TEMA 1

ANOMALÍAS CROMOSÓMICASESTRUCTURALES Y TÉCNICAS DECITOGENÉTICA MOLECULAR EN

DIAGNÓSTICO PRENATALVictoria Simón García

Programa deFormación Continuada

a Distancia2014

ANOMALÍAS CROMOSÓMICAS ESTRUCTURALES Y TÉCNICAS DECITOGENÉTICA MOLECULAR EN DIAGNÓSTICO PRENATAL.

Dr. Victoria Simón García. Doctora en Farmacia. Especialista en Análisis Clínicos.

Laboratorio de Análisis Clínicos. Hospital La Plana. Vila-real (Castellón).

OBJETIVOS ESPECÍFICOS:En este tema, veremos más a fondo las anomalías cromosómicas estructurales (ya que las numé-

ricas fueron estudiadas en el Tema 1 de FC AEFA 2013) e introduciremos el concepto de mosai-

cismo, importante para entender las repercusiones de algunas de estas anomalías.

Así mismo, se tratará en el tema la citogenética en el diagnóstico prenatal, la forma de obtención

de las muestras para realizar estos estudios y algunas peculiaridades del cultivo de tejido fetal. Por

último, realizaremos un acercamiento a las técnicas de citogenética molecular, y dada su impor-

tancia, podría ser objeto de un tema a tratar posteriormente en toda su extensión.

Después de completar esta unidad didáctica, los participantes deben ser capaces de:

1. Conocer e identificar los tipos de Anomalías Cromosómicas, sobre todo las estructurales, que

nos podemos encontrar en el campo de la Citogenética Humana.

2. Adquirir habilidades en le campo del Diagnóstico Citogenético Prenatal, conocer con qué tipos

de tejido podemos trabajar, las peculiaridades de cada uno de ellos, así como, las Indicaciones

Clínicas para realizar este tipo de estudios.

3. Comprender la metodología de las Técnicas de Citogenética Molecular, el alcance y las limita-

ciones de estos estudios cromosómicos, así como, conocer e interpretar los resultados obtenidos a

partir los mismos.

INDICE1. INTRODUCCIÓN.1.1. Nomenclatura para cromosomas

normales y anomalías cromosó-micas constitucionales.

1.2. Mosaicismo2. ANOMALÍAS CROMOSÓMICAS

ESTRUCTURALES.CLASIFICACIÓN

2.1 Anomalías estructurales balanceadas o equilibradas.

2.1.1 Translocaciones Recíprocas2.1.2 Translocaciones Robertsonianas2.1.3 Inversión2.1.4 Inserción2.2 Anomalías estructurales no

balanceadas o desequilibradas2.2.1 Deleción2.2.2 Duplicación2.2.3 Adición2.2.4 Anillos2.2.5 Isocromosoma2.2.6 Cromosoma Derivado2.2.7 Cromosomas marcadores3. DIAGNÓSTICO CITOGENÉTICO

PRENATAL.

3.1 Obtención de tejido fetal para elanálisis citogenético

3.1.1 Amniocentesis3.1.2 Biopsia de vellosidades coriónicas. 3.1.3 Funiculocentesis.3.2 Cultivo de líquido amniótico3.3 Indicaciones clínicas del diagnóstico

prenatal citogenético.4. INTRODUCCIÓN A LAS TÉCNICAS

DE CITOGENÉTICA MOLECULAR4.1 FISH (hibridación in situ fluorescente)4.1.1 Sondas locus-específicas (LSI).4.1.2 Sondas centroméricas (o alfoides)4.1.3 Sondas subteloméricas4.1.4 Sondas de pintado cromosómico.4.2 FISH multicolor o M-FISH4.3 SKY4.4 CGH5. VENTAJAS Y DESVENTAJAS DE

LAS DISTINTAS TÉCNICASCITOGENÉTICAS

6. RESUMENBIBLIOGRAFÍAENLACES DE INTERÉSCASOS CLÍNICOS

1. INTRODUCCIÓN

1.1. Nomenclatura para cromosomas normales y anomalías cromosó-micas constitucionales

El método de bandeo más usado para la identificación individualizada de los cromosomas es elbandeo GTG que produce las bandas G, de forma que cada cromosoma en las células somáticashumanas está formado por una serie de bandas continuas. Cada banda es parte de un cromo-soma, que es fácilmente distinguible de los segmentos adyacentes, por aparecer más clara o másoscura con una o más técnicas de bandeo.

Estas bandas se ubican en regiones a lo largo de los brazos cromosómicos, de forma que lasbandas y las regiones se numeran desde el centrómero hacia el telómero del brazo correspon-diente. Para definir una banda en particular se requiere: número del cromosoma, símbolo delbrazo (p: brazo corto del cromosoma, q: brazo largo), número de la región y número de la bandadentro de la región. Ej: 2q34 indica banda 4 de la región 3, del brazo largo del cromosoma2.(Fig. 1)

Las técnicas de bandeo de alta resolución (850 bandas) permiten descubrir sub-bandas y éstastambién se nombran con un número (creciente de centrómero a telómero) que se coloca despuésde un número decimal que sigue al numero de la banda. Ej.: 2q34.2 indica sub-banda 2, de labanda 4 de la región 3, del brazo largo del cromosoma 2.

En la descripción del cariotipo (fórmula cromosómica), se registra el número de cromosomas,seguido de una coma, tras la cual se escriben los cromosomas sexuales. Ej. 46,XY (cariotipomasculino normal).

Si existen anomalías numéricas éstas se escriben a continuación, tras otra coma. Ej. 47,XX,+21(el signo (+) o (-), colocado delante del número del autosoma indica ganancia o pérdida de esecromosoma completo. Aquí se lee: cariotipo anormal femenino con 47 cromosomas y un cromo-soma 21 adicional).

Si existen anomalías estructurales, se escribe el símbolo de ésta, tras otra coma. A continuaciónse coloca el número del cromosoma involucrado (Ej.: inv(7), inversión del cromosoma 7). Si estáninvolucrados dos cromosomas, se colocan los dos dentro del paréntesis separados por punto ycoma (Ej.: t(8;14), translocación ocho catorce). A continuación, se especifica el lugar donde se ha/nproducido el/los cortes y se colocan entre paréntesis, separadas entre sí por punto y coma, inme-diatamente a continuación de la anomalía. (Ej.: t(8;14)(q12;q22), se lee translocación ocho catorce,con puntos de ruptura en la banda 2, región 1, del brazo largo del cromosoma 8 y la banda 2, región2, del brazo largo del cromosoma 14). Siempre se pone en primer término el cromosoma denúmero menor.

Figura 1. Ideograma del cromosoma 2

1

2

Algunos de los símbolos utilizados para la descripción de las reorganizaciones:add.- material adicional de origen desconocido pat.- origen paterno

del.- deleción q.- brazo largoder.- cromosoma derivado r.- cromosoma en anillodic.- dicéntrico p.- brazo cortodir.- directa rob.- trans. Robertsonianadir dup.- duplicación directa t.- translocacióndup.- duplicación tan.- tándemi.- isocromosoma ? - asignación dudosa

ins.- inserción mar.- cromosoma marcadorinv.- inversión mat.- origen maternoinv ins.- inserción inversa mos.- mosaicorep.- recíproca, normalmente translocación

1.2. MosaicismoCuando una persona presenta una anomalía cromosómica, generalmente está presente en todas sus

células en cultivo. Sin embargo, a veces se detectan dos o más fórmulas cromosómicas diferentes. Estasituación se denomina mosaicismo. El mosaicismo puede ser numérico (el tipo más común) o estructural.

Así, mosaicismo, se define como la presencia en un individuo o en un tejido de al menos doslíneas celulares, que difieren desde el punto de vista genético, pero derivan de un solo cigoto.

Una causa frecuente de mosaicismo es la no disyunción de una división mitótica poscigóticatemprana. Por ejemplo, un cigoto con un cromosoma 21 adicional puede perder el cromosomaextra en una división mitótica y continuar su desarrollo como un mosaico 46/47,+21.

En los mosaicos deben describirse todas las líneas celulares, primero las anormales y por últimola normal. Ej: mos 45,X/46,XX.

Dependiendo del momento en que se produce esta anomalía, y de la viabilidad de las líneas celu-lares resultantes, cada una de estas líneas celulares se encontrará en el adulto en una determi-nada proporción que se puede indicar escribiendo entre corchetes después de la descripción decada línea celular diferente el número absoluto de las células analizadas.

Ej: mos 45,X[23]/46,XX[60].Normalmente estos individuos mosaico están menos gravemente afectados (menor expresión

fenotípica) que los individuos trisómicos no afectados por el mosaicismo.El significado del hallazgo del mosaico a menudo resulta difícil de valorar, especialmente si se

identifica prenatalmente.

