija; na jednoj podlozi se tako mogu ispitati brojni antibiotici

Metode na osnovi nukleinskih kiselina

Metode koje otkrivaju gene za otpornost na antibiotke ili mutacije

Primer je mecA, gen za otpornost na oksacilin kod S. aureusa

( ako taj gen postoji, smatra se da je mikroorganizam otporan na sve β–laktamske antibiotike, bez obzira na sve postojeće rezultate antibiograma).

Ograničenja: što su skupi i nisu široko dostupni,te zato nisu zamenili standardnu kulturu i antibiogram.

Streptoccocus beta hemolitički

USLOVI TESTIRANJA:

Podloga : Mueller Hinton agar sa 5% ovčije krvi

Inokulum: direktna suspenzija kolonija gustine 0,5 McFarland

Inkubacija: 35±2o C, 5% CO2, 20-24 sata

KONTROLA KVALITETA: Streptococcus pneumoniae ATCC 49619

Streptococcus pneumonie

Podloga: Mueller Hinton agar sa 5% ovčije krvi

Inokilim: direktna suspenzija kolonija gustine 0,5 McFarland

Inkubacija: 35 ±2o C, 5% CO2, 20-24 sata

KONTROLA KVALITETA: Streptococcus pneumoniae ATCC 49619

Enterococus

Podloga: Mueller Hinton agar (MH agar)

Inokulum: Direktna suspenzija kolonija gustine 0.5 McFarland

Inkubacija: Aerobna, 35±2ºC, 16-18 sati

Kontrola kvaliteta: (minimalni zahtevi) E. coli ATCC 25922 E. coli ATCC 35218

Pseudomonas aeruginosa

Podloga: Mueller Hinton agar (MH agar)

Inokulum: Direktna suspenzija kolonija gustine 0.5 McFarland

Inkubacija: Aerobna, 35±2ºC, 16-18 sati

Kontrola kvaliteta: (minimalni zahtevi) E. coli ATCC 25922 E. coli ATCC 35218 Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853

Acinetobacter spp. Podloga: Mueller Hinton agar (MH agar)

Inokulum: Direktna suspenzija kolonija gustine 0.5 McFarland

Inkubacija: Aerobna, 35±2ºC, 20-24 sata

Kontrola kvaliteta: (minimalni zahtevi) E. coli ATCC 25922 E. coli ATCC 35218 Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853

Staphyloccocus spp

Podloga: Mueller Hinton agar (MH agar)

Inokulum: Direktna suspenzija kolonija gustine 0.5 McFarland

Inkubacija: Aerobna, 35±2ºC, 16-18 h; 24h za koagulaza negativne stafilokoke, cefoksitin (Fox) i vankomicin

Kontrola kvaliteta: (minimalni zahtevi) S. aureus ATCC 25923 (disk difuzioni test) S. aureus ATCC 29213 (MIC) E. coli ATCC 35218 (za β laktam/β laktamaza inhibitorne kombinacije)

enterococus

USLOVI TESTIRANJA:

Podloga: Mueller Hinton agar ( MH agar )

Inokulum: direktna suspenzija kolonija gustine o,5 McFarland

Inkubacija: aerobna, 35 ± 2o C, 16-18 sati; 24 sata za vankomicin

KONTROLA KVALITETA: S. aureus ATCC 25923

Dilucioni metod antibiograma

niz dvostrukih razblaženja antibiotika u odgovarajućoj podlozi

Prema podlozi u kojoj se prave razblaženja antibiotika:

bujon dilucioni metod

agar dilucioni metod

100 µl

Bakterijska suspenzija

Antibiotik (µg/ml)

Bujon

MBK = 0,5 µg/mlMBK

MIK MIK = 0,25 µg/ml

+

24 h37°C

24 h37°C

0,030,060,1250,250,5

Bujon dilucioni metod antibiograma

MIK: najmanja koncentracija antibiotika koja inhibira porast bakterija (bujon ostaje bistar)

MBK: presejavanjem svih razblaženja koja inhibiraju porast bakterija

Bujon dilucioni metod antibiograma

- mogućnost određivanja MIK i MBK

ispituje se osetljivost jedne bakterijske vrste na jedan antibiotik

složena tehnika izvođenja trajanje > 24 h

E-test

Kombinovani metod antibiograma

Zasniva se na pincipu difiuzje antibiotika kroz čvrstu hranljivu podlogu-agar predhodno zasejanu ispitivanom bakterijskom kulturom

Koristi se plastična traka impregnirana antibiotikom u gradijentu koncentracije

E

1

1.5

.75

.50

.35

.25

.10

.05

.02.01

2348

12

E

11.5

.75

.50

.35

.25

.10

.05

.02

.01

234812 Zona inhibicije: elipsa

E test

direktno očitavanje vrednosti MIK istovremeno se ispituje osetljivost na veći broj

antibiotika jednostavan relativno brz (24 h) visoka cena

Čitanje rezultata E testa

očitava se na skali koncentracija

na E -test traci• na mestu gde linija zone inhibicije

rasta preseca ivicu E test trake

MIK

Rezultati E testa

Слајд 1AntibiogramСлајд 3Metode određivanja antibiogramaKvalitativna metodaDisk-difuziona metodaPostupak disk difuzione metodePostupakDisk difuzioni metod antibiogramaRezultat antibiogramaMerenje prečnika zone inhibicijeСлајд 12Tumačenje rezultata disk difuzionog metodaSemikvantitativne metodeMetode na osnovi nukleinskih kiselinaStreptoccocus beta hemolitičkiStreptococcus pneumonieEnterococusPseudomonas aeruginosaAcinetobacter spp.Staphyloccocus sppenterococusDilucioni metod antibiogramaСлајд 24Bujon dilucioni metod antibiogramaE-testE testČitanje rezultata E testaRezultati E testa