antibacterial activity of hen egg white lysozyme against
TRANSCRIPT
-
8/10/2019 Antibacterial Activity of Hen Egg White Lysozyme Against
1/8
V o l . 5 5 ,
N o .
3
P P L I E D AND ENVIRONMENTAL
MICROBIOLOGY,
M a r .
1 9 8 9 ,
p .
6 3 1 - 6 3 8
0 0 9 9 - 2 2 4 0 / 8 9 / 0 3 0 6 3 1 - 0 8 0 2 . 0 0 / 0
C o p y r i g h t
C ) 1 9 8 9 , A m e r i c a n S o c i e t y
f o r M i c r o b i o l o g y
A n t i b a c t e r i a l
A c t i v i t y o f
Hen
Egg W h i t e
Lysozyme a g a i n s t
L i s t e r i a monocytogenes
S c o t t A
i n Foods
V I R G I N I A
L .
HUGHEY,
PAMELA
A . W I L G E R , AND
E R I C A.
JOHNSON
D e p a r t m e n t o f
Food
M i c r o b i o l o g y
and
T o x i c o l o g y ,
U n i v e r s i t y
o f
W i s c o n s i n , 1 9 2 5
W i l l o w
D r i v e ,
M a d i s o n ,
W i s c o n s i n
5 3 7 0 6
R e c e i v e d 2 0 S e p t e m b e r
1 9 8 8 / A c c e p t e d 1 2
December 1 9 8 8
E g g w h i t e
lysozyme
k i l l e d
or
p r e v e n t e d g r o w t h
o f
L i s t e r i a monocytogenes
S c o t t A
i n
s e v e r a l
f o o d s . Lysozyme
was
more a c t i v e
i n v e g e t a b l e s
t h a n i n a n i m a l - d e r i v e d
f o o d s t h a t we t e s t e d .
For maximum
a c t i v i t y i n
c e r t a i n
f o o d s , E D T A was
r e q u i r e d i n
a d d i t i o n t o lysozyme.
Lysozyme
w i t h EDTA
e f f e c t i v e l y k i l l e d i n o c u l a t e d
p o p u l a t i o n s
o f
1 0 4 L . monocytogenes
per g
i n
f r e s h
corn, f r e s h
green b e a n s ,
s h r e d d e d
c a b b a g e , s h r e d d e d
l e t t u c e ,
a n d c a r r o t s d u r i n g
s t o r a g e
a t 5 C . C o nt r o l
i n c u b a t i o n s w i t h o u t
lysozyme s u p p o r t e d
growth o f L .
monocytogenes
t o
1 0 6 t o 1 0 7 / g .
L y s o z y m e h a d
l e s s a c t i v i t y i n a n i m a l - d e r i v e d
f o o d s ,
i n c l u d i n g f r e s h
pork sausage
( b r a t w u r s t )
a n d
Camembert
c h e e s e .
I n b r at w ur s t, lysozyme
w i t h E D T A
p r e v e n t e d
L . monocytogenes
f r o m
g r o w i n g
f o r 2 t o 3
w e e k s b u t d i d n o t
k i l l s i g n i f i c a n t
numbers o f
c e l l s
and
d i d n o t
p r e v e n t
e v e n t u a l
g r o w t h .
The
c o n t r o l
sausages
n o t
c o n t a i n i n g
lysozyme s u p p o r t e d
r a p i d a n d h e a v y
g r o w t h ,
w h i c h i n d i c a t e d t h a t
lysozyme
was b a c t e r i o s t a t i c
f o r
2
t o
3
w e e k s
i n
f r e s h
p o r k sausage. We
a l s o p r e p a r e d
Camembert
c h e e s e
c o n t a i n i n g
1 0 4
L . monocytogenes
c e l l s
p er
g a n d
i n v e s t i g a t e d
t h e
c h a n g e s
d u r i n g r i p e n i n g
i n
c h e e s e s
s u p p l e m e n t e d
w i t h
lysozyme
a n d
ED TA.
C h e e s e s
w i t h lysozyme
b y i t s e l f
or t o g e t h e r w i t h E D T A
r e d u c e d
t h e L . monocytogenes
p o p u l a t i o n
b y
- 1 0 - f o l d over
t h e
f i r s t
3 t o
4 w e e k s o f r i p e n i n g .
I n t h e
same
p e r i o d ,
t h e
c o n t r o l
c h e e s e
w h e e l s
w i t h o u t a d d e d
lysozyme
w i t h a n d
w i t h o u t c h e l a t o r
s l o w l y s t a r t e d
t o grow and e v e n t u a l l y
r e a c h e d 1 0 6 t o
1 0 7
CFU/g
a f t e r
5 5
d a y s
o f r i p e n i n g .
I n
t h e
l y s o z y m e - c o n t a i n i n g
c h e e s e s ,
h o w e v e r ,
L . monocytogenes
a l s o grew
a f t e r
3 t o
4
w e e k s o f c u r i n g ,
w h i c h
i n d i c a t e d t h a t lysozyme
was i n i t i a l l y
b a c t e r i o s t a t i c
b u t l a t e r a l l o w e d
g r o w t h
u n d e r
t h e
e x p e r i m e n t a l
c o n d i t i o n s . A s s a y o f lysozyme
s h o w e d
t h a t lysozyme was
s t i l l a c t i v e
i n C a m e m b e r t ;
t h e r e f o r e ,
c h a n g e s
d u r i n g
r i p e n i n g i n
t h e c h e e s e or i n t h e b a c t e r i u m
p r o b a b l y overcame
t h e
i n h i b i t o r y a c t i v i t y
o f
lysozyme.
I n
c o n c l u s i o n , r e s u l t s o f
t h i s s t u d y s u g g e s t
t h a t eg g
w h i t e
lysozyme
c o u l d
b e u s e f u l
as a
p r e s e r v a t i v e
t o
p r o t e c t
a ga i n st L .
monocytogenes c o n t a m i n a t i o n
i n
s e v e r a l f o o d s , e s p e c i a l l y
t h o s e p r e p a r e d
f r o m
f r e s h v e g e t a b l e s .
T h e f o u r m a j o r
o u t b r e a k s
o f l i s t e r i o s i s t h a t
h a v e
o c c u r r e d
s i n c e
1 9 8 1
( 2 ,
4 , 1 0 , 1 9 )
h a v e p r o v e n
L i s t e r i a m o n o c y t o g e n e s
t o
b e a n
i m p o r t a n t
p a t h o g e n .
T h e i n c i d e n t s
t h a t o c c u r r e d
i n
Nova
S c o t i a
i n
1 9 8 1 ,
L o s
A n g e l e s
i n
1 9 8 5 ,
a n d
V a u d ,
S w i t z e r l a n d ,
i n
1 9 8 8
c o n f i r m e d b y
means
o f
e p i d e m i o l o g i c a l
a n d
m i c r o b i o l o g i c a l
e v i d e n c e
t h a t L . m o n o c y t o g e n e s
was
t r a n s m i t t e d b y
p a r t i c u l a r
f o o d s ( 2 8 ) .
I n t h e B o s t o n i n c i d e n t
( 4 ) , e p i d e m i o l o g i c a l
e v i d e n c e s u g g e s t e d p a s t e u r i z e d
w h o l e
m i l k a s t h e
v e h i c l e ,
b u t
m i c r o b i o l o g i c a l
c o n f i r m a t i o n
was
n o t
o b t a i n e d . T h e s e c a r e f u l l y
i n v e s t i g a t e d
o u t b r e a k s
h a v e
c l e a r l y
d e m o n s t r a t e d
t h a t
L .
m o n o c y t o g e n e s
c a n
b e t r a n s -
m i t t e d
i n
f o o d s .
I n a d d i t i o n
t o
t h e s e
p r o v e n
o u t b r e a k s ,
o t h e r
l i s t e r i o s e s
h a v e o c c u r r ed
i n w h i c h
e p i d e m i o l o g i c a l
o r m i c r o -
b i o l o g i c a l
e v i d e n c e w as
u n s a t i s f a c t o r y
t o
p r o v e
f o o d - b o r n e
t r a n s m i t t a l ( 2 8 ) .
One
o f t h e
f i r s t w e l l - d e s c r i b e d
f o o d - r e l a t e d
o u t b re ak s o f l i s t e r i o s i s
o c c u r r e d
i n 1 9 7 9 i n
a
B o s t o n
h o s p i t a l ,
w h e n 2 0 p a t i e n t s d e v e l o p e d
l i s t e r i o s i s
p r o b a b l y b y
e a t i n g
r a w
c e l e r y , t o m a t o e s ,
a n d
l e t t u c e
8 . D e s p i t e
t h e l a c k o f
c o n f i r m i n g
e v i d e n c e
i n
many
o b s e r v e d l i s t e r i o s e s ,
t h e
a v a i l -
a b l e
d a t a
i n d i c a t e
t h a t
o c c u r r e n c e
o f f o o d - b o r n e
l i s t e r i o s i s
i s
i n c r e a s i n g
i n
s e v e r a l
c o u n t r i e s
( 2 8 ) .
F o o d - b o r n e
t r a n s m i s s i o n
o f l i s t e r i o s i s
t o
humans
p r o b a b l y
o c c u r s m ai n l y t h r o u g h
e n v i r o n m e n t a l
c o n t a m i n a t i o n
b e -
c a u s e o f
t h e
uncommon
a b i l i t y
o f
L .
m o n o c y t o g e n e s
t o
c o l o n i z e
a n i m a l s a n d
f o o d c o n t a c t
s u r f a c e s
f r o m
e n v i r o n -
m e n t a l s o u r c e s
( 1 6 ,
2 6 ,
2 8 ) .
L .
m o n o c y t o g e n e s
i s
w i d e s p r e a d
i n t h e e n v i r o n m e n t a n d
h a s b e e n
i s o l a t e d
b y
e n r i c h m e n t
t e c h n i q u e s
f r o m many s o u r c e s ,
i n c l u d i n g
s e w a g e ,
v e g e t a b l e
*
C o r r e s p o n d i n g
a u t h o r .
6 3 1
m a t t e r ,
s o i l ,
s t r a w ,
s i l a g e , d u s t ,
m i l k , a n d
t h e
f e c e s o f
h e a l t h y
a n i m a l s a n d
h u m a n s
( 3 ,
7 ,
1 3 ,
2 5 ,
2 7 ) .
A l t h o u g h
l i s t e r i o s i s
was o n c e
b e l i e v e d
t o b e m a i n l y
a z o o n o s i s ,
many
e x p e r t s
no w
t h i n k
t h a t
i t
c o n t a m i n a t e s
f o o d m o s t l y
f r o m
e n v i r o n m e n t a l
s o u r c e s
( 2 8 ) .
M i c r o b i o l o g i c a l
s u r v e y s
o f f o o d s
a n d
f o o d - p r o c e s s i n g
p l a n t s
h a v e s h o w n
t h a t
t h e
p a t h o g e n
i s
t h o r o u g h l y
s p r e a d
i n
t h e f o o d
s u p p l y
a n d i n
f o o d - p r o c e s s i n g
p l a n t s
( 1 6 ,
2 6 ,
2 8 ) .
L .
m o n o c y t o g e n e s
h a s b e e n i s o l a t e d
f r o m raw
m i l k
( 1 , 5 , 1 6 ) ,
c h e e s e s
( 1 , 2 , 1 0 ,
1 6 , 2 4 , 2 8 ) , e g g s ( 1 7 ) ,
v e g e t a b l e s ( 1 7 , 2 8 ) ,
p r e p a r e d
s a l a d s
( 1 7 ,
2 2 ) ,
m e a t a n d
p o u l t r y
p r o d u c t s ( 6 ,
7 ,
1 6 ,
1 9 ) ,
a n d
s e a f o o d s
( 1 6 , 2 8 ) .