2. ANOMALÍAS CROMOSÓMICAS ESTRUCTURALES. CLASIFICACIÓN

Las anomalías estructurales son reordenamientos estructurales que se originan por una roturacromosómica seguida de reconstitución en una combinación anormal. Son muy variadas y susefectos son más complejos de predecir que las anomalías numéricas. Pueden afectar a varioscromosomas y al igual que las anomalías numéricas, pueden estar presentes en todas las célulasde una persona o en forma de mosaico.

Se pueden dividir en balanceadas o equilibradas y no balanceadas o desequilibradas. (Tabla 1)

2.1. Anomalías estructurales balanceadas o equilibradas. Son aquellas donde no existe pérdida o ganancia de material genético (los conjuntos cromosó-

micos tienen el complemento normal de información genética) y habitualmente no se acompañande efecto fenotípico, pero pueden tener un riesgo incrementado de anomalía cromosómica en ladescendencia, aunque los individuos afectos sean fenotípicamente normales. Entre ellas, porejemplo, tenemos las translocaciones, las inversiones y las inserciones.

Tabla 1. Anomalías Cromosómicas Estructurales.

Las translocaciones pueden ser translocaciones recíprocas (intercambio de fragmentos cromo-sómicos entre cromosomas) y robertsonianas (donde se intercambia material cromosómico entrelos cromosomas acrocéntricos).

Las inversiones se producen por una doble rotura de un cromosoma y reunión de nuevo tras ungiro (inversión de 180°). Pueden ser inversiones paracéntricas, si las dos roturas afectan a unmismo brazo cromosómico (no cambia la morfología del cromosoma), o pericéntricas, si cadarotura afecta a un brazo cromosómico (cambia la morfología del cromosoma).

-Repercusión fenotípica de las alteraciones cromosómicas estructurales equilibradas

Generalmente, los reordenamientos cromosómicos no tienen efecto fenotípico aparente si sonequilibrados, ya que toda la información genética está presente, aunque su empaquetamiento seadistinto.

Sin embargo, estas alteraciones cromosómicas equilibradas hay que analizarlas individualmenteya que dependiendo del cromosoma o cromosomas implicados y del tamaño del fragmento

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ANOMALÍAS CROMOSÓMICAS ESTRUCTURALES

EQUILIBRADAS

Translocaciones RecíprocasIntercambio de material

cromosómico.

Translocaciones

Robertsonianas

Translocación donde se

produce la fusión de dos

cromosomas acrocéntricos.

Inversión

Cambio de sentido de un

segmento dentro del mismo

cromosoma

Inserción

Transferencia de un segmento

delecionado de un cromosoma

a otro.

DESEQUILIBRADAS

DeleciónPérdida de un segmento de un

cromosoma

DuplicaciónRepetición una o varias veces

de un fragmento cromosómico

Adición

Hallazgo de material extra en

un cromosoma (de otro

cromosoma)

Anillo

Deleción de ambos brazos

cromosómicos y unión del

segmento medio en una

estructura circular.

Isocromosoma

Pérdida completa de un brazo

de un cromosoma y

duplicación del otro brazo.

Cromosoma DicéntricoCromosoma con dos

centrómeros

Cromosomas MarcadoresPequeños elementos

supernumerarios

cromosómico comprometido tendrán un comportamiento determinado en la meiosis, pudiendoconstituir una amenaza para la siguiente generación, por lo que es probable que los portadores deestas anomalías equilibradas produzcan una alta frecuencia de gametos desequilibrados y, portanto, tengan un riesgo incrementado (riesgo teórico del 2 al 12%) de tener descendencia anormalcon cariotipos desequilibrados.

Además, siempre existe la posibilidad de que se produzca un fenotipo anómalo debido a que unade las roturas cromosómicas produzca una disrupción o alteración (mutación) de un gen, o biencambios por efectos de posición.

La frecuencia con la que se ha observado alteraciones clínicas en individuos portadores de alte-raciones cromosómicas balanceadas varía de unas publicaciones a otras (por ejemplo, entre un6% y un 9% para las translocaciones recíprocas). Es importante conocer el riesgo que supone elser portador de estos reordenamientos equilibrados para informar a los pacientes.

2.1.1. Translocaciones RecíprocasEste tipo de reordenamientos se originan por roturas de cromosomas no homólogos con inter-

cambio recíproco de los fragmentos rotos. Generalmente, se produce un intercambio mutuo entresegmentos terminales de los brazos de 2 cromosomas El número cromosómico total no cambia ycomo no hay pérdida de material cromosómico en los puntos de intercambio, el reordenamientonuevo es, en principio, genéticamente balanceado.

Son relativamente frecuentes. 1 de 500 neonatos. Las translocaciones se nombran con una t,seguida entre paréntesis con el número de los 2 cromosomas, y un segundo paréntesis indicandolos puntos de ruptura, como en el ejemplo de la figura 2.

2.1.2. Translocaciones RobertsonianasSon translocaciones donde se produce la fusión de 2 cromosomas acrocéntricos (cromosoma 13,

14, 15, 21 o 22) por una zona muy cercana al centrómero, dando lugar a un cromosoma metacén-trico o submetacéntrico. Se fusionan los brazos largos de los 2 acrocéntricos, teniendo comoconsecuencia la pérdida sistemática e inmediata de los brazos cortos (el número de cromosomasdel individuo quedaría reducido a 45 si no se le suman otras anomalías. El individuo con 45 cromo-somas tendrá un fenotipo normal).

Robertson propuso que los puntos de rotura de la translocación eran p10 y q10 resultando unatranslocación simétrica con pérdida inmediata del cromosoma pequeño portador de los brazoscortos.

Sybenga propuso que los puntos de rotura era en p10 en ambos cromosomas resultando unatranslocación asímétrica (los dos brazos cortos sin centrómero se perderían inmediatamente y losdos centrómeros con los brazos largos se unirían formando una unidad funcional; esta propuestaparece que se encuentra más frecuentemente).

Se nombran con las abreviaturas t o con rob seguida entre paréntesis, de los números de cadauno de los 2 cromosomas seguidos de una q (por ejemplo. t(13q10;14q10)). (Fig. 3)

Figura 2. Ejemplos de translocaciones. A: traslocación recíproca entre los brazos largos de

los cromosomas 7 y 13. B: translocación recíproca entre el brazo largo del cromosoma 4 y el

brazo corto del cromosoma 12.

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Figura 3. Mujer con translocación robertsoniana entre los cromosomas 13 y 14 en el que se observan

también los cromosomas 15 normales. La fórmula cromosómica sería 45,XX,t(13;14)(q10;q10)

Figura 4. Mujer con trisomía 21 derivado de translocación robertsoniana 13;21

Figura 5. Paciente varón con trisomía13 derivado de translocación robertsoniana 13;14,

Aunque un portador de una translocación Robertsoniana es fenotípicamente normal, existe unriesgo de producir gametos desequilibrados, y por tanto de descendencia desequilibrada. Así, porejemplo, las translocaciones Robertsonianas que afectan a los cromosomas 13 y/o 21 producenembriones viables con trisomías 13 o 21. (Fig. 4 y 5)

2.1.3. InversiónLas inversiones suponen dos rupturas en un mismo cromosoma, un giro de 180º y posterior

reunión del segmento fragmentado pero de manera invertida. Es la consecuencia de la rotura deun cromosoma y su reparación según los mecanismos moleculares de reparación del ADN peroinvirtiendo la orientación del segmento implicado.

Figura 6. Imagen e ideograma de inversión pericéntrica. A: Cr 1: inv(1)(p13q21), B: Cr 5:

inv(5)(p11.3;q13.1)

Figura 7. Inversión del cromosoma 9. inv(9)(p11q12)

En cuanto a las consecuencias de las inversiones, al ser una reestructuración equilibrada notiene efectos fenotípicos nocivos para el individuo pero sí puede ser causa de esterilidad, abortosde repetición y producir descendencia con desequilibrio cromosómico o con alteraciones fenotí-picas como consecuencia de que en los sobrecruzamientos meióticos, en el lazo de inversión seformaran gametos recombinantes con duplicaciones, deleciones, cromosomas dicéntricos, etc.También se conocen casos de efectos fenotípicos producidos por el propio cambio en la situaciónrelativa de los genes dentro del cromosoma (efecto de posición), ya que los cromosomas queposeen alguna inversión no cambian de tamaño pero sí cambia la ordenación lineal de los genescomo consecuencia de la misma.

El símbolo utilizado en la formulación cromosómica es inv, seguido entre paréntesis con elnúmero del cromosoma, y en un segundo paréntesis se indica los puntos de ruptura implicados.

Las inversiones se clasifican en atención a que incluyan o no al centrómero; las que lo incluyense llaman pericéntricas (los dos puntos de ruptura implicados está situados en lados opuestos delcentrómero, y la unión invierte un segmento cromosómico que incluye el centrómero) (Fig.6) y lasque no lo incluyen y se localizan en un solo brazo cromosómico se denominan paracéntricas.

