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Anaacutelisis de compuestos
farmaceacuteuticos en sangre total
Agilent Webinar
Julian de la Mata
28 de Marzo de 2012
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Contenido
Preparacioacuten de muestras en la monitorizacioacuten terapeacuteutica
de faacutermacos y quiacutemica foreacutensica
Teacutecnica mini-QuEChERS para el Clean-up de sangre
La teacutecnica de Puntos de Sangre Seca (Dried blood spots)
como una teacutecnica de recoleccioacuten de muestra
Anaacutelisis raacutepidos de HPLCUHPLC a presiones
convencionales con las columnas Poroshell 120
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Dried Blood Spotting
QuEChERS
LCMSMS 1290InfinityQQQ 6400
Extracto Poroshell 120
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Anaacutelisis de Faacutermacos reductores del Colesterol (Estatinas) usando la Tecnologiacutea de Gotas en Matriz Seca (Dried Matrix Spots) y Columnas Poroshell 120
Nota de aplicacioacuten 5990-8305EN
httpwwwchemagilentcomLibraryapplications5990--8305ENpdf
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Introduccioacuten
La tecnologiacutea Gota de Sangre Seca como meacutetodo de muestreo
para el bioanaacutelisis quantitativo de pequentildeas moleacuteculas
Significativa reduccioacuten en los voluacutemenes de sangre necesarios
lo que simplifica la recogida de muestras
Reduccioacuten en el procesamiento el enviacuteo de la muestra y los
gastos de almacenamiento en condiciones ambientales
Estabilidad de los metabolitos en la tarjeta
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Los compuestos
Las Estatinas (inhibidores de la HMG-CoA reductasa) son un
grupo de faacutermacos usados para disminuir los niveles de
colesterol
Se analizaron cuatro estatinas con las nuevas tarjetas de
Dried Matrix Spotting (DMS) no basadas en celulosa
Excepto la atorvastatina estos compuestos que son aacutecidos
por naturaleza son un reto aacute la hora de lograr unos liacutemites de
deteccioacuten bajos
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Propiedades de las Estatinas
Compuesto Estructura Log P pKa
Atorvastatina
636 636
Simvastatina
468 NA
Pravastatina
218 470
Lovastatina
426 NA
Naproxeno (IS)
318 415
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Procedimiento DMS
Fortificacioacuten de sangre humana entera fresca con cada una de las cuatro estatinas para crear una curva de calibracioacuten
Adicioacuten de la sangre fortificada en las tarjetas Agilent Bond Elut DMS (Part A400150)
Se prepararon 3 replicados de concentraciones de sangre a 20 ngmL y 500 ngmL
Secado de las tarjetas
Perforacioacuten de discos de 3 mm y se depositan en viales de 2 mL
Disolucioacuten de cada gota en el solvente de desorcioacuten y vortex
Evaporacioacuten hasta sequedad
Reconstitucioacuten en 100 μL de fase moacutevil (70 5 mM formiato amoacutenico 30 CH3CN) y agitacioacuten
Las muestras se analizaron por LCndashMSndashMS
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Parametros de las transiciones MS-MS para las
estatinas estudiadas
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Cromatograma LCndashMSndashMS de sangre fortificada
con 50 ngmL de estatinas despueacutes del DMS
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Columna Poroshell 120 en la separacioacuten por HPLC
La columna Poroshell 120 ofrece velocidad y alta resolucioacuten
comparable a las columnas sub-2 μm de UHPLC
La tecnologia de partiacuteculas superficialmente genera
separaciones de alta eficacia a menores presiones
Se generaron presiones inferiores a 400 bares
La Poroshell 120 EC-C8 proporciona excelentes formas de
pico para todos los analitos
La atorvastatina puede ser facilmente detectada a 1 ngmL
con una SNR de 797
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Cromatograma LCndashMSndashMS de atorvastatina en
sangre fortificada 1 ngmL
Condiciones LCndashMS
Columna Poroshell 120 EC-C8 27 μm 150 times 21 mm
(Part 693775-906)
Fase Movil
A 5 mM Formiato Amoacutenico B CH3CN
Flujo 200 μLmin
Gradiente
t0 A 70 B 30
t50 A 25 B 75
t55 A 25 B 75
t56 A 70 B 30
t80 A 70 B 30
Temperatura 30 degC
Presioacuten 394 bar
Tiempo anaacutelisis 8 min
Instrumento Agilent 1290 LC
6460 QQQ
Gas temp 275 degC
Gas flow 10 Lmin
Nebulizer 10 psi
Sheath gas temp 250 degC
Sheath gas flow 7 Lmin
Polarity Negative
1 ngmL con una SNR de 797
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Curvas de calibracioacuten representativas de estatinas
en sangre fortificada
Linearidad en las curvas de calibracioacuten para seis niveles de
pravastatina y atorvastatina
Las curvas de Lovastatina y simvastatina no fueron lineales a
las maacutes altas concentraciones y rindieron regresioacuten cuadraacutetica
con coeficientes de correlacioacuten mejores de 0999
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Recuperaciones de estatinas con tarjetas Bond
Elut DMS y tarjetas de celulosa (n = 3)
Los resultados indican que cuando se usan tarjetas de celulosa hay incremento
ionico dando lugar a altas recuperaciones artificiales
Estos datos corroboran que las tarjetas no celulosicas exhiben datos de desorcioacuten
de mejor calidad comparados con las tarjetas tradicionales de celulosa
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Conclusiones
Meacutetodo simple y raacutepido para el anaacutelisis de un grupo de compuestos aciacutedicos en muestras de sangre humana con DMS y LCndashMSndashMS
El meacutetodo ha demostrado se exacto preciso y robusto
Buena linealidad para la pravastatina y atorvastatina usando una regresioacuten lineal con coeficientes de correlacioacuten mejores de 0998
Estas tarjetas ofrecen mejores propiedades de desorcioacuten comparadas con las tarjetas competitivas basadas en celulosa
La columna Poroshell 120 EC-C8 es una excelente eleccioacuten para las aplicaciones bioanaacuteliticas
La tecnologia de Gota de Sangre Seca (Dried blood spots) es una teacutecnica de recoleccioacuten de muestra para el anaacutelisis de faacutermacos en estudios cliacutenicos y precliacutenicos
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Referencias
N Spooner R Lad M Barfield Anal Chem 2009 811557ndash
1563
M Barfield N Spooner R Lad S Parry S Fowles
J Chromatogr B 2008 870 32ndash37
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bullTecnologiacutea Innovadora no-celulosa
bullProporciona un nuevo nivel de confianza en la recoleccioacuten de muestras
bullMejora significativa en la sensibilidad analiacutetica reproducibilidad y faacutecil uso
Anaacutelisis Dried Blood Spotting (DBS)
Desarrollado en colaboracioacuten con Compantildeiacuteas farmaceacuteuticas y CROs este
dispositivo elimina problemas actuales asociados a los sistemas de DBS que
hay en el mercado
bullMuestreo de Sangre plasma o suero (liacutequido sinoviallaacutegrimas bilis LCR) para
anaacutelisis bioanaliacuteticos en pruebas farmaceacuteuticas cliacutenicas y precliacutenicas en
empresasa farmaceacuteuticas de bioanaacutelisis (DMPK ADME y MetID) (no para
Diagnoacutestico cliacutenico)
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La tarjeta sin celulosa es superior de forma medible a las tarjetas de papel de celulosa
Mejora la Sentildeal del MS
bullFormato libre de celulosa ha reducido el enlazado no especiacutefico y no contiene reactivos
quiacutemicos impregnados
Ventajas del Producto
Flujo de trabajo maacutes faacutecil
bull La extraccioacuten de la muestra de la tarjeta
requiere 5 veces menos fuerza que el
producto de celulosa
Proporciona excelente homogeneidad
de la mancha
bull Extracciones reproducibles
recuperaciones maacutes altas
independientemente del nivel de
hematocrito
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bull El nivel de Hematocrito es el porcentaje del volumen de sangre ocupado por las ceacutelulas
rojas de la sangre
bull El material de muestreo Bond Elut DMS tiene una estructura de fibras
maacutes ordenadas comparado con la celulosa estaacutendard
Esta es la razoacuten de porqueacute Bond Elut DMS muestra mejor
reproducibilidad
Mejor Reproducibilidad
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Bond Elut DBS Muestra Mejor Reproducibilidad
Bond Elut DMS tiene una desviacioacuten total de un 5 en todos los niveles HCT mientras que la
tarjeta de celulosa tiene una desviacioacuten de un 52 en todo el rango 10 veces de diferencia
Los datos abajo muestran la desviacioacuten de las medidas del CV desde niveles de HTC
normales (45) para tarjetas Bond Elut DMS y de celulosa (Whatman DMPK-C)
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Ventajas Clave de la Teacutecnica DBS de Agilent
bull Una vez seca la muestra de sangre no supone peligro bioloacutegico alguno y se
puede transportar sin necesidad de sistemas de refrigeracioacuten costosos
bull Permite a los laboratorios centralizar los anaacutelisis de muestra perifeacutericas
bull Se requiere menos volumen de muestra (menor nordm de sujetos en el ensayo
menor nordm de repeticiones y eliminacioacuten de sujetos sateacutelite)
bull Permite la toma demuestra en serie del mismo sujeto
bull La recoleccioacuten de sangre es maacutes sencilla
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Notas de Aplicacioacuten farmaceacuteuticas en Poroshell
120 and DMS Fast Analysis of Cefepime and Related Impurities on Poroshell 120 EC-C18 (publication 5990-7492EN) Comparing Selectivity Easy Transfer of Methods between Superficially Porous Agilent Poroshell 120 EC-C18 and totally Porous Agilent ZORBAX Eclipse Plus C18 (publication 5990-6588EN)
Analysis of Water Soluble Vitamins in Multivitamin Tablets Using Poroshell 120 EC-C18 (publication 5990-8107EN)
Analysis of Anthocyanins in Common Foods Using an Agilent Poroshell 120 SB-C18 (publication 5990-8249EN)
Analysis of Amitriptyline Fluoxetine Quetiapine and Sertraline Using Dried Plasma (publication 5990-8169EN)
Analysis of Amitriptyline Fluoxetine Quetiapine and Sertraline Using Dried Blood Spots (publication 5990-8168EN)
Investigation of Varying Blood Hematocrit Level in Dried Blood Spotting (publication 5990-8306EN)
Analysis of Cholesterol Lowering Drugs (Statins) Using Dried Matrix Spots Technology (publication 5990-8305EN)
Scalability of Agilent Columns Across HPLC and UHPLC Instruments (publication 5990-8428EN)
Converting a CHP Method for Insulin to Agilent Poroshell 120 Columns (publication 5990-9029EN)
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La propuesta QuEChERS para Determinar compuestos
Farmaceacuteuticos y Toxinas en Sangre Total
Anaacutelisis de Compuestos Farmaceacuteuticos en Sangre Total con
la columna Poroshell 120 Usando el meacutetodo Modificado
Mini-QuEChERS para la preparacioacuten de muestra
Nota de Aplicacioacuten5990-8789EN
httpwwwchemagilentcomLibraryapplications5990-8789ENpdf
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Introduccioacuten
Determinacioacuten de compuestos farmaceacuteuticos en anaacutelisis cliacutenicos y
foreacutensicos ADME (DMPK)
La preparacioacuten de muestra va desde la simple precipitacioacuten de
proteinas (PPT) a la maacutes compleja extraccioacuten en fase soacutelida (SPE)
Habitualmente la SPE ha ocupado este vaciacuteo pero simpre hay
espacio para teacutecnicas de preparacioacuten de muestras que son raacutepidas y
baratas de implementar
Se describe un procedimiento mini-QuEChERS modificado con
analisis LCndashMS-MS para la determinacioacuten de faacutermacos en sangre
total
Se analizan nueve diferentes faacutermacos (lidocaina tramadol
amitriptilina biperidina oxazepam lorazepam clorpromazina
diltiazem y naloxona)
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Compuestos farmaceacuteuticos usados en el estudio
Compuesto Nuacutemero CAS Log P (ow) pKa Uso
terapeacuteutico
Lidocaina 137-58-6 24 801 Anesteacutesico local
antiarrithmico
Tramadol 27203-92-5 25 941 Analgesico
Amitriptilina 50-48-6 492 94 Antidepresivo
Biperidena 514-65-8 40 108 Anticolinergico
Oxazepam 604-75-1 223 17 113 Antianxiedad
Lorazepam 846-49-1 247 13 115 Antidepresivo
Clorpromazina 50-53-3 518 93 Antipsycoacutetico
Diltiazem 42399-41-7 363 77 Bloqueante de los
canales del calcio
Naloxona 465-65-6 145 79 Antagonista de los
receptores de opio
Nortriptilina (IS) 72-69-5 565 97
5 ugmL de solucioacuten (9 compuestos) y estandar interno en metanol
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La Teacutecnica de QuEChERS aplicada a las muestras
de sangre
La sangre es el maacutes complejo de los fluidos bioloacutegicos
La determinacioacuten de faacutermacos en sangre total es a menudo necesaria en los
anaacutelisis foreacutensicos dada la dificultad de obtener suero o plasma
Los procedimientos convencionales para analizar faacutermacos en matrices
complejas como la sangre total son complicados
QuEChERS es una teacutecnica de preparacioacuten de muestra que fue desarrollada
para la extraccioacuten de residuos de plaguicidas multi-clase de frutas y vegetales
en 2003
A pesar de que los fluidos bioloacutegicos pueden parecer muy diferentes a una
pieza de fruta sin embargo siguen caminos paralelos
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Caminos paralelos en la preparacioacuten de muestra
Fluidos Bioloacutegicos
Matrices complejas
Rotura de la arquitectura celular
bull Lisis agitacioacuten solvente orgaacutenico
hidroacutelisis
Analitos con un amplio rango de
polaridades
Retirar analito o matriz
Anaacutelisis por LCMSMS GCMS o
GCMSMS
Frutas y Vegetales
Matrices complejas
Rotura de la arquitectura celular
bull Trituracioacuten agitacioacuten solvente
orgaacutenico hidroacutelisis
Analitos con un amplio rango de
polaridades
Retirar analito o matriz
Anaacutelisis por LCMSMS GCMS o
GCMSMS
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Procedimiento baacutesico por SPE para muestras de sangre
El pretratamiento de la sangre total implica la dilucioacuten con una
solucioacuten aacutecida un tampoacuten fosfato o aguaFA
Sonicar 15 minutos rotura de membranas celulares
Centrifugacioacuten
bull Procedimiento de SPE
ndash Acondicionado del cartucho metanol agua
ndash Carga del cartucho muestra
ndash Lavado del cartucho agua con metanol o tampoacuten metanol
ndash Elucioacuten del cartucho eluyente para el anaacutelisis
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Procedimiento Baacutesico QuEChERS
15 g muestra homogeneizada (fortificada)
Antildeadir 15 mL ACN (1 AA) vortex
Antildeadir Sales de Extraccioacuten AOAC agitar
Centrifugar
Transferir 1 u 8 mL a un tubo d-SPE AOAC vortex centrifugar
Transferir al vial de Anaacutelisis
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Ventajas y desventajas del Procedimiento QuEChERS
Ventajas
Extraccioacuten tipo liacutequidoliacutequido
Uso de aacutecido para interrumpir el ligado de proteinas
Exceso de sal para lisar los componentes celulares
Uso de acetonitrilo para facilitar la precipitacioacuten proteacuteica
Uso de SPE dispersiva para adsorber las interferencias de la matriz
Plossl etat J Chrom A 1135 (2006) 19-26
Desventajas
La cantidad de solvente y de muestra requeridos en el meacutetodo no
son ldquobioloacutegicamente adecuadosrdquo
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Propoacutesito de la propuesta mini-Q
Ofrecer un enfoque maacutes adecuado biologicamente
Requirimientos de menores volumenes y tamantildeos de
muestra
Rango de faacutermacos varias polaridades y pKa
Evaluaciacuteoacuten de las interferencias de fondo
Extraccioacuten y datos de recuperacioacuten en un rango
aceptable
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Faacutermacos en sangre Procedimiento mini-QuEChERS
mini-Q
Procedimiento
1 Antildeadir 2 homogeneizadores ceraacutemicos
2 Antildeadir 1 o 2 mL de sangre entera a un tubo de centriacutefuga con tapoacuten de rosca
3 Antildeadir estandar interno vortex
4 Antildeadir 2 mL de ACN acidificado ( 04 FA) vortex 30 seg
5 Antildeadir 500 mg de sales de extraccioacuten agitar vigorsamente 1 minuto centrifugar 5000 rpm 1 min
6 Transferir 1 mL del extraccto al material de d-SPE en tubo de centrifuga vortex centrifugar
7 Antildeadir 200 uL a 800 uL de agua en un vial LC vortex y analizar
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Refinamiento del Procedimiento mini-Q
Paraacutemetros evaluados en la teacutecnica mini-Q
Muestra de sangre total
bull La matriz bioloacutegica maacutes complicada
Adicioacuten de aacutecido tipo y cantidad
bull Efecto en la particioacuten y extraccioacuten
Adicioacuten de las sales de QuEChERS no-tamponadas o
tamponadas con NaAcetato o Citrato
bull Efecto en el extracto inspeccioacuten visual
SPE Dispersiva
bull Limpieza de la matriz y recuperaciones de los compuestos
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Conclusiones del estudio
El ACN con 4 de FA como solvente de extraccioacuten muestra
una lisis maacutes completa de la muestra frente a otros solventes
de extraccioacuten que mostraron una masa soacutelida
Las sales tamponadas AOAC de acetato Soacutedico generan el
extracto maacutes liacutempio y fueron elegidas para la d-SPE
El paso de dSPE no ofrece un clean up adicional para los
meacutetodos de extraccioacuten con sales EN y no tamponadas
principalmente
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Datos de Adquisicoacuten LCMSMS
Compuestos Canales MRM
(mz) Fragmentador
(V) CE (V) RT (min) Delta RT
Lidocaina 1) 23518 gt 861
2) 23518 gt 581
97 11
35
137 04
Tramadol 1) 2642 gt 581
2) 2642 gt 2461
97 15
3
120 04
Amitriptilina 1) 2782 gt 117
2) 2782 gt 105
112 19
19
425 04
Biperidena 1)31223 gt 981
2) 31223 gt 551
123 19
60
423 07
Oxazepam 1) 28706 gt 2409
2) 28706 gt 2689
112 19
7
399 04
Lorazepam 1) 32102 gt 2749
2) 32102 gt 3029
113 15
7
409 04
Clorpromazina 1) 31911 gt 861
2) 31911 gt 581
112 15
43
463 04
Diltiazem 1) 41517 gt 1779
2) 41517 gt 1499
128 19
43
373 04
Naloxona 1) 32816 gt 310
2) 32816 gt 212
123 15
39
082 04
Nortriptilina (IS) 1) 26418 gt 233
2) 26418 gt 91
97 7
19
417 04
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035
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045
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05
0525
055
0575
06
0625
065
0675
07
0725
075
0775
08
0825
085
0875
09
0925
095
0975
1
1025
105
1075
11
1125
115
1175
12
1225
125
1275
13
1325
135
1375
+ESI TIC Scan Frag=800V AOAC_BLANK_110228bd
1 1
Counts vs Acquisition Time (min)
05 1 15 2 25
3 35 4 45 5 55 6 65 7 75 8 85 9 95 10
Columna Poroshell 120 EC-C18 27
micro 21 x 100 mm PN 695775-902
Fase Moacutevil
A 5 mM Acetato Amoacutenico pH 5
2080 MeOHagua
B 5 mM Acetato amoacutencio en ACN
Flujo 04mLmin
Inyeccioacuten 10uL
GT (ordmC) 300
GF (lmin) 7
Nebulizador (psi) 40
SGT (ordmC) 400
SFG (lmin) 12
Capilar (V) 3500
NV (V) 500
Condiciones LCMS
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27
28
29
3
31
32
33
34
35
36
37
38
39
4
41
42
43
44
45
46
47
48
49
5
51
+ESI MRM Frag=1120V CID190 (2782000 -gt 1170000) HQC_6d
1 1
Counts vs Acquisition Time (min) 01 02 03 04 05 06 07 08 09 1 11 12 13 14 15 16 17 18 19 2 21 22 23 24 25 26 27 28 29 3 31 32 33 34 35 36 37 38 39 4 41 42 43 44 45 46
Nalo
xo
ne
Lid
oc
ain
e
Tra
mad
ol
Oxazep
am
Lo
razep
am
Bip
eri
de
n
Am
itri
pty
lin
e
Dil
tiazem
Ch
lorp
rom
azin
e
No
rtri
pty
lin
e (
IS)
Cromatograma LCMSMS de 10 ngmL de sangre total fortificada despueacutes
de extraccioacuten mini-QuEChERS AOAC (NaAc) y d-SPE (50mg PSA y
150mg MgSO4)
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4
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43
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45
46
47
48
49
5
51
+ESI MRM Frag=1120V CID190 (2782000 -gt 1170000) HQC_6d
1 1
Counts vs Acquisition Time (min) 01 02 03 04 05 06 07 08 09 1 11 12 13 14 15 16 17 18 19 2 21 22 23 24 25 26 27 28 29 3 31 32 33 34 35 36 37 38 39 4 41 42 43 44 45 46
1 x10
415 42 425 43 435 44 445 45 455 46 465 47 475 48 485 49 495 5
505 51 515 52 525 53 535 54 545 55 555 56 565 57
+ESI MRM Frag=1120V CID190 (2871000 -gt 2409000) RE_L_1d 1
Counts vs Acquisition Time (min) 305 31 315 32 325 33 335 34 345 35 355 36 365 37 375 38 385 39 395 4 405 41 415 42 425 43 435 44 445 45 455 46 465 47 475
Relacioacuten sentildealruido para el Oxazepam y Lorazepam a
10 ngmL (10 ppb)
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 39
La Naloxone muestra esta curva de linealidad de10-250 ngmL (ppb) con una R2
= 0991
Las curvas de calibracioacuten se generaron con la respuestra relativa (area pico
analitoarea pico IS) frente a la concentracioacuten relativa (concentracion de
analitoconcentracioacuten de IS)
Ejemplo de curva de linealidad para Naloxona extraido
con mini-QuEChERS
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 40
Recuperacioacuten y Reproducibilidad
Compuesto 50 ngmL Spiked
Recuperacioacuten RSD
100 ngmL Spiked
Recuperacioacuten RSD
Lidocaine 987 157 100 118
Tramadol 105 30 104 82
Amitriptyline 104 21 104 82
Biperidene 97 45 99 82
Oxazepam 770 92 78 86
Lorazepam 819 68 818 86
Chlorpromazine 110 103 105 63
Diltiazem 881 27 917 83
Naloxone 806 90 755 77
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 41
Conclusioacutenes y trabajo posterior
El meacutetodo mini-QuEChERS para la extraccioacuten de compuestos farmaceacuteuticos en
sangre total ofrece una alternativa a otras teacutecnicas de preparacioacuten de muestras
La preparacioacuten de muestras mini-QuEChERS es un enfoque simple facil y
barato que requiere una miacutenima experiencia en preparacioacuten de muestras y
miacutenimo equipamiento
Es un punto de partida para ampliar el numero y las clasificaciones evaluadas
en otras matrices bioloacutegicas y en sangre postmortem
El trabajo futuro incluira combinaciones adecuadas tanto de las sales de
extraccioacuten como de los sorbentes de d-SPE por el meacutetodo mini-QuEChERS
La columna Poroshell 120 ofrece una selectividad diferente y excelentes formas
de pico a lo largo del amplio rango de compuestos farmaceacuteuticos usados en este
estudio
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 42
Referencias
(1) M Anastassiades SJ Lehotay D Štajnbaher and FJ Schenk J AOAC Int 86 4121 (2003)
(2) G Stubbings and T Bigwood Anal Chim Acta 637 68 (2009)
(3) RR Rasmussen IMLD Storm PZH Rasmussen J Smedsgaard and KF Nielsen Anal Bioanal Chem 397 765 (2010)
(4) D Smith and K Lynam GCμECD analysis and confirmation of PCBs in fish tissue with Agilent JampW DB-35ms and DB-XLB GC columns Agilent Technologies 5990-6236EN (2010)
(5) F Ploumlssl M Giera and F Bracher J Chrom A 1135 19 (2006)
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 43
MEJORAR LA PRODUCTIVIDAD EN
HPLC ESTAacuteNDAR CON COLUMNAS
POROSHELL
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Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 44
Columnas Poroshell 120 para HPLC y UHPLC
bull 80-90 de eficacia de las sub 2um
bull A presiones un ~40-50 maacutes bajas
bull Con un tamantildeo de partiacutecula de 27um
bull Con una frita de entrada de 2um
bull Con el doble de resolucioacuten de una
columna de 35um
bull Con un liacutemite de presioacuten de 600 bar
bull La partiacutecula tiene un nuacutecleo soacutelido
(17um) y una cubierta exterior porosa
de 05um como zona de difusioacuten
Las Columnas Poroshell 120 tienen
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Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 45
Poroshell 120 proporciona Eficacia Suficiente
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Flujo 0582 mLmin AcetonitriloAgua (6040)
Volumen de Inyeccioacuten 4 microL
TCC 26 oC
DAD Sig=2544nm Ref=360100nm
Muestra Muestra de test RRLC
(PN 5188-6529) inoculada con
50 microL 2 mgmL Tiourea en
aguaacetonitrilo (6535)
25 5 75 10
mAU
0
200
400
600
06
46
0
82
6
11
48
15
18
20
16
2
22
3
28
16
41
32
62
73
97
53
larr N = 25053 Presioacuten = 182 bar
Poroshell 120 EC-C18 30 x 100 mm 27 um
min 25 5 75 10 125
mAU
0
200
400
600
06
49
0
86
5
12
75
17
56
24
18
27
05
34
94
52
81
82
18
13
04
1
larr N = 27295 Presioacuten = 386 bar
Eclipse Plus C18 30 x 100 mm 18 um
gt90 de la Eficacia de una 18um
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 46
iquestEn queacute tipos de instrumentos puede usar
Columnas Poroshell 120 HPLCrsquos y UHPLCrsquos
Consideraciones en UHPLC
bull Las columnas Poroshell 120 tienen un liacutemite de presioacuten de 600 bar
bull Los UHPLC estaacuten ajustados para columnas de bajo volumen por lo tanto las
Poroshell pueden usarse en todos los UHPLC
Consideraciones en HPLC
bull Las Columnas Poroshell 120 trabajan bien por debajo de 400 bar
bull Minimize los volumenes extra columna para las columnas 21 y 30mm ID ndash
siga las instrucciones dadas para las columnas RRHT (18um 600 bar)
bull Use en el detector velocidades adecuadas de adquisicioacuten para picos
estrechos de alta eficacia
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Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 47
Con una frita de 2 um Poroshell 120 no se bloquea
Muestras Complejas- Plasma
Diflusinal in Plasma
0
20
40
60
80
100
120
140
160
180
200
220
240
260
280
300
320
340
360
380
400
1 501 1001 1501 2001 2501
Injections
Pre
ssu
re
0
20000
40000
60000
80000
100000
120000
140000
160000
180000
200000
Eff
icie
ncy (
N)
End Press
Plates
Columna Poroshell 120 EC-C18 30 x 50mm 27um LC Agilent 1200 RRLC (SL)
Muestra Plasma Precipitado 2 partes Plasma 7 Partes 2080 Agua-MeCN w01 Aacutecido Foacutermico con 1 Parte de Diflusinal en
5050 Agua-MeCN 10 ugml (Concentracion Final Diflusinal 1 ugml) Agitado y dejado reposar 10 minutos
No Centrifugado No Filtrado
Volumen de Inyeccioacuten 1ul
Solvente A Agua w01 TFA
Solvente B MeCN w008 TFA
Flujo 1 mlmin 1 ul inyeccioacuten
Tiempo B
0 20
05 90
06 90
11 20
25 20
Page 47
Diflusinal es un anti-inflamatorio no esteroidal anaacutelogo
a la aspirina desarrollado por Merck Sharp amp Dohme
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 48
Las Columnas Superficialmente Porosas Pueden
Usarse cumpliendo los Requirimientos USP
De la lista USP de empaquetamientos de columnas LC 42009
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Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 49
Criterios de Ajuste de Meacutetodos USP y FDA Criterios de Ajuste de Meacutetodos de Dimensiones de Columna
Paraacutemetro Especificaciones Maacuteximas ComentariosEjemplos
Longitud de Columna 70 250mm 75mm
150mm 50mm
Diaacutemetro Interno de
Columna
25 (FDA ORA-LAB 545)
USP ndash 25 ID Columna puede ajustarse si la
velocidad lineal es constante
46 mm 30 mm (-35)
46 mm 21 mm (-54)
30 mm 21 mm (-30)
Flow Rate 50
Volumen de Inyeccioacuten
Reducir tanto como se necesitendash
debe cumplir los liacutemites de
deteccioacuten y precisioacuten
Si cambia a una columna maacutes
corta haga el cambio apropiado
en el volumen de inyeccioacuten
Tamantildeo de Partiacutecula Reducir hasta el 50
(no se puede aumentar)
Puede cambiar la longitud de columna y el
tamantildeo de partiacutecula para mantener la misma
Rs
5um 35um (-30)
5um 27um (-46) Cambiado en 22409 ndash Para la copia oficial y actual ir a
httpwwwfdagovScienceResearchFieldSciencedefaulthtm
USP 30 Second Supplement Revisions PF34(5) en proceso
Ver ldquo Stimuli articlerdquo en Pharmacopeial Forum 2009 35(6)
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Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 50
Comparacioacuten de 46 x 250 mm 5 um con Poroshell
120 EC-C18 46 x 100 mm 27um
min 5 10 15 20 25 30
mAU
0
20
40
60
80
100
97
12
111
16
115
96
126
74
152
48
161
51
164
35
206
87
230
76
292
90
min 5 10 15 20 25 30
mAU
0
50
100
150
200
250
17
19
21
89
23
11
26
06
38
67
44
37 45
58
54
50
59
20
70
37
Anaacutelisis maacutes raacutepido(columna maacutes corta flujo maacutes alto)
Mayor sensibilidad(partiacutecula maacutes pequentildeapico maacutes estrecho)
Maacutes optimizado (un anaacutelisis maacutes raacutepido permite ajustar mejor)
Ambos anaacutelisis en Agilent 1100 G1315B DAD (bajo 400 bar)
No se requiere cambio en la preparacioacuten de muestra frita de entrada
de 2 micras en ambas columnas
325 bar
110 bar
Sulfadiazina
Sulfatiazol
Sulfapiridina
Sulfamerazina
Sulfametazina
Sulfametazol
Sulfametoxipiridazina
Sulfacloropiridazina
Sulfametoxazol
Sulfadimetoxina
Tiempo B
0 8
33 33
34 33
Columna Eclipse Plus C18
46 x 250mm 5um
Flujo 1 mLmin
Fase Moacutevil
A 01 Aacutecido Foacutermico en Agua
B 01 Aacutecido Foacutermico en ACN
Tiempo B
0 8
12 33
132 33
Columna 46 x 100mm
Poroshell 120 EC-C18
27um
Flujo 185 mLmin
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Comparacioacuten de 46 x 250 mm 5 um con Poroshell
120 EC-C18 46 x 100 mm 27um
min 5 10 15 20 25 30
mAU
0
20
40
60
80
100
97
12
111
16
115
96
126
74
152
48
161
51
164
35
206
87
230
76
292
90
110 bar
5
mAU
0
50
100
150
200
250
17
19
21
89
23
11
26
06
38
67
44
37 45
58
54
50
59
20
70
37
325 bar
min
Ver condiciones en diapositiva anterior
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Mejor Resolucioacuten
linea base
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 52
Anaacutelisis maacutes raacutepido del meacutetodo USP para pastillas de
Simvastatina en Columnas Poroshell 120ndash Ajuste del meacutetodo
46 x 250 mm 5-um
Agilent ZORBAX Eclipse Plus C18
46 x 75 mm 27-um
Agilent Poroshell 120 EC-C18
65 CH3CN 35 39 gL NaH2PO4 (pH 45) 45 oC Sig = 238 8 Ref = 360 100 nm
Flujos 15 mLmin para la columna de 5-um 28 mLmin para la columna Poroshell 120 27um
Requerimiento
USP
5-um
(15 mLmin)
27-um
(28 mLmin)
TR na 9907 1457
krsquo gt 30 5962 5122
N gt 4500 16939 14439
Tf lt 20 109 110
min 2 4 6 8 10
mAU
0
5
10
15
20
25
30
35
40
min 2
mAU
0
5
10
15
20
25
30
35
40
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Ajustes de los parametros cromatograficos en la
transferencia de meacutetodos Escalado del volume de inyeccioacuten
v1 x [(r22 x L2)(r1
2 x L1)] = V2
O bien
v2 = V1 x [(d22 x L2)(d1
2 x L1)]
v volume de inyeccioacuten
r radio de la columna
L longitud de la columna
Ajuste del flujo
F2= F1 x (L2L1 ) x (r2r1 )2
L longitud de la columna
F Flujo
r radio de la columna
Ajuste de la longitud del gradiente
En funcioacuten de la longitud de la columna
L2L1= tg2tg1
En funcioacuten del volumen muerto de columna y del flujo
tG2= tG1 x (V2V1) x (F1F2) t tiempos de gradiente
V volumen muerto de columna
F flujo
Columna ID Volumen muerto aprox
por mm longitud
46mm 100uL
30mm 425uL
21mm 208uL
10mm 047uL
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 54
Notas de Aplicacioacuten en Poroshell 120 y QuEChERS
Determination of Hormones in Shrimp by Agilent 1290 Infinity LC with
Agilent Poroshell 120 LC Column and Agilent QuEChERS for Sample
Preparation (publication 5990-6589EN)
Analysis of Pesticide Residues in Green Tea Using Agilent SampliQ
QuEChERS EN Kit by LCMSMS Detection (publication 5990-
6400EN)
Analysis of Pesticide Residues in Rice Using Agilent Bond Elut
QuEChERS AOAC Kit (publication 5990-8034EN)
Poroshell 120 for pharmaceutical analysis
Poroshell 120 Resources
QuEChERS Applications
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 55
Sumario
bull La columna Poroshell 120 es una nueva alternativa para LC de Alta
Resolucioacuten y Alta Velocidad que puede usarse en cualquier HPLC o UHPLC
bull Con la Poroshell 120 se pueden lograr separaciones de alta eficacia a baja
presioacuten
bull Puede usarse con muestras sucias sin ver una elevacioacuten anormal de la
presioacuten
bull Puede usarse en un meacutetodo USP sin comprometer los Criterios de Ajustes de
Meacutetodo
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Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 56
Soporte Teacutecnico Agilent
Teleacutefono de Atencioacuten al Cliente
901 11 68 90
email customercare_spainagilentcom
wwwagilentcomchem
![Page 2: Análisis de compuestos farmacéuticos en sangre total · PDF fileReducción en el procesamiento, el envío de la muestra, y los ... Gas flow: 10 L/min Nebulizer: 10 psi Sheath gas](https://reader031.vdocuments.site/reader031/viewer/2022030405/5a7a81727f8b9a0a668b45aa/html5/thumbnails/2.jpg)
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 2
Contenido
Preparacioacuten de muestras en la monitorizacioacuten terapeacuteutica
de faacutermacos y quiacutemica foreacutensica
Teacutecnica mini-QuEChERS para el Clean-up de sangre
La teacutecnica de Puntos de Sangre Seca (Dried blood spots)
como una teacutecnica de recoleccioacuten de muestra
Anaacutelisis raacutepidos de HPLCUHPLC a presiones
convencionales con las columnas Poroshell 120
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 3
Dried Blood Spotting
QuEChERS
LCMSMS 1290InfinityQQQ 6400
Extracto Poroshell 120
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 4
Anaacutelisis de Faacutermacos reductores del Colesterol (Estatinas) usando la Tecnologiacutea de Gotas en Matriz Seca (Dried Matrix Spots) y Columnas Poroshell 120
Nota de aplicacioacuten 5990-8305EN
httpwwwchemagilentcomLibraryapplications5990--8305ENpdf
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 5
Introduccioacuten
La tecnologiacutea Gota de Sangre Seca como meacutetodo de muestreo
para el bioanaacutelisis quantitativo de pequentildeas moleacuteculas
Significativa reduccioacuten en los voluacutemenes de sangre necesarios
lo que simplifica la recogida de muestras
Reduccioacuten en el procesamiento el enviacuteo de la muestra y los
gastos de almacenamiento en condiciones ambientales
Estabilidad de los metabolitos en la tarjeta
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 6
Los compuestos
Las Estatinas (inhibidores de la HMG-CoA reductasa) son un
grupo de faacutermacos usados para disminuir los niveles de
colesterol
Se analizaron cuatro estatinas con las nuevas tarjetas de
Dried Matrix Spotting (DMS) no basadas en celulosa
Excepto la atorvastatina estos compuestos que son aacutecidos
por naturaleza son un reto aacute la hora de lograr unos liacutemites de
deteccioacuten bajos
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 7
Propiedades de las Estatinas
Compuesto Estructura Log P pKa
Atorvastatina
636 636
Simvastatina
468 NA
Pravastatina
218 470
Lovastatina
426 NA
Naproxeno (IS)
318 415
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 8
Procedimiento DMS
Fortificacioacuten de sangre humana entera fresca con cada una de las cuatro estatinas para crear una curva de calibracioacuten
Adicioacuten de la sangre fortificada en las tarjetas Agilent Bond Elut DMS (Part A400150)
Se prepararon 3 replicados de concentraciones de sangre a 20 ngmL y 500 ngmL
Secado de las tarjetas
Perforacioacuten de discos de 3 mm y se depositan en viales de 2 mL
Disolucioacuten de cada gota en el solvente de desorcioacuten y vortex
Evaporacioacuten hasta sequedad
Reconstitucioacuten en 100 μL de fase moacutevil (70 5 mM formiato amoacutenico 30 CH3CN) y agitacioacuten
Las muestras se analizaron por LCndashMSndashMS
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 9
Parametros de las transiciones MS-MS para las
estatinas estudiadas
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 10
Cromatograma LCndashMSndashMS de sangre fortificada
con 50 ngmL de estatinas despueacutes del DMS
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 11
Columna Poroshell 120 en la separacioacuten por HPLC
La columna Poroshell 120 ofrece velocidad y alta resolucioacuten
comparable a las columnas sub-2 μm de UHPLC
La tecnologia de partiacuteculas superficialmente genera
separaciones de alta eficacia a menores presiones
Se generaron presiones inferiores a 400 bares
La Poroshell 120 EC-C8 proporciona excelentes formas de
pico para todos los analitos
La atorvastatina puede ser facilmente detectada a 1 ngmL
con una SNR de 797
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 12
Cromatograma LCndashMSndashMS de atorvastatina en
sangre fortificada 1 ngmL
Condiciones LCndashMS
Columna Poroshell 120 EC-C8 27 μm 150 times 21 mm
(Part 693775-906)
Fase Movil
A 5 mM Formiato Amoacutenico B CH3CN
Flujo 200 μLmin
Gradiente
t0 A 70 B 30
t50 A 25 B 75
t55 A 25 B 75
t56 A 70 B 30
t80 A 70 B 30
Temperatura 30 degC
Presioacuten 394 bar
Tiempo anaacutelisis 8 min
Instrumento Agilent 1290 LC
6460 QQQ
Gas temp 275 degC
Gas flow 10 Lmin
Nebulizer 10 psi
Sheath gas temp 250 degC
Sheath gas flow 7 Lmin
Polarity Negative
1 ngmL con una SNR de 797
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 13
Curvas de calibracioacuten representativas de estatinas
en sangre fortificada
Linearidad en las curvas de calibracioacuten para seis niveles de
pravastatina y atorvastatina
Las curvas de Lovastatina y simvastatina no fueron lineales a
las maacutes altas concentraciones y rindieron regresioacuten cuadraacutetica
con coeficientes de correlacioacuten mejores de 0999
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 14
Recuperaciones de estatinas con tarjetas Bond
Elut DMS y tarjetas de celulosa (n = 3)
Los resultados indican que cuando se usan tarjetas de celulosa hay incremento
ionico dando lugar a altas recuperaciones artificiales
Estos datos corroboran que las tarjetas no celulosicas exhiben datos de desorcioacuten
de mejor calidad comparados con las tarjetas tradicionales de celulosa
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 15
Conclusiones
Meacutetodo simple y raacutepido para el anaacutelisis de un grupo de compuestos aciacutedicos en muestras de sangre humana con DMS y LCndashMSndashMS
El meacutetodo ha demostrado se exacto preciso y robusto
Buena linealidad para la pravastatina y atorvastatina usando una regresioacuten lineal con coeficientes de correlacioacuten mejores de 0998
Estas tarjetas ofrecen mejores propiedades de desorcioacuten comparadas con las tarjetas competitivas basadas en celulosa
La columna Poroshell 120 EC-C8 es una excelente eleccioacuten para las aplicaciones bioanaacuteliticas
La tecnologia de Gota de Sangre Seca (Dried blood spots) es una teacutecnica de recoleccioacuten de muestra para el anaacutelisis de faacutermacos en estudios cliacutenicos y precliacutenicos
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 16
Referencias
N Spooner R Lad M Barfield Anal Chem 2009 811557ndash
1563
M Barfield N Spooner R Lad S Parry S Fowles
J Chromatogr B 2008 870 32ndash37
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 17
bullTecnologiacutea Innovadora no-celulosa
bullProporciona un nuevo nivel de confianza en la recoleccioacuten de muestras
bullMejora significativa en la sensibilidad analiacutetica reproducibilidad y faacutecil uso
Anaacutelisis Dried Blood Spotting (DBS)
Desarrollado en colaboracioacuten con Compantildeiacuteas farmaceacuteuticas y CROs este
dispositivo elimina problemas actuales asociados a los sistemas de DBS que
hay en el mercado
bullMuestreo de Sangre plasma o suero (liacutequido sinoviallaacutegrimas bilis LCR) para
anaacutelisis bioanaliacuteticos en pruebas farmaceacuteuticas cliacutenicas y precliacutenicas en
empresasa farmaceacuteuticas de bioanaacutelisis (DMPK ADME y MetID) (no para
Diagnoacutestico cliacutenico)
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 18
La tarjeta sin celulosa es superior de forma medible a las tarjetas de papel de celulosa
Mejora la Sentildeal del MS
bullFormato libre de celulosa ha reducido el enlazado no especiacutefico y no contiene reactivos
quiacutemicos impregnados
Ventajas del Producto
Flujo de trabajo maacutes faacutecil
bull La extraccioacuten de la muestra de la tarjeta
requiere 5 veces menos fuerza que el
producto de celulosa
Proporciona excelente homogeneidad
de la mancha
bull Extracciones reproducibles
recuperaciones maacutes altas
independientemente del nivel de
hematocrito
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bull El nivel de Hematocrito es el porcentaje del volumen de sangre ocupado por las ceacutelulas
rojas de la sangre
bull El material de muestreo Bond Elut DMS tiene una estructura de fibras
maacutes ordenadas comparado con la celulosa estaacutendard
Esta es la razoacuten de porqueacute Bond Elut DMS muestra mejor
reproducibilidad
Mejor Reproducibilidad
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Bond Elut DBS Muestra Mejor Reproducibilidad
Bond Elut DMS tiene una desviacioacuten total de un 5 en todos los niveles HCT mientras que la
tarjeta de celulosa tiene una desviacioacuten de un 52 en todo el rango 10 veces de diferencia
Los datos abajo muestran la desviacioacuten de las medidas del CV desde niveles de HTC
normales (45) para tarjetas Bond Elut DMS y de celulosa (Whatman DMPK-C)
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Ventajas Clave de la Teacutecnica DBS de Agilent
bull Una vez seca la muestra de sangre no supone peligro bioloacutegico alguno y se
puede transportar sin necesidad de sistemas de refrigeracioacuten costosos
bull Permite a los laboratorios centralizar los anaacutelisis de muestra perifeacutericas
bull Se requiere menos volumen de muestra (menor nordm de sujetos en el ensayo
menor nordm de repeticiones y eliminacioacuten de sujetos sateacutelite)
bull Permite la toma demuestra en serie del mismo sujeto
bull La recoleccioacuten de sangre es maacutes sencilla
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Notas de Aplicacioacuten farmaceacuteuticas en Poroshell
120 and DMS Fast Analysis of Cefepime and Related Impurities on Poroshell 120 EC-C18 (publication 5990-7492EN) Comparing Selectivity Easy Transfer of Methods between Superficially Porous Agilent Poroshell 120 EC-C18 and totally Porous Agilent ZORBAX Eclipse Plus C18 (publication 5990-6588EN)
Analysis of Water Soluble Vitamins in Multivitamin Tablets Using Poroshell 120 EC-C18 (publication 5990-8107EN)
Analysis of Anthocyanins in Common Foods Using an Agilent Poroshell 120 SB-C18 (publication 5990-8249EN)
Analysis of Amitriptyline Fluoxetine Quetiapine and Sertraline Using Dried Plasma (publication 5990-8169EN)
Analysis of Amitriptyline Fluoxetine Quetiapine and Sertraline Using Dried Blood Spots (publication 5990-8168EN)
Investigation of Varying Blood Hematocrit Level in Dried Blood Spotting (publication 5990-8306EN)
Analysis of Cholesterol Lowering Drugs (Statins) Using Dried Matrix Spots Technology (publication 5990-8305EN)
Scalability of Agilent Columns Across HPLC and UHPLC Instruments (publication 5990-8428EN)
Converting a CHP Method for Insulin to Agilent Poroshell 120 Columns (publication 5990-9029EN)
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La propuesta QuEChERS para Determinar compuestos
Farmaceacuteuticos y Toxinas en Sangre Total
Anaacutelisis de Compuestos Farmaceacuteuticos en Sangre Total con
la columna Poroshell 120 Usando el meacutetodo Modificado
Mini-QuEChERS para la preparacioacuten de muestra
Nota de Aplicacioacuten5990-8789EN
httpwwwchemagilentcomLibraryapplications5990-8789ENpdf
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Introduccioacuten
Determinacioacuten de compuestos farmaceacuteuticos en anaacutelisis cliacutenicos y
foreacutensicos ADME (DMPK)
La preparacioacuten de muestra va desde la simple precipitacioacuten de
proteinas (PPT) a la maacutes compleja extraccioacuten en fase soacutelida (SPE)
Habitualmente la SPE ha ocupado este vaciacuteo pero simpre hay
espacio para teacutecnicas de preparacioacuten de muestras que son raacutepidas y
baratas de implementar
Se describe un procedimiento mini-QuEChERS modificado con
analisis LCndashMS-MS para la determinacioacuten de faacutermacos en sangre
total
Se analizan nueve diferentes faacutermacos (lidocaina tramadol
amitriptilina biperidina oxazepam lorazepam clorpromazina
diltiazem y naloxona)
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 25
Compuestos farmaceacuteuticos usados en el estudio
Compuesto Nuacutemero CAS Log P (ow) pKa Uso
terapeacuteutico
Lidocaina 137-58-6 24 801 Anesteacutesico local
antiarrithmico
Tramadol 27203-92-5 25 941 Analgesico
Amitriptilina 50-48-6 492 94 Antidepresivo
Biperidena 514-65-8 40 108 Anticolinergico
Oxazepam 604-75-1 223 17 113 Antianxiedad
Lorazepam 846-49-1 247 13 115 Antidepresivo
Clorpromazina 50-53-3 518 93 Antipsycoacutetico
Diltiazem 42399-41-7 363 77 Bloqueante de los
canales del calcio
Naloxona 465-65-6 145 79 Antagonista de los
receptores de opio
Nortriptilina (IS) 72-69-5 565 97
5 ugmL de solucioacuten (9 compuestos) y estandar interno en metanol
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La Teacutecnica de QuEChERS aplicada a las muestras
de sangre
La sangre es el maacutes complejo de los fluidos bioloacutegicos
La determinacioacuten de faacutermacos en sangre total es a menudo necesaria en los
anaacutelisis foreacutensicos dada la dificultad de obtener suero o plasma
Los procedimientos convencionales para analizar faacutermacos en matrices
complejas como la sangre total son complicados
QuEChERS es una teacutecnica de preparacioacuten de muestra que fue desarrollada
para la extraccioacuten de residuos de plaguicidas multi-clase de frutas y vegetales
en 2003
A pesar de que los fluidos bioloacutegicos pueden parecer muy diferentes a una
pieza de fruta sin embargo siguen caminos paralelos
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 27
Caminos paralelos en la preparacioacuten de muestra
Fluidos Bioloacutegicos
Matrices complejas
Rotura de la arquitectura celular
bull Lisis agitacioacuten solvente orgaacutenico
hidroacutelisis
Analitos con un amplio rango de
polaridades
Retirar analito o matriz
Anaacutelisis por LCMSMS GCMS o
GCMSMS
Frutas y Vegetales
Matrices complejas
Rotura de la arquitectura celular
bull Trituracioacuten agitacioacuten solvente
orgaacutenico hidroacutelisis
Analitos con un amplio rango de
polaridades
Retirar analito o matriz
Anaacutelisis por LCMSMS GCMS o
GCMSMS
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Procedimiento baacutesico por SPE para muestras de sangre
El pretratamiento de la sangre total implica la dilucioacuten con una
solucioacuten aacutecida un tampoacuten fosfato o aguaFA
Sonicar 15 minutos rotura de membranas celulares
Centrifugacioacuten
bull Procedimiento de SPE
ndash Acondicionado del cartucho metanol agua
ndash Carga del cartucho muestra
ndash Lavado del cartucho agua con metanol o tampoacuten metanol
ndash Elucioacuten del cartucho eluyente para el anaacutelisis
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 29
Procedimiento Baacutesico QuEChERS
15 g muestra homogeneizada (fortificada)
Antildeadir 15 mL ACN (1 AA) vortex
Antildeadir Sales de Extraccioacuten AOAC agitar
Centrifugar
Transferir 1 u 8 mL a un tubo d-SPE AOAC vortex centrifugar
Transferir al vial de Anaacutelisis
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 30
Ventajas y desventajas del Procedimiento QuEChERS
Ventajas
Extraccioacuten tipo liacutequidoliacutequido
Uso de aacutecido para interrumpir el ligado de proteinas
Exceso de sal para lisar los componentes celulares
Uso de acetonitrilo para facilitar la precipitacioacuten proteacuteica
Uso de SPE dispersiva para adsorber las interferencias de la matriz
Plossl etat J Chrom A 1135 (2006) 19-26
Desventajas
La cantidad de solvente y de muestra requeridos en el meacutetodo no
son ldquobioloacutegicamente adecuadosrdquo
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Propoacutesito de la propuesta mini-Q
Ofrecer un enfoque maacutes adecuado biologicamente
Requirimientos de menores volumenes y tamantildeos de
muestra
Rango de faacutermacos varias polaridades y pKa
Evaluaciacuteoacuten de las interferencias de fondo
Extraccioacuten y datos de recuperacioacuten en un rango
aceptable
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Faacutermacos en sangre Procedimiento mini-QuEChERS
mini-Q
Procedimiento
1 Antildeadir 2 homogeneizadores ceraacutemicos
2 Antildeadir 1 o 2 mL de sangre entera a un tubo de centriacutefuga con tapoacuten de rosca
3 Antildeadir estandar interno vortex
4 Antildeadir 2 mL de ACN acidificado ( 04 FA) vortex 30 seg
5 Antildeadir 500 mg de sales de extraccioacuten agitar vigorsamente 1 minuto centrifugar 5000 rpm 1 min
6 Transferir 1 mL del extraccto al material de d-SPE en tubo de centrifuga vortex centrifugar
7 Antildeadir 200 uL a 800 uL de agua en un vial LC vortex y analizar
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 33
Refinamiento del Procedimiento mini-Q
Paraacutemetros evaluados en la teacutecnica mini-Q
Muestra de sangre total
bull La matriz bioloacutegica maacutes complicada
Adicioacuten de aacutecido tipo y cantidad
bull Efecto en la particioacuten y extraccioacuten
Adicioacuten de las sales de QuEChERS no-tamponadas o
tamponadas con NaAcetato o Citrato
bull Efecto en el extracto inspeccioacuten visual
SPE Dispersiva
bull Limpieza de la matriz y recuperaciones de los compuestos
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 34
Conclusiones del estudio
El ACN con 4 de FA como solvente de extraccioacuten muestra
una lisis maacutes completa de la muestra frente a otros solventes
de extraccioacuten que mostraron una masa soacutelida
Las sales tamponadas AOAC de acetato Soacutedico generan el
extracto maacutes liacutempio y fueron elegidas para la d-SPE
El paso de dSPE no ofrece un clean up adicional para los
meacutetodos de extraccioacuten con sales EN y no tamponadas
principalmente
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Datos de Adquisicoacuten LCMSMS
Compuestos Canales MRM
(mz) Fragmentador
(V) CE (V) RT (min) Delta RT
Lidocaina 1) 23518 gt 861
2) 23518 gt 581
97 11
35
137 04
Tramadol 1) 2642 gt 581
2) 2642 gt 2461
97 15
3
120 04
Amitriptilina 1) 2782 gt 117
2) 2782 gt 105
112 19
19
425 04
Biperidena 1)31223 gt 981
2) 31223 gt 551
123 19
60
423 07
Oxazepam 1) 28706 gt 2409
2) 28706 gt 2689
112 19
7
399 04
Lorazepam 1) 32102 gt 2749
2) 32102 gt 3029
113 15
7
409 04
Clorpromazina 1) 31911 gt 861
2) 31911 gt 581
112 15
43
463 04
Diltiazem 1) 41517 gt 1779
2) 41517 gt 1499
128 19
43
373 04
Naloxona 1) 32816 gt 310
2) 32816 gt 212
123 15
39
082 04
Nortriptilina (IS) 1) 26418 gt 233
2) 26418 gt 91
97 7
19
417 04
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05
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06
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065
0675
07
0725
075
0775
08
0825
085
0875
09
0925
095
0975
1
1025
105
1075
11
1125
115
1175
12
1225
125
1275
13
1325
135
1375
+ESI TIC Scan Frag=800V AOAC_BLANK_110228bd
1 1
Counts vs Acquisition Time (min)
05 1 15 2 25
3 35 4 45 5 55 6 65 7 75 8 85 9 95 10
Columna Poroshell 120 EC-C18 27
micro 21 x 100 mm PN 695775-902
Fase Moacutevil
A 5 mM Acetato Amoacutenico pH 5
2080 MeOHagua
B 5 mM Acetato amoacutencio en ACN
Flujo 04mLmin
Inyeccioacuten 10uL
GT (ordmC) 300
GF (lmin) 7
Nebulizador (psi) 40
SGT (ordmC) 400
SFG (lmin) 12
Capilar (V) 3500
NV (V) 500
Condiciones LCMS
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48
49
5
51
+ESI MRM Frag=1120V CID190 (2782000 -gt 1170000) HQC_6d
1 1
Counts vs Acquisition Time (min) 01 02 03 04 05 06 07 08 09 1 11 12 13 14 15 16 17 18 19 2 21 22 23 24 25 26 27 28 29 3 31 32 33 34 35 36 37 38 39 4 41 42 43 44 45 46
Nalo
xo
ne
Lid
oc
ain
e
Tra
mad
ol
Oxazep
am
Lo
razep
am
Bip
eri
de
n
Am
itri
pty
lin
e
Dil
tiazem
Ch
lorp
rom
azin
e
No
rtri
pty
lin
e (
IS)
Cromatograma LCMSMS de 10 ngmL de sangre total fortificada despueacutes
de extraccioacuten mini-QuEChERS AOAC (NaAc) y d-SPE (50mg PSA y
150mg MgSO4)
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2
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39
4
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48
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5
51
+ESI MRM Frag=1120V CID190 (2782000 -gt 1170000) HQC_6d
1 1
Counts vs Acquisition Time (min) 01 02 03 04 05 06 07 08 09 1 11 12 13 14 15 16 17 18 19 2 21 22 23 24 25 26 27 28 29 3 31 32 33 34 35 36 37 38 39 4 41 42 43 44 45 46
1 x10
415 42 425 43 435 44 445 45 455 46 465 47 475 48 485 49 495 5
505 51 515 52 525 53 535 54 545 55 555 56 565 57
+ESI MRM Frag=1120V CID190 (2871000 -gt 2409000) RE_L_1d 1
Counts vs Acquisition Time (min) 305 31 315 32 325 33 335 34 345 35 355 36 365 37 375 38 385 39 395 4 405 41 415 42 425 43 435 44 445 45 455 46 465 47 475
Relacioacuten sentildealruido para el Oxazepam y Lorazepam a
10 ngmL (10 ppb)
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 39
La Naloxone muestra esta curva de linealidad de10-250 ngmL (ppb) con una R2
= 0991
Las curvas de calibracioacuten se generaron con la respuestra relativa (area pico
analitoarea pico IS) frente a la concentracioacuten relativa (concentracion de
analitoconcentracioacuten de IS)
Ejemplo de curva de linealidad para Naloxona extraido
con mini-QuEChERS
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 40
Recuperacioacuten y Reproducibilidad
Compuesto 50 ngmL Spiked
Recuperacioacuten RSD
100 ngmL Spiked
Recuperacioacuten RSD
Lidocaine 987 157 100 118
Tramadol 105 30 104 82
Amitriptyline 104 21 104 82
Biperidene 97 45 99 82
Oxazepam 770 92 78 86
Lorazepam 819 68 818 86
Chlorpromazine 110 103 105 63
Diltiazem 881 27 917 83
Naloxone 806 90 755 77
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 41
Conclusioacutenes y trabajo posterior
El meacutetodo mini-QuEChERS para la extraccioacuten de compuestos farmaceacuteuticos en
sangre total ofrece una alternativa a otras teacutecnicas de preparacioacuten de muestras
La preparacioacuten de muestras mini-QuEChERS es un enfoque simple facil y
barato que requiere una miacutenima experiencia en preparacioacuten de muestras y
miacutenimo equipamiento
Es un punto de partida para ampliar el numero y las clasificaciones evaluadas
en otras matrices bioloacutegicas y en sangre postmortem
El trabajo futuro incluira combinaciones adecuadas tanto de las sales de
extraccioacuten como de los sorbentes de d-SPE por el meacutetodo mini-QuEChERS
La columna Poroshell 120 ofrece una selectividad diferente y excelentes formas
de pico a lo largo del amplio rango de compuestos farmaceacuteuticos usados en este
estudio
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 42
Referencias
(1) M Anastassiades SJ Lehotay D Štajnbaher and FJ Schenk J AOAC Int 86 4121 (2003)
(2) G Stubbings and T Bigwood Anal Chim Acta 637 68 (2009)
(3) RR Rasmussen IMLD Storm PZH Rasmussen J Smedsgaard and KF Nielsen Anal Bioanal Chem 397 765 (2010)
(4) D Smith and K Lynam GCμECD analysis and confirmation of PCBs in fish tissue with Agilent JampW DB-35ms and DB-XLB GC columns Agilent Technologies 5990-6236EN (2010)
(5) F Ploumlssl M Giera and F Bracher J Chrom A 1135 19 (2006)
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 43
MEJORAR LA PRODUCTIVIDAD EN
HPLC ESTAacuteNDAR CON COLUMNAS
POROSHELL
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Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 44
Columnas Poroshell 120 para HPLC y UHPLC
bull 80-90 de eficacia de las sub 2um
bull A presiones un ~40-50 maacutes bajas
bull Con un tamantildeo de partiacutecula de 27um
bull Con una frita de entrada de 2um
bull Con el doble de resolucioacuten de una
columna de 35um
bull Con un liacutemite de presioacuten de 600 bar
bull La partiacutecula tiene un nuacutecleo soacutelido
(17um) y una cubierta exterior porosa
de 05um como zona de difusioacuten
Las Columnas Poroshell 120 tienen
Page 44
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 45
Poroshell 120 proporciona Eficacia Suficiente
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Flujo 0582 mLmin AcetonitriloAgua (6040)
Volumen de Inyeccioacuten 4 microL
TCC 26 oC
DAD Sig=2544nm Ref=360100nm
Muestra Muestra de test RRLC
(PN 5188-6529) inoculada con
50 microL 2 mgmL Tiourea en
aguaacetonitrilo (6535)
25 5 75 10
mAU
0
200
400
600
06
46
0
82
6
11
48
15
18
20
16
2
22
3
28
16
41
32
62
73
97
53
larr N = 25053 Presioacuten = 182 bar
Poroshell 120 EC-C18 30 x 100 mm 27 um
min 25 5 75 10 125
mAU
0
200
400
600
06
49
0
86
5
12
75
17
56
24
18
27
05
34
94
52
81
82
18
13
04
1
larr N = 27295 Presioacuten = 386 bar
Eclipse Plus C18 30 x 100 mm 18 um
gt90 de la Eficacia de una 18um
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 46
iquestEn queacute tipos de instrumentos puede usar
Columnas Poroshell 120 HPLCrsquos y UHPLCrsquos
Consideraciones en UHPLC
bull Las columnas Poroshell 120 tienen un liacutemite de presioacuten de 600 bar
bull Los UHPLC estaacuten ajustados para columnas de bajo volumen por lo tanto las
Poroshell pueden usarse en todos los UHPLC
Consideraciones en HPLC
bull Las Columnas Poroshell 120 trabajan bien por debajo de 400 bar
bull Minimize los volumenes extra columna para las columnas 21 y 30mm ID ndash
siga las instrucciones dadas para las columnas RRHT (18um 600 bar)
bull Use en el detector velocidades adecuadas de adquisicioacuten para picos
estrechos de alta eficacia
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Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 47
Con una frita de 2 um Poroshell 120 no se bloquea
Muestras Complejas- Plasma
Diflusinal in Plasma
0
20
40
60
80
100
120
140
160
180
200
220
240
260
280
300
320
340
360
380
400
1 501 1001 1501 2001 2501
Injections
Pre
ssu
re
0
20000
40000
60000
80000
100000
120000
140000
160000
180000
200000
Eff
icie
ncy (
N)
End Press
Plates
Columna Poroshell 120 EC-C18 30 x 50mm 27um LC Agilent 1200 RRLC (SL)
Muestra Plasma Precipitado 2 partes Plasma 7 Partes 2080 Agua-MeCN w01 Aacutecido Foacutermico con 1 Parte de Diflusinal en
5050 Agua-MeCN 10 ugml (Concentracion Final Diflusinal 1 ugml) Agitado y dejado reposar 10 minutos
No Centrifugado No Filtrado
Volumen de Inyeccioacuten 1ul
Solvente A Agua w01 TFA
Solvente B MeCN w008 TFA
Flujo 1 mlmin 1 ul inyeccioacuten
Tiempo B
0 20
05 90
06 90
11 20
25 20
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Diflusinal es un anti-inflamatorio no esteroidal anaacutelogo
a la aspirina desarrollado por Merck Sharp amp Dohme
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Las Columnas Superficialmente Porosas Pueden
Usarse cumpliendo los Requirimientos USP
De la lista USP de empaquetamientos de columnas LC 42009
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Criterios de Ajuste de Meacutetodos USP y FDA Criterios de Ajuste de Meacutetodos de Dimensiones de Columna
Paraacutemetro Especificaciones Maacuteximas ComentariosEjemplos
Longitud de Columna 70 250mm 75mm
150mm 50mm
Diaacutemetro Interno de
Columna
25 (FDA ORA-LAB 545)
USP ndash 25 ID Columna puede ajustarse si la
velocidad lineal es constante
46 mm 30 mm (-35)
46 mm 21 mm (-54)
30 mm 21 mm (-30)
Flow Rate 50
Volumen de Inyeccioacuten
Reducir tanto como se necesitendash
debe cumplir los liacutemites de
deteccioacuten y precisioacuten
Si cambia a una columna maacutes
corta haga el cambio apropiado
en el volumen de inyeccioacuten
Tamantildeo de Partiacutecula Reducir hasta el 50
(no se puede aumentar)
Puede cambiar la longitud de columna y el
tamantildeo de partiacutecula para mantener la misma
Rs
5um 35um (-30)
5um 27um (-46) Cambiado en 22409 ndash Para la copia oficial y actual ir a
httpwwwfdagovScienceResearchFieldSciencedefaulthtm
USP 30 Second Supplement Revisions PF34(5) en proceso
Ver ldquo Stimuli articlerdquo en Pharmacopeial Forum 2009 35(6)
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Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 50
Comparacioacuten de 46 x 250 mm 5 um con Poroshell
120 EC-C18 46 x 100 mm 27um
min 5 10 15 20 25 30
mAU
0
20
40
60
80
100
97
12
111
16
115
96
126
74
152
48
161
51
164
35
206
87
230
76
292
90
min 5 10 15 20 25 30
mAU
0
50
100
150
200
250
17
19
21
89
23
11
26
06
38
67
44
37 45
58
54
50
59
20
70
37
Anaacutelisis maacutes raacutepido(columna maacutes corta flujo maacutes alto)
Mayor sensibilidad(partiacutecula maacutes pequentildeapico maacutes estrecho)
Maacutes optimizado (un anaacutelisis maacutes raacutepido permite ajustar mejor)
Ambos anaacutelisis en Agilent 1100 G1315B DAD (bajo 400 bar)
No se requiere cambio en la preparacioacuten de muestra frita de entrada
de 2 micras en ambas columnas
325 bar
110 bar
Sulfadiazina
Sulfatiazol
Sulfapiridina
Sulfamerazina
Sulfametazina
Sulfametazol
Sulfametoxipiridazina
Sulfacloropiridazina
Sulfametoxazol
Sulfadimetoxina
Tiempo B
0 8
33 33
34 33
Columna Eclipse Plus C18
46 x 250mm 5um
Flujo 1 mLmin
Fase Moacutevil
A 01 Aacutecido Foacutermico en Agua
B 01 Aacutecido Foacutermico en ACN
Tiempo B
0 8
12 33
132 33
Columna 46 x 100mm
Poroshell 120 EC-C18
27um
Flujo 185 mLmin
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Comparacioacuten de 46 x 250 mm 5 um con Poroshell
120 EC-C18 46 x 100 mm 27um
min 5 10 15 20 25 30
mAU
0
20
40
60
80
100
97
12
111
16
115
96
126
74
152
48
161
51
164
35
206
87
230
76
292
90
110 bar
5
mAU
0
50
100
150
200
250
17
19
21
89
23
11
26
06
38
67
44
37 45
58
54
50
59
20
70
37
325 bar
min
Ver condiciones en diapositiva anterior
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Mejor Resolucioacuten
linea base
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Anaacutelisis maacutes raacutepido del meacutetodo USP para pastillas de
Simvastatina en Columnas Poroshell 120ndash Ajuste del meacutetodo
46 x 250 mm 5-um
Agilent ZORBAX Eclipse Plus C18
46 x 75 mm 27-um
Agilent Poroshell 120 EC-C18
65 CH3CN 35 39 gL NaH2PO4 (pH 45) 45 oC Sig = 238 8 Ref = 360 100 nm
Flujos 15 mLmin para la columna de 5-um 28 mLmin para la columna Poroshell 120 27um
Requerimiento
USP
5-um
(15 mLmin)
27-um
(28 mLmin)
TR na 9907 1457
krsquo gt 30 5962 5122
N gt 4500 16939 14439
Tf lt 20 109 110
min 2 4 6 8 10
mAU
0
5
10
15
20
25
30
35
40
min 2
mAU
0
5
10
15
20
25
30
35
40
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Ajustes de los parametros cromatograficos en la
transferencia de meacutetodos Escalado del volume de inyeccioacuten
v1 x [(r22 x L2)(r1
2 x L1)] = V2
O bien
v2 = V1 x [(d22 x L2)(d1
2 x L1)]
v volume de inyeccioacuten
r radio de la columna
L longitud de la columna
Ajuste del flujo
F2= F1 x (L2L1 ) x (r2r1 )2
L longitud de la columna
F Flujo
r radio de la columna
Ajuste de la longitud del gradiente
En funcioacuten de la longitud de la columna
L2L1= tg2tg1
En funcioacuten del volumen muerto de columna y del flujo
tG2= tG1 x (V2V1) x (F1F2) t tiempos de gradiente
V volumen muerto de columna
F flujo
Columna ID Volumen muerto aprox
por mm longitud
46mm 100uL
30mm 425uL
21mm 208uL
10mm 047uL
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 54
Notas de Aplicacioacuten en Poroshell 120 y QuEChERS
Determination of Hormones in Shrimp by Agilent 1290 Infinity LC with
Agilent Poroshell 120 LC Column and Agilent QuEChERS for Sample
Preparation (publication 5990-6589EN)
Analysis of Pesticide Residues in Green Tea Using Agilent SampliQ
QuEChERS EN Kit by LCMSMS Detection (publication 5990-
6400EN)
Analysis of Pesticide Residues in Rice Using Agilent Bond Elut
QuEChERS AOAC Kit (publication 5990-8034EN)
Poroshell 120 for pharmaceutical analysis
Poroshell 120 Resources
QuEChERS Applications
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Sumario
bull La columna Poroshell 120 es una nueva alternativa para LC de Alta
Resolucioacuten y Alta Velocidad que puede usarse en cualquier HPLC o UHPLC
bull Con la Poroshell 120 se pueden lograr separaciones de alta eficacia a baja
presioacuten
bull Puede usarse con muestras sucias sin ver una elevacioacuten anormal de la
presioacuten
bull Puede usarse en un meacutetodo USP sin comprometer los Criterios de Ajustes de
Meacutetodo
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Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 56
Soporte Teacutecnico Agilent
Teleacutefono de Atencioacuten al Cliente
901 11 68 90
email customercare_spainagilentcom
wwwagilentcomchem
![Page 3: Análisis de compuestos farmacéuticos en sangre total · PDF fileReducción en el procesamiento, el envío de la muestra, y los ... Gas flow: 10 L/min Nebulizer: 10 psi Sheath gas](https://reader031.vdocuments.site/reader031/viewer/2022030405/5a7a81727f8b9a0a668b45aa/html5/thumbnails/3.jpg)
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 3
Dried Blood Spotting
QuEChERS
LCMSMS 1290InfinityQQQ 6400
Extracto Poroshell 120
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 4
Anaacutelisis de Faacutermacos reductores del Colesterol (Estatinas) usando la Tecnologiacutea de Gotas en Matriz Seca (Dried Matrix Spots) y Columnas Poroshell 120
Nota de aplicacioacuten 5990-8305EN
httpwwwchemagilentcomLibraryapplications5990--8305ENpdf
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 5
Introduccioacuten
La tecnologiacutea Gota de Sangre Seca como meacutetodo de muestreo
para el bioanaacutelisis quantitativo de pequentildeas moleacuteculas
Significativa reduccioacuten en los voluacutemenes de sangre necesarios
lo que simplifica la recogida de muestras
Reduccioacuten en el procesamiento el enviacuteo de la muestra y los
gastos de almacenamiento en condiciones ambientales
Estabilidad de los metabolitos en la tarjeta
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 6
Los compuestos
Las Estatinas (inhibidores de la HMG-CoA reductasa) son un
grupo de faacutermacos usados para disminuir los niveles de
colesterol
Se analizaron cuatro estatinas con las nuevas tarjetas de
Dried Matrix Spotting (DMS) no basadas en celulosa
Excepto la atorvastatina estos compuestos que son aacutecidos
por naturaleza son un reto aacute la hora de lograr unos liacutemites de
deteccioacuten bajos
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 7
Propiedades de las Estatinas
Compuesto Estructura Log P pKa
Atorvastatina
636 636
Simvastatina
468 NA
Pravastatina
218 470
Lovastatina
426 NA
Naproxeno (IS)
318 415
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 8
Procedimiento DMS
Fortificacioacuten de sangre humana entera fresca con cada una de las cuatro estatinas para crear una curva de calibracioacuten
Adicioacuten de la sangre fortificada en las tarjetas Agilent Bond Elut DMS (Part A400150)
Se prepararon 3 replicados de concentraciones de sangre a 20 ngmL y 500 ngmL
Secado de las tarjetas
Perforacioacuten de discos de 3 mm y se depositan en viales de 2 mL
Disolucioacuten de cada gota en el solvente de desorcioacuten y vortex
Evaporacioacuten hasta sequedad
Reconstitucioacuten en 100 μL de fase moacutevil (70 5 mM formiato amoacutenico 30 CH3CN) y agitacioacuten
Las muestras se analizaron por LCndashMSndashMS
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 9
Parametros de las transiciones MS-MS para las
estatinas estudiadas
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 10
Cromatograma LCndashMSndashMS de sangre fortificada
con 50 ngmL de estatinas despueacutes del DMS
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 11
Columna Poroshell 120 en la separacioacuten por HPLC
La columna Poroshell 120 ofrece velocidad y alta resolucioacuten
comparable a las columnas sub-2 μm de UHPLC
La tecnologia de partiacuteculas superficialmente genera
separaciones de alta eficacia a menores presiones
Se generaron presiones inferiores a 400 bares
La Poroshell 120 EC-C8 proporciona excelentes formas de
pico para todos los analitos
La atorvastatina puede ser facilmente detectada a 1 ngmL
con una SNR de 797
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 12
Cromatograma LCndashMSndashMS de atorvastatina en
sangre fortificada 1 ngmL
Condiciones LCndashMS
Columna Poroshell 120 EC-C8 27 μm 150 times 21 mm
(Part 693775-906)
Fase Movil
A 5 mM Formiato Amoacutenico B CH3CN
Flujo 200 μLmin
Gradiente
t0 A 70 B 30
t50 A 25 B 75
t55 A 25 B 75
t56 A 70 B 30
t80 A 70 B 30
Temperatura 30 degC
Presioacuten 394 bar
Tiempo anaacutelisis 8 min
Instrumento Agilent 1290 LC
6460 QQQ
Gas temp 275 degC
Gas flow 10 Lmin
Nebulizer 10 psi
Sheath gas temp 250 degC
Sheath gas flow 7 Lmin
Polarity Negative
1 ngmL con una SNR de 797
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 13
Curvas de calibracioacuten representativas de estatinas
en sangre fortificada
Linearidad en las curvas de calibracioacuten para seis niveles de
pravastatina y atorvastatina
Las curvas de Lovastatina y simvastatina no fueron lineales a
las maacutes altas concentraciones y rindieron regresioacuten cuadraacutetica
con coeficientes de correlacioacuten mejores de 0999
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 14
Recuperaciones de estatinas con tarjetas Bond
Elut DMS y tarjetas de celulosa (n = 3)
Los resultados indican que cuando se usan tarjetas de celulosa hay incremento
ionico dando lugar a altas recuperaciones artificiales
Estos datos corroboran que las tarjetas no celulosicas exhiben datos de desorcioacuten
de mejor calidad comparados con las tarjetas tradicionales de celulosa
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 15
Conclusiones
Meacutetodo simple y raacutepido para el anaacutelisis de un grupo de compuestos aciacutedicos en muestras de sangre humana con DMS y LCndashMSndashMS
El meacutetodo ha demostrado se exacto preciso y robusto
Buena linealidad para la pravastatina y atorvastatina usando una regresioacuten lineal con coeficientes de correlacioacuten mejores de 0998
Estas tarjetas ofrecen mejores propiedades de desorcioacuten comparadas con las tarjetas competitivas basadas en celulosa
La columna Poroshell 120 EC-C8 es una excelente eleccioacuten para las aplicaciones bioanaacuteliticas
La tecnologia de Gota de Sangre Seca (Dried blood spots) es una teacutecnica de recoleccioacuten de muestra para el anaacutelisis de faacutermacos en estudios cliacutenicos y precliacutenicos
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 16
Referencias
N Spooner R Lad M Barfield Anal Chem 2009 811557ndash
1563
M Barfield N Spooner R Lad S Parry S Fowles
J Chromatogr B 2008 870 32ndash37
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 17
bullTecnologiacutea Innovadora no-celulosa
bullProporciona un nuevo nivel de confianza en la recoleccioacuten de muestras
bullMejora significativa en la sensibilidad analiacutetica reproducibilidad y faacutecil uso
Anaacutelisis Dried Blood Spotting (DBS)
Desarrollado en colaboracioacuten con Compantildeiacuteas farmaceacuteuticas y CROs este
dispositivo elimina problemas actuales asociados a los sistemas de DBS que
hay en el mercado
bullMuestreo de Sangre plasma o suero (liacutequido sinoviallaacutegrimas bilis LCR) para
anaacutelisis bioanaliacuteticos en pruebas farmaceacuteuticas cliacutenicas y precliacutenicas en
empresasa farmaceacuteuticas de bioanaacutelisis (DMPK ADME y MetID) (no para
Diagnoacutestico cliacutenico)
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 18
La tarjeta sin celulosa es superior de forma medible a las tarjetas de papel de celulosa
Mejora la Sentildeal del MS
bullFormato libre de celulosa ha reducido el enlazado no especiacutefico y no contiene reactivos
quiacutemicos impregnados
Ventajas del Producto
Flujo de trabajo maacutes faacutecil
bull La extraccioacuten de la muestra de la tarjeta
requiere 5 veces menos fuerza que el
producto de celulosa
Proporciona excelente homogeneidad
de la mancha
bull Extracciones reproducibles
recuperaciones maacutes altas
independientemente del nivel de
hematocrito
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 19
bull El nivel de Hematocrito es el porcentaje del volumen de sangre ocupado por las ceacutelulas
rojas de la sangre
bull El material de muestreo Bond Elut DMS tiene una estructura de fibras
maacutes ordenadas comparado con la celulosa estaacutendard
Esta es la razoacuten de porqueacute Bond Elut DMS muestra mejor
reproducibilidad
Mejor Reproducibilidad
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 20
Bond Elut DBS Muestra Mejor Reproducibilidad
Bond Elut DMS tiene una desviacioacuten total de un 5 en todos los niveles HCT mientras que la
tarjeta de celulosa tiene una desviacioacuten de un 52 en todo el rango 10 veces de diferencia
Los datos abajo muestran la desviacioacuten de las medidas del CV desde niveles de HTC
normales (45) para tarjetas Bond Elut DMS y de celulosa (Whatman DMPK-C)
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 21
Ventajas Clave de la Teacutecnica DBS de Agilent
bull Una vez seca la muestra de sangre no supone peligro bioloacutegico alguno y se
puede transportar sin necesidad de sistemas de refrigeracioacuten costosos
bull Permite a los laboratorios centralizar los anaacutelisis de muestra perifeacutericas
bull Se requiere menos volumen de muestra (menor nordm de sujetos en el ensayo
menor nordm de repeticiones y eliminacioacuten de sujetos sateacutelite)
bull Permite la toma demuestra en serie del mismo sujeto
bull La recoleccioacuten de sangre es maacutes sencilla
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 22
Notas de Aplicacioacuten farmaceacuteuticas en Poroshell
120 and DMS Fast Analysis of Cefepime and Related Impurities on Poroshell 120 EC-C18 (publication 5990-7492EN) Comparing Selectivity Easy Transfer of Methods between Superficially Porous Agilent Poroshell 120 EC-C18 and totally Porous Agilent ZORBAX Eclipse Plus C18 (publication 5990-6588EN)
Analysis of Water Soluble Vitamins in Multivitamin Tablets Using Poroshell 120 EC-C18 (publication 5990-8107EN)
Analysis of Anthocyanins in Common Foods Using an Agilent Poroshell 120 SB-C18 (publication 5990-8249EN)
Analysis of Amitriptyline Fluoxetine Quetiapine and Sertraline Using Dried Plasma (publication 5990-8169EN)
Analysis of Amitriptyline Fluoxetine Quetiapine and Sertraline Using Dried Blood Spots (publication 5990-8168EN)
Investigation of Varying Blood Hematocrit Level in Dried Blood Spotting (publication 5990-8306EN)
Analysis of Cholesterol Lowering Drugs (Statins) Using Dried Matrix Spots Technology (publication 5990-8305EN)
Scalability of Agilent Columns Across HPLC and UHPLC Instruments (publication 5990-8428EN)
Converting a CHP Method for Insulin to Agilent Poroshell 120 Columns (publication 5990-9029EN)
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 23
La propuesta QuEChERS para Determinar compuestos
Farmaceacuteuticos y Toxinas en Sangre Total
Anaacutelisis de Compuestos Farmaceacuteuticos en Sangre Total con
la columna Poroshell 120 Usando el meacutetodo Modificado
Mini-QuEChERS para la preparacioacuten de muestra
Nota de Aplicacioacuten5990-8789EN
httpwwwchemagilentcomLibraryapplications5990-8789ENpdf
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 24
Introduccioacuten
Determinacioacuten de compuestos farmaceacuteuticos en anaacutelisis cliacutenicos y
foreacutensicos ADME (DMPK)
La preparacioacuten de muestra va desde la simple precipitacioacuten de
proteinas (PPT) a la maacutes compleja extraccioacuten en fase soacutelida (SPE)
Habitualmente la SPE ha ocupado este vaciacuteo pero simpre hay
espacio para teacutecnicas de preparacioacuten de muestras que son raacutepidas y
baratas de implementar
Se describe un procedimiento mini-QuEChERS modificado con
analisis LCndashMS-MS para la determinacioacuten de faacutermacos en sangre
total
Se analizan nueve diferentes faacutermacos (lidocaina tramadol
amitriptilina biperidina oxazepam lorazepam clorpromazina
diltiazem y naloxona)
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 25
Compuestos farmaceacuteuticos usados en el estudio
Compuesto Nuacutemero CAS Log P (ow) pKa Uso
terapeacuteutico
Lidocaina 137-58-6 24 801 Anesteacutesico local
antiarrithmico
Tramadol 27203-92-5 25 941 Analgesico
Amitriptilina 50-48-6 492 94 Antidepresivo
Biperidena 514-65-8 40 108 Anticolinergico
Oxazepam 604-75-1 223 17 113 Antianxiedad
Lorazepam 846-49-1 247 13 115 Antidepresivo
Clorpromazina 50-53-3 518 93 Antipsycoacutetico
Diltiazem 42399-41-7 363 77 Bloqueante de los
canales del calcio
Naloxona 465-65-6 145 79 Antagonista de los
receptores de opio
Nortriptilina (IS) 72-69-5 565 97
5 ugmL de solucioacuten (9 compuestos) y estandar interno en metanol
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 26
La Teacutecnica de QuEChERS aplicada a las muestras
de sangre
La sangre es el maacutes complejo de los fluidos bioloacutegicos
La determinacioacuten de faacutermacos en sangre total es a menudo necesaria en los
anaacutelisis foreacutensicos dada la dificultad de obtener suero o plasma
Los procedimientos convencionales para analizar faacutermacos en matrices
complejas como la sangre total son complicados
QuEChERS es una teacutecnica de preparacioacuten de muestra que fue desarrollada
para la extraccioacuten de residuos de plaguicidas multi-clase de frutas y vegetales
en 2003
A pesar de que los fluidos bioloacutegicos pueden parecer muy diferentes a una
pieza de fruta sin embargo siguen caminos paralelos
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 27
Caminos paralelos en la preparacioacuten de muestra
Fluidos Bioloacutegicos
Matrices complejas
Rotura de la arquitectura celular
bull Lisis agitacioacuten solvente orgaacutenico
hidroacutelisis
Analitos con un amplio rango de
polaridades
Retirar analito o matriz
Anaacutelisis por LCMSMS GCMS o
GCMSMS
Frutas y Vegetales
Matrices complejas
Rotura de la arquitectura celular
bull Trituracioacuten agitacioacuten solvente
orgaacutenico hidroacutelisis
Analitos con un amplio rango de
polaridades
Retirar analito o matriz
Anaacutelisis por LCMSMS GCMS o
GCMSMS
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 28
Procedimiento baacutesico por SPE para muestras de sangre
El pretratamiento de la sangre total implica la dilucioacuten con una
solucioacuten aacutecida un tampoacuten fosfato o aguaFA
Sonicar 15 minutos rotura de membranas celulares
Centrifugacioacuten
bull Procedimiento de SPE
ndash Acondicionado del cartucho metanol agua
ndash Carga del cartucho muestra
ndash Lavado del cartucho agua con metanol o tampoacuten metanol
ndash Elucioacuten del cartucho eluyente para el anaacutelisis
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 29
Procedimiento Baacutesico QuEChERS
15 g muestra homogeneizada (fortificada)
Antildeadir 15 mL ACN (1 AA) vortex
Antildeadir Sales de Extraccioacuten AOAC agitar
Centrifugar
Transferir 1 u 8 mL a un tubo d-SPE AOAC vortex centrifugar
Transferir al vial de Anaacutelisis
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 30
Ventajas y desventajas del Procedimiento QuEChERS
Ventajas
Extraccioacuten tipo liacutequidoliacutequido
Uso de aacutecido para interrumpir el ligado de proteinas
Exceso de sal para lisar los componentes celulares
Uso de acetonitrilo para facilitar la precipitacioacuten proteacuteica
Uso de SPE dispersiva para adsorber las interferencias de la matriz
Plossl etat J Chrom A 1135 (2006) 19-26
Desventajas
La cantidad de solvente y de muestra requeridos en el meacutetodo no
son ldquobioloacutegicamente adecuadosrdquo
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 31
Propoacutesito de la propuesta mini-Q
Ofrecer un enfoque maacutes adecuado biologicamente
Requirimientos de menores volumenes y tamantildeos de
muestra
Rango de faacutermacos varias polaridades y pKa
Evaluaciacuteoacuten de las interferencias de fondo
Extraccioacuten y datos de recuperacioacuten en un rango
aceptable
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 32
Faacutermacos en sangre Procedimiento mini-QuEChERS
mini-Q
Procedimiento
1 Antildeadir 2 homogeneizadores ceraacutemicos
2 Antildeadir 1 o 2 mL de sangre entera a un tubo de centriacutefuga con tapoacuten de rosca
3 Antildeadir estandar interno vortex
4 Antildeadir 2 mL de ACN acidificado ( 04 FA) vortex 30 seg
5 Antildeadir 500 mg de sales de extraccioacuten agitar vigorsamente 1 minuto centrifugar 5000 rpm 1 min
6 Transferir 1 mL del extraccto al material de d-SPE en tubo de centrifuga vortex centrifugar
7 Antildeadir 200 uL a 800 uL de agua en un vial LC vortex y analizar
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 33
Refinamiento del Procedimiento mini-Q
Paraacutemetros evaluados en la teacutecnica mini-Q
Muestra de sangre total
bull La matriz bioloacutegica maacutes complicada
Adicioacuten de aacutecido tipo y cantidad
bull Efecto en la particioacuten y extraccioacuten
Adicioacuten de las sales de QuEChERS no-tamponadas o
tamponadas con NaAcetato o Citrato
bull Efecto en el extracto inspeccioacuten visual
SPE Dispersiva
bull Limpieza de la matriz y recuperaciones de los compuestos
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 34
Conclusiones del estudio
El ACN con 4 de FA como solvente de extraccioacuten muestra
una lisis maacutes completa de la muestra frente a otros solventes
de extraccioacuten que mostraron una masa soacutelida
Las sales tamponadas AOAC de acetato Soacutedico generan el
extracto maacutes liacutempio y fueron elegidas para la d-SPE
El paso de dSPE no ofrece un clean up adicional para los
meacutetodos de extraccioacuten con sales EN y no tamponadas
principalmente
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 35
Datos de Adquisicoacuten LCMSMS
Compuestos Canales MRM
(mz) Fragmentador
(V) CE (V) RT (min) Delta RT
Lidocaina 1) 23518 gt 861
2) 23518 gt 581
97 11
35
137 04
Tramadol 1) 2642 gt 581
2) 2642 gt 2461
97 15
3
120 04
Amitriptilina 1) 2782 gt 117
2) 2782 gt 105
112 19
19
425 04
Biperidena 1)31223 gt 981
2) 31223 gt 551
123 19
60
423 07
Oxazepam 1) 28706 gt 2409
2) 28706 gt 2689
112 19
7
399 04
Lorazepam 1) 32102 gt 2749
2) 32102 gt 3029
113 15
7
409 04
Clorpromazina 1) 31911 gt 861
2) 31911 gt 581
112 15
43
463 04
Diltiazem 1) 41517 gt 1779
2) 41517 gt 1499
128 19
43
373 04
Naloxona 1) 32816 gt 310
2) 32816 gt 212
123 15
39
082 04
Nortriptilina (IS) 1) 26418 gt 233
2) 26418 gt 91
97 7
19
417 04
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045
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05
0525
055
0575
06
0625
065
0675
07
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075
0775
08
0825
085
0875
09
0925
095
0975
1
1025
105
1075
11
1125
115
1175
12
1225
125
1275
13
1325
135
1375
+ESI TIC Scan Frag=800V AOAC_BLANK_110228bd
1 1
Counts vs Acquisition Time (min)
05 1 15 2 25
3 35 4 45 5 55 6 65 7 75 8 85 9 95 10
Columna Poroshell 120 EC-C18 27
micro 21 x 100 mm PN 695775-902
Fase Moacutevil
A 5 mM Acetato Amoacutenico pH 5
2080 MeOHagua
B 5 mM Acetato amoacutencio en ACN
Flujo 04mLmin
Inyeccioacuten 10uL
GT (ordmC) 300
GF (lmin) 7
Nebulizador (psi) 40
SGT (ordmC) 400
SFG (lmin) 12
Capilar (V) 3500
NV (V) 500
Condiciones LCMS
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38
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4
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47
48
49
5
51
+ESI MRM Frag=1120V CID190 (2782000 -gt 1170000) HQC_6d
1 1
Counts vs Acquisition Time (min) 01 02 03 04 05 06 07 08 09 1 11 12 13 14 15 16 17 18 19 2 21 22 23 24 25 26 27 28 29 3 31 32 33 34 35 36 37 38 39 4 41 42 43 44 45 46
Nalo
xo
ne
Lid
oc
ain
e
Tra
mad
ol
Oxazep
am
Lo
razep
am
Bip
eri
de
n
Am
itri
pty
lin
e
Dil
tiazem
Ch
lorp
rom
azin
e
No
rtri
pty
lin
e (
IS)
Cromatograma LCMSMS de 10 ngmL de sangre total fortificada despueacutes
de extraccioacuten mini-QuEChERS AOAC (NaAc) y d-SPE (50mg PSA y
150mg MgSO4)
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2
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4
41
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46
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48
49
5
51
+ESI MRM Frag=1120V CID190 (2782000 -gt 1170000) HQC_6d
1 1
Counts vs Acquisition Time (min) 01 02 03 04 05 06 07 08 09 1 11 12 13 14 15 16 17 18 19 2 21 22 23 24 25 26 27 28 29 3 31 32 33 34 35 36 37 38 39 4 41 42 43 44 45 46
1 x10
415 42 425 43 435 44 445 45 455 46 465 47 475 48 485 49 495 5
505 51 515 52 525 53 535 54 545 55 555 56 565 57
+ESI MRM Frag=1120V CID190 (2871000 -gt 2409000) RE_L_1d 1
Counts vs Acquisition Time (min) 305 31 315 32 325 33 335 34 345 35 355 36 365 37 375 38 385 39 395 4 405 41 415 42 425 43 435 44 445 45 455 46 465 47 475
Relacioacuten sentildealruido para el Oxazepam y Lorazepam a
10 ngmL (10 ppb)
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 39
La Naloxone muestra esta curva de linealidad de10-250 ngmL (ppb) con una R2
= 0991
Las curvas de calibracioacuten se generaron con la respuestra relativa (area pico
analitoarea pico IS) frente a la concentracioacuten relativa (concentracion de
analitoconcentracioacuten de IS)
Ejemplo de curva de linealidad para Naloxona extraido
con mini-QuEChERS
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 40
Recuperacioacuten y Reproducibilidad
Compuesto 50 ngmL Spiked
Recuperacioacuten RSD
100 ngmL Spiked
Recuperacioacuten RSD
Lidocaine 987 157 100 118
Tramadol 105 30 104 82
Amitriptyline 104 21 104 82
Biperidene 97 45 99 82
Oxazepam 770 92 78 86
Lorazepam 819 68 818 86
Chlorpromazine 110 103 105 63
Diltiazem 881 27 917 83
Naloxone 806 90 755 77
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 41
Conclusioacutenes y trabajo posterior
El meacutetodo mini-QuEChERS para la extraccioacuten de compuestos farmaceacuteuticos en
sangre total ofrece una alternativa a otras teacutecnicas de preparacioacuten de muestras
La preparacioacuten de muestras mini-QuEChERS es un enfoque simple facil y
barato que requiere una miacutenima experiencia en preparacioacuten de muestras y
miacutenimo equipamiento
Es un punto de partida para ampliar el numero y las clasificaciones evaluadas
en otras matrices bioloacutegicas y en sangre postmortem
El trabajo futuro incluira combinaciones adecuadas tanto de las sales de
extraccioacuten como de los sorbentes de d-SPE por el meacutetodo mini-QuEChERS
La columna Poroshell 120 ofrece una selectividad diferente y excelentes formas
de pico a lo largo del amplio rango de compuestos farmaceacuteuticos usados en este
estudio
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 42
Referencias
(1) M Anastassiades SJ Lehotay D Štajnbaher and FJ Schenk J AOAC Int 86 4121 (2003)
(2) G Stubbings and T Bigwood Anal Chim Acta 637 68 (2009)
(3) RR Rasmussen IMLD Storm PZH Rasmussen J Smedsgaard and KF Nielsen Anal Bioanal Chem 397 765 (2010)
(4) D Smith and K Lynam GCμECD analysis and confirmation of PCBs in fish tissue with Agilent JampW DB-35ms and DB-XLB GC columns Agilent Technologies 5990-6236EN (2010)
(5) F Ploumlssl M Giera and F Bracher J Chrom A 1135 19 (2006)
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 43
MEJORAR LA PRODUCTIVIDAD EN
HPLC ESTAacuteNDAR CON COLUMNAS
POROSHELL
Page 43
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 44
Columnas Poroshell 120 para HPLC y UHPLC
bull 80-90 de eficacia de las sub 2um
bull A presiones un ~40-50 maacutes bajas
bull Con un tamantildeo de partiacutecula de 27um
bull Con una frita de entrada de 2um
bull Con el doble de resolucioacuten de una
columna de 35um
bull Con un liacutemite de presioacuten de 600 bar
bull La partiacutecula tiene un nuacutecleo soacutelido
(17um) y una cubierta exterior porosa
de 05um como zona de difusioacuten