I n a d d i t i o n t o
i t s i n h e r e n t c o n t a m i n a t i o n
o f
many f o o d s ,
L .
m o n o c y t o g e n e s
s e e m s
t o h a v e a n
e x c e p t i o n a l
a b i l i t y
t o
c o l o n i z e
p a s t e u r i z e d
o r
p r o c es s e d p r o d u ct s
a n d t o
b e
t r a n s -
m i t t e d
o n - l i n e b y
p r o c e s s i n g m a c h i n e r y ,
s u c h a s
d u r i n g
s l i c i n g
o f
m e a t s
o r
v e g e t a b l e s ,
f i l l i n g
o f i c e
cream
c o n t a i n e r s ,
o r
p r e p a r a t i o n
o f
s a l a d s
( 1 4 , 1 6 , 2 8 ) .
I n a
s u r v e y
c o n d u c t e d
b y
t h e
U . S .
F o o d
a n d
D r u g
A d m i n i s t r a t i o n
b e g i n n i n g
i n
1 9 8 6 ,
2 . 5
o f
3 5 7
d a i r y p r o c e s s i n g
p l a n t s
were f o u n d t o
h a v e
p r o d u c t s
c o n t a i n i n g
L .
m o n o c y t o g e n e s
5 ,
1 6 ) .
P o s t p a s t e u r -
i z a t i o n
c o n t a m i n a t i o n
w as
t h o u g h t
t o
b e
m a i n l y
r e s p o n s i b l e
f o r
c o n t a m i n a t i o n .
L .
m o n o c y t o g e n e s
c a n
g r o w
a t
t e m p e r a -
t u r e s
o f
1
t o
4 5 C ( 2 0 ) ,
a n d
r e f r i g e r a t i o n
a l o n e
i s
n o t s u f f i c i e n t
t o
p r e v e n t
g r o w t h
i n
f o o d s .
I t c a n
w i t h s t a n d
25
N a C l a n d
a c i d i c
pHs
f o r s e v e r a l
m o n t h s
( 2 1 ) .
The
p r e s e n c e
o f
L .
m o n o c y t o g e n e s
i n
r aw
a n d c e r t a i n
p r o c e s s e d
f o o d s
may
b e
c u r r e n t l y
u n a v o i d a b l e
( 2 8 ) .
S a f e t y
o f
a
f o o d
f r o m
L .
m o n o c y t o g e n e s
d e p e n d s
on
m e e t i n g
t h r e e
p r o c e s s i n g
c r i t e r i a
( 1 4 ) : i
e l i m i n a t i n g
t h e
-
8/10/2019 Antibacterial Activity of Hen Egg White Lysozyme Against
2/8
6 3 2
HUGHEY
E T A L .
o r g a n i s m
t o t h e
h i g h e s t
a c h i e v a b l e e x t e n t
b y p a s t e u r i z a t i o n
or
o t h e r
p r o c e s s i n g
m e t h o d s ,
i i a v o i d i n g
r e c o n t a m i n a t i o n ,
a n d
i i i a d d i n g
n e e d e d
a n t i m i c r o b i a l
p r o t e c t i o n
when
i n t r i n -
s i c
p r o t e c t i o n
i s
i n a d e q u a t e .
I f r e c o n t a m i n a t i o n o f
a
f o o d
d o e s
o c c u r ,
a
s e c o n d a r y
p r e s e r v a t i v e
i s
h i g h l y
d e s i r e d .
O u r
l a b o r a t o r y
showed e a r l i e r
( 9 )
t h a t
eg g
w h i t e
lysozyme
k i l l e d
f o u r
p a t h o g e n i c
s t r a i n s
o f
L .
monocytogenes
i n c u l t u r e
media a n d i n
b u f f e r .
We h a v e e x t e n d e d our
t e s t s
t o
f o o d s
a n d
show
i n
t h i s
s t u d y
t h a t
l y s o z y m e
i s
e f f e c t i v e
i n
k i l l i n g
or
p r e v e n t i n g g r o w t h
o f
L .
monocytogenes
S c o t t
A
i n
s e v e r a l
f o o d s .
M A T E R I A L S
A N D
M E T H O D S
M a t e r i a l s . The sources
o f
eg g
w h i t e
lysozyme,
M i c r o c o c -
cus
l u t e u s ,
a n d
o t h e r m at e ri a l s were t h e
same
as
p r e v i o u s l y
d e s c r i b e d
9 .
O r g a n i s m s .
L .
monocytogenes
S c o t t A was
p r o v i d e d
b y E .
H .
M a r t h ,
U n i v e r s i t y
o f
W i s c o n s i n ,
M a d i s o n .
T h i s
s t r a i n
i s
b e i n g
u s e d
b y
t h e
I n t e r n a t i o n a l
D a i r y
F e d e r a t i o n
( g r o u p
E 6 4 )
f o r
d e v e l o p m e n t
o f m e t h o d s t o
d e t e c t
a n d
e n u m e r a t e
L .
monocytogenes
i n
f o o d s
( I n t e r n a t i o n a l
D a i r y
F e d e r a t i o n ,
group
E 6 4 ,
D e t e c t i o n
a n d E n u m e r a t i o n o f L . monocyto-
g e n e s ) .
P e n i c i l l i u m
c a m e m b e r t i was u s e d f o r s u rf ac e r i p en i ng
o f
c h e e s e ;
i t was
o r i g i n a l l y
s u b c u l t u r e d f r o m
t h e
K e n n e t h
R a p e r
c u l t u r e
c o l l e c t i o n i n
t h e
D e p a r t m e n t o f B ac t er io l o g y ,
U n i v e r s i t y
o f
W i s c o n s i n ,
M a d i s o n . S p o r e s
were p r o d u c e d
b y
2 -
t o
4 - w e e k
g r o w t h
a t
2 5 C
on
p o t a t o
d e x t r o s e agar.
B a c t e r i a l
m ed i a, g r o w t h ,
a n d e n u m e r a t i o n .
L . monocyto-
genes
was
r o u t i n e l y
grown
i n s t a t i c
c u l t u r e
i n
b r a i n
h e a r t
i n f u s i o n b r o t h
( D i f c o
L a b o r a t o r i e s ,
D e t r o i t , M i c h . )
a t
3 7 C .
Growth
i n
c u l t u r e m e d i a was m e a s u r e d
b y o p t i c a l
d e n s i t y
a t
5 0 0 nm
i n
a
S p e c t r o n i c
2 0
s p e c t r o p h o t o m e t e r
( B a u s c h
Lomb, I n c . ,
R o c h e s t er , N . Y . ) . O p t i c a l
d e n s i t y
v a l u e s
o f 0 . 1
a n d
1 . 0
r e p r e s e n t
v i a b l e
c e l l c o u n t s
o f
2 . 7
x
1 0 8
a n d 2 . 0
x
1 0 9 ,
r e s p e c t i v e l y ( J e a n
S c h o en i , p e r so n al
c o m m u n i c a t i o n ) .
For
g r o w t h
s t u d i e s
i n
f o o d s ,
L .
monocytogenes
S c o t t A
was f i r s t
c u l t u r e d i n b ra i n h e a r t i n f u s i o n b r o t h a t 3 7 C
a n d
i n o c u l a t e d i n t o t h e
f o o d s
a t
a
p r e d e t e r m i n e d
c o n c e n t r a t i o n
o f c e l l s .
T o
a d e q u a t e l y
m o n i t o r
l o s s o f v i a b i l i t y ,
we u s u a l l y
u s e d
1 0 4
c e l l s
p er g o f
f o o d .
A l l
f o o d i n c u b a t i o n s
were d o n e
i n
d u p l i c a t e ,
a n d
2 5 - g s a m p l e s o f f o o d s
w e r e s a m p l e d a n d
a n a l y z e d
i n d e p e n d e n t l y
f o r L .
monocytogenes.
L .
monocytogenes
was e n u m e r a t e d
b y
d i r e c t
p l a t i n g
on
l i t h i u m
c h l o r i d e - p h e n y l e t h a n o l - m o x a l a c t a m
a ga r
as d e -
s c r i b e d
p r e v i o u s l y ( 1 1 ,
1 2 )
e x c e p t t h a t g l y c i n e
was
u s e d
i n
p l a c e
o f
g l y c i n e
a n h y d r i d e . F o o d
s a m p l e s ( 2 5
g ) were
p l a c e d
i n
s t e r i l e
p l a s t i c
s t o m a c h e r b a g s
( m o d e l 4 0 0 ;
S e w a r d M e d i c a l
C o . ,
L o n d o n ,
U n i t e d
K i n g d o m ) ,
a n d
2 2 5
m l o f
L i s t e r i a
e n r i c h m e n t
b r o t h
( s e e
b e l o w
f o r
c o m p o s i t i o n )
was
a d d e d .
T h e
s a m p l e s
were
h o m o g e n i z e d
i n a s t o m a c h e r
( S t o m a c h e r
La b
B l e n d e r ,
m o d e l
4 0 0 ; Tekmar
C o . ,
C i n c i n n a t i , O h i o ) f o r
2
m i n . P o rt i o ns o f
0 . 1
m l
were
p l a t e d on
1 0 l i t h i um c h l o r i d e -
p h e n y l e t h a n o l - m o x a l a c t a m
p l a t e s .
When
c e l l s
were
present
i n
h i g h
n u m b e r s
( _ 1 0 4 / g ) , s a m p l e s
were s e r i a l l y
d i l u t e d i n
0 . 0 1
M
p h o s p h a t e
b u f f e r
( p H
7 . 2 ) , a n d
0 . 1
m i
was p l a t e d
on
d u p l i c a t e p l a t e s .
The
p l a t e s were i n c u b a t e d
a t
3 0 C
f o r
5
to
7
d a y s .
E n r i c h m e n t s
were a l s o p e r f o r m e d
t o
d e t e c t
very
low
numbers
o f L .
monocytogenes.
We m o d i f i e d
t h e e n r i c h m e n t
p r o c e d u r e
o f
M c C l a i n
a n d L e e ( 1 2 ) b y i n c u b a t i n g
c u l t u r e s
f o r
5
t o 7
d a y s
i n
t h e s t o m a c h e r b a g s
a t
3 0 C .
L i s t e r i a
e n r i c h m e n t
b r o t h
( 1 2 )
c o n s i s t e d
o f
t h e f o l l o w i n g ( p e r
l i t e r ) :
p r o t e o s e p e p t o n e
( D i f c o ) , 5 g; tryptone
( D i f c o ) ,
5
g;
La b
Lemco
p o w d e r ( O x o i d
L t d . , C o l u m b i a ,
M d . ) ,
5
g; yeast
e x t r a c t
( D i f c o ) ,
5
g ;
N a C I ,
2 0
g ; N a 2 H P O 4 ,
1 2
g ;
K H 2 P O 4 ,
1 . 3 5
g ; e s c u l i n ( S i g m a
C h e m i c a l
C o . ,
S t .
L o u i s , M o . ) ,
1
g ;
a n d n a l i d i x i c
a c i d
( s o d i u m
s a l t ;
S i g m a ) ,
2 0
m g .
A c r i f l a v i n e
h y d r o c h l o r i d e ( S i g m a ) ( 1 2 m g / l i t e r )
was f i l t e r s t e r i l i z e d
a n d
a d d e d t o
t h e m e d i u m
a f t e r
a u t o c l a v i n g .
F o r
p r i m a r y
e n r i c h -
m e n t , t h e
f o o d
h o m o g e n a t e s
i n
t h e s t o m a c h e r
b a g s
were
i n c u b a t e d
a t
3 0 C
f o r
5
t o
7
d a y s .