Algunas inversiones pericéntricas son muy frecuentes, denominándose cromosomas variantes.Por ejemplo la inv(9)(p11q12), es la inversión más común encontrándose en el 1% de los indivi-duos examinados (con una gran variación geográfica).

Esta inversión no tiene efectos deletéreos conocidos en los portadores y parece que no estáasociada con riesgo significativo de aborto o descendencia desequilibrada; por lo tanto general-mente se considera una variante polimórfica normal. No se ha encontrado descendencia conformás desbalanceadas.

2.1.4. InserciónAnomalía estructural caracterizada por el desplazamiento de un segmento, dentro del mismo

cromosoma o de un cromosoma (donante) a otro (receptor). Se produce porque se deleciona unfragmento intersticial de un cromosoma y se transfiere a una nueva posición en otro cromosoma,ocasionalmente en su homólogo, o en cualquier otro cromosoma. Las inserciones pueden ser

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directas (dir) si las bandas (la información genética) presentan la misma ordenación que teníanen su posición original, siempre respecto al centrómero, o inversas (inv) si están colocadas alrevés.

Aunque aparentemente se trata de un reordenamiento balanceado, puede dar lugar a trisomíasy monosomías parciales en la descendencia produciendo alteraciones en el fenotipo por anoma-lías durante la gametogénesis.

El símbolo utilizado en la formulación cromosómica es ins (Fig. 8), seguido entre paréntesis delnúmero del cromosoma que recibe el fragmento precediendo al número del cromosoma que lodona (si es diferente). En un segundo paréntesis se indica el punto de ruptura donde se ha inser-tado, seguido de los 2 puntos de ruptura que definen al segmento delecionado. (por ejemplo:ins(2)(p13;q31q34) e ins(5;2)(p12;q31q34): el segmento q31q34 del cromosoma 2 se ha insertadorespectivamente en p13 del cromosoma 2, y en p12 del cromosoma 5).

2.2. Anomalías estructurales no balanceadas o desequilibradasLas Anomalías estructurales desbalanceadas o desequilibradas son aquellas donde sí existe

pérdida o ganancia de material genético y se acompañan de efecto fenotípico en menor o mayormedida ya que no conservan el complemento cromosómico íntegro.

2.2.1. DeleciónEs el cambio estructural que tiene como resultado la pérdida de un trozo de cromosoma y de la

información genética que en él se contiene.Las deleciones pueden ser de dos tipos. Si la pérdida es de un segmento terminal (que

incluya un telómero) se llaman terminales o deficiencias. Si la pérdida es de un segmento noterminal (no incluye telómero alguno y suponen dos puntos de ruptura) se llaman intersticialeso deleciones.

En ambos casos el símbolo utilizado para su formulación es del, seguido entre paréntesis con elnúmero de los cromosomas, y en un segundo paréntesis se indican el/los punto(s) de ruptura dela región delecionada (por ejemplo del(5)(q14q34)). Cuando la deleción es intersticial se indican los2 puntos de ruptura; cuando la deleción parece que es terminal se puede indicar sólo 1 punto deruptura.

Como consecuencia siempre hay pérdida de material cromosómico que se traduce en monoso-mías parciales y que generalmente tienen un efecto fenotípico adverso y conlleva un riesgo parala descendencia.

Las alteraciones 4p-, 5p-, 13q-, 17p-, 18p-, 18q-, tienen cada una su propia entidad sindrómicapor sus características fenotípicas.

Figura 8. Inserción entre el Cr. 4 y el Cr. 20.

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Figura 9. Sdre. Wolf Hirschhorn. Deleción de cromosoma 4. del(4)(p15,2)

Figura 10. Sdre. Cri-Du-Chat. Deleción del cromosoma 5. del(5)(p13.2)

Ejemplos de ello:

Síndrome de Wolf-Hirschhorn. Deleción brazo corto del cromosoma 4. (Fig.9)• Rasgos faciales peculiares: nariz en forma de “casco griego”, microcefalia, frente alta con

glabela prominente, hipertelorismo ocular, cejas arqueadas, filtrum corto, boca en V invertida,micrognatia, orejas simplificadas

• Hipotonía• Retraso en el desarrollo/retraso mental• Espasmos 50-100%• Anomalías esqueléticas 60-70%. Cardiopatías congénitas 50%. Sordera >40%

Síndrome de Cri-Du-Chat. (o Síndrome de Maullido de Gato). Deleción brazo corto del cromosoma5. (Fig.10). Es probable que se supriman múltiples genes en dicho cromosoma. Uno de los genessuprimidos llamado transcriptasa inversa de la telomerasa (TERT) está comprometido en el controldel crecimiento celular y puede jugar un papel fundamental en la forma en que se desarrollanalgunas de las características de este síndrome.

• Microcefalia, cara alargada. Hipertelorismo. Micrognatia• Pliegues epicánticos. Orejas de implantación baja• Hipotonía y Retraso psicomotor severo• Retraso mental severo• Grito o llanto característico (similar al de un gato)

Síndrome de Smith-Magenis. Deleción intersticial brazo corto del cromosoma 17. (Fig. 11)• Peso y talla normales• Nariz corta, labio superior evertido, boca en carpa, micrognatia• Retraso del desarrollo• Dificultades de aprendizaje. Retraso mental leve/moderado• Anomalías del comportamiento

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Cromosoma 5

Figura 11. Sdre. Smith-Magenis. Deleción del cromosoma 17. del(17)(p11.2)

Figura 12. Ideograma e imagen de una duplicación del cromosoma 11.

2.2.2. DuplicaciónEs un reordenamiento desbalanceado, producen un exceso de material genético, lo cual puede

dar lugar a una trisomía parcial del cromosoma involucrado que generalmente produce altera-ciones fenotípicas y conllevan un riesgo para la descendencia. Aunque en general, la duplicaciónparece ser mucho menos nociva que la deleción igual que las trisomías parecen ser menos nocivasque las monosomías.

En origen, se producen por una duplicación de material cromosómico, probablemente por unsobrecruzamiento desigual entre cromosomas homólogos durante la profase I de la meiosis I.

El símbolo utilizado en la formulación para indicar duplicación es dup, seguido entre paréntesiscon el número del cromosoma, y en un segundo paréntesis se indica el(los) punto(s) de la regiónduplicada. Ej.: 46,XY,dup(7)(q22q34).

Atendiendo a su localización se pueden clasificar en: Duplicaciones en tándem cuando elsegmento duplicado se encuentra adyacente con el original y duplicaciones desplazadas cuandoel segmento duplicado no está adyacente con el original.

Atendiendo a su orientación las duplicaciones pueden clasificarse en directas (dir) o invertidas(inv). Son directas aquellas en las que la información del segmento duplicado tiene la misma orien-tación que el original tomando como referencia el centrómero y se consideran inversas o invertidasaquellas en las que la disposición de la información genética, respecto al centrómero, en elsegmento duplicado es al revés de la disposición en el original. (Fig. 12).

2.2.3. AdiciónSe produce cuando se encuentra material extra de origen desconocido en un cromosoma, porque

la ausencia de marcadores morfológicos en el segmento adicionado impide conocer su origen.La abreviatura es add y en la formulación sólo es necesario indicar el lugar donde se encuentra el

aumento. Ej.: 46,XY,add(20)(q13). Hombre con material de origen desconocido en el extremo distaldel brazo largo del cromosoma 20.

Suelen ser material procedente del producto de la translocación equilibrada de algunos de susprogenitores. (Fig. 13)

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Cromosoma 17

Cromosoma 11

Figura 13. add(5)(p15). Cromosomas procedentes de un feto de sexo femenino con material de

origen desconocido en el extremo distal del brazo corto del cromosoma 5.

Figura 14. Paciente varón con un cromosoma 13 en anillo cuya fórmula cromosómica sería

46,XY,r(13)(p12q33)

2.2.4. AnillosAnomalía estructural consistente en la pérdida de dos segmentos cromosómicos que incluyen

ambos telómeros, formándose un cromosoma circular. Es una doble deleción terminal concircularización del cromosoma. Debido a estos cambios que se producen en el cromosoma, amenudo conducen a problemas en la mitosis, acompañadas de continuos cambios en el tamañoy composición del anillo. Es por tanto, muchas veces, un reordenamiento inestable. Debido aesta inestabilidad mitótica, es frecuente encontrar cromosomas en anillo en mosaico. Elproducto “de novo” es el más frecuente, y es en muy raras ocasiones transmitido a la descen-dencia.

Las repercusiones en el fenotipo son variables, con signos de trisomías, bien monosomías o dedeleciones. Los cromosomas en anillo son muy raros, pero se han detectado para cada cromo-soma humano. El anillo más frecuente es el que afecta al cromosoma 13.