Las Columnas Poroshell 120 tienen
Page 44
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 45
Poroshell 120 proporciona Eficacia Suficiente
Page 45
Flujo 0582 mLmin AcetonitriloAgua (6040)
Volumen de Inyeccioacuten 4 microL
TCC 26 oC
DAD Sig=2544nm Ref=360100nm
Muestra Muestra de test RRLC
(PN 5188-6529) inoculada con
50 microL 2 mgmL Tiourea en
aguaacetonitrilo (6535)
25 5 75 10
mAU
0
200
400
600
06
46
0
82
6
11
48
15
18
20
16
2
22
3
28
16
41
32
62
73
97
53
larr N = 25053 Presioacuten = 182 bar
Poroshell 120 EC-C18 30 x 100 mm 27 um
min 25 5 75 10 125
mAU
0
200
400
600
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49
0
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5
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24
18
27
05
34
94
52
81
82
18
13
04
1
larr N = 27295 Presioacuten = 386 bar
Eclipse Plus C18 30 x 100 mm 18 um
gt90 de la Eficacia de una 18um
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 46
iquestEn queacute tipos de instrumentos puede usar
Columnas Poroshell 120 HPLCrsquos y UHPLCrsquos
Consideraciones en UHPLC
bull Las columnas Poroshell 120 tienen un liacutemite de presioacuten de 600 bar
bull Los UHPLC estaacuten ajustados para columnas de bajo volumen por lo tanto las
Poroshell pueden usarse en todos los UHPLC
Consideraciones en HPLC
bull Las Columnas Poroshell 120 trabajan bien por debajo de 400 bar
bull Minimize los volumenes extra columna para las columnas 21 y 30mm ID ndash
siga las instrucciones dadas para las columnas RRHT (18um 600 bar)
bull Use en el detector velocidades adecuadas de adquisicioacuten para picos
estrechos de alta eficacia
Page 46
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 47
Con una frita de 2 um Poroshell 120 no se bloquea
Muestras Complejas- Plasma
Diflusinal in Plasma
0
20
40
60
80
100
120
140
160
180
200
220
240
260
280
300
320
340
360
380
400
1 501 1001 1501 2001 2501
Injections
Pre
ssu
re
0
20000
40000
60000
80000
100000
120000
140000
160000
180000
200000
Eff
icie
ncy (
N)
End Press
Plates
Columna Poroshell 120 EC-C18 30 x 50mm 27um LC Agilent 1200 RRLC (SL)
Muestra Plasma Precipitado 2 partes Plasma 7 Partes 2080 Agua-MeCN w01 Aacutecido Foacutermico con 1 Parte de Diflusinal en
5050 Agua-MeCN 10 ugml (Concentracion Final Diflusinal 1 ugml) Agitado y dejado reposar 10 minutos
No Centrifugado No Filtrado
Volumen de Inyeccioacuten 1ul
Solvente A Agua w01 TFA
Solvente B MeCN w008 TFA
Flujo 1 mlmin 1 ul inyeccioacuten
Tiempo B
0 20
05 90
06 90
11 20
25 20
Page 47
Diflusinal es un anti-inflamatorio no esteroidal anaacutelogo
a la aspirina desarrollado por Merck Sharp amp Dohme
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 48
Las Columnas Superficialmente Porosas Pueden
Usarse cumpliendo los Requirimientos USP
De la lista USP de empaquetamientos de columnas LC 42009
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Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 49
Criterios de Ajuste de Meacutetodos USP y FDA Criterios de Ajuste de Meacutetodos de Dimensiones de Columna
Paraacutemetro Especificaciones Maacuteximas ComentariosEjemplos
Longitud de Columna 70 250mm 75mm
150mm 50mm
Diaacutemetro Interno de
Columna
25 (FDA ORA-LAB 545)
USP ndash 25 ID Columna puede ajustarse si la
velocidad lineal es constante
46 mm 30 mm (-35)
46 mm 21 mm (-54)
30 mm 21 mm (-30)
Flow Rate 50
Volumen de Inyeccioacuten
Reducir tanto como se necesitendash
debe cumplir los liacutemites de
deteccioacuten y precisioacuten
Si cambia a una columna maacutes
corta haga el cambio apropiado
en el volumen de inyeccioacuten
Tamantildeo de Partiacutecula Reducir hasta el 50
(no se puede aumentar)
Puede cambiar la longitud de columna y el
tamantildeo de partiacutecula para mantener la misma
Rs
5um 35um (-30)
5um 27um (-46) Cambiado en 22409 ndash Para la copia oficial y actual ir a
httpwwwfdagovScienceResearchFieldSciencedefaulthtm
USP 30 Second Supplement Revisions PF34(5) en proceso
Ver ldquo Stimuli articlerdquo en Pharmacopeial Forum 2009 35(6)
Page 49
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 50
Comparacioacuten de 46 x 250 mm 5 um con Poroshell
120 EC-C18 46 x 100 mm 27um
min 5 10 15 20 25 30
mAU
0
20
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60
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100
97
12
111
16
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126
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152
48
161
51
164
35
206
87
230
76
292
90
min 5 10 15 20 25 30
mAU
0
50
100
150
200
250
17
19
21
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26
06
38
67
44
37 45
58
54
50
59
20
70
37
Anaacutelisis maacutes raacutepido(columna maacutes corta flujo maacutes alto)
Mayor sensibilidad(partiacutecula maacutes pequentildeapico maacutes estrecho)
Maacutes optimizado (un anaacutelisis maacutes raacutepido permite ajustar mejor)
Ambos anaacutelisis en Agilent 1100 G1315B DAD (bajo 400 bar)
No se requiere cambio en la preparacioacuten de muestra frita de entrada
de 2 micras en ambas columnas
325 bar
110 bar
Sulfadiazina
Sulfatiazol
Sulfapiridina
Sulfamerazina
Sulfametazina
Sulfametazol
Sulfametoxipiridazina
Sulfacloropiridazina
Sulfametoxazol
Sulfadimetoxina
Tiempo B
0 8
33 33
34 33
Columna Eclipse Plus C18
46 x 250mm 5um
Flujo 1 mLmin
Fase Moacutevil
A 01 Aacutecido Foacutermico en Agua
B 01 Aacutecido Foacutermico en ACN
Tiempo B
0 8
12 33
132 33
Columna 46 x 100mm
Poroshell 120 EC-C18
27um
Flujo 185 mLmin
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Comparacioacuten de 46 x 250 mm 5 um con Poroshell
120 EC-C18 46 x 100 mm 27um
min 5 10 15 20 25 30
mAU
0
20
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100
97
12
111
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51
164
35
206
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230
76
292
90
110 bar
5
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0
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21
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38
67
44
37 45
58
54
50
59
20
70
37
325 bar
min
Ver condiciones en diapositiva anterior
Page 51
Mejor Resolucioacuten
linea base
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 52
Anaacutelisis maacutes raacutepido del meacutetodo USP para pastillas de
Simvastatina en Columnas Poroshell 120ndash Ajuste del meacutetodo
46 x 250 mm 5-um
Agilent ZORBAX Eclipse Plus C18
46 x 75 mm 27-um
Agilent Poroshell 120 EC-C18
65 CH3CN 35 39 gL NaH2PO4 (pH 45) 45 oC Sig = 238 8 Ref = 360 100 nm
Flujos 15 mLmin para la columna de 5-um 28 mLmin para la columna Poroshell 120 27um
Requerimiento
USP
5-um
(15 mLmin)
27-um
(28 mLmin)
TR na 9907 1457
krsquo gt 30 5962 5122
N gt 4500 16939 14439
Tf lt 20 109 110
min 2 4 6 8 10
mAU
0
5
10
15
20
25
30
35
40
min 2
mAU
0
5
10
15
20
25
30
35
40
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 53
Ajustes de los parametros cromatograficos en la
transferencia de meacutetodos Escalado del volume de inyeccioacuten
v1 x [(r22 x L2)(r1
2 x L1)] = V2
O bien
v2 = V1 x [(d22 x L2)(d1
2 x L1)]
v volume de inyeccioacuten
r radio de la columna
L longitud de la columna
Ajuste del flujo
F2= F1 x (L2L1 ) x (r2r1 )2
L longitud de la columna
F Flujo
r radio de la columna
Ajuste de la longitud del gradiente
En funcioacuten de la longitud de la columna
L2L1= tg2tg1
En funcioacuten del volumen muerto de columna y del flujo
tG2= tG1 x (V2V1) x (F1F2) t tiempos de gradiente
V volumen muerto de columna
F flujo
Columna ID Volumen muerto aprox
por mm longitud
46mm 100uL
30mm 425uL
21mm 208uL
10mm 047uL
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 54
Notas de Aplicacioacuten en Poroshell 120 y QuEChERS
Determination of Hormones in Shrimp by Agilent 1290 Infinity LC with
Agilent Poroshell 120 LC Column and Agilent QuEChERS for Sample
Preparation (publication 5990-6589EN)
Analysis of Pesticide Residues in Green Tea Using Agilent SampliQ
QuEChERS EN Kit by LCMSMS Detection (publication 5990-
6400EN)
Analysis of Pesticide Residues in Rice Using Agilent Bond Elut
QuEChERS AOAC Kit (publication 5990-8034EN)
Poroshell 120 for pharmaceutical analysis
Poroshell 120 Resources
QuEChERS Applications
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 55
Sumario
bull La columna Poroshell 120 es una nueva alternativa para LC de Alta
Resolucioacuten y Alta Velocidad que puede usarse en cualquier HPLC o UHPLC
bull Con la Poroshell 120 se pueden lograr separaciones de alta eficacia a baja
presioacuten
bull Puede usarse con muestras sucias sin ver una elevacioacuten anormal de la
presioacuten
bull Puede usarse en un meacutetodo USP sin comprometer los Criterios de Ajustes de
Meacutetodo
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Soporte Teacutecnico Agilent
Teleacutefono de Atencioacuten al Cliente
901 11 68 90
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Anaacutelisis de Faacutermacos reductores del Colesterol (Estatinas) usando la Tecnologiacutea de Gotas en Matriz Seca (Dried Matrix Spots) y Columnas Poroshell 120
Nota de aplicacioacuten 5990-8305EN
httpwwwchemagilentcomLibraryapplications5990--8305ENpdf
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 5
Introduccioacuten
La tecnologiacutea Gota de Sangre Seca como meacutetodo de muestreo
para el bioanaacutelisis quantitativo de pequentildeas moleacuteculas
Significativa reduccioacuten en los voluacutemenes de sangre necesarios
lo que simplifica la recogida de muestras
Reduccioacuten en el procesamiento el enviacuteo de la muestra y los
gastos de almacenamiento en condiciones ambientales
Estabilidad de los metabolitos en la tarjeta
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Los compuestos
Las Estatinas (inhibidores de la HMG-CoA reductasa) son un
grupo de faacutermacos usados para disminuir los niveles de
colesterol
Se analizaron cuatro estatinas con las nuevas tarjetas de
Dried Matrix Spotting (DMS) no basadas en celulosa
Excepto la atorvastatina estos compuestos que son aacutecidos
por naturaleza son un reto aacute la hora de lograr unos liacutemites de
deteccioacuten bajos
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Propiedades de las Estatinas
Compuesto Estructura Log P pKa
Atorvastatina
636 636
Simvastatina
468 NA
Pravastatina
218 470
Lovastatina
426 NA
Naproxeno (IS)
318 415
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Procedimiento DMS
Fortificacioacuten de sangre humana entera fresca con cada una de las cuatro estatinas para crear una curva de calibracioacuten
Adicioacuten de la sangre fortificada en las tarjetas Agilent Bond Elut DMS (Part A400150)
Se prepararon 3 replicados de concentraciones de sangre a 20 ngmL y 500 ngmL
Secado de las tarjetas
Perforacioacuten de discos de 3 mm y se depositan en viales de 2 mL
Disolucioacuten de cada gota en el solvente de desorcioacuten y vortex
Evaporacioacuten hasta sequedad
Reconstitucioacuten en 100 μL de fase moacutevil (70 5 mM formiato amoacutenico 30 CH3CN) y agitacioacuten
Las muestras se analizaron por LCndashMSndashMS
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Parametros de las transiciones MS-MS para las
estatinas estudiadas
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Cromatograma LCndashMSndashMS de sangre fortificada
con 50 ngmL de estatinas despueacutes del DMS
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Columna Poroshell 120 en la separacioacuten por HPLC
La columna Poroshell 120 ofrece velocidad y alta resolucioacuten
comparable a las columnas sub-2 μm de UHPLC
La tecnologia de partiacuteculas superficialmente genera
separaciones de alta eficacia a menores presiones
Se generaron presiones inferiores a 400 bares
La Poroshell 120 EC-C8 proporciona excelentes formas de
pico para todos los analitos
La atorvastatina puede ser facilmente detectada a 1 ngmL
con una SNR de 797
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 12
Cromatograma LCndashMSndashMS de atorvastatina en
sangre fortificada 1 ngmL
Condiciones LCndashMS
Columna Poroshell 120 EC-C8 27 μm 150 times 21 mm
(Part 693775-906)
Fase Movil
A 5 mM Formiato Amoacutenico B CH3CN
Flujo 200 μLmin
Gradiente
t0 A 70 B 30
t50 A 25 B 75
t55 A 25 B 75
t56 A 70 B 30
t80 A 70 B 30
Temperatura 30 degC
Presioacuten 394 bar
Tiempo anaacutelisis 8 min
Instrumento Agilent 1290 LC
6460 QQQ
Gas temp 275 degC
Gas flow 10 Lmin
Nebulizer 10 psi
Sheath gas temp 250 degC
Sheath gas flow 7 Lmin
Polarity Negative
1 ngmL con una SNR de 797
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 13
Curvas de calibracioacuten representativas de estatinas
en sangre fortificada
Linearidad en las curvas de calibracioacuten para seis niveles de
pravastatina y atorvastatina
Las curvas de Lovastatina y simvastatina no fueron lineales a
las maacutes altas concentraciones y rindieron regresioacuten cuadraacutetica
con coeficientes de correlacioacuten mejores de 0999
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 14
Recuperaciones de estatinas con tarjetas Bond
Elut DMS y tarjetas de celulosa (n = 3)
Los resultados indican que cuando se usan tarjetas de celulosa hay incremento
ionico dando lugar a altas recuperaciones artificiales
Estos datos corroboran que las tarjetas no celulosicas exhiben datos de desorcioacuten
de mejor calidad comparados con las tarjetas tradicionales de celulosa
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 15
Conclusiones
Meacutetodo simple y raacutepido para el anaacutelisis de un grupo de compuestos aciacutedicos en muestras de sangre humana con DMS y LCndashMSndashMS
El meacutetodo ha demostrado se exacto preciso y robusto
Buena linealidad para la pravastatina y atorvastatina usando una regresioacuten lineal con coeficientes de correlacioacuten mejores de 0998
Estas tarjetas ofrecen mejores propiedades de desorcioacuten comparadas con las tarjetas competitivas basadas en celulosa
La columna Poroshell 120 EC-C8 es una excelente eleccioacuten para las aplicaciones bioanaacuteliticas
La tecnologia de Gota de Sangre Seca (Dried blood spots) es una teacutecnica de recoleccioacuten de muestra para el anaacutelisis de faacutermacos en estudios cliacutenicos y precliacutenicos
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 16
Referencias
N Spooner R Lad M Barfield Anal Chem 2009 811557ndash
1563
M Barfield N Spooner R Lad S Parry S Fowles
J Chromatogr B 2008 870 32ndash37
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bullTecnologiacutea Innovadora no-celulosa
bullProporciona un nuevo nivel de confianza en la recoleccioacuten de muestras
bullMejora significativa en la sensibilidad analiacutetica reproducibilidad y faacutecil uso
Anaacutelisis Dried Blood Spotting (DBS)
Desarrollado en colaboracioacuten con Compantildeiacuteas farmaceacuteuticas y CROs este
dispositivo elimina problemas actuales asociados a los sistemas de DBS que
hay en el mercado
bullMuestreo de Sangre plasma o suero (liacutequido sinoviallaacutegrimas bilis LCR) para
anaacutelisis bioanaliacuteticos en pruebas farmaceacuteuticas cliacutenicas y precliacutenicas en
empresasa farmaceacuteuticas de bioanaacutelisis (DMPK ADME y MetID) (no para
Diagnoacutestico cliacutenico)
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La tarjeta sin celulosa es superior de forma medible a las tarjetas de papel de celulosa
Mejora la Sentildeal del MS
bullFormato libre de celulosa ha reducido el enlazado no especiacutefico y no contiene reactivos
quiacutemicos impregnados
Ventajas del Producto
Flujo de trabajo maacutes faacutecil
bull La extraccioacuten de la muestra de la tarjeta
requiere 5 veces menos fuerza que el
producto de celulosa
Proporciona excelente homogeneidad
de la mancha
bull Extracciones reproducibles
recuperaciones maacutes altas
independientemente del nivel de
hematocrito
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 19
bull El nivel de Hematocrito es el porcentaje del volumen de sangre ocupado por las ceacutelulas
rojas de la sangre
bull El material de muestreo Bond Elut DMS tiene una estructura de fibras
maacutes ordenadas comparado con la celulosa estaacutendard
Esta es la razoacuten de porqueacute Bond Elut DMS muestra mejor
reproducibilidad
Mejor Reproducibilidad
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Bond Elut DBS Muestra Mejor Reproducibilidad
Bond Elut DMS tiene una desviacioacuten total de un 5 en todos los niveles HCT mientras que la
tarjeta de celulosa tiene una desviacioacuten de un 52 en todo el rango 10 veces de diferencia
Los datos abajo muestran la desviacioacuten de las medidas del CV desde niveles de HTC
normales (45) para tarjetas Bond Elut DMS y de celulosa (Whatman DMPK-C)
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Ventajas Clave de la Teacutecnica DBS de Agilent
bull Una vez seca la muestra de sangre no supone peligro bioloacutegico alguno y se
puede transportar sin necesidad de sistemas de refrigeracioacuten costosos
bull Permite a los laboratorios centralizar los anaacutelisis de muestra perifeacutericas
bull Se requiere menos volumen de muestra (menor nordm de sujetos en el ensayo
menor nordm de repeticiones y eliminacioacuten de sujetos sateacutelite)
bull Permite la toma demuestra en serie del mismo sujeto
bull La recoleccioacuten de sangre es maacutes sencilla
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 22
Notas de Aplicacioacuten farmaceacuteuticas en Poroshell
120 and DMS Fast Analysis of Cefepime and Related Impurities on Poroshell 120 EC-C18 (publication 5990-7492EN) Comparing Selectivity Easy Transfer of Methods between Superficially Porous Agilent Poroshell 120 EC-C18 and totally Porous Agilent ZORBAX Eclipse Plus C18 (publication 5990-6588EN)
Analysis of Water Soluble Vitamins in Multivitamin Tablets Using Poroshell 120 EC-C18 (publication 5990-8107EN)
Analysis of Anthocyanins in Common Foods Using an Agilent Poroshell 120 SB-C18 (publication 5990-8249EN)
Analysis of Amitriptyline Fluoxetine Quetiapine and Sertraline Using Dried Plasma (publication 5990-8169EN)
Analysis of Amitriptyline Fluoxetine Quetiapine and Sertraline Using Dried Blood Spots (publication 5990-8168EN)
Investigation of Varying Blood Hematocrit Level in Dried Blood Spotting (publication 5990-8306EN)
Analysis of Cholesterol Lowering Drugs (Statins) Using Dried Matrix Spots Technology (publication 5990-8305EN)
Scalability of Agilent Columns Across HPLC and UHPLC Instruments (publication 5990-8428EN)
Converting a CHP Method for Insulin to Agilent Poroshell 120 Columns (publication 5990-9029EN)
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La propuesta QuEChERS para Determinar compuestos
Farmaceacuteuticos y Toxinas en Sangre Total
Anaacutelisis de Compuestos Farmaceacuteuticos en Sangre Total con
la columna Poroshell 120 Usando el meacutetodo Modificado
Mini-QuEChERS para la preparacioacuten de muestra
Nota de Aplicacioacuten5990-8789EN
httpwwwchemagilentcomLibraryapplications5990-8789ENpdf
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 24
Introduccioacuten
Determinacioacuten de compuestos farmaceacuteuticos en anaacutelisis cliacutenicos y
foreacutensicos ADME (DMPK)
La preparacioacuten de muestra va desde la simple precipitacioacuten de
proteinas (PPT) a la maacutes compleja extraccioacuten en fase soacutelida (SPE)
Habitualmente la SPE ha ocupado este vaciacuteo pero simpre hay
espacio para teacutecnicas de preparacioacuten de muestras que son raacutepidas y
baratas de implementar
Se describe un procedimiento mini-QuEChERS modificado con
analisis LCndashMS-MS para la determinacioacuten de faacutermacos en sangre
total
Se analizan nueve diferentes faacutermacos (lidocaina tramadol
amitriptilina biperidina oxazepam lorazepam clorpromazina
diltiazem y naloxona)
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 25
Compuestos farmaceacuteuticos usados en el estudio
Compuesto Nuacutemero CAS Log P (ow) pKa Uso
terapeacuteutico
Lidocaina 137-58-6 24 801 Anesteacutesico local
antiarrithmico
Tramadol 27203-92-5 25 941 Analgesico
Amitriptilina 50-48-6 492 94 Antidepresivo
Biperidena 514-65-8 40 108 Anticolinergico
Oxazepam 604-75-1 223 17 113 Antianxiedad
Lorazepam 846-49-1 247 13 115 Antidepresivo
Clorpromazina 50-53-3 518 93 Antipsycoacutetico
Diltiazem 42399-41-7 363 77 Bloqueante de los
canales del calcio
Naloxona 465-65-6 145 79 Antagonista de los
receptores de opio
Nortriptilina (IS) 72-69-5 565 97
5 ugmL de solucioacuten (9 compuestos) y estandar interno en metanol
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 26
La Teacutecnica de QuEChERS aplicada a las muestras
de sangre
La sangre es el maacutes complejo de los fluidos bioloacutegicos
La determinacioacuten de faacutermacos en sangre total es a menudo necesaria en los
anaacutelisis foreacutensicos dada la dificultad de obtener suero o plasma
Los procedimientos convencionales para analizar faacutermacos en matrices
complejas como la sangre total son complicados
QuEChERS es una teacutecnica de preparacioacuten de muestra que fue desarrollada
para la extraccioacuten de residuos de plaguicidas multi-clase de frutas y vegetales
en 2003
A pesar de que los fluidos bioloacutegicos pueden parecer muy diferentes a una
pieza de fruta sin embargo siguen caminos paralelos
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 27
Caminos paralelos en la preparacioacuten de muestra
Fluidos Bioloacutegicos
Matrices complejas
Rotura de la arquitectura celular
bull Lisis agitacioacuten solvente orgaacutenico
hidroacutelisis
Analitos con un amplio rango de
polaridades
Retirar analito o matriz
Anaacutelisis por LCMSMS GCMS o
GCMSMS
Frutas y Vegetales
Matrices complejas
Rotura de la arquitectura celular
bull Trituracioacuten agitacioacuten solvente
orgaacutenico hidroacutelisis
Analitos con un amplio rango de
polaridades
Retirar analito o matriz
Anaacutelisis por LCMSMS GCMS o
GCMSMS
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Procedimiento baacutesico por SPE para muestras de sangre
El pretratamiento de la sangre total implica la dilucioacuten con una
solucioacuten aacutecida un tampoacuten fosfato o aguaFA
Sonicar 15 minutos rotura de membranas celulares
Centrifugacioacuten
bull Procedimiento de SPE
ndash Acondicionado del cartucho metanol agua
ndash Carga del cartucho muestra
ndash Lavado del cartucho agua con metanol o tampoacuten metanol
ndash Elucioacuten del cartucho eluyente para el anaacutelisis
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Procedimiento Baacutesico QuEChERS
15 g muestra homogeneizada (fortificada)
Antildeadir 15 mL ACN (1 AA) vortex
Antildeadir Sales de Extraccioacuten AOAC agitar
Centrifugar
Transferir 1 u 8 mL a un tubo d-SPE AOAC vortex centrifugar
Transferir al vial de Anaacutelisis
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Ventajas y desventajas del Procedimiento QuEChERS
Ventajas
Extraccioacuten tipo liacutequidoliacutequido
Uso de aacutecido para interrumpir el ligado de proteinas
Exceso de sal para lisar los componentes celulares
Uso de acetonitrilo para facilitar la precipitacioacuten proteacuteica
Uso de SPE dispersiva para adsorber las interferencias de la matriz
Plossl etat J Chrom A 1135 (2006) 19-26
Desventajas
La cantidad de solvente y de muestra requeridos en el meacutetodo no
son ldquobioloacutegicamente adecuadosrdquo
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 31
Propoacutesito de la propuesta mini-Q
Ofrecer un enfoque maacutes adecuado biologicamente
Requirimientos de menores volumenes y tamantildeos de
muestra
Rango de faacutermacos varias polaridades y pKa
Evaluaciacuteoacuten de las interferencias de fondo
Extraccioacuten y datos de recuperacioacuten en un rango
aceptable
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Faacutermacos en sangre Procedimiento mini-QuEChERS
mini-Q
Procedimiento
1 Antildeadir 2 homogeneizadores ceraacutemicos
2 Antildeadir 1 o 2 mL de sangre entera a un tubo de centriacutefuga con tapoacuten de rosca
3 Antildeadir estandar interno vortex
4 Antildeadir 2 mL de ACN acidificado ( 04 FA) vortex 30 seg
5 Antildeadir 500 mg de sales de extraccioacuten agitar vigorsamente 1 minuto centrifugar 5000 rpm 1 min
6 Transferir 1 mL del extraccto al material de d-SPE en tubo de centrifuga vortex centrifugar
7 Antildeadir 200 uL a 800 uL de agua en un vial LC vortex y analizar
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Refinamiento del Procedimiento mini-Q
Paraacutemetros evaluados en la teacutecnica mini-Q
Muestra de sangre total
bull La matriz bioloacutegica maacutes complicada
Adicioacuten de aacutecido tipo y cantidad
bull Efecto en la particioacuten y extraccioacuten
Adicioacuten de las sales de QuEChERS no-tamponadas o
tamponadas con NaAcetato o Citrato
bull Efecto en el extracto inspeccioacuten visual
SPE Dispersiva
bull Limpieza de la matriz y recuperaciones de los compuestos
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 34
Conclusiones del estudio
El ACN con 4 de FA como solvente de extraccioacuten muestra
una lisis maacutes completa de la muestra frente a otros solventes
de extraccioacuten que mostraron una masa soacutelida
Las sales tamponadas AOAC de acetato Soacutedico generan el
extracto maacutes liacutempio y fueron elegidas para la d-SPE
El paso de dSPE no ofrece un clean up adicional para los
meacutetodos de extraccioacuten con sales EN y no tamponadas
principalmente
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 35
Datos de Adquisicoacuten LCMSMS
Compuestos Canales MRM
(mz) Fragmentador
(V) CE (V) RT (min) Delta RT
Lidocaina 1) 23518 gt 861
2) 23518 gt 581
97 11
35
137 04
Tramadol 1) 2642 gt 581
2) 2642 gt 2461
97 15
3
120 04
Amitriptilina 1) 2782 gt 117
2) 2782 gt 105
112 19
19
425 04
Biperidena 1)31223 gt 981
2) 31223 gt 551
123 19
60
423 07
Oxazepam 1) 28706 gt 2409
2) 28706 gt 2689
112 19
7
399 04
Lorazepam 1) 32102 gt 2749
2) 32102 gt 3029
113 15
7
409 04
Clorpromazina 1) 31911 gt 861
2) 31911 gt 581
112 15
43
463 04
Diltiazem 1) 41517 gt 1779
2) 41517 gt 1499
128 19
43
373 04
Naloxona 1) 32816 gt 310
2) 32816 gt 212
123 15
39
082 04
Nortriptilina (IS) 1) 26418 gt 233
2) 26418 gt 91
97 7
19
417 04
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06
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065
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07
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075
0775
08
0825
085
0875
09
0925
095
0975
1
1025
105
1075
11
1125
115
1175
12
1225
125
1275
13
1325
135
1375
+ESI TIC Scan Frag=800V AOAC_BLANK_110228bd
1 1
Counts vs Acquisition Time (min)
05 1 15 2 25
3 35 4 45 5 55 6 65 7 75 8 85 9 95 10
Columna Poroshell 120 EC-C18 27
micro 21 x 100 mm PN 695775-902
Fase Moacutevil
A 5 mM Acetato Amoacutenico pH 5
2080 MeOHagua
B 5 mM Acetato amoacutencio en ACN
Flujo 04mLmin
Inyeccioacuten 10uL
GT (ordmC) 300
GF (lmin) 7
Nebulizador (psi) 40
SGT (ordmC) 400
SFG (lmin) 12
Capilar (V) 3500
NV (V) 500
Condiciones LCMS
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32
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37
38
39
4
41
42
43
44
45
46
47
48
49
5
51
+ESI MRM Frag=1120V CID190 (2782000 -gt 1170000) HQC_6d
1 1
Counts vs Acquisition Time (min) 01 02 03 04 05 06 07 08 09 1 11 12 13 14 15 16 17 18 19 2 21 22 23 24 25 26 27 28 29 3 31 32 33 34 35 36 37 38 39 4 41 42 43 44 45 46
Nalo
xo
ne
Lid
oc
ain
e
Tra
mad
ol
Oxazep
am
Lo
razep
am
Bip
eri
de
n
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lin
e
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tiazem
Ch
lorp
rom
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e
No
rtri
pty
lin
e (
IS)
Cromatograma LCMSMS de 10 ngmL de sangre total fortificada despueacutes
de extraccioacuten mini-QuEChERS AOAC (NaAc) y d-SPE (50mg PSA y
150mg MgSO4)
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39
4
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45
46
47
48
49
5
51
+ESI MRM Frag=1120V CID190 (2782000 -gt 1170000) HQC_6d
1 1
Counts vs Acquisition Time (min) 01 02 03 04 05 06 07 08 09 1 11 12 13 14 15 16 17 18 19 2 21 22 23 24 25 26 27 28 29 3 31 32 33 34 35 36 37 38 39 4 41 42 43 44 45 46
1 x10
415 42 425 43 435 44 445 45 455 46 465 47 475 48 485 49 495 5
505 51 515 52 525 53 535 54 545 55 555 56 565 57
+ESI MRM Frag=1120V CID190 (2871000 -gt 2409000) RE_L_1d 1
Counts vs Acquisition Time (min) 305 31 315 32 325 33 335 34 345 35 355 36 365 37 375 38 385 39 395 4 405 41 415 42 425 43 435 44 445 45 455 46 465 47 475
Relacioacuten sentildealruido para el Oxazepam y Lorazepam a
10 ngmL (10 ppb)
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 39
La Naloxone muestra esta curva de linealidad de10-250 ngmL (ppb) con una R2
= 0991
Las curvas de calibracioacuten se generaron con la respuestra relativa (area pico
analitoarea pico IS) frente a la concentracioacuten relativa (concentracion de
analitoconcentracioacuten de IS)
Ejemplo de curva de linealidad para Naloxona extraido
con mini-QuEChERS
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 40
Recuperacioacuten y Reproducibilidad
Compuesto 50 ngmL Spiked
Recuperacioacuten RSD
100 ngmL Spiked
Recuperacioacuten RSD
Lidocaine 987 157 100 118
Tramadol 105 30 104 82
Amitriptyline 104 21 104 82
Biperidene 97 45 99 82
Oxazepam 770 92 78 86
Lorazepam 819 68 818 86
Chlorpromazine 110 103 105 63
Diltiazem 881 27 917 83
Naloxone 806 90 755 77
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 41
Conclusioacutenes y trabajo posterior
El meacutetodo mini-QuEChERS para la extraccioacuten de compuestos farmaceacuteuticos en
sangre total ofrece una alternativa a otras teacutecnicas de preparacioacuten de muestras
La preparacioacuten de muestras mini-QuEChERS es un enfoque simple facil y
barato que requiere una miacutenima experiencia en preparacioacuten de muestras y
miacutenimo equipamiento
Es un punto de partida para ampliar el numero y las clasificaciones evaluadas
en otras matrices bioloacutegicas y en sangre postmortem
El trabajo futuro incluira combinaciones adecuadas tanto de las sales de
extraccioacuten como de los sorbentes de d-SPE por el meacutetodo mini-QuEChERS
La columna Poroshell 120 ofrece una selectividad diferente y excelentes formas
de pico a lo largo del amplio rango de compuestos farmaceacuteuticos usados en este
estudio
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 42
Referencias
(1) M Anastassiades SJ Lehotay D Štajnbaher and FJ Schenk J AOAC Int 86 4121 (2003)
(2) G Stubbings and T Bigwood Anal Chim Acta 637 68 (2009)
(3) RR Rasmussen IMLD Storm PZH Rasmussen J Smedsgaard and KF Nielsen Anal Bioanal Chem 397 765 (2010)
(4) D Smith and K Lynam GCμECD analysis and confirmation of PCBs in fish tissue with Agilent JampW DB-35ms and DB-XLB GC columns Agilent Technologies 5990-6236EN (2010)
(5) F Ploumlssl M Giera and F Bracher J Chrom A 1135 19 (2006)
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 43
MEJORAR LA PRODUCTIVIDAD EN
HPLC ESTAacuteNDAR CON COLUMNAS
POROSHELL
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Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 44
Columnas Poroshell 120 para HPLC y UHPLC
bull 80-90 de eficacia de las sub 2um
bull A presiones un ~40-50 maacutes bajas
bull Con un tamantildeo de partiacutecula de 27um
bull Con una frita de entrada de 2um
bull Con el doble de resolucioacuten de una
columna de 35um
bull Con un liacutemite de presioacuten de 600 bar
bull La partiacutecula tiene un nuacutecleo soacutelido
(17um) y una cubierta exterior porosa
de 05um como zona de difusioacuten
Las Columnas Poroshell 120 tienen
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Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 45
Poroshell 120 proporciona Eficacia Suficiente
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Flujo 0582 mLmin AcetonitriloAgua (6040)
Volumen de Inyeccioacuten 4 microL
TCC 26 oC
DAD Sig=2544nm Ref=360100nm
Muestra Muestra de test RRLC
(PN 5188-6529) inoculada con
50 microL 2 mgmL Tiourea en
aguaacetonitrilo (6535)
25 5 75 10
mAU
0
200
400
600
06
46
0
82
6
11
48
15
18
20
16
2
22
3
28
16
41
32
62
73
97
53
larr N = 25053 Presioacuten = 182 bar
Poroshell 120 EC-C18 30 x 100 mm 27 um
min 25 5 75 10 125
mAU
0
200
400
600
06
49
0
86
5
12
75
17
56
24
18
27
05
34
94
52
81
82
18
13
04
1
larr N = 27295 Presioacuten = 386 bar
Eclipse Plus C18 30 x 100 mm 18 um
gt90 de la Eficacia de una 18um
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 46
iquestEn queacute tipos de instrumentos puede usar
Columnas Poroshell 120 HPLCrsquos y UHPLCrsquos
Consideraciones en UHPLC
bull Las columnas Poroshell 120 tienen un liacutemite de presioacuten de 600 bar
bull Los UHPLC estaacuten ajustados para columnas de bajo volumen por lo tanto las
Poroshell pueden usarse en todos los UHPLC
Consideraciones en HPLC
bull Las Columnas Poroshell 120 trabajan bien por debajo de 400 bar
bull Minimize los volumenes extra columna para las columnas 21 y 30mm ID ndash
siga las instrucciones dadas para las columnas RRHT (18um 600 bar)
bull Use en el detector velocidades adecuadas de adquisicioacuten para picos
estrechos de alta eficacia
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Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 47
Con una frita de 2 um Poroshell 120 no se bloquea
Muestras Complejas- Plasma
Diflusinal in Plasma
0
20
40
60
80
100
120
140
160
180
200
220
240
260
280
300
320
340
360
380
400
1 501 1001 1501 2001 2501
Injections
Pre
ssu
re
0
20000
40000
60000
80000
100000
120000
140000
160000
180000
200000
Eff
icie
ncy (
N)
End Press
Plates
Columna Poroshell 120 EC-C18 30 x 50mm 27um LC Agilent 1200 RRLC (SL)
Muestra Plasma Precipitado 2 partes Plasma 7 Partes 2080 Agua-MeCN w01 Aacutecido Foacutermico con 1 Parte de Diflusinal en
5050 Agua-MeCN 10 ugml (Concentracion Final Diflusinal 1 ugml) Agitado y dejado reposar 10 minutos
No Centrifugado No Filtrado
Volumen de Inyeccioacuten 1ul
Solvente A Agua w01 TFA
Solvente B MeCN w008 TFA
Flujo 1 mlmin 1 ul inyeccioacuten
Tiempo B
0 20
05 90
06 90
11 20
25 20
Page 47
Diflusinal es un anti-inflamatorio no esteroidal anaacutelogo
a la aspirina desarrollado por Merck Sharp amp Dohme
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 48
Las Columnas Superficialmente Porosas Pueden
Usarse cumpliendo los Requirimientos USP
De la lista USP de empaquetamientos de columnas LC 42009
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Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 49
Criterios de Ajuste de Meacutetodos USP y FDA Criterios de Ajuste de Meacutetodos de Dimensiones de Columna
Paraacutemetro Especificaciones Maacuteximas ComentariosEjemplos
Longitud de Columna 70 250mm 75mm
150mm 50mm
Diaacutemetro Interno de
Columna
25 (FDA ORA-LAB 545)
USP ndash 25 ID Columna puede ajustarse si la
velocidad lineal es constante
46 mm 30 mm (-35)
46 mm 21 mm (-54)
30 mm 21 mm (-30)
Flow Rate 50
Volumen de Inyeccioacuten
Reducir tanto como se necesitendash
debe cumplir los liacutemites de
deteccioacuten y precisioacuten
Si cambia a una columna maacutes
corta haga el cambio apropiado
en el volumen de inyeccioacuten
Tamantildeo de Partiacutecula Reducir hasta el 50
(no se puede aumentar)
Puede cambiar la longitud de columna y el
tamantildeo de partiacutecula para mantener la misma
Rs
5um 35um (-30)
5um 27um (-46) Cambiado en 22409 ndash Para la copia oficial y actual ir a
httpwwwfdagovScienceResearchFieldSciencedefaulthtm
USP 30 Second Supplement Revisions PF34(5) en proceso
Ver ldquo Stimuli articlerdquo en Pharmacopeial Forum 2009 35(6)
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Comparacioacuten de 46 x 250 mm 5 um con Poroshell
120 EC-C18 46 x 100 mm 27um
min 5 10 15 20 25 30
mAU
0
20
40
60
80
100
97
12
111
16
115
96
126
74
152
48
161
51
164
35
206
87
230
76
292
90
min 5 10 15 20 25 30
mAU
0
50
100
150
200
250
17
19
21
89
23
11
26
06
38
67
44
37 45
58
54
50
59
20
70
37
Anaacutelisis maacutes raacutepido(columna maacutes corta flujo maacutes alto)
Mayor sensibilidad(partiacutecula maacutes pequentildeapico maacutes estrecho)
Maacutes optimizado (un anaacutelisis maacutes raacutepido permite ajustar mejor)
Ambos anaacutelisis en Agilent 1100 G1315B DAD (bajo 400 bar)
No se requiere cambio en la preparacioacuten de muestra frita de entrada
de 2 micras en ambas columnas
325 bar
110 bar
Sulfadiazina
Sulfatiazol
Sulfapiridina
Sulfamerazina
Sulfametazina
Sulfametazol
Sulfametoxipiridazina
Sulfacloropiridazina
Sulfametoxazol
Sulfadimetoxina
Tiempo B
0 8
33 33
34 33
Columna Eclipse Plus C18
46 x 250mm 5um
Flujo 1 mLmin
Fase Moacutevil
A 01 Aacutecido Foacutermico en Agua
B 01 Aacutecido Foacutermico en ACN
Tiempo B
0 8
12 33
132 33
Columna 46 x 100mm
Poroshell 120 EC-C18
27um
Flujo 185 mLmin
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Comparacioacuten de 46 x 250 mm 5 um con Poroshell
120 EC-C18 46 x 100 mm 27um
min 5 10 15 20 25 30
mAU
0
20
40
60
80
100
97
12
111
16
115
96
126
74
152
48
161
51
164
35
206
87
230
76
292
90
110 bar
5
mAU
0
50
100
150
200
250
17
19
21
89
23
11
26
06
38
67
44
37 45
58
54
50
59
20
70
37
325 bar
min
Ver condiciones en diapositiva anterior
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Mejor Resolucioacuten
linea base
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 52
Anaacutelisis maacutes raacutepido del meacutetodo USP para pastillas de
Simvastatina en Columnas Poroshell 120ndash Ajuste del meacutetodo
46 x 250 mm 5-um
Agilent ZORBAX Eclipse Plus C18
46 x 75 mm 27-um
Agilent Poroshell 120 EC-C18
65 CH3CN 35 39 gL NaH2PO4 (pH 45) 45 oC Sig = 238 8 Ref = 360 100 nm
Flujos 15 mLmin para la columna de 5-um 28 mLmin para la columna Poroshell 120 27um
Requerimiento
USP
5-um
(15 mLmin)
27-um
(28 mLmin)
TR na 9907 1457
krsquo gt 30 5962 5122
N gt 4500 16939 14439
Tf lt 20 109 110
min 2 4 6 8 10
mAU
0
5
10
15
20
25
30
35
40
min 2
mAU
0
5
10
15
20
25
30
35
40
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Ajustes de los parametros cromatograficos en la
transferencia de meacutetodos Escalado del volume de inyeccioacuten
v1 x [(r22 x L2)(r1
2 x L1)] = V2
O bien
v2 = V1 x [(d22 x L2)(d1
2 x L1)]
v volume de inyeccioacuten
r radio de la columna
L longitud de la columna
Ajuste del flujo
F2= F1 x (L2L1 ) x (r2r1 )2
L longitud de la columna
F Flujo
r radio de la columna
Ajuste de la longitud del gradiente
En funcioacuten de la longitud de la columna
L2L1= tg2tg1
En funcioacuten del volumen muerto de columna y del flujo
tG2= tG1 x (V2V1) x (F1F2) t tiempos de gradiente
V volumen muerto de columna
F flujo
Columna ID Volumen muerto aprox
por mm longitud
46mm 100uL
30mm 425uL
21mm 208uL
10mm 047uL
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 54
Notas de Aplicacioacuten en Poroshell 120 y QuEChERS
Determination of Hormones in Shrimp by Agilent 1290 Infinity LC with
Agilent Poroshell 120 LC Column and Agilent QuEChERS for Sample
Preparation (publication 5990-6589EN)
Analysis of Pesticide Residues in Green Tea Using Agilent SampliQ
QuEChERS EN Kit by LCMSMS Detection (publication 5990-
6400EN)
Analysis of Pesticide Residues in Rice Using Agilent Bond Elut
QuEChERS AOAC Kit (publication 5990-8034EN)
Poroshell 120 for pharmaceutical analysis
Poroshell 120 Resources
QuEChERS Applications
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 55
Sumario
bull La columna Poroshell 120 es una nueva alternativa para LC de Alta
Resolucioacuten y Alta Velocidad que puede usarse en cualquier HPLC o UHPLC
bull Con la Poroshell 120 se pueden lograr separaciones de alta eficacia a baja
presioacuten
bull Puede usarse con muestras sucias sin ver una elevacioacuten anormal de la
presioacuten
bull Puede usarse en un meacutetodo USP sin comprometer los Criterios de Ajustes de
Meacutetodo
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Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 56
Soporte Teacutecnico Agilent
Teleacutefono de Atencioacuten al Cliente
901 11 68 90
email customercare_spainagilentcom
wwwagilentcomchem
![Page 5: Análisis de compuestos farmacéuticos en sangre total · PDF fileReducción en el procesamiento, el envío de la muestra, y los ... Gas flow: 10 L/min Nebulizer: 10 psi Sheath gas](https://reader031.vdocuments.site/reader031/viewer/2022030405/5a7a81727f8b9a0a668b45aa/html5/thumbnails/5.jpg)
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 5
Introduccioacuten
La tecnologiacutea Gota de Sangre Seca como meacutetodo de muestreo
para el bioanaacutelisis quantitativo de pequentildeas moleacuteculas
Significativa reduccioacuten en los voluacutemenes de sangre necesarios
lo que simplifica la recogida de muestras
Reduccioacuten en el procesamiento el enviacuteo de la muestra y los
gastos de almacenamiento en condiciones ambientales
Estabilidad de los metabolitos en la tarjeta
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 6
Los compuestos
Las Estatinas (inhibidores de la HMG-CoA reductasa) son un
grupo de faacutermacos usados para disminuir los niveles de
colesterol
Se analizaron cuatro estatinas con las nuevas tarjetas de
Dried Matrix Spotting (DMS) no basadas en celulosa
Excepto la atorvastatina estos compuestos que son aacutecidos
por naturaleza son un reto aacute la hora de lograr unos liacutemites de
deteccioacuten bajos
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 7
Propiedades de las Estatinas
Compuesto Estructura Log P pKa
Atorvastatina
636 636
Simvastatina
468 NA
Pravastatina
218 470
Lovastatina
426 NA
Naproxeno (IS)
318 415
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 8
Procedimiento DMS
Fortificacioacuten de sangre humana entera fresca con cada una de las cuatro estatinas para crear una curva de calibracioacuten
Adicioacuten de la sangre fortificada en las tarjetas Agilent Bond Elut DMS (Part A400150)
Se prepararon 3 replicados de concentraciones de sangre a 20 ngmL y 500 ngmL
Secado de las tarjetas
Perforacioacuten de discos de 3 mm y se depositan en viales de 2 mL
Disolucioacuten de cada gota en el solvente de desorcioacuten y vortex
Evaporacioacuten hasta sequedad
Reconstitucioacuten en 100 μL de fase moacutevil (70 5 mM formiato amoacutenico 30 CH3CN) y agitacioacuten
Las muestras se analizaron por LCndashMSndashMS
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 9
Parametros de las transiciones MS-MS para las
estatinas estudiadas
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 10
Cromatograma LCndashMSndashMS de sangre fortificada
con 50 ngmL de estatinas despueacutes del DMS
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 11
Columna Poroshell 120 en la separacioacuten por HPLC
La columna Poroshell 120 ofrece velocidad y alta resolucioacuten
comparable a las columnas sub-2 μm de UHPLC
La tecnologia de partiacuteculas superficialmente genera
separaciones de alta eficacia a menores presiones
Se generaron presiones inferiores a 400 bares
La Poroshell 120 EC-C8 proporciona excelentes formas de
pico para todos los analitos
La atorvastatina puede ser facilmente detectada a 1 ngmL
con una SNR de 797
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 12
Cromatograma LCndashMSndashMS de atorvastatina en
sangre fortificada 1 ngmL
Condiciones LCndashMS
Columna Poroshell 120 EC-C8 27 μm 150 times 21 mm
(Part 693775-906)
Fase Movil
A 5 mM Formiato Amoacutenico B CH3CN
Flujo 200 μLmin
Gradiente
t0 A 70 B 30
t50 A 25 B 75
t55 A 25 B 75
t56 A 70 B 30
t80 A 70 B 30
Temperatura 30 degC
Presioacuten 394 bar
Tiempo anaacutelisis 8 min
Instrumento Agilent 1290 LC
6460 QQQ
Gas temp 275 degC
Gas flow 10 Lmin
Nebulizer 10 psi
Sheath gas temp 250 degC
Sheath gas flow 7 Lmin
Polarity Negative
1 ngmL con una SNR de 797
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 13
Curvas de calibracioacuten representativas de estatinas
en sangre fortificada
Linearidad en las curvas de calibracioacuten para seis niveles de
pravastatina y atorvastatina
Las curvas de Lovastatina y simvastatina no fueron lineales a
las maacutes altas concentraciones y rindieron regresioacuten cuadraacutetica
con coeficientes de correlacioacuten mejores de 0999
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 14
Recuperaciones de estatinas con tarjetas Bond
Elut DMS y tarjetas de celulosa (n = 3)
Los resultados indican que cuando se usan tarjetas de celulosa hay incremento
ionico dando lugar a altas recuperaciones artificiales
Estos datos corroboran que las tarjetas no celulosicas exhiben datos de desorcioacuten
de mejor calidad comparados con las tarjetas tradicionales de celulosa
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 15
Conclusiones
Meacutetodo simple y raacutepido para el anaacutelisis de un grupo de compuestos aciacutedicos en muestras de sangre humana con DMS y LCndashMSndashMS
El meacutetodo ha demostrado se exacto preciso y robusto
Buena linealidad para la pravastatina y atorvastatina usando una regresioacuten lineal con coeficientes de correlacioacuten mejores de 0998
Estas tarjetas ofrecen mejores propiedades de desorcioacuten comparadas con las tarjetas competitivas basadas en celulosa
La columna Poroshell 120 EC-C8 es una excelente eleccioacuten para las aplicaciones bioanaacuteliticas
La tecnologia de Gota de Sangre Seca (Dried blood spots) es una teacutecnica de recoleccioacuten de muestra para el anaacutelisis de faacutermacos en estudios cliacutenicos y precliacutenicos
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 16
Referencias
N Spooner R Lad M Barfield Anal Chem 2009 811557ndash
1563
M Barfield N Spooner R Lad S Parry S Fowles
J Chromatogr B 2008 870 32ndash37
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 17
bullTecnologiacutea Innovadora no-celulosa
bullProporciona un nuevo nivel de confianza en la recoleccioacuten de muestras
bullMejora significativa en la sensibilidad analiacutetica reproducibilidad y faacutecil uso
Anaacutelisis Dried Blood Spotting (DBS)
Desarrollado en colaboracioacuten con Compantildeiacuteas farmaceacuteuticas y CROs este
dispositivo elimina problemas actuales asociados a los sistemas de DBS que
hay en el mercado
bullMuestreo de Sangre plasma o suero (liacutequido sinoviallaacutegrimas bilis LCR) para
anaacutelisis bioanaliacuteticos en pruebas farmaceacuteuticas cliacutenicas y precliacutenicas en
empresasa farmaceacuteuticas de bioanaacutelisis (DMPK ADME y MetID) (no para
Diagnoacutestico cliacutenico)
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 18
La tarjeta sin celulosa es superior de forma medible a las tarjetas de papel de celulosa
Mejora la Sentildeal del MS
bullFormato libre de celulosa ha reducido el enlazado no especiacutefico y no contiene reactivos
quiacutemicos impregnados
Ventajas del Producto
Flujo de trabajo maacutes faacutecil
bull La extraccioacuten de la muestra de la tarjeta
requiere 5 veces menos fuerza que el
producto de celulosa
Proporciona excelente homogeneidad
de la mancha
bull Extracciones reproducibles
recuperaciones maacutes altas
independientemente del nivel de
hematocrito
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 19
bull El nivel de Hematocrito es el porcentaje del volumen de sangre ocupado por las ceacutelulas
rojas de la sangre
bull El material de muestreo Bond Elut DMS tiene una estructura de fibras
maacutes ordenadas comparado con la celulosa estaacutendard
Esta es la razoacuten de porqueacute Bond Elut DMS muestra mejor
reproducibilidad
Mejor Reproducibilidad
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 20
Bond Elut DBS Muestra Mejor Reproducibilidad
Bond Elut DMS tiene una desviacioacuten total de un 5 en todos los niveles HCT mientras que la
tarjeta de celulosa tiene una desviacioacuten de un 52 en todo el rango 10 veces de diferencia
Los datos abajo muestran la desviacioacuten de las medidas del CV desde niveles de HTC
normales (45) para tarjetas Bond Elut DMS y de celulosa (Whatman DMPK-C)
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Ventajas Clave de la Teacutecnica DBS de Agilent
bull Una vez seca la muestra de sangre no supone peligro bioloacutegico alguno y se
puede transportar sin necesidad de sistemas de refrigeracioacuten costosos
bull Permite a los laboratorios centralizar los anaacutelisis de muestra perifeacutericas
bull Se requiere menos volumen de muestra (menor nordm de sujetos en el ensayo
menor nordm de repeticiones y eliminacioacuten de sujetos sateacutelite)
bull Permite la toma demuestra en serie del mismo sujeto
bull La recoleccioacuten de sangre es maacutes sencilla
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Notas de Aplicacioacuten farmaceacuteuticas en Poroshell
120 and DMS Fast Analysis of Cefepime and Related Impurities on Poroshell 120 EC-C18 (publication 5990-7492EN) Comparing Selectivity Easy Transfer of Methods between Superficially Porous Agilent Poroshell 120 EC-C18 and totally Porous Agilent ZORBAX Eclipse Plus C18 (publication 5990-6588EN)
Analysis of Water Soluble Vitamins in Multivitamin Tablets Using Poroshell 120 EC-C18 (publication 5990-8107EN)
Analysis of Anthocyanins in Common Foods Using an Agilent Poroshell 120 SB-C18 (publication 5990-8249EN)
Analysis of Amitriptyline Fluoxetine Quetiapine and Sertraline Using Dried Plasma (publication 5990-8169EN)
Analysis of Amitriptyline Fluoxetine Quetiapine and Sertraline Using Dried Blood Spots (publication 5990-8168EN)
Investigation of Varying Blood Hematocrit Level in Dried Blood Spotting (publication 5990-8306EN)
Analysis of Cholesterol Lowering Drugs (Statins) Using Dried Matrix Spots Technology (publication 5990-8305EN)
Scalability of Agilent Columns Across HPLC and UHPLC Instruments (publication 5990-8428EN)
Converting a CHP Method for Insulin to Agilent Poroshell 120 Columns (publication 5990-9029EN)
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La propuesta QuEChERS para Determinar compuestos
Farmaceacuteuticos y Toxinas en Sangre Total
Anaacutelisis de Compuestos Farmaceacuteuticos en Sangre Total con
la columna Poroshell 120 Usando el meacutetodo Modificado
Mini-QuEChERS para la preparacioacuten de muestra
Nota de Aplicacioacuten5990-8789EN
httpwwwchemagilentcomLibraryapplications5990-8789ENpdf
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Introduccioacuten
Determinacioacuten de compuestos farmaceacuteuticos en anaacutelisis cliacutenicos y
foreacutensicos ADME (DMPK)
La preparacioacuten de muestra va desde la simple precipitacioacuten de
proteinas (PPT) a la maacutes compleja extraccioacuten en fase soacutelida (SPE)
Habitualmente la SPE ha ocupado este vaciacuteo pero simpre hay
espacio para teacutecnicas de preparacioacuten de muestras que son raacutepidas y
baratas de implementar
Se describe un procedimiento mini-QuEChERS modificado con
analisis LCndashMS-MS para la determinacioacuten de faacutermacos en sangre
total
Se analizan nueve diferentes faacutermacos (lidocaina tramadol
amitriptilina biperidina oxazepam lorazepam clorpromazina
diltiazem y naloxona)
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Compuestos farmaceacuteuticos usados en el estudio
Compuesto Nuacutemero CAS Log P (ow) pKa Uso
terapeacuteutico
Lidocaina 137-58-6 24 801 Anesteacutesico local
antiarrithmico
Tramadol 27203-92-5 25 941 Analgesico
Amitriptilina 50-48-6 492 94 Antidepresivo
Biperidena 514-65-8 40 108 Anticolinergico
Oxazepam 604-75-1 223 17 113 Antianxiedad
Lorazepam 846-49-1 247 13 115 Antidepresivo
Clorpromazina 50-53-3 518 93 Antipsycoacutetico
Diltiazem 42399-41-7 363 77 Bloqueante de los
canales del calcio
Naloxona 465-65-6 145 79 Antagonista de los
receptores de opio
Nortriptilina (IS) 72-69-5 565 97
5 ugmL de solucioacuten (9 compuestos) y estandar interno en metanol
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La Teacutecnica de QuEChERS aplicada a las muestras
de sangre
La sangre es el maacutes complejo de los fluidos bioloacutegicos
La determinacioacuten de faacutermacos en sangre total es a menudo necesaria en los
anaacutelisis foreacutensicos dada la dificultad de obtener suero o plasma
Los procedimientos convencionales para analizar faacutermacos en matrices
complejas como la sangre total son complicados
QuEChERS es una teacutecnica de preparacioacuten de muestra que fue desarrollada
para la extraccioacuten de residuos de plaguicidas multi-clase de frutas y vegetales
en 2003
A pesar de que los fluidos bioloacutegicos pueden parecer muy diferentes a una
pieza de fruta sin embargo siguen caminos paralelos
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 27
Caminos paralelos en la preparacioacuten de muestra
Fluidos Bioloacutegicos
Matrices complejas
Rotura de la arquitectura celular
bull Lisis agitacioacuten solvente orgaacutenico
hidroacutelisis
Analitos con un amplio rango de
polaridades
Retirar analito o matriz
Anaacutelisis por LCMSMS GCMS o
GCMSMS
Frutas y Vegetales
Matrices complejas
Rotura de la arquitectura celular
bull Trituracioacuten agitacioacuten solvente
orgaacutenico hidroacutelisis
Analitos con un amplio rango de
polaridades
Retirar analito o matriz
Anaacutelisis por LCMSMS GCMS o
GCMSMS
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Procedimiento baacutesico por SPE para muestras de sangre
El pretratamiento de la sangre total implica la dilucioacuten con una
solucioacuten aacutecida un tampoacuten fosfato o aguaFA
Sonicar 15 minutos rotura de membranas celulares
Centrifugacioacuten
bull Procedimiento de SPE
ndash Acondicionado del cartucho metanol agua
ndash Carga del cartucho muestra
ndash Lavado del cartucho agua con metanol o tampoacuten metanol
ndash Elucioacuten del cartucho eluyente para el anaacutelisis
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 29
Procedimiento Baacutesico QuEChERS
15 g muestra homogeneizada (fortificada)
Antildeadir 15 mL ACN (1 AA) vortex
Antildeadir Sales de Extraccioacuten AOAC agitar
Centrifugar
Transferir 1 u 8 mL a un tubo d-SPE AOAC vortex centrifugar
Transferir al vial de Anaacutelisis
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 30
Ventajas y desventajas del Procedimiento QuEChERS
Ventajas
Extraccioacuten tipo liacutequidoliacutequido
Uso de aacutecido para interrumpir el ligado de proteinas
Exceso de sal para lisar los componentes celulares
Uso de acetonitrilo para facilitar la precipitacioacuten proteacuteica
Uso de SPE dispersiva para adsorber las interferencias de la matriz
Plossl etat J Chrom A 1135 (2006) 19-26
Desventajas
La cantidad de solvente y de muestra requeridos en el meacutetodo no
son ldquobioloacutegicamente adecuadosrdquo
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Propoacutesito de la propuesta mini-Q
Ofrecer un enfoque maacutes adecuado biologicamente
Requirimientos de menores volumenes y tamantildeos de
muestra
Rango de faacutermacos varias polaridades y pKa
Evaluaciacuteoacuten de las interferencias de fondo
Extraccioacuten y datos de recuperacioacuten en un rango
aceptable
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Faacutermacos en sangre Procedimiento mini-QuEChERS
mini-Q
Procedimiento
1 Antildeadir 2 homogeneizadores ceraacutemicos
2 Antildeadir 1 o 2 mL de sangre entera a un tubo de centriacutefuga con tapoacuten de rosca
3 Antildeadir estandar interno vortex
4 Antildeadir 2 mL de ACN acidificado ( 04 FA) vortex 30 seg
5 Antildeadir 500 mg de sales de extraccioacuten agitar vigorsamente 1 minuto centrifugar 5000 rpm 1 min
6 Transferir 1 mL del extraccto al material de d-SPE en tubo de centrifuga vortex centrifugar
7 Antildeadir 200 uL a 800 uL de agua en un vial LC vortex y analizar
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Refinamiento del Procedimiento mini-Q
Paraacutemetros evaluados en la teacutecnica mini-Q
Muestra de sangre total
bull La matriz bioloacutegica maacutes complicada
Adicioacuten de aacutecido tipo y cantidad
bull Efecto en la particioacuten y extraccioacuten
Adicioacuten de las sales de QuEChERS no-tamponadas o
tamponadas con NaAcetato o Citrato
bull Efecto en el extracto inspeccioacuten visual
SPE Dispersiva
bull Limpieza de la matriz y recuperaciones de los compuestos
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 34
Conclusiones del estudio
El ACN con 4 de FA como solvente de extraccioacuten muestra
una lisis maacutes completa de la muestra frente a otros solventes
de extraccioacuten que mostraron una masa soacutelida
Las sales tamponadas AOAC de acetato Soacutedico generan el
extracto maacutes liacutempio y fueron elegidas para la d-SPE
El paso de dSPE no ofrece un clean up adicional para los
meacutetodos de extraccioacuten con sales EN y no tamponadas
principalmente
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Datos de Adquisicoacuten LCMSMS
Compuestos Canales MRM
(mz) Fragmentador
(V) CE (V) RT (min) Delta RT
Lidocaina 1) 23518 gt 861
2) 23518 gt 581
97 11
35
137 04
Tramadol 1) 2642 gt 581
2) 2642 gt 2461
97 15
3
120 04
Amitriptilina 1) 2782 gt 117
2) 2782 gt 105
112 19
19
425 04
Biperidena 1)31223 gt 981
2) 31223 gt 551
123 19
60
423 07
Oxazepam 1) 28706 gt 2409
2) 28706 gt 2689
112 19
7
399 04
Lorazepam 1) 32102 gt 2749
2) 32102 gt 3029
113 15
7
409 04
Clorpromazina 1) 31911 gt 861
2) 31911 gt 581
112 15
43
463 04
Diltiazem 1) 41517 gt 1779
2) 41517 gt 1499
128 19
43
373 04
Naloxona 1) 32816 gt 310
2) 32816 gt 212
123 15
39
082 04
Nortriptilina (IS) 1) 26418 gt 233
2) 26418 gt 91
97 7
19
417 04
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05
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055
0575
06
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065
0675
07
0725
075
0775
08
0825
085
0875
09
0925
095
0975
1
1025
105
1075
11
1125
115
1175
12
1225
125
1275
13
1325
135
1375
+ESI TIC Scan Frag=800V AOAC_BLANK_110228bd
1 1
Counts vs Acquisition Time (min)
05 1 15 2 25
3 35 4 45 5 55 6 65 7 75 8 85 9 95 10
Columna Poroshell 120 EC-C18 27
micro 21 x 100 mm PN 695775-902
Fase Moacutevil
A 5 mM Acetato Amoacutenico pH 5
2080 MeOHagua
B 5 mM Acetato amoacutencio en ACN
Flujo 04mLmin
Inyeccioacuten 10uL
GT (ordmC) 300
GF (lmin) 7
Nebulizador (psi) 40
SGT (ordmC) 400
SFG (lmin) 12
Capilar (V) 3500
NV (V) 500
Condiciones LCMS
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36
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38
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4
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48
49
5
51
+ESI MRM Frag=1120V CID190 (2782000 -gt 1170000) HQC_6d
1 1
Counts vs Acquisition Time (min) 01 02 03 04 05 06 07 08 09 1 11 12 13 14 15 16 17 18 19 2 21 22 23 24 25 26 27 28 29 3 31 32 33 34 35 36 37 38 39 4 41 42 43 44 45 46
Nalo
xo
ne
Lid
oc
ain
e
Tra
mad
ol
Oxazep
am
Lo
razep
am
Bip
eri
de
n
Am
itri
pty
lin
e
Dil
tiazem
Ch
lorp
rom
azin
e
No
rtri
pty
lin
e (
IS)
Cromatograma LCMSMS de 10 ngmL de sangre total fortificada despueacutes
de extraccioacuten mini-QuEChERS AOAC (NaAc) y d-SPE (50mg PSA y
150mg MgSO4)
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17
18
19
2
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22
23
24
25
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29
3
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34
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39
4
41
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48
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5
51
+ESI MRM Frag=1120V CID190 (2782000 -gt 1170000) HQC_6d
1 1
Counts vs Acquisition Time (min) 01 02 03 04 05 06 07 08 09 1 11 12 13 14 15 16 17 18 19 2 21 22 23 24 25 26 27 28 29 3 31 32 33 34 35 36 37 38 39 4 41 42 43 44 45 46
1 x10
415 42 425 43 435 44 445 45 455 46 465 47 475 48 485 49 495 5
505 51 515 52 525 53 535 54 545 55 555 56 565 57
+ESI MRM Frag=1120V CID190 (2871000 -gt 2409000) RE_L_1d 1
Counts vs Acquisition Time (min) 305 31 315 32 325 33 335 34 345 35 355 36 365 37 375 38 385 39 395 4 405 41 415 42 425 43 435 44 445 45 455 46 465 47 475
Relacioacuten sentildealruido para el Oxazepam y Lorazepam a
10 ngmL (10 ppb)
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 39
La Naloxone muestra esta curva de linealidad de10-250 ngmL (ppb) con una R2
= 0991
Las curvas de calibracioacuten se generaron con la respuestra relativa (area pico
analitoarea pico IS) frente a la concentracioacuten relativa (concentracion de
analitoconcentracioacuten de IS)
Ejemplo de curva de linealidad para Naloxona extraido
con mini-QuEChERS
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 40
Recuperacioacuten y Reproducibilidad
Compuesto 50 ngmL Spiked
Recuperacioacuten RSD
100 ngmL Spiked
Recuperacioacuten RSD
Lidocaine 987 157 100 118
Tramadol 105 30 104 82
Amitriptyline 104 21 104 82
Biperidene 97 45 99 82
Oxazepam 770 92 78 86
Lorazepam 819 68 818 86
Chlorpromazine 110 103 105 63
Diltiazem 881 27 917 83
Naloxone 806 90 755 77
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 41
Conclusioacutenes y trabajo posterior
El meacutetodo mini-QuEChERS para la extraccioacuten de compuestos farmaceacuteuticos en
sangre total ofrece una alternativa a otras teacutecnicas de preparacioacuten de muestras
La preparacioacuten de muestras mini-QuEChERS es un enfoque simple facil y
barato que requiere una miacutenima experiencia en preparacioacuten de muestras y
miacutenimo equipamiento
Es un punto de partida para ampliar el numero y las clasificaciones evaluadas
en otras matrices bioloacutegicas y en sangre postmortem
El trabajo futuro incluira combinaciones adecuadas tanto de las sales de
extraccioacuten como de los sorbentes de d-SPE por el meacutetodo mini-QuEChERS
La columna Poroshell 120 ofrece una selectividad diferente y excelentes formas
de pico a lo largo del amplio rango de compuestos farmaceacuteuticos usados en este
estudio
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 42
Referencias
(1) M Anastassiades SJ Lehotay D Štajnbaher and FJ Schenk J AOAC Int 86 4121 (2003)
(2) G Stubbings and T Bigwood Anal Chim Acta 637 68 (2009)
(3) RR Rasmussen IMLD Storm PZH Rasmussen J Smedsgaard and KF Nielsen Anal Bioanal Chem 397 765 (2010)
(4) D Smith and K Lynam GCμECD analysis and confirmation of PCBs in fish tissue with Agilent JampW DB-35ms and DB-XLB GC columns Agilent Technologies 5990-6236EN (2010)
(5) F Ploumlssl M Giera and F Bracher J Chrom A 1135 19 (2006)
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 43
MEJORAR LA PRODUCTIVIDAD EN
HPLC ESTAacuteNDAR CON COLUMNAS
POROSHELL
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Columnas Poroshell 120 para HPLC y UHPLC
bull 80-90 de eficacia de las sub 2um
bull A presiones un ~40-50 maacutes bajas
bull Con un tamantildeo de partiacutecula de 27um
bull Con una frita de entrada de 2um
bull Con el doble de resolucioacuten de una
columna de 35um
bull Con un liacutemite de presioacuten de 600 bar
bull La partiacutecula tiene un nuacutecleo soacutelido
(17um) y una cubierta exterior porosa
de 05um como zona de difusioacuten
Las Columnas Poroshell 120 tienen
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Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 45
Poroshell 120 proporciona Eficacia Suficiente
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Flujo 0582 mLmin AcetonitriloAgua (6040)
Volumen de Inyeccioacuten 4 microL
TCC 26 oC
DAD Sig=2544nm Ref=360100nm
Muestra Muestra de test RRLC
(PN 5188-6529) inoculada con
50 microL 2 mgmL Tiourea en
aguaacetonitrilo (6535)
25 5 75 10
mAU
0
200
400
600
06
46
0
82
6
11
48
15
18
20
16
2
22
3
28
16
41
32
62
73
97
53
larr N = 25053 Presioacuten = 182 bar
Poroshell 120 EC-C18 30 x 100 mm 27 um
min 25 5 75 10 125
mAU
0
200
400
600
06
49
0
86
5
12
75
17
56
24
18
27
05
34
94
52
81
82
18
13
04
1
larr N = 27295 Presioacuten = 386 bar
Eclipse Plus C18 30 x 100 mm 18 um
gt90 de la Eficacia de una 18um
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 46
iquestEn queacute tipos de instrumentos puede usar
Columnas Poroshell 120 HPLCrsquos y UHPLCrsquos
Consideraciones en UHPLC
bull Las columnas Poroshell 120 tienen un liacutemite de presioacuten de 600 bar
bull Los UHPLC estaacuten ajustados para columnas de bajo volumen por lo tanto las
Poroshell pueden usarse en todos los UHPLC
Consideraciones en HPLC
bull Las Columnas Poroshell 120 trabajan bien por debajo de 400 bar
bull Minimize los volumenes extra columna para las columnas 21 y 30mm ID ndash
siga las instrucciones dadas para las columnas RRHT (18um 600 bar)
bull Use en el detector velocidades adecuadas de adquisicioacuten para picos
estrechos de alta eficacia
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Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 47
Con una frita de 2 um Poroshell 120 no se bloquea
Muestras Complejas- Plasma
Diflusinal in Plasma
0
20
40
60
80
100
120
140
160
180
200
220
240
260
280
300
320
340
360
380
400
1 501 1001 1501 2001 2501
Injections
Pre
ssu
re
0
20000
40000
60000
80000
100000
120000
140000
160000
180000
200000
Eff
icie
ncy (
N)
End Press
Plates
Columna Poroshell 120 EC-C18 30 x 50mm 27um LC Agilent 1200 RRLC (SL)
Muestra Plasma Precipitado 2 partes Plasma 7 Partes 2080 Agua-MeCN w01 Aacutecido Foacutermico con 1 Parte de Diflusinal en
5050 Agua-MeCN 10 ugml (Concentracion Final Diflusinal 1 ugml) Agitado y dejado reposar 10 minutos
No Centrifugado No Filtrado
Volumen de Inyeccioacuten 1ul
Solvente A Agua w01 TFA
Solvente B MeCN w008 TFA
Flujo 1 mlmin 1 ul inyeccioacuten
Tiempo B
0 20
05 90
06 90
11 20
25 20
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Diflusinal es un anti-inflamatorio no esteroidal anaacutelogo
a la aspirina desarrollado por Merck Sharp amp Dohme
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Las Columnas Superficialmente Porosas Pueden
Usarse cumpliendo los Requirimientos USP
De la lista USP de empaquetamientos de columnas LC 42009
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Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 49
Criterios de Ajuste de Meacutetodos USP y FDA Criterios de Ajuste de Meacutetodos de Dimensiones de Columna
Paraacutemetro Especificaciones Maacuteximas ComentariosEjemplos
Longitud de Columna 70 250mm 75mm
150mm 50mm
Diaacutemetro Interno de
Columna
25 (FDA ORA-LAB 545)
USP ndash 25 ID Columna puede ajustarse si la
velocidad lineal es constante
46 mm 30 mm (-35)
46 mm 21 mm (-54)
30 mm 21 mm (-30)
Flow Rate 50
Volumen de Inyeccioacuten
Reducir tanto como se necesitendash
debe cumplir los liacutemites de
deteccioacuten y precisioacuten
Si cambia a una columna maacutes
corta haga el cambio apropiado
en el volumen de inyeccioacuten
Tamantildeo de Partiacutecula Reducir hasta el 50
(no se puede aumentar)
Puede cambiar la longitud de columna y el
tamantildeo de partiacutecula para mantener la misma
Rs
5um 35um (-30)
5um 27um (-46) Cambiado en 22409 ndash Para la copia oficial y actual ir a
httpwwwfdagovScienceResearchFieldSciencedefaulthtm
USP 30 Second Supplement Revisions PF34(5) en proceso
Ver ldquo Stimuli articlerdquo en Pharmacopeial Forum 2009 35(6)
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Comparacioacuten de 46 x 250 mm 5 um con Poroshell
120 EC-C18 46 x 100 mm 27um
min 5 10 15 20 25 30
mAU
0
20
40
60
80
100
97
12
111
16
115
96
126
74
152
48
161
51
164
35
206
87
230
76
292
90
min 5 10 15 20 25 30
mAU
0
50
100
150
200
250
17
19
21
89
23
11
26
06
38
67
44
37 45
58
54
50
59
20
70
37
Anaacutelisis maacutes raacutepido(columna maacutes corta flujo maacutes alto)
Mayor sensibilidad(partiacutecula maacutes pequentildeapico maacutes estrecho)
Maacutes optimizado (un anaacutelisis maacutes raacutepido permite ajustar mejor)
Ambos anaacutelisis en Agilent 1100 G1315B DAD (bajo 400 bar)
No se requiere cambio en la preparacioacuten de muestra frita de entrada
de 2 micras en ambas columnas
325 bar
110 bar
Sulfadiazina
Sulfatiazol
Sulfapiridina
Sulfamerazina
Sulfametazina
Sulfametazol
Sulfametoxipiridazina
Sulfacloropiridazina
Sulfametoxazol
Sulfadimetoxina
Tiempo B
0 8
33 33
34 33
Columna Eclipse Plus C18
46 x 250mm 5um
Flujo 1 mLmin
Fase Moacutevil
A 01 Aacutecido Foacutermico en Agua
B 01 Aacutecido Foacutermico en ACN
Tiempo B
0 8
12 33
132 33
Columna 46 x 100mm
Poroshell 120 EC-C18
27um
Flujo 185 mLmin
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Comparacioacuten de 46 x 250 mm 5 um con Poroshell
120 EC-C18 46 x 100 mm 27um
min 5 10 15 20 25 30
mAU
0
20
40
60
80
100
97
12
111
16
115
96
126
74
152
48
161
51
164
35
206
87
230
76
292
90
110 bar
5
mAU
0
50
100
150
200
250
17
19
21
89
23
11
26
06
38
67
44
37 45
58
54
50
59
20
70
37
325 bar
min
Ver condiciones en diapositiva anterior
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Mejor Resolucioacuten
linea base
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Anaacutelisis maacutes raacutepido del meacutetodo USP para pastillas de
Simvastatina en Columnas Poroshell 120ndash Ajuste del meacutetodo
46 x 250 mm 5-um
Agilent ZORBAX Eclipse Plus C18
46 x 75 mm 27-um
Agilent Poroshell 120 EC-C18
65 CH3CN 35 39 gL NaH2PO4 (pH 45) 45 oC Sig = 238 8 Ref = 360 100 nm
Flujos 15 mLmin para la columna de 5-um 28 mLmin para la columna Poroshell 120 27um
Requerimiento
USP
5-um
(15 mLmin)
27-um
(28 mLmin)
TR na 9907 1457
krsquo gt 30 5962 5122
N gt 4500 16939 14439
Tf lt 20 109 110
min 2 4 6 8 10
mAU
0
5
10
15
20
25
30
35
40
min 2
mAU
0
5
10
15
20
25
30
35
40
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Ajustes de los parametros cromatograficos en la
transferencia de meacutetodos Escalado del volume de inyeccioacuten
v1 x [(r22 x L2)(r1
2 x L1)] = V2
O bien
v2 = V1 x [(d22 x L2)(d1
2 x L1)]
v volume de inyeccioacuten
r radio de la columna
L longitud de la columna
Ajuste del flujo
F2= F1 x (L2L1 ) x (r2r1 )2
L longitud de la columna
F Flujo
r radio de la columna
Ajuste de la longitud del gradiente
En funcioacuten de la longitud de la columna
L2L1= tg2tg1
En funcioacuten del volumen muerto de columna y del flujo
tG2= tG1 x (V2V1) x (F1F2) t tiempos de gradiente
V volumen muerto de columna
F flujo
Columna ID Volumen muerto aprox
por mm longitud
46mm 100uL
30mm 425uL
21mm 208uL
10mm 047uL
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 54
Notas de Aplicacioacuten en Poroshell 120 y QuEChERS
Determination of Hormones in Shrimp by Agilent 1290 Infinity LC with
Agilent Poroshell 120 LC Column and Agilent QuEChERS for Sample
Preparation (publication 5990-6589EN)
Analysis of Pesticide Residues in Green Tea Using Agilent SampliQ
QuEChERS EN Kit by LCMSMS Detection (publication 5990-
6400EN)
Analysis of Pesticide Residues in Rice Using Agilent Bond Elut
QuEChERS AOAC Kit (publication 5990-8034EN)
Poroshell 120 for pharmaceutical analysis
Poroshell 120 Resources
QuEChERS Applications
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Sumario
bull La columna Poroshell 120 es una nueva alternativa para LC de Alta
Resolucioacuten y Alta Velocidad que puede usarse en cualquier HPLC o UHPLC
bull Con la Poroshell 120 se pueden lograr separaciones de alta eficacia a baja
presioacuten
bull Puede usarse con muestras sucias sin ver una elevacioacuten anormal de la
presioacuten
bull Puede usarse en un meacutetodo USP sin comprometer los Criterios de Ajustes de
Meacutetodo
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Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 56
Soporte Teacutecnico Agilent
Teleacutefono de Atencioacuten al Cliente
901 11 68 90
email customercare_spainagilentcom
wwwagilentcomchem
![Page 6: Análisis de compuestos farmacéuticos en sangre total · PDF fileReducción en el procesamiento, el envío de la muestra, y los ... Gas flow: 10 L/min Nebulizer: 10 psi Sheath gas](https://reader031.vdocuments.site/reader031/viewer/2022030405/5a7a81727f8b9a0a668b45aa/html5/thumbnails/6.jpg)
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 6
Los compuestos
Las Estatinas (inhibidores de la HMG-CoA reductasa) son un
grupo de faacutermacos usados para disminuir los niveles de
colesterol
Se analizaron cuatro estatinas con las nuevas tarjetas de
Dried Matrix Spotting (DMS) no basadas en celulosa
Excepto la atorvastatina estos compuestos que son aacutecidos
por naturaleza son un reto aacute la hora de lograr unos liacutemites de
deteccioacuten bajos
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 7
Propiedades de las Estatinas
Compuesto Estructura Log P pKa
Atorvastatina
636 636
Simvastatina
468 NA
Pravastatina
218 470
Lovastatina
426 NA
Naproxeno (IS)
318 415
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Procedimiento DMS
Fortificacioacuten de sangre humana entera fresca con cada una de las cuatro estatinas para crear una curva de calibracioacuten
Adicioacuten de la sangre fortificada en las tarjetas Agilent Bond Elut DMS (Part A400150)
Se prepararon 3 replicados de concentraciones de sangre a 20 ngmL y 500 ngmL
Secado de las tarjetas
Perforacioacuten de discos de 3 mm y se depositan en viales de 2 mL
Disolucioacuten de cada gota en el solvente de desorcioacuten y vortex
Evaporacioacuten hasta sequedad
Reconstitucioacuten en 100 μL de fase moacutevil (70 5 mM formiato amoacutenico 30 CH3CN) y agitacioacuten
Las muestras se analizaron por LCndashMSndashMS
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Parametros de las transiciones MS-MS para las
estatinas estudiadas
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Cromatograma LCndashMSndashMS de sangre fortificada
con 50 ngmL de estatinas despueacutes del DMS
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 11
Columna Poroshell 120 en la separacioacuten por HPLC
La columna Poroshell 120 ofrece velocidad y alta resolucioacuten
comparable a las columnas sub-2 μm de UHPLC
La tecnologia de partiacuteculas superficialmente genera
separaciones de alta eficacia a menores presiones
Se generaron presiones inferiores a 400 bares
La Poroshell 120 EC-C8 proporciona excelentes formas de
pico para todos los analitos
La atorvastatina puede ser facilmente detectada a 1 ngmL
con una SNR de 797
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 12
Cromatograma LCndashMSndashMS de atorvastatina en
sangre fortificada 1 ngmL
Condiciones LCndashMS
Columna Poroshell 120 EC-C8 27 μm 150 times 21 mm
(Part 693775-906)
Fase Movil
A 5 mM Formiato Amoacutenico B CH3CN
Flujo 200 μLmin
Gradiente
t0 A 70 B 30
t50 A 25 B 75
t55 A 25 B 75
t56 A 70 B 30
t80 A 70 B 30
Temperatura 30 degC
Presioacuten 394 bar
Tiempo anaacutelisis 8 min
Instrumento Agilent 1290 LC
6460 QQQ
Gas temp 275 degC
Gas flow 10 Lmin
Nebulizer 10 psi
Sheath gas temp 250 degC
Sheath gas flow 7 Lmin
Polarity Negative
1 ngmL con una SNR de 797
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 13
Curvas de calibracioacuten representativas de estatinas
en sangre fortificada
Linearidad en las curvas de calibracioacuten para seis niveles de
pravastatina y atorvastatina
Las curvas de Lovastatina y simvastatina no fueron lineales a
las maacutes altas concentraciones y rindieron regresioacuten cuadraacutetica
con coeficientes de correlacioacuten mejores de 0999
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 14
Recuperaciones de estatinas con tarjetas Bond
Elut DMS y tarjetas de celulosa (n = 3)
Los resultados indican que cuando se usan tarjetas de celulosa hay incremento
ionico dando lugar a altas recuperaciones artificiales
Estos datos corroboran que las tarjetas no celulosicas exhiben datos de desorcioacuten
de mejor calidad comparados con las tarjetas tradicionales de celulosa
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 15
Conclusiones
Meacutetodo simple y raacutepido para el anaacutelisis de un grupo de compuestos aciacutedicos en muestras de sangre humana con DMS y LCndashMSndashMS
El meacutetodo ha demostrado se exacto preciso y robusto
Buena linealidad para la pravastatina y atorvastatina usando una regresioacuten lineal con coeficientes de correlacioacuten mejores de 0998
Estas tarjetas ofrecen mejores propiedades de desorcioacuten comparadas con las tarjetas competitivas basadas en celulosa
La columna Poroshell 120 EC-C8 es una excelente eleccioacuten para las aplicaciones bioanaacuteliticas
La tecnologia de Gota de Sangre Seca (Dried blood spots) es una teacutecnica de recoleccioacuten de muestra para el anaacutelisis de faacutermacos en estudios cliacutenicos y precliacutenicos
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 16
Referencias
N Spooner R Lad M Barfield Anal Chem 2009 811557ndash
1563
M Barfield N Spooner R Lad S Parry S Fowles
J Chromatogr B 2008 870 32ndash37
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 17
bullTecnologiacutea Innovadora no-celulosa
bullProporciona un nuevo nivel de confianza en la recoleccioacuten de muestras
bullMejora significativa en la sensibilidad analiacutetica reproducibilidad y faacutecil uso
Anaacutelisis Dried Blood Spotting (DBS)
Desarrollado en colaboracioacuten con Compantildeiacuteas farmaceacuteuticas y CROs este
dispositivo elimina problemas actuales asociados a los sistemas de DBS que
hay en el mercado
bullMuestreo de Sangre plasma o suero (liacutequido sinoviallaacutegrimas bilis LCR) para
anaacutelisis bioanaliacuteticos en pruebas farmaceacuteuticas cliacutenicas y precliacutenicas en
empresasa farmaceacuteuticas de bioanaacutelisis (DMPK ADME y MetID) (no para
Diagnoacutestico cliacutenico)
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 18
La tarjeta sin celulosa es superior de forma medible a las tarjetas de papel de celulosa
Mejora la Sentildeal del MS
bullFormato libre de celulosa ha reducido el enlazado no especiacutefico y no contiene reactivos
quiacutemicos impregnados
Ventajas del Producto
Flujo de trabajo maacutes faacutecil
bull La extraccioacuten de la muestra de la tarjeta
requiere 5 veces menos fuerza que el
producto de celulosa
Proporciona excelente homogeneidad
de la mancha
bull Extracciones reproducibles
recuperaciones maacutes altas
independientemente del nivel de
hematocrito
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 19
bull El nivel de Hematocrito es el porcentaje del volumen de sangre ocupado por las ceacutelulas
rojas de la sangre
bull El material de muestreo Bond Elut DMS tiene una estructura de fibras
maacutes ordenadas comparado con la celulosa estaacutendard
Esta es la razoacuten de porqueacute Bond Elut DMS muestra mejor
reproducibilidad
Mejor Reproducibilidad
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Bond Elut DBS Muestra Mejor Reproducibilidad
Bond Elut DMS tiene una desviacioacuten total de un 5 en todos los niveles HCT mientras que la
tarjeta de celulosa tiene una desviacioacuten de un 52 en todo el rango 10 veces de diferencia
Los datos abajo muestran la desviacioacuten de las medidas del CV desde niveles de HTC
normales (45) para tarjetas Bond Elut DMS y de celulosa (Whatman DMPK-C)
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 21
Ventajas Clave de la Teacutecnica DBS de Agilent
bull Una vez seca la muestra de sangre no supone peligro bioloacutegico alguno y se
puede transportar sin necesidad de sistemas de refrigeracioacuten costosos
bull Permite a los laboratorios centralizar los anaacutelisis de muestra perifeacutericas
bull Se requiere menos volumen de muestra (menor nordm de sujetos en el ensayo
menor nordm de repeticiones y eliminacioacuten de sujetos sateacutelite)
bull Permite la toma demuestra en serie del mismo sujeto
bull La recoleccioacuten de sangre es maacutes sencilla
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 22
Notas de Aplicacioacuten farmaceacuteuticas en Poroshell
120 and DMS Fast Analysis of Cefepime and Related Impurities on Poroshell 120 EC-C18 (publication 5990-7492EN) Comparing Selectivity Easy Transfer of Methods between Superficially Porous Agilent Poroshell 120 EC-C18 and totally Porous Agilent ZORBAX Eclipse Plus C18 (publication 5990-6588EN)
Analysis of Water Soluble Vitamins in Multivitamin Tablets Using Poroshell 120 EC-C18 (publication 5990-8107EN)
Analysis of Anthocyanins in Common Foods Using an Agilent Poroshell 120 SB-C18 (publication 5990-8249EN)
Analysis of Amitriptyline Fluoxetine Quetiapine and Sertraline Using Dried Plasma (publication 5990-8169EN)
Analysis of Amitriptyline Fluoxetine Quetiapine and Sertraline Using Dried Blood Spots (publication 5990-8168EN)
Investigation of Varying Blood Hematocrit Level in Dried Blood Spotting (publication 5990-8306EN)
Analysis of Cholesterol Lowering Drugs (Statins) Using Dried Matrix Spots Technology (publication 5990-8305EN)
Scalability of Agilent Columns Across HPLC and UHPLC Instruments (publication 5990-8428EN)
Converting a CHP Method for Insulin to Agilent Poroshell 120 Columns (publication 5990-9029EN)
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 23
La propuesta QuEChERS para Determinar compuestos
Farmaceacuteuticos y Toxinas en Sangre Total
Anaacutelisis de Compuestos Farmaceacuteuticos en Sangre Total con
la columna Poroshell 120 Usando el meacutetodo Modificado
Mini-QuEChERS para la preparacioacuten de muestra
Nota de Aplicacioacuten5990-8789EN
httpwwwchemagilentcomLibraryapplications5990-8789ENpdf
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 24
Introduccioacuten
Determinacioacuten de compuestos farmaceacuteuticos en anaacutelisis cliacutenicos y
foreacutensicos ADME (DMPK)
La preparacioacuten de muestra va desde la simple precipitacioacuten de
proteinas (PPT) a la maacutes compleja extraccioacuten en fase soacutelida (SPE)
Habitualmente la SPE ha ocupado este vaciacuteo pero simpre hay
espacio para teacutecnicas de preparacioacuten de muestras que son raacutepidas y
baratas de implementar
Se describe un procedimiento mini-QuEChERS modificado con
analisis LCndashMS-MS para la determinacioacuten de faacutermacos en sangre
total
Se analizan nueve diferentes faacutermacos (lidocaina tramadol
amitriptilina biperidina oxazepam lorazepam clorpromazina
diltiazem y naloxona)
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 25
Compuestos farmaceacuteuticos usados en el estudio
Compuesto Nuacutemero CAS Log P (ow) pKa Uso
terapeacuteutico
Lidocaina 137-58-6 24 801 Anesteacutesico local
antiarrithmico
Tramadol 27203-92-5 25 941 Analgesico
Amitriptilina 50-48-6 492 94 Antidepresivo
Biperidena 514-65-8 40 108 Anticolinergico
Oxazepam 604-75-1 223 17 113 Antianxiedad
Lorazepam 846-49-1 247 13 115 Antidepresivo
Clorpromazina 50-53-3 518 93 Antipsycoacutetico
Diltiazem 42399-41-7 363 77 Bloqueante de los
canales del calcio
Naloxona 465-65-6 145 79 Antagonista de los
receptores de opio
Nortriptilina (IS) 72-69-5 565 97
5 ugmL de solucioacuten (9 compuestos) y estandar interno en metanol
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 26
La Teacutecnica de QuEChERS aplicada a las muestras
de sangre
La sangre es el maacutes complejo de los fluidos bioloacutegicos
La determinacioacuten de faacutermacos en sangre total es a menudo necesaria en los
anaacutelisis foreacutensicos dada la dificultad de obtener suero o plasma
Los procedimientos convencionales para analizar faacutermacos en matrices
complejas como la sangre total son complicados
QuEChERS es una teacutecnica de preparacioacuten de muestra que fue desarrollada
para la extraccioacuten de residuos de plaguicidas multi-clase de frutas y vegetales
en 2003
A pesar de que los fluidos bioloacutegicos pueden parecer muy diferentes a una
pieza de fruta sin embargo siguen caminos paralelos
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 27
Caminos paralelos en la preparacioacuten de muestra
Fluidos Bioloacutegicos
Matrices complejas
Rotura de la arquitectura celular
bull Lisis agitacioacuten solvente orgaacutenico
hidroacutelisis
Analitos con un amplio rango de
polaridades
Retirar analito o matriz
Anaacutelisis por LCMSMS GCMS o
GCMSMS
Frutas y Vegetales
Matrices complejas
Rotura de la arquitectura celular
bull Trituracioacuten agitacioacuten solvente
orgaacutenico hidroacutelisis
Analitos con un amplio rango de
polaridades
Retirar analito o matriz
Anaacutelisis por LCMSMS GCMS o
GCMSMS
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 28
Procedimiento baacutesico por SPE para muestras de sangre
El pretratamiento de la sangre total implica la dilucioacuten con una
solucioacuten aacutecida un tampoacuten fosfato o aguaFA
Sonicar 15 minutos rotura de membranas celulares
Centrifugacioacuten
bull Procedimiento de SPE
ndash Acondicionado del cartucho metanol agua
ndash Carga del cartucho muestra
ndash Lavado del cartucho agua con metanol o tampoacuten metanol
ndash Elucioacuten del cartucho eluyente para el anaacutelisis
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 29
Procedimiento Baacutesico QuEChERS
15 g muestra homogeneizada (fortificada)
Antildeadir 15 mL ACN (1 AA) vortex
Antildeadir Sales de Extraccioacuten AOAC agitar
Centrifugar
Transferir 1 u 8 mL a un tubo d-SPE AOAC vortex centrifugar
Transferir al vial de Anaacutelisis
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 30
Ventajas y desventajas del Procedimiento QuEChERS
Ventajas
Extraccioacuten tipo liacutequidoliacutequido
Uso de aacutecido para interrumpir el ligado de proteinas
Exceso de sal para lisar los componentes celulares
Uso de acetonitrilo para facilitar la precipitacioacuten proteacuteica
Uso de SPE dispersiva para adsorber las interferencias de la matriz
Plossl etat J Chrom A 1135 (2006) 19-26
Desventajas
La cantidad de solvente y de muestra requeridos en el meacutetodo no
son ldquobioloacutegicamente adecuadosrdquo
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 31
Propoacutesito de la propuesta mini-Q
Ofrecer un enfoque maacutes adecuado biologicamente
Requirimientos de menores volumenes y tamantildeos de
muestra
Rango de faacutermacos varias polaridades y pKa
Evaluaciacuteoacuten de las interferencias de fondo
Extraccioacuten y datos de recuperacioacuten en un rango
aceptable
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 32
Faacutermacos en sangre Procedimiento mini-QuEChERS
mini-Q
Procedimiento
1 Antildeadir 2 homogeneizadores ceraacutemicos
2 Antildeadir 1 o 2 mL de sangre entera a un tubo de centriacutefuga con tapoacuten de rosca
3 Antildeadir estandar interno vortex
4 Antildeadir 2 mL de ACN acidificado ( 04 FA) vortex 30 seg
5 Antildeadir 500 mg de sales de extraccioacuten agitar vigorsamente 1 minuto centrifugar 5000 rpm 1 min
6 Transferir 1 mL del extraccto al material de d-SPE en tubo de centrifuga vortex centrifugar
7 Antildeadir 200 uL a 800 uL de agua en un vial LC vortex y analizar
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 33
Refinamiento del Procedimiento mini-Q
Paraacutemetros evaluados en la teacutecnica mini-Q
Muestra de sangre total
bull La matriz bioloacutegica maacutes complicada
Adicioacuten de aacutecido tipo y cantidad
bull Efecto en la particioacuten y extraccioacuten
Adicioacuten de las sales de QuEChERS no-tamponadas o
tamponadas con NaAcetato o Citrato