T h e n 0 . 1 - m l
p o r t i o n s
o f
t h e
e n r i c h m e n t s
w e r e i n o c u l a t e d i n t o
1 0
m l
o f L i s t e r i a
e n r i c h -
m e n t
b r o t h
p l u s
a c r i f l a v i n e
h y d r o c h l o r i d e
( 2 5
m g / l i t e r )
a n d
i n c u b a t e d
f o r
5
t o
7
d a y s
a s
a
s e c o n d a r y
e n r i c h m e n t .
T h e s e
s a m p l e s
w e r e s t r e a k e d
d i r e c t l y
o n
l i t h i u m
c h l o r i d e - p h e -
n y l e t h a n o l - m o x a l a c t a m
p l a t e s
a n d
a l s o
t r e a t e d
w i t h KOH
s o l u t i o n ( 1 2 )
t o
s e l e c t f o r L .
m o n o c y t o g e n e s .
T o c o n f i r m i d e n t i f i c a t i o n ,
f i v e
p r e s u m p t i v e
c o l o n i e s
p e r
s a m p l e
w e r e
e x a m i n e d
f o r v a r i o u s
p h e n o t y p i c
c h a r a c t e r i s -
t i c s , i n c l u d i n g
l a c k
o f p i g m e n t a t i o n ,
m o r p h o l o g y
o n
t r y p t o s e
a g a r ,
a n d p o s i t i v e c a t a l a s e t e s t .
T h r e e o f
t h e c o l o n i e s
w e r e
t h e n
t e s t e d
f o r
c h a r a c t e r i s t i c
e n d - o v e r - e n d
t u m b l i n g
m o t i l i t y
i n t r y p t o s e
b r o t h a t
a m b i e n t
t e m p e r a t u r e a n d f o r
u m b r e l l a
m o t i l i t y j u s t b e l o w
t h e
s u r f a c e
i n
m o t i l i t y
t e s t m e d i u m
( D i f c o )
a t
a m b i e n t
t e m p e r a t u r e a n d
a t
3 7 C . O n e c o l o n y
p e r
f o o d s am p l e w a s f u r t h e r t e s t e d
f o r
a
p o s i t i v e
m e t h y l
r e d
r e a c t i o n i n
MRVP m e d i u m ( D i f c o ) , f o r e s c u l i n
h y d r o l y s i s
i n
b i l e - e s c u l i n
a g a r
( D i f c o ) ,
a n d
f o r
r e d u c t i o n
o f l i t m u s
m i l k
( D i f c o )
a f t e r 2
d a y s
a t
3 0 C . S e r o l o g i c a l a n a l y s i s
w a s a l s o
p e r f o r m e d ,
u s i n g
L i s t e r i a 0 a n t i s e r u m t y p e 4 ( D i f c o ) . L i s t -
e r i a
0
a n t i g e n ( t y p e
4 ; D i f c o ) w a s u s e d a s a p o s i t i v e
c o n t r o l .
We a l s o t e s t e d
- 1 5
i s o l a t e s
f r o m t h e
b r a t w u r s t e x p e r i m e n t
f o r a c i d p r o d u c t i o n i n p u r p l e
b r o t h ( D i f c o )
c o n t a i n i n g
0 . 5
( w t / v o l ) g a l a c t o s e , s o r b i t o l , m a n n i t o l , d u l c i t o l ,
m a l t o s e ,
r h a m n o s e , x y l o s e , g l u c o s e ,
l a c t o s e ,
a n d
m e l e z i t o s e , a n d
we
f o u n d t h a t t h e p a t t e r n o f a c i d
f o r m a t i o n
w a s t h e
s a m e
a s
f o r
S co t t A .
F o o d s t u d i e s . S e v e ra l f o o d s w e r e
u s e d
a s
s u b s t r a t e s
f o r
L .
m o n o c y t o g e n e s .
I n a l l f o o d s , we t e s t e d
f o u r c o n d i t i o n s :
i
c o n t r o l
( n o a d d i t i o n s ) ; i i l y s o z y m e ,
1 0 0 m g / k g ;
i i i
EDTA,
5
mM ( e x c e p t f o r C a m e m b e r t , w h i c h h a d
1
m M ) ;
a n d
( i v )
l y s o z y m e
p l u s EDTA.
I n
e a c h
e x p e r i m e n t ,
f o o d s
w e r e
p r e p a r e d a n d i n d i v i d u a l l y p l a c e d
i n s e v e r a l c o n t a i n e r s
f o r
i n c u b a t i o n .
Tw o
c o n t a i n e r s
( d u p l i c a t e
s a m p l e s )
w e r e
t e s t e d
a t
e a c h
t i m e
p o i n t
o f
s a m p l i n g . A l l f o o d s a m p l e s
w e r e
i n c u b at e d w i t h
a n d w i t h o u t e x p e ri m en t al l y i n o c u l a t e d
L .
m o n o c y t o g e n e s t o
e x a m i n e f o r
n a t u r a l
c o n t a m i n a t i o n .
F o o d s w e r e q u a l i t a t i v e l y e x a m i n e d
a t t h e
c o n c l u s i o n s
o f
t h e
e x p e r i m e n t s
f o r
l y s o z y m e
a c t i v i t y . M .
l u t e u s
d r i e d
c e l l s
( 0 . 2 5 m g / m l ; S i g ma )
w e r e
s u s p e n d e d
i n 2 . 9- ml p o rt i o ns
o f
0 . 0 6 7
M
p h o s p h a t e b u f f e r
( p H 6 . 6 ) . F o o d s a m p l e s
w e r e
d i l u t e d
1 0 - f o l d
w i t h b u f f e r a n d
a d d e d
t o t h e M.
l u t e u s
s u s p e n s i o n .
T h e d e c r e a s e i n A 5 4 0 w a s
m e a s u r e d
a f t e r 2
h .
A
m a r k e d d e c r e a s e i n
a b s o r b a n c e
c o m p a r e d
w i t h
t h a t
s e e n
i n
t h e
f o o d
s a m p l e s
w i t h o u t a d d e d
l y s o z y m e
i n d i c a t e d
t h a t
l y s o z y m e a c t i v i t y
w a s p r e s e n t . A l s o , f r e s h l y s o z y m e ( 1
t o 3
p p m [ 1 t o 3
, u g / m l ] ) w a s t e s t e d
i n
b u f f e r f o r c o m p a r i s o n
a n d
i n f o o d s w i t h o u t a d d e d l y s o zy m e
t o
a s c e r t a i n
t h a t
i n h i b i t i o n
w a s n o t o c c u r r i n g .
T h e
p H o f e a c h f o o d
s a m p l e
w a s e s t i -
m a t e d a f t e r 1 0
g
o f f o o d
w a s
h o m o g e n i z e d
i n
9 0 m l
o f
d i s t i l l e d
w a t e r .
P r e p a r a t i o n s
o f
f o o d s .
F r e s h
l e t t u c e h e a d s f r o m
a l o c a l
m a r k e t w e r e c o a r s e l y
s h r e d d e d a n d d i v i d e d i n t o
1 , 8 0 0 - g
p o r t i o n s .
L y s o z y m e
w a s
d i s s o l v e d i n
2 5
m l
o f 6 7
mM
p h o s p h a t e b u f f e r
( p H
6 . 6 ) , a n d E D T A ( t e t r a s o d i u m
s a l t ;
S i g m a )
w a s d i s s o l v e d i n
2 5 m l o f d i s t i l l e d w a t e r .
T h e
s o l u t i o n s
w e r e s p r i n k l e d o n t o t h e 1 , 8 0 0 - g p o r t i o n s
o f l e t t u c e .
T h e
f i n a l
c o n c e n t r a t i o n s
o f
l y s o z y m e
a n d E D T A
w e r e
1 0 0
m g / k g
a n d 5
mM ,
r e s p e c t i v e l y . L .
m o n o c y t o g e n e s
w a s
d i l u t e d
a n d p l a c e d i n 2 5
m l
o f 6 7 mM
p h o s p h a t e
b u f f e r a t
a
A P P L . E N V I R O N .
M I C R O B I O L .
-
8/10/2019 Antibacterial Activity of Hen Egg White Lysozyme Against
3/8
LYSOZYME
AC TIVITY
A G A I N S T L .
MONOCYTOGENES IN F O O D S
6 3 3
c o n c e n t r a t i o n t o
g i v e
a p p r o x i m a t e l y 1 0 4 C F U / g o f l e t t u c e .
T h e
l e t t u c e w a s t h e n w e l l m i x e d
b y
h a n d .
P o r t i o n s
o f
1 0 0 g
w e r e
p l a c e d
i n
8 - o z
( c a . 2 2 7 - g )
p o l y s t y r e n e c o n t ai n e rs ( M il e s
S c i e n t i f i c ,
D i v . M i l e s L a b o r a t o r i e s , I n c . ,
N a p e r v i l l e ,
I l l . ,
a n d t h e
c o n t a i n e r s w e r e i n cu b at e d a t 5 C . D u p l i c a t e
c o n t a i n -
e r s w e r e
s a m p l e d f o r
L .
m o n o c y t o g e n e s a f t e r 0 , 3 ,
7 ,
a n d 1 2
d a y s .
F r e s h
g r e e n c a b b a g e o b t ai n ed
f r o m a l o c a l m a r k e t w a s
p r o c e s s e d
a s
d e s c r i b e d
a b o v e
f o r
l e t t u c e .
D u p l i c a t e
c o n t a i n
e r s w e re s a m p l e d a f t e r 0 , 3 , 7 , 1 2 , 2 0 , 2 7 , 3 4 , 4 1 , a n d 4 8 d a y s .
F r e s h e a r s o f s w e e t c o rn w e r e o b t a i n e d a t
a
l o c a l
m a r k e t ,
a n d k e r n e l s
w e r e
r e m o v e d .
P r o c e d u r e s
f o r
l y s o z y m e ,
EDTA, a n d L . m o n o c y t o g e n e s a d d i t i o n s a n d s a m p l i n g s w e r e
a s
d e s c r i b e d
a b o v e f o r
l e t t u c e .
S a m p l e s w e r e t a k e n a f t e r 0 ,
2 ,
4 ,
9 , 1 1 , a n d 1 5 d a y s .
F r e s h
g r e e n
b e a n s
w e r e
o b t a i n e d f r o m a
l o c a l
m a r k e t
a n d
w e r e s n a p p e d b y h a n d i n t o p i e c e s 1 t o 1 . 5 i n . ( c a . 2 . 5 t o 3 . 8
c m )
l o n g .
O t h e r
p r o c e d u r e s
w e r e
a s
d e s c r i b e d a b o v e
f o r
l e t t u c e . S a m p l e s w e r e t a k e n a f t e r 0 , 2 , 5 , 7 ,
9 ,
a n d
1 5
d a y s .
F r e s h c a r r o t s w e re p ro c es s ed
a s
d e s c r i b e d
f o r
f r e s h
l e t -
t u c e
e x c e p t
t h a t a n i n o c u l u m
o f
1 0 3
C F U
o f
L .
m o n o c y t o -
g e n e s p e r
g
w a s u s e d . S a m p l e s w e r e t a k e n o n
d a y s
0 , 2 , 5 , 9 ,
a n d
1 6 .
F r o z e n
c o r n
a n d f r o z e n
g r e e n
b e a n s
w e r e t r e a t e d
a s
d e s cr i b ed a b o v e .
C o r n s a m p l e s w e r e
t a k e n o n
d a y s
0 , 2 , 4 , 7 ,
a n d
1 0 ;
g r e e n
b e an s w e re
s a m p l e d
a f t e r
0 , 4 , 7 ,
a n d
1 1
d a y s .