El símbolo utilizado en la formulación para este tipo de cromosomas es r, seguida entre parén-tesis con el número del cromosoma, y en un segundo paréntesis se indica los puntos de ruptura,si han podido ser identificados . Un ejemplo de ello sería el anillo del cromosoma 13, r(13)(p12q33).(Fig. 14)

2.2.5. IsocromosomaCromosoma con brazos homólogos (los brazos son imágenes especulares). Se produce una

pérdida completa de un brazo de un cromosoma, "reemplazado" por la duplicación del otro brazo(equivale a la monosomía de un brazo y a la trisomía del otro, es decir, es parcialmente monosó-mico y parcialmente trisómico), por tanto, generan fenotipos alterados y conllevan un riesgo parala descendencia. La abreviatura en formulación es i.

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Figura 15. Isocromosoma X. La fórmula cromosómica sería 46,XX,i(X)(q10).

Figura 16. Paciente Mujer con cromosoma 9 derivado de dos deleciones de los extremos distales

de ambos brazos, desde 9p12 y desde 9q31. Fórmula cromosómica: 46,XX,der(9)del(9)(p12)del(9)(q31).

La formación de los isocromosomas puede ser por procesos diferentes desde una translocaciónrobertsoniana entre cromosomas homólogos hasta una misdivisión (anormalidad en la disyunciónde cromátidas hermanas durante anafase II de la meiosis II); en todo caso el punto de rotura yreunión, el centrómero, se formulará q10 o p10 dependiendo de que se trate de un isocromosomade brazo largo o brazo corto respectivamente. Ej.: 46,XY,i(18)(q10). Hombre con 46 cromosomasy con isocromosoma del brazo largo del cromosoma 18.

Esta alteración cromosómica es frecuente en el brazo largo del cromosoma X (en el Síndromede Turner con i(Xq)). (Fig. 15)

2.2.6. Cromosoma DerivadoCromosoma con reordenamientos que implican a dos o más cromosomas o con múltiples anoma-

lías cromosómicas (en un solo cromosoma).En los casos con dos anomalías en un cromosoma después de la abreviatura der se especifica

el cromosoma entre paréntesis y a continuación el tipo de anomalías que tiene (en orden deextremo de brazo corto a extremo de brazo largo). (Fig.16)

2.2.7. Cromosomas MarcadoresCromosoma autónomo, con centrómero y aparentemente funcional, que no se puede identificar

en ninguna de sus partes (suelen ser muy pequeños). Se representan abreviadamente mar en laformulación precedido del signo +. Ej.: 47,XX,+mar. (Fig.17).

Pueden ser pequeños elementos supernumerarios detectados en el cariotipo constitucional, confrecuencia en un estado de mosaico, con o sin repercusión en el fenotipo, ya que muchas vecesconsisten en poco más que heterocromatina céntrica, pero que suponen un problema en el diag-nóstico prenatal ya que es difícil evaluar la importancia clínica de un marcador, y el hallazgo de unode ellos en un cariotipo fetal puede originar un serio problema para el consejo genético, sobre todosi se ha producido ”de novo”.

La frecuencia prenatal de cromosomas marcadores supernumerarios de novo se estima aproxi-madamente de 1 de cada 2500 embarazos.

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Figura 17. Cariograma e imagen ampliada de una paciente femenina con cromosoma marcador

extra. 47,XX,+mar

3. DIAGNÓSTICO CITOGENÉTICO PRENATAL

Según la Organización Mundial de la Salud (OMS) (1980) el diagnóstico prenatal consiste en:“todas aquellas acciones prenatales que tengan por objeto el diagnóstico de un defecto congénito,entendiendo por tal toda anomalía del desarrollo morfológico, estructural, funcional o molecularpresente al nacer (aunque puede manifestarse más tarde).

El diagnóstico prenatal es una empresa multidisciplinaria que abarca desde el análisis citogenético,bioquímico y molecular hasta la asistencia médica.

El propósito del Diagnóstico prenatal no es solo detectar anomalías en la vida fetal y permitir la inte-rrupción del embarazo cuando se encuentra que el feto tiene un defecto, más bien esta técnica tieneel objetivo de permitir a las parejas en riesgo de tener un hijo con un defecto especifico, comenzar unembarazo con el conocimiento de que puede detectarse la presencia o ausencia del trastorno en elfeto, así como tranquilizar y reducir la ansiedad, en especial entre grupos de alto riesgo.

Los grupos de alto riesgo son aquellas parejas, entre otros, que son portadores de alteracionescromosómicas estructurales por ejemplo translocaciones, inversiones..etc, o que presentan malfor-maciones fetales detectadas ecográficamente.

Los grupos que presentan un riesgo moderado son, por ejemplo, las mujeres de 38 años o más ylas parejas que han tenido previamente un hijo con una cromosomopatía, sobre todo si es estructural.

Mientras que los grupos de riesgo bajo son, por ejemplo, las mujeres de 35 a 38 años, o bienmujeres que han tenido previamente un mortinato o un malformado sin estudio cromosómico o bienparejas con una esterilidad idiopática.

Evidentemente y debido al alcance de este tema, nos centraremos solamente en los aspectos cito-genéticos del diagnóstico prenatal.

3.1. Obtención de tejido fetal para el análisis citogenéticoSe realiza mediante métodos invasivos, procedimientos quirúrgicos que irrumpen en el interior de

la madre y penetran en el espacio en el que se encuentra el feto o los tejidos a su alrededor, comoson el útero o el cordón umbilical, con el fin de extraer diferentes tipos de material según el análisisrequerido.

3.1.1. Amniocentesis:La amniocentesis es una técnica de diagnóstico prenatal invasiva que consiste en la punción del

amnios, membrana más interna de la placenta que rodea el feto, para extraer el líquido amnióticopor vía transabdominal por medio de una jeringa guiada por ultrasonido que se suele realizar alre-dedor de la semana 16 de gestación (15-18) con el fin de obtener células fetales útiles para el

12

análisis e implica un riesgo de aborto de aproximadamente un 0,5%. Con esta técnica se obtienencromosomas con una buena calidad citogenética y el resultado se obtiene en 3-4 semanas.

Los problemas que podemos encontrar al realizar una amniocentesis son por ejemplo la nopresencia de células fetales así como el fracaso de crecimiento celular o la contaminación concélulas maternas. La infección materna constituye una complicación rara.

Para su realización es necesaria la obtención, en condiciones estériles, de 10-20 ml de líquidoamniótico (LA) (se aconseja extraer 1 ml por semana de gestación como máximo). (Fig. 18).

3.1.2. Biopsia de vellosidades coriónicas.La biopsia de vellosidades coriónicas consiste en la obtención de material coriónico mediante el

aspirado de tejido trofoblástico del área vellositaria del corion por vía transcervical o transabdo-minal a partir de la novena semana de embarazo, normalmente entre la semana 9 y la 12.(Fig 19).El resultado del informe de la biopsia de corion es más rápido, aunque la tasa de pérdidas fetalesdebida a ella es es un poco mayor que en la amniocentesis y alcanza hasta un 1% si se practicaen la edad gestacional indicada. Otro problema que puede surgir con este método es que no seobtenga suficiente material o que éste esté degenerado, además de la posible contaminación contejido materno y que pueden con frecuencia observarse clones discrepantes.

3.1.3. Funiculocentesis: La funiculocentesis o cordocentesis es un procedimiento empleado para obtener una muestra de

sangre fetal directamente del cordón umbilical con apoyo ecográfico. (Fig. 20). Se usa para propor-cionar un resultado rápido (entre 4 y 6 días) cuando por ejemplo el cultivo de células del liquidoamniótico por amniocentesis ha fallado. Se realiza a partir de la semana 19. El inconveniente deesta técnica es que el índice de abortos tras su práctica es casi del 2% además de un riesgo altode contaminación de la muestra con células maternas.

Figura 18. Amniocentesis y cultivo celular

Figura 19. Representación de una biopsia de corion transcervical e imagen del tejido.

13

Figura 20. Cordocentesis

Figura 21. fibroblasto y célula epitelial de líquido amniótico

Figura 22. Colonia de Fibroblastos.

3.2. Cultivo de líquido amniótico La muestra de LA contiene distintos tipos celulares, procedentes de la descamación de las

membranas que rodean al feto y del propio feto.Dicha celularidad es variada y escasa y, además, la mayoría, son células viejas o muertas, no útilespara un cultivo celular. Los tres tipos celulares más significativos son (Fig 21):- Las células típicas del líquido amniótico o amnióticos- Los fibroblastos y- Las células epiteliales del feto.

Morfológicamente, las células amnióticas son muy parecidas a los fibroblastos, pero de menor tamaño.Los fibroblastos son células típicamente alargadas y son las que se cultivan cuando se hace una amnio-centesis por sus características especiales de crecimiento, ya que cuando un fibroblasto contacta lateral-mente con alguna célula, deja de crecer en ese plano pero puede hacerlo en otro diferente (por arriba,abajo y en todas direcciones) dando a la colonia celular un aspecto caótico de crecimiento (Fig. 22).

En cambio, las células epiteliales típicas y los amniocitos se inhiben por contacto con muchamayor facilidad, dejando de crecer en la dirección en que contactaron y en todas las demás, dandolugar a colonias más pequeñas.