bull Efecto en el extracto inspeccioacuten visual
SPE Dispersiva
bull Limpieza de la matriz y recuperaciones de los compuestos
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 34
Conclusiones del estudio
El ACN con 4 de FA como solvente de extraccioacuten muestra
una lisis maacutes completa de la muestra frente a otros solventes
de extraccioacuten que mostraron una masa soacutelida
Las sales tamponadas AOAC de acetato Soacutedico generan el
extracto maacutes liacutempio y fueron elegidas para la d-SPE
El paso de dSPE no ofrece un clean up adicional para los
meacutetodos de extraccioacuten con sales EN y no tamponadas
principalmente
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 35
Datos de Adquisicoacuten LCMSMS
Compuestos Canales MRM
(mz) Fragmentador
(V) CE (V) RT (min) Delta RT
Lidocaina 1) 23518 gt 861
2) 23518 gt 581
97 11
35
137 04
Tramadol 1) 2642 gt 581
2) 2642 gt 2461
97 15
3
120 04
Amitriptilina 1) 2782 gt 117
2) 2782 gt 105
112 19
19
425 04
Biperidena 1)31223 gt 981
2) 31223 gt 551
123 19
60
423 07
Oxazepam 1) 28706 gt 2409
2) 28706 gt 2689
112 19
7
399 04
Lorazepam 1) 32102 gt 2749
2) 32102 gt 3029
113 15
7
409 04
Clorpromazina 1) 31911 gt 861
2) 31911 gt 581
112 15
43
463 04
Diltiazem 1) 41517 gt 1779
2) 41517 gt 1499
128 19
43
373 04
Naloxona 1) 32816 gt 310
2) 32816 gt 212
123 15
39
082 04
Nortriptilina (IS) 1) 26418 gt 233
2) 26418 gt 91
97 7
19
417 04
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04
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045
0475
05
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055
0575
06
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065
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07
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075
0775
08
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085
0875
09
0925
095
0975
1
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105
1075
11
1125
115
1175
12
1225
125
1275
13
1325
135
1375
+ESI TIC Scan Frag=800V AOAC_BLANK_110228bd
1 1
Counts vs Acquisition Time (min)
05 1 15 2 25
3 35 4 45 5 55 6 65 7 75 8 85 9 95 10
Columna Poroshell 120 EC-C18 27
micro 21 x 100 mm PN 695775-902
Fase Moacutevil
A 5 mM Acetato Amoacutenico pH 5
2080 MeOHagua
B 5 mM Acetato amoacutencio en ACN
Flujo 04mLmin
Inyeccioacuten 10uL
GT (ordmC) 300
GF (lmin) 7
Nebulizador (psi) 40
SGT (ordmC) 400
SFG (lmin) 12
Capilar (V) 3500
NV (V) 500
Condiciones LCMS
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48
49
5
51
+ESI MRM Frag=1120V CID190 (2782000 -gt 1170000) HQC_6d
1 1
Counts vs Acquisition Time (min) 01 02 03 04 05 06 07 08 09 1 11 12 13 14 15 16 17 18 19 2 21 22 23 24 25 26 27 28 29 3 31 32 33 34 35 36 37 38 39 4 41 42 43 44 45 46
Nalo
xo
ne
Lid
oc
ain
e
Tra
mad
ol
Oxazep
am
Lo
razep
am
Bip
eri
de
n
Am
itri
pty
lin
e
Dil
tiazem
Ch
lorp
rom
azin
e
No
rtri
pty
lin
e (
IS)
Cromatograma LCMSMS de 10 ngmL de sangre total fortificada despueacutes
de extraccioacuten mini-QuEChERS AOAC (NaAc) y d-SPE (50mg PSA y
150mg MgSO4)
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 38
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51
+ESI MRM Frag=1120V CID190 (2782000 -gt 1170000) HQC_6d
1 1
Counts vs Acquisition Time (min) 01 02 03 04 05 06 07 08 09 1 11 12 13 14 15 16 17 18 19 2 21 22 23 24 25 26 27 28 29 3 31 32 33 34 35 36 37 38 39 4 41 42 43 44 45 46
1 x10
415 42 425 43 435 44 445 45 455 46 465 47 475 48 485 49 495 5
505 51 515 52 525 53 535 54 545 55 555 56 565 57
+ESI MRM Frag=1120V CID190 (2871000 -gt 2409000) RE_L_1d 1
Counts vs Acquisition Time (min) 305 31 315 32 325 33 335 34 345 35 355 36 365 37 375 38 385 39 395 4 405 41 415 42 425 43 435 44 445 45 455 46 465 47 475
Relacioacuten sentildealruido para el Oxazepam y Lorazepam a
10 ngmL (10 ppb)
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 39
La Naloxone muestra esta curva de linealidad de10-250 ngmL (ppb) con una R2
= 0991
Las curvas de calibracioacuten se generaron con la respuestra relativa (area pico
analitoarea pico IS) frente a la concentracioacuten relativa (concentracion de
analitoconcentracioacuten de IS)
Ejemplo de curva de linealidad para Naloxona extraido
con mini-QuEChERS
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 40
Recuperacioacuten y Reproducibilidad
Compuesto 50 ngmL Spiked
Recuperacioacuten RSD
100 ngmL Spiked
Recuperacioacuten RSD
Lidocaine 987 157 100 118
Tramadol 105 30 104 82
Amitriptyline 104 21 104 82
Biperidene 97 45 99 82
Oxazepam 770 92 78 86
Lorazepam 819 68 818 86
Chlorpromazine 110 103 105 63
Diltiazem 881 27 917 83
Naloxone 806 90 755 77
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 41
Conclusioacutenes y trabajo posterior
El meacutetodo mini-QuEChERS para la extraccioacuten de compuestos farmaceacuteuticos en
sangre total ofrece una alternativa a otras teacutecnicas de preparacioacuten de muestras
La preparacioacuten de muestras mini-QuEChERS es un enfoque simple facil y
barato que requiere una miacutenima experiencia en preparacioacuten de muestras y
miacutenimo equipamiento
Es un punto de partida para ampliar el numero y las clasificaciones evaluadas
en otras matrices bioloacutegicas y en sangre postmortem
El trabajo futuro incluira combinaciones adecuadas tanto de las sales de
extraccioacuten como de los sorbentes de d-SPE por el meacutetodo mini-QuEChERS
La columna Poroshell 120 ofrece una selectividad diferente y excelentes formas
de pico a lo largo del amplio rango de compuestos farmaceacuteuticos usados en este
estudio
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 42
Referencias
(1) M Anastassiades SJ Lehotay D Štajnbaher and FJ Schenk J AOAC Int 86 4121 (2003)
(2) G Stubbings and T Bigwood Anal Chim Acta 637 68 (2009)
(3) RR Rasmussen IMLD Storm PZH Rasmussen J Smedsgaard and KF Nielsen Anal Bioanal Chem 397 765 (2010)
(4) D Smith and K Lynam GCμECD analysis and confirmation of PCBs in fish tissue with Agilent JampW DB-35ms and DB-XLB GC columns Agilent Technologies 5990-6236EN (2010)
(5) F Ploumlssl M Giera and F Bracher J Chrom A 1135 19 (2006)
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 43
MEJORAR LA PRODUCTIVIDAD EN
HPLC ESTAacuteNDAR CON COLUMNAS
POROSHELL
Page 43
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 44
Columnas Poroshell 120 para HPLC y UHPLC
bull 80-90 de eficacia de las sub 2um
bull A presiones un ~40-50 maacutes bajas
bull Con un tamantildeo de partiacutecula de 27um
bull Con una frita de entrada de 2um
bull Con el doble de resolucioacuten de una
columna de 35um
bull Con un liacutemite de presioacuten de 600 bar
bull La partiacutecula tiene un nuacutecleo soacutelido
(17um) y una cubierta exterior porosa
de 05um como zona de difusioacuten
Las Columnas Poroshell 120 tienen
Page 44
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 45
Poroshell 120 proporciona Eficacia Suficiente
Page 45
Flujo 0582 mLmin AcetonitriloAgua (6040)
Volumen de Inyeccioacuten 4 microL
TCC 26 oC
DAD Sig=2544nm Ref=360100nm
Muestra Muestra de test RRLC
(PN 5188-6529) inoculada con
50 microL 2 mgmL Tiourea en
aguaacetonitrilo (6535)
25 5 75 10
mAU
0
200
400
600
06
46
0
82
6
11
48
15
18
20
16
2
22
3
28
16
41
32
62
73
97
53
larr N = 25053 Presioacuten = 182 bar
Poroshell 120 EC-C18 30 x 100 mm 27 um
min 25 5 75 10 125
mAU
0
200
400
600
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0
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27
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34
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52
81
82
18
13
04
1
larr N = 27295 Presioacuten = 386 bar
Eclipse Plus C18 30 x 100 mm 18 um
gt90 de la Eficacia de una 18um
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 46
iquestEn queacute tipos de instrumentos puede usar
Columnas Poroshell 120 HPLCrsquos y UHPLCrsquos
Consideraciones en UHPLC
bull Las columnas Poroshell 120 tienen un liacutemite de presioacuten de 600 bar
bull Los UHPLC estaacuten ajustados para columnas de bajo volumen por lo tanto las
Poroshell pueden usarse en todos los UHPLC
Consideraciones en HPLC
bull Las Columnas Poroshell 120 trabajan bien por debajo de 400 bar
bull Minimize los volumenes extra columna para las columnas 21 y 30mm ID ndash
siga las instrucciones dadas para las columnas RRHT (18um 600 bar)
bull Use en el detector velocidades adecuadas de adquisicioacuten para picos
estrechos de alta eficacia
Page 46
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 47
Con una frita de 2 um Poroshell 120 no se bloquea
Muestras Complejas- Plasma
Diflusinal in Plasma
0
20
40
60
80
100
120
140
160
180
200
220
240
260
280
300
320
340
360
380
400
1 501 1001 1501 2001 2501
Injections
Pre
ssu
re
0
20000
40000
60000
80000
100000
120000
140000
160000
180000
200000
Eff
icie
ncy (
N)
End Press
Plates
Columna Poroshell 120 EC-C18 30 x 50mm 27um LC Agilent 1200 RRLC (SL)
Muestra Plasma Precipitado 2 partes Plasma 7 Partes 2080 Agua-MeCN w01 Aacutecido Foacutermico con 1 Parte de Diflusinal en
5050 Agua-MeCN 10 ugml (Concentracion Final Diflusinal 1 ugml) Agitado y dejado reposar 10 minutos
No Centrifugado No Filtrado
Volumen de Inyeccioacuten 1ul
Solvente A Agua w01 TFA
Solvente B MeCN w008 TFA
Flujo 1 mlmin 1 ul inyeccioacuten
Tiempo B
0 20
05 90
06 90
11 20
25 20
Page 47
Diflusinal es un anti-inflamatorio no esteroidal anaacutelogo
a la aspirina desarrollado por Merck Sharp amp Dohme
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 48
Las Columnas Superficialmente Porosas Pueden
Usarse cumpliendo los Requirimientos USP
De la lista USP de empaquetamientos de columnas LC 42009
Page 48
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 49
Criterios de Ajuste de Meacutetodos USP y FDA Criterios de Ajuste de Meacutetodos de Dimensiones de Columna
Paraacutemetro Especificaciones Maacuteximas ComentariosEjemplos
Longitud de Columna 70 250mm 75mm
150mm 50mm
Diaacutemetro Interno de
Columna
25 (FDA ORA-LAB 545)
USP ndash 25 ID Columna puede ajustarse si la
velocidad lineal es constante
46 mm 30 mm (-35)
46 mm 21 mm (-54)
30 mm 21 mm (-30)
Flow Rate 50
Volumen de Inyeccioacuten
Reducir tanto como se necesitendash
debe cumplir los liacutemites de
deteccioacuten y precisioacuten
Si cambia a una columna maacutes
corta haga el cambio apropiado
en el volumen de inyeccioacuten
Tamantildeo de Partiacutecula Reducir hasta el 50
(no se puede aumentar)
Puede cambiar la longitud de columna y el
tamantildeo de partiacutecula para mantener la misma
Rs
5um 35um (-30)
5um 27um (-46) Cambiado en 22409 ndash Para la copia oficial y actual ir a
httpwwwfdagovScienceResearchFieldSciencedefaulthtm
USP 30 Second Supplement Revisions PF34(5) en proceso
Ver ldquo Stimuli articlerdquo en Pharmacopeial Forum 2009 35(6)
Page 49
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 50
Comparacioacuten de 46 x 250 mm 5 um con Poroshell
120 EC-C18 46 x 100 mm 27um
min 5 10 15 20 25 30
mAU
0
20
40
60
80
100
97
12
111
16
115
96
126
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152
48
161
51
164
35
206
87
230
76
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90
min 5 10 15 20 25 30
mAU
0
50
100
150
200
250
17
19
21
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11
26
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38
67
44
37 45
58
54
50
59
20
70
37
Anaacutelisis maacutes raacutepido(columna maacutes corta flujo maacutes alto)
Mayor sensibilidad(partiacutecula maacutes pequentildeapico maacutes estrecho)
Maacutes optimizado (un anaacutelisis maacutes raacutepido permite ajustar mejor)
Ambos anaacutelisis en Agilent 1100 G1315B DAD (bajo 400 bar)
No se requiere cambio en la preparacioacuten de muestra frita de entrada
de 2 micras en ambas columnas
325 bar
110 bar
Sulfadiazina
Sulfatiazol
Sulfapiridina
Sulfamerazina
Sulfametazina
Sulfametazol
Sulfametoxipiridazina
Sulfacloropiridazina
Sulfametoxazol
Sulfadimetoxina
Tiempo B
0 8
33 33
34 33
Columna Eclipse Plus C18
46 x 250mm 5um
Flujo 1 mLmin
Fase Moacutevil
A 01 Aacutecido Foacutermico en Agua
B 01 Aacutecido Foacutermico en ACN
Tiempo B
0 8
12 33
132 33
Columna 46 x 100mm
Poroshell 120 EC-C18
27um
Flujo 185 mLmin
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Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 51
Comparacioacuten de 46 x 250 mm 5 um con Poroshell
120 EC-C18 46 x 100 mm 27um
min 5 10 15 20 25 30
mAU
0
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206
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230
76
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90
110 bar
5
mAU
0
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100
150
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250
17
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21
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38
67
44
37 45
58
54
50
59
20
70
37
325 bar
min
Ver condiciones en diapositiva anterior
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Mejor Resolucioacuten
linea base
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 52
Anaacutelisis maacutes raacutepido del meacutetodo USP para pastillas de
Simvastatina en Columnas Poroshell 120ndash Ajuste del meacutetodo
46 x 250 mm 5-um
Agilent ZORBAX Eclipse Plus C18
46 x 75 mm 27-um
Agilent Poroshell 120 EC-C18
65 CH3CN 35 39 gL NaH2PO4 (pH 45) 45 oC Sig = 238 8 Ref = 360 100 nm
Flujos 15 mLmin para la columna de 5-um 28 mLmin para la columna Poroshell 120 27um
Requerimiento
USP
5-um
(15 mLmin)
27-um
(28 mLmin)
TR na 9907 1457
krsquo gt 30 5962 5122
N gt 4500 16939 14439
Tf lt 20 109 110
min 2 4 6 8 10
mAU
0
5
10
15
20
25
30
35
40
min 2
mAU
0
5
10
15
20
25
30
35
40
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 53
Ajustes de los parametros cromatograficos en la
transferencia de meacutetodos Escalado del volume de inyeccioacuten
v1 x [(r22 x L2)(r1
2 x L1)] = V2
O bien
v2 = V1 x [(d22 x L2)(d1
2 x L1)]
v volume de inyeccioacuten
r radio de la columna
L longitud de la columna
Ajuste del flujo
F2= F1 x (L2L1 ) x (r2r1 )2
L longitud de la columna
F Flujo
r radio de la columna
Ajuste de la longitud del gradiente
En funcioacuten de la longitud de la columna
L2L1= tg2tg1
En funcioacuten del volumen muerto de columna y del flujo
tG2= tG1 x (V2V1) x (F1F2) t tiempos de gradiente
V volumen muerto de columna
F flujo
Columna ID Volumen muerto aprox
por mm longitud
46mm 100uL
30mm 425uL
21mm 208uL
10mm 047uL
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 54
Notas de Aplicacioacuten en Poroshell 120 y QuEChERS
Determination of Hormones in Shrimp by Agilent 1290 Infinity LC with
Agilent Poroshell 120 LC Column and Agilent QuEChERS for Sample
Preparation (publication 5990-6589EN)
Analysis of Pesticide Residues in Green Tea Using Agilent SampliQ
QuEChERS EN Kit by LCMSMS Detection (publication 5990-
6400EN)
Analysis of Pesticide Residues in Rice Using Agilent Bond Elut
QuEChERS AOAC Kit (publication 5990-8034EN)
Poroshell 120 for pharmaceutical analysis
Poroshell 120 Resources
QuEChERS Applications
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 55
Sumario
bull La columna Poroshell 120 es una nueva alternativa para LC de Alta
Resolucioacuten y Alta Velocidad que puede usarse en cualquier HPLC o UHPLC
bull Con la Poroshell 120 se pueden lograr separaciones de alta eficacia a baja
presioacuten
bull Puede usarse con muestras sucias sin ver una elevacioacuten anormal de la
presioacuten
bull Puede usarse en un meacutetodo USP sin comprometer los Criterios de Ajustes de
Meacutetodo
Page 55
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 56
Soporte Teacutecnico Agilent
Teleacutefono de Atencioacuten al Cliente
901 11 68 90
email customercare_spainagilentcom
wwwagilentcomchem
![Page 7: Análisis de compuestos farmacéuticos en sangre total · PDF fileReducción en el procesamiento, el envío de la muestra, y los ... Gas flow: 10 L/min Nebulizer: 10 psi Sheath gas](https://reader031.vdocuments.site/reader031/viewer/2022030405/5a7a81727f8b9a0a668b45aa/html5/thumbnails/7.jpg)
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 7
Propiedades de las Estatinas
Compuesto Estructura Log P pKa
Atorvastatina
636 636
Simvastatina
468 NA
Pravastatina
218 470
Lovastatina
426 NA
Naproxeno (IS)
318 415
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 8
Procedimiento DMS
Fortificacioacuten de sangre humana entera fresca con cada una de las cuatro estatinas para crear una curva de calibracioacuten
Adicioacuten de la sangre fortificada en las tarjetas Agilent Bond Elut DMS (Part A400150)
Se prepararon 3 replicados de concentraciones de sangre a 20 ngmL y 500 ngmL
Secado de las tarjetas
Perforacioacuten de discos de 3 mm y se depositan en viales de 2 mL
Disolucioacuten de cada gota en el solvente de desorcioacuten y vortex
Evaporacioacuten hasta sequedad
Reconstitucioacuten en 100 μL de fase moacutevil (70 5 mM formiato amoacutenico 30 CH3CN) y agitacioacuten
Las muestras se analizaron por LCndashMSndashMS
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Parametros de las transiciones MS-MS para las
estatinas estudiadas
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 10
Cromatograma LCndashMSndashMS de sangre fortificada
con 50 ngmL de estatinas despueacutes del DMS
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 11
Columna Poroshell 120 en la separacioacuten por HPLC
La columna Poroshell 120 ofrece velocidad y alta resolucioacuten
comparable a las columnas sub-2 μm de UHPLC
La tecnologia de partiacuteculas superficialmente genera
separaciones de alta eficacia a menores presiones
Se generaron presiones inferiores a 400 bares
La Poroshell 120 EC-C8 proporciona excelentes formas de
pico para todos los analitos
La atorvastatina puede ser facilmente detectada a 1 ngmL
con una SNR de 797
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 12
Cromatograma LCndashMSndashMS de atorvastatina en
sangre fortificada 1 ngmL
Condiciones LCndashMS
Columna Poroshell 120 EC-C8 27 μm 150 times 21 mm
(Part 693775-906)
Fase Movil
A 5 mM Formiato Amoacutenico B CH3CN
Flujo 200 μLmin
Gradiente
t0 A 70 B 30
t50 A 25 B 75
t55 A 25 B 75
t56 A 70 B 30
t80 A 70 B 30
Temperatura 30 degC
Presioacuten 394 bar
Tiempo anaacutelisis 8 min
Instrumento Agilent 1290 LC
6460 QQQ
Gas temp 275 degC
Gas flow 10 Lmin
Nebulizer 10 psi
Sheath gas temp 250 degC
Sheath gas flow 7 Lmin
Polarity Negative
1 ngmL con una SNR de 797
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Curvas de calibracioacuten representativas de estatinas
en sangre fortificada
Linearidad en las curvas de calibracioacuten para seis niveles de
pravastatina y atorvastatina
Las curvas de Lovastatina y simvastatina no fueron lineales a
las maacutes altas concentraciones y rindieron regresioacuten cuadraacutetica
con coeficientes de correlacioacuten mejores de 0999
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 14
Recuperaciones de estatinas con tarjetas Bond
Elut DMS y tarjetas de celulosa (n = 3)
Los resultados indican que cuando se usan tarjetas de celulosa hay incremento
ionico dando lugar a altas recuperaciones artificiales
Estos datos corroboran que las tarjetas no celulosicas exhiben datos de desorcioacuten
de mejor calidad comparados con las tarjetas tradicionales de celulosa
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 15
Conclusiones
Meacutetodo simple y raacutepido para el anaacutelisis de un grupo de compuestos aciacutedicos en muestras de sangre humana con DMS y LCndashMSndashMS
El meacutetodo ha demostrado se exacto preciso y robusto
Buena linealidad para la pravastatina y atorvastatina usando una regresioacuten lineal con coeficientes de correlacioacuten mejores de 0998
Estas tarjetas ofrecen mejores propiedades de desorcioacuten comparadas con las tarjetas competitivas basadas en celulosa
La columna Poroshell 120 EC-C8 es una excelente eleccioacuten para las aplicaciones bioanaacuteliticas
La tecnologia de Gota de Sangre Seca (Dried blood spots) es una teacutecnica de recoleccioacuten de muestra para el anaacutelisis de faacutermacos en estudios cliacutenicos y precliacutenicos
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 16
Referencias
N Spooner R Lad M Barfield Anal Chem 2009 811557ndash
1563
M Barfield N Spooner R Lad S Parry S Fowles
J Chromatogr B 2008 870 32ndash37
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bullTecnologiacutea Innovadora no-celulosa
bullProporciona un nuevo nivel de confianza en la recoleccioacuten de muestras
bullMejora significativa en la sensibilidad analiacutetica reproducibilidad y faacutecil uso
Anaacutelisis Dried Blood Spotting (DBS)
Desarrollado en colaboracioacuten con Compantildeiacuteas farmaceacuteuticas y CROs este
dispositivo elimina problemas actuales asociados a los sistemas de DBS que
hay en el mercado
bullMuestreo de Sangre plasma o suero (liacutequido sinoviallaacutegrimas bilis LCR) para
anaacutelisis bioanaliacuteticos en pruebas farmaceacuteuticas cliacutenicas y precliacutenicas en
empresasa farmaceacuteuticas de bioanaacutelisis (DMPK ADME y MetID) (no para
Diagnoacutestico cliacutenico)
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 18
La tarjeta sin celulosa es superior de forma medible a las tarjetas de papel de celulosa
Mejora la Sentildeal del MS
bullFormato libre de celulosa ha reducido el enlazado no especiacutefico y no contiene reactivos
quiacutemicos impregnados
Ventajas del Producto
Flujo de trabajo maacutes faacutecil
bull La extraccioacuten de la muestra de la tarjeta
requiere 5 veces menos fuerza que el
producto de celulosa
Proporciona excelente homogeneidad
de la mancha
bull Extracciones reproducibles
recuperaciones maacutes altas
independientemente del nivel de
hematocrito
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 19
bull El nivel de Hematocrito es el porcentaje del volumen de sangre ocupado por las ceacutelulas
rojas de la sangre
bull El material de muestreo Bond Elut DMS tiene una estructura de fibras
maacutes ordenadas comparado con la celulosa estaacutendard
Esta es la razoacuten de porqueacute Bond Elut DMS muestra mejor
reproducibilidad
Mejor Reproducibilidad
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Bond Elut DBS Muestra Mejor Reproducibilidad
Bond Elut DMS tiene una desviacioacuten total de un 5 en todos los niveles HCT mientras que la
tarjeta de celulosa tiene una desviacioacuten de un 52 en todo el rango 10 veces de diferencia
Los datos abajo muestran la desviacioacuten de las medidas del CV desde niveles de HTC
normales (45) para tarjetas Bond Elut DMS y de celulosa (Whatman DMPK-C)
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 21
Ventajas Clave de la Teacutecnica DBS de Agilent
bull Una vez seca la muestra de sangre no supone peligro bioloacutegico alguno y se
puede transportar sin necesidad de sistemas de refrigeracioacuten costosos
bull Permite a los laboratorios centralizar los anaacutelisis de muestra perifeacutericas
bull Se requiere menos volumen de muestra (menor nordm de sujetos en el ensayo
menor nordm de repeticiones y eliminacioacuten de sujetos sateacutelite)
bull Permite la toma demuestra en serie del mismo sujeto
bull La recoleccioacuten de sangre es maacutes sencilla
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Notas de Aplicacioacuten farmaceacuteuticas en Poroshell
120 and DMS Fast Analysis of Cefepime and Related Impurities on Poroshell 120 EC-C18 (publication 5990-7492EN) Comparing Selectivity Easy Transfer of Methods between Superficially Porous Agilent Poroshell 120 EC-C18 and totally Porous Agilent ZORBAX Eclipse Plus C18 (publication 5990-6588EN)
Analysis of Water Soluble Vitamins in Multivitamin Tablets Using Poroshell 120 EC-C18 (publication 5990-8107EN)
Analysis of Anthocyanins in Common Foods Using an Agilent Poroshell 120 SB-C18 (publication 5990-8249EN)
Analysis of Amitriptyline Fluoxetine Quetiapine and Sertraline Using Dried Plasma (publication 5990-8169EN)
Analysis of Amitriptyline Fluoxetine Quetiapine and Sertraline Using Dried Blood Spots (publication 5990-8168EN)
Investigation of Varying Blood Hematocrit Level in Dried Blood Spotting (publication 5990-8306EN)
Analysis of Cholesterol Lowering Drugs (Statins) Using Dried Matrix Spots Technology (publication 5990-8305EN)
Scalability of Agilent Columns Across HPLC and UHPLC Instruments (publication 5990-8428EN)
Converting a CHP Method for Insulin to Agilent Poroshell 120 Columns (publication 5990-9029EN)
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 23
La propuesta QuEChERS para Determinar compuestos
Farmaceacuteuticos y Toxinas en Sangre Total
Anaacutelisis de Compuestos Farmaceacuteuticos en Sangre Total con
la columna Poroshell 120 Usando el meacutetodo Modificado
Mini-QuEChERS para la preparacioacuten de muestra
Nota de Aplicacioacuten5990-8789EN
httpwwwchemagilentcomLibraryapplications5990-8789ENpdf
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 24
Introduccioacuten
Determinacioacuten de compuestos farmaceacuteuticos en anaacutelisis cliacutenicos y
foreacutensicos ADME (DMPK)
La preparacioacuten de muestra va desde la simple precipitacioacuten de
proteinas (PPT) a la maacutes compleja extraccioacuten en fase soacutelida (SPE)
Habitualmente la SPE ha ocupado este vaciacuteo pero simpre hay
espacio para teacutecnicas de preparacioacuten de muestras que son raacutepidas y
baratas de implementar
Se describe un procedimiento mini-QuEChERS modificado con
analisis LCndashMS-MS para la determinacioacuten de faacutermacos en sangre
total
Se analizan nueve diferentes faacutermacos (lidocaina tramadol
amitriptilina biperidina oxazepam lorazepam clorpromazina
diltiazem y naloxona)
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 25
Compuestos farmaceacuteuticos usados en el estudio
Compuesto Nuacutemero CAS Log P (ow) pKa Uso
terapeacuteutico
Lidocaina 137-58-6 24 801 Anesteacutesico local
antiarrithmico
Tramadol 27203-92-5 25 941 Analgesico
Amitriptilina 50-48-6 492 94 Antidepresivo
Biperidena 514-65-8 40 108 Anticolinergico
Oxazepam 604-75-1 223 17 113 Antianxiedad
Lorazepam 846-49-1 247 13 115 Antidepresivo
Clorpromazina 50-53-3 518 93 Antipsycoacutetico
Diltiazem 42399-41-7 363 77 Bloqueante de los
canales del calcio
Naloxona 465-65-6 145 79 Antagonista de los
receptores de opio
Nortriptilina (IS) 72-69-5 565 97
5 ugmL de solucioacuten (9 compuestos) y estandar interno en metanol
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 26
La Teacutecnica de QuEChERS aplicada a las muestras
de sangre
La sangre es el maacutes complejo de los fluidos bioloacutegicos
La determinacioacuten de faacutermacos en sangre total es a menudo necesaria en los
anaacutelisis foreacutensicos dada la dificultad de obtener suero o plasma
Los procedimientos convencionales para analizar faacutermacos en matrices
complejas como la sangre total son complicados
QuEChERS es una teacutecnica de preparacioacuten de muestra que fue desarrollada
para la extraccioacuten de residuos de plaguicidas multi-clase de frutas y vegetales
en 2003
A pesar de que los fluidos bioloacutegicos pueden parecer muy diferentes a una
pieza de fruta sin embargo siguen caminos paralelos
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 27
Caminos paralelos en la preparacioacuten de muestra
Fluidos Bioloacutegicos
Matrices complejas
Rotura de la arquitectura celular
bull Lisis agitacioacuten solvente orgaacutenico
hidroacutelisis
Analitos con un amplio rango de
polaridades
Retirar analito o matriz
Anaacutelisis por LCMSMS GCMS o
GCMSMS
Frutas y Vegetales
Matrices complejas
Rotura de la arquitectura celular
bull Trituracioacuten agitacioacuten solvente
orgaacutenico hidroacutelisis
Analitos con un amplio rango de
polaridades
Retirar analito o matriz
Anaacutelisis por LCMSMS GCMS o
GCMSMS
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Procedimiento baacutesico por SPE para muestras de sangre
El pretratamiento de la sangre total implica la dilucioacuten con una
solucioacuten aacutecida un tampoacuten fosfato o aguaFA
Sonicar 15 minutos rotura de membranas celulares
Centrifugacioacuten
bull Procedimiento de SPE
ndash Acondicionado del cartucho metanol agua
ndash Carga del cartucho muestra
ndash Lavado del cartucho agua con metanol o tampoacuten metanol
ndash Elucioacuten del cartucho eluyente para el anaacutelisis
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 29
Procedimiento Baacutesico QuEChERS
15 g muestra homogeneizada (fortificada)
Antildeadir 15 mL ACN (1 AA) vortex
Antildeadir Sales de Extraccioacuten AOAC agitar
Centrifugar
Transferir 1 u 8 mL a un tubo d-SPE AOAC vortex centrifugar
Transferir al vial de Anaacutelisis
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 30
Ventajas y desventajas del Procedimiento QuEChERS
Ventajas
Extraccioacuten tipo liacutequidoliacutequido
Uso de aacutecido para interrumpir el ligado de proteinas
Exceso de sal para lisar los componentes celulares
Uso de acetonitrilo para facilitar la precipitacioacuten proteacuteica
Uso de SPE dispersiva para adsorber las interferencias de la matriz
Plossl etat J Chrom A 1135 (2006) 19-26
Desventajas
La cantidad de solvente y de muestra requeridos en el meacutetodo no
son ldquobioloacutegicamente adecuadosrdquo
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 31
Propoacutesito de la propuesta mini-Q
Ofrecer un enfoque maacutes adecuado biologicamente
Requirimientos de menores volumenes y tamantildeos de
muestra
Rango de faacutermacos varias polaridades y pKa
Evaluaciacuteoacuten de las interferencias de fondo
Extraccioacuten y datos de recuperacioacuten en un rango
aceptable
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Faacutermacos en sangre Procedimiento mini-QuEChERS
mini-Q
Procedimiento
1 Antildeadir 2 homogeneizadores ceraacutemicos
2 Antildeadir 1 o 2 mL de sangre entera a un tubo de centriacutefuga con tapoacuten de rosca
3 Antildeadir estandar interno vortex
4 Antildeadir 2 mL de ACN acidificado ( 04 FA) vortex 30 seg
5 Antildeadir 500 mg de sales de extraccioacuten agitar vigorsamente 1 minuto centrifugar 5000 rpm 1 min
6 Transferir 1 mL del extraccto al material de d-SPE en tubo de centrifuga vortex centrifugar
7 Antildeadir 200 uL a 800 uL de agua en un vial LC vortex y analizar
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 33
Refinamiento del Procedimiento mini-Q
Paraacutemetros evaluados en la teacutecnica mini-Q
Muestra de sangre total
bull La matriz bioloacutegica maacutes complicada
Adicioacuten de aacutecido tipo y cantidad
bull Efecto en la particioacuten y extraccioacuten
Adicioacuten de las sales de QuEChERS no-tamponadas o
tamponadas con NaAcetato o Citrato
bull Efecto en el extracto inspeccioacuten visual
SPE Dispersiva
bull Limpieza de la matriz y recuperaciones de los compuestos
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 34
Conclusiones del estudio
El ACN con 4 de FA como solvente de extraccioacuten muestra
una lisis maacutes completa de la muestra frente a otros solventes
de extraccioacuten que mostraron una masa soacutelida
Las sales tamponadas AOAC de acetato Soacutedico generan el
extracto maacutes liacutempio y fueron elegidas para la d-SPE
El paso de dSPE no ofrece un clean up adicional para los
meacutetodos de extraccioacuten con sales EN y no tamponadas
principalmente
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 35
Datos de Adquisicoacuten LCMSMS
Compuestos Canales MRM
(mz) Fragmentador
(V) CE (V) RT (min) Delta RT
Lidocaina 1) 23518 gt 861
2) 23518 gt 581
97 11
35
137 04
Tramadol 1) 2642 gt 581
2) 2642 gt 2461
97 15
3
120 04
Amitriptilina 1) 2782 gt 117
2) 2782 gt 105
112 19
19
425 04
Biperidena 1)31223 gt 981
2) 31223 gt 551
123 19
60
423 07
Oxazepam 1) 28706 gt 2409
2) 28706 gt 2689
112 19
7
399 04
Lorazepam 1) 32102 gt 2749
2) 32102 gt 3029
113 15
7
409 04
Clorpromazina 1) 31911 gt 861
2) 31911 gt 581
112 15
43
463 04
Diltiazem 1) 41517 gt 1779
2) 41517 gt 1499
128 19
43
373 04
Naloxona 1) 32816 gt 310
2) 32816 gt 212
123 15
39
082 04
Nortriptilina (IS) 1) 26418 gt 233
2) 26418 gt 91
97 7
19
417 04
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035
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04
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045
0475
05
0525
055
0575
06
0625
065
0675
07
0725
075
0775
08
0825
085
0875
09
0925
095
0975
1
1025
105
1075
11
1125
115
1175
12
1225
125
1275
13
1325
135
1375
+ESI TIC Scan Frag=800V AOAC_BLANK_110228bd
1 1
Counts vs Acquisition Time (min)
05 1 15 2 25
3 35 4 45 5 55 6 65 7 75 8 85 9 95 10
Columna Poroshell 120 EC-C18 27
micro 21 x 100 mm PN 695775-902
Fase Moacutevil
A 5 mM Acetato Amoacutenico pH 5
2080 MeOHagua
B 5 mM Acetato amoacutencio en ACN
Flujo 04mLmin
Inyeccioacuten 10uL
GT (ordmC) 300
GF (lmin) 7
Nebulizador (psi) 40
SGT (ordmC) 400
SFG (lmin) 12
Capilar (V) 3500
NV (V) 500
Condiciones LCMS
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37
38
39
4
41
42
43
44
45
46
47
48
49
5
51
+ESI MRM Frag=1120V CID190 (2782000 -gt 1170000) HQC_6d
1 1
Counts vs Acquisition Time (min) 01 02 03 04 05 06 07 08 09 1 11 12 13 14 15 16 17 18 19 2 21 22 23 24 25 26 27 28 29 3 31 32 33 34 35 36 37 38 39 4 41 42 43 44 45 46
Nalo
xo
ne
Lid
oc
ain
e
Tra
mad
ol
Oxazep
am
Lo
razep
am
Bip
eri
de
n
Am
itri
pty
lin
e
Dil
tiazem
Ch
lorp
rom
azin
e
No
rtri
pty
lin
e (
IS)
Cromatograma LCMSMS de 10 ngmL de sangre total fortificada despueacutes
de extraccioacuten mini-QuEChERS AOAC (NaAc) y d-SPE (50mg PSA y
150mg MgSO4)
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39
4
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48
49
5
51
+ESI MRM Frag=1120V CID190 (2782000 -gt 1170000) HQC_6d
1 1
Counts vs Acquisition Time (min) 01 02 03 04 05 06 07 08 09 1 11 12 13 14 15 16 17 18 19 2 21 22 23 24 25 26 27 28 29 3 31 32 33 34 35 36 37 38 39 4 41 42 43 44 45 46
1 x10
415 42 425 43 435 44 445 45 455 46 465 47 475 48 485 49 495 5
505 51 515 52 525 53 535 54 545 55 555 56 565 57
+ESI MRM Frag=1120V CID190 (2871000 -gt 2409000) RE_L_1d 1
Counts vs Acquisition Time (min) 305 31 315 32 325 33 335 34 345 35 355 36 365 37 375 38 385 39 395 4 405 41 415 42 425 43 435 44 445 45 455 46 465 47 475
Relacioacuten sentildealruido para el Oxazepam y Lorazepam a
10 ngmL (10 ppb)
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 39
La Naloxone muestra esta curva de linealidad de10-250 ngmL (ppb) con una R2
= 0991
Las curvas de calibracioacuten se generaron con la respuestra relativa (area pico
analitoarea pico IS) frente a la concentracioacuten relativa (concentracion de
analitoconcentracioacuten de IS)
Ejemplo de curva de linealidad para Naloxona extraido
con mini-QuEChERS
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 40
Recuperacioacuten y Reproducibilidad
Compuesto 50 ngmL Spiked
Recuperacioacuten RSD
100 ngmL Spiked
Recuperacioacuten RSD
Lidocaine 987 157 100 118
Tramadol 105 30 104 82
Amitriptyline 104 21 104 82
Biperidene 97 45 99 82
Oxazepam 770 92 78 86
Lorazepam 819 68 818 86
Chlorpromazine 110 103 105 63
Diltiazem 881 27 917 83
Naloxone 806 90 755 77
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 41
Conclusioacutenes y trabajo posterior
El meacutetodo mini-QuEChERS para la extraccioacuten de compuestos farmaceacuteuticos en
sangre total ofrece una alternativa a otras teacutecnicas de preparacioacuten de muestras
La preparacioacuten de muestras mini-QuEChERS es un enfoque simple facil y
barato que requiere una miacutenima experiencia en preparacioacuten de muestras y
miacutenimo equipamiento
Es un punto de partida para ampliar el numero y las clasificaciones evaluadas
en otras matrices bioloacutegicas y en sangre postmortem
El trabajo futuro incluira combinaciones adecuadas tanto de las sales de
extraccioacuten como de los sorbentes de d-SPE por el meacutetodo mini-QuEChERS
La columna Poroshell 120 ofrece una selectividad diferente y excelentes formas
de pico a lo largo del amplio rango de compuestos farmaceacuteuticos usados en este
estudio
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 42
Referencias
(1) M Anastassiades SJ Lehotay D Štajnbaher and FJ Schenk J AOAC Int 86 4121 (2003)
(2) G Stubbings and T Bigwood Anal Chim Acta 637 68 (2009)
(3) RR Rasmussen IMLD Storm PZH Rasmussen J Smedsgaard and KF Nielsen Anal Bioanal Chem 397 765 (2010)
(4) D Smith and K Lynam GCμECD analysis and confirmation of PCBs in fish tissue with Agilent JampW DB-35ms and DB-XLB GC columns Agilent Technologies 5990-6236EN (2010)
(5) F Ploumlssl M Giera and F Bracher J Chrom A 1135 19 (2006)
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MEJORAR LA PRODUCTIVIDAD EN
HPLC ESTAacuteNDAR CON COLUMNAS
POROSHELL
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Columnas Poroshell 120 para HPLC y UHPLC
bull 80-90 de eficacia de las sub 2um
bull A presiones un ~40-50 maacutes bajas
bull Con un tamantildeo de partiacutecula de 27um
bull Con una frita de entrada de 2um
bull Con el doble de resolucioacuten de una
columna de 35um
bull Con un liacutemite de presioacuten de 600 bar
bull La partiacutecula tiene un nuacutecleo soacutelido
(17um) y una cubierta exterior porosa
de 05um como zona de difusioacuten
Las Columnas Poroshell 120 tienen
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Poroshell 120 proporciona Eficacia Suficiente
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Flujo 0582 mLmin AcetonitriloAgua (6040)
Volumen de Inyeccioacuten 4 microL
TCC 26 oC
DAD Sig=2544nm Ref=360100nm
Muestra Muestra de test RRLC
(PN 5188-6529) inoculada con
50 microL 2 mgmL Tiourea en
aguaacetonitrilo (6535)
25 5 75 10
mAU
0
200
400
600
06
46
0
82
6
11
48
15
18
20
16
2
22
3
28
16
41
32
62
73
97
53
larr N = 25053 Presioacuten = 182 bar
Poroshell 120 EC-C18 30 x 100 mm 27 um
min 25 5 75 10 125
mAU
0
200
400
600
06
49
0
86
5
12
75
17
56
24
18
27
05
34
94
52
81
82
18
13
04
1
larr N = 27295 Presioacuten = 386 bar
Eclipse Plus C18 30 x 100 mm 18 um
gt90 de la Eficacia de una 18um
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 46
iquestEn queacute tipos de instrumentos puede usar
Columnas Poroshell 120 HPLCrsquos y UHPLCrsquos
Consideraciones en UHPLC
bull Las columnas Poroshell 120 tienen un liacutemite de presioacuten de 600 bar
bull Los UHPLC estaacuten ajustados para columnas de bajo volumen por lo tanto las
Poroshell pueden usarse en todos los UHPLC
Consideraciones en HPLC
bull Las Columnas Poroshell 120 trabajan bien por debajo de 400 bar
bull Minimize los volumenes extra columna para las columnas 21 y 30mm ID ndash
siga las instrucciones dadas para las columnas RRHT (18um 600 bar)
bull Use en el detector velocidades adecuadas de adquisicioacuten para picos
estrechos de alta eficacia
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Con una frita de 2 um Poroshell 120 no se bloquea
Muestras Complejas- Plasma
Diflusinal in Plasma
0
20
40
60
80
100
120
140
160
180
200
220
240
260
280
300
320
340
360
380
400
1 501 1001 1501 2001 2501
Injections
Pre
ssu
re
0
20000
40000
60000
80000
100000
120000
140000
160000
180000
200000
Eff
icie
ncy (
N)
End Press
Plates
Columna Poroshell 120 EC-C18 30 x 50mm 27um LC Agilent 1200 RRLC (SL)
Muestra Plasma Precipitado 2 partes Plasma 7 Partes 2080 Agua-MeCN w01 Aacutecido Foacutermico con 1 Parte de Diflusinal en
5050 Agua-MeCN 10 ugml (Concentracion Final Diflusinal 1 ugml) Agitado y dejado reposar 10 minutos
No Centrifugado No Filtrado
Volumen de Inyeccioacuten 1ul
Solvente A Agua w01 TFA
Solvente B MeCN w008 TFA
Flujo 1 mlmin 1 ul inyeccioacuten
Tiempo B
0 20
05 90
06 90
11 20
25 20
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Diflusinal es un anti-inflamatorio no esteroidal anaacutelogo
a la aspirina desarrollado por Merck Sharp amp Dohme
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Las Columnas Superficialmente Porosas Pueden
Usarse cumpliendo los Requirimientos USP
De la lista USP de empaquetamientos de columnas LC 42009
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Criterios de Ajuste de Meacutetodos USP y FDA Criterios de Ajuste de Meacutetodos de Dimensiones de Columna
Paraacutemetro Especificaciones Maacuteximas ComentariosEjemplos
Longitud de Columna 70 250mm 75mm
150mm 50mm
Diaacutemetro Interno de
Columna
25 (FDA ORA-LAB 545)
USP ndash 25 ID Columna puede ajustarse si la
velocidad lineal es constante
46 mm 30 mm (-35)
46 mm 21 mm (-54)
30 mm 21 mm (-30)
Flow Rate 50
Volumen de Inyeccioacuten
Reducir tanto como se necesitendash
debe cumplir los liacutemites de
deteccioacuten y precisioacuten
Si cambia a una columna maacutes
corta haga el cambio apropiado
en el volumen de inyeccioacuten
Tamantildeo de Partiacutecula Reducir hasta el 50
(no se puede aumentar)
Puede cambiar la longitud de columna y el
tamantildeo de partiacutecula para mantener la misma
Rs
5um 35um (-30)
5um 27um (-46) Cambiado en 22409 ndash Para la copia oficial y actual ir a
httpwwwfdagovScienceResearchFieldSciencedefaulthtm
USP 30 Second Supplement Revisions PF34(5) en proceso
Ver ldquo Stimuli articlerdquo en Pharmacopeial Forum 2009 35(6)
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Comparacioacuten de 46 x 250 mm 5 um con Poroshell
120 EC-C18 46 x 100 mm 27um
min 5 10 15 20 25 30
mAU
0
20
40
60
80
100
97
12
111
16
115
96
126
74
152
48
161
51
164
35
206
87
230
76
292
90
min 5 10 15 20 25 30
mAU
0
50
100
150
200
250
17
19
21
89
23
11
26
06
38
67
44
37 45
58
54
50
59
20
70
37
Anaacutelisis maacutes raacutepido(columna maacutes corta flujo maacutes alto)
Mayor sensibilidad(partiacutecula maacutes pequentildeapico maacutes estrecho)
Maacutes optimizado (un anaacutelisis maacutes raacutepido permite ajustar mejor)
Ambos anaacutelisis en Agilent 1100 G1315B DAD (bajo 400 bar)
No se requiere cambio en la preparacioacuten de muestra frita de entrada
de 2 micras en ambas columnas
325 bar
110 bar
Sulfadiazina
Sulfatiazol
Sulfapiridina
Sulfamerazina
Sulfametazina
Sulfametazol
Sulfametoxipiridazina
Sulfacloropiridazina
Sulfametoxazol
Sulfadimetoxina
Tiempo B
0 8
33 33
34 33
Columna Eclipse Plus C18
46 x 250mm 5um
Flujo 1 mLmin
Fase Moacutevil
A 01 Aacutecido Foacutermico en Agua
B 01 Aacutecido Foacutermico en ACN
Tiempo B
0 8
12 33
132 33
Columna 46 x 100mm
Poroshell 120 EC-C18
27um
Flujo 185 mLmin
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Comparacioacuten de 46 x 250 mm 5 um con Poroshell
120 EC-C18 46 x 100 mm 27um
min 5 10 15 20 25 30
mAU
0
20
40
60
80
100
97
12
111
16
115
96
126
74
152
48
161
51
164
35
206
87
230
76
292
90
110 bar
5
mAU
0
50
100
150
200
250
17
19
21
89
23
11
26
06
38
67
44
37 45
58
54
50
59
20
70
37
325 bar
min
Ver condiciones en diapositiva anterior
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Mejor Resolucioacuten
linea base
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Anaacutelisis maacutes raacutepido del meacutetodo USP para pastillas de
Simvastatina en Columnas Poroshell 120ndash Ajuste del meacutetodo
46 x 250 mm 5-um
Agilent ZORBAX Eclipse Plus C18
46 x 75 mm 27-um
Agilent Poroshell 120 EC-C18
65 CH3CN 35 39 gL NaH2PO4 (pH 45) 45 oC Sig = 238 8 Ref = 360 100 nm
Flujos 15 mLmin para la columna de 5-um 28 mLmin para la columna Poroshell 120 27um
Requerimiento
USP
5-um
(15 mLmin)
27-um
(28 mLmin)
TR na 9907 1457
krsquo gt 30 5962 5122
N gt 4500 16939 14439
Tf lt 20 109 110
min 2 4 6 8 10
mAU
0
5
10
15
20
25
30
35
40
min 2
mAU
0
5
10
15
20
25
30
35
40
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Ajustes de los parametros cromatograficos en la
transferencia de meacutetodos Escalado del volume de inyeccioacuten
v1 x [(r22 x L2)(r1
2 x L1)] = V2
O bien
v2 = V1 x [(d22 x L2)(d1
2 x L1)]
v volume de inyeccioacuten
r radio de la columna
L longitud de la columna
Ajuste del flujo
F2= F1 x (L2L1 ) x (r2r1 )2
L longitud de la columna
F Flujo
r radio de la columna
Ajuste de la longitud del gradiente
En funcioacuten de la longitud de la columna
L2L1= tg2tg1
En funcioacuten del volumen muerto de columna y del flujo
tG2= tG1 x (V2V1) x (F1F2) t tiempos de gradiente
V volumen muerto de columna
F flujo
Columna ID Volumen muerto aprox
por mm longitud
46mm 100uL
30mm 425uL
21mm 208uL
10mm 047uL
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 54
Notas de Aplicacioacuten en Poroshell 120 y QuEChERS
Determination of Hormones in Shrimp by Agilent 1290 Infinity LC with
Agilent Poroshell 120 LC Column and Agilent QuEChERS for Sample
Preparation (publication 5990-6589EN)
Analysis of Pesticide Residues in Green Tea Using Agilent SampliQ
QuEChERS EN Kit by LCMSMS Detection (publication 5990-
6400EN)
Analysis of Pesticide Residues in Rice Using Agilent Bond Elut
QuEChERS AOAC Kit (publication 5990-8034EN)
Poroshell 120 for pharmaceutical analysis
Poroshell 120 Resources
QuEChERS Applications
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 55
Sumario
bull La columna Poroshell 120 es una nueva alternativa para LC de Alta
Resolucioacuten y Alta Velocidad que puede usarse en cualquier HPLC o UHPLC
bull Con la Poroshell 120 se pueden lograr separaciones de alta eficacia a baja
presioacuten
bull Puede usarse con muestras sucias sin ver una elevacioacuten anormal de la
presioacuten
bull Puede usarse en un meacutetodo USP sin comprometer los Criterios de Ajustes de
Meacutetodo
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Soporte Teacutecnico Agilent
Teleacutefono de Atencioacuten al Cliente
901 11 68 90
email customercare_spainagilentcom
wwwagilentcomchem
![Page 8: Análisis de compuestos farmacéuticos en sangre total · PDF fileReducción en el procesamiento, el envío de la muestra, y los ... Gas flow: 10 L/min Nebulizer: 10 psi Sheath gas](https://reader031.vdocuments.site/reader031/viewer/2022030405/5a7a81727f8b9a0a668b45aa/html5/thumbnails/8.jpg)
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 8
Procedimiento DMS
Fortificacioacuten de sangre humana entera fresca con cada una de las cuatro estatinas para crear una curva de calibracioacuten
Adicioacuten de la sangre fortificada en las tarjetas Agilent Bond Elut DMS (Part A400150)
Se prepararon 3 replicados de concentraciones de sangre a 20 ngmL y 500 ngmL
Secado de las tarjetas
Perforacioacuten de discos de 3 mm y se depositan en viales de 2 mL
Disolucioacuten de cada gota en el solvente de desorcioacuten y vortex
Evaporacioacuten hasta sequedad
Reconstitucioacuten en 100 μL de fase moacutevil (70 5 mM formiato amoacutenico 30 CH3CN) y agitacioacuten
Las muestras se analizaron por LCndashMSndashMS
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 9
Parametros de las transiciones MS-MS para las
estatinas estudiadas
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Cromatograma LCndashMSndashMS de sangre fortificada
con 50 ngmL de estatinas despueacutes del DMS
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 11
Columna Poroshell 120 en la separacioacuten por HPLC
La columna Poroshell 120 ofrece velocidad y alta resolucioacuten
comparable a las columnas sub-2 μm de UHPLC
La tecnologia de partiacuteculas superficialmente genera
separaciones de alta eficacia a menores presiones
Se generaron presiones inferiores a 400 bares
La Poroshell 120 EC-C8 proporciona excelentes formas de
pico para todos los analitos
La atorvastatina puede ser facilmente detectada a 1 ngmL
con una SNR de 797
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 12
Cromatograma LCndashMSndashMS de atorvastatina en
sangre fortificada 1 ngmL
Condiciones LCndashMS
Columna Poroshell 120 EC-C8 27 μm 150 times 21 mm
(Part 693775-906)
Fase Movil
A 5 mM Formiato Amoacutenico B CH3CN
Flujo 200 μLmin
Gradiente
t0 A 70 B 30
t50 A 25 B 75
t55 A 25 B 75
t56 A 70 B 30
t80 A 70 B 30
Temperatura 30 degC
Presioacuten 394 bar
Tiempo anaacutelisis 8 min
Instrumento Agilent 1290 LC
6460 QQQ
Gas temp 275 degC
Gas flow 10 Lmin
Nebulizer 10 psi
Sheath gas temp 250 degC
Sheath gas flow 7 Lmin
Polarity Negative
1 ngmL con una SNR de 797
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 13
Curvas de calibracioacuten representativas de estatinas
en sangre fortificada
Linearidad en las curvas de calibracioacuten para seis niveles de
pravastatina y atorvastatina
Las curvas de Lovastatina y simvastatina no fueron lineales a
las maacutes altas concentraciones y rindieron regresioacuten cuadraacutetica
con coeficientes de correlacioacuten mejores de 0999
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 14
Recuperaciones de estatinas con tarjetas Bond
Elut DMS y tarjetas de celulosa (n = 3)
Los resultados indican que cuando se usan tarjetas de celulosa hay incremento
ionico dando lugar a altas recuperaciones artificiales
Estos datos corroboran que las tarjetas no celulosicas exhiben datos de desorcioacuten
de mejor calidad comparados con las tarjetas tradicionales de celulosa
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 15
Conclusiones
Meacutetodo simple y raacutepido para el anaacutelisis de un grupo de compuestos aciacutedicos en muestras de sangre humana con DMS y LCndashMSndashMS
El meacutetodo ha demostrado se exacto preciso y robusto
Buena linealidad para la pravastatina y atorvastatina usando una regresioacuten lineal con coeficientes de correlacioacuten mejores de 0998
Estas tarjetas ofrecen mejores propiedades de desorcioacuten comparadas con las tarjetas competitivas basadas en celulosa
La columna Poroshell 120 EC-C8 es una excelente eleccioacuten para las aplicaciones bioanaacuteliticas
La tecnologia de Gota de Sangre Seca (Dried blood spots) es una teacutecnica de recoleccioacuten de muestra para el anaacutelisis de faacutermacos en estudios cliacutenicos y precliacutenicos
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 16
Referencias
N Spooner R Lad M Barfield Anal Chem 2009 811557ndash
1563
M Barfield N Spooner R Lad S Parry S Fowles
J Chromatogr B 2008 870 32ndash37
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 17
bullTecnologiacutea Innovadora no-celulosa
bullProporciona un nuevo nivel de confianza en la recoleccioacuten de muestras
bullMejora significativa en la sensibilidad analiacutetica reproducibilidad y faacutecil uso
Anaacutelisis Dried Blood Spotting (DBS)
Desarrollado en colaboracioacuten con Compantildeiacuteas farmaceacuteuticas y CROs este
dispositivo elimina problemas actuales asociados a los sistemas de DBS que
hay en el mercado
bullMuestreo de Sangre plasma o suero (liacutequido sinoviallaacutegrimas bilis LCR) para
anaacutelisis bioanaliacuteticos en pruebas farmaceacuteuticas cliacutenicas y precliacutenicas en
empresasa farmaceacuteuticas de bioanaacutelisis (DMPK ADME y MetID) (no para
Diagnoacutestico cliacutenico)
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 18
La tarjeta sin celulosa es superior de forma medible a las tarjetas de papel de celulosa
Mejora la Sentildeal del MS
bullFormato libre de celulosa ha reducido el enlazado no especiacutefico y no contiene reactivos
quiacutemicos impregnados
Ventajas del Producto
Flujo de trabajo maacutes faacutecil
bull La extraccioacuten de la muestra de la tarjeta
requiere 5 veces menos fuerza que el
producto de celulosa
Proporciona excelente homogeneidad
de la mancha
bull Extracciones reproducibles
recuperaciones maacutes altas
independientemente del nivel de
hematocrito
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 19
bull El nivel de Hematocrito es el porcentaje del volumen de sangre ocupado por las ceacutelulas
rojas de la sangre
bull El material de muestreo Bond Elut DMS tiene una estructura de fibras
maacutes ordenadas comparado con la celulosa estaacutendard
Esta es la razoacuten de porqueacute Bond Elut DMS muestra mejor
reproducibilidad
Mejor Reproducibilidad
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 20
Bond Elut DBS Muestra Mejor Reproducibilidad
Bond Elut DMS tiene una desviacioacuten total de un 5 en todos los niveles HCT mientras que la
tarjeta de celulosa tiene una desviacioacuten de un 52 en todo el rango 10 veces de diferencia
Los datos abajo muestran la desviacioacuten de las medidas del CV desde niveles de HTC
normales (45) para tarjetas Bond Elut DMS y de celulosa (Whatman DMPK-C)
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 21
Ventajas Clave de la Teacutecnica DBS de Agilent
bull Una vez seca la muestra de sangre no supone peligro bioloacutegico alguno y se
puede transportar sin necesidad de sistemas de refrigeracioacuten costosos
bull Permite a los laboratorios centralizar los anaacutelisis de muestra perifeacutericas
bull Se requiere menos volumen de muestra (menor nordm de sujetos en el ensayo
menor nordm de repeticiones y eliminacioacuten de sujetos sateacutelite)
bull Permite la toma demuestra en serie del mismo sujeto
bull La recoleccioacuten de sangre es maacutes sencilla
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 22
Notas de Aplicacioacuten farmaceacuteuticas en Poroshell
120 and DMS Fast Analysis of Cefepime and Related Impurities on Poroshell 120 EC-C18 (publication 5990-7492EN) Comparing Selectivity Easy Transfer of Methods between Superficially Porous Agilent Poroshell 120 EC-C18 and totally Porous Agilent ZORBAX Eclipse Plus C18 (publication 5990-6588EN)
Analysis of Water Soluble Vitamins in Multivitamin Tablets Using Poroshell 120 EC-C18 (publication 5990-8107EN)
Analysis of Anthocyanins in Common Foods Using an Agilent Poroshell 120 SB-C18 (publication 5990-8249EN)
Analysis of Amitriptyline Fluoxetine Quetiapine and Sertraline Using Dried Plasma (publication 5990-8169EN)
Analysis of Amitriptyline Fluoxetine Quetiapine and Sertraline Using Dried Blood Spots (publication 5990-8168EN)
Investigation of Varying Blood Hematocrit Level in Dried Blood Spotting (publication 5990-8306EN)
Analysis of Cholesterol Lowering Drugs (Statins) Using Dried Matrix Spots Technology (publication 5990-8305EN)
Scalability of Agilent Columns Across HPLC and UHPLC Instruments (publication 5990-8428EN)
Converting a CHP Method for Insulin to Agilent Poroshell 120 Columns (publication 5990-9029EN)
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 23
La propuesta QuEChERS para Determinar compuestos
Farmaceacuteuticos y Toxinas en Sangre Total
Anaacutelisis de Compuestos Farmaceacuteuticos en Sangre Total con
la columna Poroshell 120 Usando el meacutetodo Modificado
Mini-QuEChERS para la preparacioacuten de muestra
Nota de Aplicacioacuten5990-8789EN
httpwwwchemagilentcomLibraryapplications5990-8789ENpdf
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 24
Introduccioacuten
Determinacioacuten de compuestos farmaceacuteuticos en anaacutelisis cliacutenicos y
foreacutensicos ADME (DMPK)
La preparacioacuten de muestra va desde la simple precipitacioacuten de
proteinas (PPT) a la maacutes compleja extraccioacuten en fase soacutelida (SPE)
Habitualmente la SPE ha ocupado este vaciacuteo pero simpre hay
espacio para teacutecnicas de preparacioacuten de muestras que son raacutepidas y
baratas de implementar
Se describe un procedimiento mini-QuEChERS modificado con
analisis LCndashMS-MS para la determinacioacuten de faacutermacos en sangre
total
Se analizan nueve diferentes faacutermacos (lidocaina tramadol
amitriptilina biperidina oxazepam lorazepam clorpromazina
diltiazem y naloxona)
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 25
Compuestos farmaceacuteuticos usados en el estudio
Compuesto Nuacutemero CAS Log P (ow) pKa Uso
terapeacuteutico
Lidocaina 137-58-6 24 801 Anesteacutesico local
antiarrithmico
Tramadol 27203-92-5 25 941 Analgesico
Amitriptilina 50-48-6 492 94 Antidepresivo
Biperidena 514-65-8 40 108 Anticolinergico
Oxazepam 604-75-1 223 17 113 Antianxiedad
Lorazepam 846-49-1 247 13 115 Antidepresivo
Clorpromazina 50-53-3 518 93 Antipsycoacutetico
Diltiazem 42399-41-7 363 77 Bloqueante de los
canales del calcio
Naloxona 465-65-6 145 79 Antagonista de los
receptores de opio
Nortriptilina (IS) 72-69-5 565 97
5 ugmL de solucioacuten (9 compuestos) y estandar interno en metanol
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 26
La Teacutecnica de QuEChERS aplicada a las muestras
de sangre
La sangre es el maacutes complejo de los fluidos bioloacutegicos
La determinacioacuten de faacutermacos en sangre total es a menudo necesaria en los
anaacutelisis foreacutensicos dada la dificultad de obtener suero o plasma
Los procedimientos convencionales para analizar faacutermacos en matrices
complejas como la sangre total son complicados
QuEChERS es una teacutecnica de preparacioacuten de muestra que fue desarrollada
para la extraccioacuten de residuos de plaguicidas multi-clase de frutas y vegetales
en 2003
A pesar de que los fluidos bioloacutegicos pueden parecer muy diferentes a una
pieza de fruta sin embargo siguen caminos paralelos
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 27
Caminos paralelos en la preparacioacuten de muestra
Fluidos Bioloacutegicos
Matrices complejas
Rotura de la arquitectura celular
bull Lisis agitacioacuten solvente orgaacutenico
hidroacutelisis
Analitos con un amplio rango de
polaridades
Retirar analito o matriz
Anaacutelisis por LCMSMS GCMS o
GCMSMS
Frutas y Vegetales
Matrices complejas
Rotura de la arquitectura celular
bull Trituracioacuten agitacioacuten solvente
orgaacutenico hidroacutelisis
Analitos con un amplio rango de
polaridades
Retirar analito o matriz
Anaacutelisis por LCMSMS GCMS o
GCMSMS
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Procedimiento baacutesico por SPE para muestras de sangre
El pretratamiento de la sangre total implica la dilucioacuten con una
solucioacuten aacutecida un tampoacuten fosfato o aguaFA
Sonicar 15 minutos rotura de membranas celulares
Centrifugacioacuten
bull Procedimiento de SPE
ndash Acondicionado del cartucho metanol agua
ndash Carga del cartucho muestra
ndash Lavado del cartucho agua con metanol o tampoacuten metanol
ndash Elucioacuten del cartucho eluyente para el anaacutelisis
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 29
Procedimiento Baacutesico QuEChERS
15 g muestra homogeneizada (fortificada)
Antildeadir 15 mL ACN (1 AA) vortex
Antildeadir Sales de Extraccioacuten AOAC agitar
Centrifugar
Transferir 1 u 8 mL a un tubo d-SPE AOAC vortex centrifugar
Transferir al vial de Anaacutelisis
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 30
Ventajas y desventajas del Procedimiento QuEChERS
Ventajas
Extraccioacuten tipo liacutequidoliacutequido
Uso de aacutecido para interrumpir el ligado de proteinas
Exceso de sal para lisar los componentes celulares
Uso de acetonitrilo para facilitar la precipitacioacuten proteacuteica
Uso de SPE dispersiva para adsorber las interferencias de la matriz
Plossl etat J Chrom A 1135 (2006) 19-26
Desventajas
La cantidad de solvente y de muestra requeridos en el meacutetodo no
son ldquobioloacutegicamente adecuadosrdquo
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 31
Propoacutesito de la propuesta mini-Q
Ofrecer un enfoque maacutes adecuado biologicamente
Requirimientos de menores volumenes y tamantildeos de
muestra
Rango de faacutermacos varias polaridades y pKa
Evaluaciacuteoacuten de las interferencias de fondo
Extraccioacuten y datos de recuperacioacuten en un rango
aceptable
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 32
Faacutermacos en sangre Procedimiento mini-QuEChERS
mini-Q
Procedimiento
1 Antildeadir 2 homogeneizadores ceraacutemicos
2 Antildeadir 1 o 2 mL de sangre entera a un tubo de centriacutefuga con tapoacuten de rosca
3 Antildeadir estandar interno vortex
4 Antildeadir 2 mL de ACN acidificado ( 04 FA) vortex 30 seg
5 Antildeadir 500 mg de sales de extraccioacuten agitar vigorsamente 1 minuto centrifugar 5000 rpm 1 min
6 Transferir 1 mL del extraccto al material de d-SPE en tubo de centrifuga vortex centrifugar
7 Antildeadir 200 uL a 800 uL de agua en un vial LC vortex y analizar
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 33
Refinamiento del Procedimiento mini-Q
Paraacutemetros evaluados en la teacutecnica mini-Q
Muestra de sangre total
bull La matriz bioloacutegica maacutes complicada
Adicioacuten de aacutecido tipo y cantidad
bull Efecto en la particioacuten y extraccioacuten
Adicioacuten de las sales de QuEChERS no-tamponadas o
tamponadas con NaAcetato o Citrato
bull Efecto en el extracto inspeccioacuten visual
SPE Dispersiva
bull Limpieza de la matriz y recuperaciones de los compuestos
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 34
Conclusiones del estudio
El ACN con 4 de FA como solvente de extraccioacuten muestra
una lisis maacutes completa de la muestra frente a otros solventes
de extraccioacuten que mostraron una masa soacutelida
Las sales tamponadas AOAC de acetato Soacutedico generan el
extracto maacutes liacutempio y fueron elegidas para la d-SPE
El paso de dSPE no ofrece un clean up adicional para los
meacutetodos de extraccioacuten con sales EN y no tamponadas
principalmente
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 35
Datos de Adquisicoacuten LCMSMS
Compuestos Canales MRM
(mz) Fragmentador
(V) CE (V) RT (min) Delta RT
Lidocaina 1) 23518 gt 861
2) 23518 gt 581
97 11
35
137 04
Tramadol 1) 2642 gt 581
2) 2642 gt 2461
97 15
3
120 04
Amitriptilina 1) 2782 gt 117
2) 2782 gt 105
112 19
19
425 04
Biperidena 1)31223 gt 981
2) 31223 gt 551
123 19
60
423 07
Oxazepam 1) 28706 gt 2409
2) 28706 gt 2689
112 19
7
399 04
Lorazepam 1) 32102 gt 2749
2) 32102 gt 3029
113 15
7
409 04
Clorpromazina 1) 31911 gt 861
2) 31911 gt 581
112 15
43
463 04
Diltiazem 1) 41517 gt 1779
2) 41517 gt 1499
128 19
43
373 04
Naloxona 1) 32816 gt 310
2) 32816 gt 212
123 15
39
082 04
Nortriptilina (IS) 1) 26418 gt 233
2) 26418 gt 91
97 7
19
417 04
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035
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04
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05
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055
0575
06
0625
065
0675
07
0725
075
0775
08
0825
085
0875
09
0925
095
0975
1
1025
105
1075
11
1125
115
1175
12
1225
125
1275
13
1325
135
1375
+ESI TIC Scan Frag=800V AOAC_BLANK_110228bd
1 1
Counts vs Acquisition Time (min)
05 1 15 2 25
3 35 4 45 5 55 6 65 7 75 8 85 9 95 10
Columna Poroshell 120 EC-C18 27
micro 21 x 100 mm PN 695775-902
Fase Moacutevil
A 5 mM Acetato Amoacutenico pH 5
2080 MeOHagua
B 5 mM Acetato amoacutencio en ACN
Flujo 04mLmin
Inyeccioacuten 10uL
GT (ordmC) 300
GF (lmin) 7
Nebulizador (psi) 40
SGT (ordmC) 400
SFG (lmin) 12
Capilar (V) 3500
NV (V) 500
Condiciones LCMS
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2
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29
3
31
32
33
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36
37
38
39
4
41
42
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45
46
47
48
49
5
51
+ESI MRM Frag=1120V CID190 (2782000 -gt 1170000) HQC_6d
1 1
Counts vs Acquisition Time (min) 01 02 03 04 05 06 07 08 09 1 11 12 13 14 15 16 17 18 19 2 21 22 23 24 25 26 27 28 29 3 31 32 33 34 35 36 37 38 39 4 41 42 43 44 45 46
Nalo
xo
ne
Lid
oc
ain
e
Tra
mad
ol
Oxazep
am
Lo
razep
am
Bip
eri
de
n
Am
itri
pty
lin
e
Dil
tiazem
Ch
lorp
rom
azin
e
No
rtri
pty
lin
e (
IS)
Cromatograma LCMSMS de 10 ngmL de sangre total fortificada despueacutes
de extraccioacuten mini-QuEChERS AOAC (NaAc) y d-SPE (50mg PSA y
150mg MgSO4)
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11
12
13
14
15
16
17
18
19
2
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22
23
24
25
26
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29
3
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34
35
36
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39
4
41
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48
49
5
51
+ESI MRM Frag=1120V CID190 (2782000 -gt 1170000) HQC_6d
1 1
Counts vs Acquisition Time (min) 01 02 03 04 05 06 07 08 09 1 11 12 13 14 15 16 17 18 19 2 21 22 23 24 25 26 27 28 29 3 31 32 33 34 35 36 37 38 39 4 41 42 43 44 45 46
1 x10
415 42 425 43 435 44 445 45 455 46 465 47 475 48 485 49 495 5
505 51 515 52 525 53 535 54 545 55 555 56 565 57
+ESI MRM Frag=1120V CID190 (2871000 -gt 2409000) RE_L_1d 1
Counts vs Acquisition Time (min) 305 31 315 32 325 33 335 34 345 35 355 36 365 37 375 38 385 39 395 4 405 41 415 42 425 43 435 44 445 45 455 46 465 47 475
Relacioacuten sentildealruido para el Oxazepam y Lorazepam a
10 ngmL (10 ppb)
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 39
La Naloxone muestra esta curva de linealidad de10-250 ngmL (ppb) con una R2
= 0991
Las curvas de calibracioacuten se generaron con la respuestra relativa (area pico
analitoarea pico IS) frente a la concentracioacuten relativa (concentracion de
analitoconcentracioacuten de IS)
Ejemplo de curva de linealidad para Naloxona extraido
con mini-QuEChERS
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 40
Recuperacioacuten y Reproducibilidad
Compuesto 50 ngmL Spiked
Recuperacioacuten RSD
100 ngmL Spiked
Recuperacioacuten RSD
Lidocaine 987 157 100 118
Tramadol 105 30 104 82
Amitriptyline 104 21 104 82
Biperidene 97 45 99 82
Oxazepam 770 92 78 86
Lorazepam 819 68 818 86
Chlorpromazine 110 103 105 63
Diltiazem 881 27 917 83
Naloxone 806 90 755 77
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 41
Conclusioacutenes y trabajo posterior
El meacutetodo mini-QuEChERS para la extraccioacuten de compuestos farmaceacuteuticos en
sangre total ofrece una alternativa a otras teacutecnicas de preparacioacuten de muestras
La preparacioacuten de muestras mini-QuEChERS es un enfoque simple facil y
barato que requiere una miacutenima experiencia en preparacioacuten de muestras y
miacutenimo equipamiento
Es un punto de partida para ampliar el numero y las clasificaciones evaluadas
en otras matrices bioloacutegicas y en sangre postmortem
El trabajo futuro incluira combinaciones adecuadas tanto de las sales de
extraccioacuten como de los sorbentes de d-SPE por el meacutetodo mini-QuEChERS
La columna Poroshell 120 ofrece una selectividad diferente y excelentes formas
de pico a lo largo del amplio rango de compuestos farmaceacuteuticos usados en este
estudio
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 42
Referencias
(1) M Anastassiades SJ Lehotay D Štajnbaher and FJ Schenk J AOAC Int 86 4121 (2003)
(2) G Stubbings and T Bigwood Anal Chim Acta 637 68 (2009)
(3) RR Rasmussen IMLD Storm PZH Rasmussen J Smedsgaard and KF Nielsen Anal Bioanal Chem 397 765 (2010)
(4) D Smith and K Lynam GCμECD analysis and confirmation of PCBs in fish tissue with Agilent JampW DB-35ms and DB-XLB GC columns Agilent Technologies 5990-6236EN (2010)
(5) F Ploumlssl M Giera and F Bracher J Chrom A 1135 19 (2006)
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 43
MEJORAR LA PRODUCTIVIDAD EN
HPLC ESTAacuteNDAR CON COLUMNAS
POROSHELL
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Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 44
Columnas Poroshell 120 para HPLC y UHPLC
bull 80-90 de eficacia de las sub 2um
bull A presiones un ~40-50 maacutes bajas
bull Con un tamantildeo de partiacutecula de 27um
bull Con una frita de entrada de 2um
bull Con el doble de resolucioacuten de una
columna de 35um
bull Con un liacutemite de presioacuten de 600 bar
bull La partiacutecula tiene un nuacutecleo soacutelido
(17um) y una cubierta exterior porosa
de 05um como zona de difusioacuten
Las Columnas Poroshell 120 tienen
Page 44
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 45
Poroshell 120 proporciona Eficacia Suficiente
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Flujo 0582 mLmin AcetonitriloAgua (6040)
Volumen de Inyeccioacuten 4 microL
TCC 26 oC
DAD Sig=2544nm Ref=360100nm
Muestra Muestra de test RRLC
(PN 5188-6529) inoculada con
50 microL 2 mgmL Tiourea en
aguaacetonitrilo (6535)
25 5 75 10
mAU
0
200
400
600
06
46
0
82
6
11
48
15
18
20
16
2
22
3
28
16
41
32
62
73
97
53
larr N = 25053 Presioacuten = 182 bar
Poroshell 120 EC-C18 30 x 100 mm 27 um
min 25 5 75 10 125
mAU
0
200
400
600
06
49
0
86
5
12
75
17
56
24
18
27
05
34
94
52
81
82
18
13
04
1
larr N = 27295 Presioacuten = 386 bar
Eclipse Plus C18 30 x 100 mm 18 um
gt90 de la Eficacia de una 18um
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 46
iquestEn queacute tipos de instrumentos puede usar
Columnas Poroshell 120 HPLCrsquos y UHPLCrsquos
Consideraciones en UHPLC
bull Las columnas Poroshell 120 tienen un liacutemite de presioacuten de 600 bar
bull Los UHPLC estaacuten ajustados para columnas de bajo volumen por lo tanto las
Poroshell pueden usarse en todos los UHPLC
Consideraciones en HPLC
bull Las Columnas Poroshell 120 trabajan bien por debajo de 400 bar
bull Minimize los volumenes extra columna para las columnas 21 y 30mm ID ndash
siga las instrucciones dadas para las columnas RRHT (18um 600 bar)
bull Use en el detector velocidades adecuadas de adquisicioacuten para picos
estrechos de alta eficacia
Page 46
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 47
Con una frita de 2 um Poroshell 120 no se bloquea
Muestras Complejas- Plasma
Diflusinal in Plasma
0
20
40
60
80
100
120
140
160
180
200
220
240
260
280
300
320
340
360
380
400
1 501 1001 1501 2001 2501
Injections
Pre
ssu
re
0
20000
40000
60000
80000
100000
120000
140000
160000
180000
200000
Eff
icie
ncy (
N)
End Press
Plates
Columna Poroshell 120 EC-C18 30 x 50mm 27um LC Agilent 1200 RRLC (SL)
Muestra Plasma Precipitado 2 partes Plasma 7 Partes 2080 Agua-MeCN w01 Aacutecido Foacutermico con 1 Parte de Diflusinal en
5050 Agua-MeCN 10 ugml (Concentracion Final Diflusinal 1 ugml) Agitado y dejado reposar 10 minutos
No Centrifugado No Filtrado
Volumen de Inyeccioacuten 1ul
Solvente A Agua w01 TFA
Solvente B MeCN w008 TFA
Flujo 1 mlmin 1 ul inyeccioacuten
Tiempo B
0 20
05 90
06 90
11 20
25 20
Page 47
Diflusinal es un anti-inflamatorio no esteroidal anaacutelogo
a la aspirina desarrollado por Merck Sharp amp Dohme
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 48
Las Columnas Superficialmente Porosas Pueden
Usarse cumpliendo los Requirimientos USP
De la lista USP de empaquetamientos de columnas LC 42009
Page 48
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 49
Criterios de Ajuste de Meacutetodos USP y FDA Criterios de Ajuste de Meacutetodos de Dimensiones de Columna
Paraacutemetro Especificaciones Maacuteximas ComentariosEjemplos
Longitud de Columna 70 250mm 75mm
150mm 50mm
Diaacutemetro Interno de
Columna
25 (FDA ORA-LAB 545)
USP ndash 25 ID Columna puede ajustarse si la
velocidad lineal es constante
46 mm 30 mm (-35)
46 mm 21 mm (-54)
30 mm 21 mm (-30)
Flow Rate 50
Volumen de Inyeccioacuten
Reducir tanto como se necesitendash
debe cumplir los liacutemites de
deteccioacuten y precisioacuten
Si cambia a una columna maacutes
corta haga el cambio apropiado
en el volumen de inyeccioacuten
Tamantildeo de Partiacutecula Reducir hasta el 50
(no se puede aumentar)
Puede cambiar la longitud de columna y el
tamantildeo de partiacutecula para mantener la misma
Rs
5um 35um (-30)
5um 27um (-46) Cambiado en 22409 ndash Para la copia oficial y actual ir a
httpwwwfdagovScienceResearchFieldSciencedefaulthtm
USP 30 Second Supplement Revisions PF34(5) en proceso
Ver ldquo Stimuli articlerdquo en Pharmacopeial Forum 2009 35(6)
Page 49
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 50
Comparacioacuten de 46 x 250 mm 5 um con Poroshell
120 EC-C18 46 x 100 mm 27um
min 5 10 15 20 25 30
mAU
0
20
40
60
80
100
97
12
111
16
115
96
126
74
152
48
161
51
164
35
206
87
230
76
292
90
min 5 10 15 20 25 30
mAU
0
50
100
150
200
250
17
19
21
89
23
11
26
06
38
67
44
37 45
58
54
50
59
20
70
37
Anaacutelisis maacutes raacutepido(columna maacutes corta flujo maacutes alto)
Mayor sensibilidad(partiacutecula maacutes pequentildeapico maacutes estrecho)
Maacutes optimizado (un anaacutelisis maacutes raacutepido permite ajustar mejor)
Ambos anaacutelisis en Agilent 1100 G1315B DAD (bajo 400 bar)
No se requiere cambio en la preparacioacuten de muestra frita de entrada
de 2 micras en ambas columnas
325 bar
110 bar
Sulfadiazina
Sulfatiazol
Sulfapiridina
Sulfamerazina
Sulfametazina
Sulfametazol
Sulfametoxipiridazina
Sulfacloropiridazina
Sulfametoxazol
Sulfadimetoxina
Tiempo B
0 8
33 33
34 33
Columna Eclipse Plus C18
46 x 250mm 5um
Flujo 1 mLmin
Fase Moacutevil
A 01 Aacutecido Foacutermico en Agua
B 01 Aacutecido Foacutermico en ACN
Tiempo B
0 8
12 33
132 33
Columna 46 x 100mm
Poroshell 120 EC-C18
27um
Flujo 185 mLmin
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Comparacioacuten de 46 x 250 mm 5 um con Poroshell
120 EC-C18 46 x 100 mm 27um
min 5 10 15 20 25 30
mAU
0
20
40
60
80
100
97
12
111
16
115
96
126
74
152
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164
35
206
87
230
76
292
90
110 bar
5
mAU
0
50
100
150
200
250
17
19
21
89
23
11
26
06
38
67
44
37 45
58
54
50
59
20
70
37
325 bar
min
Ver condiciones en diapositiva anterior
Page 51
Mejor Resolucioacuten
linea base
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 52
Anaacutelisis maacutes raacutepido del meacutetodo USP para pastillas de
Simvastatina en Columnas Poroshell 120ndash Ajuste del meacutetodo
46 x 250 mm 5-um
Agilent ZORBAX Eclipse Plus C18
46 x 75 mm 27-um
Agilent Poroshell 120 EC-C18
65 CH3CN 35 39 gL NaH2PO4 (pH 45) 45 oC Sig = 238 8 Ref = 360 100 nm
Flujos 15 mLmin para la columna de 5-um 28 mLmin para la columna Poroshell 120 27um
Requerimiento
USP
5-um
(15 mLmin)
27-um
(28 mLmin)
TR na 9907 1457
krsquo gt 30 5962 5122
N gt 4500 16939 14439
Tf lt 20 109 110
min 2 4 6 8 10
mAU
0
5
10
15
20
25
30
35
40
min 2
mAU
0
5
10
15
20
25
30
35
40
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Ajustes de los parametros cromatograficos en la
transferencia de meacutetodos Escalado del volume de inyeccioacuten
v1 x [(r22 x L2)(r1
2 x L1)] = V2
O bien
v2 = V1 x [(d22 x L2)(d1
2 x L1)]
v volume de inyeccioacuten
r radio de la columna
L longitud de la columna
Ajuste del flujo
F2= F1 x (L2L1 ) x (r2r1 )2
L longitud de la columna
F Flujo
r radio de la columna
Ajuste de la longitud del gradiente
En funcioacuten de la longitud de la columna
L2L1= tg2tg1
En funcioacuten del volumen muerto de columna y del flujo
tG2= tG1 x (V2V1) x (F1F2) t tiempos de gradiente
V volumen muerto de columna
F flujo
Columna ID Volumen muerto aprox
por mm longitud
46mm 100uL
30mm 425uL
21mm 208uL
10mm 047uL
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 54
Notas de Aplicacioacuten en Poroshell 120 y QuEChERS
Determination of Hormones in Shrimp by Agilent 1290 Infinity LC with
Agilent Poroshell 120 LC Column and Agilent QuEChERS for Sample
Preparation (publication 5990-6589EN)
Analysis of Pesticide Residues in Green Tea Using Agilent SampliQ
QuEChERS EN Kit by LCMSMS Detection (publication 5990-
6400EN)
Analysis of Pesticide Residues in Rice Using Agilent Bond Elut
QuEChERS AOAC Kit (publication 5990-8034EN)
Poroshell 120 for pharmaceutical analysis
Poroshell 120 Resources
QuEChERS Applications
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 55
Sumario
bull La columna Poroshell 120 es una nueva alternativa para LC de Alta
Resolucioacuten y Alta Velocidad que puede usarse en cualquier HPLC o UHPLC
bull Con la Poroshell 120 se pueden lograr separaciones de alta eficacia a baja
presioacuten
bull Puede usarse con muestras sucias sin ver una elevacioacuten anormal de la
presioacuten
bull Puede usarse en un meacutetodo USP sin comprometer los Criterios de Ajustes de
Meacutetodo
Page 55
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 56
Soporte Teacutecnico Agilent
Teleacutefono de Atencioacuten al Cliente
901 11 68 90
email customercare_spainagilentcom
wwwagilentcomchem
![Page 9: Análisis de compuestos farmacéuticos en sangre total · PDF fileReducción en el procesamiento, el envío de la muestra, y los ... Gas flow: 10 L/min Nebulizer: 10 psi Sheath gas](https://reader031.vdocuments.site/reader031/viewer/2022030405/5a7a81727f8b9a0a668b45aa/html5/thumbnails/9.jpg)
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 9
Parametros de las transiciones MS-MS para las
estatinas estudiadas
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 10
Cromatograma LCndashMSndashMS de sangre fortificada
con 50 ngmL de estatinas despueacutes del DMS
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 11
Columna Poroshell 120 en la separacioacuten por HPLC
La columna Poroshell 120 ofrece velocidad y alta resolucioacuten
comparable a las columnas sub-2 μm de UHPLC
La tecnologia de partiacuteculas superficialmente genera
separaciones de alta eficacia a menores presiones
Se generaron presiones inferiores a 400 bares
La Poroshell 120 EC-C8 proporciona excelentes formas de
pico para todos los analitos
La atorvastatina puede ser facilmente detectada a 1 ngmL
con una SNR de 797
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 12
Cromatograma LCndashMSndashMS de atorvastatina en
sangre fortificada 1 ngmL
Condiciones LCndashMS
Columna Poroshell 120 EC-C8 27 μm 150 times 21 mm
(Part 693775-906)
Fase Movil
A 5 mM Formiato Amoacutenico B CH3CN
Flujo 200 μLmin
Gradiente
t0 A 70 B 30
t50 A 25 B 75
t55 A 25 B 75
t56 A 70 B 30
t80 A 70 B 30
Temperatura 30 degC
Presioacuten 394 bar
Tiempo anaacutelisis 8 min
Instrumento Agilent 1290 LC
6460 QQQ
Gas temp 275 degC
Gas flow 10 Lmin
Nebulizer 10 psi
Sheath gas temp 250 degC
Sheath gas flow 7 Lmin
Polarity Negative
1 ngmL con una SNR de 797
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 13
Curvas de calibracioacuten representativas de estatinas
en sangre fortificada
Linearidad en las curvas de calibracioacuten para seis niveles de
pravastatina y atorvastatina
Las curvas de Lovastatina y simvastatina no fueron lineales a
las maacutes altas concentraciones y rindieron regresioacuten cuadraacutetica
con coeficientes de correlacioacuten mejores de 0999
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 14
Recuperaciones de estatinas con tarjetas Bond
Elut DMS y tarjetas de celulosa (n = 3)
Los resultados indican que cuando se usan tarjetas de celulosa hay incremento
ionico dando lugar a altas recuperaciones artificiales
Estos datos corroboran que las tarjetas no celulosicas exhiben datos de desorcioacuten
de mejor calidad comparados con las tarjetas tradicionales de celulosa
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 15
Conclusiones
Meacutetodo simple y raacutepido para el anaacutelisis de un grupo de compuestos aciacutedicos en muestras de sangre humana con DMS y LCndashMSndashMS
El meacutetodo ha demostrado se exacto preciso y robusto
Buena linealidad para la pravastatina y atorvastatina usando una regresioacuten lineal con coeficientes de correlacioacuten mejores de 0998
Estas tarjetas ofrecen mejores propiedades de desorcioacuten comparadas con las tarjetas competitivas basadas en celulosa
La columna Poroshell 120 EC-C8 es una excelente eleccioacuten para las aplicaciones bioanaacuteliticas
La tecnologia de Gota de Sangre Seca (Dried blood spots) es una teacutecnica de recoleccioacuten de muestra para el anaacutelisis de faacutermacos en estudios cliacutenicos y precliacutenicos
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 16
Referencias
N Spooner R Lad M Barfield Anal Chem 2009 811557ndash
1563
M Barfield N Spooner R Lad S Parry S Fowles
J Chromatogr B 2008 870 32ndash37
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 17
bullTecnologiacutea Innovadora no-celulosa
bullProporciona un nuevo nivel de confianza en la recoleccioacuten de muestras
bullMejora significativa en la sensibilidad analiacutetica reproducibilidad y faacutecil uso
Anaacutelisis Dried Blood Spotting (DBS)
Desarrollado en colaboracioacuten con Compantildeiacuteas farmaceacuteuticas y CROs este
dispositivo elimina problemas actuales asociados a los sistemas de DBS que
hay en el mercado
bullMuestreo de Sangre plasma o suero (liacutequido sinoviallaacutegrimas bilis LCR) para
anaacutelisis bioanaliacuteticos en pruebas farmaceacuteuticas cliacutenicas y precliacutenicas en
empresasa farmaceacuteuticas de bioanaacutelisis (DMPK ADME y MetID) (no para
Diagnoacutestico cliacutenico)
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 18
La tarjeta sin celulosa es superior de forma medible a las tarjetas de papel de celulosa
Mejora la Sentildeal del MS
bullFormato libre de celulosa ha reducido el enlazado no especiacutefico y no contiene reactivos
quiacutemicos impregnados
Ventajas del Producto
Flujo de trabajo maacutes faacutecil
bull La extraccioacuten de la muestra de la tarjeta
requiere 5 veces menos fuerza que el
producto de celulosa
Proporciona excelente homogeneidad
de la mancha
bull Extracciones reproducibles
recuperaciones maacutes altas
independientemente del nivel de
hematocrito
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 19
bull El nivel de Hematocrito es el porcentaje del volumen de sangre ocupado por las ceacutelulas
rojas de la sangre
bull El material de muestreo Bond Elut DMS tiene una estructura de fibras
maacutes ordenadas comparado con la celulosa estaacutendard
Esta es la razoacuten de porqueacute Bond Elut DMS muestra mejor
reproducibilidad
Mejor Reproducibilidad
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 20
Bond Elut DBS Muestra Mejor Reproducibilidad
Bond Elut DMS tiene una desviacioacuten total de un 5 en todos los niveles HCT mientras que la
tarjeta de celulosa tiene una desviacioacuten de un 52 en todo el rango 10 veces de diferencia
Los datos abajo muestran la desviacioacuten de las medidas del CV desde niveles de HTC
normales (45) para tarjetas Bond Elut DMS y de celulosa (Whatman DMPK-C)
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 21
Ventajas Clave de la Teacutecnica DBS de Agilent
bull Una vez seca la muestra de sangre no supone peligro bioloacutegico alguno y se
puede transportar sin necesidad de sistemas de refrigeracioacuten costosos
bull Permite a los laboratorios centralizar los anaacutelisis de muestra perifeacutericas
bull Se requiere menos volumen de muestra (menor nordm de sujetos en el ensayo
menor nordm de repeticiones y eliminacioacuten de sujetos sateacutelite)
bull Permite la toma demuestra en serie del mismo sujeto
bull La recoleccioacuten de sangre es maacutes sencilla
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 22
Notas de Aplicacioacuten farmaceacuteuticas en Poroshell
120 and DMS Fast Analysis of Cefepime and Related Impurities on Poroshell 120 EC-C18 (publication 5990-7492EN) Comparing Selectivity Easy Transfer of Methods between Superficially Porous Agilent Poroshell 120 EC-C18 and totally Porous Agilent ZORBAX Eclipse Plus C18 (publication 5990-6588EN)
Analysis of Water Soluble Vitamins in Multivitamin Tablets Using Poroshell 120 EC-C18 (publication 5990-8107EN)
Analysis of Anthocyanins in Common Foods Using an Agilent Poroshell 120 SB-C18 (publication 5990-8249EN)
Analysis of Amitriptyline Fluoxetine Quetiapine and Sertraline Using Dried Plasma (publication 5990-8169EN)
Analysis of Amitriptyline Fluoxetine Quetiapine and Sertraline Using Dried Blood Spots (publication 5990-8168EN)
Investigation of Varying Blood Hematocrit Level in Dried Blood Spotting (publication 5990-8306EN)
Analysis of Cholesterol Lowering Drugs (Statins) Using Dried Matrix Spots Technology (publication 5990-8305EN)
Scalability of Agilent Columns Across HPLC and UHPLC Instruments (publication 5990-8428EN)
Converting a CHP Method for Insulin to Agilent Poroshell 120 Columns (publication 5990-9029EN)
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 23
La propuesta QuEChERS para Determinar compuestos
Farmaceacuteuticos y Toxinas en Sangre Total
Anaacutelisis de Compuestos Farmaceacuteuticos en Sangre Total con
la columna Poroshell 120 Usando el meacutetodo Modificado
Mini-QuEChERS para la preparacioacuten de muestra
Nota de Aplicacioacuten5990-8789EN
httpwwwchemagilentcomLibraryapplications5990-8789ENpdf
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 24
Introduccioacuten
Determinacioacuten de compuestos farmaceacuteuticos en anaacutelisis cliacutenicos y
foreacutensicos ADME (DMPK)
La preparacioacuten de muestra va desde la simple precipitacioacuten de
proteinas (PPT) a la maacutes compleja extraccioacuten en fase soacutelida (SPE)
Habitualmente la SPE ha ocupado este vaciacuteo pero simpre hay
espacio para teacutecnicas de preparacioacuten de muestras que son raacutepidas y
baratas de implementar
Se describe un procedimiento mini-QuEChERS modificado con
analisis LCndashMS-MS para la determinacioacuten de faacutermacos en sangre
total
Se analizan nueve diferentes faacutermacos (lidocaina tramadol
amitriptilina biperidina oxazepam lorazepam clorpromazina
diltiazem y naloxona)
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 25
Compuestos farmaceacuteuticos usados en el estudio
Compuesto Nuacutemero CAS Log P (ow) pKa Uso
terapeacuteutico
Lidocaina 137-58-6 24 801 Anesteacutesico local
antiarrithmico
Tramadol 27203-92-5 25 941 Analgesico
Amitriptilina 50-48-6 492 94 Antidepresivo
Biperidena 514-65-8 40 108 Anticolinergico
Oxazepam 604-75-1 223 17 113 Antianxiedad
Lorazepam 846-49-1 247 13 115 Antidepresivo
Clorpromazina 50-53-3 518 93 Antipsycoacutetico
Diltiazem 42399-41-7 363 77 Bloqueante de los
canales del calcio
Naloxona 465-65-6 145 79 Antagonista de los
receptores de opio
Nortriptilina (IS) 72-69-5 565 97
5 ugmL de solucioacuten (9 compuestos) y estandar interno en metanol
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 26
La Teacutecnica de QuEChERS aplicada a las muestras
de sangre
La sangre es el maacutes complejo de los fluidos bioloacutegicos
La determinacioacuten de faacutermacos en sangre total es a menudo necesaria en los
anaacutelisis foreacutensicos dada la dificultad de obtener suero o plasma
Los procedimientos convencionales para analizar faacutermacos en matrices
complejas como la sangre total son complicados
QuEChERS es una teacutecnica de preparacioacuten de muestra que fue desarrollada
para la extraccioacuten de residuos de plaguicidas multi-clase de frutas y vegetales
en 2003
A pesar de que los fluidos bioloacutegicos pueden parecer muy diferentes a una
pieza de fruta sin embargo siguen caminos paralelos
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 27
Caminos paralelos en la preparacioacuten de muestra
Fluidos Bioloacutegicos
Matrices complejas
Rotura de la arquitectura celular
bull Lisis agitacioacuten solvente orgaacutenico
hidroacutelisis
Analitos con un amplio rango de
polaridades
Retirar analito o matriz
Anaacutelisis por LCMSMS GCMS o
GCMSMS
Frutas y Vegetales
Matrices complejas
Rotura de la arquitectura celular
bull Trituracioacuten agitacioacuten solvente
orgaacutenico hidroacutelisis
Analitos con un amplio rango de
polaridades
Retirar analito o matriz
Anaacutelisis por LCMSMS GCMS o
GCMSMS
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 28
Procedimiento baacutesico por SPE para muestras de sangre