F o r b r a t w u r s t
s a m p l e s , c o a r s e l y g r o u n d
f r o z e n
p o r k
t r i m
( 2 5
t o 3 0 f a t )
was o b t a i n e d f r o m t h e
D e p a r t m e n t
o f M u s c l e
B i o l o g y , U n i v e r s i t y
o f
W i s c o n s i n ,
M a d i s o n . S e m i t h a w e d
m e a t
( 1 5 - l b [ c a . 6 . 8 - k g ] s a m p l e s )
w a s
p l a c e d i n a
B u f f a l o
M i x e r
( J o h n
E . S m i t h s
S o n s C o . , B u f f a l o ,
N . Y . ) ;
a n
i c e
s l u r r y
( 7 5 0
m l )
a n d
1 3 6
g
o f b r at w u rs t
s p i c e ( F .
W. W i t t a n d
C o . ,
Y o r k v i l l e ,
I l l .
w e r e
a l s o
a d d e d . T h e n 1 0 0
m l e a c h o f
d i s t i l l e d w a t e r
w i t h
o r
w i t h o u t E D T A
( 5 mM,
f i n a l c o n c e n -
t r a t i o n )
a n d
6 7
mM
p h o s p h a t e
b u f f e r
w i t h o r w i t h o u t
l y s o -
zyme ( 1 0 0 p p m ,
f i n a l
c o n c e n t r a t i o n )
was
a d d e d ,
a n d L .
m o n o c y t o g e n e s
w as
i n o c u l a t e d
t o
1 0 4 / g .
T h e
s a m p l e s
were
m i x e d
f o r
4
m i n
w i t h i n t e r m i t t e n t
s t o p s
t o s h i f t
t h e
m e a t .
T h e
m e a t
was
t h e n g r o u n d
a n d
s t u f f e d i n t o
r i n s e d 3 2 - t o 35-mm
n a t u r a l
h o g
c a s i n g s
( V i s t a I n t e r n a t i o n a l
P a c k a g i n g ,
K e n o -
s h a ,
W i s . )
w i t h
a
h a n d - c r a n k e d
s t u f f i n g
m a c h i n e .
H a n d -
t w i s t e d l i n k s
( - 6
i n .
[ - 1 5 c m ] )
w e r e c u t
a p a r t
a n d vacuum
p a c k a g e d
i n
6 . 5 - b y - 1 2 - i n . ( c a .
1 6 . 5 - b y - 3 0 . 5 - c m )
C u r l o n
( g r a d e 5 5 0 ) vacuum b a g s
( C u r w o o d , I n c . , C h i c a g o ,
I l 1 .
i n
p o r t i o n s
o f 0 . 7 5
t o
1 l b
( c a .
0 . 3 4
t o 0 . 4 5 4
k g ) .
T h e
s p i c e
m i x
w a s f o r m u l a t e d s u c h t h a t
t h e
p r e p a r e d s a u s a g e s
c o n t a i n e d
a p p r o x i m a t e l y
2 0
o z
( c a .
5 6 7
g )
o f
N a C l
p e r
1 0 0
l b
( c a .
4 5 . 4
k g )
o f m e a t
( F .
W.
W i t t ,
p e r s o n a l c o m m u n i c a t i o n ) .
T h r o u g h -
o u t
p r e p a r a t i o n
o f
t h e
s au s ag e s , r ea g e n t s
a n d
e q u i p m e n t
w e r e
k e p t
c o l d
a n d
h a n d l i n g
w as
m i n i m i z e d t o
k e e p
t h e f a t
a n d
m u s c l e
p a r t i c u l a t e .
T h e
p a c k a g e s
o f
l i n k s
were s t o r e d a t
5 C
f o r t h e
d u r a t i o n
o f
t h e
e x p e r i m e n t .
D u p l i c a t e p a c k a g e s
w e r e
e x a m i n e d
f o r L .
m o n o c y t o g e n e s
a s
d e s c r i b e d
a b o v e
a f t e r
0 ,
2 ,
6 ,
9 , 1 5 , 2 3 , 3 3 , 3 7 ,
a n d 4 4
d a y s .
C a m e m b e r t
c h e e s e
was
p r e p a r e d
a c c o r d i n g
t o
a s t a n d a r d
p r o t o c o l
f r o m
t h e
C h e e s e
R e s e a r c h
I n s t i t u t e
( c o u r t e s y
o f
Mark
J o h n s o n ,
C h e e s e
R e s e a r c h
I n s t i t u t e ,
U n i v e r s i t y
o f
W is c o ns i n, M a d i s o n) . S a f e t y p r e c a u t i o n s
i n
p r e p a r a t i o n
o f
t h e c h e e s e w i t h L .
m o n o c y t o g e n e s
were f o l l o w e d
a s d e -
s c r i b e d
b y R y s e r
a n d
M a r t h
( 1 8 ) .
F r e s h
p a s t e u r i z e d
w h o l e
m i l k
( - 6 0
l b
[ - 2 7 k g ] )
w a s
o b t a i n e d f r o m
t h e
U n i v e r s i t y
D a i r y
P l a n t .
T h e
m i l k w as
p l a c e d
i n a
s m a l l
c h e e s e
v a t ,
a n d t h e
t e m p e r a t u r e
w a s
a d j u s t e d
t o
3 3 C .
A
1 0 - m l
amount
o f
S u p e r s t a r t
s t a r t e r
c u l t u r e
( M i l e s
L a b o r a t o r i e s ,
I n c . , M a d i s o n , W i s . )
a n d 6
m l
o f
M a r z y m e s i n g l e - s t r e n g t h
m i c r o b i a l
r e n n e t
( M i l e s )
were
a d d e d .
L y s o z y m e
i n
6 7 mM
p h o s p h a t e
b u f f e r
a n d
E D T A i n
d i s t i l l e d
w a t e r
were a d d e d t o
d e s i g n a t e d
v a t s
a t 1 0 0
m g / k g
a n d 1
mM , r e s p e c t i v e l y ( 1
mM i n s t e a d o f 5
mM E D T A w a s
u s e d
b e c a u s e
t h e
h i g h e r
c o n c e n t r a t i o n i n h i b i t e d
c u rd f o r ma -
t i o n .
F i n a l l y ,
L .
m o n o c y t o g e n e s
w a s
s u s p e n d e d
i n 1 0
m l
o f
s t e r i l e
s k i m
m i l k
a n d
a d d e d a t
1 0 4
CFU/ml t o
d e s i g n a t e d
b a t c h e s . T h e c o n t e n t s
o f t h e
v a t s
were w e l l
m i x e d
w i t h
a
s t r a i n i n g s p o o n ,
a n d c u r d
w a s
a l l o w e d
t o f o r m f o r
5 0
m i n .
T h e
c u r d
w a s
c u t
i n t o 0 . 7 5 - i n .
( c a .
1 . 9 - c m )
c u b e s
w i t h
c h e e s e
k n i v e s
a n d a l l o w e d t o h e a l f o r 1 5
t o 2 0
m i n
w h i l e
b e i n g
f r e q u e n t l y
s t i r r e d . T h e
c u r d s we re
p o u r e d
i n t o 1 2 c h e e s e
h o o p s 5
a n d
0 . 5
i n .
[ c a .
1 2 . 7 a n d
1 . 3
c m ] ) ,
w h i c h we re
p l a c e d
on a
d r a i n i n g
b o a r d c o v er ed
w i t h
c h e e s e c l o t h .
T h e
h o o p s
were
c o v e r e d
w i t h c h e es e c l o t h
a n d
t u r n e d
a f t e r
1 a n d
5
h . T h e c o v e r e d
c h e e s e w h e e l s
were
l e f t
o v e r n i g h t
a t
a m b i e n t
t e m p e r a t u r e ,
a n d
t h e n e x t
m o r n i n g
t h e y
were
c o a t e d w i t h c h e e s e s a l t t o a c h i e v e a s a l t
c o n t e n t o f
- 2 . 5 o .
T h e
w h e e l s were
l e f t
c o v e r e d a t
5 C
on
t h e s e c o n d
n i g h t .
On
t h e t h i r d
m o r n i n g ,
t h e w h e e l s were
d i p p e d
i n t o 1 0 0
m l
o f
s t e r i l e s a l i n e
c o n t a i n i n g
P .
c a m e m b e r t i
s p o r e s .
T h e
c h e e s e
w h e e l s were
p l a c e d
on a
c l e a n e d
d r a i n i n g b o a r d ,
c o v e r e d
w i t h f r e s h
c h e e s e c l o t h ,
a n d
i n c u b a t e d
i n
t h e
U n i v e r s i t y
o f
W i s c o n s i n B i o t r o n
f a c i l i t y
i n an
i n c u b a t o r h e l d
a t
1 5 C
a n d
9 0 t o 95
r e l a t i v e
h u m i d i t y .
T h e
w h e e l s
w e r e
t u r n e d
e v e r y
1
t o
2
d a y s
f o r
1 4
d a y s ,
a t
w h i c h
t i m e
t h e w h e e l s
were
i n d i v i d u a l l y w r a p p e d
i n a l u m i n u m f o i l
a n d
s t o r e d a t
5 C
f o r
t h e d u r a t i o n
o f t h e
e x p e r i m e n t .
T h e c u r d s
were
s a m p l e d
on
d a y 0 ,
a n d
d u p l i c a t e
s l i c e s
we re
t a k e n
f r o m
s i n g l e
w h e e l s o f
t h e
r i p e n i n g
c h e e s e s
on
d a y s 2 , 6 ,
1 3 ,
2 0 , 2 7 , 3 4 ,
4 8 ,
5 5 ,
a n d
6 7 .
I n
a d d i t i o n ,
a c h e e s e
w h e e l w a s
r e m o v e d on
d a y
2
j u s t
b e f o r e m o l d
i n o c u l a t i o n
a n d t e s t e d f o r s a l t
a n d m o i s t u r e
c o n t e n t s .
T h e s a l t c o n c e n t r a t i o n s
w e r e d e t e r m i n e d
b y u s i n g
Q u a n t a b
C h l o r i d e T i t r a t o r s
( n o . 1 1 7 6 ;
M i l e s ) ;
i n d i v i d u a l
d e t e r m i n a t i o n s
r a n g e d
f r o m
1 . 5
t o 2 . 7 .
T h e
m o i s t u r e
c o n t e n t w a s
e s t i m a t e d b y c r u m b l i n g
a s l i c e
a n d t h e n
m i x i n g
a n d
p l a c i n g
2 - t o
3 - g p o r t i o n s
i n t o e a c h
o f t h r e e
t a r e d
a l u m i n u m
b o a t s ,
w h i c h
were
d r i e d
o v e r n i g h t
a t
9 4 C
i n
a
vacuum
o v e n ,
a l l o w e d t o c o o l
i n
a
d e s i c c a t o r ,
a n d
w e i g h e d .
M o i s t u r e
c o n t e n t s
r a n g e d
f r o m
4 9 . 6 t o
5 5 . 6 .
S a m p l i n g
a n d
e n u m e r a t i o n
o f
L .
m o n o c y t o g e n e s
i n
d u p l i c a t e
c h e e s e
s l i c e s
were c a r r i e d o u t
a s d e s c r i b e d
a b o v e f o r t h e o t h e r
f o o d s .
RESULTS
A c t i v i t y
o f
l y s o z y m e
i n
v e g e t a b l e s .
T h e a n t i b a c t e r i a l a c t i v -
i t y
o f
l y s o z y m e a g a i n s t
L .
m o n o c y t o g e n e s
S c o t t
A was
e v a l u a t e d
i n s e v e r a l
f o o d s ,
e s p e c i a l l y
t h o s e
t h a t h a v e
b e e n
s h o w n o r
s u s p e c t e d
t o t r a n s m i t
l i s t e r i o s i s or t o
h a r b o r t h e
p a t h o g e n .