Esta particularidad junto con el hecho de que los fibroblastos presentan un índice mitótico mayorque el del resto de tipos celulares consigue que, a la hora de hacer subcultivos celulares para estu-dios citogenéticos a partir de una muestra de líquido amniótico, haya una selección de un solo tipocelular que además de dividirse rápidamente, lo hace en todas direcciones, minimizando e inhi-biendo el crecimiento del resto.

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Siguiendo las recomendaciones de la Guía de Práctica Clínica Prenatal, Prenatal Diagnostic BestPractice Guidelines (2009), y si el volumen de muestra lo permite, ésta se divide en dos o inclusotres tubos (estériles), obteniendo así posteriormente 2 o 3 líneas de cultivo (normalmente 2).Además, para minimizar el riesgo de contaminación u otros problemas en el cultivo, estas lineasde cultivo deben mantenerse independientes y deben ser manipuladas por separado, mantenidasen dos incubadores distintos y a ser posible sembradas y cultivadas con distinto lote de medio decultivo. Además, se recomienda que los cultivos de muestras prenatales y no prenatales (porejemplo líquido amniótico y sangre periférica o médula ósea) deben incubarse por separado, endistinto incubador para minimizar el riesgo de contaminación microbiana cruzada.

Los tubos conteniendo los especímenes de LA se centrifugan con el fin de recuperar en el botónaquellas pocas células viables para cultivarlas.

Una vez resuspendido el botón, se añade 2.5 ml de medio de cultivo similar al utilizado para el cultivode sangre periférica, el cual contiene sales, hormonas, vitaminas, glucosa y un pH y presión osmóticacontrolados. Este medio se está suplementado con suero fetal bovino, antibiótico y L-glutamina. Todo elcontenido se siembra en frascos de cultivo. El cultivo se mantiene en una estufa a 37ºC y al 5% de CO2.

Durante este proceso de incubación debe llevarse a cabo un control del crecimiento celular: a los 3-4días se realiza la adición de 2.5 ml de medio de cultivo fresco. Al sexto y al noveno día se le realizancambios completos del medio de cultivo. A los 9-11 días de la siembra se debe evaluar el crecimiento delas colonias de células en el fondo del frasco. Se selecciona el frasco que contenga colonias de mejorcalidad y se subcultiva. El subcultivo tiene como finalidad sincronizar el crecimiento del cultivo de formaque se obtengan el mayor número de células posibles en el estadio de la división que nos interesa,además de realizar una selección de un solo tipo celular que tenga la capacidad de dividirse rápidamente.Para ello, se añade tripsina, la cual se encarga de romper las uniones intercelulares ya que se pretendelevantar los fibroblastos adheridos al fondo del frasco en el que se va a hacer el subcultivo.Posteriormente se le añaden 10 ml de medio de cultivo (la acción antitripsina del suero fetal bovino delmedio de cultivo hace que pare la acción de la tripsina y que sedimenten las células, consiguiendo así uncultivo celular en monocapa), se divide el cultivo en dos frascos de cultivo y se incuban ambos frascosdurante 24 h. a 37 ºC en estufa de CO2. Transcurrido este tiempo, si el crecimiento y el índice mitóticoes el adecuado, se sacrifica el cultivo mediante la adición de colchicina y tras una incubación de 90-120minutos, se recolectan las células y se procesan , de una forma similar a la utilizada para el procesadode células de sangre periférica, es decir, se somete la suspensión celular a un choque hipotónico concloruro potásico precalentado a 37 ºC, seguido de una prefijación con solución Carnoy (mezcla de ácidoacético y metanol) y dos fijaciones más con la misma solución, tras lo que se obtiene una suspensióncelular lista para la preparación de extensiones. (Ver tema 1, Formación Continuada de AEFA 2013).

El otro frasco de cultivo se devuelve a la estufa y se mantiene en cultivo por si es necesariocomprobar la fórmula cromosómica observada o descartar la presencia de un mosaicismo opseudo-mosaicismo. A este frasco se le llama “muestra virgen”.

3.3. Indicaciones clínicas del diagnóstico prenatal citogenéticoEl Diagnóstico Prenatal Citogenético en tejido fetal se pueden solicitar siguiendo los criterios que

se indican:1. Cribado combinado del primer trimestre positivo: Edad materna, Translucencianucal, β-HCG libre y PAPP-A (riesgo > 1/270).2. Edad materna avanzada.3. Antecedente de hijo o feto anterior afecto de anomalía cromosómica o malformación asociada acromosomopatía.4. Padres portadores de alteraciones cromosómicas.5. Malformación fetal actual asociada a cromosomopatía (anomalías cardiovasculares, digestivas, genitourinarias o en el pliegue nucal).6. Antecedente de enfermedad cromosómica.7. Ansiedad materna (valorado en consulta de diagnóstico prenatal).

15

4. INTRODUCCIÓN A LAS TÉCNICAS DE CITOGENÉTICA MOLECULAR

A veces, es difícil identificar ciertas anomalías cromosómicas, tales como cromosomas marcadores,translocaciones no balanceadas de novo o algunas regiones anormalmente bandeadas, ya sea encélulas somáticas o de diagnóstico prenatal. Otro inconveniente de las técnicas citogenéticas habi-tuales proviene del hecho de que el análisis cromosómico se realiza en células que se están divi-diendo y los cromosomas deben detenerse en metafase.

Esto significa que el proceso requiere un tiempo y trabajo para obtener células que estén en fasede división y poder realizar el estudio. Por último, la selección que realicemos de las células, puedeen ocasiones conducir a errores, debido a que las células que proliferan in vitro, pueden no repre-sentar la población original (neoplatonicismo).Desde su inicio, hacia 1980, las técnicas de citogenética molecular basadas en la hibridación in situ

fluorescente (FISH) y sus variantes tecnológicas han permitido la detección e identificación precisade un gran número de anomalías cromosómicas, que hasta ese momento pasaban desapercibidas,como las reorganizaciones cromosómicas complejas, las microdeleciones y las reorganizacionescrípticas, alteraciones cromosómicas que por su tamaño < 3-5 Mb son muy difíciles de identificarmediante las técnicas de bandas convencionales.

Estas modernas técnicas de citogenética molecular, basadas en la FISH y que combinan la citoge-nética convencional con la genética molecular, así como otras técnicas surgidas posteriormente comola Hibridación Genómica Comparada, intentan paliar dichas limitaciones.

4.1. FISH (hibridación in situ fluorescente)Muchas de las dificultades anteriormente enumeradas han podido solventarse con la introducción

de la hibridación fluorescente in situ (FISH –fluorescent in situ hybridization–).Esta tecnología, relativamente nueva, proporciona una ayuda importante a las técnicas citogené-

ticas clásicas, debido al hecho de valorar simultáneamente información citogenética y molecularademás de que permite el diagnóstico rápido de anomalías cromosómicas tanto en cromosomas,como en núcleos interfásicos mediante la detección de secuencias específicas de ácidosnucleicos, lo cual nos permite la posibilidad de disponer de un test diagnóstico en 24-48 horas, encontraste con la gran cantidad de tiempo requerido para algunas técnicas citogenéticas (Tabla 2).

La metodología de la FISH se basa en la complementariedad entre las 2 cadenas de ADN dedoble hélice además de en la capacidad de una hebra sencilla de ADN (sonda), para unirse ohibridar con su secuencia específica complementaria.

Tabla 2. Utilidades y aplicaciones clínicas de la FISH

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Utilidades y aplicaciones clínicas de la FISH.

Diagnóstico prenatal. Detección de aneuploidías más frecuentes.

Diagnóstico de diferentes aneuploidías en abortos espontáneos

Caracterización de reestructuraciones cromosómicas. P.e.: Detección e

identificación de Translocaciones no balanceadas “de novo”

Detección de Marcadores cromosómicos

Detección de Deleciones, duplicaciones e isocromosomas.

En general, detección de anomalías cromosómicas en células en interfase

Estudio de anomalías cromosómicas “sutiles” o “crípticas” en zonas

subteloméricas (anomalías subteloméricas).

Identificación de cromosomas marcadores

Parejas con abortos de repetición

Sospecha de síndrome de microdeleción en retraso mental

Figura 23. Esquema de la FISH

La técnica consiste en someter la muestra con los núcleos a calor, para desnaturalizar o abrir ladoble cadena de ADN, y entonces unirla con una sonda. La sonda es la secuencia de ADNcomplementaria a la que queremos localizar, la cual hemos construido usando nucleótidos modifi-cados químicamente que están marcadas con moléculas fluorescentes que permitirán visualizarlacon luz ultravioleta una vez hibridada.