El pretratamiento de la sangre total implica la dilucioacuten con una
solucioacuten aacutecida un tampoacuten fosfato o aguaFA
Sonicar 15 minutos rotura de membranas celulares
Centrifugacioacuten
bull Procedimiento de SPE
ndash Acondicionado del cartucho metanol agua
ndash Carga del cartucho muestra
ndash Lavado del cartucho agua con metanol o tampoacuten metanol
ndash Elucioacuten del cartucho eluyente para el anaacutelisis
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 29
Procedimiento Baacutesico QuEChERS
15 g muestra homogeneizada (fortificada)
Antildeadir 15 mL ACN (1 AA) vortex
Antildeadir Sales de Extraccioacuten AOAC agitar
Centrifugar
Transferir 1 u 8 mL a un tubo d-SPE AOAC vortex centrifugar
Transferir al vial de Anaacutelisis
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 30
Ventajas y desventajas del Procedimiento QuEChERS
Ventajas
Extraccioacuten tipo liacutequidoliacutequido
Uso de aacutecido para interrumpir el ligado de proteinas
Exceso de sal para lisar los componentes celulares
Uso de acetonitrilo para facilitar la precipitacioacuten proteacuteica
Uso de SPE dispersiva para adsorber las interferencias de la matriz
Plossl etat J Chrom A 1135 (2006) 19-26
Desventajas
La cantidad de solvente y de muestra requeridos en el meacutetodo no
son ldquobioloacutegicamente adecuadosrdquo
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 31
Propoacutesito de la propuesta mini-Q
Ofrecer un enfoque maacutes adecuado biologicamente
Requirimientos de menores volumenes y tamantildeos de
muestra
Rango de faacutermacos varias polaridades y pKa
Evaluaciacuteoacuten de las interferencias de fondo
Extraccioacuten y datos de recuperacioacuten en un rango
aceptable
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 32
Faacutermacos en sangre Procedimiento mini-QuEChERS
mini-Q
Procedimiento
1 Antildeadir 2 homogeneizadores ceraacutemicos
2 Antildeadir 1 o 2 mL de sangre entera a un tubo de centriacutefuga con tapoacuten de rosca
3 Antildeadir estandar interno vortex
4 Antildeadir 2 mL de ACN acidificado ( 04 FA) vortex 30 seg
5 Antildeadir 500 mg de sales de extraccioacuten agitar vigorsamente 1 minuto centrifugar 5000 rpm 1 min
6 Transferir 1 mL del extraccto al material de d-SPE en tubo de centrifuga vortex centrifugar
7 Antildeadir 200 uL a 800 uL de agua en un vial LC vortex y analizar
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 33
Refinamiento del Procedimiento mini-Q
Paraacutemetros evaluados en la teacutecnica mini-Q
Muestra de sangre total
bull La matriz bioloacutegica maacutes complicada
Adicioacuten de aacutecido tipo y cantidad
bull Efecto en la particioacuten y extraccioacuten
Adicioacuten de las sales de QuEChERS no-tamponadas o
tamponadas con NaAcetato o Citrato
bull Efecto en el extracto inspeccioacuten visual
SPE Dispersiva
bull Limpieza de la matriz y recuperaciones de los compuestos
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 34
Conclusiones del estudio
El ACN con 4 de FA como solvente de extraccioacuten muestra
una lisis maacutes completa de la muestra frente a otros solventes
de extraccioacuten que mostraron una masa soacutelida
Las sales tamponadas AOAC de acetato Soacutedico generan el
extracto maacutes liacutempio y fueron elegidas para la d-SPE
El paso de dSPE no ofrece un clean up adicional para los
meacutetodos de extraccioacuten con sales EN y no tamponadas
principalmente
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 35
Datos de Adquisicoacuten LCMSMS
Compuestos Canales MRM
(mz) Fragmentador
(V) CE (V) RT (min) Delta RT
Lidocaina 1) 23518 gt 861
2) 23518 gt 581
97 11
35
137 04
Tramadol 1) 2642 gt 581
2) 2642 gt 2461
97 15
3
120 04
Amitriptilina 1) 2782 gt 117
2) 2782 gt 105
112 19
19
425 04
Biperidena 1)31223 gt 981
2) 31223 gt 551
123 19
60
423 07
Oxazepam 1) 28706 gt 2409
2) 28706 gt 2689
112 19
7
399 04
Lorazepam 1) 32102 gt 2749
2) 32102 gt 3029
113 15
7
409 04
Clorpromazina 1) 31911 gt 861
2) 31911 gt 581
112 15
43
463 04
Diltiazem 1) 41517 gt 1779
2) 41517 gt 1499
128 19
43
373 04
Naloxona 1) 32816 gt 310
2) 32816 gt 212
123 15
39
082 04
Nortriptilina (IS) 1) 26418 gt 233
2) 26418 gt 91
97 7
19
417 04
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7 x10
0125
015
0175
02
0225
025
0275
03
0325
035
0375
04
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045
0475
05
0525
055
0575
06
0625
065
0675
07
0725
075
0775
08
0825
085
0875
09
0925
095
0975
1
1025
105
1075
11
1125
115
1175
12
1225
125
1275
13
1325
135
1375
+ESI TIC Scan Frag=800V AOAC_BLANK_110228bd
1 1
Counts vs Acquisition Time (min)
05 1 15 2 25
3 35 4 45 5 55 6 65 7 75 8 85 9 95 10
Columna Poroshell 120 EC-C18 27
micro 21 x 100 mm PN 695775-902
Fase Moacutevil
A 5 mM Acetato Amoacutenico pH 5
2080 MeOHagua
B 5 mM Acetato amoacutencio en ACN
Flujo 04mLmin
Inyeccioacuten 10uL
GT (ordmC) 300
GF (lmin) 7
Nebulizador (psi) 40
SGT (ordmC) 400
SFG (lmin) 12
Capilar (V) 3500
NV (V) 500
Condiciones LCMS
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 37
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3
31
32
33
34
35
36
37
38
39
4
41
42
43
44
45
46
47
48
49
5
51
+ESI MRM Frag=1120V CID190 (2782000 -gt 1170000) HQC_6d
1 1
Counts vs Acquisition Time (min) 01 02 03 04 05 06 07 08 09 1 11 12 13 14 15 16 17 18 19 2 21 22 23 24 25 26 27 28 29 3 31 32 33 34 35 36 37 38 39 4 41 42 43 44 45 46
Nalo
xo
ne
Lid
oc
ain
e
Tra
mad
ol
Oxazep
am
Lo
razep
am
Bip
eri
de
n
Am
itri
pty
lin
e
Dil
tiazem
Ch
lorp
rom
azin
e
No
rtri
pty
lin
e (
IS)
Cromatograma LCMSMS de 10 ngmL de sangre total fortificada despueacutes
de extraccioacuten mini-QuEChERS AOAC (NaAc) y d-SPE (50mg PSA y
150mg MgSO4)
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 38
3 x10
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28
29
3
31
32
33
34
35
36
37
38
39
4
41
42
43
44
45
46
47
48
49
5
51
+ESI MRM Frag=1120V CID190 (2782000 -gt 1170000) HQC_6d
1 1
Counts vs Acquisition Time (min) 01 02 03 04 05 06 07 08 09 1 11 12 13 14 15 16 17 18 19 2 21 22 23 24 25 26 27 28 29 3 31 32 33 34 35 36 37 38 39 4 41 42 43 44 45 46
1 x10
415 42 425 43 435 44 445 45 455 46 465 47 475 48 485 49 495 5
505 51 515 52 525 53 535 54 545 55 555 56 565 57
+ESI MRM Frag=1120V CID190 (2871000 -gt 2409000) RE_L_1d 1
Counts vs Acquisition Time (min) 305 31 315 32 325 33 335 34 345 35 355 36 365 37 375 38 385 39 395 4 405 41 415 42 425 43 435 44 445 45 455 46 465 47 475
Relacioacuten sentildealruido para el Oxazepam y Lorazepam a
10 ngmL (10 ppb)
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 39
La Naloxone muestra esta curva de linealidad de10-250 ngmL (ppb) con una R2
= 0991
Las curvas de calibracioacuten se generaron con la respuestra relativa (area pico
analitoarea pico IS) frente a la concentracioacuten relativa (concentracion de
analitoconcentracioacuten de IS)
Ejemplo de curva de linealidad para Naloxona extraido
con mini-QuEChERS
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 40
Recuperacioacuten y Reproducibilidad
Compuesto 50 ngmL Spiked
Recuperacioacuten RSD
100 ngmL Spiked
Recuperacioacuten RSD
Lidocaine 987 157 100 118
Tramadol 105 30 104 82
Amitriptyline 104 21 104 82
Biperidene 97 45 99 82
Oxazepam 770 92 78 86
Lorazepam 819 68 818 86
Chlorpromazine 110 103 105 63
Diltiazem 881 27 917 83
Naloxone 806 90 755 77
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 41
Conclusioacutenes y trabajo posterior
El meacutetodo mini-QuEChERS para la extraccioacuten de compuestos farmaceacuteuticos en
sangre total ofrece una alternativa a otras teacutecnicas de preparacioacuten de muestras
La preparacioacuten de muestras mini-QuEChERS es un enfoque simple facil y
barato que requiere una miacutenima experiencia en preparacioacuten de muestras y
miacutenimo equipamiento
Es un punto de partida para ampliar el numero y las clasificaciones evaluadas
en otras matrices bioloacutegicas y en sangre postmortem
El trabajo futuro incluira combinaciones adecuadas tanto de las sales de
extraccioacuten como de los sorbentes de d-SPE por el meacutetodo mini-QuEChERS
La columna Poroshell 120 ofrece una selectividad diferente y excelentes formas
de pico a lo largo del amplio rango de compuestos farmaceacuteuticos usados en este
estudio
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 42
Referencias
(1) M Anastassiades SJ Lehotay D Štajnbaher and FJ Schenk J AOAC Int 86 4121 (2003)
(2) G Stubbings and T Bigwood Anal Chim Acta 637 68 (2009)
(3) RR Rasmussen IMLD Storm PZH Rasmussen J Smedsgaard and KF Nielsen Anal Bioanal Chem 397 765 (2010)
(4) D Smith and K Lynam GCμECD analysis and confirmation of PCBs in fish tissue with Agilent JampW DB-35ms and DB-XLB GC columns Agilent Technologies 5990-6236EN (2010)
(5) F Ploumlssl M Giera and F Bracher J Chrom A 1135 19 (2006)
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 43
MEJORAR LA PRODUCTIVIDAD EN
HPLC ESTAacuteNDAR CON COLUMNAS
POROSHELL
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Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 44
Columnas Poroshell 120 para HPLC y UHPLC
bull 80-90 de eficacia de las sub 2um
bull A presiones un ~40-50 maacutes bajas
bull Con un tamantildeo de partiacutecula de 27um
bull Con una frita de entrada de 2um
bull Con el doble de resolucioacuten de una
columna de 35um
bull Con un liacutemite de presioacuten de 600 bar
bull La partiacutecula tiene un nuacutecleo soacutelido
(17um) y una cubierta exterior porosa
de 05um como zona de difusioacuten
Las Columnas Poroshell 120 tienen
Page 44
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 45
Poroshell 120 proporciona Eficacia Suficiente
Page 45
Flujo 0582 mLmin AcetonitriloAgua (6040)
Volumen de Inyeccioacuten 4 microL
TCC 26 oC
DAD Sig=2544nm Ref=360100nm
Muestra Muestra de test RRLC
(PN 5188-6529) inoculada con
50 microL 2 mgmL Tiourea en
aguaacetonitrilo (6535)
25 5 75 10
mAU
0
200
400
600
06
46
0
82
6
11
48
15
18
20
16
2
22
3
28
16
41
32
62
73
97
53
larr N = 25053 Presioacuten = 182 bar
Poroshell 120 EC-C18 30 x 100 mm 27 um
min 25 5 75 10 125
mAU
0
200
400
600
06
49
0
86
5
12
75
17
56
24
18
27
05
34
94
52
81
82
18
13
04
1
larr N = 27295 Presioacuten = 386 bar
Eclipse Plus C18 30 x 100 mm 18 um
gt90 de la Eficacia de una 18um
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 46
iquestEn queacute tipos de instrumentos puede usar
Columnas Poroshell 120 HPLCrsquos y UHPLCrsquos
Consideraciones en UHPLC
bull Las columnas Poroshell 120 tienen un liacutemite de presioacuten de 600 bar
bull Los UHPLC estaacuten ajustados para columnas de bajo volumen por lo tanto las
Poroshell pueden usarse en todos los UHPLC
Consideraciones en HPLC
bull Las Columnas Poroshell 120 trabajan bien por debajo de 400 bar
bull Minimize los volumenes extra columna para las columnas 21 y 30mm ID ndash
siga las instrucciones dadas para las columnas RRHT (18um 600 bar)
bull Use en el detector velocidades adecuadas de adquisicioacuten para picos
estrechos de alta eficacia
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Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 47
Con una frita de 2 um Poroshell 120 no se bloquea
Muestras Complejas- Plasma
Diflusinal in Plasma
0
20
40
60
80
100
120
140
160
180
200
220
240
260
280
300
320
340
360
380
400
1 501 1001 1501 2001 2501
Injections
Pre
ssu
re
0
20000
40000
60000
80000
100000
120000
140000
160000
180000
200000
Eff
icie
ncy (
N)
End Press
Plates
Columna Poroshell 120 EC-C18 30 x 50mm 27um LC Agilent 1200 RRLC (SL)
Muestra Plasma Precipitado 2 partes Plasma 7 Partes 2080 Agua-MeCN w01 Aacutecido Foacutermico con 1 Parte de Diflusinal en
5050 Agua-MeCN 10 ugml (Concentracion Final Diflusinal 1 ugml) Agitado y dejado reposar 10 minutos
No Centrifugado No Filtrado
Volumen de Inyeccioacuten 1ul
Solvente A Agua w01 TFA
Solvente B MeCN w008 TFA
Flujo 1 mlmin 1 ul inyeccioacuten
Tiempo B
0 20
05 90
06 90
11 20
25 20
Page 47
Diflusinal es un anti-inflamatorio no esteroidal anaacutelogo
a la aspirina desarrollado por Merck Sharp amp Dohme
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 48
Las Columnas Superficialmente Porosas Pueden
Usarse cumpliendo los Requirimientos USP
De la lista USP de empaquetamientos de columnas LC 42009
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Criterios de Ajuste de Meacutetodos USP y FDA Criterios de Ajuste de Meacutetodos de Dimensiones de Columna
Paraacutemetro Especificaciones Maacuteximas ComentariosEjemplos
Longitud de Columna 70 250mm 75mm
150mm 50mm
Diaacutemetro Interno de
Columna
25 (FDA ORA-LAB 545)
USP ndash 25 ID Columna puede ajustarse si la
velocidad lineal es constante
46 mm 30 mm (-35)
46 mm 21 mm (-54)
30 mm 21 mm (-30)
Flow Rate 50
Volumen de Inyeccioacuten
Reducir tanto como se necesitendash
debe cumplir los liacutemites de
deteccioacuten y precisioacuten
Si cambia a una columna maacutes
corta haga el cambio apropiado
en el volumen de inyeccioacuten
Tamantildeo de Partiacutecula Reducir hasta el 50
(no se puede aumentar)
Puede cambiar la longitud de columna y el
tamantildeo de partiacutecula para mantener la misma
Rs
5um 35um (-30)
5um 27um (-46) Cambiado en 22409 ndash Para la copia oficial y actual ir a
httpwwwfdagovScienceResearchFieldSciencedefaulthtm
USP 30 Second Supplement Revisions PF34(5) en proceso
Ver ldquo Stimuli articlerdquo en Pharmacopeial Forum 2009 35(6)
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Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 50
Comparacioacuten de 46 x 250 mm 5 um con Poroshell
120 EC-C18 46 x 100 mm 27um
min 5 10 15 20 25 30
mAU
0
20
40
60
80
100
97
12
111
16
115
96
126
74
152
48
161
51
164
35
206
87
230
76
292
90
min 5 10 15 20 25 30
mAU
0
50
100
150
200
250
17
19
21
89
23
11
26
06
38
67
44
37 45
58
54
50
59
20
70
37
Anaacutelisis maacutes raacutepido(columna maacutes corta flujo maacutes alto)
Mayor sensibilidad(partiacutecula maacutes pequentildeapico maacutes estrecho)
Maacutes optimizado (un anaacutelisis maacutes raacutepido permite ajustar mejor)
Ambos anaacutelisis en Agilent 1100 G1315B DAD (bajo 400 bar)
No se requiere cambio en la preparacioacuten de muestra frita de entrada
de 2 micras en ambas columnas
325 bar
110 bar
Sulfadiazina
Sulfatiazol
Sulfapiridina
Sulfamerazina
Sulfametazina
Sulfametazol
Sulfametoxipiridazina
Sulfacloropiridazina
Sulfametoxazol
Sulfadimetoxina
Tiempo B
0 8
33 33
34 33
Columna Eclipse Plus C18
46 x 250mm 5um
Flujo 1 mLmin
Fase Moacutevil
A 01 Aacutecido Foacutermico en Agua
B 01 Aacutecido Foacutermico en ACN
Tiempo B
0 8
12 33
132 33
Columna 46 x 100mm
Poroshell 120 EC-C18
27um
Flujo 185 mLmin
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Comparacioacuten de 46 x 250 mm 5 um con Poroshell
120 EC-C18 46 x 100 mm 27um
min 5 10 15 20 25 30
mAU
0
20
40
60
80
100
97
12
111
16
115
96
126
74
152
48
161
51
164
35
206
87
230
76
292
90
110 bar
5
mAU
0
50
100
150
200
250
17
19
21
89
23
11
26
06
38
67
44
37 45
58
54
50
59
20
70
37
325 bar
min
Ver condiciones en diapositiva anterior
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Mejor Resolucioacuten
linea base
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 52
Anaacutelisis maacutes raacutepido del meacutetodo USP para pastillas de
Simvastatina en Columnas Poroshell 120ndash Ajuste del meacutetodo
46 x 250 mm 5-um
Agilent ZORBAX Eclipse Plus C18
46 x 75 mm 27-um
Agilent Poroshell 120 EC-C18
65 CH3CN 35 39 gL NaH2PO4 (pH 45) 45 oC Sig = 238 8 Ref = 360 100 nm
Flujos 15 mLmin para la columna de 5-um 28 mLmin para la columna Poroshell 120 27um
Requerimiento
USP
5-um
(15 mLmin)
27-um
(28 mLmin)
TR na 9907 1457
krsquo gt 30 5962 5122
N gt 4500 16939 14439
Tf lt 20 109 110
min 2 4 6 8 10
mAU
0
5
10
15
20
25
30
35
40
min 2
mAU
0
5
10
15
20
25
30
35
40
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 53
Ajustes de los parametros cromatograficos en la
transferencia de meacutetodos Escalado del volume de inyeccioacuten
v1 x [(r22 x L2)(r1
2 x L1)] = V2
O bien
v2 = V1 x [(d22 x L2)(d1
2 x L1)]
v volume de inyeccioacuten
r radio de la columna
L longitud de la columna
Ajuste del flujo
F2= F1 x (L2L1 ) x (r2r1 )2
L longitud de la columna
F Flujo
r radio de la columna
Ajuste de la longitud del gradiente
En funcioacuten de la longitud de la columna
L2L1= tg2tg1
En funcioacuten del volumen muerto de columna y del flujo
tG2= tG1 x (V2V1) x (F1F2) t tiempos de gradiente
V volumen muerto de columna
F flujo
Columna ID Volumen muerto aprox
por mm longitud
46mm 100uL
30mm 425uL
21mm 208uL
10mm 047uL
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 54
Notas de Aplicacioacuten en Poroshell 120 y QuEChERS
Determination of Hormones in Shrimp by Agilent 1290 Infinity LC with
Agilent Poroshell 120 LC Column and Agilent QuEChERS for Sample
Preparation (publication 5990-6589EN)
Analysis of Pesticide Residues in Green Tea Using Agilent SampliQ
QuEChERS EN Kit by LCMSMS Detection (publication 5990-
6400EN)
Analysis of Pesticide Residues in Rice Using Agilent Bond Elut
QuEChERS AOAC Kit (publication 5990-8034EN)
Poroshell 120 for pharmaceutical analysis
Poroshell 120 Resources
QuEChERS Applications
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 55
Sumario
bull La columna Poroshell 120 es una nueva alternativa para LC de Alta
Resolucioacuten y Alta Velocidad que puede usarse en cualquier HPLC o UHPLC
bull Con la Poroshell 120 se pueden lograr separaciones de alta eficacia a baja
presioacuten
bull Puede usarse con muestras sucias sin ver una elevacioacuten anormal de la
presioacuten
bull Puede usarse en un meacutetodo USP sin comprometer los Criterios de Ajustes de
Meacutetodo
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Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 56
Soporte Teacutecnico Agilent
Teleacutefono de Atencioacuten al Cliente
901 11 68 90
email customercare_spainagilentcom
wwwagilentcomchem
![Page 10: Análisis de compuestos farmacéuticos en sangre total · PDF fileReducción en el procesamiento, el envío de la muestra, y los ... Gas flow: 10 L/min Nebulizer: 10 psi Sheath gas](https://reader031.vdocuments.site/reader031/viewer/2022030405/5a7a81727f8b9a0a668b45aa/html5/thumbnails/10.jpg)
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 10
Cromatograma LCndashMSndashMS de sangre fortificada
con 50 ngmL de estatinas despueacutes del DMS
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 11
Columna Poroshell 120 en la separacioacuten por HPLC
La columna Poroshell 120 ofrece velocidad y alta resolucioacuten
comparable a las columnas sub-2 μm de UHPLC
La tecnologia de partiacuteculas superficialmente genera
separaciones de alta eficacia a menores presiones
Se generaron presiones inferiores a 400 bares
La Poroshell 120 EC-C8 proporciona excelentes formas de
pico para todos los analitos
La atorvastatina puede ser facilmente detectada a 1 ngmL
con una SNR de 797
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 12
Cromatograma LCndashMSndashMS de atorvastatina en
sangre fortificada 1 ngmL
Condiciones LCndashMS
Columna Poroshell 120 EC-C8 27 μm 150 times 21 mm
(Part 693775-906)
Fase Movil
A 5 mM Formiato Amoacutenico B CH3CN
Flujo 200 μLmin
Gradiente
t0 A 70 B 30
t50 A 25 B 75
t55 A 25 B 75
t56 A 70 B 30
t80 A 70 B 30
Temperatura 30 degC
Presioacuten 394 bar
Tiempo anaacutelisis 8 min
Instrumento Agilent 1290 LC
6460 QQQ
Gas temp 275 degC
Gas flow 10 Lmin
Nebulizer 10 psi
Sheath gas temp 250 degC
Sheath gas flow 7 Lmin
Polarity Negative
1 ngmL con una SNR de 797
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 13
Curvas de calibracioacuten representativas de estatinas
en sangre fortificada
Linearidad en las curvas de calibracioacuten para seis niveles de
pravastatina y atorvastatina
Las curvas de Lovastatina y simvastatina no fueron lineales a
las maacutes altas concentraciones y rindieron regresioacuten cuadraacutetica
con coeficientes de correlacioacuten mejores de 0999
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 14
Recuperaciones de estatinas con tarjetas Bond
Elut DMS y tarjetas de celulosa (n = 3)
Los resultados indican que cuando se usan tarjetas de celulosa hay incremento
ionico dando lugar a altas recuperaciones artificiales
Estos datos corroboran que las tarjetas no celulosicas exhiben datos de desorcioacuten
de mejor calidad comparados con las tarjetas tradicionales de celulosa
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 15
Conclusiones
Meacutetodo simple y raacutepido para el anaacutelisis de un grupo de compuestos aciacutedicos en muestras de sangre humana con DMS y LCndashMSndashMS
El meacutetodo ha demostrado se exacto preciso y robusto
Buena linealidad para la pravastatina y atorvastatina usando una regresioacuten lineal con coeficientes de correlacioacuten mejores de 0998
Estas tarjetas ofrecen mejores propiedades de desorcioacuten comparadas con las tarjetas competitivas basadas en celulosa
La columna Poroshell 120 EC-C8 es una excelente eleccioacuten para las aplicaciones bioanaacuteliticas
La tecnologia de Gota de Sangre Seca (Dried blood spots) es una teacutecnica de recoleccioacuten de muestra para el anaacutelisis de faacutermacos en estudios cliacutenicos y precliacutenicos
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 16
Referencias
N Spooner R Lad M Barfield Anal Chem 2009 811557ndash
1563
M Barfield N Spooner R Lad S Parry S Fowles
J Chromatogr B 2008 870 32ndash37
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 17
bullTecnologiacutea Innovadora no-celulosa
bullProporciona un nuevo nivel de confianza en la recoleccioacuten de muestras
bullMejora significativa en la sensibilidad analiacutetica reproducibilidad y faacutecil uso
Anaacutelisis Dried Blood Spotting (DBS)
Desarrollado en colaboracioacuten con Compantildeiacuteas farmaceacuteuticas y CROs este
dispositivo elimina problemas actuales asociados a los sistemas de DBS que
hay en el mercado
bullMuestreo de Sangre plasma o suero (liacutequido sinoviallaacutegrimas bilis LCR) para
anaacutelisis bioanaliacuteticos en pruebas farmaceacuteuticas cliacutenicas y precliacutenicas en
empresasa farmaceacuteuticas de bioanaacutelisis (DMPK ADME y MetID) (no para
Diagnoacutestico cliacutenico)
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 18
La tarjeta sin celulosa es superior de forma medible a las tarjetas de papel de celulosa
Mejora la Sentildeal del MS
bullFormato libre de celulosa ha reducido el enlazado no especiacutefico y no contiene reactivos
quiacutemicos impregnados
Ventajas del Producto
Flujo de trabajo maacutes faacutecil
bull La extraccioacuten de la muestra de la tarjeta
requiere 5 veces menos fuerza que el
producto de celulosa
Proporciona excelente homogeneidad
de la mancha
bull Extracciones reproducibles
recuperaciones maacutes altas
independientemente del nivel de
hematocrito
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 19
bull El nivel de Hematocrito es el porcentaje del volumen de sangre ocupado por las ceacutelulas
rojas de la sangre
bull El material de muestreo Bond Elut DMS tiene una estructura de fibras
maacutes ordenadas comparado con la celulosa estaacutendard
Esta es la razoacuten de porqueacute Bond Elut DMS muestra mejor
reproducibilidad
Mejor Reproducibilidad
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 20
Bond Elut DBS Muestra Mejor Reproducibilidad
Bond Elut DMS tiene una desviacioacuten total de un 5 en todos los niveles HCT mientras que la
tarjeta de celulosa tiene una desviacioacuten de un 52 en todo el rango 10 veces de diferencia
Los datos abajo muestran la desviacioacuten de las medidas del CV desde niveles de HTC
normales (45) para tarjetas Bond Elut DMS y de celulosa (Whatman DMPK-C)
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 21
Ventajas Clave de la Teacutecnica DBS de Agilent
bull Una vez seca la muestra de sangre no supone peligro bioloacutegico alguno y se
puede transportar sin necesidad de sistemas de refrigeracioacuten costosos
bull Permite a los laboratorios centralizar los anaacutelisis de muestra perifeacutericas
bull Se requiere menos volumen de muestra (menor nordm de sujetos en el ensayo
menor nordm de repeticiones y eliminacioacuten de sujetos sateacutelite)
bull Permite la toma demuestra en serie del mismo sujeto
bull La recoleccioacuten de sangre es maacutes sencilla
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 22
Notas de Aplicacioacuten farmaceacuteuticas en Poroshell
120 and DMS Fast Analysis of Cefepime and Related Impurities on Poroshell 120 EC-C18 (publication 5990-7492EN) Comparing Selectivity Easy Transfer of Methods between Superficially Porous Agilent Poroshell 120 EC-C18 and totally Porous Agilent ZORBAX Eclipse Plus C18 (publication 5990-6588EN)
Analysis of Water Soluble Vitamins in Multivitamin Tablets Using Poroshell 120 EC-C18 (publication 5990-8107EN)
Analysis of Anthocyanins in Common Foods Using an Agilent Poroshell 120 SB-C18 (publication 5990-8249EN)
Analysis of Amitriptyline Fluoxetine Quetiapine and Sertraline Using Dried Plasma (publication 5990-8169EN)
Analysis of Amitriptyline Fluoxetine Quetiapine and Sertraline Using Dried Blood Spots (publication 5990-8168EN)
Investigation of Varying Blood Hematocrit Level in Dried Blood Spotting (publication 5990-8306EN)
Analysis of Cholesterol Lowering Drugs (Statins) Using Dried Matrix Spots Technology (publication 5990-8305EN)
Scalability of Agilent Columns Across HPLC and UHPLC Instruments (publication 5990-8428EN)
Converting a CHP Method for Insulin to Agilent Poroshell 120 Columns (publication 5990-9029EN)
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La propuesta QuEChERS para Determinar compuestos
Farmaceacuteuticos y Toxinas en Sangre Total
Anaacutelisis de Compuestos Farmaceacuteuticos en Sangre Total con
la columna Poroshell 120 Usando el meacutetodo Modificado
Mini-QuEChERS para la preparacioacuten de muestra
Nota de Aplicacioacuten5990-8789EN
httpwwwchemagilentcomLibraryapplications5990-8789ENpdf
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Introduccioacuten
Determinacioacuten de compuestos farmaceacuteuticos en anaacutelisis cliacutenicos y
foreacutensicos ADME (DMPK)
La preparacioacuten de muestra va desde la simple precipitacioacuten de
proteinas (PPT) a la maacutes compleja extraccioacuten en fase soacutelida (SPE)
Habitualmente la SPE ha ocupado este vaciacuteo pero simpre hay
espacio para teacutecnicas de preparacioacuten de muestras que son raacutepidas y
baratas de implementar
Se describe un procedimiento mini-QuEChERS modificado con
analisis LCndashMS-MS para la determinacioacuten de faacutermacos en sangre
total
Se analizan nueve diferentes faacutermacos (lidocaina tramadol
amitriptilina biperidina oxazepam lorazepam clorpromazina
diltiazem y naloxona)
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 25
Compuestos farmaceacuteuticos usados en el estudio
Compuesto Nuacutemero CAS Log P (ow) pKa Uso
terapeacuteutico
Lidocaina 137-58-6 24 801 Anesteacutesico local
antiarrithmico
Tramadol 27203-92-5 25 941 Analgesico
Amitriptilina 50-48-6 492 94 Antidepresivo
Biperidena 514-65-8 40 108 Anticolinergico
Oxazepam 604-75-1 223 17 113 Antianxiedad
Lorazepam 846-49-1 247 13 115 Antidepresivo
Clorpromazina 50-53-3 518 93 Antipsycoacutetico
Diltiazem 42399-41-7 363 77 Bloqueante de los
canales del calcio
Naloxona 465-65-6 145 79 Antagonista de los
receptores de opio
Nortriptilina (IS) 72-69-5 565 97
5 ugmL de solucioacuten (9 compuestos) y estandar interno en metanol
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La Teacutecnica de QuEChERS aplicada a las muestras
de sangre
La sangre es el maacutes complejo de los fluidos bioloacutegicos
La determinacioacuten de faacutermacos en sangre total es a menudo necesaria en los
anaacutelisis foreacutensicos dada la dificultad de obtener suero o plasma
Los procedimientos convencionales para analizar faacutermacos en matrices
complejas como la sangre total son complicados
QuEChERS es una teacutecnica de preparacioacuten de muestra que fue desarrollada
para la extraccioacuten de residuos de plaguicidas multi-clase de frutas y vegetales
en 2003
A pesar de que los fluidos bioloacutegicos pueden parecer muy diferentes a una
pieza de fruta sin embargo siguen caminos paralelos
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 27
Caminos paralelos en la preparacioacuten de muestra
Fluidos Bioloacutegicos
Matrices complejas
Rotura de la arquitectura celular
bull Lisis agitacioacuten solvente orgaacutenico
hidroacutelisis
Analitos con un amplio rango de
polaridades
Retirar analito o matriz
Anaacutelisis por LCMSMS GCMS o
GCMSMS
Frutas y Vegetales
Matrices complejas
Rotura de la arquitectura celular
bull Trituracioacuten agitacioacuten solvente
orgaacutenico hidroacutelisis
Analitos con un amplio rango de
polaridades
Retirar analito o matriz
Anaacutelisis por LCMSMS GCMS o
GCMSMS
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Procedimiento baacutesico por SPE para muestras de sangre
El pretratamiento de la sangre total implica la dilucioacuten con una
solucioacuten aacutecida un tampoacuten fosfato o aguaFA
Sonicar 15 minutos rotura de membranas celulares
Centrifugacioacuten
bull Procedimiento de SPE
ndash Acondicionado del cartucho metanol agua
ndash Carga del cartucho muestra
ndash Lavado del cartucho agua con metanol o tampoacuten metanol
ndash Elucioacuten del cartucho eluyente para el anaacutelisis
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 29
Procedimiento Baacutesico QuEChERS
15 g muestra homogeneizada (fortificada)
Antildeadir 15 mL ACN (1 AA) vortex
Antildeadir Sales de Extraccioacuten AOAC agitar
Centrifugar
Transferir 1 u 8 mL a un tubo d-SPE AOAC vortex centrifugar
Transferir al vial de Anaacutelisis
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 30
Ventajas y desventajas del Procedimiento QuEChERS
Ventajas
Extraccioacuten tipo liacutequidoliacutequido
Uso de aacutecido para interrumpir el ligado de proteinas
Exceso de sal para lisar los componentes celulares
Uso de acetonitrilo para facilitar la precipitacioacuten proteacuteica
Uso de SPE dispersiva para adsorber las interferencias de la matriz
Plossl etat J Chrom A 1135 (2006) 19-26
Desventajas
La cantidad de solvente y de muestra requeridos en el meacutetodo no
son ldquobioloacutegicamente adecuadosrdquo
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Propoacutesito de la propuesta mini-Q
Ofrecer un enfoque maacutes adecuado biologicamente
Requirimientos de menores volumenes y tamantildeos de
muestra
Rango de faacutermacos varias polaridades y pKa
Evaluaciacuteoacuten de las interferencias de fondo
Extraccioacuten y datos de recuperacioacuten en un rango
aceptable
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Faacutermacos en sangre Procedimiento mini-QuEChERS
mini-Q
Procedimiento
1 Antildeadir 2 homogeneizadores ceraacutemicos
2 Antildeadir 1 o 2 mL de sangre entera a un tubo de centriacutefuga con tapoacuten de rosca
3 Antildeadir estandar interno vortex
4 Antildeadir 2 mL de ACN acidificado ( 04 FA) vortex 30 seg
5 Antildeadir 500 mg de sales de extraccioacuten agitar vigorsamente 1 minuto centrifugar 5000 rpm 1 min
6 Transferir 1 mL del extraccto al material de d-SPE en tubo de centrifuga vortex centrifugar
7 Antildeadir 200 uL a 800 uL de agua en un vial LC vortex y analizar
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Refinamiento del Procedimiento mini-Q
Paraacutemetros evaluados en la teacutecnica mini-Q
Muestra de sangre total
bull La matriz bioloacutegica maacutes complicada
Adicioacuten de aacutecido tipo y cantidad
bull Efecto en la particioacuten y extraccioacuten
Adicioacuten de las sales de QuEChERS no-tamponadas o
tamponadas con NaAcetato o Citrato
bull Efecto en el extracto inspeccioacuten visual
SPE Dispersiva
bull Limpieza de la matriz y recuperaciones de los compuestos
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 34
Conclusiones del estudio
El ACN con 4 de FA como solvente de extraccioacuten muestra
una lisis maacutes completa de la muestra frente a otros solventes
de extraccioacuten que mostraron una masa soacutelida
Las sales tamponadas AOAC de acetato Soacutedico generan el
extracto maacutes liacutempio y fueron elegidas para la d-SPE
El paso de dSPE no ofrece un clean up adicional para los
meacutetodos de extraccioacuten con sales EN y no tamponadas
principalmente
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Datos de Adquisicoacuten LCMSMS
Compuestos Canales MRM
(mz) Fragmentador
(V) CE (V) RT (min) Delta RT
Lidocaina 1) 23518 gt 861
2) 23518 gt 581
97 11
35
137 04
Tramadol 1) 2642 gt 581
2) 2642 gt 2461
97 15
3
120 04
Amitriptilina 1) 2782 gt 117
2) 2782 gt 105
112 19
19
425 04
Biperidena 1)31223 gt 981
2) 31223 gt 551
123 19
60
423 07
Oxazepam 1) 28706 gt 2409
2) 28706 gt 2689
112 19
7
399 04
Lorazepam 1) 32102 gt 2749
2) 32102 gt 3029
113 15
7
409 04
Clorpromazina 1) 31911 gt 861
2) 31911 gt 581
112 15
43
463 04
Diltiazem 1) 41517 gt 1779
2) 41517 gt 1499
128 19
43
373 04
Naloxona 1) 32816 gt 310
2) 32816 gt 212
123 15
39
082 04
Nortriptilina (IS) 1) 26418 gt 233
2) 26418 gt 91
97 7
19
417 04
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045
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05
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055
0575
06
0625
065
0675
07
0725
075
0775
08
0825
085
0875
09
0925
095
0975
1
1025
105
1075
11
1125
115
1175
12
1225
125
1275
13
1325
135
1375
+ESI TIC Scan Frag=800V AOAC_BLANK_110228bd
1 1
Counts vs Acquisition Time (min)
05 1 15 2 25
3 35 4 45 5 55 6 65 7 75 8 85 9 95 10
Columna Poroshell 120 EC-C18 27
micro 21 x 100 mm PN 695775-902
Fase Moacutevil
A 5 mM Acetato Amoacutenico pH 5
2080 MeOHagua
B 5 mM Acetato amoacutencio en ACN
Flujo 04mLmin
Inyeccioacuten 10uL
GT (ordmC) 300
GF (lmin) 7
Nebulizador (psi) 40
SGT (ordmC) 400
SFG (lmin) 12
Capilar (V) 3500
NV (V) 500
Condiciones LCMS
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4
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48
49
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51
+ESI MRM Frag=1120V CID190 (2782000 -gt 1170000) HQC_6d
1 1
Counts vs Acquisition Time (min) 01 02 03 04 05 06 07 08 09 1 11 12 13 14 15 16 17 18 19 2 21 22 23 24 25 26 27 28 29 3 31 32 33 34 35 36 37 38 39 4 41 42 43 44 45 46
Nalo
xo
ne
Lid
oc
ain
e
Tra
mad
ol
Oxazep
am
Lo
razep
am
Bip
eri
de
n
Am
itri
pty
lin
e
Dil
tiazem
Ch
lorp
rom
azin
e
No
rtri
pty
lin
e (
IS)
Cromatograma LCMSMS de 10 ngmL de sangre total fortificada despueacutes
de extraccioacuten mini-QuEChERS AOAC (NaAc) y d-SPE (50mg PSA y
150mg MgSO4)
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19
2
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22
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25
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3
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39
4
41
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46
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48
49
5
51
+ESI MRM Frag=1120V CID190 (2782000 -gt 1170000) HQC_6d
1 1
Counts vs Acquisition Time (min) 01 02 03 04 05 06 07 08 09 1 11 12 13 14 15 16 17 18 19 2 21 22 23 24 25 26 27 28 29 3 31 32 33 34 35 36 37 38 39 4 41 42 43 44 45 46
1 x10
415 42 425 43 435 44 445 45 455 46 465 47 475 48 485 49 495 5
505 51 515 52 525 53 535 54 545 55 555 56 565 57
+ESI MRM Frag=1120V CID190 (2871000 -gt 2409000) RE_L_1d 1
Counts vs Acquisition Time (min) 305 31 315 32 325 33 335 34 345 35 355 36 365 37 375 38 385 39 395 4 405 41 415 42 425 43 435 44 445 45 455 46 465 47 475
Relacioacuten sentildealruido para el Oxazepam y Lorazepam a
10 ngmL (10 ppb)
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 39
La Naloxone muestra esta curva de linealidad de10-250 ngmL (ppb) con una R2
= 0991
Las curvas de calibracioacuten se generaron con la respuestra relativa (area pico
analitoarea pico IS) frente a la concentracioacuten relativa (concentracion de
analitoconcentracioacuten de IS)
Ejemplo de curva de linealidad para Naloxona extraido
con mini-QuEChERS
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 40
Recuperacioacuten y Reproducibilidad
Compuesto 50 ngmL Spiked
Recuperacioacuten RSD
100 ngmL Spiked
Recuperacioacuten RSD
Lidocaine 987 157 100 118
Tramadol 105 30 104 82
Amitriptyline 104 21 104 82
Biperidene 97 45 99 82
Oxazepam 770 92 78 86
Lorazepam 819 68 818 86
Chlorpromazine 110 103 105 63
Diltiazem 881 27 917 83
Naloxone 806 90 755 77
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 41
Conclusioacutenes y trabajo posterior
El meacutetodo mini-QuEChERS para la extraccioacuten de compuestos farmaceacuteuticos en
sangre total ofrece una alternativa a otras teacutecnicas de preparacioacuten de muestras
La preparacioacuten de muestras mini-QuEChERS es un enfoque simple facil y
barato que requiere una miacutenima experiencia en preparacioacuten de muestras y
miacutenimo equipamiento
Es un punto de partida para ampliar el numero y las clasificaciones evaluadas
en otras matrices bioloacutegicas y en sangre postmortem
El trabajo futuro incluira combinaciones adecuadas tanto de las sales de
extraccioacuten como de los sorbentes de d-SPE por el meacutetodo mini-QuEChERS
La columna Poroshell 120 ofrece una selectividad diferente y excelentes formas
de pico a lo largo del amplio rango de compuestos farmaceacuteuticos usados en este
estudio
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 42
Referencias
(1) M Anastassiades SJ Lehotay D Štajnbaher and FJ Schenk J AOAC Int 86 4121 (2003)
(2) G Stubbings and T Bigwood Anal Chim Acta 637 68 (2009)
(3) RR Rasmussen IMLD Storm PZH Rasmussen J Smedsgaard and KF Nielsen Anal Bioanal Chem 397 765 (2010)
(4) D Smith and K Lynam GCμECD analysis and confirmation of PCBs in fish tissue with Agilent JampW DB-35ms and DB-XLB GC columns Agilent Technologies 5990-6236EN (2010)
(5) F Ploumlssl M Giera and F Bracher J Chrom A 1135 19 (2006)
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 43
MEJORAR LA PRODUCTIVIDAD EN
HPLC ESTAacuteNDAR CON COLUMNAS
POROSHELL
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Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 44
Columnas Poroshell 120 para HPLC y UHPLC
bull 80-90 de eficacia de las sub 2um
bull A presiones un ~40-50 maacutes bajas
bull Con un tamantildeo de partiacutecula de 27um
bull Con una frita de entrada de 2um
bull Con el doble de resolucioacuten de una
columna de 35um
bull Con un liacutemite de presioacuten de 600 bar
bull La partiacutecula tiene un nuacutecleo soacutelido
(17um) y una cubierta exterior porosa
de 05um como zona de difusioacuten
Las Columnas Poroshell 120 tienen
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Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 45
Poroshell 120 proporciona Eficacia Suficiente
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Flujo 0582 mLmin AcetonitriloAgua (6040)
Volumen de Inyeccioacuten 4 microL
TCC 26 oC
DAD Sig=2544nm Ref=360100nm
Muestra Muestra de test RRLC
(PN 5188-6529) inoculada con
50 microL 2 mgmL Tiourea en
aguaacetonitrilo (6535)
25 5 75 10
mAU
0
200
400
600
06
46
0
82
6
11
48
15
18
20
16
2
22
3
28
16
41
32
62
73
97
53
larr N = 25053 Presioacuten = 182 bar
Poroshell 120 EC-C18 30 x 100 mm 27 um
min 25 5 75 10 125
mAU
0
200
400
600
06
49
0
86
5
12
75
17
56
24
18
27
05
34
94
52
81
82
18
13
04
1
larr N = 27295 Presioacuten = 386 bar
Eclipse Plus C18 30 x 100 mm 18 um
gt90 de la Eficacia de una 18um
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 46
iquestEn queacute tipos de instrumentos puede usar
Columnas Poroshell 120 HPLCrsquos y UHPLCrsquos
Consideraciones en UHPLC
bull Las columnas Poroshell 120 tienen un liacutemite de presioacuten de 600 bar
bull Los UHPLC estaacuten ajustados para columnas de bajo volumen por lo tanto las
Poroshell pueden usarse en todos los UHPLC
Consideraciones en HPLC
bull Las Columnas Poroshell 120 trabajan bien por debajo de 400 bar
bull Minimize los volumenes extra columna para las columnas 21 y 30mm ID ndash
siga las instrucciones dadas para las columnas RRHT (18um 600 bar)
bull Use en el detector velocidades adecuadas de adquisicioacuten para picos
estrechos de alta eficacia
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Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 47
Con una frita de 2 um Poroshell 120 no se bloquea
Muestras Complejas- Plasma
Diflusinal in Plasma
0
20
40
60
80
100
120
140
160
180
200
220
240
260
280
300
320
340
360
380
400
1 501 1001 1501 2001 2501
Injections
Pre
ssu
re
0
20000
40000
60000
80000
100000
120000
140000
160000
180000
200000
Eff
icie
ncy (
N)
End Press
Plates
Columna Poroshell 120 EC-C18 30 x 50mm 27um LC Agilent 1200 RRLC (SL)
Muestra Plasma Precipitado 2 partes Plasma 7 Partes 2080 Agua-MeCN w01 Aacutecido Foacutermico con 1 Parte de Diflusinal en
5050 Agua-MeCN 10 ugml (Concentracion Final Diflusinal 1 ugml) Agitado y dejado reposar 10 minutos
No Centrifugado No Filtrado
Volumen de Inyeccioacuten 1ul
Solvente A Agua w01 TFA
Solvente B MeCN w008 TFA
Flujo 1 mlmin 1 ul inyeccioacuten
Tiempo B
0 20
05 90
06 90
11 20
25 20
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Diflusinal es un anti-inflamatorio no esteroidal anaacutelogo
a la aspirina desarrollado por Merck Sharp amp Dohme
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Las Columnas Superficialmente Porosas Pueden
Usarse cumpliendo los Requirimientos USP
De la lista USP de empaquetamientos de columnas LC 42009
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Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 49
Criterios de Ajuste de Meacutetodos USP y FDA Criterios de Ajuste de Meacutetodos de Dimensiones de Columna
Paraacutemetro Especificaciones Maacuteximas ComentariosEjemplos
Longitud de Columna 70 250mm 75mm
150mm 50mm
Diaacutemetro Interno de
Columna
25 (FDA ORA-LAB 545)
USP ndash 25 ID Columna puede ajustarse si la
velocidad lineal es constante
46 mm 30 mm (-35)
46 mm 21 mm (-54)
30 mm 21 mm (-30)
Flow Rate 50
Volumen de Inyeccioacuten
Reducir tanto como se necesitendash
debe cumplir los liacutemites de
deteccioacuten y precisioacuten
Si cambia a una columna maacutes
corta haga el cambio apropiado
en el volumen de inyeccioacuten
Tamantildeo de Partiacutecula Reducir hasta el 50
(no se puede aumentar)
Puede cambiar la longitud de columna y el
tamantildeo de partiacutecula para mantener la misma
Rs
5um 35um (-30)
5um 27um (-46) Cambiado en 22409 ndash Para la copia oficial y actual ir a
httpwwwfdagovScienceResearchFieldSciencedefaulthtm
USP 30 Second Supplement Revisions PF34(5) en proceso
Ver ldquo Stimuli articlerdquo en Pharmacopeial Forum 2009 35(6)
Page 49
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 50
Comparacioacuten de 46 x 250 mm 5 um con Poroshell
120 EC-C18 46 x 100 mm 27um
min 5 10 15 20 25 30
mAU
0
20
40
60
80
100
97
12
111
16
115
96
126
74
152
48
161
51
164
35
206
87
230
76
292
90
min 5 10 15 20 25 30
mAU
0
50
100
150
200
250
17
19
21
89
23
11
26
06
38
67
44
37 45
58
54
50
59
20
70
37
Anaacutelisis maacutes raacutepido(columna maacutes corta flujo maacutes alto)
Mayor sensibilidad(partiacutecula maacutes pequentildeapico maacutes estrecho)
Maacutes optimizado (un anaacutelisis maacutes raacutepido permite ajustar mejor)
Ambos anaacutelisis en Agilent 1100 G1315B DAD (bajo 400 bar)
No se requiere cambio en la preparacioacuten de muestra frita de entrada
de 2 micras en ambas columnas
325 bar
110 bar
Sulfadiazina
Sulfatiazol
Sulfapiridina
Sulfamerazina
Sulfametazina
Sulfametazol
Sulfametoxipiridazina
Sulfacloropiridazina
Sulfametoxazol
Sulfadimetoxina
Tiempo B
0 8
33 33
34 33
Columna Eclipse Plus C18
46 x 250mm 5um
Flujo 1 mLmin
Fase Moacutevil
A 01 Aacutecido Foacutermico en Agua
B 01 Aacutecido Foacutermico en ACN
Tiempo B
0 8
12 33
132 33
Columna 46 x 100mm
Poroshell 120 EC-C18
27um
Flujo 185 mLmin
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Comparacioacuten de 46 x 250 mm 5 um con Poroshell
120 EC-C18 46 x 100 mm 27um
min 5 10 15 20 25 30
mAU
0
20
40
60
80
100
97
12
111
16
115
96
126
74
152
48
161
51
164
35
206
87
230
76
292
90
110 bar
5
mAU
0
50
100
150
200
250
17
19
21
89
23
11
26
06
38
67
44
37 45
58
54
50
59
20
70
37
325 bar
min
Ver condiciones en diapositiva anterior
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Mejor Resolucioacuten
linea base
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 52
Anaacutelisis maacutes raacutepido del meacutetodo USP para pastillas de
Simvastatina en Columnas Poroshell 120ndash Ajuste del meacutetodo
46 x 250 mm 5-um
Agilent ZORBAX Eclipse Plus C18
46 x 75 mm 27-um
Agilent Poroshell 120 EC-C18
65 CH3CN 35 39 gL NaH2PO4 (pH 45) 45 oC Sig = 238 8 Ref = 360 100 nm
Flujos 15 mLmin para la columna de 5-um 28 mLmin para la columna Poroshell 120 27um
Requerimiento
USP
5-um
(15 mLmin)
27-um
(28 mLmin)
TR na 9907 1457
krsquo gt 30 5962 5122
N gt 4500 16939 14439
Tf lt 20 109 110
min 2 4 6 8 10
mAU
0
5
10
15
20
25
30
35
40
min 2
mAU
0
5
10
15
20
25
30
35
40
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Ajustes de los parametros cromatograficos en la
transferencia de meacutetodos Escalado del volume de inyeccioacuten
v1 x [(r22 x L2)(r1
2 x L1)] = V2
O bien
v2 = V1 x [(d22 x L2)(d1
2 x L1)]
v volume de inyeccioacuten
r radio de la columna
L longitud de la columna
Ajuste del flujo
F2= F1 x (L2L1 ) x (r2r1 )2
L longitud de la columna
F Flujo
r radio de la columna
Ajuste de la longitud del gradiente
En funcioacuten de la longitud de la columna
L2L1= tg2tg1
En funcioacuten del volumen muerto de columna y del flujo
tG2= tG1 x (V2V1) x (F1F2) t tiempos de gradiente
V volumen muerto de columna
F flujo
Columna ID Volumen muerto aprox
por mm longitud
46mm 100uL
30mm 425uL
21mm 208uL
10mm 047uL
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 54
Notas de Aplicacioacuten en Poroshell 120 y QuEChERS
Determination of Hormones in Shrimp by Agilent 1290 Infinity LC with
Agilent Poroshell 120 LC Column and Agilent QuEChERS for Sample
Preparation (publication 5990-6589EN)
Analysis of Pesticide Residues in Green Tea Using Agilent SampliQ
QuEChERS EN Kit by LCMSMS Detection (publication 5990-
6400EN)
Analysis of Pesticide Residues in Rice Using Agilent Bond Elut
QuEChERS AOAC Kit (publication 5990-8034EN)
Poroshell 120 for pharmaceutical analysis
Poroshell 120 Resources
QuEChERS Applications
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 55
Sumario
bull La columna Poroshell 120 es una nueva alternativa para LC de Alta
Resolucioacuten y Alta Velocidad que puede usarse en cualquier HPLC o UHPLC
bull Con la Poroshell 120 se pueden lograr separaciones de alta eficacia a baja
presioacuten
bull Puede usarse con muestras sucias sin ver una elevacioacuten anormal de la
presioacuten
bull Puede usarse en un meacutetodo USP sin comprometer los Criterios de Ajustes de
Meacutetodo
Page 55
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 56
Soporte Teacutecnico Agilent
Teleacutefono de Atencioacuten al Cliente
901 11 68 90
email customercare_spainagilentcom
wwwagilentcomchem
![Page 11: Análisis de compuestos farmacéuticos en sangre total · PDF fileReducción en el procesamiento, el envío de la muestra, y los ... Gas flow: 10 L/min Nebulizer: 10 psi Sheath gas](https://reader031.vdocuments.site/reader031/viewer/2022030405/5a7a81727f8b9a0a668b45aa/html5/thumbnails/11.jpg)
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 11
Columna Poroshell 120 en la separacioacuten por HPLC
La columna Poroshell 120 ofrece velocidad y alta resolucioacuten
comparable a las columnas sub-2 μm de UHPLC
La tecnologia de partiacuteculas superficialmente genera
separaciones de alta eficacia a menores presiones
Se generaron presiones inferiores a 400 bares
La Poroshell 120 EC-C8 proporciona excelentes formas de
pico para todos los analitos
La atorvastatina puede ser facilmente detectada a 1 ngmL
con una SNR de 797
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 12
Cromatograma LCndashMSndashMS de atorvastatina en
sangre fortificada 1 ngmL
Condiciones LCndashMS
Columna Poroshell 120 EC-C8 27 μm 150 times 21 mm
(Part 693775-906)
Fase Movil
A 5 mM Formiato Amoacutenico B CH3CN
Flujo 200 μLmin
Gradiente
t0 A 70 B 30
t50 A 25 B 75
t55 A 25 B 75
t56 A 70 B 30
t80 A 70 B 30
Temperatura 30 degC
Presioacuten 394 bar
Tiempo anaacutelisis 8 min
Instrumento Agilent 1290 LC
6460 QQQ
Gas temp 275 degC
Gas flow 10 Lmin
Nebulizer 10 psi
Sheath gas temp 250 degC
Sheath gas flow 7 Lmin
Polarity Negative
1 ngmL con una SNR de 797
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 13
Curvas de calibracioacuten representativas de estatinas
en sangre fortificada
Linearidad en las curvas de calibracioacuten para seis niveles de
pravastatina y atorvastatina
Las curvas de Lovastatina y simvastatina no fueron lineales a
las maacutes altas concentraciones y rindieron regresioacuten cuadraacutetica
con coeficientes de correlacioacuten mejores de 0999
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 14
Recuperaciones de estatinas con tarjetas Bond
Elut DMS y tarjetas de celulosa (n = 3)
Los resultados indican que cuando se usan tarjetas de celulosa hay incremento
ionico dando lugar a altas recuperaciones artificiales
Estos datos corroboran que las tarjetas no celulosicas exhiben datos de desorcioacuten
de mejor calidad comparados con las tarjetas tradicionales de celulosa
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 15
Conclusiones
Meacutetodo simple y raacutepido para el anaacutelisis de un grupo de compuestos aciacutedicos en muestras de sangre humana con DMS y LCndashMSndashMS
El meacutetodo ha demostrado se exacto preciso y robusto
Buena linealidad para la pravastatina y atorvastatina usando una regresioacuten lineal con coeficientes de correlacioacuten mejores de 0998
Estas tarjetas ofrecen mejores propiedades de desorcioacuten comparadas con las tarjetas competitivas basadas en celulosa
La columna Poroshell 120 EC-C8 es una excelente eleccioacuten para las aplicaciones bioanaacuteliticas
La tecnologia de Gota de Sangre Seca (Dried blood spots) es una teacutecnica de recoleccioacuten de muestra para el anaacutelisis de faacutermacos en estudios cliacutenicos y precliacutenicos
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 16
Referencias
N Spooner R Lad M Barfield Anal Chem 2009 811557ndash
1563
M Barfield N Spooner R Lad S Parry S Fowles
J Chromatogr B 2008 870 32ndash37
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 17
bullTecnologiacutea Innovadora no-celulosa
bullProporciona un nuevo nivel de confianza en la recoleccioacuten de muestras
bullMejora significativa en la sensibilidad analiacutetica reproducibilidad y faacutecil uso
Anaacutelisis Dried Blood Spotting (DBS)
Desarrollado en colaboracioacuten con Compantildeiacuteas farmaceacuteuticas y CROs este
dispositivo elimina problemas actuales asociados a los sistemas de DBS que
hay en el mercado
bullMuestreo de Sangre plasma o suero (liacutequido sinoviallaacutegrimas bilis LCR) para
anaacutelisis bioanaliacuteticos en pruebas farmaceacuteuticas cliacutenicas y precliacutenicas en
empresasa farmaceacuteuticas de bioanaacutelisis (DMPK ADME y MetID) (no para
Diagnoacutestico cliacutenico)
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 18
La tarjeta sin celulosa es superior de forma medible a las tarjetas de papel de celulosa
Mejora la Sentildeal del MS
bullFormato libre de celulosa ha reducido el enlazado no especiacutefico y no contiene reactivos
quiacutemicos impregnados
Ventajas del Producto
Flujo de trabajo maacutes faacutecil
bull La extraccioacuten de la muestra de la tarjeta
requiere 5 veces menos fuerza que el
producto de celulosa
Proporciona excelente homogeneidad
de la mancha
bull Extracciones reproducibles
recuperaciones maacutes altas
independientemente del nivel de
hematocrito
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 19
bull El nivel de Hematocrito es el porcentaje del volumen de sangre ocupado por las ceacutelulas
rojas de la sangre
bull El material de muestreo Bond Elut DMS tiene una estructura de fibras
maacutes ordenadas comparado con la celulosa estaacutendard
Esta es la razoacuten de porqueacute Bond Elut DMS muestra mejor
reproducibilidad
Mejor Reproducibilidad
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 20
Bond Elut DBS Muestra Mejor Reproducibilidad
Bond Elut DMS tiene una desviacioacuten total de un 5 en todos los niveles HCT mientras que la
tarjeta de celulosa tiene una desviacioacuten de un 52 en todo el rango 10 veces de diferencia
Los datos abajo muestran la desviacioacuten de las medidas del CV desde niveles de HTC
normales (45) para tarjetas Bond Elut DMS y de celulosa (Whatman DMPK-C)
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 21
Ventajas Clave de la Teacutecnica DBS de Agilent
bull Una vez seca la muestra de sangre no supone peligro bioloacutegico alguno y se
puede transportar sin necesidad de sistemas de refrigeracioacuten costosos
bull Permite a los laboratorios centralizar los anaacutelisis de muestra perifeacutericas
bull Se requiere menos volumen de muestra (menor nordm de sujetos en el ensayo
menor nordm de repeticiones y eliminacioacuten de sujetos sateacutelite)
bull Permite la toma demuestra en serie del mismo sujeto
bull La recoleccioacuten de sangre es maacutes sencilla
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 22
Notas de Aplicacioacuten farmaceacuteuticas en Poroshell
120 and DMS Fast Analysis of Cefepime and Related Impurities on Poroshell 120 EC-C18 (publication 5990-7492EN) Comparing Selectivity Easy Transfer of Methods between Superficially Porous Agilent Poroshell 120 EC-C18 and totally Porous Agilent ZORBAX Eclipse Plus C18 (publication 5990-6588EN)
Analysis of Water Soluble Vitamins in Multivitamin Tablets Using Poroshell 120 EC-C18 (publication 5990-8107EN)
Analysis of Anthocyanins in Common Foods Using an Agilent Poroshell 120 SB-C18 (publication 5990-8249EN)
Analysis of Amitriptyline Fluoxetine Quetiapine and Sertraline Using Dried Plasma (publication 5990-8169EN)
Analysis of Amitriptyline Fluoxetine Quetiapine and Sertraline Using Dried Blood Spots (publication 5990-8168EN)
Investigation of Varying Blood Hematocrit Level in Dried Blood Spotting (publication 5990-8306EN)
Analysis of Cholesterol Lowering Drugs (Statins) Using Dried Matrix Spots Technology (publication 5990-8305EN)
Scalability of Agilent Columns Across HPLC and UHPLC Instruments (publication 5990-8428EN)
Converting a CHP Method for Insulin to Agilent Poroshell 120 Columns (publication 5990-9029EN)
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 23
La propuesta QuEChERS para Determinar compuestos
Farmaceacuteuticos y Toxinas en Sangre Total
Anaacutelisis de Compuestos Farmaceacuteuticos en Sangre Total con
la columna Poroshell 120 Usando el meacutetodo Modificado
Mini-QuEChERS para la preparacioacuten de muestra
Nota de Aplicacioacuten5990-8789EN
httpwwwchemagilentcomLibraryapplications5990-8789ENpdf
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 24
Introduccioacuten
Determinacioacuten de compuestos farmaceacuteuticos en anaacutelisis cliacutenicos y
foreacutensicos ADME (DMPK)
La preparacioacuten de muestra va desde la simple precipitacioacuten de
proteinas (PPT) a la maacutes compleja extraccioacuten en fase soacutelida (SPE)
Habitualmente la SPE ha ocupado este vaciacuteo pero simpre hay
espacio para teacutecnicas de preparacioacuten de muestras que son raacutepidas y
baratas de implementar
Se describe un procedimiento mini-QuEChERS modificado con
analisis LCndashMS-MS para la determinacioacuten de faacutermacos en sangre
total
Se analizan nueve diferentes faacutermacos (lidocaina tramadol
amitriptilina biperidina oxazepam lorazepam clorpromazina
diltiazem y naloxona)
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 25
Compuestos farmaceacuteuticos usados en el estudio
Compuesto Nuacutemero CAS Log P (ow) pKa Uso
terapeacuteutico
Lidocaina 137-58-6 24 801 Anesteacutesico local
antiarrithmico
Tramadol 27203-92-5 25 941 Analgesico
Amitriptilina 50-48-6 492 94 Antidepresivo
Biperidena 514-65-8 40 108 Anticolinergico
Oxazepam 604-75-1 223 17 113 Antianxiedad
Lorazepam 846-49-1 247 13 115 Antidepresivo
Clorpromazina 50-53-3 518 93 Antipsycoacutetico
Diltiazem 42399-41-7 363 77 Bloqueante de los
canales del calcio
Naloxona 465-65-6 145 79 Antagonista de los
receptores de opio
Nortriptilina (IS) 72-69-5 565 97
5 ugmL de solucioacuten (9 compuestos) y estandar interno en metanol
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 26
La Teacutecnica de QuEChERS aplicada a las muestras
de sangre
La sangre es el maacutes complejo de los fluidos bioloacutegicos
La determinacioacuten de faacutermacos en sangre total es a menudo necesaria en los
anaacutelisis foreacutensicos dada la dificultad de obtener suero o plasma
Los procedimientos convencionales para analizar faacutermacos en matrices
complejas como la sangre total son complicados
QuEChERS es una teacutecnica de preparacioacuten de muestra que fue desarrollada
para la extraccioacuten de residuos de plaguicidas multi-clase de frutas y vegetales
en 2003
A pesar de que los fluidos bioloacutegicos pueden parecer muy diferentes a una
pieza de fruta sin embargo siguen caminos paralelos
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 27
Caminos paralelos en la preparacioacuten de muestra
Fluidos Bioloacutegicos
Matrices complejas
Rotura de la arquitectura celular
bull Lisis agitacioacuten solvente orgaacutenico
hidroacutelisis
Analitos con un amplio rango de
polaridades
Retirar analito o matriz
Anaacutelisis por LCMSMS GCMS o
GCMSMS
Frutas y Vegetales
Matrices complejas
Rotura de la arquitectura celular
bull Trituracioacuten agitacioacuten solvente
orgaacutenico hidroacutelisis
Analitos con un amplio rango de
polaridades
Retirar analito o matriz
Anaacutelisis por LCMSMS GCMS o
GCMSMS
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 28
Procedimiento baacutesico por SPE para muestras de sangre
El pretratamiento de la sangre total implica la dilucioacuten con una
solucioacuten aacutecida un tampoacuten fosfato o aguaFA
Sonicar 15 minutos rotura de membranas celulares
Centrifugacioacuten
bull Procedimiento de SPE
ndash Acondicionado del cartucho metanol agua
ndash Carga del cartucho muestra
ndash Lavado del cartucho agua con metanol o tampoacuten metanol
ndash Elucioacuten del cartucho eluyente para el anaacutelisis
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 29
Procedimiento Baacutesico QuEChERS
15 g muestra homogeneizada (fortificada)
Antildeadir 15 mL ACN (1 AA) vortex
Antildeadir Sales de Extraccioacuten AOAC agitar
Centrifugar
Transferir 1 u 8 mL a un tubo d-SPE AOAC vortex centrifugar
Transferir al vial de Anaacutelisis
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 30
Ventajas y desventajas del Procedimiento QuEChERS
Ventajas
Extraccioacuten tipo liacutequidoliacutequido
Uso de aacutecido para interrumpir el ligado de proteinas
Exceso de sal para lisar los componentes celulares
Uso de acetonitrilo para facilitar la precipitacioacuten proteacuteica
Uso de SPE dispersiva para adsorber las interferencias de la matriz
Plossl etat J Chrom A 1135 (2006) 19-26
Desventajas
La cantidad de solvente y de muestra requeridos en el meacutetodo no
son ldquobioloacutegicamente adecuadosrdquo
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 31
Propoacutesito de la propuesta mini-Q
Ofrecer un enfoque maacutes adecuado biologicamente
Requirimientos de menores volumenes y tamantildeos de
muestra
Rango de faacutermacos varias polaridades y pKa
Evaluaciacuteoacuten de las interferencias de fondo
Extraccioacuten y datos de recuperacioacuten en un rango
aceptable
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 32
Faacutermacos en sangre Procedimiento mini-QuEChERS
mini-Q
Procedimiento
1 Antildeadir 2 homogeneizadores ceraacutemicos
2 Antildeadir 1 o 2 mL de sangre entera a un tubo de centriacutefuga con tapoacuten de rosca
3 Antildeadir estandar interno vortex
4 Antildeadir 2 mL de ACN acidificado ( 04 FA) vortex 30 seg
5 Antildeadir 500 mg de sales de extraccioacuten agitar vigorsamente 1 minuto centrifugar 5000 rpm 1 min
6 Transferir 1 mL del extraccto al material de d-SPE en tubo de centrifuga vortex centrifugar
7 Antildeadir 200 uL a 800 uL de agua en un vial LC vortex y analizar
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 33
Refinamiento del Procedimiento mini-Q
Paraacutemetros evaluados en la teacutecnica mini-Q
Muestra de sangre total
bull La matriz bioloacutegica maacutes complicada
Adicioacuten de aacutecido tipo y cantidad
bull Efecto en la particioacuten y extraccioacuten
Adicioacuten de las sales de QuEChERS no-tamponadas o
tamponadas con NaAcetato o Citrato
bull Efecto en el extracto inspeccioacuten visual
SPE Dispersiva
bull Limpieza de la matriz y recuperaciones de los compuestos
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 34
Conclusiones del estudio
El ACN con 4 de FA como solvente de extraccioacuten muestra
una lisis maacutes completa de la muestra frente a otros solventes
de extraccioacuten que mostraron una masa soacutelida
Las sales tamponadas AOAC de acetato Soacutedico generan el
extracto maacutes liacutempio y fueron elegidas para la d-SPE
El paso de dSPE no ofrece un clean up adicional para los
meacutetodos de extraccioacuten con sales EN y no tamponadas
principalmente
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 35
Datos de Adquisicoacuten LCMSMS
Compuestos Canales MRM
(mz) Fragmentador
(V) CE (V) RT (min) Delta RT
Lidocaina 1) 23518 gt 861
2) 23518 gt 581
97 11
35
137 04
Tramadol 1) 2642 gt 581
2) 2642 gt 2461
97 15
3
120 04
Amitriptilina 1) 2782 gt 117
2) 2782 gt 105
112 19
19
425 04
Biperidena 1)31223 gt 981
2) 31223 gt 551
123 19
60
423 07
Oxazepam 1) 28706 gt 2409
2) 28706 gt 2689
112 19
7
399 04
Lorazepam 1) 32102 gt 2749
2) 32102 gt 3029
113 15
7
409 04
Clorpromazina 1) 31911 gt 861
2) 31911 gt 581
112 15
43
463 04
Diltiazem 1) 41517 gt 1779
2) 41517 gt 1499
128 19
43
373 04
Naloxona 1) 32816 gt 310
2) 32816 gt 212
123 15
39
082 04
Nortriptilina (IS) 1) 26418 gt 233
2) 26418 gt 91
97 7
19
417 04
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 36
7 x10
0125
015
0175
02
0225
025
0275
03
0325
035
0375
04
0425
045
0475
05
0525
055
0575
06
0625
065
0675
07
0725
075
0775
08
0825
085
0875
09
0925
095
0975
1
1025
105
1075
11
1125
115
1175
12
1225
125
1275
13
1325
135
1375
+ESI TIC Scan Frag=800V AOAC_BLANK_110228bd
1 1
Counts vs Acquisition Time (min)
05 1 15 2 25
3 35 4 45 5 55 6 65 7 75 8 85 9 95 10
Columna Poroshell 120 EC-C18 27
micro 21 x 100 mm PN 695775-902
Fase Moacutevil
A 5 mM Acetato Amoacutenico pH 5
2080 MeOHagua
B 5 mM Acetato amoacutencio en ACN
Flujo 04mLmin
Inyeccioacuten 10uL
GT (ordmC) 300
GF (lmin) 7
Nebulizador (psi) 40
SGT (ordmC) 400
SFG (lmin) 12
Capilar (V) 3500
NV (V) 500
Condiciones LCMS
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5
51
+ESI MRM Frag=1120V CID190 (2782000 -gt 1170000) HQC_6d
1 1
Counts vs Acquisition Time (min) 01 02 03 04 05 06 07 08 09 1 11 12 13 14 15 16 17 18 19 2 21 22 23 24 25 26 27 28 29 3 31 32 33 34 35 36 37 38 39 4 41 42 43 44 45 46
Nalo
xo
ne
Lid
oc
ain
e
Tra
mad
ol
Oxazep
am
Lo
razep
am
Bip
eri
de
n
Am
itri
pty
lin
e
Dil
tiazem
Ch
lorp
rom
azin
e
No
rtri
pty
lin
e (
IS)
Cromatograma LCMSMS de 10 ngmL de sangre total fortificada despueacutes
de extraccioacuten mini-QuEChERS AOAC (NaAc) y d-SPE (50mg PSA y
150mg MgSO4)
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+ESI MRM Frag=1120V CID190 (2782000 -gt 1170000) HQC_6d
1 1
Counts vs Acquisition Time (min) 01 02 03 04 05 06 07 08 09 1 11 12 13 14 15 16 17 18 19 2 21 22 23 24 25 26 27 28 29 3 31 32 33 34 35 36 37 38 39 4 41 42 43 44 45 46
1 x10
415 42 425 43 435 44 445 45 455 46 465 47 475 48 485 49 495 5
505 51 515 52 525 53 535 54 545 55 555 56 565 57
+ESI MRM Frag=1120V CID190 (2871000 -gt 2409000) RE_L_1d 1
Counts vs Acquisition Time (min) 305 31 315 32 325 33 335 34 345 35 355 36 365 37 375 38 385 39 395 4 405 41 415 42 425 43 435 44 445 45 455 46 465 47 475
Relacioacuten sentildealruido para el Oxazepam y Lorazepam a
10 ngmL (10 ppb)
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 39
La Naloxone muestra esta curva de linealidad de10-250 ngmL (ppb) con una R2
= 0991
Las curvas de calibracioacuten se generaron con la respuestra relativa (area pico
analitoarea pico IS) frente a la concentracioacuten relativa (concentracion de
analitoconcentracioacuten de IS)
Ejemplo de curva de linealidad para Naloxona extraido
con mini-QuEChERS
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 40
Recuperacioacuten y Reproducibilidad
Compuesto 50 ngmL Spiked
Recuperacioacuten RSD
100 ngmL Spiked
Recuperacioacuten RSD
Lidocaine 987 157 100 118
Tramadol 105 30 104 82
Amitriptyline 104 21 104 82
Biperidene 97 45 99 82
Oxazepam 770 92 78 86
Lorazepam 819 68 818 86
Chlorpromazine 110 103 105 63
Diltiazem 881 27 917 83
Naloxone 806 90 755 77
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 41
Conclusioacutenes y trabajo posterior
El meacutetodo mini-QuEChERS para la extraccioacuten de compuestos farmaceacuteuticos en
sangre total ofrece una alternativa a otras teacutecnicas de preparacioacuten de muestras
La preparacioacuten de muestras mini-QuEChERS es un enfoque simple facil y
barato que requiere una miacutenima experiencia en preparacioacuten de muestras y
miacutenimo equipamiento
Es un punto de partida para ampliar el numero y las clasificaciones evaluadas
en otras matrices bioloacutegicas y en sangre postmortem
El trabajo futuro incluira combinaciones adecuadas tanto de las sales de
extraccioacuten como de los sorbentes de d-SPE por el meacutetodo mini-QuEChERS
La columna Poroshell 120 ofrece una selectividad diferente y excelentes formas
de pico a lo largo del amplio rango de compuestos farmaceacuteuticos usados en este
estudio
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 42
Referencias
(1) M Anastassiades SJ Lehotay D Štajnbaher and FJ Schenk J AOAC Int 86 4121 (2003)
(2) G Stubbings and T Bigwood Anal Chim Acta 637 68 (2009)
(3) RR Rasmussen IMLD Storm PZH Rasmussen J Smedsgaard and KF Nielsen Anal Bioanal Chem 397 765 (2010)
(4) D Smith and K Lynam GCμECD analysis and confirmation of PCBs in fish tissue with Agilent JampW DB-35ms and DB-XLB GC columns Agilent Technologies 5990-6236EN (2010)
(5) F Ploumlssl M Giera and F Bracher J Chrom A 1135 19 (2006)
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 43
MEJORAR LA PRODUCTIVIDAD EN
HPLC ESTAacuteNDAR CON COLUMNAS
POROSHELL
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Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 44
Columnas Poroshell 120 para HPLC y UHPLC
bull 80-90 de eficacia de las sub 2um
bull A presiones un ~40-50 maacutes bajas
bull Con un tamantildeo de partiacutecula de 27um
bull Con una frita de entrada de 2um
bull Con el doble de resolucioacuten de una
columna de 35um
bull Con un liacutemite de presioacuten de 600 bar
bull La partiacutecula tiene un nuacutecleo soacutelido
(17um) y una cubierta exterior porosa
de 05um como zona de difusioacuten
Las Columnas Poroshell 120 tienen
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Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 45
Poroshell 120 proporciona Eficacia Suficiente
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Flujo 0582 mLmin AcetonitriloAgua (6040)
Volumen de Inyeccioacuten 4 microL
TCC 26 oC
DAD Sig=2544nm Ref=360100nm
Muestra Muestra de test RRLC
(PN 5188-6529) inoculada con
50 microL 2 mgmL Tiourea en
aguaacetonitrilo (6535)
25 5 75 10
mAU
0
200
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73
97
53
larr N = 25053 Presioacuten = 182 bar
Poroshell 120 EC-C18 30 x 100 mm 27 um
min 25 5 75 10 125
mAU
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82
18
13
04
1
larr N = 27295 Presioacuten = 386 bar
Eclipse Plus C18 30 x 100 mm 18 um
gt90 de la Eficacia de una 18um
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 46
iquestEn queacute tipos de instrumentos puede usar
Columnas Poroshell 120 HPLCrsquos y UHPLCrsquos
Consideraciones en UHPLC
bull Las columnas Poroshell 120 tienen un liacutemite de presioacuten de 600 bar
bull Los UHPLC estaacuten ajustados para columnas de bajo volumen por lo tanto las
Poroshell pueden usarse en todos los UHPLC
Consideraciones en HPLC
bull Las Columnas Poroshell 120 trabajan bien por debajo de 400 bar
bull Minimize los volumenes extra columna para las columnas 21 y 30mm ID ndash
siga las instrucciones dadas para las columnas RRHT (18um 600 bar)
bull Use en el detector velocidades adecuadas de adquisicioacuten para picos
estrechos de alta eficacia
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Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 47
Con una frita de 2 um Poroshell 120 no se bloquea
Muestras Complejas- Plasma
Diflusinal in Plasma
0
20
40
60
80
100
120
140
160
180
200
220
240
260
280
300
320
340
360
380
400
1 501 1001 1501 2001 2501
Injections
Pre
ssu
re
0
20000
40000
60000
80000
100000
120000
140000
160000
180000
200000
Eff
icie
ncy (
N)
End Press
Plates
Columna Poroshell 120 EC-C18 30 x 50mm 27um LC Agilent 1200 RRLC (SL)
Muestra Plasma Precipitado 2 partes Plasma 7 Partes 2080 Agua-MeCN w01 Aacutecido Foacutermico con 1 Parte de Diflusinal en
5050 Agua-MeCN 10 ugml (Concentracion Final Diflusinal 1 ugml) Agitado y dejado reposar 10 minutos
No Centrifugado No Filtrado
Volumen de Inyeccioacuten 1ul
Solvente A Agua w01 TFA
Solvente B MeCN w008 TFA
Flujo 1 mlmin 1 ul inyeccioacuten
Tiempo B
0 20
05 90
06 90
11 20
25 20
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Diflusinal es un anti-inflamatorio no esteroidal anaacutelogo
a la aspirina desarrollado por Merck Sharp amp Dohme
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 48
Las Columnas Superficialmente Porosas Pueden
Usarse cumpliendo los Requirimientos USP
De la lista USP de empaquetamientos de columnas LC 42009
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Criterios de Ajuste de Meacutetodos USP y FDA Criterios de Ajuste de Meacutetodos de Dimensiones de Columna
Paraacutemetro Especificaciones Maacuteximas ComentariosEjemplos
Longitud de Columna 70 250mm 75mm
150mm 50mm
Diaacutemetro Interno de
Columna
25 (FDA ORA-LAB 545)
USP ndash 25 ID Columna puede ajustarse si la
velocidad lineal es constante
46 mm 30 mm (-35)
46 mm 21 mm (-54)
30 mm 21 mm (-30)
Flow Rate 50
Volumen de Inyeccioacuten
Reducir tanto como se necesitendash
debe cumplir los liacutemites de
deteccioacuten y precisioacuten
Si cambia a una columna maacutes
corta haga el cambio apropiado
en el volumen de inyeccioacuten
Tamantildeo de Partiacutecula Reducir hasta el 50
(no se puede aumentar)
Puede cambiar la longitud de columna y el
tamantildeo de partiacutecula para mantener la misma
Rs
5um 35um (-30)
5um 27um (-46) Cambiado en 22409 ndash Para la copia oficial y actual ir a
httpwwwfdagovScienceResearchFieldSciencedefaulthtm
USP 30 Second Supplement Revisions PF34(5) en proceso
Ver ldquo Stimuli articlerdquo en Pharmacopeial Forum 2009 35(6)
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Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 50
Comparacioacuten de 46 x 250 mm 5 um con Poroshell
120 EC-C18 46 x 100 mm 27um
min 5 10 15 20 25 30
mAU
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230
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90
min 5 10 15 20 25 30
mAU
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50
100
150
200
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17
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11
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37 45
58
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59
20
70
37
Anaacutelisis maacutes raacutepido(columna maacutes corta flujo maacutes alto)
Mayor sensibilidad(partiacutecula maacutes pequentildeapico maacutes estrecho)
Maacutes optimizado (un anaacutelisis maacutes raacutepido permite ajustar mejor)
Ambos anaacutelisis en Agilent 1100 G1315B DAD (bajo 400 bar)
No se requiere cambio en la preparacioacuten de muestra frita de entrada
de 2 micras en ambas columnas
325 bar
110 bar
Sulfadiazina
Sulfatiazol
Sulfapiridina
Sulfamerazina
Sulfametazina
Sulfametazol
Sulfametoxipiridazina
Sulfacloropiridazina
Sulfametoxazol
Sulfadimetoxina
Tiempo B
0 8
33 33
34 33
Columna Eclipse Plus C18
46 x 250mm 5um
Flujo 1 mLmin
Fase Moacutevil
A 01 Aacutecido Foacutermico en Agua
B 01 Aacutecido Foacutermico en ACN
Tiempo B
0 8
12 33
132 33
Columna 46 x 100mm
Poroshell 120 EC-C18
27um
Flujo 185 mLmin
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Comparacioacuten de 46 x 250 mm 5 um con Poroshell
120 EC-C18 46 x 100 mm 27um
min 5 10 15 20 25 30
mAU
0
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90
110 bar
5
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50
59
20
70
37
325 bar
min
Ver condiciones en diapositiva anterior
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Mejor Resolucioacuten
linea base
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 52
Anaacutelisis maacutes raacutepido del meacutetodo USP para pastillas de
Simvastatina en Columnas Poroshell 120ndash Ajuste del meacutetodo
46 x 250 mm 5-um
Agilent ZORBAX Eclipse Plus C18
46 x 75 mm 27-um
Agilent Poroshell 120 EC-C18
65 CH3CN 35 39 gL NaH2PO4 (pH 45) 45 oC Sig = 238 8 Ref = 360 100 nm
Flujos 15 mLmin para la columna de 5-um 28 mLmin para la columna Poroshell 120 27um
Requerimiento
USP
5-um
(15 mLmin)
27-um
(28 mLmin)
TR na 9907 1457
krsquo gt 30 5962 5122
N gt 4500 16939 14439
Tf lt 20 109 110
min 2 4 6 8 10
mAU
0
5
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min 2
mAU
0
5
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30
35
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Ajustes de los parametros cromatograficos en la
transferencia de meacutetodos Escalado del volume de inyeccioacuten
v1 x [(r22 x L2)(r1
2 x L1)] = V2
O bien
v2 = V1 x [(d22 x L2)(d1
2 x L1)]
v volume de inyeccioacuten
r radio de la columna
L longitud de la columna
Ajuste del flujo
F2= F1 x (L2L1 ) x (r2r1 )2
L longitud de la columna
F Flujo
r radio de la columna
Ajuste de la longitud del gradiente
En funcioacuten de la longitud de la columna
L2L1= tg2tg1
En funcioacuten del volumen muerto de columna y del flujo
tG2= tG1 x (V2V1) x (F1F2) t tiempos de gradiente
V volumen muerto de columna
F flujo
Columna ID Volumen muerto aprox
por mm longitud
46mm 100uL
30mm 425uL
21mm 208uL
10mm 047uL
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 54
Notas de Aplicacioacuten en Poroshell 120 y QuEChERS
Determination of Hormones in Shrimp by Agilent 1290 Infinity LC with
Agilent Poroshell 120 LC Column and Agilent QuEChERS for Sample
Preparation (publication 5990-6589EN)
Analysis of Pesticide Residues in Green Tea Using Agilent SampliQ
QuEChERS EN Kit by LCMSMS Detection (publication 5990-
6400EN)
Analysis of Pesticide Residues in Rice Using Agilent Bond Elut
QuEChERS AOAC Kit (publication 5990-8034EN)
Poroshell 120 for pharmaceutical analysis
Poroshell 120 Resources
QuEChERS Applications
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 55
Sumario
bull La columna Poroshell 120 es una nueva alternativa para LC de Alta
Resolucioacuten y Alta Velocidad que puede usarse en cualquier HPLC o UHPLC
bull Con la Poroshell 120 se pueden lograr separaciones de alta eficacia a baja
presioacuten
bull Puede usarse con muestras sucias sin ver una elevacioacuten anormal de la
presioacuten
bull Puede usarse en un meacutetodo USP sin comprometer los Criterios de Ajustes de
Meacutetodo
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Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 56
Soporte Teacutecnico Agilent
Teleacutefono de Atencioacuten al Cliente
901 11 68 90
email customercare_spainagilentcom
wwwagilentcomchem
![Page 12: Análisis de compuestos farmacéuticos en sangre total · PDF fileReducción en el procesamiento, el envío de la muestra, y los ... Gas flow: 10 L/min Nebulizer: 10 psi Sheath gas](https://reader031.vdocuments.site/reader031/viewer/2022030405/5a7a81727f8b9a0a668b45aa/html5/thumbnails/12.jpg)
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Cromatograma LCndashMSndashMS de atorvastatina en
sangre fortificada 1 ngmL
Condiciones LCndashMS
Columna Poroshell 120 EC-C8 27 μm 150 times 21 mm
(Part 693775-906)
Fase Movil
A 5 mM Formiato Amoacutenico B CH3CN
Flujo 200 μLmin
Gradiente
t0 A 70 B 30
t50 A 25 B 75
t55 A 25 B 75
t56 A 70 B 30
t80 A 70 B 30
Temperatura 30 degC
Presioacuten 394 bar
Tiempo anaacutelisis 8 min
Instrumento Agilent 1290 LC
6460 QQQ
Gas temp 275 degC
Gas flow 10 Lmin
Nebulizer 10 psi
Sheath gas temp 250 degC
Sheath gas flow 7 Lmin
Polarity Negative
1 ngmL con una SNR de 797
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 13
Curvas de calibracioacuten representativas de estatinas
en sangre fortificada
Linearidad en las curvas de calibracioacuten para seis niveles de
pravastatina y atorvastatina
Las curvas de Lovastatina y simvastatina no fueron lineales a
las maacutes altas concentraciones y rindieron regresioacuten cuadraacutetica
con coeficientes de correlacioacuten mejores de 0999
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 14
Recuperaciones de estatinas con tarjetas Bond
Elut DMS y tarjetas de celulosa (n = 3)
Los resultados indican que cuando se usan tarjetas de celulosa hay incremento
ionico dando lugar a altas recuperaciones artificiales
Estos datos corroboran que las tarjetas no celulosicas exhiben datos de desorcioacuten
de mejor calidad comparados con las tarjetas tradicionales de celulosa
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 15
Conclusiones
Meacutetodo simple y raacutepido para el anaacutelisis de un grupo de compuestos aciacutedicos en muestras de sangre humana con DMS y LCndashMSndashMS
El meacutetodo ha demostrado se exacto preciso y robusto
Buena linealidad para la pravastatina y atorvastatina usando una regresioacuten lineal con coeficientes de correlacioacuten mejores de 0998
Estas tarjetas ofrecen mejores propiedades de desorcioacuten comparadas con las tarjetas competitivas basadas en celulosa
La columna Poroshell 120 EC-C8 es una excelente eleccioacuten para las aplicaciones bioanaacuteliticas
La tecnologia de Gota de Sangre Seca (Dried blood spots) es una teacutecnica de recoleccioacuten de muestra para el anaacutelisis de faacutermacos en estudios cliacutenicos y precliacutenicos
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 16
Referencias
N Spooner R Lad M Barfield Anal Chem 2009 811557ndash
1563
M Barfield N Spooner R Lad S Parry S Fowles
J Chromatogr B 2008 870 32ndash37
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 17
bullTecnologiacutea Innovadora no-celulosa
bullProporciona un nuevo nivel de confianza en la recoleccioacuten de muestras
bullMejora significativa en la sensibilidad analiacutetica reproducibilidad y faacutecil uso
Anaacutelisis Dried Blood Spotting (DBS)
Desarrollado en colaboracioacuten con Compantildeiacuteas farmaceacuteuticas y CROs este
dispositivo elimina problemas actuales asociados a los sistemas de DBS que
hay en el mercado
bullMuestreo de Sangre plasma o suero (liacutequido sinoviallaacutegrimas bilis LCR) para
anaacutelisis bioanaliacuteticos en pruebas farmaceacuteuticas cliacutenicas y precliacutenicas en
empresasa farmaceacuteuticas de bioanaacutelisis (DMPK ADME y MetID) (no para
Diagnoacutestico cliacutenico)
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La tarjeta sin celulosa es superior de forma medible a las tarjetas de papel de celulosa
Mejora la Sentildeal del MS
bullFormato libre de celulosa ha reducido el enlazado no especiacutefico y no contiene reactivos
quiacutemicos impregnados
Ventajas del Producto
Flujo de trabajo maacutes faacutecil
bull La extraccioacuten de la muestra de la tarjeta
requiere 5 veces menos fuerza que el
producto de celulosa
Proporciona excelente homogeneidad
de la mancha
bull Extracciones reproducibles
recuperaciones maacutes altas
independientemente del nivel de
hematocrito
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bull El nivel de Hematocrito es el porcentaje del volumen de sangre ocupado por las ceacutelulas
rojas de la sangre
bull El material de muestreo Bond Elut DMS tiene una estructura de fibras
maacutes ordenadas comparado con la celulosa estaacutendard
Esta es la razoacuten de porqueacute Bond Elut DMS muestra mejor
reproducibilidad
Mejor Reproducibilidad
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Bond Elut DBS Muestra Mejor Reproducibilidad
Bond Elut DMS tiene una desviacioacuten total de un 5 en todos los niveles HCT mientras que la
tarjeta de celulosa tiene una desviacioacuten de un 52 en todo el rango 10 veces de diferencia
Los datos abajo muestran la desviacioacuten de las medidas del CV desde niveles de HTC
normales (45) para tarjetas Bond Elut DMS y de celulosa (Whatman DMPK-C)
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Ventajas Clave de la Teacutecnica DBS de Agilent
bull Una vez seca la muestra de sangre no supone peligro bioloacutegico alguno y se
puede transportar sin necesidad de sistemas de refrigeracioacuten costosos
bull Permite a los laboratorios centralizar los anaacutelisis de muestra perifeacutericas
bull Se requiere menos volumen de muestra (menor nordm de sujetos en el ensayo
menor nordm de repeticiones y eliminacioacuten de sujetos sateacutelite)
bull Permite la toma demuestra en serie del mismo sujeto
bull La recoleccioacuten de sangre es maacutes sencilla
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Notas de Aplicacioacuten farmaceacuteuticas en Poroshell
120 and DMS Fast Analysis of Cefepime and Related Impurities on Poroshell 120 EC-C18 (publication 5990-7492EN) Comparing Selectivity Easy Transfer of Methods between Superficially Porous Agilent Poroshell 120 EC-C18 and totally Porous Agilent ZORBAX Eclipse Plus C18 (publication 5990-6588EN)
Analysis of Water Soluble Vitamins in Multivitamin Tablets Using Poroshell 120 EC-C18 (publication 5990-8107EN)
Analysis of Anthocyanins in Common Foods Using an Agilent Poroshell 120 SB-C18 (publication 5990-8249EN)
Analysis of Amitriptyline Fluoxetine Quetiapine and Sertraline Using Dried Plasma (publication 5990-8169EN)
Analysis of Amitriptyline Fluoxetine Quetiapine and Sertraline Using Dried Blood Spots (publication 5990-8168EN)
Investigation of Varying Blood Hematocrit Level in Dried Blood Spotting (publication 5990-8306EN)
Analysis of Cholesterol Lowering Drugs (Statins) Using Dried Matrix Spots Technology (publication 5990-8305EN)
Scalability of Agilent Columns Across HPLC and UHPLC Instruments (publication 5990-8428EN)
Converting a CHP Method for Insulin to Agilent Poroshell 120 Columns (publication 5990-9029EN)
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La propuesta QuEChERS para Determinar compuestos
Farmaceacuteuticos y Toxinas en Sangre Total
Anaacutelisis de Compuestos Farmaceacuteuticos en Sangre Total con
la columna Poroshell 120 Usando el meacutetodo Modificado
Mini-QuEChERS para la preparacioacuten de muestra
Nota de Aplicacioacuten5990-8789EN
httpwwwchemagilentcomLibraryapplications5990-8789ENpdf
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Introduccioacuten
Determinacioacuten de compuestos farmaceacuteuticos en anaacutelisis cliacutenicos y
foreacutensicos ADME (DMPK)
La preparacioacuten de muestra va desde la simple precipitacioacuten de
proteinas (PPT) a la maacutes compleja extraccioacuten en fase soacutelida (SPE)
Habitualmente la SPE ha ocupado este vaciacuteo pero simpre hay
espacio para teacutecnicas de preparacioacuten de muestras que son raacutepidas y
baratas de implementar
Se describe un procedimiento mini-QuEChERS modificado con
analisis LCndashMS-MS para la determinacioacuten de faacutermacos en sangre
total
Se analizan nueve diferentes faacutermacos (lidocaina tramadol
amitriptilina biperidina oxazepam lorazepam clorpromazina
diltiazem y naloxona)
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Compuestos farmaceacuteuticos usados en el estudio
Compuesto Nuacutemero CAS Log P (ow) pKa Uso
terapeacuteutico
Lidocaina 137-58-6 24 801 Anesteacutesico local
antiarrithmico
Tramadol 27203-92-5 25 941 Analgesico
Amitriptilina 50-48-6 492 94 Antidepresivo
Biperidena 514-65-8 40 108 Anticolinergico
Oxazepam 604-75-1 223 17 113 Antianxiedad
Lorazepam 846-49-1 247 13 115 Antidepresivo
Clorpromazina 50-53-3 518 93 Antipsycoacutetico
Diltiazem 42399-41-7 363 77 Bloqueante de los
canales del calcio
Naloxona 465-65-6 145 79 Antagonista de los
receptores de opio
Nortriptilina (IS) 72-69-5 565 97
5 ugmL de solucioacuten (9 compuestos) y estandar interno en metanol
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La Teacutecnica de QuEChERS aplicada a las muestras
de sangre
La sangre es el maacutes complejo de los fluidos bioloacutegicos
La determinacioacuten de faacutermacos en sangre total es a menudo necesaria en los
anaacutelisis foreacutensicos dada la dificultad de obtener suero o plasma
Los procedimientos convencionales para analizar faacutermacos en matrices
complejas como la sangre total son complicados
QuEChERS es una teacutecnica de preparacioacuten de muestra que fue desarrollada
para la extraccioacuten de residuos de plaguicidas multi-clase de frutas y vegetales
en 2003
A pesar de que los fluidos bioloacutegicos pueden parecer muy diferentes a una
pieza de fruta sin embargo siguen caminos paralelos
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Caminos paralelos en la preparacioacuten de muestra
Fluidos Bioloacutegicos
Matrices complejas
Rotura de la arquitectura celular
bull Lisis agitacioacuten solvente orgaacutenico
hidroacutelisis
Analitos con un amplio rango de
polaridades
Retirar analito o matriz
Anaacutelisis por LCMSMS GCMS o
GCMSMS
Frutas y Vegetales
Matrices complejas
Rotura de la arquitectura celular
bull Trituracioacuten agitacioacuten solvente
orgaacutenico hidroacutelisis
Analitos con un amplio rango de
polaridades
Retirar analito o matriz
Anaacutelisis por LCMSMS GCMS o
GCMSMS
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Procedimiento baacutesico por SPE para muestras de sangre
El pretratamiento de la sangre total implica la dilucioacuten con una
solucioacuten aacutecida un tampoacuten fosfato o aguaFA
Sonicar 15 minutos rotura de membranas celulares
Centrifugacioacuten
bull Procedimiento de SPE
ndash Acondicionado del cartucho metanol agua
ndash Carga del cartucho muestra