O f t h e
t h r e e
c o n f i r m e d
f o o d - b o r n e
o u t b r e a k s o f
l i s t e r i o s i s
s i n c e
M a r c h
1 9 8 1
2 8 ,
tw o
r e s u l t e d f r o m
c o n t a m -
i n a t i o n
o f
s o f t - r i p e n e d
c h e e s e s
2 ,
1 0 )
a n d one
w a s
a t t r i b u t e d
t o
c o l e s l a w
c o n t a m i n a t e d
w i t h
i n f e c t e d
c a b b a g e
1 9 .
We
f i r s t
e x a m i n e d
t h e
a c t i v i t y
o f
l y s o z y m e
i n
s e v e r a l
v e g e t a b l e s ,
i n c l u d i n g
c a b b a g e .
L .
m o n o c y t o g e n e s
g r e w
w e l l
i n s h r e d d e d
c a b b a g e
F i g .
1 ;
i n t h e a b s e nc e o f
i n h i b i t o r y a g e n t s ,
t h e
o r g a n i s m
r a p i d l y
r e a c h e d
3 . 5 x
1 0 6
C F U / g
a n d t h e n f u r t h e r
i n c r e a s e d
t o
1 0 8
C F U / g .
( I n
a l l
s a m p l i n g s ,
we e x a m i n e d
d u p l i c a t e
c o n t a i n e r s
a t e a c h t i m e
p o i n t .
D u p l i c a t e
e n u m e r a t i o n s
o f L .
m o n o c y t o -
g e n e s
f r o m
i n d i v i d u a l
c o n t a i n e r s
v a r i e d
< 2 - f o l d
f r o m
t h e
me a n o f
t h e tw o
d e t e r m i n a t i o n s . )
I n i n c u b a t i o n s
c o n t a i n i n g
c a b b a g e
w i t h
1 0 0
mg
o f
l y s o z y m e p e r k g
or
l y s o z y m e
w i t h
5
mM
E D T A ,
L .
m o n o c y t o g e n e s
S c o t t
A
( C F U
p e r
g r a m )
d e c l i n e d
b y a p p r o x i m a t e l y
1 0 - or
1 0 0 - f o l d ,
r e s p e c t i v e l y ,
a f t e r
7
d a y s
o f
i n c u b a t i o n a t
5 C .
L .
m o n o c y t o g e n e s
i n
t h e
c a b b a g e s a m p l e s
w i t h
l y s o z y m e g r e w
m a r g i n a l l y
a f t e r 7
d a y s
V O L .
5 5 ,
1 9 8 9
-
8/10/2019 Antibacterial Activity of Hen Egg White Lysozyme Against
4/8
6 3 4
HUGHEY E T
AL .
a
b o
0
0 1 0 2 0
3 0 40
5 0
d a y s
F I G .
1 .
E f f e c t o f l y s o z y m e a n d
EDTA
on
g r o w t h
o f
L i s t e r i a
monocytogenes
i n
s h r e d d e d c a b b a g e .
S e e M a t e r i a l s a n d M e t h o d s
f o r
e x p e r i m e n t a l
d e t a i l s .
a n d l a t e r
d e c l i n e d ,
w h e r e a s
g r o w t h
i n t h e
i n c u b a t i o n s w i t h
l y s o z y m e a n d
EDTA
d e c l i n e d t h r o u g h o u t
t h e
e x p e r i m e n t .
B a c t e r i a
i n
t h e t r e a t m e n t s c o n t a i n i n g EDTA a l o n e
grew
w e l l
a n d
p a r a l l e l e d
n u m b e r s i n
t h e
c o n t r o l f o r
3 0
d a y s ,
a f t e r
w h i c h t h e p o p u l a t i o n r a p i d l y
d r o p p e d .
The
u n u s u a l g r o w t h
p a t t e r n s
o f
L . monocytogenes
i n
c a b b a g e
c o n t a i n i n g
EDTA
were
o f t e n seen i n o t h e r f o o d s as
w e l l
( s e e
b e l o w ) .
The l o s s
i n
v i a b i l i t y
o f L .
monocytogenes
i n
c a b b a g e
i n
t h e
presence
o f
l y s o z y m e
was n o t d u e
t o
c h a n g e s
i n
p H ,
s i n c e a l l
f o u r i n c u b a t i o n c o n d i t i o n s
g a v e
a p p r o x i m a t e l y
t h e
same
p H
p r o f i l e s .
T h e i n i t i a l
p H
o f
t h e
c a b b a g e medium was
4 . 8 ,
w h i c h i n c r e a s e d t o 6 . 6 t o 6 . 8 a f t e r 7 d a y s a n d r e ma i n e d at
t h i s
p H
u n t i l
2 0
d a y s o f i n c u b a t i o n . T h e pHs t h e n d r o p p e d t o
4 . 3
t o
4 . 9
i n
t h e
s a m p l e s
c o n t a i n i n g
lysozyme,
w h e r e a s t h e
c o n t r o l s
h a d f i n a l pHs
o f
5 . 8
t o
5 . 8 5
a f t e r 4 0
d a y s .
The
s a m p l es s u p p l e m e n t e d
w i t h
EDTA
a l o n e h a d
pHs
r a n g i n g
f r o m 5 . 0 t o 5 . 5
a f t e r 4 0 d a y s .
T h e u n u s u a l
c h a n g e s
i n
p H
may
h a v e b e e n
c a u s e d
b y c h a n g e s
m e d i a t e d b y
L .
monocyto-
g enes
a n d
o t h e r
b a c t e r i a l
f l o r a
i n t h e
r e f r i g e r a t e d c o n d i t i o n s ,
i n
w h i c h
l a c t i c a c i d f e r m e n t a t i o n may h a v e b e e n
s u p p r e s s e d .
V i s i b l e
c h a n g e s
o f
t h e
c a b b a g e , i n c l u d i n g b r o w n i n g a n d
s o f t e n i n g , were n o t i c e d
a f t e r 1
t o
2
w e e k s .
The
i n c u b at i o n s w i t h
l e t t u c e
( F i g .
2 ) s h o w e d
p a t t e r n s
o f
L .
monocytogenes
s u r v i v a l s i m i l a r t o
t h o s e
seen w i t h
c a b b a g e .
The
c o m b i n a t i o n
o f
lysozyme a n d EDTA was a c t i v e l y
l i s t e r i c i d a l , w h e r e a s
l y s o z y m e
a l o n e
was l i s t e r i s t a t i c . The
c o n t r o l s a n d
t h e
s a m p l e s w i t h EDTA a l o n e grew t o p o p u l a -
t i o n s o f
3 . 4
x
1 0 5 a n d
1 . 6
x
1 0 5 .
I n
c o n t r a s t , s a m p l e s w i t h
EDTA
a n d l y s o z y m e
h a d
no
d e t e c t a b l e
L .
monocytogenes
a f t e r 1 2
d a y s . T h e l y s o z y m e s a m p l e s h a d - 2 . 5
x
1 0 3
o r g a n i s m s ,
a 2 - f o l d
d e c r e a s e f r o m t h e i n i t i a l c e l l c o u n t . I n
t h e
l e t t u c e s a m p l e s , t h e r e
was
l i t t l e v a r i a t i o n
among
t h e p H
0
WW
0 5
1 0
1 5
d a y s
F I G . 2 .
E f f e c t
o f
l y s o z y m e
a n d E D T A o n
g r o w t h
o f L .
m o n o c y -
t o g e n e s i n s h r e d d e d l e t t u c e .
p r o f i l e s
e x c e p t
f o r
t h e
n e g a t i v e
c o n t r o l ,
w h i c h
h a d a
l o w e r
f i n a l p H ( 4 . 8 )
t h a n d i d
t h e
o t h e r i n c u b at i o n s
( p H r a n g e ,
5 . 6 t o
5 . 8 ) . T h e r e f o r e , l y s o z y m e
w as
a c t i v e l y
l i s t e r i c i d a l
i n l e t t u c e .
L y s o z y m e w i t h
E D T A
was b a c t e r i c i d a l
i n
s n a p p e d g r e e n
b e a n s ;
a f t e r 1
w e e k ,
a d e cr ea se o f - 10 0 -f o l d was
o b s e r v e d
( F i g .
3 .
I n
t h e o t h e r
e x p e r i m e n t a l
v a r i a t i o n s
g r o w t h
o c -
c u r r e d ,
a l t h o u g h
l y s o z y m e
s l o w e d
g r o w t h
c o n s i d e r a b l y
c o m p a r e d
w i t h r e s u l t s f o r t h e
c o n t r o l
o r
E D T A
i n c u b a t i o n s
( F i g . 3 .
I t
a p p e a r s
t h a t
l y s o z y m e
w i t h
o r
w i t h o u t
E D T A
was
l e s s e f f e c t i v e
i n
g r e e n
b e a n s
t h a n
i n
c a b b a g e
o r l e t t u c e .
T h e
i n i t i a l p H s
o f t h e
g r e e n
b e a n s
v a r i e d
f r o m 5 . 9 4
t o
6 . 0 7 ,
a n d
t h e
f i n a l
pHs
o f
t h e d i f f e r e n t
s a m p l e s c h a n g e d
b y
l e s s t h a n
0 . 4
p H
u n i t s .
P o s s i b l y ,
t h e a b s e n c e o f
p H
s t r e s s
d u r i n g
i n c u b a t i o n s u p p o r t e d s u r v i v a l
o f L .
m o n o c y t o g e n e s .
A l t e r -
n a t i v e l y ,
s i n c e t h e
g r e e n
b e a n s
w e r e
s n a p p e d
i n t o
f a i r l y
l a r g e
p i e c e s ,
i t
i s
p o s s i b l e
t h a t
l y s o z y m e
d i d
n o t
r a p i d l y
p e n e t r a t e
t o
t h e i n t e r i o r
a n d L .
m o n o c y t o g e n e s
c o u l d c o l o ni ze
t h e
c e n t e r
a n d
g r o w
i n i s o l a t i o n .
T r e a t m e n t
o f f r e s h
c o r n
k e r n e l s
w i t h
l y s o z y m e
w i t h
a n d
w i t h o u t EDTA
r e s u l t e d
i n a p a t t e r n
o f
L .
m o n o c y t o g e n e s
s u r v i v a l
s i m i l a r
t o t h a t d e s c r i b e d a b o v e f o r
g r e e n
b e a n s .
T h e
d e c l i n e
r a t e s
w e r e much
s l o w e r t h a n o n
l e t t u c e
a n d
c a b b a g e ,
b u t i t
was s t i l l
e v i d e n t t h a t
l y s o z y m e p l u s
E D T A was
l i s t e r i c i d a l
w h e r e a s
l y s o z y m e a l o n e
was
l i s t e r i s t a t i c ( F i g . 4 ) .
I n
c o n t r a s t ,
L .
m o n o c y t o g e n e s i n t h e
n e g a t i v e c o n t r o l s
w i t h o u t
a n y a d d i t i o n s
a n d
t h e
i n c u b at i o n s c o n t ai n i n g
E D T A
a l o n e g r e w t o
1 . 0
x
1 0 7 a n d 1 . 8 x
1 0 5 ,
r e s p e c t i v e l y ,
a f t e r
9
d a y s .
I n i t i a l
pHs o f
t h e f r e s h
c o r n
s a m p l e s
v a r i e d
f r o m
6 . 6 t o
6 . 7
a n d
d i d n o t
c h a n g e t h r o u g h d a y 9 ,
b u t
d r o p p e d
t o
4 . 5
t o
5 . 0 a f t e r 1 5
d a y s
i n t h e
s a m p l e s n o t c o n t a i n i n g
EDTA. W i t h
EDT
p r e s e n t ,
t h e
pHs
d i d n o t
d r o p b e l o w
6 . 0
a f t e r 1 5
d a y s .