Cuando ponemos el ADN abierto en contacto con la sonda, ésta, como es más pequeña, se uneantes que la propia cadena, y así el cromosoma queda marcado. (Fig. 23)Las células o los cromosomas en metafase que van a ser estudiados se preparan en portaobjetos

para ser evaluados al microscopio, motivo por el que la FISH se llama in situ, porque se hace enun portaobjetos, dónde se fijan las células a estudio. Estas preparaciones se obtienen mediante las técnicas habituales para los estudios citogenéticosde rutina. En el diagnóstico prenatal, pueden utilizarse células amnióticas, de vellosidades corialeso sangre fetal obtenida por punción percutánea del cordón umbilical.

Sin embargo, y esto es uno de los avances más importantes, la FISH no necesita preparacionesobligatoriamente en metafase como sucede con las técnicas citogenéticas standard. Al contrario,puede realizarse un diagnóstico rápido, de gran utilidad sobre todo para el diagnóstico prenatal ypara muestras tumorales, estudiando células inmovilizadas en interfase que se obtienen directa-mente de las muestras o de una extensión/sección y posterior fijación de la muestra. Como cadacromosoma ocupa un territorio dentro del núcleo en interfase, es posible determinar el número decromosomas o determinadas regiones cromosómicas contando el número de señales presentes.Para la observación del FISH al microscopio se requiere de un microscopio de fluorescencia (con

luz ultravioleta) y de un sistema de filtros adecuados de acuerdo con la longitudes de onda de lasseñales fluorescentes (los más comunes: dapi, verde, rojo, aqua)

La capacidad para detectar y caracterizar anomalías cromosómicas mediante FISH ha aumentadoy mejorado en los últimos años por el rápido incremento y perfeccionamiento de sondas cromosó-micas específicas. En la actualidad, pueden detectarse regiones de 1-10 kilobases (Kb) de tamaño.Existen sondas diferentes dependiendo de las distintas necesidades para la detección de anomalíascromosómicas. La elección de la sonda variará con cada aplicación particular en cuestión.

En la actualidad hay un gran número de sondas comerciales disponibles, ofreciendo todas ellasun resultado rápido y fiable en la caracterización de determinadas anomalías cromosómicas.

En general, se distinguen cuatro tipos de sondas, en función de las estructuras que son capacesde detectar en el núcleo celular o en metafase:

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4.1.1. Sondas locus-específicas (LSI).Estas sondas hibridan con una secuencia única de ADN, es decir, son específicas para un locus

determinado. Se conocen como sondas LSI (locus specific identifier) o sondas de secuencia única.Las sondas locus-específicas tienen su aplicación dirigida a la detección de aneuploidías, pero

también permiten detectar reordenamientos estructurales de genes o de regiones cromosómicasconcretas e identificar deleciones y duplicaciones submicroscópicas de hasta 3 Megabases (Mb).

No obstante, su aplicación requiere conocer a priori la región que se desea estudiar.En función de su diana, tienen un tamaño de 1-10 Kb, como los plásmidos, o son vectores más

largos de 80 Kb -1 Mb como los Bacterial artificial chromosomes (BACs) o Yeast artificial chromo-

somes (YACs). Es el ejemplo de la sonda LSI para los cromosomas 13 y 21 utilizada comercial-mente, la cual es un vector de E.coli que contiene una mezcla de secuencias de DNA únicas quese hibridan en la región 13q14 del cromosoma 13 y en las regiones 21q22.13 a 21q22.2 del brazolargo del cromosoma 21. (Fig. 24)

4.1.2. Sondas centroméricas (o alfoides)El DNA satélite o repetitivo constituye aproximadamente del 10 al 20% de todo el DNA humano. En

particular, los cromosomas llevan de 105 a 106 pares de bases de secuencias DNA centroméricas opericentroméricas cortas repetidas en tándem. Las unidades monoméricas que forman estas secuen-cias satélites alfa, a pesar de ser prácticamente idénticos para todos los cromosomas, varían de talmanera (en 2-3% de su secuencia) que muchas son cromosoma-específico lo que permite que lamayor parte de los centrómeros individuales puedan ser distinguidos, a excepción de las parejas decentrómeros de los cromosomas 13 y 21, y de los centrómeros de los cromosomas 14 y 22.

Se han aislado y clonado sondas para estas secuencias específicas para la mayoría de loscromosomas humanos y están comercialmente disponibles, de forma que se pueden detectar eidentificar alteraciones de tipo numérico (monosomías, trisomías...). Se conocen como sondasCEP (chromosome enumeration probe).

Es el ejemplo de la sonda CEP 18/X/Y, plásmido de E.coli utilizado para detectar secuenciassatélite alfa en las regiones centroméricas de los cromosomas 18, X e Y en el screening de aneu-ploidías en líquido amniótico. (Fig. 25).

Figura 24. Sondas de secuencia única 13/21

Figura 25. Sonda CEP 18/X/Y

18

4.1.3. Sondas subteloméricasLos telómeros son una zona del genoma humano con alta concentración de genes y, por tanto,

pequeñas alteraciones en esa zona podrían afectar a genes candidatos a producir síndromes queconlleven retraso mental. La mayoría de estas anomalías teloméricas son indetectables para la citoge-nética convencional, de ahí el nombre de “crípticas” o “sutiles”. Esto es debido a que el tamaño y elpatrón de bandas de estas regiones cromosómicas son muy similares y no se pueden distinguir conve-nientemente como ocurriría en el caso de una translocación, o bien, puede ser debido a que el tamañode la anomalía es tan pequeño que supera el límite de resolución de las actuales técnicas de bandas.Por ello se utilizan sondas subteloméricas, que contienen secuencias específicas de ADN que se

encuentran aproximadamente a 100-300 Kb del extremo del cromosoma y se usan en la identifica-ción de deleciones y rearreglos teloméricos submicroscópicos. Poseen una alta resolución quevaría según la medida de la sonda utilizada (30-100 Kb). (Fig. 26)

4.1.4. Sondas de pintado cromosómico.Las sondas painting o de pintado cromosómico, también conocidas como sondas WCP (whole

chromosome painting) son sondas complejas que utilizan una mezcla de diferentes secuencias deDNA que son homólogas a muchas zonas a lo largo de un cromosoma específico, y que son gene-radas a partir de cromosomas microdiseccionados que se obtienen mediante separación cromosó-mica por citometría de flujo y se marcan y amplifican directamente mediante DOP-PCR(Degenerate Oligonucleotide Primer-Polimerase Chain Reaction). Esto permite que el cromosomasea pintado o decorado tanto en metafase como en el núcleo en interfase.

Con la sonda de pintado cromosómico simple correspondiente a un determinado cromosoma seconsiguen pintar sólo los cromosomas homólogos correspondientes (con excepción de lasregiones centroméricas y teloméricas), permitiendo así detectar de forma rápida, alteracionesnuméricas y estructurales intercromosómicas que afecten a ese cromosoma específico, como porejemplo, detectar translocaciones difíciles de identificar con las técnicas de citogenética conven-cional, así como para identificar el origen de material adicional presente en un cromosoma deri-vado o en pequeños marcadores supernumerarios. (Fig. 27).

Figura 26. FISH con sonda subtelomérica 11p (D11S2071, Cytocell)

Figura 27. Sonda de pintado del cromosoma 6 en color verde, WCP 6 Spectrum Green (Vysis).

19

Los principales inconvenientes de la utilización de estas sondas son la no detección de inver-siones paracentroméricas y su baja resolución, que impide detectar pequeñas deleciones, duplica-ciones y translocaciones (< 2-3 Mb).

Con el pintado cromosómico múltiple se consigue pintar de forma simultánea todos los cromo-somas pero en metafases independientes.

4.2. FISH multicolor o M-FISHEn los últimos años, se han perfeccionado las técnicas de FISH, y han aumentado el número de

sondas comercialmente disponibles. Ello nos permite en la actualidad utilizar distintas sondasmarcadas de manera diferente en una misma preparación, utilizando diferentes colores para lafluorescencia de las diferentes sondas, etc. Hoy por ejemplo, disponemos del Multicolor painting (más conocido como multicolor FISH o M-FISH)

que nos permite analizar en una misma preparación sondas que “dibujarían” con 6-8 colores dife-rentes todos los cromosomas de una metafase, de forma simultánea, pintando cada pareja de cromo-somas homólogos de un color distinto, es decir, permite el análisis directo de todos los cromosomasen un único experimento de FISH. De esta forma, se obtiene un cariotipo en colores (Fig. 28) quepermite detectar y clasificar, de forma rápida, alteraciones numéricas y estructurales intercromosó-micas que provocan un cambio en el patrón característico de pintado de cada cromosoma.

4.3. SKYParalelamente, se ha desarrollado una metodología similar a la M-FISH, que permitía obtener el

denominado cariotipo espectral (Spectral Karyotyping, SKY), mediante el cual se consigue elrastreo del genoma humano completo mediante definición espectral definida para cada cromosoma

La diferencia entre ambas técnicas radica en el modo de adquisición y análisis de las imágenes.Mientras la M-FISH utiliza filtros ópticos específicos para la captura de cada fluorocromo en parti-cular, el SKY, haciendo uso de un interferómetro, realiza una interpretación basándose en elespectro píxel a píxel a lo largo de todo el cromosoma. (Fig. 29).