ndash Lavado del cartucho agua con metanol o tampoacuten metanol
ndash Elucioacuten del cartucho eluyente para el anaacutelisis
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 29
Procedimiento Baacutesico QuEChERS
15 g muestra homogeneizada (fortificada)
Antildeadir 15 mL ACN (1 AA) vortex
Antildeadir Sales de Extraccioacuten AOAC agitar
Centrifugar
Transferir 1 u 8 mL a un tubo d-SPE AOAC vortex centrifugar
Transferir al vial de Anaacutelisis
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Ventajas y desventajas del Procedimiento QuEChERS
Ventajas
Extraccioacuten tipo liacutequidoliacutequido
Uso de aacutecido para interrumpir el ligado de proteinas
Exceso de sal para lisar los componentes celulares
Uso de acetonitrilo para facilitar la precipitacioacuten proteacuteica
Uso de SPE dispersiva para adsorber las interferencias de la matriz
Plossl etat J Chrom A 1135 (2006) 19-26
Desventajas
La cantidad de solvente y de muestra requeridos en el meacutetodo no
son ldquobioloacutegicamente adecuadosrdquo
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Propoacutesito de la propuesta mini-Q
Ofrecer un enfoque maacutes adecuado biologicamente
Requirimientos de menores volumenes y tamantildeos de
muestra
Rango de faacutermacos varias polaridades y pKa
Evaluaciacuteoacuten de las interferencias de fondo
Extraccioacuten y datos de recuperacioacuten en un rango
aceptable
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Faacutermacos en sangre Procedimiento mini-QuEChERS
mini-Q
Procedimiento
1 Antildeadir 2 homogeneizadores ceraacutemicos
2 Antildeadir 1 o 2 mL de sangre entera a un tubo de centriacutefuga con tapoacuten de rosca
3 Antildeadir estandar interno vortex
4 Antildeadir 2 mL de ACN acidificado ( 04 FA) vortex 30 seg
5 Antildeadir 500 mg de sales de extraccioacuten agitar vigorsamente 1 minuto centrifugar 5000 rpm 1 min
6 Transferir 1 mL del extraccto al material de d-SPE en tubo de centrifuga vortex centrifugar
7 Antildeadir 200 uL a 800 uL de agua en un vial LC vortex y analizar
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Refinamiento del Procedimiento mini-Q
Paraacutemetros evaluados en la teacutecnica mini-Q
Muestra de sangre total
bull La matriz bioloacutegica maacutes complicada
Adicioacuten de aacutecido tipo y cantidad
bull Efecto en la particioacuten y extraccioacuten
Adicioacuten de las sales de QuEChERS no-tamponadas o
tamponadas con NaAcetato o Citrato
bull Efecto en el extracto inspeccioacuten visual
SPE Dispersiva
bull Limpieza de la matriz y recuperaciones de los compuestos
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Conclusiones del estudio
El ACN con 4 de FA como solvente de extraccioacuten muestra
una lisis maacutes completa de la muestra frente a otros solventes
de extraccioacuten que mostraron una masa soacutelida
Las sales tamponadas AOAC de acetato Soacutedico generan el
extracto maacutes liacutempio y fueron elegidas para la d-SPE
El paso de dSPE no ofrece un clean up adicional para los
meacutetodos de extraccioacuten con sales EN y no tamponadas
principalmente
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Datos de Adquisicoacuten LCMSMS
Compuestos Canales MRM
(mz) Fragmentador
(V) CE (V) RT (min) Delta RT
Lidocaina 1) 23518 gt 861
2) 23518 gt 581
97 11
35
137 04
Tramadol 1) 2642 gt 581
2) 2642 gt 2461
97 15
3
120 04
Amitriptilina 1) 2782 gt 117
2) 2782 gt 105
112 19
19
425 04
Biperidena 1)31223 gt 981
2) 31223 gt 551
123 19
60
423 07
Oxazepam 1) 28706 gt 2409
2) 28706 gt 2689
112 19
7
399 04
Lorazepam 1) 32102 gt 2749
2) 32102 gt 3029
113 15
7
409 04
Clorpromazina 1) 31911 gt 861
2) 31911 gt 581
112 15
43
463 04
Diltiazem 1) 41517 gt 1779
2) 41517 gt 1499
128 19
43
373 04
Naloxona 1) 32816 gt 310
2) 32816 gt 212
123 15
39
082 04
Nortriptilina (IS) 1) 26418 gt 233
2) 26418 gt 91
97 7
19
417 04
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075
0775
08
0825
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0875
09
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095
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1
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105
1075
11
1125
115
1175
12
1225
125
1275
13
1325
135
1375
+ESI TIC Scan Frag=800V AOAC_BLANK_110228bd
1 1
Counts vs Acquisition Time (min)
05 1 15 2 25
3 35 4 45 5 55 6 65 7 75 8 85 9 95 10
Columna Poroshell 120 EC-C18 27
micro 21 x 100 mm PN 695775-902
Fase Moacutevil
A 5 mM Acetato Amoacutenico pH 5
2080 MeOHagua
B 5 mM Acetato amoacutencio en ACN
Flujo 04mLmin
Inyeccioacuten 10uL
GT (ordmC) 300
GF (lmin) 7
Nebulizador (psi) 40
SGT (ordmC) 400
SFG (lmin) 12
Capilar (V) 3500
NV (V) 500
Condiciones LCMS
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5
51
+ESI MRM Frag=1120V CID190 (2782000 -gt 1170000) HQC_6d
1 1
Counts vs Acquisition Time (min) 01 02 03 04 05 06 07 08 09 1 11 12 13 14 15 16 17 18 19 2 21 22 23 24 25 26 27 28 29 3 31 32 33 34 35 36 37 38 39 4 41 42 43 44 45 46
Nalo
xo
ne
Lid
oc
ain
e
Tra
mad
ol
Oxazep
am
Lo
razep
am
Bip
eri
de
n
Am
itri
pty
lin
e
Dil
tiazem
Ch
lorp
rom
azin
e
No
rtri
pty
lin
e (
IS)
Cromatograma LCMSMS de 10 ngmL de sangre total fortificada despueacutes
de extraccioacuten mini-QuEChERS AOAC (NaAc) y d-SPE (50mg PSA y
150mg MgSO4)
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2
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4
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48
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5
51
+ESI MRM Frag=1120V CID190 (2782000 -gt 1170000) HQC_6d
1 1
Counts vs Acquisition Time (min) 01 02 03 04 05 06 07 08 09 1 11 12 13 14 15 16 17 18 19 2 21 22 23 24 25 26 27 28 29 3 31 32 33 34 35 36 37 38 39 4 41 42 43 44 45 46
1 x10
415 42 425 43 435 44 445 45 455 46 465 47 475 48 485 49 495 5
505 51 515 52 525 53 535 54 545 55 555 56 565 57
+ESI MRM Frag=1120V CID190 (2871000 -gt 2409000) RE_L_1d 1
Counts vs Acquisition Time (min) 305 31 315 32 325 33 335 34 345 35 355 36 365 37 375 38 385 39 395 4 405 41 415 42 425 43 435 44 445 45 455 46 465 47 475
Relacioacuten sentildealruido para el Oxazepam y Lorazepam a
10 ngmL (10 ppb)
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 39
La Naloxone muestra esta curva de linealidad de10-250 ngmL (ppb) con una R2
= 0991
Las curvas de calibracioacuten se generaron con la respuestra relativa (area pico
analitoarea pico IS) frente a la concentracioacuten relativa (concentracion de
analitoconcentracioacuten de IS)
Ejemplo de curva de linealidad para Naloxona extraido
con mini-QuEChERS
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 40
Recuperacioacuten y Reproducibilidad
Compuesto 50 ngmL Spiked
Recuperacioacuten RSD
100 ngmL Spiked
Recuperacioacuten RSD
Lidocaine 987 157 100 118
Tramadol 105 30 104 82
Amitriptyline 104 21 104 82
Biperidene 97 45 99 82
Oxazepam 770 92 78 86
Lorazepam 819 68 818 86
Chlorpromazine 110 103 105 63
Diltiazem 881 27 917 83
Naloxone 806 90 755 77
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 41
Conclusioacutenes y trabajo posterior
El meacutetodo mini-QuEChERS para la extraccioacuten de compuestos farmaceacuteuticos en
sangre total ofrece una alternativa a otras teacutecnicas de preparacioacuten de muestras
La preparacioacuten de muestras mini-QuEChERS es un enfoque simple facil y
barato que requiere una miacutenima experiencia en preparacioacuten de muestras y
miacutenimo equipamiento
Es un punto de partida para ampliar el numero y las clasificaciones evaluadas
en otras matrices bioloacutegicas y en sangre postmortem
El trabajo futuro incluira combinaciones adecuadas tanto de las sales de
extraccioacuten como de los sorbentes de d-SPE por el meacutetodo mini-QuEChERS
La columna Poroshell 120 ofrece una selectividad diferente y excelentes formas
de pico a lo largo del amplio rango de compuestos farmaceacuteuticos usados en este
estudio
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 42
Referencias
(1) M Anastassiades SJ Lehotay D Štajnbaher and FJ Schenk J AOAC Int 86 4121 (2003)
(2) G Stubbings and T Bigwood Anal Chim Acta 637 68 (2009)
(3) RR Rasmussen IMLD Storm PZH Rasmussen J Smedsgaard and KF Nielsen Anal Bioanal Chem 397 765 (2010)
(4) D Smith and K Lynam GCμECD analysis and confirmation of PCBs in fish tissue with Agilent JampW DB-35ms and DB-XLB GC columns Agilent Technologies 5990-6236EN (2010)
(5) F Ploumlssl M Giera and F Bracher J Chrom A 1135 19 (2006)
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 43
MEJORAR LA PRODUCTIVIDAD EN
HPLC ESTAacuteNDAR CON COLUMNAS
POROSHELL
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Columnas Poroshell 120 para HPLC y UHPLC
bull 80-90 de eficacia de las sub 2um
bull A presiones un ~40-50 maacutes bajas
bull Con un tamantildeo de partiacutecula de 27um
bull Con una frita de entrada de 2um
bull Con el doble de resolucioacuten de una
columna de 35um
bull Con un liacutemite de presioacuten de 600 bar
bull La partiacutecula tiene un nuacutecleo soacutelido
(17um) y una cubierta exterior porosa
de 05um como zona de difusioacuten
Las Columnas Poroshell 120 tienen
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Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 45
Poroshell 120 proporciona Eficacia Suficiente
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Flujo 0582 mLmin AcetonitriloAgua (6040)
Volumen de Inyeccioacuten 4 microL
TCC 26 oC
DAD Sig=2544nm Ref=360100nm
Muestra Muestra de test RRLC
(PN 5188-6529) inoculada con
50 microL 2 mgmL Tiourea en
aguaacetonitrilo (6535)
25 5 75 10
mAU
0
200
400
600
06
46
0
82
6
11
48
15
18
20
16
2
22
3
28
16
41
32
62
73
97
53
larr N = 25053 Presioacuten = 182 bar
Poroshell 120 EC-C18 30 x 100 mm 27 um
min 25 5 75 10 125
mAU
0
200
400
600
06
49
0
86
5
12
75
17
56
24
18
27
05
34
94
52
81
82
18
13
04
1
larr N = 27295 Presioacuten = 386 bar
Eclipse Plus C18 30 x 100 mm 18 um
gt90 de la Eficacia de una 18um
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 46
iquestEn queacute tipos de instrumentos puede usar
Columnas Poroshell 120 HPLCrsquos y UHPLCrsquos
Consideraciones en UHPLC
bull Las columnas Poroshell 120 tienen un liacutemite de presioacuten de 600 bar
bull Los UHPLC estaacuten ajustados para columnas de bajo volumen por lo tanto las
Poroshell pueden usarse en todos los UHPLC
Consideraciones en HPLC
bull Las Columnas Poroshell 120 trabajan bien por debajo de 400 bar
bull Minimize los volumenes extra columna para las columnas 21 y 30mm ID ndash
siga las instrucciones dadas para las columnas RRHT (18um 600 bar)
bull Use en el detector velocidades adecuadas de adquisicioacuten para picos
estrechos de alta eficacia
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Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 47
Con una frita de 2 um Poroshell 120 no se bloquea
Muestras Complejas- Plasma
Diflusinal in Plasma
0
20
40
60
80
100
120
140
160
180
200
220
240
260
280
300
320
340
360
380
400
1 501 1001 1501 2001 2501
Injections
Pre
ssu
re
0
20000
40000
60000
80000
100000
120000
140000
160000
180000
200000
Eff
icie
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End Press
Plates
Columna Poroshell 120 EC-C18 30 x 50mm 27um LC Agilent 1200 RRLC (SL)
Muestra Plasma Precipitado 2 partes Plasma 7 Partes 2080 Agua-MeCN w01 Aacutecido Foacutermico con 1 Parte de Diflusinal en
5050 Agua-MeCN 10 ugml (Concentracion Final Diflusinal 1 ugml) Agitado y dejado reposar 10 minutos
No Centrifugado No Filtrado
Volumen de Inyeccioacuten 1ul
Solvente A Agua w01 TFA
Solvente B MeCN w008 TFA
Flujo 1 mlmin 1 ul inyeccioacuten
Tiempo B
0 20
05 90
06 90
11 20
25 20
Page 47
Diflusinal es un anti-inflamatorio no esteroidal anaacutelogo
a la aspirina desarrollado por Merck Sharp amp Dohme
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Las Columnas Superficialmente Porosas Pueden
Usarse cumpliendo los Requirimientos USP
De la lista USP de empaquetamientos de columnas LC 42009
Page 48
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Criterios de Ajuste de Meacutetodos USP y FDA Criterios de Ajuste de Meacutetodos de Dimensiones de Columna
Paraacutemetro Especificaciones Maacuteximas ComentariosEjemplos
Longitud de Columna 70 250mm 75mm
150mm 50mm
Diaacutemetro Interno de
Columna
25 (FDA ORA-LAB 545)
USP ndash 25 ID Columna puede ajustarse si la
velocidad lineal es constante
46 mm 30 mm (-35)
46 mm 21 mm (-54)
30 mm 21 mm (-30)
Flow Rate 50
Volumen de Inyeccioacuten
Reducir tanto como se necesitendash
debe cumplir los liacutemites de
deteccioacuten y precisioacuten
Si cambia a una columna maacutes
corta haga el cambio apropiado
en el volumen de inyeccioacuten
Tamantildeo de Partiacutecula Reducir hasta el 50
(no se puede aumentar)
Puede cambiar la longitud de columna y el
tamantildeo de partiacutecula para mantener la misma
Rs
5um 35um (-30)
5um 27um (-46) Cambiado en 22409 ndash Para la copia oficial y actual ir a
httpwwwfdagovScienceResearchFieldSciencedefaulthtm
USP 30 Second Supplement Revisions PF34(5) en proceso
Ver ldquo Stimuli articlerdquo en Pharmacopeial Forum 2009 35(6)
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Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 50
Comparacioacuten de 46 x 250 mm 5 um con Poroshell
120 EC-C18 46 x 100 mm 27um
min 5 10 15 20 25 30
mAU
0
20
40
60
80
100
97
12
111
16
115
96
126
74
152
48
161
51
164
35
206
87
230
76
292
90
min 5 10 15 20 25 30
mAU
0
50
100
150
200
250
17
19
21
89
23
11
26
06
38
67
44
37 45
58
54
50
59
20
70
37
Anaacutelisis maacutes raacutepido(columna maacutes corta flujo maacutes alto)
Mayor sensibilidad(partiacutecula maacutes pequentildeapico maacutes estrecho)
Maacutes optimizado (un anaacutelisis maacutes raacutepido permite ajustar mejor)
Ambos anaacutelisis en Agilent 1100 G1315B DAD (bajo 400 bar)
No se requiere cambio en la preparacioacuten de muestra frita de entrada
de 2 micras en ambas columnas
325 bar
110 bar
Sulfadiazina
Sulfatiazol
Sulfapiridina
Sulfamerazina
Sulfametazina
Sulfametazol
Sulfametoxipiridazina
Sulfacloropiridazina
Sulfametoxazol
Sulfadimetoxina
Tiempo B
0 8
33 33
34 33
Columna Eclipse Plus C18
46 x 250mm 5um
Flujo 1 mLmin
Fase Moacutevil
A 01 Aacutecido Foacutermico en Agua
B 01 Aacutecido Foacutermico en ACN
Tiempo B
0 8
12 33
132 33
Columna 46 x 100mm
Poroshell 120 EC-C18
27um
Flujo 185 mLmin
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Comparacioacuten de 46 x 250 mm 5 um con Poroshell
120 EC-C18 46 x 100 mm 27um
min 5 10 15 20 25 30
mAU
0
20
40
60
80
100
97
12
111
16
115
96
126
74
152
48
161
51
164
35
206
87
230
76
292
90
110 bar
5
mAU
0
50
100
150
200
250
17
19
21
89
23
11
26
06
38
67
44
37 45
58
54
50
59
20
70
37
325 bar
min
Ver condiciones en diapositiva anterior
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Mejor Resolucioacuten
linea base
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 52
Anaacutelisis maacutes raacutepido del meacutetodo USP para pastillas de
Simvastatina en Columnas Poroshell 120ndash Ajuste del meacutetodo
46 x 250 mm 5-um
Agilent ZORBAX Eclipse Plus C18
46 x 75 mm 27-um
Agilent Poroshell 120 EC-C18
65 CH3CN 35 39 gL NaH2PO4 (pH 45) 45 oC Sig = 238 8 Ref = 360 100 nm
Flujos 15 mLmin para la columna de 5-um 28 mLmin para la columna Poroshell 120 27um
Requerimiento
USP
5-um
(15 mLmin)
27-um
(28 mLmin)
TR na 9907 1457
krsquo gt 30 5962 5122
N gt 4500 16939 14439
Tf lt 20 109 110
min 2 4 6 8 10
mAU
0
5
10
15
20
25
30
35
40
min 2
mAU
0
5
10
15
20
25
30
35
40
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Ajustes de los parametros cromatograficos en la
transferencia de meacutetodos Escalado del volume de inyeccioacuten
v1 x [(r22 x L2)(r1
2 x L1)] = V2
O bien
v2 = V1 x [(d22 x L2)(d1
2 x L1)]
v volume de inyeccioacuten
r radio de la columna
L longitud de la columna
Ajuste del flujo
F2= F1 x (L2L1 ) x (r2r1 )2
L longitud de la columna
F Flujo
r radio de la columna
Ajuste de la longitud del gradiente
En funcioacuten de la longitud de la columna
L2L1= tg2tg1
En funcioacuten del volumen muerto de columna y del flujo
tG2= tG1 x (V2V1) x (F1F2) t tiempos de gradiente
V volumen muerto de columna
F flujo
Columna ID Volumen muerto aprox
por mm longitud
46mm 100uL
30mm 425uL
21mm 208uL
10mm 047uL
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 54
Notas de Aplicacioacuten en Poroshell 120 y QuEChERS
Determination of Hormones in Shrimp by Agilent 1290 Infinity LC with
Agilent Poroshell 120 LC Column and Agilent QuEChERS for Sample
Preparation (publication 5990-6589EN)
Analysis of Pesticide Residues in Green Tea Using Agilent SampliQ
QuEChERS EN Kit by LCMSMS Detection (publication 5990-
6400EN)
Analysis of Pesticide Residues in Rice Using Agilent Bond Elut
QuEChERS AOAC Kit (publication 5990-8034EN)
Poroshell 120 for pharmaceutical analysis
Poroshell 120 Resources
QuEChERS Applications
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 55
Sumario
bull La columna Poroshell 120 es una nueva alternativa para LC de Alta
Resolucioacuten y Alta Velocidad que puede usarse en cualquier HPLC o UHPLC
bull Con la Poroshell 120 se pueden lograr separaciones de alta eficacia a baja
presioacuten
bull Puede usarse con muestras sucias sin ver una elevacioacuten anormal de la
presioacuten
bull Puede usarse en un meacutetodo USP sin comprometer los Criterios de Ajustes de
Meacutetodo
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Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 56
Soporte Teacutecnico Agilent
Teleacutefono de Atencioacuten al Cliente
901 11 68 90
email customercare_spainagilentcom
wwwagilentcomchem
![Page 13: Análisis de compuestos farmacéuticos en sangre total · PDF fileReducción en el procesamiento, el envío de la muestra, y los ... Gas flow: 10 L/min Nebulizer: 10 psi Sheath gas](https://reader031.vdocuments.site/reader031/viewer/2022030405/5a7a81727f8b9a0a668b45aa/html5/thumbnails/13.jpg)
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 13
Curvas de calibracioacuten representativas de estatinas
en sangre fortificada
Linearidad en las curvas de calibracioacuten para seis niveles de
pravastatina y atorvastatina
Las curvas de Lovastatina y simvastatina no fueron lineales a
las maacutes altas concentraciones y rindieron regresioacuten cuadraacutetica
con coeficientes de correlacioacuten mejores de 0999
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 14
Recuperaciones de estatinas con tarjetas Bond
Elut DMS y tarjetas de celulosa (n = 3)
Los resultados indican que cuando se usan tarjetas de celulosa hay incremento
ionico dando lugar a altas recuperaciones artificiales
Estos datos corroboran que las tarjetas no celulosicas exhiben datos de desorcioacuten
de mejor calidad comparados con las tarjetas tradicionales de celulosa
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 15
Conclusiones
Meacutetodo simple y raacutepido para el anaacutelisis de un grupo de compuestos aciacutedicos en muestras de sangre humana con DMS y LCndashMSndashMS
El meacutetodo ha demostrado se exacto preciso y robusto
Buena linealidad para la pravastatina y atorvastatina usando una regresioacuten lineal con coeficientes de correlacioacuten mejores de 0998
Estas tarjetas ofrecen mejores propiedades de desorcioacuten comparadas con las tarjetas competitivas basadas en celulosa
La columna Poroshell 120 EC-C8 es una excelente eleccioacuten para las aplicaciones bioanaacuteliticas
La tecnologia de Gota de Sangre Seca (Dried blood spots) es una teacutecnica de recoleccioacuten de muestra para el anaacutelisis de faacutermacos en estudios cliacutenicos y precliacutenicos
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 16
Referencias
N Spooner R Lad M Barfield Anal Chem 2009 811557ndash
1563
M Barfield N Spooner R Lad S Parry S Fowles
J Chromatogr B 2008 870 32ndash37
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 17
bullTecnologiacutea Innovadora no-celulosa
bullProporciona un nuevo nivel de confianza en la recoleccioacuten de muestras
bullMejora significativa en la sensibilidad analiacutetica reproducibilidad y faacutecil uso
Anaacutelisis Dried Blood Spotting (DBS)
Desarrollado en colaboracioacuten con Compantildeiacuteas farmaceacuteuticas y CROs este
dispositivo elimina problemas actuales asociados a los sistemas de DBS que
hay en el mercado
bullMuestreo de Sangre plasma o suero (liacutequido sinoviallaacutegrimas bilis LCR) para
anaacutelisis bioanaliacuteticos en pruebas farmaceacuteuticas cliacutenicas y precliacutenicas en
empresasa farmaceacuteuticas de bioanaacutelisis (DMPK ADME y MetID) (no para
Diagnoacutestico cliacutenico)
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 18
La tarjeta sin celulosa es superior de forma medible a las tarjetas de papel de celulosa
Mejora la Sentildeal del MS
bullFormato libre de celulosa ha reducido el enlazado no especiacutefico y no contiene reactivos
quiacutemicos impregnados
Ventajas del Producto
Flujo de trabajo maacutes faacutecil
bull La extraccioacuten de la muestra de la tarjeta
requiere 5 veces menos fuerza que el
producto de celulosa
Proporciona excelente homogeneidad
de la mancha
bull Extracciones reproducibles
recuperaciones maacutes altas
independientemente del nivel de
hematocrito
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 19
bull El nivel de Hematocrito es el porcentaje del volumen de sangre ocupado por las ceacutelulas
rojas de la sangre
bull El material de muestreo Bond Elut DMS tiene una estructura de fibras
maacutes ordenadas comparado con la celulosa estaacutendard
Esta es la razoacuten de porqueacute Bond Elut DMS muestra mejor
reproducibilidad
Mejor Reproducibilidad
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 20
Bond Elut DBS Muestra Mejor Reproducibilidad
Bond Elut DMS tiene una desviacioacuten total de un 5 en todos los niveles HCT mientras que la
tarjeta de celulosa tiene una desviacioacuten de un 52 en todo el rango 10 veces de diferencia
Los datos abajo muestran la desviacioacuten de las medidas del CV desde niveles de HTC
normales (45) para tarjetas Bond Elut DMS y de celulosa (Whatman DMPK-C)
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 21
Ventajas Clave de la Teacutecnica DBS de Agilent
bull Una vez seca la muestra de sangre no supone peligro bioloacutegico alguno y se
puede transportar sin necesidad de sistemas de refrigeracioacuten costosos
bull Permite a los laboratorios centralizar los anaacutelisis de muestra perifeacutericas
bull Se requiere menos volumen de muestra (menor nordm de sujetos en el ensayo
menor nordm de repeticiones y eliminacioacuten de sujetos sateacutelite)
bull Permite la toma demuestra en serie del mismo sujeto
bull La recoleccioacuten de sangre es maacutes sencilla
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 22
Notas de Aplicacioacuten farmaceacuteuticas en Poroshell
120 and DMS Fast Analysis of Cefepime and Related Impurities on Poroshell 120 EC-C18 (publication 5990-7492EN) Comparing Selectivity Easy Transfer of Methods between Superficially Porous Agilent Poroshell 120 EC-C18 and totally Porous Agilent ZORBAX Eclipse Plus C18 (publication 5990-6588EN)
Analysis of Water Soluble Vitamins in Multivitamin Tablets Using Poroshell 120 EC-C18 (publication 5990-8107EN)
Analysis of Anthocyanins in Common Foods Using an Agilent Poroshell 120 SB-C18 (publication 5990-8249EN)
Analysis of Amitriptyline Fluoxetine Quetiapine and Sertraline Using Dried Plasma (publication 5990-8169EN)
Analysis of Amitriptyline Fluoxetine Quetiapine and Sertraline Using Dried Blood Spots (publication 5990-8168EN)
Investigation of Varying Blood Hematocrit Level in Dried Blood Spotting (publication 5990-8306EN)
Analysis of Cholesterol Lowering Drugs (Statins) Using Dried Matrix Spots Technology (publication 5990-8305EN)
Scalability of Agilent Columns Across HPLC and UHPLC Instruments (publication 5990-8428EN)
Converting a CHP Method for Insulin to Agilent Poroshell 120 Columns (publication 5990-9029EN)
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 23
La propuesta QuEChERS para Determinar compuestos
Farmaceacuteuticos y Toxinas en Sangre Total
Anaacutelisis de Compuestos Farmaceacuteuticos en Sangre Total con
la columna Poroshell 120 Usando el meacutetodo Modificado
Mini-QuEChERS para la preparacioacuten de muestra
Nota de Aplicacioacuten5990-8789EN
httpwwwchemagilentcomLibraryapplications5990-8789ENpdf
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 24
Introduccioacuten
Determinacioacuten de compuestos farmaceacuteuticos en anaacutelisis cliacutenicos y
foreacutensicos ADME (DMPK)
La preparacioacuten de muestra va desde la simple precipitacioacuten de
proteinas (PPT) a la maacutes compleja extraccioacuten en fase soacutelida (SPE)
Habitualmente la SPE ha ocupado este vaciacuteo pero simpre hay
espacio para teacutecnicas de preparacioacuten de muestras que son raacutepidas y
baratas de implementar
Se describe un procedimiento mini-QuEChERS modificado con
analisis LCndashMS-MS para la determinacioacuten de faacutermacos en sangre
total
Se analizan nueve diferentes faacutermacos (lidocaina tramadol
amitriptilina biperidina oxazepam lorazepam clorpromazina
diltiazem y naloxona)
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 25
Compuestos farmaceacuteuticos usados en el estudio
Compuesto Nuacutemero CAS Log P (ow) pKa Uso
terapeacuteutico
Lidocaina 137-58-6 24 801 Anesteacutesico local
antiarrithmico
Tramadol 27203-92-5 25 941 Analgesico
Amitriptilina 50-48-6 492 94 Antidepresivo
Biperidena 514-65-8 40 108 Anticolinergico
Oxazepam 604-75-1 223 17 113 Antianxiedad
Lorazepam 846-49-1 247 13 115 Antidepresivo
Clorpromazina 50-53-3 518 93 Antipsycoacutetico
Diltiazem 42399-41-7 363 77 Bloqueante de los
canales del calcio
Naloxona 465-65-6 145 79 Antagonista de los
receptores de opio
Nortriptilina (IS) 72-69-5 565 97
5 ugmL de solucioacuten (9 compuestos) y estandar interno en metanol
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 26
La Teacutecnica de QuEChERS aplicada a las muestras
de sangre
La sangre es el maacutes complejo de los fluidos bioloacutegicos
La determinacioacuten de faacutermacos en sangre total es a menudo necesaria en los
anaacutelisis foreacutensicos dada la dificultad de obtener suero o plasma
Los procedimientos convencionales para analizar faacutermacos en matrices
complejas como la sangre total son complicados
QuEChERS es una teacutecnica de preparacioacuten de muestra que fue desarrollada
para la extraccioacuten de residuos de plaguicidas multi-clase de frutas y vegetales
en 2003
A pesar de que los fluidos bioloacutegicos pueden parecer muy diferentes a una
pieza de fruta sin embargo siguen caminos paralelos
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 27
Caminos paralelos en la preparacioacuten de muestra
Fluidos Bioloacutegicos
Matrices complejas
Rotura de la arquitectura celular
bull Lisis agitacioacuten solvente orgaacutenico
hidroacutelisis
Analitos con un amplio rango de
polaridades
Retirar analito o matriz
Anaacutelisis por LCMSMS GCMS o
GCMSMS
Frutas y Vegetales
Matrices complejas
Rotura de la arquitectura celular
bull Trituracioacuten agitacioacuten solvente
orgaacutenico hidroacutelisis
Analitos con un amplio rango de
polaridades
Retirar analito o matriz
Anaacutelisis por LCMSMS GCMS o
GCMSMS
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 28
Procedimiento baacutesico por SPE para muestras de sangre
El pretratamiento de la sangre total implica la dilucioacuten con una
solucioacuten aacutecida un tampoacuten fosfato o aguaFA
Sonicar 15 minutos rotura de membranas celulares
Centrifugacioacuten
bull Procedimiento de SPE
ndash Acondicionado del cartucho metanol agua
ndash Carga del cartucho muestra
ndash Lavado del cartucho agua con metanol o tampoacuten metanol
ndash Elucioacuten del cartucho eluyente para el anaacutelisis
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 29
Procedimiento Baacutesico QuEChERS
15 g muestra homogeneizada (fortificada)
Antildeadir 15 mL ACN (1 AA) vortex
Antildeadir Sales de Extraccioacuten AOAC agitar
Centrifugar
Transferir 1 u 8 mL a un tubo d-SPE AOAC vortex centrifugar
Transferir al vial de Anaacutelisis
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 30
Ventajas y desventajas del Procedimiento QuEChERS
Ventajas
Extraccioacuten tipo liacutequidoliacutequido
Uso de aacutecido para interrumpir el ligado de proteinas
Exceso de sal para lisar los componentes celulares
Uso de acetonitrilo para facilitar la precipitacioacuten proteacuteica
Uso de SPE dispersiva para adsorber las interferencias de la matriz
Plossl etat J Chrom A 1135 (2006) 19-26
Desventajas
La cantidad de solvente y de muestra requeridos en el meacutetodo no
son ldquobioloacutegicamente adecuadosrdquo
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 31
Propoacutesito de la propuesta mini-Q
Ofrecer un enfoque maacutes adecuado biologicamente
Requirimientos de menores volumenes y tamantildeos de
muestra
Rango de faacutermacos varias polaridades y pKa
Evaluaciacuteoacuten de las interferencias de fondo
Extraccioacuten y datos de recuperacioacuten en un rango
aceptable
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 32
Faacutermacos en sangre Procedimiento mini-QuEChERS
mini-Q
Procedimiento
1 Antildeadir 2 homogeneizadores ceraacutemicos
2 Antildeadir 1 o 2 mL de sangre entera a un tubo de centriacutefuga con tapoacuten de rosca
3 Antildeadir estandar interno vortex
4 Antildeadir 2 mL de ACN acidificado ( 04 FA) vortex 30 seg
5 Antildeadir 500 mg de sales de extraccioacuten agitar vigorsamente 1 minuto centrifugar 5000 rpm 1 min
6 Transferir 1 mL del extraccto al material de d-SPE en tubo de centrifuga vortex centrifugar
7 Antildeadir 200 uL a 800 uL de agua en un vial LC vortex y analizar
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 33
Refinamiento del Procedimiento mini-Q
Paraacutemetros evaluados en la teacutecnica mini-Q
Muestra de sangre total
bull La matriz bioloacutegica maacutes complicada
Adicioacuten de aacutecido tipo y cantidad
bull Efecto en la particioacuten y extraccioacuten
Adicioacuten de las sales de QuEChERS no-tamponadas o
tamponadas con NaAcetato o Citrato
bull Efecto en el extracto inspeccioacuten visual
SPE Dispersiva
bull Limpieza de la matriz y recuperaciones de los compuestos
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 34
Conclusiones del estudio
El ACN con 4 de FA como solvente de extraccioacuten muestra
una lisis maacutes completa de la muestra frente a otros solventes
de extraccioacuten que mostraron una masa soacutelida
Las sales tamponadas AOAC de acetato Soacutedico generan el
extracto maacutes liacutempio y fueron elegidas para la d-SPE
El paso de dSPE no ofrece un clean up adicional para los
meacutetodos de extraccioacuten con sales EN y no tamponadas
principalmente
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 35
Datos de Adquisicoacuten LCMSMS
Compuestos Canales MRM
(mz) Fragmentador
(V) CE (V) RT (min) Delta RT
Lidocaina 1) 23518 gt 861
2) 23518 gt 581
97 11
35
137 04
Tramadol 1) 2642 gt 581
2) 2642 gt 2461
97 15
3
120 04
Amitriptilina 1) 2782 gt 117
2) 2782 gt 105
112 19
19
425 04
Biperidena 1)31223 gt 981
2) 31223 gt 551
123 19
60
423 07
Oxazepam 1) 28706 gt 2409
2) 28706 gt 2689
112 19
7
399 04
Lorazepam 1) 32102 gt 2749
2) 32102 gt 3029
113 15
7
409 04
Clorpromazina 1) 31911 gt 861
2) 31911 gt 581
112 15
43
463 04
Diltiazem 1) 41517 gt 1779
2) 41517 gt 1499
128 19
43
373 04
Naloxona 1) 32816 gt 310
2) 32816 gt 212
123 15
39
082 04
Nortriptilina (IS) 1) 26418 gt 233
2) 26418 gt 91
97 7
19
417 04
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 36
7 x10
0125
015
0175
02
0225
025
0275
03
0325
035
0375
04
0425
045
0475
05
0525
055
0575
06
0625
065
0675
07
0725
075
0775
08
0825
085
0875
09
0925
095
0975
1
1025
105
1075
11
1125
115
1175
12
1225
125
1275
13
1325
135
1375
+ESI TIC Scan Frag=800V AOAC_BLANK_110228bd
1 1
Counts vs Acquisition Time (min)
05 1 15 2 25
3 35 4 45 5 55 6 65 7 75 8 85 9 95 10
Columna Poroshell 120 EC-C18 27
micro 21 x 100 mm PN 695775-902
Fase Moacutevil
A 5 mM Acetato Amoacutenico pH 5
2080 MeOHagua
B 5 mM Acetato amoacutencio en ACN
Flujo 04mLmin
Inyeccioacuten 10uL
GT (ordmC) 300
GF (lmin) 7
Nebulizador (psi) 40
SGT (ordmC) 400
SFG (lmin) 12
Capilar (V) 3500
NV (V) 500
Condiciones LCMS
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4
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48
49
5
51
+ESI MRM Frag=1120V CID190 (2782000 -gt 1170000) HQC_6d
1 1
Counts vs Acquisition Time (min) 01 02 03 04 05 06 07 08 09 1 11 12 13 14 15 16 17 18 19 2 21 22 23 24 25 26 27 28 29 3 31 32 33 34 35 36 37 38 39 4 41 42 43 44 45 46
Nalo
xo
ne
Lid
oc
ain
e
Tra
mad
ol
Oxazep
am
Lo
razep
am
Bip
eri
de
n
Am
itri
pty
lin
e
Dil
tiazem
Ch
lorp
rom
azin
e
No
rtri
pty
lin
e (
IS)
Cromatograma LCMSMS de 10 ngmL de sangre total fortificada despueacutes
de extraccioacuten mini-QuEChERS AOAC (NaAc) y d-SPE (50mg PSA y
150mg MgSO4)
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+ESI MRM Frag=1120V CID190 (2782000 -gt 1170000) HQC_6d
1 1
Counts vs Acquisition Time (min) 01 02 03 04 05 06 07 08 09 1 11 12 13 14 15 16 17 18 19 2 21 22 23 24 25 26 27 28 29 3 31 32 33 34 35 36 37 38 39 4 41 42 43 44 45 46
1 x10
415 42 425 43 435 44 445 45 455 46 465 47 475 48 485 49 495 5
505 51 515 52 525 53 535 54 545 55 555 56 565 57
+ESI MRM Frag=1120V CID190 (2871000 -gt 2409000) RE_L_1d 1
Counts vs Acquisition Time (min) 305 31 315 32 325 33 335 34 345 35 355 36 365 37 375 38 385 39 395 4 405 41 415 42 425 43 435 44 445 45 455 46 465 47 475
Relacioacuten sentildealruido para el Oxazepam y Lorazepam a
10 ngmL (10 ppb)
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 39
La Naloxone muestra esta curva de linealidad de10-250 ngmL (ppb) con una R2
= 0991
Las curvas de calibracioacuten se generaron con la respuestra relativa (area pico
analitoarea pico IS) frente a la concentracioacuten relativa (concentracion de
analitoconcentracioacuten de IS)
Ejemplo de curva de linealidad para Naloxona extraido
con mini-QuEChERS
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 40
Recuperacioacuten y Reproducibilidad
Compuesto 50 ngmL Spiked
Recuperacioacuten RSD
100 ngmL Spiked
Recuperacioacuten RSD
Lidocaine 987 157 100 118
Tramadol 105 30 104 82
Amitriptyline 104 21 104 82
Biperidene 97 45 99 82
Oxazepam 770 92 78 86
Lorazepam 819 68 818 86
Chlorpromazine 110 103 105 63
Diltiazem 881 27 917 83
Naloxone 806 90 755 77
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 41
Conclusioacutenes y trabajo posterior
El meacutetodo mini-QuEChERS para la extraccioacuten de compuestos farmaceacuteuticos en
sangre total ofrece una alternativa a otras teacutecnicas de preparacioacuten de muestras
La preparacioacuten de muestras mini-QuEChERS es un enfoque simple facil y
barato que requiere una miacutenima experiencia en preparacioacuten de muestras y
miacutenimo equipamiento
Es un punto de partida para ampliar el numero y las clasificaciones evaluadas
en otras matrices bioloacutegicas y en sangre postmortem
El trabajo futuro incluira combinaciones adecuadas tanto de las sales de
extraccioacuten como de los sorbentes de d-SPE por el meacutetodo mini-QuEChERS
La columna Poroshell 120 ofrece una selectividad diferente y excelentes formas
de pico a lo largo del amplio rango de compuestos farmaceacuteuticos usados en este
estudio
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 42
Referencias
(1) M Anastassiades SJ Lehotay D Štajnbaher and FJ Schenk J AOAC Int 86 4121 (2003)
(2) G Stubbings and T Bigwood Anal Chim Acta 637 68 (2009)
(3) RR Rasmussen IMLD Storm PZH Rasmussen J Smedsgaard and KF Nielsen Anal Bioanal Chem 397 765 (2010)
(4) D Smith and K Lynam GCμECD analysis and confirmation of PCBs in fish tissue with Agilent JampW DB-35ms and DB-XLB GC columns Agilent Technologies 5990-6236EN (2010)
(5) F Ploumlssl M Giera and F Bracher J Chrom A 1135 19 (2006)
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 43
MEJORAR LA PRODUCTIVIDAD EN
HPLC ESTAacuteNDAR CON COLUMNAS
POROSHELL
Page 43
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 44
Columnas Poroshell 120 para HPLC y UHPLC
bull 80-90 de eficacia de las sub 2um
bull A presiones un ~40-50 maacutes bajas
bull Con un tamantildeo de partiacutecula de 27um
bull Con una frita de entrada de 2um
bull Con el doble de resolucioacuten de una
columna de 35um
bull Con un liacutemite de presioacuten de 600 bar
bull La partiacutecula tiene un nuacutecleo soacutelido
(17um) y una cubierta exterior porosa
de 05um como zona de difusioacuten
Las Columnas Poroshell 120 tienen
Page 44
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 45
Poroshell 120 proporciona Eficacia Suficiente
Page 45
Flujo 0582 mLmin AcetonitriloAgua (6040)
Volumen de Inyeccioacuten 4 microL
TCC 26 oC
DAD Sig=2544nm Ref=360100nm
Muestra Muestra de test RRLC
(PN 5188-6529) inoculada con
50 microL 2 mgmL Tiourea en
aguaacetonitrilo (6535)
25 5 75 10
mAU
0
200
400
600
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46
0
82
6
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15
18
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3
28
16
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32
62
73
97
53
larr N = 25053 Presioacuten = 182 bar
Poroshell 120 EC-C18 30 x 100 mm 27 um
min 25 5 75 10 125
mAU
0
200
400
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27
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52
81
82
18
13
04
1
larr N = 27295 Presioacuten = 386 bar
Eclipse Plus C18 30 x 100 mm 18 um
gt90 de la Eficacia de una 18um
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 46
iquestEn queacute tipos de instrumentos puede usar
Columnas Poroshell 120 HPLCrsquos y UHPLCrsquos
Consideraciones en UHPLC
bull Las columnas Poroshell 120 tienen un liacutemite de presioacuten de 600 bar
bull Los UHPLC estaacuten ajustados para columnas de bajo volumen por lo tanto las
Poroshell pueden usarse en todos los UHPLC
Consideraciones en HPLC
bull Las Columnas Poroshell 120 trabajan bien por debajo de 400 bar
bull Minimize los volumenes extra columna para las columnas 21 y 30mm ID ndash
siga las instrucciones dadas para las columnas RRHT (18um 600 bar)
bull Use en el detector velocidades adecuadas de adquisicioacuten para picos
estrechos de alta eficacia
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Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 47
Con una frita de 2 um Poroshell 120 no se bloquea
Muestras Complejas- Plasma
Diflusinal in Plasma
0
20
40
60
80
100
120
140
160
180
200
220
240
260
280
300
320
340
360
380
400
1 501 1001 1501 2001 2501
Injections
Pre
ssu
re
0
20000
40000
60000
80000
100000
120000
140000
160000
180000
200000
Eff
icie
ncy (
N)
End Press
Plates
Columna Poroshell 120 EC-C18 30 x 50mm 27um LC Agilent 1200 RRLC (SL)
Muestra Plasma Precipitado 2 partes Plasma 7 Partes 2080 Agua-MeCN w01 Aacutecido Foacutermico con 1 Parte de Diflusinal en
5050 Agua-MeCN 10 ugml (Concentracion Final Diflusinal 1 ugml) Agitado y dejado reposar 10 minutos
No Centrifugado No Filtrado
Volumen de Inyeccioacuten 1ul
Solvente A Agua w01 TFA
Solvente B MeCN w008 TFA
Flujo 1 mlmin 1 ul inyeccioacuten
Tiempo B
0 20
05 90
06 90
11 20
25 20
Page 47
Diflusinal es un anti-inflamatorio no esteroidal anaacutelogo
a la aspirina desarrollado por Merck Sharp amp Dohme
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 48
Las Columnas Superficialmente Porosas Pueden
Usarse cumpliendo los Requirimientos USP
De la lista USP de empaquetamientos de columnas LC 42009
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Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 49
Criterios de Ajuste de Meacutetodos USP y FDA Criterios de Ajuste de Meacutetodos de Dimensiones de Columna
Paraacutemetro Especificaciones Maacuteximas ComentariosEjemplos
Longitud de Columna 70 250mm 75mm
150mm 50mm
Diaacutemetro Interno de
Columna
25 (FDA ORA-LAB 545)
USP ndash 25 ID Columna puede ajustarse si la
velocidad lineal es constante
46 mm 30 mm (-35)
46 mm 21 mm (-54)
30 mm 21 mm (-30)
Flow Rate 50
Volumen de Inyeccioacuten
Reducir tanto como se necesitendash
debe cumplir los liacutemites de
deteccioacuten y precisioacuten
Si cambia a una columna maacutes
corta haga el cambio apropiado
en el volumen de inyeccioacuten
Tamantildeo de Partiacutecula Reducir hasta el 50
(no se puede aumentar)
Puede cambiar la longitud de columna y el
tamantildeo de partiacutecula para mantener la misma
Rs
5um 35um (-30)
5um 27um (-46) Cambiado en 22409 ndash Para la copia oficial y actual ir a
httpwwwfdagovScienceResearchFieldSciencedefaulthtm
USP 30 Second Supplement Revisions PF34(5) en proceso
Ver ldquo Stimuli articlerdquo en Pharmacopeial Forum 2009 35(6)
Page 49
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 50
Comparacioacuten de 46 x 250 mm 5 um con Poroshell
120 EC-C18 46 x 100 mm 27um
min 5 10 15 20 25 30
mAU
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20
40
60
80
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161
51
164
35
206
87
230
76
292
90
min 5 10 15 20 25 30
mAU
0
50
100
150
200
250
17
19
21
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11
26
06
38
67
44
37 45
58
54
50
59
20
70
37
Anaacutelisis maacutes raacutepido(columna maacutes corta flujo maacutes alto)
Mayor sensibilidad(partiacutecula maacutes pequentildeapico maacutes estrecho)
Maacutes optimizado (un anaacutelisis maacutes raacutepido permite ajustar mejor)
Ambos anaacutelisis en Agilent 1100 G1315B DAD (bajo 400 bar)
No se requiere cambio en la preparacioacuten de muestra frita de entrada
de 2 micras en ambas columnas
325 bar
110 bar
Sulfadiazina
Sulfatiazol
Sulfapiridina
Sulfamerazina
Sulfametazina
Sulfametazol
Sulfametoxipiridazina
Sulfacloropiridazina
Sulfametoxazol
Sulfadimetoxina
Tiempo B
0 8
33 33
34 33
Columna Eclipse Plus C18
46 x 250mm 5um
Flujo 1 mLmin
Fase Moacutevil
A 01 Aacutecido Foacutermico en Agua
B 01 Aacutecido Foacutermico en ACN
Tiempo B
0 8
12 33
132 33
Columna 46 x 100mm
Poroshell 120 EC-C18
27um
Flujo 185 mLmin
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Comparacioacuten de 46 x 250 mm 5 um con Poroshell
120 EC-C18 46 x 100 mm 27um
min 5 10 15 20 25 30
mAU
0
20
40
60
80
100
97
12
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16
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96
126
74
152
48
161
51
164
35
206
87
230
76
292
90
110 bar
5
mAU
0
50
100
150
200
250
17
19
21
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06
38
67
44
37 45
58
54
50
59
20
70
37
325 bar
min
Ver condiciones en diapositiva anterior
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Mejor Resolucioacuten
linea base
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 52
Anaacutelisis maacutes raacutepido del meacutetodo USP para pastillas de
Simvastatina en Columnas Poroshell 120ndash Ajuste del meacutetodo
46 x 250 mm 5-um
Agilent ZORBAX Eclipse Plus C18
46 x 75 mm 27-um
Agilent Poroshell 120 EC-C18
65 CH3CN 35 39 gL NaH2PO4 (pH 45) 45 oC Sig = 238 8 Ref = 360 100 nm
Flujos 15 mLmin para la columna de 5-um 28 mLmin para la columna Poroshell 120 27um
Requerimiento
USP
5-um
(15 mLmin)
27-um
(28 mLmin)
TR na 9907 1457
krsquo gt 30 5962 5122
N gt 4500 16939 14439
Tf lt 20 109 110
min 2 4 6 8 10
mAU
0
5
10
15
20
25
30
35
40
min 2
mAU
0
5
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15
20
25
30
35
40
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 53
Ajustes de los parametros cromatograficos en la
transferencia de meacutetodos Escalado del volume de inyeccioacuten
v1 x [(r22 x L2)(r1
2 x L1)] = V2
O bien
v2 = V1 x [(d22 x L2)(d1
2 x L1)]
v volume de inyeccioacuten
r radio de la columna
L longitud de la columna
Ajuste del flujo
F2= F1 x (L2L1 ) x (r2r1 )2
L longitud de la columna
F Flujo
r radio de la columna
Ajuste de la longitud del gradiente
En funcioacuten de la longitud de la columna
L2L1= tg2tg1
En funcioacuten del volumen muerto de columna y del flujo
tG2= tG1 x (V2V1) x (F1F2) t tiempos de gradiente
V volumen muerto de columna
F flujo
Columna ID Volumen muerto aprox
por mm longitud
46mm 100uL
30mm 425uL
21mm 208uL
10mm 047uL
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 54
Notas de Aplicacioacuten en Poroshell 120 y QuEChERS
Determination of Hormones in Shrimp by Agilent 1290 Infinity LC with
Agilent Poroshell 120 LC Column and Agilent QuEChERS for Sample
Preparation (publication 5990-6589EN)
Analysis of Pesticide Residues in Green Tea Using Agilent SampliQ
QuEChERS EN Kit by LCMSMS Detection (publication 5990-
6400EN)
Analysis of Pesticide Residues in Rice Using Agilent Bond Elut
QuEChERS AOAC Kit (publication 5990-8034EN)
Poroshell 120 for pharmaceutical analysis
Poroshell 120 Resources
QuEChERS Applications
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 55
Sumario
bull La columna Poroshell 120 es una nueva alternativa para LC de Alta
Resolucioacuten y Alta Velocidad que puede usarse en cualquier HPLC o UHPLC
bull Con la Poroshell 120 se pueden lograr separaciones de alta eficacia a baja
presioacuten
bull Puede usarse con muestras sucias sin ver una elevacioacuten anormal de la
presioacuten
bull Puede usarse en un meacutetodo USP sin comprometer los Criterios de Ajustes de
Meacutetodo
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Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 56
Soporte Teacutecnico Agilent
Teleacutefono de Atencioacuten al Cliente
901 11 68 90
email customercare_spainagilentcom
wwwagilentcomchem
![Page 14: Análisis de compuestos farmacéuticos en sangre total · PDF fileReducción en el procesamiento, el envío de la muestra, y los ... Gas flow: 10 L/min Nebulizer: 10 psi Sheath gas](https://reader031.vdocuments.site/reader031/viewer/2022030405/5a7a81727f8b9a0a668b45aa/html5/thumbnails/14.jpg)
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 14
Recuperaciones de estatinas con tarjetas Bond
Elut DMS y tarjetas de celulosa (n = 3)
Los resultados indican que cuando se usan tarjetas de celulosa hay incremento
ionico dando lugar a altas recuperaciones artificiales
Estos datos corroboran que las tarjetas no celulosicas exhiben datos de desorcioacuten
de mejor calidad comparados con las tarjetas tradicionales de celulosa
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 15
Conclusiones
Meacutetodo simple y raacutepido para el anaacutelisis de un grupo de compuestos aciacutedicos en muestras de sangre humana con DMS y LCndashMSndashMS
El meacutetodo ha demostrado se exacto preciso y robusto
Buena linealidad para la pravastatina y atorvastatina usando una regresioacuten lineal con coeficientes de correlacioacuten mejores de 0998
Estas tarjetas ofrecen mejores propiedades de desorcioacuten comparadas con las tarjetas competitivas basadas en celulosa
La columna Poroshell 120 EC-C8 es una excelente eleccioacuten para las aplicaciones bioanaacuteliticas
La tecnologia de Gota de Sangre Seca (Dried blood spots) es una teacutecnica de recoleccioacuten de muestra para el anaacutelisis de faacutermacos en estudios cliacutenicos y precliacutenicos
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 16
Referencias
N Spooner R Lad M Barfield Anal Chem 2009 811557ndash
1563
M Barfield N Spooner R Lad S Parry S Fowles
J Chromatogr B 2008 870 32ndash37
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 17
bullTecnologiacutea Innovadora no-celulosa
bullProporciona un nuevo nivel de confianza en la recoleccioacuten de muestras
bullMejora significativa en la sensibilidad analiacutetica reproducibilidad y faacutecil uso
Anaacutelisis Dried Blood Spotting (DBS)
Desarrollado en colaboracioacuten con Compantildeiacuteas farmaceacuteuticas y CROs este
dispositivo elimina problemas actuales asociados a los sistemas de DBS que
hay en el mercado
bullMuestreo de Sangre plasma o suero (liacutequido sinoviallaacutegrimas bilis LCR) para
anaacutelisis bioanaliacuteticos en pruebas farmaceacuteuticas cliacutenicas y precliacutenicas en
empresasa farmaceacuteuticas de bioanaacutelisis (DMPK ADME y MetID) (no para
Diagnoacutestico cliacutenico)
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 18
La tarjeta sin celulosa es superior de forma medible a las tarjetas de papel de celulosa
Mejora la Sentildeal del MS
bullFormato libre de celulosa ha reducido el enlazado no especiacutefico y no contiene reactivos
quiacutemicos impregnados
Ventajas del Producto
Flujo de trabajo maacutes faacutecil
bull La extraccioacuten de la muestra de la tarjeta
requiere 5 veces menos fuerza que el
producto de celulosa
Proporciona excelente homogeneidad
de la mancha
bull Extracciones reproducibles
recuperaciones maacutes altas
independientemente del nivel de
hematocrito
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 19
bull El nivel de Hematocrito es el porcentaje del volumen de sangre ocupado por las ceacutelulas
rojas de la sangre
bull El material de muestreo Bond Elut DMS tiene una estructura de fibras
maacutes ordenadas comparado con la celulosa estaacutendard
Esta es la razoacuten de porqueacute Bond Elut DMS muestra mejor
reproducibilidad
Mejor Reproducibilidad
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Bond Elut DBS Muestra Mejor Reproducibilidad
Bond Elut DMS tiene una desviacioacuten total de un 5 en todos los niveles HCT mientras que la
tarjeta de celulosa tiene una desviacioacuten de un 52 en todo el rango 10 veces de diferencia
Los datos abajo muestran la desviacioacuten de las medidas del CV desde niveles de HTC
normales (45) para tarjetas Bond Elut DMS y de celulosa (Whatman DMPK-C)
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Ventajas Clave de la Teacutecnica DBS de Agilent
bull Una vez seca la muestra de sangre no supone peligro bioloacutegico alguno y se
puede transportar sin necesidad de sistemas de refrigeracioacuten costosos
bull Permite a los laboratorios centralizar los anaacutelisis de muestra perifeacutericas
bull Se requiere menos volumen de muestra (menor nordm de sujetos en el ensayo
menor nordm de repeticiones y eliminacioacuten de sujetos sateacutelite)
bull Permite la toma demuestra en serie del mismo sujeto
bull La recoleccioacuten de sangre es maacutes sencilla
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Notas de Aplicacioacuten farmaceacuteuticas en Poroshell
120 and DMS Fast Analysis of Cefepime and Related Impurities on Poroshell 120 EC-C18 (publication 5990-7492EN) Comparing Selectivity Easy Transfer of Methods between Superficially Porous Agilent Poroshell 120 EC-C18 and totally Porous Agilent ZORBAX Eclipse Plus C18 (publication 5990-6588EN)
Analysis of Water Soluble Vitamins in Multivitamin Tablets Using Poroshell 120 EC-C18 (publication 5990-8107EN)
Analysis of Anthocyanins in Common Foods Using an Agilent Poroshell 120 SB-C18 (publication 5990-8249EN)
Analysis of Amitriptyline Fluoxetine Quetiapine and Sertraline Using Dried Plasma (publication 5990-8169EN)
Analysis of Amitriptyline Fluoxetine Quetiapine and Sertraline Using Dried Blood Spots (publication 5990-8168EN)
Investigation of Varying Blood Hematocrit Level in Dried Blood Spotting (publication 5990-8306EN)
Analysis of Cholesterol Lowering Drugs (Statins) Using Dried Matrix Spots Technology (publication 5990-8305EN)
Scalability of Agilent Columns Across HPLC and UHPLC Instruments (publication 5990-8428EN)
Converting a CHP Method for Insulin to Agilent Poroshell 120 Columns (publication 5990-9029EN)
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La propuesta QuEChERS para Determinar compuestos
Farmaceacuteuticos y Toxinas en Sangre Total
Anaacutelisis de Compuestos Farmaceacuteuticos en Sangre Total con
la columna Poroshell 120 Usando el meacutetodo Modificado
Mini-QuEChERS para la preparacioacuten de muestra
Nota de Aplicacioacuten5990-8789EN
httpwwwchemagilentcomLibraryapplications5990-8789ENpdf
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 24
Introduccioacuten
Determinacioacuten de compuestos farmaceacuteuticos en anaacutelisis cliacutenicos y
foreacutensicos ADME (DMPK)
La preparacioacuten de muestra va desde la simple precipitacioacuten de
proteinas (PPT) a la maacutes compleja extraccioacuten en fase soacutelida (SPE)
Habitualmente la SPE ha ocupado este vaciacuteo pero simpre hay
espacio para teacutecnicas de preparacioacuten de muestras que son raacutepidas y
baratas de implementar
Se describe un procedimiento mini-QuEChERS modificado con
analisis LCndashMS-MS para la determinacioacuten de faacutermacos en sangre
total
Se analizan nueve diferentes faacutermacos (lidocaina tramadol
amitriptilina biperidina oxazepam lorazepam clorpromazina
diltiazem y naloxona)
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 25
Compuestos farmaceacuteuticos usados en el estudio
Compuesto Nuacutemero CAS Log P (ow) pKa Uso
terapeacuteutico
Lidocaina 137-58-6 24 801 Anesteacutesico local
antiarrithmico
Tramadol 27203-92-5 25 941 Analgesico
Amitriptilina 50-48-6 492 94 Antidepresivo
Biperidena 514-65-8 40 108 Anticolinergico
Oxazepam 604-75-1 223 17 113 Antianxiedad
Lorazepam 846-49-1 247 13 115 Antidepresivo
Clorpromazina 50-53-3 518 93 Antipsycoacutetico
Diltiazem 42399-41-7 363 77 Bloqueante de los
canales del calcio
Naloxona 465-65-6 145 79 Antagonista de los
receptores de opio
Nortriptilina (IS) 72-69-5 565 97
5 ugmL de solucioacuten (9 compuestos) y estandar interno en metanol
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 26
La Teacutecnica de QuEChERS aplicada a las muestras
de sangre
La sangre es el maacutes complejo de los fluidos bioloacutegicos
La determinacioacuten de faacutermacos en sangre total es a menudo necesaria en los
anaacutelisis foreacutensicos dada la dificultad de obtener suero o plasma
Los procedimientos convencionales para analizar faacutermacos en matrices
complejas como la sangre total son complicados
QuEChERS es una teacutecnica de preparacioacuten de muestra que fue desarrollada
para la extraccioacuten de residuos de plaguicidas multi-clase de frutas y vegetales
en 2003
A pesar de que los fluidos bioloacutegicos pueden parecer muy diferentes a una
pieza de fruta sin embargo siguen caminos paralelos
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 27
Caminos paralelos en la preparacioacuten de muestra
Fluidos Bioloacutegicos
Matrices complejas
Rotura de la arquitectura celular
bull Lisis agitacioacuten solvente orgaacutenico
hidroacutelisis
Analitos con un amplio rango de
polaridades
Retirar analito o matriz
Anaacutelisis por LCMSMS GCMS o
GCMSMS
Frutas y Vegetales
Matrices complejas
Rotura de la arquitectura celular
bull Trituracioacuten agitacioacuten solvente
orgaacutenico hidroacutelisis
Analitos con un amplio rango de
polaridades
Retirar analito o matriz
Anaacutelisis por LCMSMS GCMS o
GCMSMS
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Procedimiento baacutesico por SPE para muestras de sangre
El pretratamiento de la sangre total implica la dilucioacuten con una
solucioacuten aacutecida un tampoacuten fosfato o aguaFA
Sonicar 15 minutos rotura de membranas celulares
Centrifugacioacuten
bull Procedimiento de SPE
ndash Acondicionado del cartucho metanol agua
ndash Carga del cartucho muestra
ndash Lavado del cartucho agua con metanol o tampoacuten metanol
ndash Elucioacuten del cartucho eluyente para el anaacutelisis
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 29
Procedimiento Baacutesico QuEChERS
15 g muestra homogeneizada (fortificada)
Antildeadir 15 mL ACN (1 AA) vortex
Antildeadir Sales de Extraccioacuten AOAC agitar
Centrifugar
Transferir 1 u 8 mL a un tubo d-SPE AOAC vortex centrifugar
Transferir al vial de Anaacutelisis
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 30
Ventajas y desventajas del Procedimiento QuEChERS
Ventajas
Extraccioacuten tipo liacutequidoliacutequido
Uso de aacutecido para interrumpir el ligado de proteinas
Exceso de sal para lisar los componentes celulares
Uso de acetonitrilo para facilitar la precipitacioacuten proteacuteica
Uso de SPE dispersiva para adsorber las interferencias de la matriz
Plossl etat J Chrom A 1135 (2006) 19-26
Desventajas
La cantidad de solvente y de muestra requeridos en el meacutetodo no
son ldquobioloacutegicamente adecuadosrdquo
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 31
Propoacutesito de la propuesta mini-Q
Ofrecer un enfoque maacutes adecuado biologicamente
Requirimientos de menores volumenes y tamantildeos de
muestra
Rango de faacutermacos varias polaridades y pKa
Evaluaciacuteoacuten de las interferencias de fondo
Extraccioacuten y datos de recuperacioacuten en un rango
aceptable
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Faacutermacos en sangre Procedimiento mini-QuEChERS
mini-Q
Procedimiento
1 Antildeadir 2 homogeneizadores ceraacutemicos
2 Antildeadir 1 o 2 mL de sangre entera a un tubo de centriacutefuga con tapoacuten de rosca
3 Antildeadir estandar interno vortex
4 Antildeadir 2 mL de ACN acidificado ( 04 FA) vortex 30 seg
5 Antildeadir 500 mg de sales de extraccioacuten agitar vigorsamente 1 minuto centrifugar 5000 rpm 1 min
6 Transferir 1 mL del extraccto al material de d-SPE en tubo de centrifuga vortex centrifugar
7 Antildeadir 200 uL a 800 uL de agua en un vial LC vortex y analizar
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 33
Refinamiento del Procedimiento mini-Q
Paraacutemetros evaluados en la teacutecnica mini-Q
Muestra de sangre total
bull La matriz bioloacutegica maacutes complicada
Adicioacuten de aacutecido tipo y cantidad
bull Efecto en la particioacuten y extraccioacuten
Adicioacuten de las sales de QuEChERS no-tamponadas o
tamponadas con NaAcetato o Citrato
bull Efecto en el extracto inspeccioacuten visual
SPE Dispersiva
bull Limpieza de la matriz y recuperaciones de los compuestos
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 34
Conclusiones del estudio
El ACN con 4 de FA como solvente de extraccioacuten muestra
una lisis maacutes completa de la muestra frente a otros solventes
de extraccioacuten que mostraron una masa soacutelida
Las sales tamponadas AOAC de acetato Soacutedico generan el
extracto maacutes liacutempio y fueron elegidas para la d-SPE
El paso de dSPE no ofrece un clean up adicional para los
meacutetodos de extraccioacuten con sales EN y no tamponadas
principalmente
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Datos de Adquisicoacuten LCMSMS
Compuestos Canales MRM
(mz) Fragmentador
(V) CE (V) RT (min) Delta RT
Lidocaina 1) 23518 gt 861
2) 23518 gt 581
97 11
35
137 04
Tramadol 1) 2642 gt 581
2) 2642 gt 2461
97 15
3
120 04
Amitriptilina 1) 2782 gt 117
2) 2782 gt 105
112 19
19
425 04
Biperidena 1)31223 gt 981
2) 31223 gt 551
123 19
60
423 07
Oxazepam 1) 28706 gt 2409
2) 28706 gt 2689
112 19
7
399 04
Lorazepam 1) 32102 gt 2749
2) 32102 gt 3029
113 15
7
409 04
Clorpromazina 1) 31911 gt 861
2) 31911 gt 581
112 15
43
463 04
Diltiazem 1) 41517 gt 1779
2) 41517 gt 1499
128 19
43
373 04
Naloxona 1) 32816 gt 310
2) 32816 gt 212
123 15
39
082 04
Nortriptilina (IS) 1) 26418 gt 233
2) 26418 gt 91
97 7
19
417 04
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045
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05
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055
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06
0625
065
0675
07
0725
075
0775
08
0825
085
0875
09
0925
095
0975
1
1025
105
1075
11
1125
115
1175
12
1225
125
1275
13
1325
135
1375
+ESI TIC Scan Frag=800V AOAC_BLANK_110228bd
1 1
Counts vs Acquisition Time (min)
05 1 15 2 25
3 35 4 45 5 55 6 65 7 75 8 85 9 95 10
Columna Poroshell 120 EC-C18 27
micro 21 x 100 mm PN 695775-902
Fase Moacutevil
A 5 mM Acetato Amoacutenico pH 5
2080 MeOHagua
B 5 mM Acetato amoacutencio en ACN
Flujo 04mLmin
Inyeccioacuten 10uL
GT (ordmC) 300
GF (lmin) 7
Nebulizador (psi) 40
SGT (ordmC) 400
SFG (lmin) 12
Capilar (V) 3500
NV (V) 500
Condiciones LCMS
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48
49
5
51
+ESI MRM Frag=1120V CID190 (2782000 -gt 1170000) HQC_6d
1 1
Counts vs Acquisition Time (min) 01 02 03 04 05 06 07 08 09 1 11 12 13 14 15 16 17 18 19 2 21 22 23 24 25 26 27 28 29 3 31 32 33 34 35 36 37 38 39 4 41 42 43 44 45 46
Nalo
xo
ne
Lid
oc
ain
e
Tra
mad
ol
Oxazep
am
Lo
razep
am
Bip
eri
de
n
Am
itri
pty
lin
e
Dil
tiazem
Ch
lorp
rom
azin
e
No
rtri
pty
lin
e (
IS)
Cromatograma LCMSMS de 10 ngmL de sangre total fortificada despueacutes
de extraccioacuten mini-QuEChERS AOAC (NaAc) y d-SPE (50mg PSA y
150mg MgSO4)
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2
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39
4
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48
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5
51
+ESI MRM Frag=1120V CID190 (2782000 -gt 1170000) HQC_6d
1 1
Counts vs Acquisition Time (min) 01 02 03 04 05 06 07 08 09 1 11 12 13 14 15 16 17 18 19 2 21 22 23 24 25 26 27 28 29 3 31 32 33 34 35 36 37 38 39 4 41 42 43 44 45 46
1 x10
415 42 425 43 435 44 445 45 455 46 465 47 475 48 485 49 495 5
505 51 515 52 525 53 535 54 545 55 555 56 565 57
+ESI MRM Frag=1120V CID190 (2871000 -gt 2409000) RE_L_1d 1
Counts vs Acquisition Time (min) 305 31 315 32 325 33 335 34 345 35 355 36 365 37 375 38 385 39 395 4 405 41 415 42 425 43 435 44 445 45 455 46 465 47 475
Relacioacuten sentildealruido para el Oxazepam y Lorazepam a
10 ngmL (10 ppb)
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 39
La Naloxone muestra esta curva de linealidad de10-250 ngmL (ppb) con una R2
= 0991
Las curvas de calibracioacuten se generaron con la respuestra relativa (area pico
analitoarea pico IS) frente a la concentracioacuten relativa (concentracion de
analitoconcentracioacuten de IS)
Ejemplo de curva de linealidad para Naloxona extraido
con mini-QuEChERS
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 40
Recuperacioacuten y Reproducibilidad
Compuesto 50 ngmL Spiked
Recuperacioacuten RSD
100 ngmL Spiked
Recuperacioacuten RSD
Lidocaine 987 157 100 118
Tramadol 105 30 104 82
Amitriptyline 104 21 104 82
Biperidene 97 45 99 82
Oxazepam 770 92 78 86
Lorazepam 819 68 818 86
Chlorpromazine 110 103 105 63
Diltiazem 881 27 917 83
Naloxone 806 90 755 77
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 41
Conclusioacutenes y trabajo posterior
El meacutetodo mini-QuEChERS para la extraccioacuten de compuestos farmaceacuteuticos en
sangre total ofrece una alternativa a otras teacutecnicas de preparacioacuten de muestras
La preparacioacuten de muestras mini-QuEChERS es un enfoque simple facil y
barato que requiere una miacutenima experiencia en preparacioacuten de muestras y
miacutenimo equipamiento
Es un punto de partida para ampliar el numero y las clasificaciones evaluadas
en otras matrices bioloacutegicas y en sangre postmortem
El trabajo futuro incluira combinaciones adecuadas tanto de las sales de
extraccioacuten como de los sorbentes de d-SPE por el meacutetodo mini-QuEChERS
La columna Poroshell 120 ofrece una selectividad diferente y excelentes formas
de pico a lo largo del amplio rango de compuestos farmaceacuteuticos usados en este
estudio
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 42
Referencias
(1) M Anastassiades SJ Lehotay D Štajnbaher and FJ Schenk J AOAC Int 86 4121 (2003)
(2) G Stubbings and T Bigwood Anal Chim Acta 637 68 (2009)
(3) RR Rasmussen IMLD Storm PZH Rasmussen J Smedsgaard and KF Nielsen Anal Bioanal Chem 397 765 (2010)
(4) D Smith and K Lynam GCμECD analysis and confirmation of PCBs in fish tissue with Agilent JampW DB-35ms and DB-XLB GC columns Agilent Technologies 5990-6236EN (2010)
(5) F Ploumlssl M Giera and F Bracher J Chrom A 1135 19 (2006)
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 43
MEJORAR LA PRODUCTIVIDAD EN
HPLC ESTAacuteNDAR CON COLUMNAS
POROSHELL
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Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 44
Columnas Poroshell 120 para HPLC y UHPLC
bull 80-90 de eficacia de las sub 2um
bull A presiones un ~40-50 maacutes bajas
bull Con un tamantildeo de partiacutecula de 27um
bull Con una frita de entrada de 2um
bull Con el doble de resolucioacuten de una
columna de 35um
bull Con un liacutemite de presioacuten de 600 bar
bull La partiacutecula tiene un nuacutecleo soacutelido
(17um) y una cubierta exterior porosa
de 05um como zona de difusioacuten
Las Columnas Poroshell 120 tienen
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Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 45
Poroshell 120 proporciona Eficacia Suficiente
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Flujo 0582 mLmin AcetonitriloAgua (6040)
Volumen de Inyeccioacuten 4 microL
TCC 26 oC
DAD Sig=2544nm Ref=360100nm
Muestra Muestra de test RRLC
(PN 5188-6529) inoculada con
50 microL 2 mgmL Tiourea en
aguaacetonitrilo (6535)
25 5 75 10
mAU
0
200
400
600
06
46
0
82
6
11
48
15
18
20
16
2
22
3
28
16
41
32
62
73
97
53
larr N = 25053 Presioacuten = 182 bar
Poroshell 120 EC-C18 30 x 100 mm 27 um
min 25 5 75 10 125
mAU
0
200
400
600
06
49
0
86
5
12
75
17
56
24
18
27
05
34
94
52
81
82
18
13
04
1
larr N = 27295 Presioacuten = 386 bar
Eclipse Plus C18 30 x 100 mm 18 um
gt90 de la Eficacia de una 18um
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 46
iquestEn queacute tipos de instrumentos puede usar
Columnas Poroshell 120 HPLCrsquos y UHPLCrsquos
Consideraciones en UHPLC
bull Las columnas Poroshell 120 tienen un liacutemite de presioacuten de 600 bar
bull Los UHPLC estaacuten ajustados para columnas de bajo volumen por lo tanto las
Poroshell pueden usarse en todos los UHPLC
Consideraciones en HPLC
bull Las Columnas Poroshell 120 trabajan bien por debajo de 400 bar
bull Minimize los volumenes extra columna para las columnas 21 y 30mm ID ndash
siga las instrucciones dadas para las columnas RRHT (18um 600 bar)
bull Use en el detector velocidades adecuadas de adquisicioacuten para picos
estrechos de alta eficacia
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Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 47
Con una frita de 2 um Poroshell 120 no se bloquea
Muestras Complejas- Plasma
Diflusinal in Plasma
0
20
40
60
80
100
120
140
160
180
200
220
240
260
280
300
320
340
360
380
400
1 501 1001 1501 2001 2501
Injections
Pre
ssu
re
0
20000
40000
60000
80000
100000
120000
140000
160000
180000
200000
Eff
icie
ncy (
N)
End Press
Plates
Columna Poroshell 120 EC-C18 30 x 50mm 27um LC Agilent 1200 RRLC (SL)
Muestra Plasma Precipitado 2 partes Plasma 7 Partes 2080 Agua-MeCN w01 Aacutecido Foacutermico con 1 Parte de Diflusinal en
5050 Agua-MeCN 10 ugml (Concentracion Final Diflusinal 1 ugml) Agitado y dejado reposar 10 minutos
No Centrifugado No Filtrado
Volumen de Inyeccioacuten 1ul
Solvente A Agua w01 TFA
Solvente B MeCN w008 TFA
Flujo 1 mlmin 1 ul inyeccioacuten
Tiempo B
0 20
05 90
06 90
11 20
25 20
Page 47
Diflusinal es un anti-inflamatorio no esteroidal anaacutelogo
a la aspirina desarrollado por Merck Sharp amp Dohme
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Las Columnas Superficialmente Porosas Pueden
Usarse cumpliendo los Requirimientos USP
De la lista USP de empaquetamientos de columnas LC 42009
Page 48
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Criterios de Ajuste de Meacutetodos USP y FDA Criterios de Ajuste de Meacutetodos de Dimensiones de Columna
Paraacutemetro Especificaciones Maacuteximas ComentariosEjemplos
Longitud de Columna 70 250mm 75mm
150mm 50mm
Diaacutemetro Interno de
Columna
25 (FDA ORA-LAB 545)
USP ndash 25 ID Columna puede ajustarse si la
velocidad lineal es constante
46 mm 30 mm (-35)
46 mm 21 mm (-54)
30 mm 21 mm (-30)
Flow Rate 50
Volumen de Inyeccioacuten
Reducir tanto como se necesitendash
debe cumplir los liacutemites de
deteccioacuten y precisioacuten
Si cambia a una columna maacutes
corta haga el cambio apropiado
en el volumen de inyeccioacuten
Tamantildeo de Partiacutecula Reducir hasta el 50
(no se puede aumentar)
Puede cambiar la longitud de columna y el
tamantildeo de partiacutecula para mantener la misma
Rs
5um 35um (-30)
5um 27um (-46) Cambiado en 22409 ndash Para la copia oficial y actual ir a
httpwwwfdagovScienceResearchFieldSciencedefaulthtm
USP 30 Second Supplement Revisions PF34(5) en proceso
Ver ldquo Stimuli articlerdquo en Pharmacopeial Forum 2009 35(6)
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Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 50
Comparacioacuten de 46 x 250 mm 5 um con Poroshell
120 EC-C18 46 x 100 mm 27um
min 5 10 15 20 25 30
mAU
0
20
40
60
80
100
97
12
111
16
115
96
126
74
152
48
161
51
164
35
206
87
230
76
292
90
min 5 10 15 20 25 30
mAU
0
50
100
150
200
250
17
19
21
89
23
11
26
06
38
67
44
37 45
58
54
50
59
20
70
37
Anaacutelisis maacutes raacutepido(columna maacutes corta flujo maacutes alto)
Mayor sensibilidad(partiacutecula maacutes pequentildeapico maacutes estrecho)
Maacutes optimizado (un anaacutelisis maacutes raacutepido permite ajustar mejor)
Ambos anaacutelisis en Agilent 1100 G1315B DAD (bajo 400 bar)
No se requiere cambio en la preparacioacuten de muestra frita de entrada
de 2 micras en ambas columnas
325 bar
110 bar
Sulfadiazina
Sulfatiazol
Sulfapiridina
Sulfamerazina
Sulfametazina
Sulfametazol
Sulfametoxipiridazina
Sulfacloropiridazina
Sulfametoxazol
Sulfadimetoxina
Tiempo B
0 8
33 33
34 33
Columna Eclipse Plus C18
46 x 250mm 5um
Flujo 1 mLmin
Fase Moacutevil
A 01 Aacutecido Foacutermico en Agua
B 01 Aacutecido Foacutermico en ACN
Tiempo B
0 8
12 33
132 33
Columna 46 x 100mm
Poroshell 120 EC-C18
27um
Flujo 185 mLmin
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Comparacioacuten de 46 x 250 mm 5 um con Poroshell
120 EC-C18 46 x 100 mm 27um
min 5 10 15 20 25 30
mAU
0
20
40
60
80
100
97
12
111
16
115
96
126
74
152
48
161
51
164
35
206
87
230
76
292
90
110 bar
5
mAU
0
50
100
150
200
250
17
19
21
89
23
11
26
06
38
67
44
37 45
58
54
50
59
20
70
37
325 bar
min
Ver condiciones en diapositiva anterior
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Mejor Resolucioacuten
linea base
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 52
Anaacutelisis maacutes raacutepido del meacutetodo USP para pastillas de
Simvastatina en Columnas Poroshell 120ndash Ajuste del meacutetodo
46 x 250 mm 5-um
Agilent ZORBAX Eclipse Plus C18
46 x 75 mm 27-um
Agilent Poroshell 120 EC-C18
65 CH3CN 35 39 gL NaH2PO4 (pH 45) 45 oC Sig = 238 8 Ref = 360 100 nm
Flujos 15 mLmin para la columna de 5-um 28 mLmin para la columna Poroshell 120 27um
Requerimiento
USP
5-um
(15 mLmin)
27-um
(28 mLmin)
TR na 9907 1457
krsquo gt 30 5962 5122
N gt 4500 16939 14439
Tf lt 20 109 110
min 2 4 6 8 10
mAU
0
5
10
15
20
25
30
35
40
min 2
mAU
0
5
10
15
20
25
30
35
40
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Ajustes de los parametros cromatograficos en la
transferencia de meacutetodos Escalado del volume de inyeccioacuten
v1 x [(r22 x L2)(r1
2 x L1)] = V2
O bien
v2 = V1 x [(d22 x L2)(d1
2 x L1)]
v volume de inyeccioacuten
r radio de la columna
L longitud de la columna
Ajuste del flujo
F2= F1 x (L2L1 ) x (r2r1 )2
L longitud de la columna
F Flujo
r radio de la columna
Ajuste de la longitud del gradiente
En funcioacuten de la longitud de la columna
L2L1= tg2tg1
En funcioacuten del volumen muerto de columna y del flujo
tG2= tG1 x (V2V1) x (F1F2) t tiempos de gradiente
V volumen muerto de columna
F flujo
Columna ID Volumen muerto aprox
por mm longitud
46mm 100uL
30mm 425uL
21mm 208uL
10mm 047uL
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 54
Notas de Aplicacioacuten en Poroshell 120 y QuEChERS
Determination of Hormones in Shrimp by Agilent 1290 Infinity LC with
Agilent Poroshell 120 LC Column and Agilent QuEChERS for Sample
Preparation (publication 5990-6589EN)
Analysis of Pesticide Residues in Green Tea Using Agilent SampliQ
QuEChERS EN Kit by LCMSMS Detection (publication 5990-
6400EN)
Analysis of Pesticide Residues in Rice Using Agilent Bond Elut
QuEChERS AOAC Kit (publication 5990-8034EN)
Poroshell 120 for pharmaceutical analysis
Poroshell 120 Resources
QuEChERS Applications
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 55
Sumario
bull La columna Poroshell 120 es una nueva alternativa para LC de Alta
Resolucioacuten y Alta Velocidad que puede usarse en cualquier HPLC o UHPLC
bull Con la Poroshell 120 se pueden lograr separaciones de alta eficacia a baja
presioacuten
bull Puede usarse con muestras sucias sin ver una elevacioacuten anormal de la
presioacuten
bull Puede usarse en un meacutetodo USP sin comprometer los Criterios de Ajustes de
Meacutetodo
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Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 56
Soporte Teacutecnico Agilent
Teleacutefono de Atencioacuten al Cliente
901 11 68 90
email customercare_spainagilentcom
wwwagilentcomchem
![Page 15: Análisis de compuestos farmacéuticos en sangre total · PDF fileReducción en el procesamiento, el envío de la muestra, y los ... Gas flow: 10 L/min Nebulizer: 10 psi Sheath gas](https://reader031.vdocuments.site/reader031/viewer/2022030405/5a7a81727f8b9a0a668b45aa/html5/thumbnails/15.jpg)
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 15
Conclusiones
Meacutetodo simple y raacutepido para el anaacutelisis de un grupo de compuestos aciacutedicos en muestras de sangre humana con DMS y LCndashMSndashMS
El meacutetodo ha demostrado se exacto preciso y robusto
Buena linealidad para la pravastatina y atorvastatina usando una regresioacuten lineal con coeficientes de correlacioacuten mejores de 0998
Estas tarjetas ofrecen mejores propiedades de desorcioacuten comparadas con las tarjetas competitivas basadas en celulosa
La columna Poroshell 120 EC-C8 es una excelente eleccioacuten para las aplicaciones bioanaacuteliticas
La tecnologia de Gota de Sangre Seca (Dried blood spots) es una teacutecnica de recoleccioacuten de muestra para el anaacutelisis de faacutermacos en estudios cliacutenicos y precliacutenicos
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 16
Referencias
N Spooner R Lad M Barfield Anal Chem 2009 811557ndash
1563
M Barfield N Spooner R Lad S Parry S Fowles
J Chromatogr B 2008 870 32ndash37
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 17
bullTecnologiacutea Innovadora no-celulosa
bullProporciona un nuevo nivel de confianza en la recoleccioacuten de muestras
bullMejora significativa en la sensibilidad analiacutetica reproducibilidad y faacutecil uso
Anaacutelisis Dried Blood Spotting (DBS)
Desarrollado en colaboracioacuten con Compantildeiacuteas farmaceacuteuticas y CROs este
dispositivo elimina problemas actuales asociados a los sistemas de DBS que
hay en el mercado
bullMuestreo de Sangre plasma o suero (liacutequido sinoviallaacutegrimas bilis LCR) para
anaacutelisis bioanaliacuteticos en pruebas farmaceacuteuticas cliacutenicas y precliacutenicas en
empresasa farmaceacuteuticas de bioanaacutelisis (DMPK ADME y MetID) (no para
Diagnoacutestico cliacutenico)
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 18
La tarjeta sin celulosa es superior de forma medible a las tarjetas de papel de celulosa
Mejora la Sentildeal del MS
bullFormato libre de celulosa ha reducido el enlazado no especiacutefico y no contiene reactivos
quiacutemicos impregnados
Ventajas del Producto
Flujo de trabajo maacutes faacutecil
bull La extraccioacuten de la muestra de la tarjeta
requiere 5 veces menos fuerza que el
producto de celulosa
Proporciona excelente homogeneidad
de la mancha
bull Extracciones reproducibles
recuperaciones maacutes altas
independientemente del nivel de
hematocrito
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 19
bull El nivel de Hematocrito es el porcentaje del volumen de sangre ocupado por las ceacutelulas
rojas de la sangre
bull El material de muestreo Bond Elut DMS tiene una estructura de fibras
maacutes ordenadas comparado con la celulosa estaacutendard
Esta es la razoacuten de porqueacute Bond Elut DMS muestra mejor
reproducibilidad
Mejor Reproducibilidad
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 20
Bond Elut DBS Muestra Mejor Reproducibilidad
Bond Elut DMS tiene una desviacioacuten total de un 5 en todos los niveles HCT mientras que la
tarjeta de celulosa tiene una desviacioacuten de un 52 en todo el rango 10 veces de diferencia
Los datos abajo muestran la desviacioacuten de las medidas del CV desde niveles de HTC
normales (45) para tarjetas Bond Elut DMS y de celulosa (Whatman DMPK-C)
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 21
Ventajas Clave de la Teacutecnica DBS de Agilent
bull Una vez seca la muestra de sangre no supone peligro bioloacutegico alguno y se
puede transportar sin necesidad de sistemas de refrigeracioacuten costosos
bull Permite a los laboratorios centralizar los anaacutelisis de muestra perifeacutericas
bull Se requiere menos volumen de muestra (menor nordm de sujetos en el ensayo
menor nordm de repeticiones y eliminacioacuten de sujetos sateacutelite)
bull Permite la toma demuestra en serie del mismo sujeto
bull La recoleccioacuten de sangre es maacutes sencilla
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 22
Notas de Aplicacioacuten farmaceacuteuticas en Poroshell
120 and DMS Fast Analysis of Cefepime and Related Impurities on Poroshell 120 EC-C18 (publication 5990-7492EN) Comparing Selectivity Easy Transfer of Methods between Superficially Porous Agilent Poroshell 120 EC-C18 and totally Porous Agilent ZORBAX Eclipse Plus C18 (publication 5990-6588EN)
Analysis of Water Soluble Vitamins in Multivitamin Tablets Using Poroshell 120 EC-C18 (publication 5990-8107EN)
Analysis of Anthocyanins in Common Foods Using an Agilent Poroshell 120 SB-C18 (publication 5990-8249EN)
Analysis of Amitriptyline Fluoxetine Quetiapine and Sertraline Using Dried Plasma (publication 5990-8169EN)
Analysis of Amitriptyline Fluoxetine Quetiapine and Sertraline Using Dried Blood Spots (publication 5990-8168EN)
Investigation of Varying Blood Hematocrit Level in Dried Blood Spotting (publication 5990-8306EN)
Analysis of Cholesterol Lowering Drugs (Statins) Using Dried Matrix Spots Technology (publication 5990-8305EN)
Scalability of Agilent Columns Across HPLC and UHPLC Instruments (publication 5990-8428EN)
Converting a CHP Method for Insulin to Agilent Poroshell 120 Columns (publication 5990-9029EN)
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 23
La propuesta QuEChERS para Determinar compuestos
Farmaceacuteuticos y Toxinas en Sangre Total
Anaacutelisis de Compuestos Farmaceacuteuticos en Sangre Total con
la columna Poroshell 120 Usando el meacutetodo Modificado
Mini-QuEChERS para la preparacioacuten de muestra
Nota de Aplicacioacuten5990-8789EN
httpwwwchemagilentcomLibraryapplications5990-8789ENpdf
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 24
Introduccioacuten
Determinacioacuten de compuestos farmaceacuteuticos en anaacutelisis cliacutenicos y
foreacutensicos ADME (DMPK)
La preparacioacuten de muestra va desde la simple precipitacioacuten de
proteinas (PPT) a la maacutes compleja extraccioacuten en fase soacutelida (SPE)
Habitualmente la SPE ha ocupado este vaciacuteo pero simpre hay
espacio para teacutecnicas de preparacioacuten de muestras que son raacutepidas y
baratas de implementar
Se describe un procedimiento mini-QuEChERS modificado con
analisis LCndashMS-MS para la determinacioacuten de faacutermacos en sangre
total
Se analizan nueve diferentes faacutermacos (lidocaina tramadol
amitriptilina biperidina oxazepam lorazepam clorpromazina
diltiazem y naloxona)
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 25
Compuestos farmaceacuteuticos usados en el estudio
Compuesto Nuacutemero CAS Log P (ow) pKa Uso
terapeacuteutico
Lidocaina 137-58-6 24 801 Anesteacutesico local
antiarrithmico
Tramadol 27203-92-5 25 941 Analgesico
Amitriptilina 50-48-6 492 94 Antidepresivo
Biperidena 514-65-8 40 108 Anticolinergico
Oxazepam 604-75-1 223 17 113 Antianxiedad
Lorazepam 846-49-1 247 13 115 Antidepresivo
Clorpromazina 50-53-3 518 93 Antipsycoacutetico
Diltiazem 42399-41-7 363 77 Bloqueante de los
canales del calcio
Naloxona 465-65-6 145 79 Antagonista de los
receptores de opio
Nortriptilina (IS) 72-69-5 565 97
5 ugmL de solucioacuten (9 compuestos) y estandar interno en metanol
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 26
La Teacutecnica de QuEChERS aplicada a las muestras
de sangre
La sangre es el maacutes complejo de los fluidos bioloacutegicos
La determinacioacuten de faacutermacos en sangre total es a menudo necesaria en los
anaacutelisis foreacutensicos dada la dificultad de obtener suero o plasma
Los procedimientos convencionales para analizar faacutermacos en matrices
complejas como la sangre total son complicados
QuEChERS es una teacutecnica de preparacioacuten de muestra que fue desarrollada
para la extraccioacuten de residuos de plaguicidas multi-clase de frutas y vegetales
en 2003
A pesar de que los fluidos bioloacutegicos pueden parecer muy diferentes a una
pieza de fruta sin embargo siguen caminos paralelos
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 27
Caminos paralelos en la preparacioacuten de muestra
Fluidos Bioloacutegicos
Matrices complejas
Rotura de la arquitectura celular
bull Lisis agitacioacuten solvente orgaacutenico
hidroacutelisis
Analitos con un amplio rango de
polaridades
Retirar analito o matriz
Anaacutelisis por LCMSMS GCMS o
GCMSMS
Frutas y Vegetales
Matrices complejas
Rotura de la arquitectura celular
bull Trituracioacuten agitacioacuten solvente
orgaacutenico hidroacutelisis
Analitos con un amplio rango de
polaridades
Retirar analito o matriz
Anaacutelisis por LCMSMS GCMS o
GCMSMS
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 28
Procedimiento baacutesico por SPE para muestras de sangre
El pretratamiento de la sangre total implica la dilucioacuten con una
solucioacuten aacutecida un tampoacuten fosfato o aguaFA
Sonicar 15 minutos rotura de membranas celulares
Centrifugacioacuten
bull Procedimiento de SPE
ndash Acondicionado del cartucho metanol agua
ndash Carga del cartucho muestra
ndash Lavado del cartucho agua con metanol o tampoacuten metanol
ndash Elucioacuten del cartucho eluyente para el anaacutelisis
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 29
Procedimiento Baacutesico QuEChERS
15 g muestra homogeneizada (fortificada)
Antildeadir 15 mL ACN (1 AA) vortex
Antildeadir Sales de Extraccioacuten AOAC agitar
Centrifugar
Transferir 1 u 8 mL a un tubo d-SPE AOAC vortex centrifugar
Transferir al vial de Anaacutelisis
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 30
Ventajas y desventajas del Procedimiento QuEChERS
Ventajas
Extraccioacuten tipo liacutequidoliacutequido
Uso de aacutecido para interrumpir el ligado de proteinas
Exceso de sal para lisar los componentes celulares
Uso de acetonitrilo para facilitar la precipitacioacuten proteacuteica
Uso de SPE dispersiva para adsorber las interferencias de la matriz
Plossl etat J Chrom A 1135 (2006) 19-26
Desventajas
La cantidad de solvente y de muestra requeridos en el meacutetodo no
son ldquobioloacutegicamente adecuadosrdquo
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 31
Propoacutesito de la propuesta mini-Q
Ofrecer un enfoque maacutes adecuado biologicamente
Requirimientos de menores volumenes y tamantildeos de
muestra
Rango de faacutermacos varias polaridades y pKa
Evaluaciacuteoacuten de las interferencias de fondo
Extraccioacuten y datos de recuperacioacuten en un rango
aceptable
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 32
Faacutermacos en sangre Procedimiento mini-QuEChERS
mini-Q
Procedimiento
1 Antildeadir 2 homogeneizadores ceraacutemicos
2 Antildeadir 1 o 2 mL de sangre entera a un tubo de centriacutefuga con tapoacuten de rosca
3 Antildeadir estandar interno vortex
4 Antildeadir 2 mL de ACN acidificado ( 04 FA) vortex 30 seg
5 Antildeadir 500 mg de sales de extraccioacuten agitar vigorsamente 1 minuto centrifugar 5000 rpm 1 min
6 Transferir 1 mL del extraccto al material de d-SPE en tubo de centrifuga vortex centrifugar
7 Antildeadir 200 uL a 800 uL de agua en un vial LC vortex y analizar
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 33
Refinamiento del Procedimiento mini-Q
Paraacutemetros evaluados en la teacutecnica mini-Q
Muestra de sangre total
bull La matriz bioloacutegica maacutes complicada
Adicioacuten de aacutecido tipo y cantidad
bull Efecto en la particioacuten y extraccioacuten
Adicioacuten de las sales de QuEChERS no-tamponadas o
tamponadas con NaAcetato o Citrato
bull Efecto en el extracto inspeccioacuten visual
SPE Dispersiva
bull Limpieza de la matriz y recuperaciones de los compuestos
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 34
Conclusiones del estudio
El ACN con 4 de FA como solvente de extraccioacuten muestra
una lisis maacutes completa de la muestra frente a otros solventes
de extraccioacuten que mostraron una masa soacutelida
Las sales tamponadas AOAC de acetato Soacutedico generan el
extracto maacutes liacutempio y fueron elegidas para la d-SPE
El paso de dSPE no ofrece un clean up adicional para los
meacutetodos de extraccioacuten con sales EN y no tamponadas
principalmente
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 35
Datos de Adquisicoacuten LCMSMS
Compuestos Canales MRM
(mz) Fragmentador
(V) CE (V) RT (min) Delta RT
Lidocaina 1) 23518 gt 861
2) 23518 gt 581
97 11
35
137 04
Tramadol 1) 2642 gt 581
2) 2642 gt 2461
97 15
3
120 04
Amitriptilina 1) 2782 gt 117
2) 2782 gt 105
112 19
19
425 04
Biperidena 1)31223 gt 981
2) 31223 gt 551
123 19
60
423 07
Oxazepam 1) 28706 gt 2409
2) 28706 gt 2689
112 19
7
399 04
Lorazepam 1) 32102 gt 2749
2) 32102 gt 3029
113 15
7
409 04
Clorpromazina 1) 31911 gt 861
2) 31911 gt 581
112 15
43
463 04
Diltiazem 1) 41517 gt 1779
2) 41517 gt 1499
128 19
43
373 04
Naloxona 1) 32816 gt 310
2) 32816 gt 212
123 15
39
082 04
Nortriptilina (IS) 1) 26418 gt 233
2) 26418 gt 91
97 7
19
417 04
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7 x10
0125
015
0175
02
0225
025
0275
03
0325
035
0375
04
0425
045
0475
05
0525
055
0575
06
0625
065
0675
07
0725
075
0775
08
0825
085
0875
09
0925
095
0975
1
1025
105
1075
11
1125
115
1175
12
1225
125
1275
13
1325
135
1375
+ESI TIC Scan Frag=800V AOAC_BLANK_110228bd
1 1
Counts vs Acquisition Time (min)
05 1 15 2 25
3 35 4 45 5 55 6 65 7 75 8 85 9 95 10
Columna Poroshell 120 EC-C18 27
micro 21 x 100 mm PN 695775-902
Fase Moacutevil
A 5 mM Acetato Amoacutenico pH 5
2080 MeOHagua
B 5 mM Acetato amoacutencio en ACN
Flujo 04mLmin
Inyeccioacuten 10uL
GT (ordmC) 300
GF (lmin) 7
Nebulizador (psi) 40
SGT (ordmC) 400
SFG (lmin) 12
Capilar (V) 3500
NV (V) 500
Condiciones LCMS