E D T A
s e e m e d
t o
a f f e c t
s u b s e q u e n t
b a c t e r i a l
s p o i l a g e
b u t d i d
n o t i n f l u e n c e
s u r v i v a l
o f
L . m o n o c y t o g e n e s . As w i t h
t h e
A P P L . E N V I R O N . M I C R O B I O L .
-
8/10/2019 Antibacterial Activity of Hen Egg White Lysozyme Against
5/8
L YS OZ YM E
ACTIVITY A G A I N S T
L . M O N O C Y T O G E N E S I N F O O D S
7
6
5
0
0
4
3
~~~
+ I y s o z y m e
2
+
I
sozyme
+EDTA
0
2 4 6
8 1 0
d a y s
F I G . 3 . E f f e c t o f
lysozyme a n d EDTA on g r o w t h o f L .
monocy-
togenes
i n
f r e s h s n a p p e d g r e en
b e a n s .
o t h e r f r e s h v e g e t a b l e s
t e s t e d , l y s o z y m e
h a d
a n e g a t i v e
e f f e c t
on L .
monocytogenes g r o w t h
i n
f r e s h corn.
T h e
s l o w e r
r a t e s
o f d ec l i n e c o u l d h a v e r e s u l t e d f r o m
d i f f e r e n c e s i n f o o d
c o m p o s i t i o n , s u c h
as t h e
p resence
o f h i g h
c o n c e n t r a t i o n s
o f
c a r b o h y d r a t e s , w h i c h
c o u l d
promote
g r o w t h .
I n
f r e s h
s h r e d d e d
c a r r o t s ,
i n c u b a t i o n o f l y s o z y m e
w i t h
a n d
w i t h o u t
EDTA
a n d
L . monocytogenes
r e s u l t e d
i n
un-
u s u a l
responses o f g r o w t h
a n d
k i l l i n g ( F i g .
5 ) . I n t h i s
e x p e r i m e n t ,
L .
monocytogenes
was u s e d a t l o w e r
i n i t i a l
l e v e l s ( - 1 , 0 0 0
c o l o n i e s
p er
g ) . Lysozyme a l o n e
or w i t h
EDTA
very
r a p i d l y k i l l e d
L . monocytogenes i n t h e
c a r r o t
medium
( F i g . 5 ) . B a c t e r i a
i n t h e c o n t r o l w i t h
no a d d i t i o n s
i n i t i a l l y
grew
f o r a p p r o x i m a t e l y
tw o d o u b l i n g s ,
a n d
t h e n
d e t e c t a b l e
n u m b e r s a l s o f e l l t o zero a f t e r d a y 9 .
I n c o n t r a s t ,
EDTA
i n i t i a l l y s u p p o r t e d
a
l a r g e
i n c r e a s e i n
v i a b l e
c e l l
c o u n t s ,
w h i c h
t h e n
r a p i d l y
d e c l i n e d a f t e r
d a y
9 . T h e s e
r e s u l t s
s u g g e s t
t h a t
t h e r e
may b e f a c t o r s
i n c a r r o t s ,
p e r h a p s
l i m i t i n g
m e t a l
i o n s or
l i s t e r i c i d a l f a c t o r s ,
t h a t
encoura ge t h e
a c t i v i t y
o f
l y s o z y m e
a g a i n s t
L .
monocytogenes.
The
pHs
o f
t h e
c a r r o t s a m p l e s
were i n i t i a l l y
6 . 2 t o
6 . 4 ;
t h e s e
d r o p p e d
s t e a d i l y t o
4 . 1
t o
4 . 4 a f t e r 9
d a y s .
The
c h a n g e
i n
p H
d i d
n o t
a p p e a r
t o
i n f l u e n c e L . monocytogenes
s u r v i v a l .
O v e r a l l , l y s o z y m e
was
very
e f f e c t i v e
i n
k i l l i n g
L .
mono-
cytogenes
i n most f r e s h
v e g e t a b l e
p r o d u c t s .
D u r i n g
t h e
w i n t e r , we a l s o
t e s t e d f r o z e n c o m m e r c i a l g reen
b e a n s a n d
corn;
i n
b o t h cases, l y s o z y m e
d i d
n o t
k i l l
t h e i n o c u l a t e d
L .
monocytogenes, a l t h o u g h
i t
d i d
( i n c o m b i n a t i o n
w i t h
E D T A)
p r e v e n t
g r o w t h ( d a t a
n o t
s h o w n ) .
We n o t i c e d t h a t
w i t h
t h e
f r o z e n
green b e a n s , b u t n o t
w i t h t h e
corn,
t h e
p H
o f t h e
f r o z e n p r o d u c t d r o p p e d
much f a s t e r t h a n
i t d i d w i t h f r e s h
green
b e a n s ,
p e r h a p s
b e c a u s e
o f more r a p i d
g r o w t h
b y
a c i d
f o r m e r s .
The
reasons
t h a t
l y s o z y m e
was
n o t
e f f e c t i v e
i n
t h a w e d
f r o z e n
p r o d u c t s
i s
n o t k n o w n ,
b u t
t h e y may
b e
5
4
+ l y s o z y m e
3
+Iysozyme
+ E D T A
2
0 1 0
2 0
d a y s
F I G . 4 . E f f e c t o f l y s o z y m e
o n
g r o w t h
o f L .
m o n o c y t o g e n e s
i n
f r e s h
c o r n .
r e l a t e d t o i n a c t i v a t i o n o f e n h a n c i n g
f a c t o r s d u r i n g p r o c e s s -
i n g
o f t h e
f r e s h
v e g e t a b l e s .
A c t i v i t y
o f l y s o z y m e
i n
f r e s h
s a u s a g e s .
We
n e x t
e x a m i n e d
t h e e f f e c t i v e n e s s o f l y s o z y m e
a g a i n s t L . m o n o c y t o g e n e s
i n
b r a t w u r s t , w h i c h
i s
a f r e s h
m e a t
s a u s a g e common
i n W i s -
c o n s i n .
I n i t i a l
c o u n t s o f
L .
m o n o c y t o g e n e s
i n
t h e
s a u s a g e s
w e r e
4
x
1 0 3 C F U / g .
We f o u n d
t h a t t h e
i n c u b a t i o n s
c o n t a i n -
i n g l y s o z y m e
a l o n e
d i d n o t
a f f e c t
g r o w t h
s i g n i f i c a n t l y
c o m -
p a r e d
w i t h
t h e
n e g a t i v e
c o n t r o l w i t h o u t
l y s o z y m e
( F i g .
6 ) .
B o t h i n c u b a t i o n s g r e w
t o _ - 1 0 7
C F U / g
i n
1
t o
2 w e e k s .
T h e
s a u s a g e s
c o n t a i n i n g
E D T A a l o n e
w e r e l i s t e r i s t a t i c f o r
2
w e e k s ,
a f t e r w h i c h
L .
m o n o c y t o g e n e s g r e w
t o v e r y h i g h
n u m b e r s .
T h e m o s t e f f e c t i v e
v a r i a t i o n t h a t
i n h i b i t e d
L .
m o n o c y t o g e n e s
was
t h e
c o m b i n a t i o n
o f
l y s o z y m e
a n d
E D T A . When
t h e s e tw o s u b s t a n c e s
w e r e
i n c l u d e d
t o g e t h e r ,
i n i t i a l n u m b e r s
f e l l
f r o m
3 . 9
x
1 0 3 t o
1 . 4
x
1 0 3
a f t e r 9
d a y s ,
a n d
t h e n
L .
m o n o c y t o g e n e s s l o w l y
b e g a n t o
g r o w
o v e r
t h e
4 4 - d a y
d u r a t i o n
o f
t h e
e x p e r i m e n t .
The
p H
r e m a i n e d
a t
a p p r o x i m a t e l y
6
i n a l l
o f
t h e i n c u b a t i o n s .
I n
c o n t r o l
s a u s a g e s
w i t h o u t i n o c u l a t e d L .
m o n o c y t o g e n e s
S c o t t
A ,
b u t
n o t
i n
t h e
s a u s a g e s
c o n t a i n i n g
EDTA,
w e
d e t e c t e d
a n d
c o n f i r m e d
L i s t e r i a
c o l o n i e s
i n t h e a b s e n c e
o r
p r e s e n c e
o f
l y s o z y m e .
C a r b o h y d r a t e
t e s t s
s h o w e d
t h a t a
p r o p o r t i o n
o f
t h e s e c o l o n i e s r e a c t e d
d i f f e r e n t l y
t h a n
d i d L .
m o n o c y t o g e n e s
S c o t t
A , e s p e c i a l l y
i n a s s i m i l a t i o n
o f
m e l e z -
i t o s e .
We a s s u m e t h a t
t h e
p o r k
t r i m
c o n t a i n e d
L i s t e r i a
c e l l s
a s i n h e r e n t c o n t a m i n a n t s .
T h e s e
c o m p r i s e d
< 0 . 1 o f
t h e
i n o c u l a
w e a d d e d a n d
p r o b a b l y
d i d n o t
a f f e c t o u r
r e s u l t s .
I t i s
e v i d e n t
t h a t
i n
f r e s h
p o r k
s a u s a g e s
EDTA
a n d
l y s o z y m e
a c t e d s y n e r g i s t i c a l l y
i n
p r e v e n t i n g g r o w t h .
S i n c e
t h e
s h e l f l i f e o f
f r e s h b r a t w u r s t
i s
-
8/10/2019 Antibacterial Activity of Hen Egg White Lysozyme Against
6/8
6 3 6
HUGHEY E T A L .
4
3
2
0
b o
1 . 1
+lysozyme\
1 0
2 0
d a y s
F I G .
5 . E f f e c t
o f l y s o z y m e
a n d
E D T A
a n d
l y s o z y m e o n
g r o w t h
o f L .
m o n o c y t o g e n e s i n c a r r o t s .
p r o v i d e
n e e d e d p r o t e c t i o n . We ar e
c u r r e n t l y e x a m i n i n g
o t h e r
m e a t s , i n c l u d i n g
f r e s h
f r a n k f u r t e r s .
V a r i o u s
c h e l a t o r s ,
i n c l u d i n g n a t u r a l
s u b s t a n c e s
s u c h a s c o n a l b u m i n
a n d
l a c t o -
f e r r i n , a r e
a l s o
b e i n g t r i e d i n c o m b i n a t i o n
w i t h l y s o z y m e .
E f f e c t i v e n e s s o f
l y s o z y m e
i n
m o l d - r i p e n e d C a m e m b e r t
c h e e s e .
S o f t - r i p e n e d c h e e s es h a v e
b e e n a s s o c i a t e d w i t h
t r a n s f e r
o f
l i s t e r i o s i s t o
h u m a n s .
T h e s e
p r o d u c t s c o u l d
b e n e f i t
b y i n c l u s i o n o f a s a f e
p r e s e r v a t i v e a c t i v e a g a i n s t L .
m o n o c y t o g e n e s .
We
p r e p a r e d s e v e r a l w h e e l s
o f C a m e m b e r t c h e e s e c o n -
t a i n i n g
l y s o z y m e ,
E D T A , a n d L . m o n o c y t o g e n e s . I n i t i a l
c o u n t s o f L .
m o n o c y t o g e n e s f r o m s e v e n
c h e e s e
w h e e l s made
i n
s e p a r a t e
w e e k s
r a n g e d
f r o m 2 . 9
x
1 0 4
t o
3 . 3
x
1 0 4 .
F i g u r e
7
s h o w s t h e
r e s u l t s o f i n c l u d i n g l y s o z y m e
w i t h a n d w i t h o u t
E D T A
i n t h e
c h e e s e s .