Figura 28. M-FISH

Figura 29. SKY 20

4.4. CGHLa CGH o Hibridación Genómica Comparada o comparativa es una técnica de citogenética

molecular que nos permite la identificación de ganancias o pérdidas cromosómicas por rastreo delgenoma completo en una simple etapa.

Tiene la ventaja de poder realizar una búsqueda de anomalías a lo largo de todo el genoma sinnecesidad de disponer de información previa acerca de la anomalía cromosómica en cuestión.

Ha sido la primera técnica combinada de citogenética e hibridación in situ fluorescente que hapermitido realizar un análisis global del genoma.

Esta técnica consiste en la hibridación in situ simultánea de dos ADN en igualdad de propor-ciones, el ADN genómico de la muestra de un paciente con un ADN humano normal (ADN de refe-rencia o control) en una extensión cromosómica. Ambos ADNs están marcados con diferentes fluo-rocromos.

Así se marca el ADN problema del paciente con un fluorocromo rojo y el ADN normal control conun fluorocromo verde.

Posteriormente se mezclan y se añade DNA cot-1 que es un DNA placentario rico en secuenciasde repetición capaz de bloquear las hibridaciones no específicas que se puedan dar. Esta mezclade DNAs se hace hibridar con cromosomas normales en metafase. Se produce una reacción porcompetencia, donde si la cantidad de ADN es similar (las marcas rojas y verdes son equitativas) elcolor resultante es amarillo. Sin embargo, en presencia de deleciones o duplicaciones existe unamayor proporción de color verde o rojo, respectivamente. Es decir, si existe una deleción en unazona del genoma del paciente, ésta aparecerá con un color verde porque hay una mayor propor-ción relativa del ADN control (verde), y rojo si existe una duplicación porque hay una mayor propor-ción relativa del ADN problema (rojo). (Fig. 30).

La visualización de las señales fluorescentes son detectadas y analizadas mediante un softwareespecífico y adecuado que realiza un análisis digital, donde se observan las ganancias y pérdidascomparando las desviaciones de señal con respecto a un valor estándar. A partir del análisis de unmínimo de 10-12 células se obtiene el valor promedio y se generan los perfiles de ganancias ypérdidas (por encima del umbral 1.25 de fluorescencia relativa se considera ganancia y por debajodel 0,75 pérdida).

Debido a que la CGH se basa en análisis del DNA, no son importantes ni el cultivo de la muestrani la disponibilidad y la calidad de las metafases. Incluso puede utilizarse en tejidos no viables.Esto hace que esta técnica sea muy útil en el laboratorio de citogenética, sobre todo en las mues-tras en las que el cariotipo no puede ser completado por las técnicas convencionales.

Figura 30. Esquema de la técnica CGH convencional

21

La sensibilidad de la CGH aún está sometida a controversia, pero según los diversos autores laCGH puede detectar anomalías de 2-10 Mb de ADN.

Las anomalías que se puede detectar con la CGH son aneuploidías parciales, bien en forma demarcadores cromosómicos, deleciones parciales o duplicaciones.

Una de las grandes desventajas de la CGH es que no puede detectar anomalías cromosómicasbalanceadas, ya que sólo detecta pérdida o ganancia de material cromosómico. Otra desventajaes que la información que nos proporciona tiene escaso valor en algunos casos de mosaicismo,sobre todo los de baja proporción, ya que las anomalías cromosómicas sólo se detectan si existenen la mayoría de las células de la muestra

La técnica de CGH descrita ha sido reemplazada, actualmente, por la técnica aCGH o CGHarray, la cual, es similar al de CGH, pero la hibridación se realiza en una matriz inmovilizada oarrays, en lugar de extensiones cromosómicas. Posteriormente, estos arrays son escaneados y losdatos analizados con un software adecuado que permite detectar las diferencias en el número decopias entre el ADN del paciente y el ADN control. (Fig.31 y 32).

Figura 31. Escaneado de un microarray CGH . Se muestran los canales rojo y verde a vista completa

y con zoom

Figura 32. Vista cromosómica (abajo) y génica (arriba) del resultado de un aCGH

mostrando el caso de una microdeleción del cromosoma 16 (del16p13.3)

22

Esta hibridación genómica comparativa empleando arrays o cariotipo molecular, como se la hadenominado, permite examinar todo el genoma en un simple chip con una gran resolución, 10 vecesmayor que los cromosomas prometafásicos de 750 bandas, detectando ganancias y pérdidas dematerial cromosómico, sin necesidad, además, de cromosomas metafásicos. Es una técnica entera-mente molecular, con aplicación en citogenética y puede considerarse un “híbrido” de ambas para lacual deben trabajar expertos de las dos disciplinas.

La mayoría de las plataformas de arrays se diseñan para detectar aneuploidías, síndromes demicrodeleción y microduplicación así como rearreglos subteloméricos desbalanceados.

La aplicación de estas técnicas está recomendada en individuos con retraso mental pero con cario-tipo aparentemente normal, retraso en el desarrollo no explicado, autismo, rasgos dismórficos yanomalías congénitas múltiples de causa desconocida.

5. VENTAJAS Y DESVENTAJAS DE LAS DISTINTAS TÉCNICAS CITOGENÉTICAS

Tabla 3. Ventajas y desventajas de las técnicas citogenéticas.

6. RESUMEN

Las anomalías estructurales son reordenamientos estructurales que se originan por una roturacromosómica seguida de reconstitución en una combinación anormal y sus efectos son complejos depredecir.

Las anomalías estructurales balanceadas o equilibradas son aquellas donde no existe pérdida o

23

Técnicas Aplicaciones Ventajas Desventajas

Bandeo G-Identificar anomalías

cromosómicas estructu-

rales y numéricas

-Bajo Costo

-Pesquisa de todo el

genoma.

-Requiere células en

división.

-Baja eficiencia en

cariotipos complejos.

FISH

-Determinar la

presencia número de

copias y localización de

secuencias de ADN.

-Su coste no es dema-

siado elevado.

-Es rápida y sencilla.

-Se aplica a células en

interfase y en división.

-Solo es informativa de

la secuencia que se

desea investigar.

Multi-FISH y SKY

-Detecta rearreglos

cromosómicos

complejos que involu-

cran más de un cromo-

soma.

-Identifica cromosomas

marcadores.

-Pesquisa de todo el

genoma.

-Clarifica rearreglos

cromosómicos

complejos.

-Es laboriosa y de alto

costo.

-Requiere células en

división y de muy

buena calidad.

-No detecta anomalías

intracromosómicas.

aCGH-Detecta pérdidas y

ganancias de secuen-

cias de ADN.

-Pesquisa de todo el

genoma.

-No necesita células en

división.

-Tanto el equipamiento

como los reactivos son

costosos.

-Las anomalías que se

detectan deben ser

confirmadas por FISH.

ganancia de material genético y habitualmente no se acompañan de efecto fenotípico, pero puedentener un riesgo incrementado de anomalía cromosómica en la descendencia, mientras que lasanomalías estructurales desbalanceadas o desequilibradas son aquellas donde sí existe pérdida oganancia de material genético y se acompañan de efecto fenotípico en menor o mayor medida ya queno conservan el complemento cromosómico íntegro.

El diagnóstico citogenético prenatal se puede solicitar siguiendo distintos criterios, entre ellos, uncribado combinado de primer trimestre positivo, en padres portadores de alteraciones cromosómicaso en malformación fetal actual asociada a cromosomopatía.Las técnicas de citogenética molecular han permitido la detección e identificación precisa de un gran

número de anomalías cromosómicas, que con la citogenética convencional pasaban desapercibidas,como las reorganizaciones cromosómicas complejas, las microdeleciones y las reorganizacionescrípticas.Es muy importante quedarnos con el concepto de que ambas técnicas citogenéticas, las convencio-

nales y las moleculares, no son excluyentes entre sí, sino complementarias, y unas vienen a paliarlas limitaciones de las otras.