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 37
3 x10
01
02
03
04
05
06
07
08
09
1
11
12
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14
15
16
17
18
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2
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3
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4
41
42
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45
46
47
48
49
5
51
+ESI MRM Frag=1120V CID190 (2782000 -gt 1170000) HQC_6d
1 1
Counts vs Acquisition Time (min) 01 02 03 04 05 06 07 08 09 1 11 12 13 14 15 16 17 18 19 2 21 22 23 24 25 26 27 28 29 3 31 32 33 34 35 36 37 38 39 4 41 42 43 44 45 46
Nalo
xo
ne
Lid
oc
ain
e
Tra
mad
ol
Oxazep
am
Lo
razep
am
Bip
eri
de
n
Am
itri
pty
lin
e
Dil
tiazem
Ch
lorp
rom
azin
e
No
rtri
pty
lin
e (
IS)
Cromatograma LCMSMS de 10 ngmL de sangre total fortificada despueacutes
de extraccioacuten mini-QuEChERS AOAC (NaAc) y d-SPE (50mg PSA y
150mg MgSO4)
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3 x10
01
02
03
04
05
06
07
08
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2
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5
51
+ESI MRM Frag=1120V CID190 (2782000 -gt 1170000) HQC_6d
1 1
Counts vs Acquisition Time (min) 01 02 03 04 05 06 07 08 09 1 11 12 13 14 15 16 17 18 19 2 21 22 23 24 25 26 27 28 29 3 31 32 33 34 35 36 37 38 39 4 41 42 43 44 45 46
1 x10
415 42 425 43 435 44 445 45 455 46 465 47 475 48 485 49 495 5
505 51 515 52 525 53 535 54 545 55 555 56 565 57
+ESI MRM Frag=1120V CID190 (2871000 -gt 2409000) RE_L_1d 1
Counts vs Acquisition Time (min) 305 31 315 32 325 33 335 34 345 35 355 36 365 37 375 38 385 39 395 4 405 41 415 42 425 43 435 44 445 45 455 46 465 47 475
Relacioacuten sentildealruido para el Oxazepam y Lorazepam a
10 ngmL (10 ppb)
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 39
La Naloxone muestra esta curva de linealidad de10-250 ngmL (ppb) con una R2
= 0991
Las curvas de calibracioacuten se generaron con la respuestra relativa (area pico
analitoarea pico IS) frente a la concentracioacuten relativa (concentracion de
analitoconcentracioacuten de IS)
Ejemplo de curva de linealidad para Naloxona extraido
con mini-QuEChERS
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 40
Recuperacioacuten y Reproducibilidad
Compuesto 50 ngmL Spiked
Recuperacioacuten RSD
100 ngmL Spiked
Recuperacioacuten RSD
Lidocaine 987 157 100 118
Tramadol 105 30 104 82
Amitriptyline 104 21 104 82
Biperidene 97 45 99 82
Oxazepam 770 92 78 86
Lorazepam 819 68 818 86
Chlorpromazine 110 103 105 63
Diltiazem 881 27 917 83
Naloxone 806 90 755 77
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 41
Conclusioacutenes y trabajo posterior
El meacutetodo mini-QuEChERS para la extraccioacuten de compuestos farmaceacuteuticos en
sangre total ofrece una alternativa a otras teacutecnicas de preparacioacuten de muestras
La preparacioacuten de muestras mini-QuEChERS es un enfoque simple facil y
barato que requiere una miacutenima experiencia en preparacioacuten de muestras y
miacutenimo equipamiento
Es un punto de partida para ampliar el numero y las clasificaciones evaluadas
en otras matrices bioloacutegicas y en sangre postmortem
El trabajo futuro incluira combinaciones adecuadas tanto de las sales de
extraccioacuten como de los sorbentes de d-SPE por el meacutetodo mini-QuEChERS
La columna Poroshell 120 ofrece una selectividad diferente y excelentes formas
de pico a lo largo del amplio rango de compuestos farmaceacuteuticos usados en este
estudio
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 42
Referencias
(1) M Anastassiades SJ Lehotay D Štajnbaher and FJ Schenk J AOAC Int 86 4121 (2003)
(2) G Stubbings and T Bigwood Anal Chim Acta 637 68 (2009)
(3) RR Rasmussen IMLD Storm PZH Rasmussen J Smedsgaard and KF Nielsen Anal Bioanal Chem 397 765 (2010)
(4) D Smith and K Lynam GCμECD analysis and confirmation of PCBs in fish tissue with Agilent JampW DB-35ms and DB-XLB GC columns Agilent Technologies 5990-6236EN (2010)
(5) F Ploumlssl M Giera and F Bracher J Chrom A 1135 19 (2006)
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 43
MEJORAR LA PRODUCTIVIDAD EN
HPLC ESTAacuteNDAR CON COLUMNAS
POROSHELL
Page 43
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 44
Columnas Poroshell 120 para HPLC y UHPLC
bull 80-90 de eficacia de las sub 2um
bull A presiones un ~40-50 maacutes bajas
bull Con un tamantildeo de partiacutecula de 27um
bull Con una frita de entrada de 2um
bull Con el doble de resolucioacuten de una
columna de 35um
bull Con un liacutemite de presioacuten de 600 bar
bull La partiacutecula tiene un nuacutecleo soacutelido
(17um) y una cubierta exterior porosa
de 05um como zona de difusioacuten
Las Columnas Poroshell 120 tienen
Page 44
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 45
Poroshell 120 proporciona Eficacia Suficiente
Page 45
Flujo 0582 mLmin AcetonitriloAgua (6040)
Volumen de Inyeccioacuten 4 microL
TCC 26 oC
DAD Sig=2544nm Ref=360100nm
Muestra Muestra de test RRLC
(PN 5188-6529) inoculada con
50 microL 2 mgmL Tiourea en
aguaacetonitrilo (6535)
25 5 75 10
mAU
0
200
400
600
06
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6
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3
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73
97
53
larr N = 25053 Presioacuten = 182 bar
Poroshell 120 EC-C18 30 x 100 mm 27 um
min 25 5 75 10 125
mAU
0
200
400
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81
82
18
13
04
1
larr N = 27295 Presioacuten = 386 bar
Eclipse Plus C18 30 x 100 mm 18 um
gt90 de la Eficacia de una 18um
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 46
iquestEn queacute tipos de instrumentos puede usar
Columnas Poroshell 120 HPLCrsquos y UHPLCrsquos
Consideraciones en UHPLC
bull Las columnas Poroshell 120 tienen un liacutemite de presioacuten de 600 bar
bull Los UHPLC estaacuten ajustados para columnas de bajo volumen por lo tanto las
Poroshell pueden usarse en todos los UHPLC
Consideraciones en HPLC
bull Las Columnas Poroshell 120 trabajan bien por debajo de 400 bar
bull Minimize los volumenes extra columna para las columnas 21 y 30mm ID ndash
siga las instrucciones dadas para las columnas RRHT (18um 600 bar)
bull Use en el detector velocidades adecuadas de adquisicioacuten para picos
estrechos de alta eficacia
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Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 47
Con una frita de 2 um Poroshell 120 no se bloquea
Muestras Complejas- Plasma
Diflusinal in Plasma
0
20
40
60
80
100
120
140
160
180
200
220
240
260
280
300
320
340
360
380
400
1 501 1001 1501 2001 2501
Injections
Pre
ssu
re
0
20000
40000
60000
80000
100000
120000
140000
160000
180000
200000
Eff
icie
ncy (
N)
End Press
Plates
Columna Poroshell 120 EC-C18 30 x 50mm 27um LC Agilent 1200 RRLC (SL)
Muestra Plasma Precipitado 2 partes Plasma 7 Partes 2080 Agua-MeCN w01 Aacutecido Foacutermico con 1 Parte de Diflusinal en
5050 Agua-MeCN 10 ugml (Concentracion Final Diflusinal 1 ugml) Agitado y dejado reposar 10 minutos
No Centrifugado No Filtrado
Volumen de Inyeccioacuten 1ul
Solvente A Agua w01 TFA
Solvente B MeCN w008 TFA
Flujo 1 mlmin 1 ul inyeccioacuten
Tiempo B
0 20
05 90
06 90
11 20
25 20
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Diflusinal es un anti-inflamatorio no esteroidal anaacutelogo
a la aspirina desarrollado por Merck Sharp amp Dohme
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Las Columnas Superficialmente Porosas Pueden
Usarse cumpliendo los Requirimientos USP
De la lista USP de empaquetamientos de columnas LC 42009
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Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 49
Criterios de Ajuste de Meacutetodos USP y FDA Criterios de Ajuste de Meacutetodos de Dimensiones de Columna
Paraacutemetro Especificaciones Maacuteximas ComentariosEjemplos
Longitud de Columna 70 250mm 75mm
150mm 50mm
Diaacutemetro Interno de
Columna
25 (FDA ORA-LAB 545)
USP ndash 25 ID Columna puede ajustarse si la
velocidad lineal es constante
46 mm 30 mm (-35)
46 mm 21 mm (-54)
30 mm 21 mm (-30)
Flow Rate 50
Volumen de Inyeccioacuten
Reducir tanto como se necesitendash
debe cumplir los liacutemites de
deteccioacuten y precisioacuten
Si cambia a una columna maacutes
corta haga el cambio apropiado
en el volumen de inyeccioacuten
Tamantildeo de Partiacutecula Reducir hasta el 50
(no se puede aumentar)
Puede cambiar la longitud de columna y el
tamantildeo de partiacutecula para mantener la misma
Rs
5um 35um (-30)
5um 27um (-46) Cambiado en 22409 ndash Para la copia oficial y actual ir a
httpwwwfdagovScienceResearchFieldSciencedefaulthtm
USP 30 Second Supplement Revisions PF34(5) en proceso
Ver ldquo Stimuli articlerdquo en Pharmacopeial Forum 2009 35(6)
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Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 50
Comparacioacuten de 46 x 250 mm 5 um con Poroshell
120 EC-C18 46 x 100 mm 27um
min 5 10 15 20 25 30
mAU
0
20
40
60
80
100
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16
115
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126
74
152
48
161
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164
35
206
87
230
76
292
90
min 5 10 15 20 25 30
mAU
0
50
100
150
200
250
17
19
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11
26
06
38
67
44
37 45
58
54
50
59
20
70
37
Anaacutelisis maacutes raacutepido(columna maacutes corta flujo maacutes alto)
Mayor sensibilidad(partiacutecula maacutes pequentildeapico maacutes estrecho)
Maacutes optimizado (un anaacutelisis maacutes raacutepido permite ajustar mejor)
Ambos anaacutelisis en Agilent 1100 G1315B DAD (bajo 400 bar)
No se requiere cambio en la preparacioacuten de muestra frita de entrada
de 2 micras en ambas columnas
325 bar
110 bar
Sulfadiazina
Sulfatiazol
Sulfapiridina
Sulfamerazina
Sulfametazina
Sulfametazol
Sulfametoxipiridazina
Sulfacloropiridazina
Sulfametoxazol
Sulfadimetoxina
Tiempo B
0 8
33 33
34 33
Columna Eclipse Plus C18
46 x 250mm 5um
Flujo 1 mLmin
Fase Moacutevil
A 01 Aacutecido Foacutermico en Agua
B 01 Aacutecido Foacutermico en ACN
Tiempo B
0 8
12 33
132 33
Columna 46 x 100mm
Poroshell 120 EC-C18
27um
Flujo 185 mLmin
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Comparacioacuten de 46 x 250 mm 5 um con Poroshell
120 EC-C18 46 x 100 mm 27um
min 5 10 15 20 25 30
mAU
0
20
40
60
80
100
97
12
111
16
115
96
126
74
152
48
161
51
164
35
206
87
230
76
292
90
110 bar
5
mAU
0
50
100
150
200
250
17
19
21
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06
38
67
44
37 45
58
54
50
59
20
70
37
325 bar
min
Ver condiciones en diapositiva anterior
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Mejor Resolucioacuten
linea base
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 52
Anaacutelisis maacutes raacutepido del meacutetodo USP para pastillas de
Simvastatina en Columnas Poroshell 120ndash Ajuste del meacutetodo
46 x 250 mm 5-um
Agilent ZORBAX Eclipse Plus C18
46 x 75 mm 27-um
Agilent Poroshell 120 EC-C18
65 CH3CN 35 39 gL NaH2PO4 (pH 45) 45 oC Sig = 238 8 Ref = 360 100 nm
Flujos 15 mLmin para la columna de 5-um 28 mLmin para la columna Poroshell 120 27um
Requerimiento
USP
5-um
(15 mLmin)
27-um
(28 mLmin)
TR na 9907 1457
krsquo gt 30 5962 5122
N gt 4500 16939 14439
Tf lt 20 109 110
min 2 4 6 8 10
mAU
0
5
10
15
20
25
30
35
40
min 2
mAU
0
5
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15
20
25
30
35
40
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 53
Ajustes de los parametros cromatograficos en la
transferencia de meacutetodos Escalado del volume de inyeccioacuten
v1 x [(r22 x L2)(r1
2 x L1)] = V2
O bien
v2 = V1 x [(d22 x L2)(d1
2 x L1)]
v volume de inyeccioacuten
r radio de la columna
L longitud de la columna
Ajuste del flujo
F2= F1 x (L2L1 ) x (r2r1 )2
L longitud de la columna
F Flujo
r radio de la columna
Ajuste de la longitud del gradiente
En funcioacuten de la longitud de la columna
L2L1= tg2tg1
En funcioacuten del volumen muerto de columna y del flujo
tG2= tG1 x (V2V1) x (F1F2) t tiempos de gradiente
V volumen muerto de columna
F flujo
Columna ID Volumen muerto aprox
por mm longitud
46mm 100uL
30mm 425uL
21mm 208uL
10mm 047uL
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 54
Notas de Aplicacioacuten en Poroshell 120 y QuEChERS
Determination of Hormones in Shrimp by Agilent 1290 Infinity LC with
Agilent Poroshell 120 LC Column and Agilent QuEChERS for Sample
Preparation (publication 5990-6589EN)
Analysis of Pesticide Residues in Green Tea Using Agilent SampliQ
QuEChERS EN Kit by LCMSMS Detection (publication 5990-
6400EN)
Analysis of Pesticide Residues in Rice Using Agilent Bond Elut
QuEChERS AOAC Kit (publication 5990-8034EN)
Poroshell 120 for pharmaceutical analysis
Poroshell 120 Resources
QuEChERS Applications
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 55
Sumario
bull La columna Poroshell 120 es una nueva alternativa para LC de Alta
Resolucioacuten y Alta Velocidad que puede usarse en cualquier HPLC o UHPLC
bull Con la Poroshell 120 se pueden lograr separaciones de alta eficacia a baja
presioacuten
bull Puede usarse con muestras sucias sin ver una elevacioacuten anormal de la
presioacuten
bull Puede usarse en un meacutetodo USP sin comprometer los Criterios de Ajustes de
Meacutetodo
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Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 56
Soporte Teacutecnico Agilent
Teleacutefono de Atencioacuten al Cliente
901 11 68 90
email customercare_spainagilentcom
wwwagilentcomchem
![Page 16: Análisis de compuestos farmacéuticos en sangre total · PDF fileReducción en el procesamiento, el envío de la muestra, y los ... Gas flow: 10 L/min Nebulizer: 10 psi Sheath gas](https://reader031.vdocuments.site/reader031/viewer/2022030405/5a7a81727f8b9a0a668b45aa/html5/thumbnails/16.jpg)
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 16
Referencias
N Spooner R Lad M Barfield Anal Chem 2009 811557ndash
1563
M Barfield N Spooner R Lad S Parry S Fowles
J Chromatogr B 2008 870 32ndash37
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 17
bullTecnologiacutea Innovadora no-celulosa
bullProporciona un nuevo nivel de confianza en la recoleccioacuten de muestras
bullMejora significativa en la sensibilidad analiacutetica reproducibilidad y faacutecil uso
Anaacutelisis Dried Blood Spotting (DBS)
Desarrollado en colaboracioacuten con Compantildeiacuteas farmaceacuteuticas y CROs este
dispositivo elimina problemas actuales asociados a los sistemas de DBS que
hay en el mercado
bullMuestreo de Sangre plasma o suero (liacutequido sinoviallaacutegrimas bilis LCR) para
anaacutelisis bioanaliacuteticos en pruebas farmaceacuteuticas cliacutenicas y precliacutenicas en
empresasa farmaceacuteuticas de bioanaacutelisis (DMPK ADME y MetID) (no para
Diagnoacutestico cliacutenico)
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 18
La tarjeta sin celulosa es superior de forma medible a las tarjetas de papel de celulosa
Mejora la Sentildeal del MS
bullFormato libre de celulosa ha reducido el enlazado no especiacutefico y no contiene reactivos
quiacutemicos impregnados
Ventajas del Producto
Flujo de trabajo maacutes faacutecil
bull La extraccioacuten de la muestra de la tarjeta
requiere 5 veces menos fuerza que el
producto de celulosa
Proporciona excelente homogeneidad
de la mancha
bull Extracciones reproducibles
recuperaciones maacutes altas
independientemente del nivel de
hematocrito
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 19
bull El nivel de Hematocrito es el porcentaje del volumen de sangre ocupado por las ceacutelulas
rojas de la sangre
bull El material de muestreo Bond Elut DMS tiene una estructura de fibras
maacutes ordenadas comparado con la celulosa estaacutendard
Esta es la razoacuten de porqueacute Bond Elut DMS muestra mejor
reproducibilidad
Mejor Reproducibilidad
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 20
Bond Elut DBS Muestra Mejor Reproducibilidad
Bond Elut DMS tiene una desviacioacuten total de un 5 en todos los niveles HCT mientras que la
tarjeta de celulosa tiene una desviacioacuten de un 52 en todo el rango 10 veces de diferencia
Los datos abajo muestran la desviacioacuten de las medidas del CV desde niveles de HTC
normales (45) para tarjetas Bond Elut DMS y de celulosa (Whatman DMPK-C)
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 21
Ventajas Clave de la Teacutecnica DBS de Agilent
bull Una vez seca la muestra de sangre no supone peligro bioloacutegico alguno y se
puede transportar sin necesidad de sistemas de refrigeracioacuten costosos
bull Permite a los laboratorios centralizar los anaacutelisis de muestra perifeacutericas
bull Se requiere menos volumen de muestra (menor nordm de sujetos en el ensayo
menor nordm de repeticiones y eliminacioacuten de sujetos sateacutelite)
bull Permite la toma demuestra en serie del mismo sujeto
bull La recoleccioacuten de sangre es maacutes sencilla
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 22
Notas de Aplicacioacuten farmaceacuteuticas en Poroshell
120 and DMS Fast Analysis of Cefepime and Related Impurities on Poroshell 120 EC-C18 (publication 5990-7492EN) Comparing Selectivity Easy Transfer of Methods between Superficially Porous Agilent Poroshell 120 EC-C18 and totally Porous Agilent ZORBAX Eclipse Plus C18 (publication 5990-6588EN)
Analysis of Water Soluble Vitamins in Multivitamin Tablets Using Poroshell 120 EC-C18 (publication 5990-8107EN)
Analysis of Anthocyanins in Common Foods Using an Agilent Poroshell 120 SB-C18 (publication 5990-8249EN)
Analysis of Amitriptyline Fluoxetine Quetiapine and Sertraline Using Dried Plasma (publication 5990-8169EN)
Analysis of Amitriptyline Fluoxetine Quetiapine and Sertraline Using Dried Blood Spots (publication 5990-8168EN)
Investigation of Varying Blood Hematocrit Level in Dried Blood Spotting (publication 5990-8306EN)
Analysis of Cholesterol Lowering Drugs (Statins) Using Dried Matrix Spots Technology (publication 5990-8305EN)
Scalability of Agilent Columns Across HPLC and UHPLC Instruments (publication 5990-8428EN)
Converting a CHP Method for Insulin to Agilent Poroshell 120 Columns (publication 5990-9029EN)
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 23
La propuesta QuEChERS para Determinar compuestos
Farmaceacuteuticos y Toxinas en Sangre Total
Anaacutelisis de Compuestos Farmaceacuteuticos en Sangre Total con
la columna Poroshell 120 Usando el meacutetodo Modificado
Mini-QuEChERS para la preparacioacuten de muestra
Nota de Aplicacioacuten5990-8789EN
httpwwwchemagilentcomLibraryapplications5990-8789ENpdf
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Introduccioacuten
Determinacioacuten de compuestos farmaceacuteuticos en anaacutelisis cliacutenicos y
foreacutensicos ADME (DMPK)
La preparacioacuten de muestra va desde la simple precipitacioacuten de
proteinas (PPT) a la maacutes compleja extraccioacuten en fase soacutelida (SPE)
Habitualmente la SPE ha ocupado este vaciacuteo pero simpre hay
espacio para teacutecnicas de preparacioacuten de muestras que son raacutepidas y
baratas de implementar
Se describe un procedimiento mini-QuEChERS modificado con
analisis LCndashMS-MS para la determinacioacuten de faacutermacos en sangre
total
Se analizan nueve diferentes faacutermacos (lidocaina tramadol
amitriptilina biperidina oxazepam lorazepam clorpromazina
diltiazem y naloxona)
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Compuestos farmaceacuteuticos usados en el estudio
Compuesto Nuacutemero CAS Log P (ow) pKa Uso
terapeacuteutico
Lidocaina 137-58-6 24 801 Anesteacutesico local
antiarrithmico
Tramadol 27203-92-5 25 941 Analgesico
Amitriptilina 50-48-6 492 94 Antidepresivo
Biperidena 514-65-8 40 108 Anticolinergico
Oxazepam 604-75-1 223 17 113 Antianxiedad
Lorazepam 846-49-1 247 13 115 Antidepresivo
Clorpromazina 50-53-3 518 93 Antipsycoacutetico
Diltiazem 42399-41-7 363 77 Bloqueante de los
canales del calcio
Naloxona 465-65-6 145 79 Antagonista de los
receptores de opio
Nortriptilina (IS) 72-69-5 565 97
5 ugmL de solucioacuten (9 compuestos) y estandar interno en metanol
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La Teacutecnica de QuEChERS aplicada a las muestras
de sangre
La sangre es el maacutes complejo de los fluidos bioloacutegicos
La determinacioacuten de faacutermacos en sangre total es a menudo necesaria en los
anaacutelisis foreacutensicos dada la dificultad de obtener suero o plasma
Los procedimientos convencionales para analizar faacutermacos en matrices
complejas como la sangre total son complicados
QuEChERS es una teacutecnica de preparacioacuten de muestra que fue desarrollada
para la extraccioacuten de residuos de plaguicidas multi-clase de frutas y vegetales
en 2003
A pesar de que los fluidos bioloacutegicos pueden parecer muy diferentes a una
pieza de fruta sin embargo siguen caminos paralelos
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Caminos paralelos en la preparacioacuten de muestra
Fluidos Bioloacutegicos
Matrices complejas
Rotura de la arquitectura celular
bull Lisis agitacioacuten solvente orgaacutenico
hidroacutelisis
Analitos con un amplio rango de
polaridades
Retirar analito o matriz
Anaacutelisis por LCMSMS GCMS o
GCMSMS
Frutas y Vegetales
Matrices complejas
Rotura de la arquitectura celular
bull Trituracioacuten agitacioacuten solvente
orgaacutenico hidroacutelisis
Analitos con un amplio rango de
polaridades
Retirar analito o matriz
Anaacutelisis por LCMSMS GCMS o
GCMSMS
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Procedimiento baacutesico por SPE para muestras de sangre
El pretratamiento de la sangre total implica la dilucioacuten con una
solucioacuten aacutecida un tampoacuten fosfato o aguaFA
Sonicar 15 minutos rotura de membranas celulares
Centrifugacioacuten
bull Procedimiento de SPE
ndash Acondicionado del cartucho metanol agua
ndash Carga del cartucho muestra
ndash Lavado del cartucho agua con metanol o tampoacuten metanol
ndash Elucioacuten del cartucho eluyente para el anaacutelisis
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Procedimiento Baacutesico QuEChERS
15 g muestra homogeneizada (fortificada)
Antildeadir 15 mL ACN (1 AA) vortex
Antildeadir Sales de Extraccioacuten AOAC agitar
Centrifugar
Transferir 1 u 8 mL a un tubo d-SPE AOAC vortex centrifugar
Transferir al vial de Anaacutelisis
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Ventajas y desventajas del Procedimiento QuEChERS
Ventajas
Extraccioacuten tipo liacutequidoliacutequido
Uso de aacutecido para interrumpir el ligado de proteinas
Exceso de sal para lisar los componentes celulares
Uso de acetonitrilo para facilitar la precipitacioacuten proteacuteica
Uso de SPE dispersiva para adsorber las interferencias de la matriz
Plossl etat J Chrom A 1135 (2006) 19-26
Desventajas
La cantidad de solvente y de muestra requeridos en el meacutetodo no
son ldquobioloacutegicamente adecuadosrdquo
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Propoacutesito de la propuesta mini-Q
Ofrecer un enfoque maacutes adecuado biologicamente
Requirimientos de menores volumenes y tamantildeos de
muestra
Rango de faacutermacos varias polaridades y pKa
Evaluaciacuteoacuten de las interferencias de fondo
Extraccioacuten y datos de recuperacioacuten en un rango
aceptable
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Faacutermacos en sangre Procedimiento mini-QuEChERS
mini-Q
Procedimiento
1 Antildeadir 2 homogeneizadores ceraacutemicos
2 Antildeadir 1 o 2 mL de sangre entera a un tubo de centriacutefuga con tapoacuten de rosca
3 Antildeadir estandar interno vortex
4 Antildeadir 2 mL de ACN acidificado ( 04 FA) vortex 30 seg
5 Antildeadir 500 mg de sales de extraccioacuten agitar vigorsamente 1 minuto centrifugar 5000 rpm 1 min
6 Transferir 1 mL del extraccto al material de d-SPE en tubo de centrifuga vortex centrifugar
7 Antildeadir 200 uL a 800 uL de agua en un vial LC vortex y analizar
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Refinamiento del Procedimiento mini-Q
Paraacutemetros evaluados en la teacutecnica mini-Q
Muestra de sangre total
bull La matriz bioloacutegica maacutes complicada
Adicioacuten de aacutecido tipo y cantidad
bull Efecto en la particioacuten y extraccioacuten
Adicioacuten de las sales de QuEChERS no-tamponadas o
tamponadas con NaAcetato o Citrato
bull Efecto en el extracto inspeccioacuten visual
SPE Dispersiva
bull Limpieza de la matriz y recuperaciones de los compuestos
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Conclusiones del estudio
El ACN con 4 de FA como solvente de extraccioacuten muestra
una lisis maacutes completa de la muestra frente a otros solventes
de extraccioacuten que mostraron una masa soacutelida
Las sales tamponadas AOAC de acetato Soacutedico generan el
extracto maacutes liacutempio y fueron elegidas para la d-SPE
El paso de dSPE no ofrece un clean up adicional para los
meacutetodos de extraccioacuten con sales EN y no tamponadas
principalmente
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Datos de Adquisicoacuten LCMSMS
Compuestos Canales MRM
(mz) Fragmentador
(V) CE (V) RT (min) Delta RT
Lidocaina 1) 23518 gt 861
2) 23518 gt 581
97 11
35
137 04
Tramadol 1) 2642 gt 581
2) 2642 gt 2461
97 15
3
120 04
Amitriptilina 1) 2782 gt 117
2) 2782 gt 105
112 19
19
425 04
Biperidena 1)31223 gt 981
2) 31223 gt 551
123 19
60
423 07
Oxazepam 1) 28706 gt 2409
2) 28706 gt 2689
112 19
7
399 04
Lorazepam 1) 32102 gt 2749
2) 32102 gt 3029
113 15
7
409 04
Clorpromazina 1) 31911 gt 861
2) 31911 gt 581
112 15
43
463 04
Diltiazem 1) 41517 gt 1779
2) 41517 gt 1499
128 19
43
373 04
Naloxona 1) 32816 gt 310
2) 32816 gt 212
123 15
39
082 04
Nortriptilina (IS) 1) 26418 gt 233
2) 26418 gt 91
97 7
19
417 04
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065
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07
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075
0775
08
0825
085
0875
09
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095
0975
1
1025
105
1075
11
1125
115
1175
12
1225
125
1275
13
1325
135
1375
+ESI TIC Scan Frag=800V AOAC_BLANK_110228bd
1 1
Counts vs Acquisition Time (min)
05 1 15 2 25
3 35 4 45 5 55 6 65 7 75 8 85 9 95 10
Columna Poroshell 120 EC-C18 27
micro 21 x 100 mm PN 695775-902
Fase Moacutevil
A 5 mM Acetato Amoacutenico pH 5
2080 MeOHagua
B 5 mM Acetato amoacutencio en ACN
Flujo 04mLmin
Inyeccioacuten 10uL
GT (ordmC) 300
GF (lmin) 7
Nebulizador (psi) 40
SGT (ordmC) 400
SFG (lmin) 12
Capilar (V) 3500
NV (V) 500
Condiciones LCMS
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48
49
5
51
+ESI MRM Frag=1120V CID190 (2782000 -gt 1170000) HQC_6d
1 1
Counts vs Acquisition Time (min) 01 02 03 04 05 06 07 08 09 1 11 12 13 14 15 16 17 18 19 2 21 22 23 24 25 26 27 28 29 3 31 32 33 34 35 36 37 38 39 4 41 42 43 44 45 46
Nalo
xo
ne
Lid
oc
ain
e
Tra
mad
ol
Oxazep
am
Lo
razep
am
Bip
eri
de
n
Am
itri
pty
lin
e
Dil
tiazem
Ch
lorp
rom
azin
e
No
rtri
pty
lin
e (
IS)
Cromatograma LCMSMS de 10 ngmL de sangre total fortificada despueacutes
de extraccioacuten mini-QuEChERS AOAC (NaAc) y d-SPE (50mg PSA y
150mg MgSO4)
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18
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2
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3
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39
4
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48
49
5
51
+ESI MRM Frag=1120V CID190 (2782000 -gt 1170000) HQC_6d
1 1
Counts vs Acquisition Time (min) 01 02 03 04 05 06 07 08 09 1 11 12 13 14 15 16 17 18 19 2 21 22 23 24 25 26 27 28 29 3 31 32 33 34 35 36 37 38 39 4 41 42 43 44 45 46
1 x10
415 42 425 43 435 44 445 45 455 46 465 47 475 48 485 49 495 5
505 51 515 52 525 53 535 54 545 55 555 56 565 57
+ESI MRM Frag=1120V CID190 (2871000 -gt 2409000) RE_L_1d 1
Counts vs Acquisition Time (min) 305 31 315 32 325 33 335 34 345 35 355 36 365 37 375 38 385 39 395 4 405 41 415 42 425 43 435 44 445 45 455 46 465 47 475
Relacioacuten sentildealruido para el Oxazepam y Lorazepam a
10 ngmL (10 ppb)
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La Naloxone muestra esta curva de linealidad de10-250 ngmL (ppb) con una R2
= 0991
Las curvas de calibracioacuten se generaron con la respuestra relativa (area pico
analitoarea pico IS) frente a la concentracioacuten relativa (concentracion de
analitoconcentracioacuten de IS)
Ejemplo de curva de linealidad para Naloxona extraido
con mini-QuEChERS
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 40
Recuperacioacuten y Reproducibilidad
Compuesto 50 ngmL Spiked
Recuperacioacuten RSD
100 ngmL Spiked
Recuperacioacuten RSD
Lidocaine 987 157 100 118
Tramadol 105 30 104 82
Amitriptyline 104 21 104 82
Biperidene 97 45 99 82
Oxazepam 770 92 78 86
Lorazepam 819 68 818 86
Chlorpromazine 110 103 105 63
Diltiazem 881 27 917 83
Naloxone 806 90 755 77
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 41
Conclusioacutenes y trabajo posterior
El meacutetodo mini-QuEChERS para la extraccioacuten de compuestos farmaceacuteuticos en
sangre total ofrece una alternativa a otras teacutecnicas de preparacioacuten de muestras
La preparacioacuten de muestras mini-QuEChERS es un enfoque simple facil y
barato que requiere una miacutenima experiencia en preparacioacuten de muestras y
miacutenimo equipamiento
Es un punto de partida para ampliar el numero y las clasificaciones evaluadas
en otras matrices bioloacutegicas y en sangre postmortem
El trabajo futuro incluira combinaciones adecuadas tanto de las sales de
extraccioacuten como de los sorbentes de d-SPE por el meacutetodo mini-QuEChERS
La columna Poroshell 120 ofrece una selectividad diferente y excelentes formas
de pico a lo largo del amplio rango de compuestos farmaceacuteuticos usados en este
estudio
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 42
Referencias
(1) M Anastassiades SJ Lehotay D Štajnbaher and FJ Schenk J AOAC Int 86 4121 (2003)
(2) G Stubbings and T Bigwood Anal Chim Acta 637 68 (2009)
(3) RR Rasmussen IMLD Storm PZH Rasmussen J Smedsgaard and KF Nielsen Anal Bioanal Chem 397 765 (2010)
(4) D Smith and K Lynam GCμECD analysis and confirmation of PCBs in fish tissue with Agilent JampW DB-35ms and DB-XLB GC columns Agilent Technologies 5990-6236EN (2010)
(5) F Ploumlssl M Giera and F Bracher J Chrom A 1135 19 (2006)
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 43
MEJORAR LA PRODUCTIVIDAD EN
HPLC ESTAacuteNDAR CON COLUMNAS
POROSHELL
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Columnas Poroshell 120 para HPLC y UHPLC
bull 80-90 de eficacia de las sub 2um
bull A presiones un ~40-50 maacutes bajas
bull Con un tamantildeo de partiacutecula de 27um
bull Con una frita de entrada de 2um
bull Con el doble de resolucioacuten de una
columna de 35um
bull Con un liacutemite de presioacuten de 600 bar
bull La partiacutecula tiene un nuacutecleo soacutelido
(17um) y una cubierta exterior porosa
de 05um como zona de difusioacuten
Las Columnas Poroshell 120 tienen
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Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 45
Poroshell 120 proporciona Eficacia Suficiente
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Flujo 0582 mLmin AcetonitriloAgua (6040)
Volumen de Inyeccioacuten 4 microL
TCC 26 oC
DAD Sig=2544nm Ref=360100nm
Muestra Muestra de test RRLC
(PN 5188-6529) inoculada con
50 microL 2 mgmL Tiourea en
aguaacetonitrilo (6535)
25 5 75 10
mAU
0
200
400
600
06
46
0
82
6
11
48
15
18
20
16
2
22
3
28
16
41
32
62
73
97
53
larr N = 25053 Presioacuten = 182 bar
Poroshell 120 EC-C18 30 x 100 mm 27 um
min 25 5 75 10 125
mAU
0
200
400
600
06
49
0
86
5
12
75
17
56
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18
27
05
34
94
52
81
82
18
13
04
1
larr N = 27295 Presioacuten = 386 bar
Eclipse Plus C18 30 x 100 mm 18 um
gt90 de la Eficacia de una 18um
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 46
iquestEn queacute tipos de instrumentos puede usar
Columnas Poroshell 120 HPLCrsquos y UHPLCrsquos
Consideraciones en UHPLC
bull Las columnas Poroshell 120 tienen un liacutemite de presioacuten de 600 bar
bull Los UHPLC estaacuten ajustados para columnas de bajo volumen por lo tanto las
Poroshell pueden usarse en todos los UHPLC
Consideraciones en HPLC
bull Las Columnas Poroshell 120 trabajan bien por debajo de 400 bar
bull Minimize los volumenes extra columna para las columnas 21 y 30mm ID ndash
siga las instrucciones dadas para las columnas RRHT (18um 600 bar)
bull Use en el detector velocidades adecuadas de adquisicioacuten para picos
estrechos de alta eficacia
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Con una frita de 2 um Poroshell 120 no se bloquea
Muestras Complejas- Plasma
Diflusinal in Plasma
0
20
40
60
80
100
120
140
160
180
200
220
240
260
280
300
320
340
360
380
400
1 501 1001 1501 2001 2501
Injections
Pre
ssu
re
0
20000
40000
60000
80000
100000
120000
140000
160000
180000
200000
Eff
icie
ncy (
N)
End Press
Plates
Columna Poroshell 120 EC-C18 30 x 50mm 27um LC Agilent 1200 RRLC (SL)
Muestra Plasma Precipitado 2 partes Plasma 7 Partes 2080 Agua-MeCN w01 Aacutecido Foacutermico con 1 Parte de Diflusinal en
5050 Agua-MeCN 10 ugml (Concentracion Final Diflusinal 1 ugml) Agitado y dejado reposar 10 minutos
No Centrifugado No Filtrado
Volumen de Inyeccioacuten 1ul
Solvente A Agua w01 TFA
Solvente B MeCN w008 TFA
Flujo 1 mlmin 1 ul inyeccioacuten
Tiempo B
0 20
05 90
06 90
11 20
25 20
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Diflusinal es un anti-inflamatorio no esteroidal anaacutelogo
a la aspirina desarrollado por Merck Sharp amp Dohme
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Las Columnas Superficialmente Porosas Pueden
Usarse cumpliendo los Requirimientos USP
De la lista USP de empaquetamientos de columnas LC 42009
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Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 49
Criterios de Ajuste de Meacutetodos USP y FDA Criterios de Ajuste de Meacutetodos de Dimensiones de Columna
Paraacutemetro Especificaciones Maacuteximas ComentariosEjemplos
Longitud de Columna 70 250mm 75mm
150mm 50mm
Diaacutemetro Interno de
Columna
25 (FDA ORA-LAB 545)
USP ndash 25 ID Columna puede ajustarse si la
velocidad lineal es constante
46 mm 30 mm (-35)
46 mm 21 mm (-54)
30 mm 21 mm (-30)
Flow Rate 50
Volumen de Inyeccioacuten
Reducir tanto como se necesitendash
debe cumplir los liacutemites de
deteccioacuten y precisioacuten
Si cambia a una columna maacutes
corta haga el cambio apropiado
en el volumen de inyeccioacuten
Tamantildeo de Partiacutecula Reducir hasta el 50
(no se puede aumentar)
Puede cambiar la longitud de columna y el
tamantildeo de partiacutecula para mantener la misma
Rs
5um 35um (-30)
5um 27um (-46) Cambiado en 22409 ndash Para la copia oficial y actual ir a
httpwwwfdagovScienceResearchFieldSciencedefaulthtm
USP 30 Second Supplement Revisions PF34(5) en proceso
Ver ldquo Stimuli articlerdquo en Pharmacopeial Forum 2009 35(6)
Page 49
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 50
Comparacioacuten de 46 x 250 mm 5 um con Poroshell
120 EC-C18 46 x 100 mm 27um
min 5 10 15 20 25 30
mAU
0
20
40
60
80
100
97
12
111
16
115
96
126
74
152
48
161
51
164
35
206
87
230
76
292
90
min 5 10 15 20 25 30
mAU
0
50
100
150
200
250
17
19
21
89
23
11
26
06
38
67
44
37 45
58
54
50
59
20
70
37
Anaacutelisis maacutes raacutepido(columna maacutes corta flujo maacutes alto)
Mayor sensibilidad(partiacutecula maacutes pequentildeapico maacutes estrecho)
Maacutes optimizado (un anaacutelisis maacutes raacutepido permite ajustar mejor)
Ambos anaacutelisis en Agilent 1100 G1315B DAD (bajo 400 bar)
No se requiere cambio en la preparacioacuten de muestra frita de entrada
de 2 micras en ambas columnas
325 bar
110 bar
Sulfadiazina
Sulfatiazol
Sulfapiridina
Sulfamerazina
Sulfametazina
Sulfametazol
Sulfametoxipiridazina
Sulfacloropiridazina
Sulfametoxazol
Sulfadimetoxina
Tiempo B
0 8
33 33
34 33
Columna Eclipse Plus C18
46 x 250mm 5um
Flujo 1 mLmin
Fase Moacutevil
A 01 Aacutecido Foacutermico en Agua
B 01 Aacutecido Foacutermico en ACN
Tiempo B
0 8
12 33
132 33
Columna 46 x 100mm
Poroshell 120 EC-C18
27um
Flujo 185 mLmin
Page 50
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 51
Comparacioacuten de 46 x 250 mm 5 um con Poroshell
120 EC-C18 46 x 100 mm 27um
min 5 10 15 20 25 30
mAU
0
20
40
60
80
100
97
12
111
16
115
96
126
74
152
48
161
51
164
35
206
87
230
76
292
90
110 bar
5
mAU
0
50
100
150
200
250
17
19
21
89
23
11
26
06
38
67
44
37 45
58
54
50
59
20
70
37
325 bar
min
Ver condiciones en diapositiva anterior
Page 51
Mejor Resolucioacuten
linea base
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 52
Anaacutelisis maacutes raacutepido del meacutetodo USP para pastillas de
Simvastatina en Columnas Poroshell 120ndash Ajuste del meacutetodo
46 x 250 mm 5-um
Agilent ZORBAX Eclipse Plus C18
46 x 75 mm 27-um
Agilent Poroshell 120 EC-C18
65 CH3CN 35 39 gL NaH2PO4 (pH 45) 45 oC Sig = 238 8 Ref = 360 100 nm
Flujos 15 mLmin para la columna de 5-um 28 mLmin para la columna Poroshell 120 27um
Requerimiento
USP
5-um
(15 mLmin)
27-um
(28 mLmin)
TR na 9907 1457
krsquo gt 30 5962 5122
N gt 4500 16939 14439
Tf lt 20 109 110
min 2 4 6 8 10
mAU
0
5
10
15
20
25
30
35
40
min 2
mAU
0
5
10
15
20
25
30
35
40
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 53
Ajustes de los parametros cromatograficos en la
transferencia de meacutetodos Escalado del volume de inyeccioacuten
v1 x [(r22 x L2)(r1
2 x L1)] = V2
O bien
v2 = V1 x [(d22 x L2)(d1
2 x L1)]
v volume de inyeccioacuten
r radio de la columna
L longitud de la columna
Ajuste del flujo
F2= F1 x (L2L1 ) x (r2r1 )2
L longitud de la columna
F Flujo
r radio de la columna
Ajuste de la longitud del gradiente
En funcioacuten de la longitud de la columna
L2L1= tg2tg1
En funcioacuten del volumen muerto de columna y del flujo
tG2= tG1 x (V2V1) x (F1F2) t tiempos de gradiente
V volumen muerto de columna
F flujo
Columna ID Volumen muerto aprox
por mm longitud
46mm 100uL
30mm 425uL
21mm 208uL
10mm 047uL
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 54
Notas de Aplicacioacuten en Poroshell 120 y QuEChERS
Determination of Hormones in Shrimp by Agilent 1290 Infinity LC with
Agilent Poroshell 120 LC Column and Agilent QuEChERS for Sample
Preparation (publication 5990-6589EN)
Analysis of Pesticide Residues in Green Tea Using Agilent SampliQ
QuEChERS EN Kit by LCMSMS Detection (publication 5990-
6400EN)
Analysis of Pesticide Residues in Rice Using Agilent Bond Elut
QuEChERS AOAC Kit (publication 5990-8034EN)
Poroshell 120 for pharmaceutical analysis
Poroshell 120 Resources
QuEChERS Applications
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 55
Sumario
bull La columna Poroshell 120 es una nueva alternativa para LC de Alta
Resolucioacuten y Alta Velocidad que puede usarse en cualquier HPLC o UHPLC
bull Con la Poroshell 120 se pueden lograr separaciones de alta eficacia a baja
presioacuten
bull Puede usarse con muestras sucias sin ver una elevacioacuten anormal de la
presioacuten
bull Puede usarse en un meacutetodo USP sin comprometer los Criterios de Ajustes de
Meacutetodo
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Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 56
Soporte Teacutecnico Agilent
Teleacutefono de Atencioacuten al Cliente
901 11 68 90
email customercare_spainagilentcom
wwwagilentcomchem
![Page 17: Análisis de compuestos farmacéuticos en sangre total · PDF fileReducción en el procesamiento, el envío de la muestra, y los ... Gas flow: 10 L/min Nebulizer: 10 psi Sheath gas](https://reader031.vdocuments.site/reader031/viewer/2022030405/5a7a81727f8b9a0a668b45aa/html5/thumbnails/17.jpg)
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 17
bullTecnologiacutea Innovadora no-celulosa
bullProporciona un nuevo nivel de confianza en la recoleccioacuten de muestras
bullMejora significativa en la sensibilidad analiacutetica reproducibilidad y faacutecil uso
Anaacutelisis Dried Blood Spotting (DBS)
Desarrollado en colaboracioacuten con Compantildeiacuteas farmaceacuteuticas y CROs este
dispositivo elimina problemas actuales asociados a los sistemas de DBS que
hay en el mercado
bullMuestreo de Sangre plasma o suero (liacutequido sinoviallaacutegrimas bilis LCR) para
anaacutelisis bioanaliacuteticos en pruebas farmaceacuteuticas cliacutenicas y precliacutenicas en
empresasa farmaceacuteuticas de bioanaacutelisis (DMPK ADME y MetID) (no para
Diagnoacutestico cliacutenico)
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 18
La tarjeta sin celulosa es superior de forma medible a las tarjetas de papel de celulosa
Mejora la Sentildeal del MS
bullFormato libre de celulosa ha reducido el enlazado no especiacutefico y no contiene reactivos
quiacutemicos impregnados
Ventajas del Producto
Flujo de trabajo maacutes faacutecil
bull La extraccioacuten de la muestra de la tarjeta
requiere 5 veces menos fuerza que el
producto de celulosa
Proporciona excelente homogeneidad
de la mancha
bull Extracciones reproducibles
recuperaciones maacutes altas
independientemente del nivel de
hematocrito
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 19
bull El nivel de Hematocrito es el porcentaje del volumen de sangre ocupado por las ceacutelulas
rojas de la sangre
bull El material de muestreo Bond Elut DMS tiene una estructura de fibras
maacutes ordenadas comparado con la celulosa estaacutendard
Esta es la razoacuten de porqueacute Bond Elut DMS muestra mejor
reproducibilidad
Mejor Reproducibilidad
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 20
Bond Elut DBS Muestra Mejor Reproducibilidad
Bond Elut DMS tiene una desviacioacuten total de un 5 en todos los niveles HCT mientras que la
tarjeta de celulosa tiene una desviacioacuten de un 52 en todo el rango 10 veces de diferencia
Los datos abajo muestran la desviacioacuten de las medidas del CV desde niveles de HTC
normales (45) para tarjetas Bond Elut DMS y de celulosa (Whatman DMPK-C)
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 21
Ventajas Clave de la Teacutecnica DBS de Agilent
bull Una vez seca la muestra de sangre no supone peligro bioloacutegico alguno y se
puede transportar sin necesidad de sistemas de refrigeracioacuten costosos
bull Permite a los laboratorios centralizar los anaacutelisis de muestra perifeacutericas
bull Se requiere menos volumen de muestra (menor nordm de sujetos en el ensayo
menor nordm de repeticiones y eliminacioacuten de sujetos sateacutelite)
bull Permite la toma demuestra en serie del mismo sujeto
bull La recoleccioacuten de sangre es maacutes sencilla
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 22
Notas de Aplicacioacuten farmaceacuteuticas en Poroshell
120 and DMS Fast Analysis of Cefepime and Related Impurities on Poroshell 120 EC-C18 (publication 5990-7492EN) Comparing Selectivity Easy Transfer of Methods between Superficially Porous Agilent Poroshell 120 EC-C18 and totally Porous Agilent ZORBAX Eclipse Plus C18 (publication 5990-6588EN)
Analysis of Water Soluble Vitamins in Multivitamin Tablets Using Poroshell 120 EC-C18 (publication 5990-8107EN)
Analysis of Anthocyanins in Common Foods Using an Agilent Poroshell 120 SB-C18 (publication 5990-8249EN)
Analysis of Amitriptyline Fluoxetine Quetiapine and Sertraline Using Dried Plasma (publication 5990-8169EN)
Analysis of Amitriptyline Fluoxetine Quetiapine and Sertraline Using Dried Blood Spots (publication 5990-8168EN)
Investigation of Varying Blood Hematocrit Level in Dried Blood Spotting (publication 5990-8306EN)
Analysis of Cholesterol Lowering Drugs (Statins) Using Dried Matrix Spots Technology (publication 5990-8305EN)
Scalability of Agilent Columns Across HPLC and UHPLC Instruments (publication 5990-8428EN)
Converting a CHP Method for Insulin to Agilent Poroshell 120 Columns (publication 5990-9029EN)
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 23
La propuesta QuEChERS para Determinar compuestos
Farmaceacuteuticos y Toxinas en Sangre Total
Anaacutelisis de Compuestos Farmaceacuteuticos en Sangre Total con
la columna Poroshell 120 Usando el meacutetodo Modificado
Mini-QuEChERS para la preparacioacuten de muestra
Nota de Aplicacioacuten5990-8789EN
httpwwwchemagilentcomLibraryapplications5990-8789ENpdf
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 24
Introduccioacuten
Determinacioacuten de compuestos farmaceacuteuticos en anaacutelisis cliacutenicos y
foreacutensicos ADME (DMPK)
La preparacioacuten de muestra va desde la simple precipitacioacuten de
proteinas (PPT) a la maacutes compleja extraccioacuten en fase soacutelida (SPE)
Habitualmente la SPE ha ocupado este vaciacuteo pero simpre hay
espacio para teacutecnicas de preparacioacuten de muestras que son raacutepidas y
baratas de implementar
Se describe un procedimiento mini-QuEChERS modificado con
analisis LCndashMS-MS para la determinacioacuten de faacutermacos en sangre
total
Se analizan nueve diferentes faacutermacos (lidocaina tramadol
amitriptilina biperidina oxazepam lorazepam clorpromazina
diltiazem y naloxona)
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 25
Compuestos farmaceacuteuticos usados en el estudio
Compuesto Nuacutemero CAS Log P (ow) pKa Uso
terapeacuteutico
Lidocaina 137-58-6 24 801 Anesteacutesico local
antiarrithmico
Tramadol 27203-92-5 25 941 Analgesico
Amitriptilina 50-48-6 492 94 Antidepresivo
Biperidena 514-65-8 40 108 Anticolinergico
Oxazepam 604-75-1 223 17 113 Antianxiedad
Lorazepam 846-49-1 247 13 115 Antidepresivo
Clorpromazina 50-53-3 518 93 Antipsycoacutetico
Diltiazem 42399-41-7 363 77 Bloqueante de los
canales del calcio
Naloxona 465-65-6 145 79 Antagonista de los
receptores de opio
Nortriptilina (IS) 72-69-5 565 97
5 ugmL de solucioacuten (9 compuestos) y estandar interno en metanol
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 26
La Teacutecnica de QuEChERS aplicada a las muestras
de sangre
La sangre es el maacutes complejo de los fluidos bioloacutegicos
La determinacioacuten de faacutermacos en sangre total es a menudo necesaria en los
anaacutelisis foreacutensicos dada la dificultad de obtener suero o plasma
Los procedimientos convencionales para analizar faacutermacos en matrices
complejas como la sangre total son complicados
QuEChERS es una teacutecnica de preparacioacuten de muestra que fue desarrollada
para la extraccioacuten de residuos de plaguicidas multi-clase de frutas y vegetales
en 2003
A pesar de que los fluidos bioloacutegicos pueden parecer muy diferentes a una
pieza de fruta sin embargo siguen caminos paralelos
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 27
Caminos paralelos en la preparacioacuten de muestra
Fluidos Bioloacutegicos
Matrices complejas
Rotura de la arquitectura celular
bull Lisis agitacioacuten solvente orgaacutenico
hidroacutelisis
Analitos con un amplio rango de
polaridades
Retirar analito o matriz
Anaacutelisis por LCMSMS GCMS o
GCMSMS
Frutas y Vegetales
Matrices complejas
Rotura de la arquitectura celular
bull Trituracioacuten agitacioacuten solvente
orgaacutenico hidroacutelisis
Analitos con un amplio rango de
polaridades
Retirar analito o matriz
Anaacutelisis por LCMSMS GCMS o
GCMSMS
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 28
Procedimiento baacutesico por SPE para muestras de sangre
El pretratamiento de la sangre total implica la dilucioacuten con una
solucioacuten aacutecida un tampoacuten fosfato o aguaFA
Sonicar 15 minutos rotura de membranas celulares
Centrifugacioacuten
bull Procedimiento de SPE
ndash Acondicionado del cartucho metanol agua
ndash Carga del cartucho muestra
ndash Lavado del cartucho agua con metanol o tampoacuten metanol
ndash Elucioacuten del cartucho eluyente para el anaacutelisis
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 29
Procedimiento Baacutesico QuEChERS
15 g muestra homogeneizada (fortificada)
Antildeadir 15 mL ACN (1 AA) vortex
Antildeadir Sales de Extraccioacuten AOAC agitar
Centrifugar
Transferir 1 u 8 mL a un tubo d-SPE AOAC vortex centrifugar
Transferir al vial de Anaacutelisis
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 30
Ventajas y desventajas del Procedimiento QuEChERS
Ventajas
Extraccioacuten tipo liacutequidoliacutequido
Uso de aacutecido para interrumpir el ligado de proteinas
Exceso de sal para lisar los componentes celulares
Uso de acetonitrilo para facilitar la precipitacioacuten proteacuteica
Uso de SPE dispersiva para adsorber las interferencias de la matriz
Plossl etat J Chrom A 1135 (2006) 19-26
Desventajas
La cantidad de solvente y de muestra requeridos en el meacutetodo no
son ldquobioloacutegicamente adecuadosrdquo
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 31
Propoacutesito de la propuesta mini-Q
Ofrecer un enfoque maacutes adecuado biologicamente
Requirimientos de menores volumenes y tamantildeos de
muestra
Rango de faacutermacos varias polaridades y pKa
Evaluaciacuteoacuten de las interferencias de fondo
Extraccioacuten y datos de recuperacioacuten en un rango
aceptable
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 32
Faacutermacos en sangre Procedimiento mini-QuEChERS
mini-Q
Procedimiento
1 Antildeadir 2 homogeneizadores ceraacutemicos
2 Antildeadir 1 o 2 mL de sangre entera a un tubo de centriacutefuga con tapoacuten de rosca
3 Antildeadir estandar interno vortex
4 Antildeadir 2 mL de ACN acidificado ( 04 FA) vortex 30 seg
5 Antildeadir 500 mg de sales de extraccioacuten agitar vigorsamente 1 minuto centrifugar 5000 rpm 1 min
6 Transferir 1 mL del extraccto al material de d-SPE en tubo de centrifuga vortex centrifugar
7 Antildeadir 200 uL a 800 uL de agua en un vial LC vortex y analizar
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 33
Refinamiento del Procedimiento mini-Q
Paraacutemetros evaluados en la teacutecnica mini-Q
Muestra de sangre total
bull La matriz bioloacutegica maacutes complicada
Adicioacuten de aacutecido tipo y cantidad
bull Efecto en la particioacuten y extraccioacuten
Adicioacuten de las sales de QuEChERS no-tamponadas o
tamponadas con NaAcetato o Citrato
bull Efecto en el extracto inspeccioacuten visual
SPE Dispersiva
bull Limpieza de la matriz y recuperaciones de los compuestos
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 34
Conclusiones del estudio
El ACN con 4 de FA como solvente de extraccioacuten muestra
una lisis maacutes completa de la muestra frente a otros solventes
de extraccioacuten que mostraron una masa soacutelida
Las sales tamponadas AOAC de acetato Soacutedico generan el
extracto maacutes liacutempio y fueron elegidas para la d-SPE
El paso de dSPE no ofrece un clean up adicional para los
meacutetodos de extraccioacuten con sales EN y no tamponadas
principalmente
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 35
Datos de Adquisicoacuten LCMSMS
Compuestos Canales MRM
(mz) Fragmentador
(V) CE (V) RT (min) Delta RT
Lidocaina 1) 23518 gt 861
2) 23518 gt 581
97 11
35
137 04
Tramadol 1) 2642 gt 581
2) 2642 gt 2461
97 15
3
120 04
Amitriptilina 1) 2782 gt 117
2) 2782 gt 105
112 19
19
425 04
Biperidena 1)31223 gt 981
2) 31223 gt 551
123 19
60
423 07
Oxazepam 1) 28706 gt 2409
2) 28706 gt 2689
112 19
7
399 04
Lorazepam 1) 32102 gt 2749
2) 32102 gt 3029
113 15
7
409 04
Clorpromazina 1) 31911 gt 861
2) 31911 gt 581
112 15
43
463 04
Diltiazem 1) 41517 gt 1779
2) 41517 gt 1499
128 19
43
373 04
Naloxona 1) 32816 gt 310
2) 32816 gt 212
123 15
39
082 04
Nortriptilina (IS) 1) 26418 gt 233
2) 26418 gt 91
97 7
19
417 04
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7 x10
0125
015
0175
02
0225
025
0275
03
0325
035
0375
04
0425
045
0475
05
0525
055
0575
06
0625
065
0675
07
0725
075
0775
08
0825
085
0875
09
0925
095
0975
1
1025
105
1075
11
1125
115
1175
12
1225
125
1275
13
1325
135
1375
+ESI TIC Scan Frag=800V AOAC_BLANK_110228bd
1 1
Counts vs Acquisition Time (min)
05 1 15 2 25
3 35 4 45 5 55 6 65 7 75 8 85 9 95 10
Columna Poroshell 120 EC-C18 27
micro 21 x 100 mm PN 695775-902
Fase Moacutevil
A 5 mM Acetato Amoacutenico pH 5
2080 MeOHagua
B 5 mM Acetato amoacutencio en ACN
Flujo 04mLmin
Inyeccioacuten 10uL
GT (ordmC) 300
GF (lmin) 7
Nebulizador (psi) 40
SGT (ordmC) 400
SFG (lmin) 12
Capilar (V) 3500
NV (V) 500
Condiciones LCMS
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26
27
28
29
3
31
32
33
34
35
36
37
38
39
4
41
42
43
44
45
46
47
48
49
5
51
+ESI MRM Frag=1120V CID190 (2782000 -gt 1170000) HQC_6d
1 1
Counts vs Acquisition Time (min) 01 02 03 04 05 06 07 08 09 1 11 12 13 14 15 16 17 18 19 2 21 22 23 24 25 26 27 28 29 3 31 32 33 34 35 36 37 38 39 4 41 42 43 44 45 46
Nalo
xo
ne
Lid
oc
ain
e
Tra
mad
ol
Oxazep
am
Lo
razep
am
Bip
eri
de
n
Am
itri
pty
lin
e
Dil
tiazem
Ch
lorp
rom
azin
e
No
rtri
pty
lin
e (
IS)
Cromatograma LCMSMS de 10 ngmL de sangre total fortificada despueacutes
de extraccioacuten mini-QuEChERS AOAC (NaAc) y d-SPE (50mg PSA y
150mg MgSO4)
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 38
3 x10
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2
21
22
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24
25
26
27
28
29
3
31
32
33
34
35
36
37
38
39
4
41
42
43
44
45
46
47
48
49
5
51
+ESI MRM Frag=1120V CID190 (2782000 -gt 1170000) HQC_6d
1 1
Counts vs Acquisition Time (min) 01 02 03 04 05 06 07 08 09 1 11 12 13 14 15 16 17 18 19 2 21 22 23 24 25 26 27 28 29 3 31 32 33 34 35 36 37 38 39 4 41 42 43 44 45 46
1 x10
415 42 425 43 435 44 445 45 455 46 465 47 475 48 485 49 495 5
505 51 515 52 525 53 535 54 545 55 555 56 565 57
+ESI MRM Frag=1120V CID190 (2871000 -gt 2409000) RE_L_1d 1
Counts vs Acquisition Time (min) 305 31 315 32 325 33 335 34 345 35 355 36 365 37 375 38 385 39 395 4 405 41 415 42 425 43 435 44 445 45 455 46 465 47 475
Relacioacuten sentildealruido para el Oxazepam y Lorazepam a
10 ngmL (10 ppb)
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 39
La Naloxone muestra esta curva de linealidad de10-250 ngmL (ppb) con una R2
= 0991
Las curvas de calibracioacuten se generaron con la respuestra relativa (area pico
analitoarea pico IS) frente a la concentracioacuten relativa (concentracion de
analitoconcentracioacuten de IS)
Ejemplo de curva de linealidad para Naloxona extraido
con mini-QuEChERS
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 40
Recuperacioacuten y Reproducibilidad
Compuesto 50 ngmL Spiked
Recuperacioacuten RSD
100 ngmL Spiked
Recuperacioacuten RSD
Lidocaine 987 157 100 118
Tramadol 105 30 104 82
Amitriptyline 104 21 104 82
Biperidene 97 45 99 82
Oxazepam 770 92 78 86
Lorazepam 819 68 818 86
Chlorpromazine 110 103 105 63
Diltiazem 881 27 917 83
Naloxone 806 90 755 77
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 41
Conclusioacutenes y trabajo posterior
El meacutetodo mini-QuEChERS para la extraccioacuten de compuestos farmaceacuteuticos en
sangre total ofrece una alternativa a otras teacutecnicas de preparacioacuten de muestras
La preparacioacuten de muestras mini-QuEChERS es un enfoque simple facil y
barato que requiere una miacutenima experiencia en preparacioacuten de muestras y
miacutenimo equipamiento
Es un punto de partida para ampliar el numero y las clasificaciones evaluadas
en otras matrices bioloacutegicas y en sangre postmortem
El trabajo futuro incluira combinaciones adecuadas tanto de las sales de
extraccioacuten como de los sorbentes de d-SPE por el meacutetodo mini-QuEChERS
La columna Poroshell 120 ofrece una selectividad diferente y excelentes formas
de pico a lo largo del amplio rango de compuestos farmaceacuteuticos usados en este
estudio
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 42
Referencias
(1) M Anastassiades SJ Lehotay D Štajnbaher and FJ Schenk J AOAC Int 86 4121 (2003)
(2) G Stubbings and T Bigwood Anal Chim Acta 637 68 (2009)
(3) RR Rasmussen IMLD Storm PZH Rasmussen J Smedsgaard and KF Nielsen Anal Bioanal Chem 397 765 (2010)
(4) D Smith and K Lynam GCμECD analysis and confirmation of PCBs in fish tissue with Agilent JampW DB-35ms and DB-XLB GC columns Agilent Technologies 5990-6236EN (2010)
(5) F Ploumlssl M Giera and F Bracher J Chrom A 1135 19 (2006)
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 43
MEJORAR LA PRODUCTIVIDAD EN
HPLC ESTAacuteNDAR CON COLUMNAS
POROSHELL
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Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 44
Columnas Poroshell 120 para HPLC y UHPLC
bull 80-90 de eficacia de las sub 2um
bull A presiones un ~40-50 maacutes bajas
bull Con un tamantildeo de partiacutecula de 27um
bull Con una frita de entrada de 2um
bull Con el doble de resolucioacuten de una
columna de 35um
bull Con un liacutemite de presioacuten de 600 bar
bull La partiacutecula tiene un nuacutecleo soacutelido
(17um) y una cubierta exterior porosa
de 05um como zona de difusioacuten
Las Columnas Poroshell 120 tienen
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Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 45
Poroshell 120 proporciona Eficacia Suficiente
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Flujo 0582 mLmin AcetonitriloAgua (6040)
Volumen de Inyeccioacuten 4 microL
TCC 26 oC
DAD Sig=2544nm Ref=360100nm
Muestra Muestra de test RRLC
(PN 5188-6529) inoculada con
50 microL 2 mgmL Tiourea en
aguaacetonitrilo (6535)
25 5 75 10
mAU
0
200
400
600
06
46
0
82
6
11
48
15
18
20
16
2
22
3
28
16
41
32
62
73
97
53
larr N = 25053 Presioacuten = 182 bar
Poroshell 120 EC-C18 30 x 100 mm 27 um
min 25 5 75 10 125
mAU
0
200
400
600
06
49
0
86
5
12
75
17
56
24
18
27
05
34
94
52
81
82
18
13
04
1
larr N = 27295 Presioacuten = 386 bar
Eclipse Plus C18 30 x 100 mm 18 um
gt90 de la Eficacia de una 18um
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 46
iquestEn queacute tipos de instrumentos puede usar
Columnas Poroshell 120 HPLCrsquos y UHPLCrsquos
Consideraciones en UHPLC
bull Las columnas Poroshell 120 tienen un liacutemite de presioacuten de 600 bar
bull Los UHPLC estaacuten ajustados para columnas de bajo volumen por lo tanto las
Poroshell pueden usarse en todos los UHPLC
Consideraciones en HPLC
bull Las Columnas Poroshell 120 trabajan bien por debajo de 400 bar
bull Minimize los volumenes extra columna para las columnas 21 y 30mm ID ndash
siga las instrucciones dadas para las columnas RRHT (18um 600 bar)
bull Use en el detector velocidades adecuadas de adquisicioacuten para picos
estrechos de alta eficacia
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Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 47
Con una frita de 2 um Poroshell 120 no se bloquea
Muestras Complejas- Plasma
Diflusinal in Plasma
0
20
40
60
80
100
120
140
160
180
200
220
240
260
280
300
320
340
360
380
400
1 501 1001 1501 2001 2501
Injections
Pre
ssu
re
0
20000
40000
60000
80000
100000
120000
140000
160000
180000
200000
Eff
icie
ncy (
N)
End Press
Plates
Columna Poroshell 120 EC-C18 30 x 50mm 27um LC Agilent 1200 RRLC (SL)
Muestra Plasma Precipitado 2 partes Plasma 7 Partes 2080 Agua-MeCN w01 Aacutecido Foacutermico con 1 Parte de Diflusinal en
5050 Agua-MeCN 10 ugml (Concentracion Final Diflusinal 1 ugml) Agitado y dejado reposar 10 minutos
No Centrifugado No Filtrado
Volumen de Inyeccioacuten 1ul
Solvente A Agua w01 TFA
Solvente B MeCN w008 TFA
Flujo 1 mlmin 1 ul inyeccioacuten
Tiempo B
0 20
05 90
06 90
11 20
25 20
Page 47
Diflusinal es un anti-inflamatorio no esteroidal anaacutelogo
a la aspirina desarrollado por Merck Sharp amp Dohme
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 48
Las Columnas Superficialmente Porosas Pueden
Usarse cumpliendo los Requirimientos USP
De la lista USP de empaquetamientos de columnas LC 42009
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Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 49
Criterios de Ajuste de Meacutetodos USP y FDA Criterios de Ajuste de Meacutetodos de Dimensiones de Columna
Paraacutemetro Especificaciones Maacuteximas ComentariosEjemplos
Longitud de Columna 70 250mm 75mm
150mm 50mm
Diaacutemetro Interno de
Columna
25 (FDA ORA-LAB 545)
USP ndash 25 ID Columna puede ajustarse si la
velocidad lineal es constante
46 mm 30 mm (-35)
46 mm 21 mm (-54)
30 mm 21 mm (-30)
Flow Rate 50
Volumen de Inyeccioacuten
Reducir tanto como se necesitendash
debe cumplir los liacutemites de
deteccioacuten y precisioacuten
Si cambia a una columna maacutes
corta haga el cambio apropiado
en el volumen de inyeccioacuten
Tamantildeo de Partiacutecula Reducir hasta el 50
(no se puede aumentar)
Puede cambiar la longitud de columna y el
tamantildeo de partiacutecula para mantener la misma
Rs
5um 35um (-30)
5um 27um (-46) Cambiado en 22409 ndash Para la copia oficial y actual ir a
httpwwwfdagovScienceResearchFieldSciencedefaulthtm
USP 30 Second Supplement Revisions PF34(5) en proceso
Ver ldquo Stimuli articlerdquo en Pharmacopeial Forum 2009 35(6)
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Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 50
Comparacioacuten de 46 x 250 mm 5 um con Poroshell
120 EC-C18 46 x 100 mm 27um
min 5 10 15 20 25 30
mAU
0
20
40
60
80
100
97
12
111
16
115
96
126
74
152
48
161
51
164
35
206
87
230
76
292
90
min 5 10 15 20 25 30
mAU
0
50
100
150
200
250
17
19
21
89
23
11
26
06
38
67
44
37 45
58
54
50
59
20
70
37
Anaacutelisis maacutes raacutepido(columna maacutes corta flujo maacutes alto)
Mayor sensibilidad(partiacutecula maacutes pequentildeapico maacutes estrecho)
Maacutes optimizado (un anaacutelisis maacutes raacutepido permite ajustar mejor)
Ambos anaacutelisis en Agilent 1100 G1315B DAD (bajo 400 bar)
No se requiere cambio en la preparacioacuten de muestra frita de entrada
de 2 micras en ambas columnas
325 bar
110 bar
Sulfadiazina
Sulfatiazol
Sulfapiridina
Sulfamerazina
Sulfametazina
Sulfametazol
Sulfametoxipiridazina
Sulfacloropiridazina
Sulfametoxazol
Sulfadimetoxina
Tiempo B
0 8
33 33
34 33
Columna Eclipse Plus C18
46 x 250mm 5um
Flujo 1 mLmin
Fase Moacutevil
A 01 Aacutecido Foacutermico en Agua
B 01 Aacutecido Foacutermico en ACN
Tiempo B
0 8
12 33
132 33
Columna 46 x 100mm
Poroshell 120 EC-C18
27um
Flujo 185 mLmin
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Comparacioacuten de 46 x 250 mm 5 um con Poroshell
120 EC-C18 46 x 100 mm 27um
min 5 10 15 20 25 30
mAU
0
20
40
60
80
100
97
12
111
16
115
96
126
74
152
48
161
51
164
35
206
87
230
76
292
90
110 bar
5
mAU
0
50
100
150
200
250
17
19
21
89
23
11
26
06
38
67
44
37 45
58
54
50
59
20
70
37
325 bar
min
Ver condiciones en diapositiva anterior
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Mejor Resolucioacuten
linea base
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 52
Anaacutelisis maacutes raacutepido del meacutetodo USP para pastillas de
Simvastatina en Columnas Poroshell 120ndash Ajuste del meacutetodo
46 x 250 mm 5-um
Agilent ZORBAX Eclipse Plus C18
46 x 75 mm 27-um
Agilent Poroshell 120 EC-C18
65 CH3CN 35 39 gL NaH2PO4 (pH 45) 45 oC Sig = 238 8 Ref = 360 100 nm
Flujos 15 mLmin para la columna de 5-um 28 mLmin para la columna Poroshell 120 27um
Requerimiento
USP
5-um
(15 mLmin)
27-um
(28 mLmin)
TR na 9907 1457
krsquo gt 30 5962 5122
N gt 4500 16939 14439
Tf lt 20 109 110
min 2 4 6 8 10
mAU
0
5
10
15
20
25
30
35
40
min 2
mAU
0
5
10
15
20
25
30
35
40
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 53
Ajustes de los parametros cromatograficos en la
transferencia de meacutetodos Escalado del volume de inyeccioacuten
v1 x [(r22 x L2)(r1
2 x L1)] = V2
O bien
v2 = V1 x [(d22 x L2)(d1
2 x L1)]
v volume de inyeccioacuten
r radio de la columna
L longitud de la columna
Ajuste del flujo
F2= F1 x (L2L1 ) x (r2r1 )2
L longitud de la columna
F Flujo
r radio de la columna
Ajuste de la longitud del gradiente
En funcioacuten de la longitud de la columna
L2L1= tg2tg1
En funcioacuten del volumen muerto de columna y del flujo
tG2= tG1 x (V2V1) x (F1F2) t tiempos de gradiente
V volumen muerto de columna
F flujo
Columna ID Volumen muerto aprox
por mm longitud
46mm 100uL
30mm 425uL
21mm 208uL
10mm 047uL
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 54
Notas de Aplicacioacuten en Poroshell 120 y QuEChERS
Determination of Hormones in Shrimp by Agilent 1290 Infinity LC with
Agilent Poroshell 120 LC Column and Agilent QuEChERS for Sample
Preparation (publication 5990-6589EN)
Analysis of Pesticide Residues in Green Tea Using Agilent SampliQ
QuEChERS EN Kit by LCMSMS Detection (publication 5990-
6400EN)
Analysis of Pesticide Residues in Rice Using Agilent Bond Elut
QuEChERS AOAC Kit (publication 5990-8034EN)
Poroshell 120 for pharmaceutical analysis
Poroshell 120 Resources
QuEChERS Applications
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 55
Sumario
bull La columna Poroshell 120 es una nueva alternativa para LC de Alta
Resolucioacuten y Alta Velocidad que puede usarse en cualquier HPLC o UHPLC
bull Con la Poroshell 120 se pueden lograr separaciones de alta eficacia a baja
presioacuten
bull Puede usarse con muestras sucias sin ver una elevacioacuten anormal de la
presioacuten
bull Puede usarse en un meacutetodo USP sin comprometer los Criterios de Ajustes de
Meacutetodo
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Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 56
Soporte Teacutecnico Agilent
Teleacutefono de Atencioacuten al Cliente
901 11 68 90
email customercare_spainagilentcom
wwwagilentcomchem
![Page 18: Análisis de compuestos farmacéuticos en sangre total · PDF fileReducción en el procesamiento, el envío de la muestra, y los ... Gas flow: 10 L/min Nebulizer: 10 psi Sheath gas](https://reader031.vdocuments.site/reader031/viewer/2022030405/5a7a81727f8b9a0a668b45aa/html5/thumbnails/18.jpg)
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 18
La tarjeta sin celulosa es superior de forma medible a las tarjetas de papel de celulosa
Mejora la Sentildeal del MS
bullFormato libre de celulosa ha reducido el enlazado no especiacutefico y no contiene reactivos
quiacutemicos impregnados
Ventajas del Producto
Flujo de trabajo maacutes faacutecil
bull La extraccioacuten de la muestra de la tarjeta
requiere 5 veces menos fuerza que el
producto de celulosa
Proporciona excelente homogeneidad
de la mancha
bull Extracciones reproducibles
recuperaciones maacutes altas
independientemente del nivel de
hematocrito
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 19
bull El nivel de Hematocrito es el porcentaje del volumen de sangre ocupado por las ceacutelulas
rojas de la sangre
bull El material de muestreo Bond Elut DMS tiene una estructura de fibras
maacutes ordenadas comparado con la celulosa estaacutendard
Esta es la razoacuten de porqueacute Bond Elut DMS muestra mejor
reproducibilidad
Mejor Reproducibilidad
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 20
Bond Elut DBS Muestra Mejor Reproducibilidad
Bond Elut DMS tiene una desviacioacuten total de un 5 en todos los niveles HCT mientras que la
tarjeta de celulosa tiene una desviacioacuten de un 52 en todo el rango 10 veces de diferencia
Los datos abajo muestran la desviacioacuten de las medidas del CV desde niveles de HTC
normales (45) para tarjetas Bond Elut DMS y de celulosa (Whatman DMPK-C)
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 21
Ventajas Clave de la Teacutecnica DBS de Agilent
bull Una vez seca la muestra de sangre no supone peligro bioloacutegico alguno y se
puede transportar sin necesidad de sistemas de refrigeracioacuten costosos
bull Permite a los laboratorios centralizar los anaacutelisis de muestra perifeacutericas
bull Se requiere menos volumen de muestra (menor nordm de sujetos en el ensayo
menor nordm de repeticiones y eliminacioacuten de sujetos sateacutelite)
bull Permite la toma demuestra en serie del mismo sujeto
bull La recoleccioacuten de sangre es maacutes sencilla
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 22
Notas de Aplicacioacuten farmaceacuteuticas en Poroshell
120 and DMS Fast Analysis of Cefepime and Related Impurities on Poroshell 120 EC-C18 (publication 5990-7492EN) Comparing Selectivity Easy Transfer of Methods between Superficially Porous Agilent Poroshell 120 EC-C18 and totally Porous Agilent ZORBAX Eclipse Plus C18 (publication 5990-6588EN)
Analysis of Water Soluble Vitamins in Multivitamin Tablets Using Poroshell 120 EC-C18 (publication 5990-8107EN)
Analysis of Anthocyanins in Common Foods Using an Agilent Poroshell 120 SB-C18 (publication 5990-8249EN)
Analysis of Amitriptyline Fluoxetine Quetiapine and Sertraline Using Dried Plasma (publication 5990-8169EN)
Analysis of Amitriptyline Fluoxetine Quetiapine and Sertraline Using Dried Blood Spots (publication 5990-8168EN)
Investigation of Varying Blood Hematocrit Level in Dried Blood Spotting (publication 5990-8306EN)
Analysis of Cholesterol Lowering Drugs (Statins) Using Dried Matrix Spots Technology (publication 5990-8305EN)
Scalability of Agilent Columns Across HPLC and UHPLC Instruments (publication 5990-8428EN)
Converting a CHP Method for Insulin to Agilent Poroshell 120 Columns (publication 5990-9029EN)
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 23
La propuesta QuEChERS para Determinar compuestos
Farmaceacuteuticos y Toxinas en Sangre Total
Anaacutelisis de Compuestos Farmaceacuteuticos en Sangre Total con
la columna Poroshell 120 Usando el meacutetodo Modificado
Mini-QuEChERS para la preparacioacuten de muestra
Nota de Aplicacioacuten5990-8789EN
httpwwwchemagilentcomLibraryapplications5990-8789ENpdf
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 24
Introduccioacuten
Determinacioacuten de compuestos farmaceacuteuticos en anaacutelisis cliacutenicos y
foreacutensicos ADME (DMPK)
La preparacioacuten de muestra va desde la simple precipitacioacuten de
proteinas (PPT) a la maacutes compleja extraccioacuten en fase soacutelida (SPE)
Habitualmente la SPE ha ocupado este vaciacuteo pero simpre hay
espacio para teacutecnicas de preparacioacuten de muestras que son raacutepidas y
baratas de implementar
Se describe un procedimiento mini-QuEChERS modificado con
analisis LCndashMS-MS para la determinacioacuten de faacutermacos en sangre
total
Se analizan nueve diferentes faacutermacos (lidocaina tramadol
amitriptilina biperidina oxazepam lorazepam clorpromazina
diltiazem y naloxona)
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 25
Compuestos farmaceacuteuticos usados en el estudio
Compuesto Nuacutemero CAS Log P (ow) pKa Uso
terapeacuteutico
Lidocaina 137-58-6 24 801 Anesteacutesico local
antiarrithmico
Tramadol 27203-92-5 25 941 Analgesico
Amitriptilina 50-48-6 492 94 Antidepresivo
Biperidena 514-65-8 40 108 Anticolinergico
Oxazepam 604-75-1 223 17 113 Antianxiedad
Lorazepam 846-49-1 247 13 115 Antidepresivo
Clorpromazina 50-53-3 518 93 Antipsycoacutetico
Diltiazem 42399-41-7 363 77 Bloqueante de los
canales del calcio
Naloxona 465-65-6 145 79 Antagonista de los
receptores de opio
Nortriptilina (IS) 72-69-5 565 97
5 ugmL de solucioacuten (9 compuestos) y estandar interno en metanol
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 26
La Teacutecnica de QuEChERS aplicada a las muestras
de sangre
La sangre es el maacutes complejo de los fluidos bioloacutegicos
La determinacioacuten de faacutermacos en sangre total es a menudo necesaria en los
anaacutelisis foreacutensicos dada la dificultad de obtener suero o plasma
Los procedimientos convencionales para analizar faacutermacos en matrices
complejas como la sangre total son complicados
QuEChERS es una teacutecnica de preparacioacuten de muestra que fue desarrollada
para la extraccioacuten de residuos de plaguicidas multi-clase de frutas y vegetales
en 2003
A pesar de que los fluidos bioloacutegicos pueden parecer muy diferentes a una
pieza de fruta sin embargo siguen caminos paralelos
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 27
Caminos paralelos en la preparacioacuten de muestra
Fluidos Bioloacutegicos
Matrices complejas
Rotura de la arquitectura celular
bull Lisis agitacioacuten solvente orgaacutenico
hidroacutelisis
Analitos con un amplio rango de
polaridades
Retirar analito o matriz
Anaacutelisis por LCMSMS GCMS o
GCMSMS
Frutas y Vegetales
Matrices complejas
Rotura de la arquitectura celular
bull Trituracioacuten agitacioacuten solvente
orgaacutenico hidroacutelisis
Analitos con un amplio rango de
polaridades
Retirar analito o matriz
Anaacutelisis por LCMSMS GCMS o
GCMSMS
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 28
Procedimiento baacutesico por SPE para muestras de sangre
El pretratamiento de la sangre total implica la dilucioacuten con una
solucioacuten aacutecida un tampoacuten fosfato o aguaFA
Sonicar 15 minutos rotura de membranas celulares
Centrifugacioacuten
bull Procedimiento de SPE
ndash Acondicionado del cartucho metanol agua
ndash Carga del cartucho muestra
ndash Lavado del cartucho agua con metanol o tampoacuten metanol
ndash Elucioacuten del cartucho eluyente para el anaacutelisis
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 29
Procedimiento Baacutesico QuEChERS
15 g muestra homogeneizada (fortificada)
Antildeadir 15 mL ACN (1 AA) vortex
Antildeadir Sales de Extraccioacuten AOAC agitar
Centrifugar
Transferir 1 u 8 mL a un tubo d-SPE AOAC vortex centrifugar
Transferir al vial de Anaacutelisis
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 30
Ventajas y desventajas del Procedimiento QuEChERS
Ventajas
Extraccioacuten tipo liacutequidoliacutequido
Uso de aacutecido para interrumpir el ligado de proteinas
Exceso de sal para lisar los componentes celulares
Uso de acetonitrilo para facilitar la precipitacioacuten proteacuteica
Uso de SPE dispersiva para adsorber las interferencias de la matriz
Plossl etat J Chrom A 1135 (2006) 19-26
Desventajas
La cantidad de solvente y de muestra requeridos en el meacutetodo no
son ldquobioloacutegicamente adecuadosrdquo
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 31
Propoacutesito de la propuesta mini-Q
Ofrecer un enfoque maacutes adecuado biologicamente
Requirimientos de menores volumenes y tamantildeos de
muestra
Rango de faacutermacos varias polaridades y pKa
Evaluaciacuteoacuten de las interferencias de fondo
Extraccioacuten y datos de recuperacioacuten en un rango
aceptable
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 32
Faacutermacos en sangre Procedimiento mini-QuEChERS
mini-Q
Procedimiento
1 Antildeadir 2 homogeneizadores ceraacutemicos
2 Antildeadir 1 o 2 mL de sangre entera a un tubo de centriacutefuga con tapoacuten de rosca
3 Antildeadir estandar interno vortex
4 Antildeadir 2 mL de ACN acidificado ( 04 FA) vortex 30 seg
5 Antildeadir 500 mg de sales de extraccioacuten agitar vigorsamente 1 minuto centrifugar 5000 rpm 1 min
6 Transferir 1 mL del extraccto al material de d-SPE en tubo de centrifuga vortex centrifugar
7 Antildeadir 200 uL a 800 uL de agua en un vial LC vortex y analizar
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 33
Refinamiento del Procedimiento mini-Q
Paraacutemetros evaluados en la teacutecnica mini-Q
Muestra de sangre total
bull La matriz bioloacutegica maacutes complicada
Adicioacuten de aacutecido tipo y cantidad
bull Efecto en la particioacuten y extraccioacuten
Adicioacuten de las sales de QuEChERS no-tamponadas o
tamponadas con NaAcetato o Citrato
bull Efecto en el extracto inspeccioacuten visual
SPE Dispersiva
bull Limpieza de la matriz y recuperaciones de los compuestos
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 34
Conclusiones del estudio
El ACN con 4 de FA como solvente de extraccioacuten muestra
una lisis maacutes completa de la muestra frente a otros solventes
de extraccioacuten que mostraron una masa soacutelida
Las sales tamponadas AOAC de acetato Soacutedico generan el
extracto maacutes liacutempio y fueron elegidas para la d-SPE
El paso de dSPE no ofrece un clean up adicional para los
meacutetodos de extraccioacuten con sales EN y no tamponadas
principalmente
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 35
Datos de Adquisicoacuten LCMSMS
Compuestos Canales MRM
(mz) Fragmentador
(V) CE (V) RT (min) Delta RT
Lidocaina 1) 23518 gt 861
2) 23518 gt 581
97 11
35
137 04
Tramadol 1) 2642 gt 581
2) 2642 gt 2461
97 15
3
120 04
Amitriptilina 1) 2782 gt 117
2) 2782 gt 105
112 19
19
425 04
Biperidena 1)31223 gt 981
2) 31223 gt 551
123 19
60
423 07
Oxazepam 1) 28706 gt 2409
2) 28706 gt 2689
112 19
7
399 04
Lorazepam 1) 32102 gt 2749
2) 32102 gt 3029
113 15
7
409 04
Clorpromazina 1) 31911 gt 861
2) 31911 gt 581
112 15
43
463 04
Diltiazem 1) 41517 gt 1779
2) 41517 gt 1499
128 19
43
373 04
Naloxona 1) 32816 gt 310
2) 32816 gt 212
123 15
39
082 04
Nortriptilina (IS) 1) 26418 gt 233
2) 26418 gt 91
97 7
19
417 04
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035
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04
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045
0475
05
0525
055
0575
06
0625
065
0675
07
0725
075
0775
08
0825
085
0875
09
0925
095
0975
1
1025
105
1075
11
1125
115
1175
12
1225
125
1275
13
1325
135
1375
+ESI TIC Scan Frag=800V AOAC_BLANK_110228bd
1 1
Counts vs Acquisition Time (min)
05 1 15 2 25
3 35 4 45 5 55 6 65 7 75 8 85 9 95 10
Columna Poroshell 120 EC-C18 27
micro 21 x 100 mm PN 695775-902
Fase Moacutevil
A 5 mM Acetato Amoacutenico pH 5
2080 MeOHagua
B 5 mM Acetato amoacutencio en ACN
Flujo 04mLmin
Inyeccioacuten 10uL
GT (ordmC) 300
GF (lmin) 7
Nebulizador (psi) 40
SGT (ordmC) 400
SFG (lmin) 12
Capilar (V) 3500
NV (V) 500
Condiciones LCMS
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4
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48
49
5
51
+ESI MRM Frag=1120V CID190 (2782000 -gt 1170000) HQC_6d
1 1
Counts vs Acquisition Time (min) 01 02 03 04 05 06 07 08 09 1 11 12 13 14 15 16 17 18 19 2 21 22 23 24 25 26 27 28 29 3 31 32 33 34 35 36 37 38 39 4 41 42 43 44 45 46
Nalo
xo
ne
Lid
oc
ain
e
Tra
mad
ol
Oxazep
am
Lo
razep
am
Bip
eri
de
n
Am
itri
pty
lin
e
Dil
tiazem
Ch
lorp
rom
azin
e
No
rtri
pty
lin
e (
IS)
Cromatograma LCMSMS de 10 ngmL de sangre total fortificada despueacutes
de extraccioacuten mini-QuEChERS AOAC (NaAc) y d-SPE (50mg PSA y
150mg MgSO4)
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14
15
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18
19
2
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25
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4
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48
49
5
51
+ESI MRM Frag=1120V CID190 (2782000 -gt 1170000) HQC_6d
1 1
Counts vs Acquisition Time (min) 01 02 03 04 05 06 07 08 09 1 11 12 13 14 15 16 17 18 19 2 21 22 23 24 25 26 27 28 29 3 31 32 33 34 35 36 37 38 39 4 41 42 43 44 45 46
1 x10
415 42 425 43 435 44 445 45 455 46 465 47 475 48 485 49 495 5
505 51 515 52 525 53 535 54 545 55 555 56 565 57
+ESI MRM Frag=1120V CID190 (2871000 -gt 2409000) RE_L_1d 1
Counts vs Acquisition Time (min) 305 31 315 32 325 33 335 34 345 35 355 36 365 37 375 38 385 39 395 4 405 41 415 42 425 43 435 44 445 45 455 46 465 47 475
Relacioacuten sentildealruido para el Oxazepam y Lorazepam a
10 ngmL (10 ppb)
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 39
La Naloxone muestra esta curva de linealidad de10-250 ngmL (ppb) con una R2
= 0991
Las curvas de calibracioacuten se generaron con la respuestra relativa (area pico
analitoarea pico IS) frente a la concentracioacuten relativa (concentracion de
analitoconcentracioacuten de IS)
Ejemplo de curva de linealidad para Naloxona extraido
con mini-QuEChERS
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 40
Recuperacioacuten y Reproducibilidad
Compuesto 50 ngmL Spiked
Recuperacioacuten RSD
100 ngmL Spiked
Recuperacioacuten RSD
Lidocaine 987 157 100 118
Tramadol 105 30 104 82
Amitriptyline 104 21 104 82
Biperidene 97 45 99 82
Oxazepam 770 92 78 86
Lorazepam 819 68 818 86
Chlorpromazine 110 103 105 63
Diltiazem 881 27 917 83
Naloxone 806 90 755 77
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 41
Conclusioacutenes y trabajo posterior
El meacutetodo mini-QuEChERS para la extraccioacuten de compuestos farmaceacuteuticos en
sangre total ofrece una alternativa a otras teacutecnicas de preparacioacuten de muestras
La preparacioacuten de muestras mini-QuEChERS es un enfoque simple facil y
barato que requiere una miacutenima experiencia en preparacioacuten de muestras y
miacutenimo equipamiento
Es un punto de partida para ampliar el numero y las clasificaciones evaluadas
en otras matrices bioloacutegicas y en sangre postmortem
El trabajo futuro incluira combinaciones adecuadas tanto de las sales de
extraccioacuten como de los sorbentes de d-SPE por el meacutetodo mini-QuEChERS
La columna Poroshell 120 ofrece una selectividad diferente y excelentes formas
de pico a lo largo del amplio rango de compuestos farmaceacuteuticos usados en este
estudio
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 42
Referencias
(1) M Anastassiades SJ Lehotay D Štajnbaher and FJ Schenk J AOAC Int 86 4121 (2003)
(2) G Stubbings and T Bigwood Anal Chim Acta 637 68 (2009)
(3) RR Rasmussen IMLD Storm PZH Rasmussen J Smedsgaard and KF Nielsen Anal Bioanal Chem 397 765 (2010)
(4) D Smith and K Lynam GCμECD analysis and confirmation of PCBs in fish tissue with Agilent JampW DB-35ms and DB-XLB GC columns Agilent Technologies 5990-6236EN (2010)
(5) F Ploumlssl M Giera and F Bracher J Chrom A 1135 19 (2006)
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 43
MEJORAR LA PRODUCTIVIDAD EN
HPLC ESTAacuteNDAR CON COLUMNAS
POROSHELL
Page 43
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 44
Columnas Poroshell 120 para HPLC y UHPLC
bull 80-90 de eficacia de las sub 2um
bull A presiones un ~40-50 maacutes bajas
bull Con un tamantildeo de partiacutecula de 27um
bull Con una frita de entrada de 2um
bull Con el doble de resolucioacuten de una
columna de 35um
bull Con un liacutemite de presioacuten de 600 bar
bull La partiacutecula tiene un nuacutecleo soacutelido
(17um) y una cubierta exterior porosa
de 05um como zona de difusioacuten
Las Columnas Poroshell 120 tienen
Page 44
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 45
Poroshell 120 proporciona Eficacia Suficiente
Page 45
Flujo 0582 mLmin AcetonitriloAgua (6040)
Volumen de Inyeccioacuten 4 microL
TCC 26 oC
DAD Sig=2544nm Ref=360100nm
Muestra Muestra de test RRLC
(PN 5188-6529) inoculada con
50 microL 2 mgmL Tiourea en
aguaacetonitrilo (6535)
25 5 75 10
mAU
0
200
400
600
06
46
0
82
6
11
48
15
18
20
16
2
22
3
28
16
41
32
62
73
97
53
larr N = 25053 Presioacuten = 182 bar
Poroshell 120 EC-C18 30 x 100 mm 27 um
min 25 5 75 10 125
mAU
0
200
400
600
06
49
0
86
5
12
75
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56
24
18
27
05
34
94
52
81
82
18
13
04
1
larr N = 27295 Presioacuten = 386 bar
Eclipse Plus C18 30 x 100 mm 18 um
gt90 de la Eficacia de una 18um
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 46
iquestEn queacute tipos de instrumentos puede usar
Columnas Poroshell 120 HPLCrsquos y UHPLCrsquos
Consideraciones en UHPLC
bull Las columnas Poroshell 120 tienen un liacutemite de presioacuten de 600 bar
bull Los UHPLC estaacuten ajustados para columnas de bajo volumen por lo tanto las
Poroshell pueden usarse en todos los UHPLC
Consideraciones en HPLC
bull Las Columnas Poroshell 120 trabajan bien por debajo de 400 bar
bull Minimize los volumenes extra columna para las columnas 21 y 30mm ID ndash
siga las instrucciones dadas para las columnas RRHT (18um 600 bar)
bull Use en el detector velocidades adecuadas de adquisicioacuten para picos
estrechos de alta eficacia
Page 46
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 47
Con una frita de 2 um Poroshell 120 no se bloquea
Muestras Complejas- Plasma
Diflusinal in Plasma
0
20
40
60
80
100
120
140
160
180
200
220
240
260
280
300
320
340
360
380
400
1 501 1001 1501 2001 2501
Injections
Pre
ssu
re
0
20000
40000
60000
80000
100000
120000
140000
160000
180000
200000
Eff
icie
ncy (
N)
End Press
Plates
Columna Poroshell 120 EC-C18 30 x 50mm 27um LC Agilent 1200 RRLC (SL)
Muestra Plasma Precipitado 2 partes Plasma 7 Partes 2080 Agua-MeCN w01 Aacutecido Foacutermico con 1 Parte de Diflusinal en
5050 Agua-MeCN 10 ugml (Concentracion Final Diflusinal 1 ugml) Agitado y dejado reposar 10 minutos
No Centrifugado No Filtrado
Volumen de Inyeccioacuten 1ul
Solvente A Agua w01 TFA
Solvente B MeCN w008 TFA
Flujo 1 mlmin 1 ul inyeccioacuten
Tiempo B
0 20
05 90
06 90
11 20
25 20
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Diflusinal es un anti-inflamatorio no esteroidal anaacutelogo
a la aspirina desarrollado por Merck Sharp amp Dohme
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 48
Las Columnas Superficialmente Porosas Pueden
Usarse cumpliendo los Requirimientos USP
De la lista USP de empaquetamientos de columnas LC 42009
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Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 49
Criterios de Ajuste de Meacutetodos USP y FDA Criterios de Ajuste de Meacutetodos de Dimensiones de Columna
Paraacutemetro Especificaciones Maacuteximas ComentariosEjemplos
Longitud de Columna 70 250mm 75mm
150mm 50mm
Diaacutemetro Interno de
Columna
25 (FDA ORA-LAB 545)
USP ndash 25 ID Columna puede ajustarse si la
velocidad lineal es constante
46 mm 30 mm (-35)
46 mm 21 mm (-54)
30 mm 21 mm (-30)
Flow Rate 50
Volumen de Inyeccioacuten
Reducir tanto como se necesitendash
debe cumplir los liacutemites de
deteccioacuten y precisioacuten
Si cambia a una columna maacutes
corta haga el cambio apropiado
en el volumen de inyeccioacuten
Tamantildeo de Partiacutecula Reducir hasta el 50
(no se puede aumentar)
Puede cambiar la longitud de columna y el
tamantildeo de partiacutecula para mantener la misma
Rs
5um 35um (-30)
5um 27um (-46) Cambiado en 22409 ndash Para la copia oficial y actual ir a
httpwwwfdagovScienceResearchFieldSciencedefaulthtm
USP 30 Second Supplement Revisions PF34(5) en proceso
Ver ldquo Stimuli articlerdquo en Pharmacopeial Forum 2009 35(6)
Page 49
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 50
Comparacioacuten de 46 x 250 mm 5 um con Poroshell
120 EC-C18 46 x 100 mm 27um
min 5 10 15 20 25 30
mAU
0
20
40
60
80
100
97
12
111
16
115
96
126
74
152
48
161
51
164
35
206
87
230
76
292
90
min 5 10 15 20 25 30
mAU
0
50
100
150
200
250
17
19
21
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11
26
06
38
67
44
37 45
58
54
50
59
20
70
37
Anaacutelisis maacutes raacutepido(columna maacutes corta flujo maacutes alto)
Mayor sensibilidad(partiacutecula maacutes pequentildeapico maacutes estrecho)
Maacutes optimizado (un anaacutelisis maacutes raacutepido permite ajustar mejor)
Ambos anaacutelisis en Agilent 1100 G1315B DAD (bajo 400 bar)