T h e
c o n t r o l
c h e e s e s
h a r b o r i n g
L .
m o n o c y t o g e n e s
b u t n o t
l y s o z y m e
o r E D T A
i n i t i a l l y s h o w e d
a
s l i g h t
d e c l i n e
i n n u m b e r s
d u r i n g t h e
f i r s t
3 w e e k s
o f
c u r i n g ,
b u t
t h e r e a f t e r L .
m o n o c y t o g e n e s g r e w s t e a d i l y a n d r e a c h e d
5
x
1 0 6
C FU / g
a f t e r 5 5 d ay s . A ft e r t h e
5 5 - d a y s a m p l i n g ,
d e t e c t i o n i n
s e v e r a l
o f
t h e
e x p e r i m e n t a l v a r i a t i o n s
g a v e
s p o r a d i c
n u m b e r s f r o m
s a m p l e t o
s a m p l e ,
p e r h a p s b e c a u s e
o f
n o n u n i f o r m
s p a t i a l
d i s t r i b u t i o n
o f
L .
m o n o c y t o g e n e s
i n
t h e
c h e e s e s .
T h e c h e e s e s
c o n t a i n i n g L . m o n o c y t o g e n e s a nd l y s o z y m e
a l s o
e x h i b i t e d a n i n i t i a l
d e c l i n e
t h a t
c o n t i n u e d u n t i l t h e
3 1 - d a y
s a m p l i n g . T h e i n i t i a l
n u m b e r s
w e r e 3 . 3
x
1 0 4
C F U / g ,
w h i c h
d r o p p e d t o
4 . 2
x
1 0 3 ( r a n g e , 3 . 4
x
1 0 3
t o
5 . 0 x
1 0 3 )
a f t e r
3 1
d a y s o f a g i n g .
L .
m o n o c y t o g e n e s
t h e n
s t a r t e d
t o
g r o w a n d r e a c h e d 2 . 5
x
1 0 4 ( r a n g e ,
5 . 0
x 1 0 3 t o 4 . 5
x
1 0 4 )
a f t e r
5 5
d a y s ( r a n g e ,
4 . 5
x
1 0 4 t o 5 . 0
x
1 0 4 ) .
V i a b l e c o u n t s
e v e n t u a l l y
d e c l i n e d t o 2 . 5
x
1 0 4 ( r a n g e , 5 . 0
x
1 0 3
t o
4 . 5
x
1 0 4 )
a f t e r
a c l i m b i n
p o p u l a t i o n
t o 2 . 3
x
1 0 5 t o 3 . 5
x
1 0 5 / g .
T h e w h e e l s
c o n t a i n i n g E D T A s h o w e d a n
u n u s u a l
g r o w t h
p a t t e r n
i n
w h i c h
p o p u l a t i o n s
i n i t i a l l y r o s e a n d
t h e n
f e l l
p r e c i p i t o u s l y . T h e s e r e s u l t s
h a v e b e e n
s e e n w i t h
some
o t h e r
f o o d s . G r o w t h
d u r i n g
t h e i n i t i a l 4 1
d a y s o f
c h e e s e
c u r i n g
w i t h o u t
i n h i b i t o r y
a g e n t s o c c u r r e d s t e a d i l y , a n d - 4 . 9
x
1 0 5
CFU/g
was
o b t a i ne d . A ft e r
t h i s
t i m e ,
v i a b l e c o u n t s d e -
c r e a s e d t o _ 1 0 4
C F U / g .
U n u s u a l
p a t t e r n s
o f
g r o w t h
were
a l s o s e e n i n
t h e w h e e l s c o n t a i n i n g L . m o n o c y t o g e n e s w i t h
E D T A a n d l y s o z y m e . D u r i n g
t h e
i n i t i a l
2 7 d a y s o f c h e e s e
r i p e n i n g ,
c o u n t s
d r o p p e d f r o m
3 . 0
x
1 0 4
t o
6 . 4
x
1 0 3
( r a n g e ,
3 . 7
x
1 0 3
t o
9 . 2
x
1 0 3 ) . A f t e r t h i s p e r i o d ,
L .
m o n o c y t o g e n e s
g r e w
u n t i l
4 1 d a y s
a n d
t h e n
d r o p p e d a g a i n
t o
-6 x
1 0 3 .
E v e n t u a l l y ,
r e l a t i v e l y
h i g h
c o u n t s
w e r e o b t ai n e d
( 4 . 0
x
1 0 6 ) .
I t i s
e v i d e n t
t h a t n u m b e r s
o f L . m o n o c y t o g e n e s
v a r i e d
c o n s i d e r a b l y a f t e r
3 0
t o
4 0 d a y s o f
a g i n g
i n t h e
c h e e s e s
c o n t a i n i n g
l y s o z y m e w i t h o r
w i t h o u t
EDTA b u t n o t i n
t h e
c o n t r o l .
S o f t - r i p e n e d c h e e s e i s a
c o m p l e x
s u b s t r a t e , a n d
m o r e w o r k i s
n e c e s s a r y
t o e v a l u a t e
t h e
e f f e c t i v e n e s s
o f
l y s o z y m e .
DISCUSSION
An
i m p o r t a n t
c o n t r i b u t i n g
f a c t o r f o r
t h e c o n tr o l
o f L .
m o n o c y t o g e n e s i n f o o d s i s
t h e
a b s e n c e
o f
t e c h n o l o g i e s t o
t h o r o u g h l y
a n d
p e r m a n e n t l y e l i m i n a t e
t h e
p a t h o g e n
f r o m t h e
p r o c e s s i n g
p l a n t e n v i r o n m e n t
( 2 6 , 2 8 ) .
The
p a t h o g e n
t e n a -
c i o u s l y
c o n t a m i n a t e s
p r o c e s s i n g
p l a n t s d e s p i t e
e x t e n s i v e
e f f o r t s t o
e l i m i n a t e i t t h r o u g h
v i g o r o u s
s a n i t a t i o n .
P o s t p r o -
c e s s i n g
c o n t a m i n a t i o n i s a n
i m p o r t a n t
f a c t o r i n
t r a n s m i s s i o n
o f
t h e
p a t h o g e n
t o
f o o d s a n d
i s
c u r r e n t l y t h o u g h t
t o
b e
t h e
m a j o r r o u t e o f
c o n t a m i n a t i o n
( 1 4 , 1 6 ,
2 6 ,
2 8 ) .
S a f e
p r e s e r -
v a t i v e s
t h a t
c a n b e a d d e d
t o f o o d s
t o k i l l
t h e
o r g a n i s m
i f
p o s t p r o c e s s i n g
c o n t a m i n a t i o n
o c c u r s
a r e
u r g e n t l y
n e e d e d .
L I
0
0 2 0
3 0 40 50
d a y s
F I G . 6 . E f f e c t
o f
l y s o z y m e
a n d EDTA
o n
g r o w t h
o f
L .
m o n o c y -
t o g e n e s
i n f r e s h
s a u s a g e s ( b r a t w u r s t ) .
A P P L .
E N V I R O N . M I C R O B I O L .
-
8/10/2019 Antibacterial Activity of Hen Egg White Lysozyme Against
7/8
LYSOZYME
A C T I V I T Y
A G A I N S T L .
M O N O C Y T O G E N E S I N
F O O D S 6 3 7
7
6
* b O
u
0
V-
5
4
-
m
] ysozyme
~ ~ + l y s o z y m e
+EDTA
0 20 4 0 60
d a y s
F I G . 7 . G r o w t h
o f
L .
m o n o c y t o g e n e s
i n C a m e m b e r t
c h e e s e
c o n t a i n i n g l y s o zy m e a n d E DTA .
The
r e s u l t s o f
t h i s
s t u d y
i n d i c a t e
t h a t
lysozyme
i s
a n
e f f e c t i v e
p r e s e r v a t i v e
a g a i n s t
L .
monocytogenes
S c o t t
A
i n
c e r t a i n
f o o d s ,
e s p e c i a l l y f r e s h v e g e t a b l e s .
I n
many
o f
t h e
v e g e t a b l e s we
t e s t e d ,
lysozyme
e f f e c t i v e l y
k i l l e d h i g h
i n i t i a l
n u m b e r s o f L .
monocytogenes. I n
s e v e r a l v e g e t a b l e f o o d s ,
EDTA
e n h a n c e d t h e a c t i v i t y o f
lysozyme
a n d r e s u l t e d
i n
r a p i d a n d c o m p l e t e e x t e rm i n a t i o n o f
L .
monocytogenes.
I n
t h e
tw o f o o d s o f a n i m a l o r i g i n
t h a t
we t e s t e d
( f r e s h
sausage
a n d
Camembert c h e e s e ) , lysozyme
w i t h EDTA was
b a c t e r i o s t a t i c
b u t
d i d n o t r i d
t h e
f o o d s o f
v i a b l e L .
monocy-
t o g e n e s , as
o c c u r r e d
i n many v e g e t a b l e s .
E v i d e n t l y ,
t h e
g r o w t h
s u b s t r a t e s are
c r i t i c a l l y i m p o r t a n t
f o r b ac te ri al
g r o w t h
a n d t h e e f f ec t i v en es s
o f lysozyme.
P e r h a p s
t h e
presence o f r e l a t i v e l y
h i g h
c o n c e n t ra t i o ns o f c e r t a i n
n u t r i -
e n t s
s u c h
as
h e m e , f a t ,
or
o t h e r s
are
h e l p f u l
t o L .
monocy-
t o g e n e s
i n
a v o i d i n g
k i l l i n g
b y
lysozyme.
The i n t e r a c t i o n o f
l y s o z y m e
w i t h c h e l a t o r s n e e d s more
e x t e n s i v e
s t u d y .
The
m e c h a n i s m ( s ) b y
w h i c h
t h e y
i n t e r a c t
i s
n o t
p r e s e n t l y
u n d e r s t o o d .
T h e r e a re
a t l e a s t
tw o
p o s s i b i l i t i e s
f o r
t h e
e n h a n c i n g
e f f e c t o f a c h e l a t o r :
i
i t
may
s l o w
g r o w t h
b y b i n d i n g
a n
i m p o r t a n t
m e t a l
necessary
f o r
g r o w t h ( e . g . ,
i r o n
[ 2 3 ] ) ,
t h u s
a l l o w i n g lysozyme
t o
d i g e s t
t h e c e l l w a l l
f a s t e r t h a n
i t
ca n b e
s y n t h e s i z e d ,
or
i i
i t
may
d i s r u p t
t h e
c e l l
w a l l s t r u c t u r e a n d e n a b l e
b e t t e r
a t t a c k b y lysozyme.
P e r r a u -
d i n
a n d
P r i e e l s
( 1 5 )
h a v e
shown t h a t l a ct o f er ri n
b i n d s
more
r e a d i l y
t o
M.
l u t e u s
c e l l s
t o
w h i c h
lysozyme
h a s
p r e v i o u s l y
b o u n d .
EDTA
was
u s e d as a m o d e l c h e l a t o r
i n
our
s t u d i e s ,
a n d
i t i s
l i k e l y
t h a t
o t h e r
c h e l a t o r s , e s p e c i a l l y
t h o s e
t h a t
occur
n a t u r a l l y
w i t h
lysozyme
i n mammalian
s e c r e t i o n s ,
s u c h as
c o n a l b u m i n , t r a n s f e r r i n , c e r u l o p l a s m i n ,
or l a c t o f e r -
r i n ,
w o u l d work
more
e f f e c t i v e l y .
L a c t o f e r r i n occurs
n a t u -
r a l l y
i n b o v i n e m i l k a t
l o w e r
c o n c e n t r a t i o n s
t h a n i t
occurs
i n
m i l k s
o f
some
o t h e r
mammals.