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ENLACES DE INTERÉS

ACC (Asociación de Citogenética Clínica del Reino Unido):http://www.cytogenetics.org.uk/

AGT (Asociación de Tecnólogos en Genética de USA):http://www.agt-info.org/

ECA (Asociación Europea de Citogenetistas):http://www.e-c-a.eu/EN/

ECARUCA (Registro de Aberraciones Cromosómicas Desbalanceadas de la AsociaciónEuropea de Citogenetistas)http://agserver01.azn.nl:8080/ecaruca/ecaruca.jsp

Atlas de Genética y Citogenética en Oncología y Hematología:http://atlasgeneticsoncology.org

Fuentes en Citogenética Molecular, Universidad de Bari (Italia):http://www.biologia.uniba.it/rmc/

Grupo de Citogenética Molecular de Instituto Sanger:http://www.sanger.ac.uk/HGP/Cytogenetics/

Recursos para Citogenética Molecular:http://www.biologia.uniba.it/rmc/

Variación Cromosómica en el Hombre (Base de Datos): Catálogo de Variantes y AnomalíasCromosómicas:

http://www.wiley.com/legacy/products/subject/life/borgaonkar/index.html

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EVALUACIÓN

CASO CLÍNICO 1

Paciente de 39 años de edad con 17 semanas de gestación a quien se le realizó diagnósticoprenatal citogenético por cultivo de líquido amniótico, obteniéndose como resultado un fetode sexo femenino que presentaba una translocación recíproca entre los brazos largos de loscromosomas 13 y 18, cuya fórmula cromosómica era 46,XX,t(13,18), la cual estaba presenteen todas y cada una de las las 30 metafases analizadas mediante bandeo GTG de 2 frascosde cultivo diferentes (fig. 1). Posteriormente se realizaron estudios cromosómicos de sangreperiférica de ambos padres cuyos resultados fueron normales.

Cromosoma 13 Cromosoma 18Fig 1. Cariotipo parcial con t(13,18).

Con la técnica de bandas GTG no se pudo observar que existiera pérdida de material cromo-sómico, por lo que, en principio, habría que pensar en una translocación recíproca balan-ceada. Pero esto no es posible asegurarlo, ya que puede haber ocurrido un desequilibrio deinformación génica de resultado imprevisible en el paciente (y su descendencia). La altera-ción en los cromosomas fetales se consideró "de novo", ya que dicha alteración no se detectóen el cariotipo de los padres. Se citó a los padres a la consulta de Consejo Genético, dondese les informó adecuadamente y estos optaron por la interrupción voluntaria del embarazo ala semana 21 de gestación. El análisis del feto tras la interrupción mostró una hembra fenotípicamente normal y en elresultado anatomopatológico no se informaron anomalías morfológicas. Al feto se le tomó una muestra de sangre por punción del corazón y una muestra de piel dela región glútea y muslos para estudios cromosómicos. Al analizarse 50 metafases prove-nientes de sangre fetal se halló un complemento cromosómico normal (46, XX) mientras queel cultivo de piel dió como resultado, en las 56 células analizadas, un cariotipo 46, XXt(13q;18q). Este hallazgo demostró que esta alteración cromosómica estaba presente sólo enalgunos tejidos, encontrándonos ante un caso de mosaicismo estructural.

Mosaicismo es la presencia en un individuo o en un tejido de al menos dos líneas celularesque difieren desde el punto de vista genético. No es cierto respecto al mosaicismo:Puede ser numéricoSe pueden detectar dos o más fórmulas cromosómicas diferentesSe puede producir como consecuencia de la no disyunción de una división mitótica poscigó-tica tempranaLas líneas celulares derivan de dos o más cigotos diferentes.

En cuanto a las translocaciones:Se forman por intercambio recíproco de fragmentos rotos de cromosomas. En todas las translocaciones el número cromosómico total cambiaLa mayoría de los casos son reordenamientos balanceados que portan un fenotipo normalaunque existe un riesgo aumentado de producir gametos desequilibrados, y por tanto dedescendencia desequilibrada. A y C son ciertas.

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d)

2 -a)b)c)

d)

En el síndrome del maullido de gato, síndrome producido por una deleción cromosómica, esfalso que:En el periodo neonatal los pacientes presentan un llanto característico, similar al de un gato. Es debido a una deleción del brazo corto del cromosoma 4.Se presenta con microcefalia y retraso mental.Se suprime el gen de la transcriptasa inversa de la telomerasa.

Tras el subcultivo de una muestra de líquido amniótico:Se incuban los subcultivos durante 72 h y después se valora el crecimiento.Si el índice mitótico es el adecuado se sacrifica (se añade la colchicina) el subcultivo a las 24 h.Se le añade la colchicina a las 12 h tras ser subcultivado.Ninguna es cierta.

En cuanto a los métodos utilizados para la obtención de tejido fetal para el análisis cromosó-mico, es cierto:La amniocentesis se debe realizar en la semana 11-14 de gestación. Se prefiere la Obtención de Vellosidades Coriónicas a la amniocentesis por la menor tasa depérdidas fetales.La técnica de elección es la foniculocentesis por proporcionar resultados más precoces Ninguna es cierta.

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4 -a)b)c)d)

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CASO CLÍNICO 2

Paciente masculino de 7 años de edad, sin antecedentes patológicos ni de consanguinidad.A los 3 meses de edad se le diagnostica estenosis de la rama pulmonar bilateral.Posteriormente estrabismo, retraso mental y del desarrollo psicomotor e hipercalcemia. Alexamen físico, punta nasal elevada, labio inferior grueso e hipotonía generalizada. Por elfenotipo se sospecha de Síndrome de Williams, que es una patología multisistémica causadapor la deleción del brazo largo del cromosoma 7, que abarca de 1,5 a 1,8 millones de paresde bases. La identificación de esta deleción se logra en un 95% de los casos medianteestudio por hibridación in situ fluorescente (FISH). Al paciente, se le realiza cariotipo, cuyafórmula cromosómica fue 46,XY correspondiente a un paciente de sexo masculino cromosó-micamente normal. Posteriormente se realiza FISH para la región crítica del síndrome deWilliams situada en 7q, siendo normal. Ante este resultado, se realizó una revisión bibliográ-fica, de modo que se confirmaron los criterios clínicos necesarios para mantener el diagnós-tico, por lo que, teniendo en cuenta la alta sospecha clínica de éste síndrome, se realizóestudio por Hibridación Genómica Comparada, detectándose mediante esta técnica una dele-ción de 1,6 Mb en el cromosoma 7, del(7)(q11.23), confírmándose con esto el diagnóstico deSíndrome de Williams.

La capacidad para detectar y caracterizar anomalías cromosómicas mediante FISH haaumentado y mejorado en los últimos años por el rápido incremento y perfeccionamiento desondas cromosómicas específicas. Respecto a estas sondas cromosómicas, no es cierto:Las sondas LSI son sondas de secuencia única que se unen a las zonas centroméricas delos cromosomas Las sondas centroméricas se usan para identificar cromosomas como el 18 o la X.Las sondas subteloméricas reconocen zonas que contienen gran cantidad de genes.Las sondas WCP sirven para detectar translocaciones difícilles de identificar por citogenéticaconvencional.

Con la CGH se puede realizar una búsqueda de anomalías a lo largo de todo el genoma sinnecesidad de disponer de información previa acerca de la anomalía. Además, es cierto:Consiste en la hibridación in situ simultánea de dos ADN en igualdad de proporciones, el ADNgenómico de la muestra de un paciente con un ADN humano normal.Es muy importante garantizar el éxito en el cultivo de la muestra, así como la disponibilidad yla calidad de las metafases obtenidas, hecho por el cual, puede utilizarse incluso en tejidosno viables.Una de las grandes ventajas de la CGH es que puede detectar pérdida o ganancia de mate-rial cromosómico, así como anomalías cromosómicas balanceadas como las inversionesparacéntricas.Todas son ciertas.

La técnica CGH array, es similar a la CGH, pero la hibridación se realiza en una matriz inmo-vilizada llamados arrays. Respecto a ella, es falso: Tiene una resolución muchísimo mayor que la de un cariotipo de alta resolución por bandeo G.La mayoría de las plataformas de arrays se diseñan para detectar aneuploidías, síndromesde microdeleción y microduplicación así como rearreglos subteloméricos desbalanceados.También se le ha llamado cariotipo molecular. Son necesarios cromosomas metafásicos para su realización.

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1 -

a)

b)c)d)

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a)

b)

c)

d)

3 -

a)b)

c)d)

Las técnicas de citogenética molecular han permitido la detección e identificación precisa deun gran número de anomalías cromosómicas. En cuanto a éstas:La técnica CGH viene a ser la “panacea” de las técnicas citogenéticas. Con ella se puededetectar cualquier tipo de anomalía cromosómica.Con la técnica Multi-FISH se pueden detectar rearreglos intercromosómicos complejos comouna translocaciónCon la técnica Multi-FISH se puede detectar una inversión paracentromérica del cromosoma 3.Con la técnica SKY se puede detectar una inversión pericentromérica del cromosoma 8.

En el caso de las anomalías cromosómicas estructurales, como es el caso de la deleción deeste niño:Cualquier tipo de deleción, debido a que existe pérdida de material cromosómico, es detec-table mediante la práctica de un cariotipo mediante bandeo G en la muestra del paciente.Siempre hay que recurrir a técnicas de citogenética molecular para detectarlas.Puede haber casos de deleciones crípticas intersticiales que se informen como un cariotiponormal.Como consecuencia de una deleción, siempre hay pérdida de material cromosómico que setraduce en monosomías, que al ser parciales, no presentan efecto fenotípico adverso.

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a)

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c)d)

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a)

b)c)

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NOTAS

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