No se requiere cambio en la preparacioacuten de muestra frita de entrada
de 2 micras en ambas columnas
325 bar
110 bar
Sulfadiazina
Sulfatiazol
Sulfapiridina
Sulfamerazina
Sulfametazina
Sulfametazol
Sulfametoxipiridazina
Sulfacloropiridazina
Sulfametoxazol
Sulfadimetoxina
Tiempo B
0 8
33 33
34 33
Columna Eclipse Plus C18
46 x 250mm 5um
Flujo 1 mLmin
Fase Moacutevil
A 01 Aacutecido Foacutermico en Agua
B 01 Aacutecido Foacutermico en ACN
Tiempo B
0 8
12 33
132 33
Columna 46 x 100mm
Poroshell 120 EC-C18
27um
Flujo 185 mLmin
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Comparacioacuten de 46 x 250 mm 5 um con Poroshell
120 EC-C18 46 x 100 mm 27um
min 5 10 15 20 25 30
mAU
0
20
40
60
80
100
97
12
111
16
115
96
126
74
152
48
161
51
164
35
206
87
230
76
292
90
110 bar
5
mAU
0
50
100
150
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250
17
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21
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38
67
44
37 45
58
54
50
59
20
70
37
325 bar
min
Ver condiciones en diapositiva anterior
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Mejor Resolucioacuten
linea base
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 52
Anaacutelisis maacutes raacutepido del meacutetodo USP para pastillas de
Simvastatina en Columnas Poroshell 120ndash Ajuste del meacutetodo
46 x 250 mm 5-um
Agilent ZORBAX Eclipse Plus C18
46 x 75 mm 27-um
Agilent Poroshell 120 EC-C18
65 CH3CN 35 39 gL NaH2PO4 (pH 45) 45 oC Sig = 238 8 Ref = 360 100 nm
Flujos 15 mLmin para la columna de 5-um 28 mLmin para la columna Poroshell 120 27um
Requerimiento
USP
5-um
(15 mLmin)
27-um
(28 mLmin)
TR na 9907 1457
krsquo gt 30 5962 5122
N gt 4500 16939 14439
Tf lt 20 109 110
min 2 4 6 8 10
mAU
0
5
10
15
20
25
30
35
40
min 2
mAU
0
5
10
15
20
25
30
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40
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Ajustes de los parametros cromatograficos en la
transferencia de meacutetodos Escalado del volume de inyeccioacuten
v1 x [(r22 x L2)(r1
2 x L1)] = V2
O bien
v2 = V1 x [(d22 x L2)(d1
2 x L1)]
v volume de inyeccioacuten
r radio de la columna
L longitud de la columna
Ajuste del flujo
F2= F1 x (L2L1 ) x (r2r1 )2
L longitud de la columna
F Flujo
r radio de la columna
Ajuste de la longitud del gradiente
En funcioacuten de la longitud de la columna
L2L1= tg2tg1
En funcioacuten del volumen muerto de columna y del flujo
tG2= tG1 x (V2V1) x (F1F2) t tiempos de gradiente
V volumen muerto de columna
F flujo
Columna ID Volumen muerto aprox
por mm longitud
46mm 100uL
30mm 425uL
21mm 208uL
10mm 047uL
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Notas de Aplicacioacuten en Poroshell 120 y QuEChERS
Determination of Hormones in Shrimp by Agilent 1290 Infinity LC with
Agilent Poroshell 120 LC Column and Agilent QuEChERS for Sample
Preparation (publication 5990-6589EN)
Analysis of Pesticide Residues in Green Tea Using Agilent SampliQ
QuEChERS EN Kit by LCMSMS Detection (publication 5990-
6400EN)
Analysis of Pesticide Residues in Rice Using Agilent Bond Elut
QuEChERS AOAC Kit (publication 5990-8034EN)
Poroshell 120 for pharmaceutical analysis
Poroshell 120 Resources
QuEChERS Applications
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Sumario
bull La columna Poroshell 120 es una nueva alternativa para LC de Alta
Resolucioacuten y Alta Velocidad que puede usarse en cualquier HPLC o UHPLC
bull Con la Poroshell 120 se pueden lograr separaciones de alta eficacia a baja
presioacuten
bull Puede usarse con muestras sucias sin ver una elevacioacuten anormal de la
presioacuten
bull Puede usarse en un meacutetodo USP sin comprometer los Criterios de Ajustes de
Meacutetodo
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Soporte Teacutecnico Agilent
Teleacutefono de Atencioacuten al Cliente
901 11 68 90
email customercare_spainagilentcom
wwwagilentcomchem
![Page 19: Análisis de compuestos farmacéuticos en sangre total · PDF fileReducción en el procesamiento, el envío de la muestra, y los ... Gas flow: 10 L/min Nebulizer: 10 psi Sheath gas](https://reader031.vdocuments.site/reader031/viewer/2022030405/5a7a81727f8b9a0a668b45aa/html5/thumbnails/19.jpg)
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 19
bull El nivel de Hematocrito es el porcentaje del volumen de sangre ocupado por las ceacutelulas
rojas de la sangre
bull El material de muestreo Bond Elut DMS tiene una estructura de fibras
maacutes ordenadas comparado con la celulosa estaacutendard
Esta es la razoacuten de porqueacute Bond Elut DMS muestra mejor
reproducibilidad
Mejor Reproducibilidad
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Bond Elut DBS Muestra Mejor Reproducibilidad
Bond Elut DMS tiene una desviacioacuten total de un 5 en todos los niveles HCT mientras que la
tarjeta de celulosa tiene una desviacioacuten de un 52 en todo el rango 10 veces de diferencia
Los datos abajo muestran la desviacioacuten de las medidas del CV desde niveles de HTC
normales (45) para tarjetas Bond Elut DMS y de celulosa (Whatman DMPK-C)
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 21
Ventajas Clave de la Teacutecnica DBS de Agilent
bull Una vez seca la muestra de sangre no supone peligro bioloacutegico alguno y se
puede transportar sin necesidad de sistemas de refrigeracioacuten costosos
bull Permite a los laboratorios centralizar los anaacutelisis de muestra perifeacutericas
bull Se requiere menos volumen de muestra (menor nordm de sujetos en el ensayo
menor nordm de repeticiones y eliminacioacuten de sujetos sateacutelite)
bull Permite la toma demuestra en serie del mismo sujeto
bull La recoleccioacuten de sangre es maacutes sencilla
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 22
Notas de Aplicacioacuten farmaceacuteuticas en Poroshell
120 and DMS Fast Analysis of Cefepime and Related Impurities on Poroshell 120 EC-C18 (publication 5990-7492EN) Comparing Selectivity Easy Transfer of Methods between Superficially Porous Agilent Poroshell 120 EC-C18 and totally Porous Agilent ZORBAX Eclipse Plus C18 (publication 5990-6588EN)
Analysis of Water Soluble Vitamins in Multivitamin Tablets Using Poroshell 120 EC-C18 (publication 5990-8107EN)
Analysis of Anthocyanins in Common Foods Using an Agilent Poroshell 120 SB-C18 (publication 5990-8249EN)
Analysis of Amitriptyline Fluoxetine Quetiapine and Sertraline Using Dried Plasma (publication 5990-8169EN)
Analysis of Amitriptyline Fluoxetine Quetiapine and Sertraline Using Dried Blood Spots (publication 5990-8168EN)
Investigation of Varying Blood Hematocrit Level in Dried Blood Spotting (publication 5990-8306EN)
Analysis of Cholesterol Lowering Drugs (Statins) Using Dried Matrix Spots Technology (publication 5990-8305EN)
Scalability of Agilent Columns Across HPLC and UHPLC Instruments (publication 5990-8428EN)
Converting a CHP Method for Insulin to Agilent Poroshell 120 Columns (publication 5990-9029EN)
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La propuesta QuEChERS para Determinar compuestos
Farmaceacuteuticos y Toxinas en Sangre Total
Anaacutelisis de Compuestos Farmaceacuteuticos en Sangre Total con
la columna Poroshell 120 Usando el meacutetodo Modificado
Mini-QuEChERS para la preparacioacuten de muestra
Nota de Aplicacioacuten5990-8789EN
httpwwwchemagilentcomLibraryapplications5990-8789ENpdf
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 24
Introduccioacuten
Determinacioacuten de compuestos farmaceacuteuticos en anaacutelisis cliacutenicos y
foreacutensicos ADME (DMPK)
La preparacioacuten de muestra va desde la simple precipitacioacuten de
proteinas (PPT) a la maacutes compleja extraccioacuten en fase soacutelida (SPE)
Habitualmente la SPE ha ocupado este vaciacuteo pero simpre hay
espacio para teacutecnicas de preparacioacuten de muestras que son raacutepidas y
baratas de implementar
Se describe un procedimiento mini-QuEChERS modificado con
analisis LCndashMS-MS para la determinacioacuten de faacutermacos en sangre
total
Se analizan nueve diferentes faacutermacos (lidocaina tramadol
amitriptilina biperidina oxazepam lorazepam clorpromazina
diltiazem y naloxona)
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 25
Compuestos farmaceacuteuticos usados en el estudio
Compuesto Nuacutemero CAS Log P (ow) pKa Uso
terapeacuteutico
Lidocaina 137-58-6 24 801 Anesteacutesico local
antiarrithmico
Tramadol 27203-92-5 25 941 Analgesico
Amitriptilina 50-48-6 492 94 Antidepresivo
Biperidena 514-65-8 40 108 Anticolinergico
Oxazepam 604-75-1 223 17 113 Antianxiedad
Lorazepam 846-49-1 247 13 115 Antidepresivo
Clorpromazina 50-53-3 518 93 Antipsycoacutetico
Diltiazem 42399-41-7 363 77 Bloqueante de los
canales del calcio
Naloxona 465-65-6 145 79 Antagonista de los
receptores de opio
Nortriptilina (IS) 72-69-5 565 97
5 ugmL de solucioacuten (9 compuestos) y estandar interno en metanol
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La Teacutecnica de QuEChERS aplicada a las muestras
de sangre
La sangre es el maacutes complejo de los fluidos bioloacutegicos
La determinacioacuten de faacutermacos en sangre total es a menudo necesaria en los
anaacutelisis foreacutensicos dada la dificultad de obtener suero o plasma
Los procedimientos convencionales para analizar faacutermacos en matrices
complejas como la sangre total son complicados
QuEChERS es una teacutecnica de preparacioacuten de muestra que fue desarrollada
para la extraccioacuten de residuos de plaguicidas multi-clase de frutas y vegetales
en 2003
A pesar de que los fluidos bioloacutegicos pueden parecer muy diferentes a una
pieza de fruta sin embargo siguen caminos paralelos
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 27
Caminos paralelos en la preparacioacuten de muestra
Fluidos Bioloacutegicos
Matrices complejas
Rotura de la arquitectura celular
bull Lisis agitacioacuten solvente orgaacutenico
hidroacutelisis
Analitos con un amplio rango de
polaridades
Retirar analito o matriz
Anaacutelisis por LCMSMS GCMS o
GCMSMS
Frutas y Vegetales
Matrices complejas
Rotura de la arquitectura celular
bull Trituracioacuten agitacioacuten solvente
orgaacutenico hidroacutelisis
Analitos con un amplio rango de
polaridades
Retirar analito o matriz
Anaacutelisis por LCMSMS GCMS o
GCMSMS
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 28
Procedimiento baacutesico por SPE para muestras de sangre
El pretratamiento de la sangre total implica la dilucioacuten con una
solucioacuten aacutecida un tampoacuten fosfato o aguaFA
Sonicar 15 minutos rotura de membranas celulares
Centrifugacioacuten
bull Procedimiento de SPE
ndash Acondicionado del cartucho metanol agua
ndash Carga del cartucho muestra
ndash Lavado del cartucho agua con metanol o tampoacuten metanol
ndash Elucioacuten del cartucho eluyente para el anaacutelisis
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 29
Procedimiento Baacutesico QuEChERS
15 g muestra homogeneizada (fortificada)
Antildeadir 15 mL ACN (1 AA) vortex
Antildeadir Sales de Extraccioacuten AOAC agitar
Centrifugar
Transferir 1 u 8 mL a un tubo d-SPE AOAC vortex centrifugar
Transferir al vial de Anaacutelisis
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 30
Ventajas y desventajas del Procedimiento QuEChERS
Ventajas
Extraccioacuten tipo liacutequidoliacutequido
Uso de aacutecido para interrumpir el ligado de proteinas
Exceso de sal para lisar los componentes celulares
Uso de acetonitrilo para facilitar la precipitacioacuten proteacuteica
Uso de SPE dispersiva para adsorber las interferencias de la matriz
Plossl etat J Chrom A 1135 (2006) 19-26
Desventajas
La cantidad de solvente y de muestra requeridos en el meacutetodo no
son ldquobioloacutegicamente adecuadosrdquo
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 31
Propoacutesito de la propuesta mini-Q
Ofrecer un enfoque maacutes adecuado biologicamente
Requirimientos de menores volumenes y tamantildeos de
muestra
Rango de faacutermacos varias polaridades y pKa
Evaluaciacuteoacuten de las interferencias de fondo
Extraccioacuten y datos de recuperacioacuten en un rango
aceptable
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 32
Faacutermacos en sangre Procedimiento mini-QuEChERS
mini-Q
Procedimiento
1 Antildeadir 2 homogeneizadores ceraacutemicos
2 Antildeadir 1 o 2 mL de sangre entera a un tubo de centriacutefuga con tapoacuten de rosca
3 Antildeadir estandar interno vortex
4 Antildeadir 2 mL de ACN acidificado ( 04 FA) vortex 30 seg
5 Antildeadir 500 mg de sales de extraccioacuten agitar vigorsamente 1 minuto centrifugar 5000 rpm 1 min
6 Transferir 1 mL del extraccto al material de d-SPE en tubo de centrifuga vortex centrifugar
7 Antildeadir 200 uL a 800 uL de agua en un vial LC vortex y analizar
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 33
Refinamiento del Procedimiento mini-Q
Paraacutemetros evaluados en la teacutecnica mini-Q
Muestra de sangre total
bull La matriz bioloacutegica maacutes complicada
Adicioacuten de aacutecido tipo y cantidad
bull Efecto en la particioacuten y extraccioacuten
Adicioacuten de las sales de QuEChERS no-tamponadas o
tamponadas con NaAcetato o Citrato
bull Efecto en el extracto inspeccioacuten visual
SPE Dispersiva
bull Limpieza de la matriz y recuperaciones de los compuestos
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 34
Conclusiones del estudio
El ACN con 4 de FA como solvente de extraccioacuten muestra
una lisis maacutes completa de la muestra frente a otros solventes
de extraccioacuten que mostraron una masa soacutelida
Las sales tamponadas AOAC de acetato Soacutedico generan el
extracto maacutes liacutempio y fueron elegidas para la d-SPE
El paso de dSPE no ofrece un clean up adicional para los
meacutetodos de extraccioacuten con sales EN y no tamponadas
principalmente
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 35
Datos de Adquisicoacuten LCMSMS
Compuestos Canales MRM
(mz) Fragmentador
(V) CE (V) RT (min) Delta RT
Lidocaina 1) 23518 gt 861
2) 23518 gt 581
97 11
35
137 04
Tramadol 1) 2642 gt 581
2) 2642 gt 2461
97 15
3
120 04
Amitriptilina 1) 2782 gt 117
2) 2782 gt 105
112 19
19
425 04
Biperidena 1)31223 gt 981
2) 31223 gt 551
123 19
60
423 07
Oxazepam 1) 28706 gt 2409
2) 28706 gt 2689
112 19
7
399 04
Lorazepam 1) 32102 gt 2749
2) 32102 gt 3029
113 15
7
409 04
Clorpromazina 1) 31911 gt 861
2) 31911 gt 581
112 15
43
463 04
Diltiazem 1) 41517 gt 1779
2) 41517 gt 1499
128 19
43
373 04
Naloxona 1) 32816 gt 310
2) 32816 gt 212
123 15
39
082 04
Nortriptilina (IS) 1) 26418 gt 233
2) 26418 gt 91
97 7
19
417 04
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06
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065
0675
07
0725
075
0775
08
0825
085
0875
09
0925
095
0975
1
1025
105
1075
11
1125
115
1175
12
1225
125
1275
13
1325
135
1375
+ESI TIC Scan Frag=800V AOAC_BLANK_110228bd
1 1
Counts vs Acquisition Time (min)
05 1 15 2 25
3 35 4 45 5 55 6 65 7 75 8 85 9 95 10
Columna Poroshell 120 EC-C18 27
micro 21 x 100 mm PN 695775-902
Fase Moacutevil
A 5 mM Acetato Amoacutenico pH 5
2080 MeOHagua
B 5 mM Acetato amoacutencio en ACN
Flujo 04mLmin
Inyeccioacuten 10uL
GT (ordmC) 300
GF (lmin) 7
Nebulizador (psi) 40
SGT (ordmC) 400
SFG (lmin) 12
Capilar (V) 3500
NV (V) 500
Condiciones LCMS
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29
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36
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38
39
4
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42
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47
48
49
5
51
+ESI MRM Frag=1120V CID190 (2782000 -gt 1170000) HQC_6d
1 1
Counts vs Acquisition Time (min) 01 02 03 04 05 06 07 08 09 1 11 12 13 14 15 16 17 18 19 2 21 22 23 24 25 26 27 28 29 3 31 32 33 34 35 36 37 38 39 4 41 42 43 44 45 46
Nalo
xo
ne
Lid
oc
ain
e
Tra
mad
ol
Oxazep
am
Lo
razep
am
Bip
eri
de
n
Am
itri
pty
lin
e
Dil
tiazem
Ch
lorp
rom
azin
e
No
rtri
pty
lin
e (
IS)
Cromatograma LCMSMS de 10 ngmL de sangre total fortificada despueacutes
de extraccioacuten mini-QuEChERS AOAC (NaAc) y d-SPE (50mg PSA y
150mg MgSO4)
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34
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39
4
41
42
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48
49
5
51
+ESI MRM Frag=1120V CID190 (2782000 -gt 1170000) HQC_6d
1 1
Counts vs Acquisition Time (min) 01 02 03 04 05 06 07 08 09 1 11 12 13 14 15 16 17 18 19 2 21 22 23 24 25 26 27 28 29 3 31 32 33 34 35 36 37 38 39 4 41 42 43 44 45 46
1 x10
415 42 425 43 435 44 445 45 455 46 465 47 475 48 485 49 495 5
505 51 515 52 525 53 535 54 545 55 555 56 565 57
+ESI MRM Frag=1120V CID190 (2871000 -gt 2409000) RE_L_1d 1
Counts vs Acquisition Time (min) 305 31 315 32 325 33 335 34 345 35 355 36 365 37 375 38 385 39 395 4 405 41 415 42 425 43 435 44 445 45 455 46 465 47 475
Relacioacuten sentildealruido para el Oxazepam y Lorazepam a
10 ngmL (10 ppb)
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 39
La Naloxone muestra esta curva de linealidad de10-250 ngmL (ppb) con una R2
= 0991
Las curvas de calibracioacuten se generaron con la respuestra relativa (area pico
analitoarea pico IS) frente a la concentracioacuten relativa (concentracion de
analitoconcentracioacuten de IS)
Ejemplo de curva de linealidad para Naloxona extraido
con mini-QuEChERS
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 40
Recuperacioacuten y Reproducibilidad
Compuesto 50 ngmL Spiked
Recuperacioacuten RSD
100 ngmL Spiked
Recuperacioacuten RSD
Lidocaine 987 157 100 118
Tramadol 105 30 104 82
Amitriptyline 104 21 104 82
Biperidene 97 45 99 82
Oxazepam 770 92 78 86
Lorazepam 819 68 818 86
Chlorpromazine 110 103 105 63
Diltiazem 881 27 917 83
Naloxone 806 90 755 77
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 41
Conclusioacutenes y trabajo posterior
El meacutetodo mini-QuEChERS para la extraccioacuten de compuestos farmaceacuteuticos en
sangre total ofrece una alternativa a otras teacutecnicas de preparacioacuten de muestras
La preparacioacuten de muestras mini-QuEChERS es un enfoque simple facil y
barato que requiere una miacutenima experiencia en preparacioacuten de muestras y
miacutenimo equipamiento
Es un punto de partida para ampliar el numero y las clasificaciones evaluadas
en otras matrices bioloacutegicas y en sangre postmortem
El trabajo futuro incluira combinaciones adecuadas tanto de las sales de
extraccioacuten como de los sorbentes de d-SPE por el meacutetodo mini-QuEChERS
La columna Poroshell 120 ofrece una selectividad diferente y excelentes formas
de pico a lo largo del amplio rango de compuestos farmaceacuteuticos usados en este
estudio
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 42
Referencias
(1) M Anastassiades SJ Lehotay D Štajnbaher and FJ Schenk J AOAC Int 86 4121 (2003)
(2) G Stubbings and T Bigwood Anal Chim Acta 637 68 (2009)
(3) RR Rasmussen IMLD Storm PZH Rasmussen J Smedsgaard and KF Nielsen Anal Bioanal Chem 397 765 (2010)
(4) D Smith and K Lynam GCμECD analysis and confirmation of PCBs in fish tissue with Agilent JampW DB-35ms and DB-XLB GC columns Agilent Technologies 5990-6236EN (2010)
(5) F Ploumlssl M Giera and F Bracher J Chrom A 1135 19 (2006)
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 43
MEJORAR LA PRODUCTIVIDAD EN
HPLC ESTAacuteNDAR CON COLUMNAS
POROSHELL
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Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 44
Columnas Poroshell 120 para HPLC y UHPLC
bull 80-90 de eficacia de las sub 2um
bull A presiones un ~40-50 maacutes bajas
bull Con un tamantildeo de partiacutecula de 27um
bull Con una frita de entrada de 2um
bull Con el doble de resolucioacuten de una
columna de 35um
bull Con un liacutemite de presioacuten de 600 bar
bull La partiacutecula tiene un nuacutecleo soacutelido
(17um) y una cubierta exterior porosa
de 05um como zona de difusioacuten
Las Columnas Poroshell 120 tienen
Page 44
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 45
Poroshell 120 proporciona Eficacia Suficiente
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Flujo 0582 mLmin AcetonitriloAgua (6040)
Volumen de Inyeccioacuten 4 microL
TCC 26 oC
DAD Sig=2544nm Ref=360100nm
Muestra Muestra de test RRLC
(PN 5188-6529) inoculada con
50 microL 2 mgmL Tiourea en
aguaacetonitrilo (6535)
25 5 75 10
mAU
0
200
400
600
06
46
0
82
6
11
48
15
18
20
16
2
22
3
28
16
41
32
62
73
97
53
larr N = 25053 Presioacuten = 182 bar
Poroshell 120 EC-C18 30 x 100 mm 27 um
min 25 5 75 10 125
mAU
0
200
400
600
06
49
0
86
5
12
75
17
56
24
18
27
05
34
94
52
81
82
18
13
04
1
larr N = 27295 Presioacuten = 386 bar
Eclipse Plus C18 30 x 100 mm 18 um
gt90 de la Eficacia de una 18um
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 46
iquestEn queacute tipos de instrumentos puede usar
Columnas Poroshell 120 HPLCrsquos y UHPLCrsquos
Consideraciones en UHPLC
bull Las columnas Poroshell 120 tienen un liacutemite de presioacuten de 600 bar
bull Los UHPLC estaacuten ajustados para columnas de bajo volumen por lo tanto las
Poroshell pueden usarse en todos los UHPLC
Consideraciones en HPLC
bull Las Columnas Poroshell 120 trabajan bien por debajo de 400 bar
bull Minimize los volumenes extra columna para las columnas 21 y 30mm ID ndash
siga las instrucciones dadas para las columnas RRHT (18um 600 bar)
bull Use en el detector velocidades adecuadas de adquisicioacuten para picos
estrechos de alta eficacia
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Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 47
Con una frita de 2 um Poroshell 120 no se bloquea
Muestras Complejas- Plasma
Diflusinal in Plasma
0
20
40
60
80
100
120
140
160
180
200
220
240
260
280
300
320
340
360
380
400
1 501 1001 1501 2001 2501
Injections
Pre
ssu
re
0
20000
40000
60000
80000
100000
120000
140000
160000
180000
200000
Eff
icie
ncy (
N)
End Press
Plates
Columna Poroshell 120 EC-C18 30 x 50mm 27um LC Agilent 1200 RRLC (SL)
Muestra Plasma Precipitado 2 partes Plasma 7 Partes 2080 Agua-MeCN w01 Aacutecido Foacutermico con 1 Parte de Diflusinal en
5050 Agua-MeCN 10 ugml (Concentracion Final Diflusinal 1 ugml) Agitado y dejado reposar 10 minutos
No Centrifugado No Filtrado
Volumen de Inyeccioacuten 1ul
Solvente A Agua w01 TFA
Solvente B MeCN w008 TFA
Flujo 1 mlmin 1 ul inyeccioacuten
Tiempo B
0 20
05 90
06 90
11 20
25 20
Page 47
Diflusinal es un anti-inflamatorio no esteroidal anaacutelogo
a la aspirina desarrollado por Merck Sharp amp Dohme
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 48
Las Columnas Superficialmente Porosas Pueden
Usarse cumpliendo los Requirimientos USP
De la lista USP de empaquetamientos de columnas LC 42009
Page 48
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 49
Criterios de Ajuste de Meacutetodos USP y FDA Criterios de Ajuste de Meacutetodos de Dimensiones de Columna
Paraacutemetro Especificaciones Maacuteximas ComentariosEjemplos
Longitud de Columna 70 250mm 75mm
150mm 50mm
Diaacutemetro Interno de
Columna
25 (FDA ORA-LAB 545)
USP ndash 25 ID Columna puede ajustarse si la
velocidad lineal es constante
46 mm 30 mm (-35)
46 mm 21 mm (-54)
30 mm 21 mm (-30)
Flow Rate 50
Volumen de Inyeccioacuten
Reducir tanto como se necesitendash
debe cumplir los liacutemites de
deteccioacuten y precisioacuten
Si cambia a una columna maacutes
corta haga el cambio apropiado
en el volumen de inyeccioacuten
Tamantildeo de Partiacutecula Reducir hasta el 50
(no se puede aumentar)
Puede cambiar la longitud de columna y el
tamantildeo de partiacutecula para mantener la misma
Rs
5um 35um (-30)
5um 27um (-46) Cambiado en 22409 ndash Para la copia oficial y actual ir a
httpwwwfdagovScienceResearchFieldSciencedefaulthtm
USP 30 Second Supplement Revisions PF34(5) en proceso
Ver ldquo Stimuli articlerdquo en Pharmacopeial Forum 2009 35(6)
Page 49
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 50
Comparacioacuten de 46 x 250 mm 5 um con Poroshell
120 EC-C18 46 x 100 mm 27um
min 5 10 15 20 25 30
mAU
0
20
40
60
80
100
97
12
111
16
115
96
126
74
152
48
161
51
164
35
206
87
230
76
292
90
min 5 10 15 20 25 30
mAU
0
50
100
150
200
250
17
19
21
89
23
11
26
06
38
67
44
37 45
58
54
50
59
20
70
37
Anaacutelisis maacutes raacutepido(columna maacutes corta flujo maacutes alto)
Mayor sensibilidad(partiacutecula maacutes pequentildeapico maacutes estrecho)
Maacutes optimizado (un anaacutelisis maacutes raacutepido permite ajustar mejor)
Ambos anaacutelisis en Agilent 1100 G1315B DAD (bajo 400 bar)
No se requiere cambio en la preparacioacuten de muestra frita de entrada
de 2 micras en ambas columnas
325 bar
110 bar
Sulfadiazina
Sulfatiazol
Sulfapiridina
Sulfamerazina
Sulfametazina
Sulfametazol
Sulfametoxipiridazina
Sulfacloropiridazina
Sulfametoxazol
Sulfadimetoxina
Tiempo B
0 8
33 33
34 33
Columna Eclipse Plus C18
46 x 250mm 5um
Flujo 1 mLmin
Fase Moacutevil
A 01 Aacutecido Foacutermico en Agua
B 01 Aacutecido Foacutermico en ACN
Tiempo B
0 8
12 33
132 33
Columna 46 x 100mm
Poroshell 120 EC-C18
27um
Flujo 185 mLmin
Page 50
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 51
Comparacioacuten de 46 x 250 mm 5 um con Poroshell
120 EC-C18 46 x 100 mm 27um
min 5 10 15 20 25 30
mAU
0
20
40
60
80
100
97
12
111
16
115
96
126
74
152
48
161
51
164
35
206
87
230
76
292
90
110 bar
5
mAU
0
50
100
150
200
250
17
19
21
89
23
11
26
06
38
67
44
37 45
58
54
50
59
20
70
37
325 bar
min
Ver condiciones en diapositiva anterior
Page 51
Mejor Resolucioacuten
linea base
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 52
Anaacutelisis maacutes raacutepido del meacutetodo USP para pastillas de
Simvastatina en Columnas Poroshell 120ndash Ajuste del meacutetodo
46 x 250 mm 5-um
Agilent ZORBAX Eclipse Plus C18
46 x 75 mm 27-um
Agilent Poroshell 120 EC-C18
65 CH3CN 35 39 gL NaH2PO4 (pH 45) 45 oC Sig = 238 8 Ref = 360 100 nm
Flujos 15 mLmin para la columna de 5-um 28 mLmin para la columna Poroshell 120 27um
Requerimiento
USP
5-um
(15 mLmin)
27-um
(28 mLmin)
TR na 9907 1457
krsquo gt 30 5962 5122
N gt 4500 16939 14439
Tf lt 20 109 110
min 2 4 6 8 10
mAU
0
5
10
15
20
25
30
35
40
min 2
mAU
0
5
10
15
20
25
30
35
40
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 53
Ajustes de los parametros cromatograficos en la
transferencia de meacutetodos Escalado del volume de inyeccioacuten
v1 x [(r22 x L2)(r1
2 x L1)] = V2
O bien
v2 = V1 x [(d22 x L2)(d1
2 x L1)]
v volume de inyeccioacuten
r radio de la columna
L longitud de la columna
Ajuste del flujo
F2= F1 x (L2L1 ) x (r2r1 )2
L longitud de la columna
F Flujo
r radio de la columna
Ajuste de la longitud del gradiente
En funcioacuten de la longitud de la columna
L2L1= tg2tg1
En funcioacuten del volumen muerto de columna y del flujo
tG2= tG1 x (V2V1) x (F1F2) t tiempos de gradiente
V volumen muerto de columna
F flujo
Columna ID Volumen muerto aprox
por mm longitud
46mm 100uL
30mm 425uL
21mm 208uL
10mm 047uL
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 54
Notas de Aplicacioacuten en Poroshell 120 y QuEChERS
Determination of Hormones in Shrimp by Agilent 1290 Infinity LC with
Agilent Poroshell 120 LC Column and Agilent QuEChERS for Sample
Preparation (publication 5990-6589EN)
Analysis of Pesticide Residues in Green Tea Using Agilent SampliQ
QuEChERS EN Kit by LCMSMS Detection (publication 5990-
6400EN)
Analysis of Pesticide Residues in Rice Using Agilent Bond Elut
QuEChERS AOAC Kit (publication 5990-8034EN)
Poroshell 120 for pharmaceutical analysis
Poroshell 120 Resources
QuEChERS Applications
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 55
Sumario
bull La columna Poroshell 120 es una nueva alternativa para LC de Alta
Resolucioacuten y Alta Velocidad que puede usarse en cualquier HPLC o UHPLC
bull Con la Poroshell 120 se pueden lograr separaciones de alta eficacia a baja
presioacuten
bull Puede usarse con muestras sucias sin ver una elevacioacuten anormal de la
presioacuten
bull Puede usarse en un meacutetodo USP sin comprometer los Criterios de Ajustes de
Meacutetodo
Page 55
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 56
Soporte Teacutecnico Agilent
Teleacutefono de Atencioacuten al Cliente
901 11 68 90
email customercare_spainagilentcom
wwwagilentcomchem
![Page 20: Análisis de compuestos farmacéuticos en sangre total · PDF fileReducción en el procesamiento, el envío de la muestra, y los ... Gas flow: 10 L/min Nebulizer: 10 psi Sheath gas](https://reader031.vdocuments.site/reader031/viewer/2022030405/5a7a81727f8b9a0a668b45aa/html5/thumbnails/20.jpg)
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 20
Bond Elut DBS Muestra Mejor Reproducibilidad
Bond Elut DMS tiene una desviacioacuten total de un 5 en todos los niveles HCT mientras que la
tarjeta de celulosa tiene una desviacioacuten de un 52 en todo el rango 10 veces de diferencia
Los datos abajo muestran la desviacioacuten de las medidas del CV desde niveles de HTC
normales (45) para tarjetas Bond Elut DMS y de celulosa (Whatman DMPK-C)
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 21
Ventajas Clave de la Teacutecnica DBS de Agilent
bull Una vez seca la muestra de sangre no supone peligro bioloacutegico alguno y se
puede transportar sin necesidad de sistemas de refrigeracioacuten costosos
bull Permite a los laboratorios centralizar los anaacutelisis de muestra perifeacutericas
bull Se requiere menos volumen de muestra (menor nordm de sujetos en el ensayo
menor nordm de repeticiones y eliminacioacuten de sujetos sateacutelite)
bull Permite la toma demuestra en serie del mismo sujeto
bull La recoleccioacuten de sangre es maacutes sencilla
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 22
Notas de Aplicacioacuten farmaceacuteuticas en Poroshell
120 and DMS Fast Analysis of Cefepime and Related Impurities on Poroshell 120 EC-C18 (publication 5990-7492EN) Comparing Selectivity Easy Transfer of Methods between Superficially Porous Agilent Poroshell 120 EC-C18 and totally Porous Agilent ZORBAX Eclipse Plus C18 (publication 5990-6588EN)
Analysis of Water Soluble Vitamins in Multivitamin Tablets Using Poroshell 120 EC-C18 (publication 5990-8107EN)
Analysis of Anthocyanins in Common Foods Using an Agilent Poroshell 120 SB-C18 (publication 5990-8249EN)
Analysis of Amitriptyline Fluoxetine Quetiapine and Sertraline Using Dried Plasma (publication 5990-8169EN)
Analysis of Amitriptyline Fluoxetine Quetiapine and Sertraline Using Dried Blood Spots (publication 5990-8168EN)
Investigation of Varying Blood Hematocrit Level in Dried Blood Spotting (publication 5990-8306EN)
Analysis of Cholesterol Lowering Drugs (Statins) Using Dried Matrix Spots Technology (publication 5990-8305EN)
Scalability of Agilent Columns Across HPLC and UHPLC Instruments (publication 5990-8428EN)
Converting a CHP Method for Insulin to Agilent Poroshell 120 Columns (publication 5990-9029EN)
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 23
La propuesta QuEChERS para Determinar compuestos
Farmaceacuteuticos y Toxinas en Sangre Total
Anaacutelisis de Compuestos Farmaceacuteuticos en Sangre Total con
la columna Poroshell 120 Usando el meacutetodo Modificado
Mini-QuEChERS para la preparacioacuten de muestra
Nota de Aplicacioacuten5990-8789EN
httpwwwchemagilentcomLibraryapplications5990-8789ENpdf
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 24
Introduccioacuten
Determinacioacuten de compuestos farmaceacuteuticos en anaacutelisis cliacutenicos y
foreacutensicos ADME (DMPK)
La preparacioacuten de muestra va desde la simple precipitacioacuten de
proteinas (PPT) a la maacutes compleja extraccioacuten en fase soacutelida (SPE)
Habitualmente la SPE ha ocupado este vaciacuteo pero simpre hay
espacio para teacutecnicas de preparacioacuten de muestras que son raacutepidas y
baratas de implementar
Se describe un procedimiento mini-QuEChERS modificado con
analisis LCndashMS-MS para la determinacioacuten de faacutermacos en sangre
total
Se analizan nueve diferentes faacutermacos (lidocaina tramadol
amitriptilina biperidina oxazepam lorazepam clorpromazina
diltiazem y naloxona)
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 25
Compuestos farmaceacuteuticos usados en el estudio
Compuesto Nuacutemero CAS Log P (ow) pKa Uso
terapeacuteutico
Lidocaina 137-58-6 24 801 Anesteacutesico local
antiarrithmico
Tramadol 27203-92-5 25 941 Analgesico
Amitriptilina 50-48-6 492 94 Antidepresivo
Biperidena 514-65-8 40 108 Anticolinergico
Oxazepam 604-75-1 223 17 113 Antianxiedad
Lorazepam 846-49-1 247 13 115 Antidepresivo
Clorpromazina 50-53-3 518 93 Antipsycoacutetico
Diltiazem 42399-41-7 363 77 Bloqueante de los
canales del calcio
Naloxona 465-65-6 145 79 Antagonista de los
receptores de opio
Nortriptilina (IS) 72-69-5 565 97
5 ugmL de solucioacuten (9 compuestos) y estandar interno en metanol
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 26
La Teacutecnica de QuEChERS aplicada a las muestras
de sangre
La sangre es el maacutes complejo de los fluidos bioloacutegicos
La determinacioacuten de faacutermacos en sangre total es a menudo necesaria en los
anaacutelisis foreacutensicos dada la dificultad de obtener suero o plasma
Los procedimientos convencionales para analizar faacutermacos en matrices
complejas como la sangre total son complicados
QuEChERS es una teacutecnica de preparacioacuten de muestra que fue desarrollada
para la extraccioacuten de residuos de plaguicidas multi-clase de frutas y vegetales
en 2003
A pesar de que los fluidos bioloacutegicos pueden parecer muy diferentes a una
pieza de fruta sin embargo siguen caminos paralelos
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 27
Caminos paralelos en la preparacioacuten de muestra
Fluidos Bioloacutegicos
Matrices complejas
Rotura de la arquitectura celular
bull Lisis agitacioacuten solvente orgaacutenico
hidroacutelisis
Analitos con un amplio rango de
polaridades
Retirar analito o matriz
Anaacutelisis por LCMSMS GCMS o
GCMSMS
Frutas y Vegetales
Matrices complejas
Rotura de la arquitectura celular
bull Trituracioacuten agitacioacuten solvente
orgaacutenico hidroacutelisis
Analitos con un amplio rango de
polaridades
Retirar analito o matriz
Anaacutelisis por LCMSMS GCMS o
GCMSMS
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 28
Procedimiento baacutesico por SPE para muestras de sangre
El pretratamiento de la sangre total implica la dilucioacuten con una
solucioacuten aacutecida un tampoacuten fosfato o aguaFA
Sonicar 15 minutos rotura de membranas celulares
Centrifugacioacuten
bull Procedimiento de SPE
ndash Acondicionado del cartucho metanol agua
ndash Carga del cartucho muestra
ndash Lavado del cartucho agua con metanol o tampoacuten metanol
ndash Elucioacuten del cartucho eluyente para el anaacutelisis
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 29
Procedimiento Baacutesico QuEChERS
15 g muestra homogeneizada (fortificada)
Antildeadir 15 mL ACN (1 AA) vortex
Antildeadir Sales de Extraccioacuten AOAC agitar
Centrifugar
Transferir 1 u 8 mL a un tubo d-SPE AOAC vortex centrifugar
Transferir al vial de Anaacutelisis
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 30
Ventajas y desventajas del Procedimiento QuEChERS
Ventajas
Extraccioacuten tipo liacutequidoliacutequido
Uso de aacutecido para interrumpir el ligado de proteinas
Exceso de sal para lisar los componentes celulares
Uso de acetonitrilo para facilitar la precipitacioacuten proteacuteica
Uso de SPE dispersiva para adsorber las interferencias de la matriz
Plossl etat J Chrom A 1135 (2006) 19-26
Desventajas
La cantidad de solvente y de muestra requeridos en el meacutetodo no
son ldquobioloacutegicamente adecuadosrdquo
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 31
Propoacutesito de la propuesta mini-Q
Ofrecer un enfoque maacutes adecuado biologicamente
Requirimientos de menores volumenes y tamantildeos de
muestra
Rango de faacutermacos varias polaridades y pKa
Evaluaciacuteoacuten de las interferencias de fondo
Extraccioacuten y datos de recuperacioacuten en un rango
aceptable
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 32
Faacutermacos en sangre Procedimiento mini-QuEChERS
mini-Q
Procedimiento
1 Antildeadir 2 homogeneizadores ceraacutemicos
2 Antildeadir 1 o 2 mL de sangre entera a un tubo de centriacutefuga con tapoacuten de rosca
3 Antildeadir estandar interno vortex
4 Antildeadir 2 mL de ACN acidificado ( 04 FA) vortex 30 seg
5 Antildeadir 500 mg de sales de extraccioacuten agitar vigorsamente 1 minuto centrifugar 5000 rpm 1 min
6 Transferir 1 mL del extraccto al material de d-SPE en tubo de centrifuga vortex centrifugar
7 Antildeadir 200 uL a 800 uL de agua en un vial LC vortex y analizar
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 33
Refinamiento del Procedimiento mini-Q
Paraacutemetros evaluados en la teacutecnica mini-Q
Muestra de sangre total
bull La matriz bioloacutegica maacutes complicada
Adicioacuten de aacutecido tipo y cantidad
bull Efecto en la particioacuten y extraccioacuten
Adicioacuten de las sales de QuEChERS no-tamponadas o
tamponadas con NaAcetato o Citrato
bull Efecto en el extracto inspeccioacuten visual
SPE Dispersiva
bull Limpieza de la matriz y recuperaciones de los compuestos
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 34
Conclusiones del estudio
El ACN con 4 de FA como solvente de extraccioacuten muestra
una lisis maacutes completa de la muestra frente a otros solventes
de extraccioacuten que mostraron una masa soacutelida
Las sales tamponadas AOAC de acetato Soacutedico generan el
extracto maacutes liacutempio y fueron elegidas para la d-SPE
El paso de dSPE no ofrece un clean up adicional para los
meacutetodos de extraccioacuten con sales EN y no tamponadas
principalmente
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 35
Datos de Adquisicoacuten LCMSMS
Compuestos Canales MRM
(mz) Fragmentador
(V) CE (V) RT (min) Delta RT
Lidocaina 1) 23518 gt 861
2) 23518 gt 581
97 11
35
137 04
Tramadol 1) 2642 gt 581
2) 2642 gt 2461
97 15
3
120 04
Amitriptilina 1) 2782 gt 117
2) 2782 gt 105
112 19
19
425 04
Biperidena 1)31223 gt 981
2) 31223 gt 551
123 19
60
423 07
Oxazepam 1) 28706 gt 2409
2) 28706 gt 2689
112 19
7
399 04
Lorazepam 1) 32102 gt 2749
2) 32102 gt 3029
113 15
7
409 04
Clorpromazina 1) 31911 gt 861
2) 31911 gt 581
112 15
43
463 04
Diltiazem 1) 41517 gt 1779
2) 41517 gt 1499
128 19
43
373 04
Naloxona 1) 32816 gt 310
2) 32816 gt 212
123 15
39
082 04
Nortriptilina (IS) 1) 26418 gt 233
2) 26418 gt 91
97 7
19
417 04
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 36
7 x10
0125
015
0175
02
0225
025
0275
03
0325
035
0375
04
0425
045
0475
05
0525
055
0575
06
0625
065
0675
07
0725
075
0775
08
0825
085
0875
09
0925
095
0975
1
1025
105
1075
11
1125
115
1175
12
1225
125
1275
13
1325
135
1375
+ESI TIC Scan Frag=800V AOAC_BLANK_110228bd
1 1
Counts vs Acquisition Time (min)
05 1 15 2 25
3 35 4 45 5 55 6 65 7 75 8 85 9 95 10
Columna Poroshell 120 EC-C18 27
micro 21 x 100 mm PN 695775-902
Fase Moacutevil
A 5 mM Acetato Amoacutenico pH 5
2080 MeOHagua
B 5 mM Acetato amoacutencio en ACN
Flujo 04mLmin
Inyeccioacuten 10uL
GT (ordmC) 300
GF (lmin) 7
Nebulizador (psi) 40
SGT (ordmC) 400
SFG (lmin) 12
Capilar (V) 3500
NV (V) 500
Condiciones LCMS
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51
+ESI MRM Frag=1120V CID190 (2782000 -gt 1170000) HQC_6d
1 1
Counts vs Acquisition Time (min) 01 02 03 04 05 06 07 08 09 1 11 12 13 14 15 16 17 18 19 2 21 22 23 24 25 26 27 28 29 3 31 32 33 34 35 36 37 38 39 4 41 42 43 44 45 46
Nalo
xo
ne
Lid
oc
ain
e
Tra
mad
ol
Oxazep
am
Lo
razep
am
Bip
eri
de
n
Am
itri
pty
lin
e
Dil
tiazem
Ch
lorp
rom
azin
e
No
rtri
pty
lin
e (
IS)
Cromatograma LCMSMS de 10 ngmL de sangre total fortificada despueacutes
de extraccioacuten mini-QuEChERS AOAC (NaAc) y d-SPE (50mg PSA y
150mg MgSO4)
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+ESI MRM Frag=1120V CID190 (2782000 -gt 1170000) HQC_6d
1 1
Counts vs Acquisition Time (min) 01 02 03 04 05 06 07 08 09 1 11 12 13 14 15 16 17 18 19 2 21 22 23 24 25 26 27 28 29 3 31 32 33 34 35 36 37 38 39 4 41 42 43 44 45 46
1 x10
415 42 425 43 435 44 445 45 455 46 465 47 475 48 485 49 495 5
505 51 515 52 525 53 535 54 545 55 555 56 565 57
+ESI MRM Frag=1120V CID190 (2871000 -gt 2409000) RE_L_1d 1
Counts vs Acquisition Time (min) 305 31 315 32 325 33 335 34 345 35 355 36 365 37 375 38 385 39 395 4 405 41 415 42 425 43 435 44 445 45 455 46 465 47 475
Relacioacuten sentildealruido para el Oxazepam y Lorazepam a
10 ngmL (10 ppb)
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La Naloxone muestra esta curva de linealidad de10-250 ngmL (ppb) con una R2
= 0991
Las curvas de calibracioacuten se generaron con la respuestra relativa (area pico
analitoarea pico IS) frente a la concentracioacuten relativa (concentracion de
analitoconcentracioacuten de IS)
Ejemplo de curva de linealidad para Naloxona extraido
con mini-QuEChERS
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Recuperacioacuten y Reproducibilidad
Compuesto 50 ngmL Spiked
Recuperacioacuten RSD
100 ngmL Spiked
Recuperacioacuten RSD
Lidocaine 987 157 100 118
Tramadol 105 30 104 82
Amitriptyline 104 21 104 82
Biperidene 97 45 99 82
Oxazepam 770 92 78 86
Lorazepam 819 68 818 86
Chlorpromazine 110 103 105 63
Diltiazem 881 27 917 83
Naloxone 806 90 755 77
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 41
Conclusioacutenes y trabajo posterior
El meacutetodo mini-QuEChERS para la extraccioacuten de compuestos farmaceacuteuticos en
sangre total ofrece una alternativa a otras teacutecnicas de preparacioacuten de muestras
La preparacioacuten de muestras mini-QuEChERS es un enfoque simple facil y
barato que requiere una miacutenima experiencia en preparacioacuten de muestras y
miacutenimo equipamiento
Es un punto de partida para ampliar el numero y las clasificaciones evaluadas
en otras matrices bioloacutegicas y en sangre postmortem
El trabajo futuro incluira combinaciones adecuadas tanto de las sales de
extraccioacuten como de los sorbentes de d-SPE por el meacutetodo mini-QuEChERS
La columna Poroshell 120 ofrece una selectividad diferente y excelentes formas
de pico a lo largo del amplio rango de compuestos farmaceacuteuticos usados en este
estudio
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 42
Referencias
(1) M Anastassiades SJ Lehotay D Štajnbaher and FJ Schenk J AOAC Int 86 4121 (2003)
(2) G Stubbings and T Bigwood Anal Chim Acta 637 68 (2009)
(3) RR Rasmussen IMLD Storm PZH Rasmussen J Smedsgaard and KF Nielsen Anal Bioanal Chem 397 765 (2010)
(4) D Smith and K Lynam GCμECD analysis and confirmation of PCBs in fish tissue with Agilent JampW DB-35ms and DB-XLB GC columns Agilent Technologies 5990-6236EN (2010)
(5) F Ploumlssl M Giera and F Bracher J Chrom A 1135 19 (2006)
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 43
MEJORAR LA PRODUCTIVIDAD EN
HPLC ESTAacuteNDAR CON COLUMNAS
POROSHELL
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Columnas Poroshell 120 para HPLC y UHPLC
bull 80-90 de eficacia de las sub 2um
bull A presiones un ~40-50 maacutes bajas
bull Con un tamantildeo de partiacutecula de 27um
bull Con una frita de entrada de 2um
bull Con el doble de resolucioacuten de una
columna de 35um
bull Con un liacutemite de presioacuten de 600 bar
bull La partiacutecula tiene un nuacutecleo soacutelido
(17um) y una cubierta exterior porosa
de 05um como zona de difusioacuten
Las Columnas Poroshell 120 tienen
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Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 45
Poroshell 120 proporciona Eficacia Suficiente
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Flujo 0582 mLmin AcetonitriloAgua (6040)
Volumen de Inyeccioacuten 4 microL
TCC 26 oC
DAD Sig=2544nm Ref=360100nm
Muestra Muestra de test RRLC
(PN 5188-6529) inoculada con
50 microL 2 mgmL Tiourea en
aguaacetonitrilo (6535)
25 5 75 10
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larr N = 25053 Presioacuten = 182 bar
Poroshell 120 EC-C18 30 x 100 mm 27 um
min 25 5 75 10 125
mAU
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18
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1
larr N = 27295 Presioacuten = 386 bar
Eclipse Plus C18 30 x 100 mm 18 um
gt90 de la Eficacia de una 18um
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iquestEn queacute tipos de instrumentos puede usar
Columnas Poroshell 120 HPLCrsquos y UHPLCrsquos
Consideraciones en UHPLC
bull Las columnas Poroshell 120 tienen un liacutemite de presioacuten de 600 bar
bull Los UHPLC estaacuten ajustados para columnas de bajo volumen por lo tanto las
Poroshell pueden usarse en todos los UHPLC
Consideraciones en HPLC
bull Las Columnas Poroshell 120 trabajan bien por debajo de 400 bar
bull Minimize los volumenes extra columna para las columnas 21 y 30mm ID ndash
siga las instrucciones dadas para las columnas RRHT (18um 600 bar)
bull Use en el detector velocidades adecuadas de adquisicioacuten para picos
estrechos de alta eficacia
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Con una frita de 2 um Poroshell 120 no se bloquea
Muestras Complejas- Plasma
Diflusinal in Plasma
0
20
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100
120
140
160
180
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220
240
260
280
300
320
340
360
380
400
1 501 1001 1501 2001 2501
Injections
Pre
ssu
re
0
20000
40000
60000
80000
100000
120000
140000
160000
180000
200000
Eff
icie
ncy (
N)
End Press
Plates
Columna Poroshell 120 EC-C18 30 x 50mm 27um LC Agilent 1200 RRLC (SL)
Muestra Plasma Precipitado 2 partes Plasma 7 Partes 2080 Agua-MeCN w01 Aacutecido Foacutermico con 1 Parte de Diflusinal en
5050 Agua-MeCN 10 ugml (Concentracion Final Diflusinal 1 ugml) Agitado y dejado reposar 10 minutos
No Centrifugado No Filtrado
Volumen de Inyeccioacuten 1ul
Solvente A Agua w01 TFA
Solvente B MeCN w008 TFA
Flujo 1 mlmin 1 ul inyeccioacuten
Tiempo B
0 20
05 90
06 90
11 20
25 20
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Diflusinal es un anti-inflamatorio no esteroidal anaacutelogo
a la aspirina desarrollado por Merck Sharp amp Dohme
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Las Columnas Superficialmente Porosas Pueden
Usarse cumpliendo los Requirimientos USP
De la lista USP de empaquetamientos de columnas LC 42009
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Criterios de Ajuste de Meacutetodos USP y FDA Criterios de Ajuste de Meacutetodos de Dimensiones de Columna
Paraacutemetro Especificaciones Maacuteximas ComentariosEjemplos
Longitud de Columna 70 250mm 75mm
150mm 50mm
Diaacutemetro Interno de
Columna
25 (FDA ORA-LAB 545)
USP ndash 25 ID Columna puede ajustarse si la
velocidad lineal es constante
46 mm 30 mm (-35)
46 mm 21 mm (-54)
30 mm 21 mm (-30)
Flow Rate 50
Volumen de Inyeccioacuten
Reducir tanto como se necesitendash
debe cumplir los liacutemites de
deteccioacuten y precisioacuten
Si cambia a una columna maacutes
corta haga el cambio apropiado
en el volumen de inyeccioacuten
Tamantildeo de Partiacutecula Reducir hasta el 50
(no se puede aumentar)
Puede cambiar la longitud de columna y el
tamantildeo de partiacutecula para mantener la misma
Rs
5um 35um (-30)
5um 27um (-46) Cambiado en 22409 ndash Para la copia oficial y actual ir a
httpwwwfdagovScienceResearchFieldSciencedefaulthtm
USP 30 Second Supplement Revisions PF34(5) en proceso
Ver ldquo Stimuli articlerdquo en Pharmacopeial Forum 2009 35(6)
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Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 50
Comparacioacuten de 46 x 250 mm 5 um con Poroshell
120 EC-C18 46 x 100 mm 27um
min 5 10 15 20 25 30
mAU
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min 5 10 15 20 25 30
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37 45
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20
70
37
Anaacutelisis maacutes raacutepido(columna maacutes corta flujo maacutes alto)
Mayor sensibilidad(partiacutecula maacutes pequentildeapico maacutes estrecho)
Maacutes optimizado (un anaacutelisis maacutes raacutepido permite ajustar mejor)
Ambos anaacutelisis en Agilent 1100 G1315B DAD (bajo 400 bar)
No se requiere cambio en la preparacioacuten de muestra frita de entrada
de 2 micras en ambas columnas
325 bar
110 bar
Sulfadiazina
Sulfatiazol
Sulfapiridina
Sulfamerazina
Sulfametazina
Sulfametazol
Sulfametoxipiridazina
Sulfacloropiridazina
Sulfametoxazol
Sulfadimetoxina
Tiempo B
0 8
33 33
34 33
Columna Eclipse Plus C18
46 x 250mm 5um
Flujo 1 mLmin
Fase Moacutevil
A 01 Aacutecido Foacutermico en Agua
B 01 Aacutecido Foacutermico en ACN
Tiempo B
0 8
12 33
132 33
Columna 46 x 100mm
Poroshell 120 EC-C18
27um
Flujo 185 mLmin
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Comparacioacuten de 46 x 250 mm 5 um con Poroshell
120 EC-C18 46 x 100 mm 27um
min 5 10 15 20 25 30
mAU
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5
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20
70
37
325 bar
min
Ver condiciones en diapositiva anterior
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Mejor Resolucioacuten
linea base
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Anaacutelisis maacutes raacutepido del meacutetodo USP para pastillas de
Simvastatina en Columnas Poroshell 120ndash Ajuste del meacutetodo
46 x 250 mm 5-um
Agilent ZORBAX Eclipse Plus C18
46 x 75 mm 27-um
Agilent Poroshell 120 EC-C18
65 CH3CN 35 39 gL NaH2PO4 (pH 45) 45 oC Sig = 238 8 Ref = 360 100 nm
Flujos 15 mLmin para la columna de 5-um 28 mLmin para la columna Poroshell 120 27um
Requerimiento
USP
5-um
(15 mLmin)
27-um
(28 mLmin)
TR na 9907 1457
krsquo gt 30 5962 5122
N gt 4500 16939 14439
Tf lt 20 109 110
min 2 4 6 8 10
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min 2
mAU
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Ajustes de los parametros cromatograficos en la
transferencia de meacutetodos Escalado del volume de inyeccioacuten
v1 x [(r22 x L2)(r1
2 x L1)] = V2
O bien
v2 = V1 x [(d22 x L2)(d1
2 x L1)]
v volume de inyeccioacuten
r radio de la columna
L longitud de la columna
Ajuste del flujo
F2= F1 x (L2L1 ) x (r2r1 )2
L longitud de la columna
F Flujo
r radio de la columna
Ajuste de la longitud del gradiente
En funcioacuten de la longitud de la columna
L2L1= tg2tg1
En funcioacuten del volumen muerto de columna y del flujo
tG2= tG1 x (V2V1) x (F1F2) t tiempos de gradiente
V volumen muerto de columna
F flujo
Columna ID Volumen muerto aprox
por mm longitud
46mm 100uL
30mm 425uL
21mm 208uL
10mm 047uL
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 54
Notas de Aplicacioacuten en Poroshell 120 y QuEChERS
Determination of Hormones in Shrimp by Agilent 1290 Infinity LC with
Agilent Poroshell 120 LC Column and Agilent QuEChERS for Sample
Preparation (publication 5990-6589EN)
Analysis of Pesticide Residues in Green Tea Using Agilent SampliQ
QuEChERS EN Kit by LCMSMS Detection (publication 5990-
6400EN)
Analysis of Pesticide Residues in Rice Using Agilent Bond Elut
QuEChERS AOAC Kit (publication 5990-8034EN)
Poroshell 120 for pharmaceutical analysis
Poroshell 120 Resources
QuEChERS Applications
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Sumario
bull La columna Poroshell 120 es una nueva alternativa para LC de Alta
Resolucioacuten y Alta Velocidad que puede usarse en cualquier HPLC o UHPLC
bull Con la Poroshell 120 se pueden lograr separaciones de alta eficacia a baja
presioacuten
bull Puede usarse con muestras sucias sin ver una elevacioacuten anormal de la
presioacuten
bull Puede usarse en un meacutetodo USP sin comprometer los Criterios de Ajustes de
Meacutetodo
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Soporte Teacutecnico Agilent
Teleacutefono de Atencioacuten al Cliente
901 11 68 90
email customercare_spainagilentcom
wwwagilentcomchem
![Page 21: Análisis de compuestos farmacéuticos en sangre total · PDF fileReducción en el procesamiento, el envío de la muestra, y los ... Gas flow: 10 L/min Nebulizer: 10 psi Sheath gas](https://reader031.vdocuments.site/reader031/viewer/2022030405/5a7a81727f8b9a0a668b45aa/html5/thumbnails/21.jpg)
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Ventajas Clave de la Teacutecnica DBS de Agilent
bull Una vez seca la muestra de sangre no supone peligro bioloacutegico alguno y se
puede transportar sin necesidad de sistemas de refrigeracioacuten costosos
bull Permite a los laboratorios centralizar los anaacutelisis de muestra perifeacutericas
bull Se requiere menos volumen de muestra (menor nordm de sujetos en el ensayo
menor nordm de repeticiones y eliminacioacuten de sujetos sateacutelite)
bull Permite la toma demuestra en serie del mismo sujeto
bull La recoleccioacuten de sangre es maacutes sencilla
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 22
Notas de Aplicacioacuten farmaceacuteuticas en Poroshell
120 and DMS Fast Analysis of Cefepime and Related Impurities on Poroshell 120 EC-C18 (publication 5990-7492EN) Comparing Selectivity Easy Transfer of Methods between Superficially Porous Agilent Poroshell 120 EC-C18 and totally Porous Agilent ZORBAX Eclipse Plus C18 (publication 5990-6588EN)
Analysis of Water Soluble Vitamins in Multivitamin Tablets Using Poroshell 120 EC-C18 (publication 5990-8107EN)
Analysis of Anthocyanins in Common Foods Using an Agilent Poroshell 120 SB-C18 (publication 5990-8249EN)
Analysis of Amitriptyline Fluoxetine Quetiapine and Sertraline Using Dried Plasma (publication 5990-8169EN)
Analysis of Amitriptyline Fluoxetine Quetiapine and Sertraline Using Dried Blood Spots (publication 5990-8168EN)
Investigation of Varying Blood Hematocrit Level in Dried Blood Spotting (publication 5990-8306EN)
Analysis of Cholesterol Lowering Drugs (Statins) Using Dried Matrix Spots Technology (publication 5990-8305EN)
Scalability of Agilent Columns Across HPLC and UHPLC Instruments (publication 5990-8428EN)
Converting a CHP Method for Insulin to Agilent Poroshell 120 Columns (publication 5990-9029EN)
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La propuesta QuEChERS para Determinar compuestos
Farmaceacuteuticos y Toxinas en Sangre Total
Anaacutelisis de Compuestos Farmaceacuteuticos en Sangre Total con
la columna Poroshell 120 Usando el meacutetodo Modificado
Mini-QuEChERS para la preparacioacuten de muestra
Nota de Aplicacioacuten5990-8789EN
httpwwwchemagilentcomLibraryapplications5990-8789ENpdf
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 24
Introduccioacuten
Determinacioacuten de compuestos farmaceacuteuticos en anaacutelisis cliacutenicos y
foreacutensicos ADME (DMPK)
La preparacioacuten de muestra va desde la simple precipitacioacuten de
proteinas (PPT) a la maacutes compleja extraccioacuten en fase soacutelida (SPE)
Habitualmente la SPE ha ocupado este vaciacuteo pero simpre hay
espacio para teacutecnicas de preparacioacuten de muestras que son raacutepidas y
baratas de implementar
Se describe un procedimiento mini-QuEChERS modificado con
analisis LCndashMS-MS para la determinacioacuten de faacutermacos en sangre
total
Se analizan nueve diferentes faacutermacos (lidocaina tramadol
amitriptilina biperidina oxazepam lorazepam clorpromazina
diltiazem y naloxona)
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Compuestos farmaceacuteuticos usados en el estudio
Compuesto Nuacutemero CAS Log P (ow) pKa Uso
terapeacuteutico
Lidocaina 137-58-6 24 801 Anesteacutesico local
antiarrithmico
Tramadol 27203-92-5 25 941 Analgesico
Amitriptilina 50-48-6 492 94 Antidepresivo
Biperidena 514-65-8 40 108 Anticolinergico
Oxazepam 604-75-1 223 17 113 Antianxiedad
Lorazepam 846-49-1 247 13 115 Antidepresivo
Clorpromazina 50-53-3 518 93 Antipsycoacutetico
Diltiazem 42399-41-7 363 77 Bloqueante de los
canales del calcio
Naloxona 465-65-6 145 79 Antagonista de los
receptores de opio
Nortriptilina (IS) 72-69-5 565 97
5 ugmL de solucioacuten (9 compuestos) y estandar interno en metanol
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 26
La Teacutecnica de QuEChERS aplicada a las muestras
de sangre
La sangre es el maacutes complejo de los fluidos bioloacutegicos
La determinacioacuten de faacutermacos en sangre total es a menudo necesaria en los
anaacutelisis foreacutensicos dada la dificultad de obtener suero o plasma
Los procedimientos convencionales para analizar faacutermacos en matrices
complejas como la sangre total son complicados
QuEChERS es una teacutecnica de preparacioacuten de muestra que fue desarrollada
para la extraccioacuten de residuos de plaguicidas multi-clase de frutas y vegetales
en 2003
A pesar de que los fluidos bioloacutegicos pueden parecer muy diferentes a una
pieza de fruta sin embargo siguen caminos paralelos
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 27
Caminos paralelos en la preparacioacuten de muestra
Fluidos Bioloacutegicos
Matrices complejas
Rotura de la arquitectura celular
bull Lisis agitacioacuten solvente orgaacutenico
hidroacutelisis
Analitos con un amplio rango de
polaridades
Retirar analito o matriz
Anaacutelisis por LCMSMS GCMS o
GCMSMS
Frutas y Vegetales
Matrices complejas
Rotura de la arquitectura celular
bull Trituracioacuten agitacioacuten solvente
orgaacutenico hidroacutelisis
Analitos con un amplio rango de
polaridades
Retirar analito o matriz
Anaacutelisis por LCMSMS GCMS o
GCMSMS
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 28
Procedimiento baacutesico por SPE para muestras de sangre
El pretratamiento de la sangre total implica la dilucioacuten con una
solucioacuten aacutecida un tampoacuten fosfato o aguaFA
Sonicar 15 minutos rotura de membranas celulares
Centrifugacioacuten
bull Procedimiento de SPE
ndash Acondicionado del cartucho metanol agua
ndash Carga del cartucho muestra
ndash Lavado del cartucho agua con metanol o tampoacuten metanol
ndash Elucioacuten del cartucho eluyente para el anaacutelisis
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 29
Procedimiento Baacutesico QuEChERS
15 g muestra homogeneizada (fortificada)
Antildeadir 15 mL ACN (1 AA) vortex
Antildeadir Sales de Extraccioacuten AOAC agitar
Centrifugar
Transferir 1 u 8 mL a un tubo d-SPE AOAC vortex centrifugar
Transferir al vial de Anaacutelisis
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 30
Ventajas y desventajas del Procedimiento QuEChERS
Ventajas
Extraccioacuten tipo liacutequidoliacutequido
Uso de aacutecido para interrumpir el ligado de proteinas
Exceso de sal para lisar los componentes celulares
Uso de acetonitrilo para facilitar la precipitacioacuten proteacuteica
Uso de SPE dispersiva para adsorber las interferencias de la matriz
Plossl etat J Chrom A 1135 (2006) 19-26
Desventajas
La cantidad de solvente y de muestra requeridos en el meacutetodo no
son ldquobioloacutegicamente adecuadosrdquo
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 31
Propoacutesito de la propuesta mini-Q
Ofrecer un enfoque maacutes adecuado biologicamente
Requirimientos de menores volumenes y tamantildeos de
muestra
Rango de faacutermacos varias polaridades y pKa
Evaluaciacuteoacuten de las interferencias de fondo
Extraccioacuten y datos de recuperacioacuten en un rango
aceptable
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 32
Faacutermacos en sangre Procedimiento mini-QuEChERS
mini-Q
Procedimiento
1 Antildeadir 2 homogeneizadores ceraacutemicos
2 Antildeadir 1 o 2 mL de sangre entera a un tubo de centriacutefuga con tapoacuten de rosca
3 Antildeadir estandar interno vortex
4 Antildeadir 2 mL de ACN acidificado ( 04 FA) vortex 30 seg
5 Antildeadir 500 mg de sales de extraccioacuten agitar vigorsamente 1 minuto centrifugar 5000 rpm 1 min
6 Transferir 1 mL del extraccto al material de d-SPE en tubo de centrifuga vortex centrifugar
7 Antildeadir 200 uL a 800 uL de agua en un vial LC vortex y analizar
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 33
Refinamiento del Procedimiento mini-Q
Paraacutemetros evaluados en la teacutecnica mini-Q
Muestra de sangre total
bull La matriz bioloacutegica maacutes complicada
Adicioacuten de aacutecido tipo y cantidad
bull Efecto en la particioacuten y extraccioacuten
Adicioacuten de las sales de QuEChERS no-tamponadas o
tamponadas con NaAcetato o Citrato
bull Efecto en el extracto inspeccioacuten visual
SPE Dispersiva
bull Limpieza de la matriz y recuperaciones de los compuestos
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 34
Conclusiones del estudio
El ACN con 4 de FA como solvente de extraccioacuten muestra
una lisis maacutes completa de la muestra frente a otros solventes
de extraccioacuten que mostraron una masa soacutelida
Las sales tamponadas AOAC de acetato Soacutedico generan el
extracto maacutes liacutempio y fueron elegidas para la d-SPE
El paso de dSPE no ofrece un clean up adicional para los
meacutetodos de extraccioacuten con sales EN y no tamponadas
principalmente
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 35
Datos de Adquisicoacuten LCMSMS
Compuestos Canales MRM
(mz) Fragmentador
(V) CE (V) RT (min) Delta RT
Lidocaina 1) 23518 gt 861
2) 23518 gt 581
97 11
35
137 04
Tramadol 1) 2642 gt 581
2) 2642 gt 2461
97 15
3
120 04
Amitriptilina 1) 2782 gt 117
2) 2782 gt 105
112 19
19
425 04
Biperidena 1)31223 gt 981
2) 31223 gt 551
123 19
60
423 07
Oxazepam 1) 28706 gt 2409
2) 28706 gt 2689
112 19
7
399 04
Lorazepam 1) 32102 gt 2749
2) 32102 gt 3029
113 15
7
409 04
Clorpromazina 1) 31911 gt 861
2) 31911 gt 581
112 15
43
463 04
Diltiazem 1) 41517 gt 1779
2) 41517 gt 1499
128 19
43
373 04
Naloxona 1) 32816 gt 310
2) 32816 gt 212
123 15
39
082 04
Nortriptilina (IS) 1) 26418 gt 233
2) 26418 gt 91
97 7
19
417 04
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035
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04
0425
045
0475
05
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055
0575
06
0625
065
0675
07
0725
075
0775
08
0825
085
0875
09
0925
095
0975
1
1025
105
1075
11
1125
115
1175
12
1225
125
1275
13
1325
135
1375
+ESI TIC Scan Frag=800V AOAC_BLANK_110228bd
1 1
Counts vs Acquisition Time (min)
05 1 15 2 25
3 35 4 45 5 55 6 65 7 75 8 85 9 95 10
Columna Poroshell 120 EC-C18 27
micro 21 x 100 mm PN 695775-902
Fase Moacutevil
A 5 mM Acetato Amoacutenico pH 5
2080 MeOHagua
B 5 mM Acetato amoacutencio en ACN
Flujo 04mLmin
Inyeccioacuten 10uL
GT (ordmC) 300
GF (lmin) 7
Nebulizador (psi) 40
SGT (ordmC) 400
SFG (lmin) 12
Capilar (V) 3500
NV (V) 500
Condiciones LCMS
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2
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29
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32
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36
37
38
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4
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47
48
49
5
51
+ESI MRM Frag=1120V CID190 (2782000 -gt 1170000) HQC_6d
1 1
Counts vs Acquisition Time (min) 01 02 03 04 05 06 07 08 09 1 11 12 13 14 15 16 17 18 19 2 21 22 23 24 25 26 27 28 29 3 31 32 33 34 35 36 37 38 39 4 41 42 43 44 45 46
Nalo
xo
ne
Lid
oc
ain
e
Tra
mad
ol
Oxazep
am
Lo
razep
am
Bip
eri
de
n
Am
itri
pty
lin
e
Dil
tiazem
Ch
lorp
rom
azin
e
No
rtri
pty
lin
e (
IS)
Cromatograma LCMSMS de 10 ngmL de sangre total fortificada despueacutes
de extraccioacuten mini-QuEChERS AOAC (NaAc) y d-SPE (50mg PSA y
150mg MgSO4)
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13
14
15
16
17
18
19
2
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22
23
24
25
26
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29
3
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35
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39
4
41
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48
49
5
51
+ESI MRM Frag=1120V CID190 (2782000 -gt 1170000) HQC_6d
1 1
Counts vs Acquisition Time (min) 01 02 03 04 05 06 07 08 09 1 11 12 13 14 15 16 17 18 19 2 21 22 23 24 25 26 27 28 29 3 31 32 33 34 35 36 37 38 39 4 41 42 43 44 45 46
1 x10
415 42 425 43 435 44 445 45 455 46 465 47 475 48 485 49 495 5
505 51 515 52 525 53 535 54 545 55 555 56 565 57
+ESI MRM Frag=1120V CID190 (2871000 -gt 2409000) RE_L_1d 1
Counts vs Acquisition Time (min) 305 31 315 32 325 33 335 34 345 35 355 36 365 37 375 38 385 39 395 4 405 41 415 42 425 43 435 44 445 45 455 46 465 47 475
Relacioacuten sentildealruido para el Oxazepam y Lorazepam a
10 ngmL (10 ppb)
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 39
La Naloxone muestra esta curva de linealidad de10-250 ngmL (ppb) con una R2
= 0991
Las curvas de calibracioacuten se generaron con la respuestra relativa (area pico
analitoarea pico IS) frente a la concentracioacuten relativa (concentracion de
analitoconcentracioacuten de IS)
Ejemplo de curva de linealidad para Naloxona extraido
con mini-QuEChERS
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 40
Recuperacioacuten y Reproducibilidad
Compuesto 50 ngmL Spiked
Recuperacioacuten RSD
100 ngmL Spiked
Recuperacioacuten RSD
Lidocaine 987 157 100 118
Tramadol 105 30 104 82
Amitriptyline 104 21 104 82
Biperidene 97 45 99 82
Oxazepam 770 92 78 86
Lorazepam 819 68 818 86
Chlorpromazine 110 103 105 63
Diltiazem 881 27 917 83
Naloxone 806 90 755 77
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 41
Conclusioacutenes y trabajo posterior
El meacutetodo mini-QuEChERS para la extraccioacuten de compuestos farmaceacuteuticos en
sangre total ofrece una alternativa a otras teacutecnicas de preparacioacuten de muestras
La preparacioacuten de muestras mini-QuEChERS es un enfoque simple facil y
barato que requiere una miacutenima experiencia en preparacioacuten de muestras y
miacutenimo equipamiento
Es un punto de partida para ampliar el numero y las clasificaciones evaluadas
en otras matrices bioloacutegicas y en sangre postmortem
El trabajo futuro incluira combinaciones adecuadas tanto de las sales de
extraccioacuten como de los sorbentes de d-SPE por el meacutetodo mini-QuEChERS
La columna Poroshell 120 ofrece una selectividad diferente y excelentes formas
de pico a lo largo del amplio rango de compuestos farmaceacuteuticos usados en este
estudio
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 42
Referencias
(1) M Anastassiades SJ Lehotay D Štajnbaher and FJ Schenk J AOAC Int 86 4121 (2003)
(2) G Stubbings and T Bigwood Anal Chim Acta 637 68 (2009)
(3) RR Rasmussen IMLD Storm PZH Rasmussen J Smedsgaard and KF Nielsen Anal Bioanal Chem 397 765 (2010)
(4) D Smith and K Lynam GCμECD analysis and confirmation of PCBs in fish tissue with Agilent JampW DB-35ms and DB-XLB GC columns Agilent Technologies 5990-6236EN (2010)
(5) F Ploumlssl M Giera and F Bracher J Chrom A 1135 19 (2006)
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 43
MEJORAR LA PRODUCTIVIDAD EN
HPLC ESTAacuteNDAR CON COLUMNAS
POROSHELL
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Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 44
Columnas Poroshell 120 para HPLC y UHPLC
bull 80-90 de eficacia de las sub 2um
bull A presiones un ~40-50 maacutes bajas
bull Con un tamantildeo de partiacutecula de 27um
bull Con una frita de entrada de 2um
bull Con el doble de resolucioacuten de una
columna de 35um
bull Con un liacutemite de presioacuten de 600 bar
bull La partiacutecula tiene un nuacutecleo soacutelido
(17um) y una cubierta exterior porosa
de 05um como zona de difusioacuten
Las Columnas Poroshell 120 tienen
Page 44
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 45
Poroshell 120 proporciona Eficacia Suficiente
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Flujo 0582 mLmin AcetonitriloAgua (6040)
Volumen de Inyeccioacuten 4 microL
TCC 26 oC
DAD Sig=2544nm Ref=360100nm
Muestra Muestra de test RRLC
(PN 5188-6529) inoculada con
50 microL 2 mgmL Tiourea en
aguaacetonitrilo (6535)
25 5 75 10
mAU
0
200
400
600
06
46
0
82
6
11
48
15
18
20
16
2
22
3
28
16
41
32
62
73
97
53
larr N = 25053 Presioacuten = 182 bar
Poroshell 120 EC-C18 30 x 100 mm 27 um
min 25 5 75 10 125
mAU
0
200
400
600
06
49
0
86
5
12
75
17
56
24
18
27
05
34
94
52
81
82
18
13
04
1
larr N = 27295 Presioacuten = 386 bar
Eclipse Plus C18 30 x 100 mm 18 um
gt90 de la Eficacia de una 18um
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 46
iquestEn queacute tipos de instrumentos puede usar
Columnas Poroshell 120 HPLCrsquos y UHPLCrsquos
Consideraciones en UHPLC
bull Las columnas Poroshell 120 tienen un liacutemite de presioacuten de 600 bar
bull Los UHPLC estaacuten ajustados para columnas de bajo volumen por lo tanto las
Poroshell pueden usarse en todos los UHPLC
Consideraciones en HPLC
bull Las Columnas Poroshell 120 trabajan bien por debajo de 400 bar
bull Minimize los volumenes extra columna para las columnas 21 y 30mm ID ndash
siga las instrucciones dadas para las columnas RRHT (18um 600 bar)
bull Use en el detector velocidades adecuadas de adquisicioacuten para picos
estrechos de alta eficacia
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Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 47
Con una frita de 2 um Poroshell 120 no se bloquea
Muestras Complejas- Plasma
Diflusinal in Plasma
0
20
40
60
80
100
120
140
160
180
200
220
240
260
280
300
320
340
360
380
400
1 501 1001 1501 2001 2501
Injections
Pre
ssu
re
0
20000
40000
60000
80000
100000
120000
140000
160000
180000
200000
Eff
icie
ncy (
N)
End Press
Plates
Columna Poroshell 120 EC-C18 30 x 50mm 27um LC Agilent 1200 RRLC (SL)
Muestra Plasma Precipitado 2 partes Plasma 7 Partes 2080 Agua-MeCN w01 Aacutecido Foacutermico con 1 Parte de Diflusinal en
5050 Agua-MeCN 10 ugml (Concentracion Final Diflusinal 1 ugml) Agitado y dejado reposar 10 minutos
No Centrifugado No Filtrado
Volumen de Inyeccioacuten 1ul
Solvente A Agua w01 TFA
Solvente B MeCN w008 TFA
Flujo 1 mlmin 1 ul inyeccioacuten
Tiempo B
0 20
05 90
06 90
11 20
25 20
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Diflusinal es un anti-inflamatorio no esteroidal anaacutelogo
a la aspirina desarrollado por Merck Sharp amp Dohme
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 48
Las Columnas Superficialmente Porosas Pueden
Usarse cumpliendo los Requirimientos USP
De la lista USP de empaquetamientos de columnas LC 42009
Page 48
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 49
Criterios de Ajuste de Meacutetodos USP y FDA Criterios de Ajuste de Meacutetodos de Dimensiones de Columna
Paraacutemetro Especificaciones Maacuteximas ComentariosEjemplos
Longitud de Columna 70 250mm 75mm
150mm 50mm
Diaacutemetro Interno de
Columna
25 (FDA ORA-LAB 545)
USP ndash 25 ID Columna puede ajustarse si la
velocidad lineal es constante
46 mm 30 mm (-35)
46 mm 21 mm (-54)
30 mm 21 mm (-30)
Flow Rate 50
Volumen de Inyeccioacuten
Reducir tanto como se necesitendash
debe cumplir los liacutemites de
deteccioacuten y precisioacuten
Si cambia a una columna maacutes
corta haga el cambio apropiado
en el volumen de inyeccioacuten
Tamantildeo de Partiacutecula Reducir hasta el 50
(no se puede aumentar)
Puede cambiar la longitud de columna y el
tamantildeo de partiacutecula para mantener la misma
Rs
5um 35um (-30)
5um 27um (-46) Cambiado en 22409 ndash Para la copia oficial y actual ir a
httpwwwfdagovScienceResearchFieldSciencedefaulthtm
USP 30 Second Supplement Revisions PF34(5) en proceso
Ver ldquo Stimuli articlerdquo en Pharmacopeial Forum 2009 35(6)
Page 49
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 50
Comparacioacuten de 46 x 250 mm 5 um con Poroshell
120 EC-C18 46 x 100 mm 27um
min 5 10 15 20 25 30
mAU
0
20
40
60
80
100
97
12
111
16
115
96
126
74
152
48
161
51
164
35
206
87
230
76
292
90
min 5 10 15 20 25 30
mAU
0
50
100
150
200
250
17
19
21
89
23
11
26
06
38
67
44
37 45
58
54
50
59
20
70
37
Anaacutelisis maacutes raacutepido(columna maacutes corta flujo maacutes alto)
Mayor sensibilidad(partiacutecula maacutes pequentildeapico maacutes estrecho)
Maacutes optimizado (un anaacutelisis maacutes raacutepido permite ajustar mejor)
Ambos anaacutelisis en Agilent 1100 G1315B DAD (bajo 400 bar)
No se requiere cambio en la preparacioacuten de muestra frita de entrada
de 2 micras en ambas columnas
325 bar
110 bar
Sulfadiazina
Sulfatiazol
Sulfapiridina
Sulfamerazina
Sulfametazina
Sulfametazol
Sulfametoxipiridazina
Sulfacloropiridazina
Sulfametoxazol
Sulfadimetoxina
Tiempo B
0 8
33 33
34 33
Columna Eclipse Plus C18
46 x 250mm 5um
Flujo 1 mLmin
Fase Moacutevil
A 01 Aacutecido Foacutermico en Agua
B 01 Aacutecido Foacutermico en ACN
Tiempo B
0 8
12 33
132 33
Columna 46 x 100mm
Poroshell 120 EC-C18
27um
Flujo 185 mLmin
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Comparacioacuten de 46 x 250 mm 5 um con Poroshell
120 EC-C18 46 x 100 mm 27um
min 5 10 15 20 25 30
mAU
0
20
40
60
80
100
97
12
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110 bar
5
mAU
0
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150
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70
37
325 bar
min
Ver condiciones en diapositiva anterior
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Mejor Resolucioacuten
linea base
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 52
Anaacutelisis maacutes raacutepido del meacutetodo USP para pastillas de
Simvastatina en Columnas Poroshell 120ndash Ajuste del meacutetodo
46 x 250 mm 5-um
Agilent ZORBAX Eclipse Plus C18
46 x 75 mm 27-um
Agilent Poroshell 120 EC-C18
65 CH3CN 35 39 gL NaH2PO4 (pH 45) 45 oC Sig = 238 8 Ref = 360 100 nm
Flujos 15 mLmin para la columna de 5-um 28 mLmin para la columna Poroshell 120 27um
Requerimiento
USP
5-um
(15 mLmin)
27-um
(28 mLmin)
TR na 9907 1457
krsquo gt 30 5962 5122
N gt 4500 16939 14439
Tf lt 20 109 110
min 2 4 6 8 10
mAU
0
5
10
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20
25
30
35
40
min 2
mAU
0
5
10
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20
25
30
35
40
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Ajustes de los parametros cromatograficos en la
transferencia de meacutetodos Escalado del volume de inyeccioacuten
v1 x [(r22 x L2)(r1
2 x L1)] = V2
O bien
v2 = V1 x [(d22 x L2)(d1
2 x L1)]
v volume de inyeccioacuten
r radio de la columna
L longitud de la columna
Ajuste del flujo
F2= F1 x (L2L1 ) x (r2r1 )2
L longitud de la columna
F Flujo
r radio de la columna
Ajuste de la longitud del gradiente
En funcioacuten de la longitud de la columna
L2L1= tg2tg1
En funcioacuten del volumen muerto de columna y del flujo
tG2= tG1 x (V2V1) x (F1F2) t tiempos de gradiente
V volumen muerto de columna
F flujo
Columna ID Volumen muerto aprox
por mm longitud
46mm 100uL
30mm 425uL
21mm 208uL
10mm 047uL
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 54
Notas de Aplicacioacuten en Poroshell 120 y QuEChERS
Determination of Hormones in Shrimp by Agilent 1290 Infinity LC with
Agilent Poroshell 120 LC Column and Agilent QuEChERS for Sample
Preparation (publication 5990-6589EN)
Analysis of Pesticide Residues in Green Tea Using Agilent SampliQ
QuEChERS EN Kit by LCMSMS Detection (publication 5990-
6400EN)
Analysis of Pesticide Residues in Rice Using Agilent Bond Elut
QuEChERS AOAC Kit (publication 5990-8034EN)
Poroshell 120 for pharmaceutical analysis
Poroshell 120 Resources
QuEChERS Applications
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 55
Sumario
bull La columna Poroshell 120 es una nueva alternativa para LC de Alta
Resolucioacuten y Alta Velocidad que puede usarse en cualquier HPLC o UHPLC
bull Con la Poroshell 120 se pueden lograr separaciones de alta eficacia a baja
presioacuten
bull Puede usarse con muestras sucias sin ver una elevacioacuten anormal de la
presioacuten
bull Puede usarse en un meacutetodo USP sin comprometer los Criterios de Ajustes de
Meacutetodo
Page 55
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 56
Soporte Teacutecnico Agilent
Teleacutefono de Atencioacuten al Cliente
901 11 68 90
email customercare_spainagilentcom
wwwagilentcomchem
![Page 22: Análisis de compuestos farmacéuticos en sangre total · PDF fileReducción en el procesamiento, el envío de la muestra, y los ... Gas flow: 10 L/min Nebulizer: 10 psi Sheath gas](https://reader031.vdocuments.site/reader031/viewer/2022030405/5a7a81727f8b9a0a668b45aa/html5/thumbnails/22.jpg)
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 22
Notas de Aplicacioacuten farmaceacuteuticas en Poroshell
120 and DMS Fast Analysis of Cefepime and Related Impurities on Poroshell 120 EC-C18 (publication 5990-7492EN) Comparing Selectivity Easy Transfer of Methods between Superficially Porous Agilent Poroshell 120 EC-C18 and totally Porous Agilent ZORBAX Eclipse Plus C18 (publication 5990-6588EN)
Analysis of Water Soluble Vitamins in Multivitamin Tablets Using Poroshell 120 EC-C18 (publication 5990-8107EN)
Analysis of Anthocyanins in Common Foods Using an Agilent Poroshell 120 SB-C18 (publication 5990-8249EN)
Analysis of Amitriptyline Fluoxetine Quetiapine and Sertraline Using Dried Plasma (publication 5990-8169EN)
Analysis of Amitriptyline Fluoxetine Quetiapine and Sertraline Using Dried Blood Spots (publication 5990-8168EN)
Investigation of Varying Blood Hematocrit Level in Dried Blood Spotting (publication 5990-8306EN)
Analysis of Cholesterol Lowering Drugs (Statins) Using Dried Matrix Spots Technology (publication 5990-8305EN)
Scalability of Agilent Columns Across HPLC and UHPLC Instruments (publication 5990-8428EN)
Converting a CHP Method for Insulin to Agilent Poroshell 120 Columns (publication 5990-9029EN)
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 23
La propuesta QuEChERS para Determinar compuestos
Farmaceacuteuticos y Toxinas en Sangre Total
Anaacutelisis de Compuestos Farmaceacuteuticos en Sangre Total con
la columna Poroshell 120 Usando el meacutetodo Modificado
Mini-QuEChERS para la preparacioacuten de muestra
Nota de Aplicacioacuten5990-8789EN
httpwwwchemagilentcomLibraryapplications5990-8789ENpdf
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 24
Introduccioacuten
Determinacioacuten de compuestos farmaceacuteuticos en anaacutelisis cliacutenicos y
foreacutensicos ADME (DMPK)
La preparacioacuten de muestra va desde la simple precipitacioacuten de
proteinas (PPT) a la maacutes compleja extraccioacuten en fase soacutelida (SPE)
Habitualmente la SPE ha ocupado este vaciacuteo pero simpre hay
espacio para teacutecnicas de preparacioacuten de muestras que son raacutepidas y
baratas de implementar
Se describe un procedimiento mini-QuEChERS modificado con
analisis LCndashMS-MS para la determinacioacuten de faacutermacos en sangre
total
Se analizan nueve diferentes faacutermacos (lidocaina tramadol
amitriptilina biperidina oxazepam lorazepam clorpromazina
diltiazem y naloxona)
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 25
Compuestos farmaceacuteuticos usados en el estudio
Compuesto Nuacutemero CAS Log P (ow) pKa Uso
terapeacuteutico
Lidocaina 137-58-6 24 801 Anesteacutesico local
antiarrithmico
Tramadol 27203-92-5 25 941 Analgesico
Amitriptilina 50-48-6 492 94 Antidepresivo
Biperidena 514-65-8 40 108 Anticolinergico
Oxazepam 604-75-1 223 17 113 Antianxiedad
Lorazepam 846-49-1 247 13 115 Antidepresivo
Clorpromazina 50-53-3 518 93 Antipsycoacutetico
Diltiazem 42399-41-7 363 77 Bloqueante de los
canales del calcio
Naloxona 465-65-6 145 79 Antagonista de los
receptores de opio
Nortriptilina (IS) 72-69-5 565 97
5 ugmL de solucioacuten (9 compuestos) y estandar interno en metanol
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 26
La Teacutecnica de QuEChERS aplicada a las muestras
de sangre
La sangre es el maacutes complejo de los fluidos bioloacutegicos
La determinacioacuten de faacutermacos en sangre total es a menudo necesaria en los
anaacutelisis foreacutensicos dada la dificultad de obtener suero o plasma
Los procedimientos convencionales para analizar faacutermacos en matrices
complejas como la sangre total son complicados
QuEChERS es una teacutecnica de preparacioacuten de muestra que fue desarrollada
para la extraccioacuten de residuos de plaguicidas multi-clase de frutas y vegetales
en 2003
A pesar de que los fluidos bioloacutegicos pueden parecer muy diferentes a una
pieza de fruta sin embargo siguen caminos paralelos
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 27
Caminos paralelos en la preparacioacuten de muestra
Fluidos Bioloacutegicos
Matrices complejas
Rotura de la arquitectura celular
bull Lisis agitacioacuten solvente orgaacutenico
hidroacutelisis
Analitos con un amplio rango de
polaridades
Retirar analito o matriz
Anaacutelisis por LCMSMS GCMS o
GCMSMS
Frutas y Vegetales
Matrices complejas
Rotura de la arquitectura celular
bull Trituracioacuten agitacioacuten solvente
orgaacutenico hidroacutelisis
Analitos con un amplio rango de
polaridades
Retirar analito o matriz
Anaacutelisis por LCMSMS GCMS o
GCMSMS
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 28
Procedimiento baacutesico por SPE para muestras de sangre
El pretratamiento de la sangre total implica la dilucioacuten con una
solucioacuten aacutecida un tampoacuten fosfato o aguaFA
Sonicar 15 minutos rotura de membranas celulares
Centrifugacioacuten
bull Procedimiento de SPE
ndash Acondicionado del cartucho metanol agua
ndash Carga del cartucho muestra
ndash Lavado del cartucho agua con metanol o tampoacuten metanol
ndash Elucioacuten del cartucho eluyente para el anaacutelisis
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 29
Procedimiento Baacutesico QuEChERS
15 g muestra homogeneizada (fortificada)
Antildeadir 15 mL ACN (1 AA) vortex
Antildeadir Sales de Extraccioacuten AOAC agitar
Centrifugar
Transferir 1 u 8 mL a un tubo d-SPE AOAC vortex centrifugar
Transferir al vial de Anaacutelisis
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 30
Ventajas y desventajas del Procedimiento QuEChERS
Ventajas
Extraccioacuten tipo liacutequidoliacutequido
Uso de aacutecido para interrumpir el ligado de proteinas
Exceso de sal para lisar los componentes celulares
Uso de acetonitrilo para facilitar la precipitacioacuten proteacuteica
Uso de SPE dispersiva para adsorber las interferencias de la matriz
Plossl etat J Chrom A 1135 (2006) 19-26
Desventajas
La cantidad de solvente y de muestra requeridos en el meacutetodo no
son ldquobioloacutegicamente adecuadosrdquo
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 31
Propoacutesito de la propuesta mini-Q
Ofrecer un enfoque maacutes adecuado biologicamente
Requirimientos de menores volumenes y tamantildeos de
muestra
Rango de faacutermacos varias polaridades y pKa
Evaluaciacuteoacuten de las interferencias de fondo
Extraccioacuten y datos de recuperacioacuten en un rango
aceptable
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 32
Faacutermacos en sangre Procedimiento mini-QuEChERS
mini-Q
Procedimiento
1 Antildeadir 2 homogeneizadores ceraacutemicos
2 Antildeadir 1 o 2 mL de sangre entera a un tubo de centriacutefuga con tapoacuten de rosca
3 Antildeadir estandar interno vortex
4 Antildeadir 2 mL de ACN acidificado ( 04 FA) vortex 30 seg
5 Antildeadir 500 mg de sales de extraccioacuten agitar vigorsamente 1 minuto centrifugar 5000 rpm 1 min
6 Transferir 1 mL del extraccto al material de d-SPE en tubo de centrifuga vortex centrifugar
7 Antildeadir 200 uL a 800 uL de agua en un vial LC vortex y analizar
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 33
Refinamiento del Procedimiento mini-Q
Paraacutemetros evaluados en la teacutecnica mini-Q
Muestra de sangre total
bull La matriz bioloacutegica maacutes complicada
Adicioacuten de aacutecido tipo y cantidad
bull Efecto en la particioacuten y extraccioacuten
Adicioacuten de las sales de QuEChERS no-tamponadas o
tamponadas con NaAcetato o Citrato
bull Efecto en el extracto inspeccioacuten visual
SPE Dispersiva
bull Limpieza de la matriz y recuperaciones de los compuestos
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 34
Conclusiones del estudio
El ACN con 4 de FA como solvente de extraccioacuten muestra
una lisis maacutes completa de la muestra frente a otros solventes
de extraccioacuten que mostraron una masa soacutelida
Las sales tamponadas AOAC de acetato Soacutedico generan el
extracto maacutes liacutempio y fueron elegidas para la d-SPE
El paso de dSPE no ofrece un clean up adicional para los
meacutetodos de extraccioacuten con sales EN y no tamponadas
principalmente
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 35
Datos de Adquisicoacuten LCMSMS
Compuestos Canales MRM
(mz) Fragmentador
(V) CE (V) RT (min) Delta RT
Lidocaina 1) 23518 gt 861
2) 23518 gt 581
97 11
35
137 04
Tramadol 1) 2642 gt 581
2) 2642 gt 2461
97 15
3
120 04
Amitriptilina 1) 2782 gt 117
2) 2782 gt 105
112 19
19
425 04
Biperidena 1)31223 gt 981
2) 31223 gt 551
123 19
60
423 07
Oxazepam 1) 28706 gt 2409
2) 28706 gt 2689
112 19
7
399 04
Lorazepam 1) 32102 gt 2749
2) 32102 gt 3029
113 15
7
409 04
Clorpromazina 1) 31911 gt 861
2) 31911 gt 581
112 15
43
463 04
Diltiazem 1) 41517 gt 1779
2) 41517 gt 1499
128 19
43
373 04
Naloxona 1) 32816 gt 310
2) 32816 gt 212
123 15
39
082 04
Nortriptilina (IS) 1) 26418 gt 233
2) 26418 gt 91
97 7
19
417 04
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06
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065
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075
0775
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0825
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09
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0975
1
1025
105
1075
11
1125
115
1175
12
1225
125
1275
13
1325
135
1375
+ESI TIC Scan Frag=800V AOAC_BLANK_110228bd
1 1
Counts vs Acquisition Time (min)
05 1 15 2 25
3 35 4 45 5 55 6 65 7 75 8 85 9 95 10
Columna Poroshell 120 EC-C18 27
micro 21 x 100 mm PN 695775-902
Fase Moacutevil
A 5 mM Acetato Amoacutenico pH 5
2080 MeOHagua
B 5 mM Acetato amoacutencio en ACN
Flujo 04mLmin
Inyeccioacuten 10uL
GT (ordmC) 300
GF (lmin) 7
Nebulizador (psi) 40
SGT (ordmC) 400
SFG (lmin) 12
Capilar (V) 3500
NV (V) 500
Condiciones LCMS
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4
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48
49
5
51
+ESI MRM Frag=1120V CID190 (2782000 -gt 1170000) HQC_6d
1 1
Counts vs Acquisition Time (min) 01 02 03 04 05 06 07 08 09 1 11 12 13 14 15 16 17 18 19 2 21 22 23 24 25 26 27 28 29 3 31 32 33 34 35 36 37 38 39 4 41 42 43 44 45 46
Nalo
xo
ne
Lid
oc
ain
e
Tra
mad
ol
Oxazep
am
Lo
razep
am
Bip
eri
de
n
Am
itri
pty
lin
e
Dil
tiazem
Ch
lorp
rom
azin
e
No
rtri
pty
lin
e (
IS)
Cromatograma LCMSMS de 10 ngmL de sangre total fortificada despueacutes
de extraccioacuten mini-QuEChERS AOAC (NaAc) y d-SPE (50mg PSA y
150mg MgSO4)
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 38
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2
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3
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33
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35