P r e l i m i n a r y e x p e r i m e n t s
h a v e
shown
t h a t c o n a l b u m i n
e n h a n c e s
t h e
a c t i v i t y
o f
l y s o -
zyme a g a i n s t
L .
monocytogenes ( V .
L .
H u g h e y ,
P . A .
W i l g e r ,
a n d
E .
A .
J o h n s o n , e x p er i me n t s
i n
p r o g r e s s ) .
Con-
a l b u m i n
s p e c i f i c a l l y
b i n d s
i r o n ,
as
o p p o s e d
t o
E D T A ,
which
p r e f e r s d i v a l e n t
a l k a l i n e
e ar t h m e ta l s .
I r o n
i s q u i t e i m p o r t a n t
f o r
g r o w t h
a n d
v i r u l e n c e o f
L .
m o n o c y t o g e n e s
( 2 3 ) .
s e c o n d
p o t e n t i a l p r o c e s s i n g
m e t h o d f o r
i n c r e a s i n g
t h e
a c t i v i t y
o f
l y s o z y m e
i s t o
h e a t L .
m o n o c y t o g e n e s d u r i n g o r
b e f o r e
e x p o s u r e
t o
l y s o z y m e . P r e l i m i n a r y e x p e r i m e n t s
h a v e
s h o w n t h a t t h i s
p r o c e d u r e d r a m a t i c a l l y
i n c r e a s e s t h e
s u s c e p -
t i b i l i t y
o f L .
m o n o c y t o g e n e s
t o
l y s i s
( A .
D i N a r d o ,
V .
L .
H u g h e y ,
a n d E .
A .
J o h n s o n , u n p u b l i s h e d
d a t a ) .
A l t h o u g h
l y s o z y m e
h a s b e e n
s u g g e s t e d
t o
h a v e
many
r o l e s
a s
a
p r e s e r v a t i v e
( s e e
r e f e r e n c e
1 7
f o r
r e v i e w ) ,
i t i s
c u r r e n t l y
u s e d
m a i n l y
i n c e r t a i n
E u r o p e a n
c h e e s e s t o
p r e v e n t b l o w i n g
b y
s p o r e f o r m e r s ( 1 7 ) .
O u r
p r e v i o u s f i n d i n g s
t h a t
e g g
w h i t e
l y s o z y m e
i s
h i g h l y
e f f e c t i v e
a g a i n s t
L .
m o n o c y t o g e n e s
a n d
some o t h e r
p a t h o g e n s ( 9 ) ,
a n d
t h e r e s u l t s
p r e s e n t e d
h e r e ,
s h o w i n g
t h a t i t
i s a c t i v e i n s e v e r a l
f o o d s , s u g g e s t
t h a t f u r t h e r
a p p l i c a t i o n s
c a n
b e
f o u n d .
B e c a u s e
l y s o z y m e s
o c c u r n a t u -
r a l l y
i n
h u m a n s ,
a n d s i n c e
e g g
w h i t e
l y s o z y m e
i s
d e s t r o y e d
i n t h e human
s t o m a c h
a n d
d u r i n g
c o o k i n g
o f
f o o d s ,
i t
i s
l i k e l y
t h a t
l y s o z y m e
c o u l d s e r v e a s
a s a f e a n d
w i d e l y
u s e d
f o o d
p r e s e r v a t i v e
t o
p r o t e c t
a g a i n s t
L .
m o n o c y t o g e n e s
c o n -
t a m i n a t i o n .
ACKNOWLEDGMENTS
We
t h a n k Mark
J o h n s o n ,
J e a n
S c h o e n i ,
a n d
J e n n i f e r
J o h n s o n
f o r
v a l u a b l e a s s i s t a n c e
d u r i n g
t h i s
s t u d y .
We
a l s o
t h a n k S o c i e t a
P r o -
d o t t i
A n t i b i o t i c i
a n d
M i l e s ,
I n c . ,
f o r
f i n a n c i a l
s u p p o r t
a n d
h e l p f u l
c o m m u n i c a t i o n s .
L I T E R A T U R E
C I T E D
1 .
B e c k e r s ,
H .
J . ,
P .
S .
S .
S o e n t o r o ,
a n d
E .
H . M.
D e l f g o u - v a n
A s c h . 1 9 8 7 . T h e o c c u r r e n c e o f
L i s t e r i a
m o n o c y t o g e n e s
i n
s o f t
c h e e s e s a n d
raw
m i l k
a n d i t s
r e s i s t a n c e
t o h e a t .
I n t .
J .
F o o d
M i c r o b i o l .
4 : 2 4 9 - 2 5 6 .
2 .
B i l l e , J . ,
a n d M . - P . G l a u s e r .
1 9 8 8 . L i s t e r i o s e
e n
S u i s s e . B u l l .
B u n d e s a m t e s G e s u n d h e i t s we s en . 3 : 2 8 - 2 9 .
3 .
D i J k s t r a ,
R . G .
1 9 8 2 . T h e o c c u r r e n c e o f
L i s t e r i a
m o n o c y t o g e n e s
i n
s u r f a c e
w a t e r o f c a n a l s
a n d
l a k e s ,
i n d i t c h e s
o f one
b i g p o l d e r
a n d
i n
t h e e f f l u e n t s
a n d
c a n a l s o f
a
s e w a g e
t r e a t m e n t
p l a n t .
Z e n t r a l b l . B a k t e r i o l . P a r a s i t e n k d . I n f e k t i o n s k r .
H y g .
A b t .
1
O r i g .
R e i h e B
1 7 6 : 2 0 2 - 2 0 5 .
4 .
F l e m i n g ,
D .
W . ,
S .
L .
C o c h i ,
L .
L .
M a c D o n a l d ,
J .
B r o n d u m ,
P .
S .
H a y e s ,
B .
D .
P l i k a y t i s ,
M. B .
H o l m e s ,
A .
A u d u r i e r ,
C .
V .
B r o o m e ,
a n d A .
L .
R e i n g o l d .
1 9 8 5 .
P a s t e u r i z e d m i l k a s
a v e h i c l e
o f
i n f e c t i o n
i n
an
o u t b r e a k
o f l i s t e r i o s i s .
N .
E n g l .
J .
M e d .
3 1 2 : 4 0 4 - 4 0 7 .
5 . F o o d a n d
D r u g
A d m i n i s t r a t i o n .
1 9 8 6 .
F DA s
d a i r y
p r o d u c t
s a f e t y
i n i t i a t i v e s .
P r e l i m i n a r y
s t a t u s
r e p o r t .
F o o d
a n d
D r u g
A d m i n i s t r a t i o n ,
W a s h i n g t o n ,
D . C .
6 .
G i t t e r ,
M. 1 9 7 6 . L i s t e r i a
m o n o c y t o g e n e s
i n oven
r e a d y
p o u l t r y .
V e t .
R e c .
9 9 : 3 3 6 .
7 .
G r a y ,
M .
L . ,
a n d
A .
H .
K i l l i n g e r .
1 9 6 6 .
L i s t e r i a
m o n o c y t o g e n e s
a n d
l i s t e r i c
i n f e c t i o n s .
B a c t e r i o l .
R e v . 3 0 : 3 0 9 - 3 8 2 .
8 .
H o ,
J . L . ,
K .
N .
S h a n d s ,
G .
F r i e d l a n d ,
P .
E c k i n d ,
a n d D . W.
F r a s e r . 1 9 8 6 . An o u t b r ea k o f
t y p e
4 b L i s t e r i a
m o n o c y t o g e n e s
i n f e c t i o n
i n v o l v i n g
p a t i e n t s
f r o m
e i g h t
B o s t o n
h o s p i t a l s .
A r c h .
I n t e r n .
M e d .
1 4 6 : 5 2 0 - 5 2 4 .
9 .
H u g h e y ,
V .
L . ,
a n d
E . A .
J o h n s o n .
1 9 8 7 .
A n t i m i c r o b i a l
a c t i v i t y
o f
l y s o z y m e
a g a i n s t
b a c t e r i a
i n v o l v e d
i n
f o o d
s p o i l a g e
a n d
f o o d - b o r n e
d i s e a s e .
A p p l .
E n v i r o n .
M i c r o b i o l . 5 3 : 2 1 6 5 - 2 1 7 0 .
1 0 .
J a m e s ,
S .
M . ,
S . L .
F a n n i n ,
B .
A .
A g e e
B .
H a l l ,
E .
P a r k e r ,
J .
V o g t ,
G .
R u n , J .
W i l l i a m s ,
L .
L i e b ,
C .
S a l m i n e n ,
T .
P e n d e r g a s t ,
S .
B .
W e r n e r ,
a n d
J .
C h i n .
1 9 8 5 . L i s t e r i o s i s o u t b r e a k
a s s o c i a t e d
w i t h
M e x i c a n - s t y l e
c h e e s e - C a l i f o r n i a .
M o r b i d .
M o r t a l .
W e e k l y R e p .
3 4 : 3 5 7 - 3 5 9 .
1 1 .
L e e ,
W.
H . ,
a n d
D . M c C l a i n .
1 9 8 6 .
I m p r o v e d
L i s t e r i a
m o n o c y -
t o g e n e s
s e l e c t i v e
a g a r . A p p l .
E n v i r o n .
M i c r o b i o l . 5 2 : 1 2 1 5 - 1 2 1 7 .
1 2 .
M c C l a i n ,
D . ,
a n d
W. H . L e e .
1 9 8 8 .
D e v e l o p m e n t
o f USDA-FSIS
m e t h o d f o r i s o l a t i o n o f
L i s t e r i a
m o n o c y t o g e n e s
f r o m
r a w
meat
a n d
p o u l t r y .
J . A s s o c .
O f f .
A n a l . C h e m . 7 1 : 6 6 0 - 6 6 4 .
1 3 .
M c L a u c h l i n ,
J .
1 9 8 7 .
L i s t e r i a
m o n o c y t o g e n e s ,
r e c e n t
a d v a n c e s
V O L .
5 5 ,
1 9 8 9
-
8/10/2019 Antibacterial Activity of Hen Egg White Lysozyme Against
8/8
A P P L .
E N V I R O N .
M I C R O B I O L .
i n
t h e
taxonomy
a n d
e p i d e m i o l o g y o f
l i s t e r i o s i s
i n h u m a n s .
J .
A p p l . B a c t e r i o l .
6 3 : 1 - 1 1 .
1 4 .
M o s s e l ,
D . A . A . 1 9 8 7 .
M i c r o b i a l
r e c o n t a m i n a t i o n
o f m i l k a n d
d a i r y p r o d u c t s .
M e c h a n i s m s ,
h e a l t h
i m p a c t ,
management
a n d
m o ni t o ri n g. M i cr o bi o l .
A l i m e n t .
N u t r . 5 : 26 7 -2 82 .
1 5 .
P e r r a u d i n ,
J . - P . , a n d
J . - P . P r i e e l s . 1 9 8 2 . L ac t o f er ri n b i n d i n g t o
l y s o z y m e t r e a t e d
M i c r o c o c c u s
l u t e u s . B i o c h i m . B i o p h y s .
A c t a
7 1 8 : 4 2 - 4 8 .
1 6 .
P r e n t i c e , G .
A . , a n d P . N e av e s . 1 98 8. L i s t e r i a monocytogenes
i n
f o o d :
i t s
s i g n i f i c a n c e
a n d m e t h o d s
f o r
i t s
d e t e c t i o n .
B u l l .
I n t .
D ai r y F e d . 2 2 3 : 1 - 1 6 .
1 7 . P r o c t o r ,
V . A . ,
a n d F . E . C u n n i n g h a m .
1 9 8 8 .
Th e
c h e m i s t r y
o f