36
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39
4
41
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46
47
48
49
5
51
+ESI MRM Frag=1120V CID190 (2782000 -gt 1170000) HQC_6d
1 1
Counts vs Acquisition Time (min) 01 02 03 04 05 06 07 08 09 1 11 12 13 14 15 16 17 18 19 2 21 22 23 24 25 26 27 28 29 3 31 32 33 34 35 36 37 38 39 4 41 42 43 44 45 46
1 x10
415 42 425 43 435 44 445 45 455 46 465 47 475 48 485 49 495 5
505 51 515 52 525 53 535 54 545 55 555 56 565 57
+ESI MRM Frag=1120V CID190 (2871000 -gt 2409000) RE_L_1d 1
Counts vs Acquisition Time (min) 305 31 315 32 325 33 335 34 345 35 355 36 365 37 375 38 385 39 395 4 405 41 415 42 425 43 435 44 445 45 455 46 465 47 475
Relacioacuten sentildealruido para el Oxazepam y Lorazepam a
10 ngmL (10 ppb)
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 39
La Naloxone muestra esta curva de linealidad de10-250 ngmL (ppb) con una R2
= 0991
Las curvas de calibracioacuten se generaron con la respuestra relativa (area pico
analitoarea pico IS) frente a la concentracioacuten relativa (concentracion de
analitoconcentracioacuten de IS)
Ejemplo de curva de linealidad para Naloxona extraido
con mini-QuEChERS
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 40
Recuperacioacuten y Reproducibilidad
Compuesto 50 ngmL Spiked
Recuperacioacuten RSD
100 ngmL Spiked
Recuperacioacuten RSD
Lidocaine 987 157 100 118
Tramadol 105 30 104 82
Amitriptyline 104 21 104 82
Biperidene 97 45 99 82
Oxazepam 770 92 78 86
Lorazepam 819 68 818 86
Chlorpromazine 110 103 105 63
Diltiazem 881 27 917 83
Naloxone 806 90 755 77
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 41
Conclusioacutenes y trabajo posterior
El meacutetodo mini-QuEChERS para la extraccioacuten de compuestos farmaceacuteuticos en
sangre total ofrece una alternativa a otras teacutecnicas de preparacioacuten de muestras
La preparacioacuten de muestras mini-QuEChERS es un enfoque simple facil y
barato que requiere una miacutenima experiencia en preparacioacuten de muestras y
miacutenimo equipamiento
Es un punto de partida para ampliar el numero y las clasificaciones evaluadas
en otras matrices bioloacutegicas y en sangre postmortem
El trabajo futuro incluira combinaciones adecuadas tanto de las sales de
extraccioacuten como de los sorbentes de d-SPE por el meacutetodo mini-QuEChERS
La columna Poroshell 120 ofrece una selectividad diferente y excelentes formas
de pico a lo largo del amplio rango de compuestos farmaceacuteuticos usados en este
estudio
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 42
Referencias
(1) M Anastassiades SJ Lehotay D Štajnbaher and FJ Schenk J AOAC Int 86 4121 (2003)
(2) G Stubbings and T Bigwood Anal Chim Acta 637 68 (2009)
(3) RR Rasmussen IMLD Storm PZH Rasmussen J Smedsgaard and KF Nielsen Anal Bioanal Chem 397 765 (2010)
(4) D Smith and K Lynam GCμECD analysis and confirmation of PCBs in fish tissue with Agilent JampW DB-35ms and DB-XLB GC columns Agilent Technologies 5990-6236EN (2010)
(5) F Ploumlssl M Giera and F Bracher J Chrom A 1135 19 (2006)
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 43
MEJORAR LA PRODUCTIVIDAD EN
HPLC ESTAacuteNDAR CON COLUMNAS
POROSHELL
Page 43
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 44
Columnas Poroshell 120 para HPLC y UHPLC
bull 80-90 de eficacia de las sub 2um
bull A presiones un ~40-50 maacutes bajas
bull Con un tamantildeo de partiacutecula de 27um
bull Con una frita de entrada de 2um
bull Con el doble de resolucioacuten de una
columna de 35um
bull Con un liacutemite de presioacuten de 600 bar
bull La partiacutecula tiene un nuacutecleo soacutelido
(17um) y una cubierta exterior porosa
de 05um como zona de difusioacuten
Las Columnas Poroshell 120 tienen
Page 44
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 45
Poroshell 120 proporciona Eficacia Suficiente
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Flujo 0582 mLmin AcetonitriloAgua (6040)
Volumen de Inyeccioacuten 4 microL
TCC 26 oC
DAD Sig=2544nm Ref=360100nm
Muestra Muestra de test RRLC
(PN 5188-6529) inoculada con
50 microL 2 mgmL Tiourea en
aguaacetonitrilo (6535)
25 5 75 10
mAU
0
200
400
600
06
46
0
82
6
11
48
15
18
20
16
2
22
3
28
16
41
32
62
73
97
53
larr N = 25053 Presioacuten = 182 bar
Poroshell 120 EC-C18 30 x 100 mm 27 um
min 25 5 75 10 125
mAU
0
200
400
600
06
49
0
86
5
12
75
17
56
24
18
27
05
34
94
52
81
82
18
13
04
1
larr N = 27295 Presioacuten = 386 bar
Eclipse Plus C18 30 x 100 mm 18 um
gt90 de la Eficacia de una 18um
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 46
iquestEn queacute tipos de instrumentos puede usar
Columnas Poroshell 120 HPLCrsquos y UHPLCrsquos
Consideraciones en UHPLC
bull Las columnas Poroshell 120 tienen un liacutemite de presioacuten de 600 bar
bull Los UHPLC estaacuten ajustados para columnas de bajo volumen por lo tanto las
Poroshell pueden usarse en todos los UHPLC
Consideraciones en HPLC
bull Las Columnas Poroshell 120 trabajan bien por debajo de 400 bar
bull Minimize los volumenes extra columna para las columnas 21 y 30mm ID ndash
siga las instrucciones dadas para las columnas RRHT (18um 600 bar)
bull Use en el detector velocidades adecuadas de adquisicioacuten para picos
estrechos de alta eficacia
Page 46
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 47
Con una frita de 2 um Poroshell 120 no se bloquea
Muestras Complejas- Plasma
Diflusinal in Plasma
0
20
40
60
80
100
120
140
160
180
200
220
240
260
280
300
320
340
360
380
400
1 501 1001 1501 2001 2501
Injections
Pre
ssu
re
0
20000
40000
60000
80000
100000
120000
140000
160000
180000
200000
Eff
icie
ncy (
N)
End Press
Plates
Columna Poroshell 120 EC-C18 30 x 50mm 27um LC Agilent 1200 RRLC (SL)
Muestra Plasma Precipitado 2 partes Plasma 7 Partes 2080 Agua-MeCN w01 Aacutecido Foacutermico con 1 Parte de Diflusinal en
5050 Agua-MeCN 10 ugml (Concentracion Final Diflusinal 1 ugml) Agitado y dejado reposar 10 minutos
No Centrifugado No Filtrado
Volumen de Inyeccioacuten 1ul
Solvente A Agua w01 TFA
Solvente B MeCN w008 TFA
Flujo 1 mlmin 1 ul inyeccioacuten
Tiempo B
0 20
05 90
06 90
11 20
25 20
Page 47
Diflusinal es un anti-inflamatorio no esteroidal anaacutelogo
a la aspirina desarrollado por Merck Sharp amp Dohme
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 48
Las Columnas Superficialmente Porosas Pueden
Usarse cumpliendo los Requirimientos USP
De la lista USP de empaquetamientos de columnas LC 42009
Page 48
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 49
Criterios de Ajuste de Meacutetodos USP y FDA Criterios de Ajuste de Meacutetodos de Dimensiones de Columna
Paraacutemetro Especificaciones Maacuteximas ComentariosEjemplos
Longitud de Columna 70 250mm 75mm
150mm 50mm
Diaacutemetro Interno de
Columna
25 (FDA ORA-LAB 545)
USP ndash 25 ID Columna puede ajustarse si la
velocidad lineal es constante
46 mm 30 mm (-35)
46 mm 21 mm (-54)
30 mm 21 mm (-30)
Flow Rate 50
Volumen de Inyeccioacuten
Reducir tanto como se necesitendash
debe cumplir los liacutemites de
deteccioacuten y precisioacuten
Si cambia a una columna maacutes
corta haga el cambio apropiado
en el volumen de inyeccioacuten
Tamantildeo de Partiacutecula Reducir hasta el 50
(no se puede aumentar)
Puede cambiar la longitud de columna y el
tamantildeo de partiacutecula para mantener la misma
Rs
5um 35um (-30)
5um 27um (-46) Cambiado en 22409 ndash Para la copia oficial y actual ir a
httpwwwfdagovScienceResearchFieldSciencedefaulthtm
USP 30 Second Supplement Revisions PF34(5) en proceso
Ver ldquo Stimuli articlerdquo en Pharmacopeial Forum 2009 35(6)
Page 49
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 50
Comparacioacuten de 46 x 250 mm 5 um con Poroshell
120 EC-C18 46 x 100 mm 27um
min 5 10 15 20 25 30
mAU
0
20
40
60
80
100
97
12
111
16
115
96
126
74
152
48
161
51
164
35
206
87
230
76
292
90
min 5 10 15 20 25 30
mAU
0
50
100
150
200
250
17
19
21
89
23
11
26
06
38
67
44
37 45
58
54
50
59
20
70
37
Anaacutelisis maacutes raacutepido(columna maacutes corta flujo maacutes alto)
Mayor sensibilidad(partiacutecula maacutes pequentildeapico maacutes estrecho)
Maacutes optimizado (un anaacutelisis maacutes raacutepido permite ajustar mejor)
Ambos anaacutelisis en Agilent 1100 G1315B DAD (bajo 400 bar)
No se requiere cambio en la preparacioacuten de muestra frita de entrada
de 2 micras en ambas columnas
325 bar
110 bar
Sulfadiazina
Sulfatiazol
Sulfapiridina
Sulfamerazina
Sulfametazina
Sulfametazol
Sulfametoxipiridazina
Sulfacloropiridazina
Sulfametoxazol
Sulfadimetoxina
Tiempo B
0 8
33 33
34 33
Columna Eclipse Plus C18
46 x 250mm 5um
Flujo 1 mLmin
Fase Moacutevil
A 01 Aacutecido Foacutermico en Agua
B 01 Aacutecido Foacutermico en ACN
Tiempo B
0 8
12 33
132 33
Columna 46 x 100mm
Poroshell 120 EC-C18
27um
Flujo 185 mLmin
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Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 51
Comparacioacuten de 46 x 250 mm 5 um con Poroshell
120 EC-C18 46 x 100 mm 27um
min 5 10 15 20 25 30
mAU
0
20
40
60
80
100
97
12
111
16
115
96
126
74
152
48
161
51
164
35
206
87
230
76
292
90
110 bar
5
mAU
0
50
100
150
200
250
17
19
21
89
23
11
26
06
38
67
44
37 45
58
54
50
59
20
70
37
325 bar
min
Ver condiciones en diapositiva anterior
Page 51
Mejor Resolucioacuten
linea base
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 52
Anaacutelisis maacutes raacutepido del meacutetodo USP para pastillas de
Simvastatina en Columnas Poroshell 120ndash Ajuste del meacutetodo
46 x 250 mm 5-um
Agilent ZORBAX Eclipse Plus C18
46 x 75 mm 27-um
Agilent Poroshell 120 EC-C18
65 CH3CN 35 39 gL NaH2PO4 (pH 45) 45 oC Sig = 238 8 Ref = 360 100 nm
Flujos 15 mLmin para la columna de 5-um 28 mLmin para la columna Poroshell 120 27um
Requerimiento
USP
5-um
(15 mLmin)
27-um
(28 mLmin)
TR na 9907 1457
krsquo gt 30 5962 5122
N gt 4500 16939 14439
Tf lt 20 109 110
min 2 4 6 8 10
mAU
0
5
10
15
20
25
30
35
40
min 2
mAU
0
5
10
15
20
25
30
35
40
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 53
Ajustes de los parametros cromatograficos en la
transferencia de meacutetodos Escalado del volume de inyeccioacuten
v1 x [(r22 x L2)(r1
2 x L1)] = V2
O bien
v2 = V1 x [(d22 x L2)(d1
2 x L1)]
v volume de inyeccioacuten
r radio de la columna
L longitud de la columna
Ajuste del flujo
F2= F1 x (L2L1 ) x (r2r1 )2
L longitud de la columna
F Flujo
r radio de la columna
Ajuste de la longitud del gradiente
En funcioacuten de la longitud de la columna
L2L1= tg2tg1
En funcioacuten del volumen muerto de columna y del flujo
tG2= tG1 x (V2V1) x (F1F2) t tiempos de gradiente
V volumen muerto de columna
F flujo
Columna ID Volumen muerto aprox
por mm longitud
46mm 100uL
30mm 425uL
21mm 208uL
10mm 047uL
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 54
Notas de Aplicacioacuten en Poroshell 120 y QuEChERS
Determination of Hormones in Shrimp by Agilent 1290 Infinity LC with
Agilent Poroshell 120 LC Column and Agilent QuEChERS for Sample
Preparation (publication 5990-6589EN)
Analysis of Pesticide Residues in Green Tea Using Agilent SampliQ
QuEChERS EN Kit by LCMSMS Detection (publication 5990-
6400EN)
Analysis of Pesticide Residues in Rice Using Agilent Bond Elut
QuEChERS AOAC Kit (publication 5990-8034EN)
Poroshell 120 for pharmaceutical analysis
Poroshell 120 Resources
QuEChERS Applications
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 55
Sumario
bull La columna Poroshell 120 es una nueva alternativa para LC de Alta
Resolucioacuten y Alta Velocidad que puede usarse en cualquier HPLC o UHPLC
bull Con la Poroshell 120 se pueden lograr separaciones de alta eficacia a baja
presioacuten
bull Puede usarse con muestras sucias sin ver una elevacioacuten anormal de la
presioacuten
bull Puede usarse en un meacutetodo USP sin comprometer los Criterios de Ajustes de
Meacutetodo
Page 55
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 56
Soporte Teacutecnico Agilent
Teleacutefono de Atencioacuten al Cliente
901 11 68 90
email customercare_spainagilentcom
wwwagilentcomchem
![Page 23: Análisis de compuestos farmacéuticos en sangre total · PDF fileReducción en el procesamiento, el envío de la muestra, y los ... Gas flow: 10 L/min Nebulizer: 10 psi Sheath gas](https://reader031.vdocuments.site/reader031/viewer/2022030405/5a7a81727f8b9a0a668b45aa/html5/thumbnails/23.jpg)
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 23
La propuesta QuEChERS para Determinar compuestos
Farmaceacuteuticos y Toxinas en Sangre Total
Anaacutelisis de Compuestos Farmaceacuteuticos en Sangre Total con
la columna Poroshell 120 Usando el meacutetodo Modificado
Mini-QuEChERS para la preparacioacuten de muestra
Nota de Aplicacioacuten5990-8789EN
httpwwwchemagilentcomLibraryapplications5990-8789ENpdf
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 24
Introduccioacuten
Determinacioacuten de compuestos farmaceacuteuticos en anaacutelisis cliacutenicos y
foreacutensicos ADME (DMPK)
La preparacioacuten de muestra va desde la simple precipitacioacuten de
proteinas (PPT) a la maacutes compleja extraccioacuten en fase soacutelida (SPE)
Habitualmente la SPE ha ocupado este vaciacuteo pero simpre hay
espacio para teacutecnicas de preparacioacuten de muestras que son raacutepidas y
baratas de implementar
Se describe un procedimiento mini-QuEChERS modificado con
analisis LCndashMS-MS para la determinacioacuten de faacutermacos en sangre
total
Se analizan nueve diferentes faacutermacos (lidocaina tramadol
amitriptilina biperidina oxazepam lorazepam clorpromazina
diltiazem y naloxona)
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 25
Compuestos farmaceacuteuticos usados en el estudio
Compuesto Nuacutemero CAS Log P (ow) pKa Uso
terapeacuteutico
Lidocaina 137-58-6 24 801 Anesteacutesico local
antiarrithmico
Tramadol 27203-92-5 25 941 Analgesico
Amitriptilina 50-48-6 492 94 Antidepresivo
Biperidena 514-65-8 40 108 Anticolinergico
Oxazepam 604-75-1 223 17 113 Antianxiedad
Lorazepam 846-49-1 247 13 115 Antidepresivo
Clorpromazina 50-53-3 518 93 Antipsycoacutetico
Diltiazem 42399-41-7 363 77 Bloqueante de los
canales del calcio
Naloxona 465-65-6 145 79 Antagonista de los
receptores de opio
Nortriptilina (IS) 72-69-5 565 97
5 ugmL de solucioacuten (9 compuestos) y estandar interno en metanol
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 26
La Teacutecnica de QuEChERS aplicada a las muestras
de sangre
La sangre es el maacutes complejo de los fluidos bioloacutegicos
La determinacioacuten de faacutermacos en sangre total es a menudo necesaria en los
anaacutelisis foreacutensicos dada la dificultad de obtener suero o plasma
Los procedimientos convencionales para analizar faacutermacos en matrices
complejas como la sangre total son complicados
QuEChERS es una teacutecnica de preparacioacuten de muestra que fue desarrollada
para la extraccioacuten de residuos de plaguicidas multi-clase de frutas y vegetales
en 2003
A pesar de que los fluidos bioloacutegicos pueden parecer muy diferentes a una
pieza de fruta sin embargo siguen caminos paralelos
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 27
Caminos paralelos en la preparacioacuten de muestra
Fluidos Bioloacutegicos
Matrices complejas
Rotura de la arquitectura celular
bull Lisis agitacioacuten solvente orgaacutenico
hidroacutelisis
Analitos con un amplio rango de
polaridades
Retirar analito o matriz
Anaacutelisis por LCMSMS GCMS o
GCMSMS
Frutas y Vegetales
Matrices complejas
Rotura de la arquitectura celular
bull Trituracioacuten agitacioacuten solvente
orgaacutenico hidroacutelisis
Analitos con un amplio rango de
polaridades
Retirar analito o matriz
Anaacutelisis por LCMSMS GCMS o
GCMSMS
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 28
Procedimiento baacutesico por SPE para muestras de sangre
El pretratamiento de la sangre total implica la dilucioacuten con una
solucioacuten aacutecida un tampoacuten fosfato o aguaFA
Sonicar 15 minutos rotura de membranas celulares
Centrifugacioacuten
bull Procedimiento de SPE
ndash Acondicionado del cartucho metanol agua
ndash Carga del cartucho muestra
ndash Lavado del cartucho agua con metanol o tampoacuten metanol
ndash Elucioacuten del cartucho eluyente para el anaacutelisis
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 29
Procedimiento Baacutesico QuEChERS
15 g muestra homogeneizada (fortificada)
Antildeadir 15 mL ACN (1 AA) vortex
Antildeadir Sales de Extraccioacuten AOAC agitar
Centrifugar
Transferir 1 u 8 mL a un tubo d-SPE AOAC vortex centrifugar
Transferir al vial de Anaacutelisis
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 30
Ventajas y desventajas del Procedimiento QuEChERS
Ventajas
Extraccioacuten tipo liacutequidoliacutequido
Uso de aacutecido para interrumpir el ligado de proteinas
Exceso de sal para lisar los componentes celulares
Uso de acetonitrilo para facilitar la precipitacioacuten proteacuteica
Uso de SPE dispersiva para adsorber las interferencias de la matriz
Plossl etat J Chrom A 1135 (2006) 19-26
Desventajas
La cantidad de solvente y de muestra requeridos en el meacutetodo no
son ldquobioloacutegicamente adecuadosrdquo
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 31
Propoacutesito de la propuesta mini-Q
Ofrecer un enfoque maacutes adecuado biologicamente
Requirimientos de menores volumenes y tamantildeos de
muestra
Rango de faacutermacos varias polaridades y pKa
Evaluaciacuteoacuten de las interferencias de fondo
Extraccioacuten y datos de recuperacioacuten en un rango
aceptable
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 32
Faacutermacos en sangre Procedimiento mini-QuEChERS
mini-Q
Procedimiento
1 Antildeadir 2 homogeneizadores ceraacutemicos
2 Antildeadir 1 o 2 mL de sangre entera a un tubo de centriacutefuga con tapoacuten de rosca
3 Antildeadir estandar interno vortex
4 Antildeadir 2 mL de ACN acidificado ( 04 FA) vortex 30 seg
5 Antildeadir 500 mg de sales de extraccioacuten agitar vigorsamente 1 minuto centrifugar 5000 rpm 1 min
6 Transferir 1 mL del extraccto al material de d-SPE en tubo de centrifuga vortex centrifugar
7 Antildeadir 200 uL a 800 uL de agua en un vial LC vortex y analizar
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 33
Refinamiento del Procedimiento mini-Q
Paraacutemetros evaluados en la teacutecnica mini-Q
Muestra de sangre total
bull La matriz bioloacutegica maacutes complicada
Adicioacuten de aacutecido tipo y cantidad
bull Efecto en la particioacuten y extraccioacuten
Adicioacuten de las sales de QuEChERS no-tamponadas o
tamponadas con NaAcetato o Citrato
bull Efecto en el extracto inspeccioacuten visual
SPE Dispersiva
bull Limpieza de la matriz y recuperaciones de los compuestos
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 34
Conclusiones del estudio
El ACN con 4 de FA como solvente de extraccioacuten muestra
una lisis maacutes completa de la muestra frente a otros solventes
de extraccioacuten que mostraron una masa soacutelida
Las sales tamponadas AOAC de acetato Soacutedico generan el
extracto maacutes liacutempio y fueron elegidas para la d-SPE
El paso de dSPE no ofrece un clean up adicional para los
meacutetodos de extraccioacuten con sales EN y no tamponadas
principalmente
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 35
Datos de Adquisicoacuten LCMSMS
Compuestos Canales MRM
(mz) Fragmentador
(V) CE (V) RT (min) Delta RT
Lidocaina 1) 23518 gt 861
2) 23518 gt 581
97 11
35
137 04
Tramadol 1) 2642 gt 581
2) 2642 gt 2461
97 15
3
120 04
Amitriptilina 1) 2782 gt 117
2) 2782 gt 105
112 19
19
425 04
Biperidena 1)31223 gt 981
2) 31223 gt 551
123 19
60
423 07
Oxazepam 1) 28706 gt 2409
2) 28706 gt 2689
112 19
7
399 04
Lorazepam 1) 32102 gt 2749
2) 32102 gt 3029
113 15
7
409 04
Clorpromazina 1) 31911 gt 861
2) 31911 gt 581
112 15
43
463 04
Diltiazem 1) 41517 gt 1779
2) 41517 gt 1499
128 19
43
373 04
Naloxona 1) 32816 gt 310
2) 32816 gt 212
123 15
39
082 04
Nortriptilina (IS) 1) 26418 gt 233
2) 26418 gt 91
97 7
19
417 04
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 36
7 x10
0125
015
0175
02
0225
025
0275
03
0325
035
0375
04
0425
045
0475
05
0525
055
0575
06
0625
065
0675
07
0725
075
0775
08
0825
085
0875
09
0925
095
0975
1
1025
105
1075
11
1125
115
1175
12
1225
125
1275
13
1325
135
1375
+ESI TIC Scan Frag=800V AOAC_BLANK_110228bd
1 1
Counts vs Acquisition Time (min)
05 1 15 2 25
3 35 4 45 5 55 6 65 7 75 8 85 9 95 10
Columna Poroshell 120 EC-C18 27
micro 21 x 100 mm PN 695775-902
Fase Moacutevil
A 5 mM Acetato Amoacutenico pH 5
2080 MeOHagua
B 5 mM Acetato amoacutencio en ACN
Flujo 04mLmin
Inyeccioacuten 10uL
GT (ordmC) 300
GF (lmin) 7
Nebulizador (psi) 40
SGT (ordmC) 400
SFG (lmin) 12
Capilar (V) 3500
NV (V) 500
Condiciones LCMS
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 37
3 x10
01
02
03
04
05
06
07
08
09
1
11
12
13
14
15
16
17
18
19
2
21
22
23
24
25
26
27
28
29
3
31
32
33
34
35
36
37
38
39
4
41
42
43
44
45
46
47
48
49
5
51
+ESI MRM Frag=1120V CID190 (2782000 -gt 1170000) HQC_6d
1 1
Counts vs Acquisition Time (min) 01 02 03 04 05 06 07 08 09 1 11 12 13 14 15 16 17 18 19 2 21 22 23 24 25 26 27 28 29 3 31 32 33 34 35 36 37 38 39 4 41 42 43 44 45 46
Nalo
xo
ne
Lid
oc
ain
e
Tra
mad
ol
Oxazep
am
Lo
razep
am
Bip
eri
de
n
Am
itri
pty
lin
e
Dil
tiazem
Ch
lorp
rom
azin
e
No
rtri
pty
lin
e (
IS)
Cromatograma LCMSMS de 10 ngmL de sangre total fortificada despueacutes
de extraccioacuten mini-QuEChERS AOAC (NaAc) y d-SPE (50mg PSA y
150mg MgSO4)
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 38
3 x10
01
02
03
04
05
06
07
08
09
1
11
12
13
14
15
16
17
18
19
2
21
22
23
24
25
26
27
28
29
3
31
32
33
34
35
36
37
38
39
4
41
42
43
44
45
46
47
48
49
5
51
+ESI MRM Frag=1120V CID190 (2782000 -gt 1170000) HQC_6d
1 1
Counts vs Acquisition Time (min) 01 02 03 04 05 06 07 08 09 1 11 12 13 14 15 16 17 18 19 2 21 22 23 24 25 26 27 28 29 3 31 32 33 34 35 36 37 38 39 4 41 42 43 44 45 46
1 x10
415 42 425 43 435 44 445 45 455 46 465 47 475 48 485 49 495 5
505 51 515 52 525 53 535 54 545 55 555 56 565 57
+ESI MRM Frag=1120V CID190 (2871000 -gt 2409000) RE_L_1d 1
Counts vs Acquisition Time (min) 305 31 315 32 325 33 335 34 345 35 355 36 365 37 375 38 385 39 395 4 405 41 415 42 425 43 435 44 445 45 455 46 465 47 475
Relacioacuten sentildealruido para el Oxazepam y Lorazepam a
10 ngmL (10 ppb)
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 39
La Naloxone muestra esta curva de linealidad de10-250 ngmL (ppb) con una R2
= 0991
Las curvas de calibracioacuten se generaron con la respuestra relativa (area pico
analitoarea pico IS) frente a la concentracioacuten relativa (concentracion de
analitoconcentracioacuten de IS)
Ejemplo de curva de linealidad para Naloxona extraido
con mini-QuEChERS
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 40
Recuperacioacuten y Reproducibilidad
Compuesto 50 ngmL Spiked
Recuperacioacuten RSD
100 ngmL Spiked
Recuperacioacuten RSD
Lidocaine 987 157 100 118
Tramadol 105 30 104 82
Amitriptyline 104 21 104 82
Biperidene 97 45 99 82
Oxazepam 770 92 78 86
Lorazepam 819 68 818 86
Chlorpromazine 110 103 105 63
Diltiazem 881 27 917 83
Naloxone 806 90 755 77
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 41
Conclusioacutenes y trabajo posterior
El meacutetodo mini-QuEChERS para la extraccioacuten de compuestos farmaceacuteuticos en
sangre total ofrece una alternativa a otras teacutecnicas de preparacioacuten de muestras
La preparacioacuten de muestras mini-QuEChERS es un enfoque simple facil y
barato que requiere una miacutenima experiencia en preparacioacuten de muestras y
miacutenimo equipamiento
Es un punto de partida para ampliar el numero y las clasificaciones evaluadas
en otras matrices bioloacutegicas y en sangre postmortem
El trabajo futuro incluira combinaciones adecuadas tanto de las sales de
extraccioacuten como de los sorbentes de d-SPE por el meacutetodo mini-QuEChERS
La columna Poroshell 120 ofrece una selectividad diferente y excelentes formas
de pico a lo largo del amplio rango de compuestos farmaceacuteuticos usados en este
estudio
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 42
Referencias
(1) M Anastassiades SJ Lehotay D Štajnbaher and FJ Schenk J AOAC Int 86 4121 (2003)
(2) G Stubbings and T Bigwood Anal Chim Acta 637 68 (2009)
(3) RR Rasmussen IMLD Storm PZH Rasmussen J Smedsgaard and KF Nielsen Anal Bioanal Chem 397 765 (2010)
(4) D Smith and K Lynam GCμECD analysis and confirmation of PCBs in fish tissue with Agilent JampW DB-35ms and DB-XLB GC columns Agilent Technologies 5990-6236EN (2010)
(5) F Ploumlssl M Giera and F Bracher J Chrom A 1135 19 (2006)
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 43
MEJORAR LA PRODUCTIVIDAD EN
HPLC ESTAacuteNDAR CON COLUMNAS
POROSHELL
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Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 44
Columnas Poroshell 120 para HPLC y UHPLC
bull 80-90 de eficacia de las sub 2um
bull A presiones un ~40-50 maacutes bajas
bull Con un tamantildeo de partiacutecula de 27um
bull Con una frita de entrada de 2um
bull Con el doble de resolucioacuten de una
columna de 35um
bull Con un liacutemite de presioacuten de 600 bar
bull La partiacutecula tiene un nuacutecleo soacutelido
(17um) y una cubierta exterior porosa
de 05um como zona de difusioacuten
Las Columnas Poroshell 120 tienen
Page 44
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 45
Poroshell 120 proporciona Eficacia Suficiente
Page 45
Flujo 0582 mLmin AcetonitriloAgua (6040)
Volumen de Inyeccioacuten 4 microL
TCC 26 oC
DAD Sig=2544nm Ref=360100nm
Muestra Muestra de test RRLC
(PN 5188-6529) inoculada con
50 microL 2 mgmL Tiourea en
aguaacetonitrilo (6535)
25 5 75 10
mAU
0
200
400
600
06
46
0
82
6
11
48
15
18
20
16
2
22
3
28
16
41
32
62
73
97
53
larr N = 25053 Presioacuten = 182 bar
Poroshell 120 EC-C18 30 x 100 mm 27 um
min 25 5 75 10 125
mAU
0
200
400
600
06
49
0
86
5
12
75
17
56
24
18
27
05
34
94
52
81
82
18
13
04
1
larr N = 27295 Presioacuten = 386 bar
Eclipse Plus C18 30 x 100 mm 18 um
gt90 de la Eficacia de una 18um
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 46
iquestEn queacute tipos de instrumentos puede usar
Columnas Poroshell 120 HPLCrsquos y UHPLCrsquos
Consideraciones en UHPLC
bull Las columnas Poroshell 120 tienen un liacutemite de presioacuten de 600 bar
bull Los UHPLC estaacuten ajustados para columnas de bajo volumen por lo tanto las
Poroshell pueden usarse en todos los UHPLC
Consideraciones en HPLC
bull Las Columnas Poroshell 120 trabajan bien por debajo de 400 bar
bull Minimize los volumenes extra columna para las columnas 21 y 30mm ID ndash
siga las instrucciones dadas para las columnas RRHT (18um 600 bar)
bull Use en el detector velocidades adecuadas de adquisicioacuten para picos
estrechos de alta eficacia
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Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 47
Con una frita de 2 um Poroshell 120 no se bloquea
Muestras Complejas- Plasma
Diflusinal in Plasma
0
20
40
60
80
100
120
140
160
180
200
220
240
260
280
300
320
340
360
380
400
1 501 1001 1501 2001 2501
Injections
Pre
ssu
re
0
20000
40000
60000
80000
100000
120000
140000
160000
180000
200000
Eff
icie
ncy (
N)
End Press
Plates
Columna Poroshell 120 EC-C18 30 x 50mm 27um LC Agilent 1200 RRLC (SL)
Muestra Plasma Precipitado 2 partes Plasma 7 Partes 2080 Agua-MeCN w01 Aacutecido Foacutermico con 1 Parte de Diflusinal en
5050 Agua-MeCN 10 ugml (Concentracion Final Diflusinal 1 ugml) Agitado y dejado reposar 10 minutos
No Centrifugado No Filtrado
Volumen de Inyeccioacuten 1ul
Solvente A Agua w01 TFA
Solvente B MeCN w008 TFA
Flujo 1 mlmin 1 ul inyeccioacuten
Tiempo B
0 20
05 90
06 90
11 20
25 20
Page 47
Diflusinal es un anti-inflamatorio no esteroidal anaacutelogo
a la aspirina desarrollado por Merck Sharp amp Dohme
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 48
Las Columnas Superficialmente Porosas Pueden
Usarse cumpliendo los Requirimientos USP
De la lista USP de empaquetamientos de columnas LC 42009
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Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 49
Criterios de Ajuste de Meacutetodos USP y FDA Criterios de Ajuste de Meacutetodos de Dimensiones de Columna
Paraacutemetro Especificaciones Maacuteximas ComentariosEjemplos
Longitud de Columna 70 250mm 75mm
150mm 50mm
Diaacutemetro Interno de
Columna
25 (FDA ORA-LAB 545)
USP ndash 25 ID Columna puede ajustarse si la
velocidad lineal es constante
46 mm 30 mm (-35)
46 mm 21 mm (-54)
30 mm 21 mm (-30)
Flow Rate 50
Volumen de Inyeccioacuten
Reducir tanto como se necesitendash
debe cumplir los liacutemites de
deteccioacuten y precisioacuten
Si cambia a una columna maacutes
corta haga el cambio apropiado
en el volumen de inyeccioacuten
Tamantildeo de Partiacutecula Reducir hasta el 50
(no se puede aumentar)
Puede cambiar la longitud de columna y el
tamantildeo de partiacutecula para mantener la misma
Rs
5um 35um (-30)
5um 27um (-46) Cambiado en 22409 ndash Para la copia oficial y actual ir a
httpwwwfdagovScienceResearchFieldSciencedefaulthtm
USP 30 Second Supplement Revisions PF34(5) en proceso
Ver ldquo Stimuli articlerdquo en Pharmacopeial Forum 2009 35(6)
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Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 50
Comparacioacuten de 46 x 250 mm 5 um con Poroshell
120 EC-C18 46 x 100 mm 27um
min 5 10 15 20 25 30
mAU
0
20
40
60
80
100
97
12
111
16
115
96
126
74
152
48
161
51
164
35
206
87
230
76
292
90
min 5 10 15 20 25 30
mAU
0
50
100
150
200
250
17
19
21
89
23
11
26
06
38
67
44
37 45
58
54
50
59
20
70
37
Anaacutelisis maacutes raacutepido(columna maacutes corta flujo maacutes alto)
Mayor sensibilidad(partiacutecula maacutes pequentildeapico maacutes estrecho)
Maacutes optimizado (un anaacutelisis maacutes raacutepido permite ajustar mejor)
Ambos anaacutelisis en Agilent 1100 G1315B DAD (bajo 400 bar)
No se requiere cambio en la preparacioacuten de muestra frita de entrada
de 2 micras en ambas columnas
325 bar
110 bar
Sulfadiazina
Sulfatiazol
Sulfapiridina
Sulfamerazina
Sulfametazina
Sulfametazol
Sulfametoxipiridazina
Sulfacloropiridazina
Sulfametoxazol
Sulfadimetoxina
Tiempo B
0 8
33 33
34 33
Columna Eclipse Plus C18
46 x 250mm 5um
Flujo 1 mLmin
Fase Moacutevil
A 01 Aacutecido Foacutermico en Agua
B 01 Aacutecido Foacutermico en ACN
Tiempo B
0 8
12 33
132 33
Columna 46 x 100mm
Poroshell 120 EC-C18
27um
Flujo 185 mLmin
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Comparacioacuten de 46 x 250 mm 5 um con Poroshell
120 EC-C18 46 x 100 mm 27um
min 5 10 15 20 25 30
mAU
0
20
40
60
80
100
97
12
111
16
115
96
126
74
152
48
161
51
164
35
206
87
230
76
292
90
110 bar
5
mAU
0
50
100
150
200
250
17
19
21
89
23
11
26
06
38
67
44
37 45
58
54
50
59
20
70
37
325 bar
min
Ver condiciones en diapositiva anterior
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Mejor Resolucioacuten
linea base
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 52
Anaacutelisis maacutes raacutepido del meacutetodo USP para pastillas de
Simvastatina en Columnas Poroshell 120ndash Ajuste del meacutetodo
46 x 250 mm 5-um
Agilent ZORBAX Eclipse Plus C18
46 x 75 mm 27-um
Agilent Poroshell 120 EC-C18
65 CH3CN 35 39 gL NaH2PO4 (pH 45) 45 oC Sig = 238 8 Ref = 360 100 nm
Flujos 15 mLmin para la columna de 5-um 28 mLmin para la columna Poroshell 120 27um
Requerimiento
USP
5-um
(15 mLmin)
27-um
(28 mLmin)
TR na 9907 1457
krsquo gt 30 5962 5122
N gt 4500 16939 14439
Tf lt 20 109 110
min 2 4 6 8 10
mAU
0
5
10
15
20
25
30
35
40
min 2
mAU
0
5
10
15
20
25
30
35
40
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 53
Ajustes de los parametros cromatograficos en la
transferencia de meacutetodos Escalado del volume de inyeccioacuten
v1 x [(r22 x L2)(r1
2 x L1)] = V2
O bien
v2 = V1 x [(d22 x L2)(d1
2 x L1)]
v volume de inyeccioacuten
r radio de la columna
L longitud de la columna
Ajuste del flujo
F2= F1 x (L2L1 ) x (r2r1 )2
L longitud de la columna
F Flujo
r radio de la columna
Ajuste de la longitud del gradiente
En funcioacuten de la longitud de la columna
L2L1= tg2tg1
En funcioacuten del volumen muerto de columna y del flujo
tG2= tG1 x (V2V1) x (F1F2) t tiempos de gradiente
V volumen muerto de columna
F flujo
Columna ID Volumen muerto aprox
por mm longitud
46mm 100uL
30mm 425uL
21mm 208uL
10mm 047uL
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 54
Notas de Aplicacioacuten en Poroshell 120 y QuEChERS
Determination of Hormones in Shrimp by Agilent 1290 Infinity LC with
Agilent Poroshell 120 LC Column and Agilent QuEChERS for Sample
Preparation (publication 5990-6589EN)
Analysis of Pesticide Residues in Green Tea Using Agilent SampliQ
QuEChERS EN Kit by LCMSMS Detection (publication 5990-
6400EN)
Analysis of Pesticide Residues in Rice Using Agilent Bond Elut
QuEChERS AOAC Kit (publication 5990-8034EN)
Poroshell 120 for pharmaceutical analysis
Poroshell 120 Resources
QuEChERS Applications
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 55
Sumario
bull La columna Poroshell 120 es una nueva alternativa para LC de Alta
Resolucioacuten y Alta Velocidad que puede usarse en cualquier HPLC o UHPLC
bull Con la Poroshell 120 se pueden lograr separaciones de alta eficacia a baja
presioacuten
bull Puede usarse con muestras sucias sin ver una elevacioacuten anormal de la
presioacuten
bull Puede usarse en un meacutetodo USP sin comprometer los Criterios de Ajustes de
Meacutetodo
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Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 56
Soporte Teacutecnico Agilent
Teleacutefono de Atencioacuten al Cliente
901 11 68 90
email customercare_spainagilentcom
wwwagilentcomchem
![Page 24: Análisis de compuestos farmacéuticos en sangre total · PDF fileReducción en el procesamiento, el envío de la muestra, y los ... Gas flow: 10 L/min Nebulizer: 10 psi Sheath gas](https://reader031.vdocuments.site/reader031/viewer/2022030405/5a7a81727f8b9a0a668b45aa/html5/thumbnails/24.jpg)
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 24
Introduccioacuten
Determinacioacuten de compuestos farmaceacuteuticos en anaacutelisis cliacutenicos y
foreacutensicos ADME (DMPK)
La preparacioacuten de muestra va desde la simple precipitacioacuten de
proteinas (PPT) a la maacutes compleja extraccioacuten en fase soacutelida (SPE)
Habitualmente la SPE ha ocupado este vaciacuteo pero simpre hay
espacio para teacutecnicas de preparacioacuten de muestras que son raacutepidas y
baratas de implementar
Se describe un procedimiento mini-QuEChERS modificado con
analisis LCndashMS-MS para la determinacioacuten de faacutermacos en sangre
total
Se analizan nueve diferentes faacutermacos (lidocaina tramadol
amitriptilina biperidina oxazepam lorazepam clorpromazina
diltiazem y naloxona)
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 25
Compuestos farmaceacuteuticos usados en el estudio
Compuesto Nuacutemero CAS Log P (ow) pKa Uso
terapeacuteutico
Lidocaina 137-58-6 24 801 Anesteacutesico local
antiarrithmico
Tramadol 27203-92-5 25 941 Analgesico
Amitriptilina 50-48-6 492 94 Antidepresivo
Biperidena 514-65-8 40 108 Anticolinergico
Oxazepam 604-75-1 223 17 113 Antianxiedad
Lorazepam 846-49-1 247 13 115 Antidepresivo
Clorpromazina 50-53-3 518 93 Antipsycoacutetico
Diltiazem 42399-41-7 363 77 Bloqueante de los
canales del calcio
Naloxona 465-65-6 145 79 Antagonista de los
receptores de opio
Nortriptilina (IS) 72-69-5 565 97
5 ugmL de solucioacuten (9 compuestos) y estandar interno en metanol
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 26
La Teacutecnica de QuEChERS aplicada a las muestras
de sangre
La sangre es el maacutes complejo de los fluidos bioloacutegicos
La determinacioacuten de faacutermacos en sangre total es a menudo necesaria en los
anaacutelisis foreacutensicos dada la dificultad de obtener suero o plasma
Los procedimientos convencionales para analizar faacutermacos en matrices
complejas como la sangre total son complicados
QuEChERS es una teacutecnica de preparacioacuten de muestra que fue desarrollada
para la extraccioacuten de residuos de plaguicidas multi-clase de frutas y vegetales
en 2003
A pesar de que los fluidos bioloacutegicos pueden parecer muy diferentes a una
pieza de fruta sin embargo siguen caminos paralelos
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 27
Caminos paralelos en la preparacioacuten de muestra
Fluidos Bioloacutegicos
Matrices complejas
Rotura de la arquitectura celular
bull Lisis agitacioacuten solvente orgaacutenico
hidroacutelisis
Analitos con un amplio rango de
polaridades
Retirar analito o matriz
Anaacutelisis por LCMSMS GCMS o
GCMSMS
Frutas y Vegetales
Matrices complejas
Rotura de la arquitectura celular
bull Trituracioacuten agitacioacuten solvente
orgaacutenico hidroacutelisis
Analitos con un amplio rango de
polaridades
Retirar analito o matriz
Anaacutelisis por LCMSMS GCMS o
GCMSMS
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 28
Procedimiento baacutesico por SPE para muestras de sangre
El pretratamiento de la sangre total implica la dilucioacuten con una
solucioacuten aacutecida un tampoacuten fosfato o aguaFA
Sonicar 15 minutos rotura de membranas celulares
Centrifugacioacuten
bull Procedimiento de SPE
ndash Acondicionado del cartucho metanol agua
ndash Carga del cartucho muestra
ndash Lavado del cartucho agua con metanol o tampoacuten metanol
ndash Elucioacuten del cartucho eluyente para el anaacutelisis
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 29
Procedimiento Baacutesico QuEChERS
15 g muestra homogeneizada (fortificada)
Antildeadir 15 mL ACN (1 AA) vortex
Antildeadir Sales de Extraccioacuten AOAC agitar
Centrifugar
Transferir 1 u 8 mL a un tubo d-SPE AOAC vortex centrifugar
Transferir al vial de Anaacutelisis
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 30
Ventajas y desventajas del Procedimiento QuEChERS
Ventajas
Extraccioacuten tipo liacutequidoliacutequido
Uso de aacutecido para interrumpir el ligado de proteinas
Exceso de sal para lisar los componentes celulares
Uso de acetonitrilo para facilitar la precipitacioacuten proteacuteica
Uso de SPE dispersiva para adsorber las interferencias de la matriz
Plossl etat J Chrom A 1135 (2006) 19-26
Desventajas
La cantidad de solvente y de muestra requeridos en el meacutetodo no
son ldquobioloacutegicamente adecuadosrdquo
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 31
Propoacutesito de la propuesta mini-Q
Ofrecer un enfoque maacutes adecuado biologicamente
Requirimientos de menores volumenes y tamantildeos de
muestra
Rango de faacutermacos varias polaridades y pKa
Evaluaciacuteoacuten de las interferencias de fondo
Extraccioacuten y datos de recuperacioacuten en un rango
aceptable
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 32
Faacutermacos en sangre Procedimiento mini-QuEChERS
mini-Q
Procedimiento
1 Antildeadir 2 homogeneizadores ceraacutemicos
2 Antildeadir 1 o 2 mL de sangre entera a un tubo de centriacutefuga con tapoacuten de rosca
3 Antildeadir estandar interno vortex
4 Antildeadir 2 mL de ACN acidificado ( 04 FA) vortex 30 seg
5 Antildeadir 500 mg de sales de extraccioacuten agitar vigorsamente 1 minuto centrifugar 5000 rpm 1 min
6 Transferir 1 mL del extraccto al material de d-SPE en tubo de centrifuga vortex centrifugar
7 Antildeadir 200 uL a 800 uL de agua en un vial LC vortex y analizar
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 33
Refinamiento del Procedimiento mini-Q
Paraacutemetros evaluados en la teacutecnica mini-Q
Muestra de sangre total
bull La matriz bioloacutegica maacutes complicada
Adicioacuten de aacutecido tipo y cantidad
bull Efecto en la particioacuten y extraccioacuten
Adicioacuten de las sales de QuEChERS no-tamponadas o
tamponadas con NaAcetato o Citrato
bull Efecto en el extracto inspeccioacuten visual
SPE Dispersiva
bull Limpieza de la matriz y recuperaciones de los compuestos
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 34
Conclusiones del estudio
El ACN con 4 de FA como solvente de extraccioacuten muestra
una lisis maacutes completa de la muestra frente a otros solventes
de extraccioacuten que mostraron una masa soacutelida
Las sales tamponadas AOAC de acetato Soacutedico generan el
extracto maacutes liacutempio y fueron elegidas para la d-SPE
El paso de dSPE no ofrece un clean up adicional para los
meacutetodos de extraccioacuten con sales EN y no tamponadas
principalmente
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 35
Datos de Adquisicoacuten LCMSMS
Compuestos Canales MRM
(mz) Fragmentador
(V) CE (V) RT (min) Delta RT
Lidocaina 1) 23518 gt 861
2) 23518 gt 581
97 11
35
137 04
Tramadol 1) 2642 gt 581
2) 2642 gt 2461
97 15
3
120 04
Amitriptilina 1) 2782 gt 117
2) 2782 gt 105
112 19
19
425 04
Biperidena 1)31223 gt 981
2) 31223 gt 551
123 19
60
423 07
Oxazepam 1) 28706 gt 2409
2) 28706 gt 2689
112 19
7
399 04
Lorazepam 1) 32102 gt 2749
2) 32102 gt 3029
113 15
7
409 04
Clorpromazina 1) 31911 gt 861
2) 31911 gt 581
112 15
43
463 04
Diltiazem 1) 41517 gt 1779
2) 41517 gt 1499
128 19
43
373 04
Naloxona 1) 32816 gt 310
2) 32816 gt 212
123 15
39
082 04
Nortriptilina (IS) 1) 26418 gt 233
2) 26418 gt 91
97 7
19
417 04
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0125
015
0175
02
0225
025
0275
03
0325
035
0375
04
0425
045
0475
05
0525
055
0575
06
0625
065
0675
07
0725
075
0775
08
0825
085
0875
09
0925
095
0975
1
1025
105
1075
11
1125
115
1175
12
1225
125
1275
13
1325
135
1375
+ESI TIC Scan Frag=800V AOAC_BLANK_110228bd
1 1
Counts vs Acquisition Time (min)
05 1 15 2 25
3 35 4 45 5 55 6 65 7 75 8 85 9 95 10
Columna Poroshell 120 EC-C18 27
micro 21 x 100 mm PN 695775-902
Fase Moacutevil
A 5 mM Acetato Amoacutenico pH 5
2080 MeOHagua
B 5 mM Acetato amoacutencio en ACN
Flujo 04mLmin
Inyeccioacuten 10uL
GT (ordmC) 300
GF (lmin) 7
Nebulizador (psi) 40
SGT (ordmC) 400
SFG (lmin) 12
Capilar (V) 3500
NV (V) 500
Condiciones LCMS
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2
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28
29
3
31
32
33
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35
36
37
38
39
4
41
42
43
44
45
46
47
48
49
5
51
+ESI MRM Frag=1120V CID190 (2782000 -gt 1170000) HQC_6d
1 1
Counts vs Acquisition Time (min) 01 02 03 04 05 06 07 08 09 1 11 12 13 14 15 16 17 18 19 2 21 22 23 24 25 26 27 28 29 3 31 32 33 34 35 36 37 38 39 4 41 42 43 44 45 46
Nalo
xo
ne
Lid
oc
ain
e
Tra
mad
ol
Oxazep
am
Lo
razep
am
Bip
eri
de
n
Am
itri
pty
lin
e
Dil
tiazem
Ch
lorp
rom
azin
e
No
rtri
pty
lin
e (
IS)
Cromatograma LCMSMS de 10 ngmL de sangre total fortificada despueacutes
de extraccioacuten mini-QuEChERS AOAC (NaAc) y d-SPE (50mg PSA y
150mg MgSO4)
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03
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1
11
12
13
14
15
16
17
18
19
2
21
22
23
24
25
26
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28
29
3
31
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34
35
36
37
38
39
4
41
42
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44
45
46
47
48
49
5
51
+ESI MRM Frag=1120V CID190 (2782000 -gt 1170000) HQC_6d
1 1
Counts vs Acquisition Time (min) 01 02 03 04 05 06 07 08 09 1 11 12 13 14 15 16 17 18 19 2 21 22 23 24 25 26 27 28 29 3 31 32 33 34 35 36 37 38 39 4 41 42 43 44 45 46
1 x10
415 42 425 43 435 44 445 45 455 46 465 47 475 48 485 49 495 5
505 51 515 52 525 53 535 54 545 55 555 56 565 57
+ESI MRM Frag=1120V CID190 (2871000 -gt 2409000) RE_L_1d 1
Counts vs Acquisition Time (min) 305 31 315 32 325 33 335 34 345 35 355 36 365 37 375 38 385 39 395 4 405 41 415 42 425 43 435 44 445 45 455 46 465 47 475
Relacioacuten sentildealruido para el Oxazepam y Lorazepam a
10 ngmL (10 ppb)
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 39
La Naloxone muestra esta curva de linealidad de10-250 ngmL (ppb) con una R2
= 0991
Las curvas de calibracioacuten se generaron con la respuestra relativa (area pico
analitoarea pico IS) frente a la concentracioacuten relativa (concentracion de
analitoconcentracioacuten de IS)
Ejemplo de curva de linealidad para Naloxona extraido
con mini-QuEChERS
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 40
Recuperacioacuten y Reproducibilidad
Compuesto 50 ngmL Spiked
Recuperacioacuten RSD
100 ngmL Spiked
Recuperacioacuten RSD
Lidocaine 987 157 100 118
Tramadol 105 30 104 82
Amitriptyline 104 21 104 82
Biperidene 97 45 99 82
Oxazepam 770 92 78 86
Lorazepam 819 68 818 86
Chlorpromazine 110 103 105 63
Diltiazem 881 27 917 83
Naloxone 806 90 755 77
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 41
Conclusioacutenes y trabajo posterior
El meacutetodo mini-QuEChERS para la extraccioacuten de compuestos farmaceacuteuticos en
sangre total ofrece una alternativa a otras teacutecnicas de preparacioacuten de muestras
La preparacioacuten de muestras mini-QuEChERS es un enfoque simple facil y
barato que requiere una miacutenima experiencia en preparacioacuten de muestras y
miacutenimo equipamiento
Es un punto de partida para ampliar el numero y las clasificaciones evaluadas
en otras matrices bioloacutegicas y en sangre postmortem
El trabajo futuro incluira combinaciones adecuadas tanto de las sales de
extraccioacuten como de los sorbentes de d-SPE por el meacutetodo mini-QuEChERS
La columna Poroshell 120 ofrece una selectividad diferente y excelentes formas
de pico a lo largo del amplio rango de compuestos farmaceacuteuticos usados en este
estudio
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 42
Referencias
(1) M Anastassiades SJ Lehotay D Štajnbaher and FJ Schenk J AOAC Int 86 4121 (2003)
(2) G Stubbings and T Bigwood Anal Chim Acta 637 68 (2009)
(3) RR Rasmussen IMLD Storm PZH Rasmussen J Smedsgaard and KF Nielsen Anal Bioanal Chem 397 765 (2010)
(4) D Smith and K Lynam GCμECD analysis and confirmation of PCBs in fish tissue with Agilent JampW DB-35ms and DB-XLB GC columns Agilent Technologies 5990-6236EN (2010)
(5) F Ploumlssl M Giera and F Bracher J Chrom A 1135 19 (2006)
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 43
MEJORAR LA PRODUCTIVIDAD EN
HPLC ESTAacuteNDAR CON COLUMNAS
POROSHELL
Page 43
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 44
Columnas Poroshell 120 para HPLC y UHPLC
bull 80-90 de eficacia de las sub 2um
bull A presiones un ~40-50 maacutes bajas
bull Con un tamantildeo de partiacutecula de 27um
bull Con una frita de entrada de 2um
bull Con el doble de resolucioacuten de una
columna de 35um
bull Con un liacutemite de presioacuten de 600 bar
bull La partiacutecula tiene un nuacutecleo soacutelido
(17um) y una cubierta exterior porosa
de 05um como zona de difusioacuten
Las Columnas Poroshell 120 tienen
Page 44
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 45
Poroshell 120 proporciona Eficacia Suficiente
Page 45
Flujo 0582 mLmin AcetonitriloAgua (6040)
Volumen de Inyeccioacuten 4 microL
TCC 26 oC
DAD Sig=2544nm Ref=360100nm
Muestra Muestra de test RRLC
(PN 5188-6529) inoculada con
50 microL 2 mgmL Tiourea en
aguaacetonitrilo (6535)
25 5 75 10
mAU
0
200
400
600
06
46
0
82
6
11
48
15
18
20
16
2
22
3
28
16
41
32
62
73
97
53
larr N = 25053 Presioacuten = 182 bar
Poroshell 120 EC-C18 30 x 100 mm 27 um
min 25 5 75 10 125
mAU
0
200
400
600
06
49
0
86
5
12
75
17
56
24
18
27
05
34
94
52
81
82
18
13
04
1
larr N = 27295 Presioacuten = 386 bar
Eclipse Plus C18 30 x 100 mm 18 um
gt90 de la Eficacia de una 18um
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 46
iquestEn queacute tipos de instrumentos puede usar
Columnas Poroshell 120 HPLCrsquos y UHPLCrsquos
Consideraciones en UHPLC
bull Las columnas Poroshell 120 tienen un liacutemite de presioacuten de 600 bar
bull Los UHPLC estaacuten ajustados para columnas de bajo volumen por lo tanto las
Poroshell pueden usarse en todos los UHPLC
Consideraciones en HPLC
bull Las Columnas Poroshell 120 trabajan bien por debajo de 400 bar
bull Minimize los volumenes extra columna para las columnas 21 y 30mm ID ndash
siga las instrucciones dadas para las columnas RRHT (18um 600 bar)
bull Use en el detector velocidades adecuadas de adquisicioacuten para picos
estrechos de alta eficacia
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Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 47
Con una frita de 2 um Poroshell 120 no se bloquea
Muestras Complejas- Plasma
Diflusinal in Plasma
0
20
40
60
80
100
120
140
160
180
200
220
240
260
280
300
320
340
360
380
400
1 501 1001 1501 2001 2501
Injections
Pre
ssu
re
0
20000
40000
60000
80000
100000
120000
140000
160000
180000
200000
Eff
icie
ncy (
N)
End Press
Plates
Columna Poroshell 120 EC-C18 30 x 50mm 27um LC Agilent 1200 RRLC (SL)
Muestra Plasma Precipitado 2 partes Plasma 7 Partes 2080 Agua-MeCN w01 Aacutecido Foacutermico con 1 Parte de Diflusinal en
5050 Agua-MeCN 10 ugml (Concentracion Final Diflusinal 1 ugml) Agitado y dejado reposar 10 minutos
No Centrifugado No Filtrado
Volumen de Inyeccioacuten 1ul
Solvente A Agua w01 TFA
Solvente B MeCN w008 TFA
Flujo 1 mlmin 1 ul inyeccioacuten
Tiempo B
0 20
05 90
06 90
11 20
25 20
Page 47
Diflusinal es un anti-inflamatorio no esteroidal anaacutelogo
a la aspirina desarrollado por Merck Sharp amp Dohme
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 48
Las Columnas Superficialmente Porosas Pueden
Usarse cumpliendo los Requirimientos USP
De la lista USP de empaquetamientos de columnas LC 42009
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Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 49
Criterios de Ajuste de Meacutetodos USP y FDA Criterios de Ajuste de Meacutetodos de Dimensiones de Columna
Paraacutemetro Especificaciones Maacuteximas ComentariosEjemplos
Longitud de Columna 70 250mm 75mm
150mm 50mm
Diaacutemetro Interno de
Columna
25 (FDA ORA-LAB 545)
USP ndash 25 ID Columna puede ajustarse si la
velocidad lineal es constante
46 mm 30 mm (-35)
46 mm 21 mm (-54)
30 mm 21 mm (-30)
Flow Rate 50
Volumen de Inyeccioacuten
Reducir tanto como se necesitendash
debe cumplir los liacutemites de
deteccioacuten y precisioacuten
Si cambia a una columna maacutes
corta haga el cambio apropiado
en el volumen de inyeccioacuten
Tamantildeo de Partiacutecula Reducir hasta el 50
(no se puede aumentar)
Puede cambiar la longitud de columna y el
tamantildeo de partiacutecula para mantener la misma
Rs
5um 35um (-30)
5um 27um (-46) Cambiado en 22409 ndash Para la copia oficial y actual ir a
httpwwwfdagovScienceResearchFieldSciencedefaulthtm
USP 30 Second Supplement Revisions PF34(5) en proceso
Ver ldquo Stimuli articlerdquo en Pharmacopeial Forum 2009 35(6)
Page 49
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 50
Comparacioacuten de 46 x 250 mm 5 um con Poroshell
120 EC-C18 46 x 100 mm 27um
min 5 10 15 20 25 30
mAU
0
20
40
60
80
100
97
12
111
16
115
96
126
74
152
48
161
51
164
35
206
87
230
76
292
90
min 5 10 15 20 25 30
mAU
0
50
100
150
200
250
17
19
21
89
23
11
26
06
38
67
44
37 45
58
54
50
59
20
70
37
Anaacutelisis maacutes raacutepido(columna maacutes corta flujo maacutes alto)
Mayor sensibilidad(partiacutecula maacutes pequentildeapico maacutes estrecho)
Maacutes optimizado (un anaacutelisis maacutes raacutepido permite ajustar mejor)
Ambos anaacutelisis en Agilent 1100 G1315B DAD (bajo 400 bar)
No se requiere cambio en la preparacioacuten de muestra frita de entrada
de 2 micras en ambas columnas
325 bar
110 bar
Sulfadiazina
Sulfatiazol
Sulfapiridina
Sulfamerazina
Sulfametazina
Sulfametazol
Sulfametoxipiridazina
Sulfacloropiridazina
Sulfametoxazol
Sulfadimetoxina
Tiempo B
0 8
33 33
34 33
Columna Eclipse Plus C18
46 x 250mm 5um
Flujo 1 mLmin
Fase Moacutevil
A 01 Aacutecido Foacutermico en Agua
B 01 Aacutecido Foacutermico en ACN
Tiempo B
0 8
12 33
132 33
Columna 46 x 100mm
Poroshell 120 EC-C18
27um
Flujo 185 mLmin
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Comparacioacuten de 46 x 250 mm 5 um con Poroshell
120 EC-C18 46 x 100 mm 27um
min 5 10 15 20 25 30
mAU
0
20
40
60
80
100
97
12
111
16
115
96
126
74
152
48
161
51
164
35
206
87
230
76
292
90
110 bar
5
mAU
0
50
100
150
200
250
17
19
21
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26
06
38
67
44
37 45
58
54
50
59
20
70
37
325 bar
min
Ver condiciones en diapositiva anterior
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Mejor Resolucioacuten
linea base
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 52
Anaacutelisis maacutes raacutepido del meacutetodo USP para pastillas de
Simvastatina en Columnas Poroshell 120ndash Ajuste del meacutetodo
46 x 250 mm 5-um
Agilent ZORBAX Eclipse Plus C18
46 x 75 mm 27-um
Agilent Poroshell 120 EC-C18
65 CH3CN 35 39 gL NaH2PO4 (pH 45) 45 oC Sig = 238 8 Ref = 360 100 nm
Flujos 15 mLmin para la columna de 5-um 28 mLmin para la columna Poroshell 120 27um
Requerimiento
USP
5-um
(15 mLmin)
27-um
(28 mLmin)
TR na 9907 1457
krsquo gt 30 5962 5122
N gt 4500 16939 14439
Tf lt 20 109 110
min 2 4 6 8 10
mAU
0
5
10
15
20
25
30
35
40
min 2
mAU
0
5
10
15
20
25
30
35
40
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 53
Ajustes de los parametros cromatograficos en la
transferencia de meacutetodos Escalado del volume de inyeccioacuten
v1 x [(r22 x L2)(r1
2 x L1)] = V2
O bien
v2 = V1 x [(d22 x L2)(d1
2 x L1)]
v volume de inyeccioacuten
r radio de la columna
L longitud de la columna
Ajuste del flujo
F2= F1 x (L2L1 ) x (r2r1 )2
L longitud de la columna
F Flujo
r radio de la columna
Ajuste de la longitud del gradiente
En funcioacuten de la longitud de la columna
L2L1= tg2tg1
En funcioacuten del volumen muerto de columna y del flujo
tG2= tG1 x (V2V1) x (F1F2) t tiempos de gradiente
V volumen muerto de columna
F flujo
Columna ID Volumen muerto aprox
por mm longitud
46mm 100uL
30mm 425uL
21mm 208uL
10mm 047uL
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Notas de Aplicacioacuten en Poroshell 120 y QuEChERS
Determination of Hormones in Shrimp by Agilent 1290 Infinity LC with
Agilent Poroshell 120 LC Column and Agilent QuEChERS for Sample
Preparation (publication 5990-6589EN)
Analysis of Pesticide Residues in Green Tea Using Agilent SampliQ
QuEChERS EN Kit by LCMSMS Detection (publication 5990-
6400EN)
Analysis of Pesticide Residues in Rice Using Agilent Bond Elut
QuEChERS AOAC Kit (publication 5990-8034EN)
Poroshell 120 for pharmaceutical analysis
Poroshell 120 Resources
QuEChERS Applications
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Sumario
bull La columna Poroshell 120 es una nueva alternativa para LC de Alta
Resolucioacuten y Alta Velocidad que puede usarse en cualquier HPLC o UHPLC
bull Con la Poroshell 120 se pueden lograr separaciones de alta eficacia a baja
presioacuten
bull Puede usarse con muestras sucias sin ver una elevacioacuten anormal de la
presioacuten
bull Puede usarse en un meacutetodo USP sin comprometer los Criterios de Ajustes de
Meacutetodo
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Soporte Teacutecnico Agilent
Teleacutefono de Atencioacuten al Cliente
901 11 68 90
email customercare_spainagilentcom
wwwagilentcomchem
![Page 25: Análisis de compuestos farmacéuticos en sangre total · PDF fileReducción en el procesamiento, el envío de la muestra, y los ... Gas flow: 10 L/min Nebulizer: 10 psi Sheath gas](https://reader031.vdocuments.site/reader031/viewer/2022030405/5a7a81727f8b9a0a668b45aa/html5/thumbnails/25.jpg)
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Compuestos farmaceacuteuticos usados en el estudio
Compuesto Nuacutemero CAS Log P (ow) pKa Uso
terapeacuteutico
Lidocaina 137-58-6 24 801 Anesteacutesico local
antiarrithmico
Tramadol 27203-92-5 25 941 Analgesico
Amitriptilina 50-48-6 492 94 Antidepresivo
Biperidena 514-65-8 40 108 Anticolinergico
Oxazepam 604-75-1 223 17 113 Antianxiedad
Lorazepam 846-49-1 247 13 115 Antidepresivo
Clorpromazina 50-53-3 518 93 Antipsycoacutetico
Diltiazem 42399-41-7 363 77 Bloqueante de los
canales del calcio
Naloxona 465-65-6 145 79 Antagonista de los
receptores de opio
Nortriptilina (IS) 72-69-5 565 97
5 ugmL de solucioacuten (9 compuestos) y estandar interno en metanol
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La Teacutecnica de QuEChERS aplicada a las muestras
de sangre
La sangre es el maacutes complejo de los fluidos bioloacutegicos
La determinacioacuten de faacutermacos en sangre total es a menudo necesaria en los
anaacutelisis foreacutensicos dada la dificultad de obtener suero o plasma
Los procedimientos convencionales para analizar faacutermacos en matrices
complejas como la sangre total son complicados
QuEChERS es una teacutecnica de preparacioacuten de muestra que fue desarrollada
para la extraccioacuten de residuos de plaguicidas multi-clase de frutas y vegetales
en 2003
A pesar de que los fluidos bioloacutegicos pueden parecer muy diferentes a una
pieza de fruta sin embargo siguen caminos paralelos
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 27
Caminos paralelos en la preparacioacuten de muestra
Fluidos Bioloacutegicos
Matrices complejas
Rotura de la arquitectura celular
bull Lisis agitacioacuten solvente orgaacutenico
hidroacutelisis
Analitos con un amplio rango de
polaridades
Retirar analito o matriz
Anaacutelisis por LCMSMS GCMS o
GCMSMS
Frutas y Vegetales
Matrices complejas
Rotura de la arquitectura celular
bull Trituracioacuten agitacioacuten solvente
orgaacutenico hidroacutelisis
Analitos con un amplio rango de
polaridades
Retirar analito o matriz
Anaacutelisis por LCMSMS GCMS o
GCMSMS
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Procedimiento baacutesico por SPE para muestras de sangre
El pretratamiento de la sangre total implica la dilucioacuten con una
solucioacuten aacutecida un tampoacuten fosfato o aguaFA
Sonicar 15 minutos rotura de membranas celulares
Centrifugacioacuten
bull Procedimiento de SPE
ndash Acondicionado del cartucho metanol agua
ndash Carga del cartucho muestra
ndash Lavado del cartucho agua con metanol o tampoacuten metanol
ndash Elucioacuten del cartucho eluyente para el anaacutelisis
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 29
Procedimiento Baacutesico QuEChERS
15 g muestra homogeneizada (fortificada)
Antildeadir 15 mL ACN (1 AA) vortex
Antildeadir Sales de Extraccioacuten AOAC agitar
Centrifugar
Transferir 1 u 8 mL a un tubo d-SPE AOAC vortex centrifugar
Transferir al vial de Anaacutelisis
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 30
Ventajas y desventajas del Procedimiento QuEChERS
Ventajas
Extraccioacuten tipo liacutequidoliacutequido
Uso de aacutecido para interrumpir el ligado de proteinas
Exceso de sal para lisar los componentes celulares
Uso de acetonitrilo para facilitar la precipitacioacuten proteacuteica
Uso de SPE dispersiva para adsorber las interferencias de la matriz
Plossl etat J Chrom A 1135 (2006) 19-26
Desventajas
La cantidad de solvente y de muestra requeridos en el meacutetodo no
son ldquobioloacutegicamente adecuadosrdquo
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 31
Propoacutesito de la propuesta mini-Q
Ofrecer un enfoque maacutes adecuado biologicamente
Requirimientos de menores volumenes y tamantildeos de
muestra
Rango de faacutermacos varias polaridades y pKa
Evaluaciacuteoacuten de las interferencias de fondo
Extraccioacuten y datos de recuperacioacuten en un rango
aceptable
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 32
Faacutermacos en sangre Procedimiento mini-QuEChERS
mini-Q
Procedimiento
1 Antildeadir 2 homogeneizadores ceraacutemicos
2 Antildeadir 1 o 2 mL de sangre entera a un tubo de centriacutefuga con tapoacuten de rosca
3 Antildeadir estandar interno vortex
4 Antildeadir 2 mL de ACN acidificado ( 04 FA) vortex 30 seg
5 Antildeadir 500 mg de sales de extraccioacuten agitar vigorsamente 1 minuto centrifugar 5000 rpm 1 min
6 Transferir 1 mL del extraccto al material de d-SPE en tubo de centrifuga vortex centrifugar
7 Antildeadir 200 uL a 800 uL de agua en un vial LC vortex y analizar
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Refinamiento del Procedimiento mini-Q
Paraacutemetros evaluados en la teacutecnica mini-Q
Muestra de sangre total
bull La matriz bioloacutegica maacutes complicada
Adicioacuten de aacutecido tipo y cantidad
bull Efecto en la particioacuten y extraccioacuten
Adicioacuten de las sales de QuEChERS no-tamponadas o
tamponadas con NaAcetato o Citrato
bull Efecto en el extracto inspeccioacuten visual
SPE Dispersiva
bull Limpieza de la matriz y recuperaciones de los compuestos
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 34
Conclusiones del estudio
El ACN con 4 de FA como solvente de extraccioacuten muestra
una lisis maacutes completa de la muestra frente a otros solventes
de extraccioacuten que mostraron una masa soacutelida
Las sales tamponadas AOAC de acetato Soacutedico generan el
extracto maacutes liacutempio y fueron elegidas para la d-SPE
El paso de dSPE no ofrece un clean up adicional para los
meacutetodos de extraccioacuten con sales EN y no tamponadas
principalmente
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 35
Datos de Adquisicoacuten LCMSMS
Compuestos Canales MRM
(mz) Fragmentador
(V) CE (V) RT (min) Delta RT
Lidocaina 1) 23518 gt 861
2) 23518 gt 581
97 11
35
137 04
Tramadol 1) 2642 gt 581
2) 2642 gt 2461
97 15
3
120 04
Amitriptilina 1) 2782 gt 117
2) 2782 gt 105
112 19
19
425 04
Biperidena 1)31223 gt 981
2) 31223 gt 551
123 19
60
423 07
Oxazepam 1) 28706 gt 2409
2) 28706 gt 2689
112 19
7
399 04
Lorazepam 1) 32102 gt 2749
2) 32102 gt 3029
113 15
7
409 04
Clorpromazina 1) 31911 gt 861
2) 31911 gt 581
112 15
43
463 04
Diltiazem 1) 41517 gt 1779
2) 41517 gt 1499
128 19
43
373 04
Naloxona 1) 32816 gt 310
2) 32816 gt 212
123 15
39
082 04
Nortriptilina (IS) 1) 26418 gt 233
2) 26418 gt 91
97 7
19
417 04
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045
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05
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055
0575
06
0625
065
0675
07
0725
075
0775
08
0825
085
0875
09
0925
095
0975
1
1025
105
1075
11
1125
115
1175
12
1225
125
1275
13
1325
135
1375
+ESI TIC Scan Frag=800V AOAC_BLANK_110228bd
1 1
Counts vs Acquisition Time (min)
05 1 15 2 25
3 35 4 45 5 55 6 65 7 75 8 85 9 95 10
Columna Poroshell 120 EC-C18 27
micro 21 x 100 mm PN 695775-902
Fase Moacutevil
A 5 mM Acetato Amoacutenico pH 5
2080 MeOHagua
B 5 mM Acetato amoacutencio en ACN
Flujo 04mLmin
Inyeccioacuten 10uL
GT (ordmC) 300
GF (lmin) 7
Nebulizador (psi) 40
SGT (ordmC) 400
SFG (lmin) 12
Capilar (V) 3500
NV (V) 500
Condiciones LCMS
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4
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48
49
5
51
+ESI MRM Frag=1120V CID190 (2782000 -gt 1170000) HQC_6d
1 1
Counts vs Acquisition Time (min) 01 02 03 04 05 06 07 08 09 1 11 12 13 14 15 16 17 18 19 2 21 22 23 24 25 26 27 28 29 3 31 32 33 34 35 36 37 38 39 4 41 42 43 44 45 46
Nalo
xo
ne
Lid
oc
ain
e
Tra
mad
ol
Oxazep
am
Lo
razep
am
Bip
eri
de
n
Am
itri
pty
lin
e
Dil
tiazem
Ch
lorp
rom
azin
e
No
rtri
pty
lin
e (
IS)
Cromatograma LCMSMS de 10 ngmL de sangre total fortificada despueacutes
de extraccioacuten mini-QuEChERS AOAC (NaAc) y d-SPE (50mg PSA y
150mg MgSO4)
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17
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2
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39
4
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48
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5
51
+ESI MRM Frag=1120V CID190 (2782000 -gt 1170000) HQC_6d
1 1
Counts vs Acquisition Time (min) 01 02 03 04 05 06 07 08 09 1 11 12 13 14 15 16 17 18 19 2 21 22 23 24 25 26 27 28 29 3 31 32 33 34 35 36 37 38 39 4 41 42 43 44 45 46
1 x10
415 42 425 43 435 44 445 45 455 46 465 47 475 48 485 49 495 5
505 51 515 52 525 53 535 54 545 55 555 56 565 57
+ESI MRM Frag=1120V CID190 (2871000 -gt 2409000) RE_L_1d 1
Counts vs Acquisition Time (min) 305 31 315 32 325 33 335 34 345 35 355 36 365 37 375 38 385 39 395 4 405 41 415 42 425 43 435 44 445 45 455 46 465 47 475
Relacioacuten sentildealruido para el Oxazepam y Lorazepam a
10 ngmL (10 ppb)
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 39
La Naloxone muestra esta curva de linealidad de10-250 ngmL (ppb) con una R2
= 0991
Las curvas de calibracioacuten se generaron con la respuestra relativa (area pico
analitoarea pico IS) frente a la concentracioacuten relativa (concentracion de
analitoconcentracioacuten de IS)
Ejemplo de curva de linealidad para Naloxona extraido
con mini-QuEChERS
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 40
Recuperacioacuten y Reproducibilidad
Compuesto 50 ngmL Spiked
Recuperacioacuten RSD
100 ngmL Spiked
Recuperacioacuten RSD
Lidocaine 987 157 100 118
Tramadol 105 30 104 82
Amitriptyline 104 21 104 82
Biperidene 97 45 99 82
Oxazepam 770 92 78 86
Lorazepam 819 68 818 86
Chlorpromazine 110 103 105 63
Diltiazem 881 27 917 83
Naloxone 806 90 755 77
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 41
Conclusioacutenes y trabajo posterior
El meacutetodo mini-QuEChERS para la extraccioacuten de compuestos farmaceacuteuticos en
sangre total ofrece una alternativa a otras teacutecnicas de preparacioacuten de muestras
La preparacioacuten de muestras mini-QuEChERS es un enfoque simple facil y
barato que requiere una miacutenima experiencia en preparacioacuten de muestras y
miacutenimo equipamiento
Es un punto de partida para ampliar el numero y las clasificaciones evaluadas
en otras matrices bioloacutegicas y en sangre postmortem
El trabajo futuro incluira combinaciones adecuadas tanto de las sales de
extraccioacuten como de los sorbentes de d-SPE por el meacutetodo mini-QuEChERS
La columna Poroshell 120 ofrece una selectividad diferente y excelentes formas
de pico a lo largo del amplio rango de compuestos farmaceacuteuticos usados en este
estudio
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 42
Referencias
(1) M Anastassiades SJ Lehotay D Štajnbaher and FJ Schenk J AOAC Int 86 4121 (2003)
(2) G Stubbings and T Bigwood Anal Chim Acta 637 68 (2009)
(3) RR Rasmussen IMLD Storm PZH Rasmussen J Smedsgaard and KF Nielsen Anal Bioanal Chem 397 765 (2010)
(4) D Smith and K Lynam GCμECD analysis and confirmation of PCBs in fish tissue with Agilent JampW DB-35ms and DB-XLB GC columns Agilent Technologies 5990-6236EN (2010)
(5) F Ploumlssl M Giera and F Bracher J Chrom A 1135 19 (2006)
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 43
MEJORAR LA PRODUCTIVIDAD EN
HPLC ESTAacuteNDAR CON COLUMNAS
POROSHELL
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Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 44
Columnas Poroshell 120 para HPLC y UHPLC
bull 80-90 de eficacia de las sub 2um
bull A presiones un ~40-50 maacutes bajas
bull Con un tamantildeo de partiacutecula de 27um
bull Con una frita de entrada de 2um
bull Con el doble de resolucioacuten de una
columna de 35um
bull Con un liacutemite de presioacuten de 600 bar
bull La partiacutecula tiene un nuacutecleo soacutelido
(17um) y una cubierta exterior porosa
de 05um como zona de difusioacuten
Las Columnas Poroshell 120 tienen
Page 44
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 45
Poroshell 120 proporciona Eficacia Suficiente
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Flujo 0582 mLmin AcetonitriloAgua (6040)
Volumen de Inyeccioacuten 4 microL
TCC 26 oC
DAD Sig=2544nm Ref=360100nm
Muestra Muestra de test RRLC
(PN 5188-6529) inoculada con
50 microL 2 mgmL Tiourea en
aguaacetonitrilo (6535)
25 5 75 10
mAU
0
200
400
600
06
46
0
82
6
11
48
15
18
20
16
2
22
3
28
16
41
32
62
73
97
53
larr N = 25053 Presioacuten = 182 bar
Poroshell 120 EC-C18 30 x 100 mm 27 um
min 25 5 75 10 125
mAU
0
200
400
600
06
49
0
86
5
12
75
17
56
24
18
27
05
34
94
52
81
82
18
13
04
1
larr N = 27295 Presioacuten = 386 bar
Eclipse Plus C18 30 x 100 mm 18 um
gt90 de la Eficacia de una 18um
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 46
iquestEn queacute tipos de instrumentos puede usar
Columnas Poroshell 120 HPLCrsquos y UHPLCrsquos
Consideraciones en UHPLC
bull Las columnas Poroshell 120 tienen un liacutemite de presioacuten de 600 bar
bull Los UHPLC estaacuten ajustados para columnas de bajo volumen por lo tanto las
Poroshell pueden usarse en todos los UHPLC
Consideraciones en HPLC
bull Las Columnas Poroshell 120 trabajan bien por debajo de 400 bar
bull Minimize los volumenes extra columna para las columnas 21 y 30mm ID ndash
siga las instrucciones dadas para las columnas RRHT (18um 600 bar)
bull Use en el detector velocidades adecuadas de adquisicioacuten para picos
estrechos de alta eficacia
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Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 47
Con una frita de 2 um Poroshell 120 no se bloquea
Muestras Complejas- Plasma
Diflusinal in Plasma
0
20
40
60
80
100
120
140
160
180
200
220
240
260
280
300
320
340
360
380
400
1 501 1001 1501 2001 2501
Injections
Pre
ssu
re
0
20000
40000
60000
80000
100000
120000
140000
160000
180000
200000
Eff
icie
ncy (
N)
End Press
Plates
Columna Poroshell 120 EC-C18 30 x 50mm 27um LC Agilent 1200 RRLC (SL)
Muestra Plasma Precipitado 2 partes Plasma 7 Partes 2080 Agua-MeCN w01 Aacutecido Foacutermico con 1 Parte de Diflusinal en
5050 Agua-MeCN 10 ugml (Concentracion Final Diflusinal 1 ugml) Agitado y dejado reposar 10 minutos
No Centrifugado No Filtrado
Volumen de Inyeccioacuten 1ul
Solvente A Agua w01 TFA
Solvente B MeCN w008 TFA
Flujo 1 mlmin 1 ul inyeccioacuten
Tiempo B
0 20
05 90
06 90
11 20
25 20
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Diflusinal es un anti-inflamatorio no esteroidal anaacutelogo
a la aspirina desarrollado por Merck Sharp amp Dohme
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 48
Las Columnas Superficialmente Porosas Pueden
Usarse cumpliendo los Requirimientos USP
De la lista USP de empaquetamientos de columnas LC 42009
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Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 49
Criterios de Ajuste de Meacutetodos USP y FDA Criterios de Ajuste de Meacutetodos de Dimensiones de Columna
Paraacutemetro Especificaciones Maacuteximas ComentariosEjemplos
Longitud de Columna 70 250mm 75mm
150mm 50mm
Diaacutemetro Interno de
Columna
25 (FDA ORA-LAB 545)
USP ndash 25 ID Columna puede ajustarse si la
velocidad lineal es constante
46 mm 30 mm (-35)
46 mm 21 mm (-54)
30 mm 21 mm (-30)
Flow Rate 50
Volumen de Inyeccioacuten
Reducir tanto como se necesitendash
debe cumplir los liacutemites de
deteccioacuten y precisioacuten
Si cambia a una columna maacutes
corta haga el cambio apropiado
en el volumen de inyeccioacuten
Tamantildeo de Partiacutecula Reducir hasta el 50
(no se puede aumentar)
Puede cambiar la longitud de columna y el
tamantildeo de partiacutecula para mantener la misma
Rs
5um 35um (-30)
5um 27um (-46) Cambiado en 22409 ndash Para la copia oficial y actual ir a
httpwwwfdagovScienceResearchFieldSciencedefaulthtm
USP 30 Second Supplement Revisions PF34(5) en proceso
Ver ldquo Stimuli articlerdquo en Pharmacopeial Forum 2009 35(6)
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Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 50
Comparacioacuten de 46 x 250 mm 5 um con Poroshell
120 EC-C18 46 x 100 mm 27um
min 5 10 15 20 25 30
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20
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37
Anaacutelisis maacutes raacutepido(columna maacutes corta flujo maacutes alto)
Mayor sensibilidad(partiacutecula maacutes pequentildeapico maacutes estrecho)
Maacutes optimizado (un anaacutelisis maacutes raacutepido permite ajustar mejor)
Ambos anaacutelisis en Agilent 1100 G1315B DAD (bajo 400 bar)
No se requiere cambio en la preparacioacuten de muestra frita de entrada
de 2 micras en ambas columnas
325 bar
110 bar
Sulfadiazina
Sulfatiazol
Sulfapiridina
Sulfamerazina
Sulfametazina
Sulfametazol
Sulfametoxipiridazina
Sulfacloropiridazina
Sulfametoxazol
Sulfadimetoxina
Tiempo B
0 8
33 33
34 33
Columna Eclipse Plus C18
46 x 250mm 5um
Flujo 1 mLmin
Fase Moacutevil
A 01 Aacutecido Foacutermico en Agua
B 01 Aacutecido Foacutermico en ACN
Tiempo B
0 8
12 33
132 33
Columna 46 x 100mm
Poroshell 120 EC-C18
27um
Flujo 185 mLmin
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Comparacioacuten de 46 x 250 mm 5 um con Poroshell
120 EC-C18 46 x 100 mm 27um
min 5 10 15 20 25 30
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230
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37
325 bar
min
Ver condiciones en diapositiva anterior
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Mejor Resolucioacuten
linea base
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Anaacutelisis maacutes raacutepido del meacutetodo USP para pastillas de
Simvastatina en Columnas Poroshell 120ndash Ajuste del meacutetodo
46 x 250 mm 5-um
Agilent ZORBAX Eclipse Plus C18
46 x 75 mm 27-um
Agilent Poroshell 120 EC-C18
65 CH3CN 35 39 gL NaH2PO4 (pH 45) 45 oC Sig = 238 8 Ref = 360 100 nm
Flujos 15 mLmin para la columna de 5-um 28 mLmin para la columna Poroshell 120 27um
Requerimiento
USP
5-um
(15 mLmin)
27-um
(28 mLmin)
TR na 9907 1457
krsquo gt 30 5962 5122
N gt 4500 16939 14439
Tf lt 20 109 110
min 2 4 6 8 10
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min 2
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Ajustes de los parametros cromatograficos en la
transferencia de meacutetodos Escalado del volume de inyeccioacuten
v1 x [(r22 x L2)(r1
2 x L1)] = V2
O bien
v2 = V1 x [(d22 x L2)(d1
2 x L1)]
v volume de inyeccioacuten
r radio de la columna
L longitud de la columna
Ajuste del flujo
F2= F1 x (L2L1 ) x (r2r1 )2
L longitud de la columna
F Flujo
r radio de la columna
Ajuste de la longitud del gradiente
En funcioacuten de la longitud de la columna
L2L1= tg2tg1
En funcioacuten del volumen muerto de columna y del flujo
tG2= tG1 x (V2V1) x (F1F2) t tiempos de gradiente
V volumen muerto de columna
F flujo
Columna ID Volumen muerto aprox
por mm longitud
46mm 100uL
30mm 425uL
21mm 208uL
10mm 047uL
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Notas de Aplicacioacuten en Poroshell 120 y QuEChERS
Determination of Hormones in Shrimp by Agilent 1290 Infinity LC with
Agilent Poroshell 120 LC Column and Agilent QuEChERS for Sample
Preparation (publication 5990-6589EN)
Analysis of Pesticide Residues in Green Tea Using Agilent SampliQ
QuEChERS EN Kit by LCMSMS Detection (publication 5990-
6400EN)
Analysis of Pesticide Residues in Rice Using Agilent Bond Elut
QuEChERS AOAC Kit (publication 5990-8034EN)
Poroshell 120 for pharmaceutical analysis
Poroshell 120 Resources
QuEChERS Applications
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Sumario
bull La columna Poroshell 120 es una nueva alternativa para LC de Alta
Resolucioacuten y Alta Velocidad que puede usarse en cualquier HPLC o UHPLC
bull Con la Poroshell 120 se pueden lograr separaciones de alta eficacia a baja
presioacuten
bull Puede usarse con muestras sucias sin ver una elevacioacuten anormal de la
presioacuten
bull Puede usarse en un meacutetodo USP sin comprometer los Criterios de Ajustes de
Meacutetodo
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Soporte Teacutecnico Agilent
Teleacutefono de Atencioacuten al Cliente
901 11 68 90
email customercare_spainagilentcom
wwwagilentcomchem
![Page 26: Análisis de compuestos farmacéuticos en sangre total · PDF fileReducción en el procesamiento, el envío de la muestra, y los ... Gas flow: 10 L/min Nebulizer: 10 psi Sheath gas](https://reader031.vdocuments.site/reader031/viewer/2022030405/5a7a81727f8b9a0a668b45aa/html5/thumbnails/26.jpg)
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La Teacutecnica de QuEChERS aplicada a las muestras
de sangre
La sangre es el maacutes complejo de los fluidos bioloacutegicos
La determinacioacuten de faacutermacos en sangre total es a menudo necesaria en los
anaacutelisis foreacutensicos dada la dificultad de obtener suero o plasma
Los procedimientos convencionales para analizar faacutermacos en matrices
complejas como la sangre total son complicados
QuEChERS es una teacutecnica de preparacioacuten de muestra que fue desarrollada
para la extraccioacuten de residuos de plaguicidas multi-clase de frutas y vegetales
en 2003
A pesar de que los fluidos bioloacutegicos pueden parecer muy diferentes a una
pieza de fruta sin embargo siguen caminos paralelos
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Caminos paralelos en la preparacioacuten de muestra
Fluidos Bioloacutegicos
Matrices complejas
Rotura de la arquitectura celular
bull Lisis agitacioacuten solvente orgaacutenico
hidroacutelisis
Analitos con un amplio rango de
polaridades
Retirar analito o matriz
Anaacutelisis por LCMSMS GCMS o
GCMSMS
Frutas y Vegetales
Matrices complejas
Rotura de la arquitectura celular
bull Trituracioacuten agitacioacuten solvente
orgaacutenico hidroacutelisis
Analitos con un amplio rango de
polaridades
Retirar analito o matriz
Anaacutelisis por LCMSMS GCMS o
GCMSMS
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Procedimiento baacutesico por SPE para muestras de sangre
El pretratamiento de la sangre total implica la dilucioacuten con una
solucioacuten aacutecida un tampoacuten fosfato o aguaFA
Sonicar 15 minutos rotura de membranas celulares
Centrifugacioacuten
bull Procedimiento de SPE
ndash Acondicionado del cartucho metanol agua
ndash Carga del cartucho muestra
ndash Lavado del cartucho agua con metanol o tampoacuten metanol
ndash Elucioacuten del cartucho eluyente para el anaacutelisis
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 29
Procedimiento Baacutesico QuEChERS
15 g muestra homogeneizada (fortificada)
Antildeadir 15 mL ACN (1 AA) vortex
Antildeadir Sales de Extraccioacuten AOAC agitar
Centrifugar
Transferir 1 u 8 mL a un tubo d-SPE AOAC vortex centrifugar
Transferir al vial de Anaacutelisis
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 30
Ventajas y desventajas del Procedimiento QuEChERS
Ventajas
Extraccioacuten tipo liacutequidoliacutequido
Uso de aacutecido para interrumpir el ligado de proteinas
Exceso de sal para lisar los componentes celulares
Uso de acetonitrilo para facilitar la precipitacioacuten proteacuteica
Uso de SPE dispersiva para adsorber las interferencias de la matriz
Plossl etat J Chrom A 1135 (2006) 19-26
Desventajas
La cantidad de solvente y de muestra requeridos en el meacutetodo no
son ldquobioloacutegicamente adecuadosrdquo
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Propoacutesito de la propuesta mini-Q
Ofrecer un enfoque maacutes adecuado biologicamente
Requirimientos de menores volumenes y tamantildeos de
muestra
Rango de faacutermacos varias polaridades y pKa
Evaluaciacuteoacuten de las interferencias de fondo
Extraccioacuten y datos de recuperacioacuten en un rango
aceptable
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Faacutermacos en sangre Procedimiento mini-QuEChERS
mini-Q
Procedimiento
1 Antildeadir 2 homogeneizadores ceraacutemicos
2 Antildeadir 1 o 2 mL de sangre entera a un tubo de centriacutefuga con tapoacuten de rosca
3 Antildeadir estandar interno vortex
4 Antildeadir 2 mL de ACN acidificado ( 04 FA) vortex 30 seg
5 Antildeadir 500 mg de sales de extraccioacuten agitar vigorsamente 1 minuto centrifugar 5000 rpm 1 min
6 Transferir 1 mL del extraccto al material de d-SPE en tubo de centrifuga vortex centrifugar
7 Antildeadir 200 uL a 800 uL de agua en un vial LC vortex y analizar
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Refinamiento del Procedimiento mini-Q
Paraacutemetros evaluados en la teacutecnica mini-Q
Muestra de sangre total
bull La matriz bioloacutegica maacutes complicada
Adicioacuten de aacutecido tipo y cantidad
bull Efecto en la particioacuten y extraccioacuten
Adicioacuten de las sales de QuEChERS no-tamponadas o
tamponadas con NaAcetato o Citrato
bull Efecto en el extracto inspeccioacuten visual
SPE Dispersiva
bull Limpieza de la matriz y recuperaciones de los compuestos
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Conclusiones del estudio
El ACN con 4 de FA como solvente de extraccioacuten muestra
una lisis maacutes completa de la muestra frente a otros solventes
de extraccioacuten que mostraron una masa soacutelida
Las sales tamponadas AOAC de acetato Soacutedico generan el
extracto maacutes liacutempio y fueron elegidas para la d-SPE
El paso de dSPE no ofrece un clean up adicional para los
meacutetodos de extraccioacuten con sales EN y no tamponadas
principalmente
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Datos de Adquisicoacuten LCMSMS
Compuestos Canales MRM
(mz) Fragmentador
(V) CE (V) RT (min) Delta RT
Lidocaina 1) 23518 gt 861
2) 23518 gt 581
97 11
35
137 04
Tramadol 1) 2642 gt 581
2) 2642 gt 2461
97 15
3
120 04
Amitriptilina 1) 2782 gt 117
2) 2782 gt 105
112 19
19
425 04
Biperidena 1)31223 gt 981
2) 31223 gt 551
123 19
60
423 07
Oxazepam 1) 28706 gt 2409
2) 28706 gt 2689
112 19
7
399 04
Lorazepam 1) 32102 gt 2749
2) 32102 gt 3029
113 15
7
409 04
Clorpromazina 1) 31911 gt 861
2) 31911 gt 581
112 15
43
463 04
Diltiazem 1) 41517 gt 1779
2) 41517 gt 1499
128 19
43
373 04
Naloxona 1) 32816 gt 310
2) 32816 gt 212
123 15
39
082 04
Nortriptilina (IS) 1) 26418 gt 233
2) 26418 gt 91
97 7
19
417 04
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1
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105
1075
11
1125
115
1175
12
1225
125
1275
13
1325
135
1375
+ESI TIC Scan Frag=800V AOAC_BLANK_110228bd
1 1
Counts vs Acquisition Time (min)
05 1 15 2 25
3 35 4 45 5 55 6 65 7 75 8 85 9 95 10
Columna Poroshell 120 EC-C18 27
micro 21 x 100 mm PN 695775-902
Fase Moacutevil
A 5 mM Acetato Amoacutenico pH 5
2080 MeOHagua
B 5 mM Acetato amoacutencio en ACN
Flujo 04mLmin
Inyeccioacuten 10uL
GT (ordmC) 300
GF (lmin) 7
Nebulizador (psi) 40
SGT (ordmC) 400
SFG (lmin) 12
Capilar (V) 3500
NV (V) 500
Condiciones LCMS
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4
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49
5
51
+ESI MRM Frag=1120V CID190 (2782000 -gt 1170000) HQC_6d
1 1
Counts vs Acquisition Time (min) 01 02 03 04 05 06 07 08 09 1 11 12 13 14 15 16 17 18 19 2 21 22 23 24 25 26 27 28 29 3 31 32 33 34 35 36 37 38 39 4 41 42 43 44 45 46
Nalo
xo
ne
Lid
oc
ain
e
Tra
mad
ol
Oxazep
am
Lo
razep
am
Bip
eri
de
n
Am
itri
pty
lin
e
Dil
tiazem
Ch
lorp
rom
azin
e
No
rtri
pty
lin
e (
IS)
Cromatograma LCMSMS de 10 ngmL de sangre total fortificada despueacutes
de extraccioacuten mini-QuEChERS AOAC (NaAc) y d-SPE (50mg PSA y
150mg MgSO4)
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51
+ESI MRM Frag=1120V CID190 (2782000 -gt 1170000) HQC_6d
1 1
Counts vs Acquisition Time (min) 01 02 03 04 05 06 07 08 09 1 11 12 13 14 15 16 17 18 19 2 21 22 23 24 25 26 27 28 29 3 31 32 33 34 35 36 37 38 39 4 41 42 43 44 45 46
1 x10
415 42 425 43 435 44 445 45 455 46 465 47 475 48 485 49 495 5
505 51 515 52 525 53 535 54 545 55 555 56 565 57
+ESI MRM Frag=1120V CID190 (2871000 -gt 2409000) RE_L_1d 1
Counts vs Acquisition Time (min) 305 31 315 32 325 33 335 34 345 35 355 36 365 37 375 38 385 39 395 4 405 41 415 42 425 43 435 44 445 45 455 46 465 47 475
Relacioacuten sentildealruido para el Oxazepam y Lorazepam a
10 ngmL (10 ppb)
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La Naloxone muestra esta curva de linealidad de10-250 ngmL (ppb) con una R2
= 0991
Las curvas de calibracioacuten se generaron con la respuestra relativa (area pico
analitoarea pico IS) frente a la concentracioacuten relativa (concentracion de
analitoconcentracioacuten de IS)
Ejemplo de curva de linealidad para Naloxona extraido
con mini-QuEChERS
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Recuperacioacuten y Reproducibilidad
Compuesto 50 ngmL Spiked
Recuperacioacuten RSD
100 ngmL Spiked
Recuperacioacuten RSD
Lidocaine 987 157 100 118
Tramadol 105 30 104 82
Amitriptyline 104 21 104 82
Biperidene 97 45 99 82
Oxazepam 770 92 78 86
Lorazepam 819 68 818 86
Chlorpromazine 110 103 105 63
Diltiazem 881 27 917 83
Naloxone 806 90 755 77
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 41
Conclusioacutenes y trabajo posterior
El meacutetodo mini-QuEChERS para la extraccioacuten de compuestos farmaceacuteuticos en
sangre total ofrece una alternativa a otras teacutecnicas de preparacioacuten de muestras
La preparacioacuten de muestras mini-QuEChERS es un enfoque simple facil y
barato que requiere una miacutenima experiencia en preparacioacuten de muestras y
miacutenimo equipamiento
Es un punto de partida para ampliar el numero y las clasificaciones evaluadas
en otras matrices bioloacutegicas y en sangre postmortem
El trabajo futuro incluira combinaciones adecuadas tanto de las sales de
extraccioacuten como de los sorbentes de d-SPE por el meacutetodo mini-QuEChERS
La columna Poroshell 120 ofrece una selectividad diferente y excelentes formas
de pico a lo largo del amplio rango de compuestos farmaceacuteuticos usados en este
estudio
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 42
Referencias
(1) M Anastassiades SJ Lehotay D Štajnbaher and FJ Schenk J AOAC Int 86 4121 (2003)
(2) G Stubbings and T Bigwood Anal Chim Acta 637 68 (2009)
(3) RR Rasmussen IMLD Storm PZH Rasmussen J Smedsgaard and KF Nielsen Anal Bioanal Chem 397 765 (2010)
(4) D Smith and K Lynam GCμECD analysis and confirmation of PCBs in fish tissue with Agilent JampW DB-35ms and DB-XLB GC columns Agilent Technologies 5990-6236EN (2010)
(5) F Ploumlssl M Giera and F Bracher J Chrom A 1135 19 (2006)
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 43
MEJORAR LA PRODUCTIVIDAD EN
HPLC ESTAacuteNDAR CON COLUMNAS
POROSHELL
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Columnas Poroshell 120 para HPLC y UHPLC
bull 80-90 de eficacia de las sub 2um
bull A presiones un ~40-50 maacutes bajas
bull Con un tamantildeo de partiacutecula de 27um
bull Con una frita de entrada de 2um
bull Con el doble de resolucioacuten de una
columna de 35um
bull Con un liacutemite de presioacuten de 600 bar
bull La partiacutecula tiene un nuacutecleo soacutelido
(17um) y una cubierta exterior porosa
de 05um como zona de difusioacuten
Las Columnas Poroshell 120 tienen
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Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 45
Poroshell 120 proporciona Eficacia Suficiente
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Flujo 0582 mLmin AcetonitriloAgua (6040)
Volumen de Inyeccioacuten 4 microL
TCC 26 oC
DAD Sig=2544nm Ref=360100nm
Muestra Muestra de test RRLC
(PN 5188-6529) inoculada con
50 microL 2 mgmL Tiourea en
aguaacetonitrilo (6535)
25 5 75 10
mAU
0
200
400
600
06
46
0
82
6
11
48
15
18
20
16
2
22
3
28
16
41
32
62
73
97
53
larr N = 25053 Presioacuten = 182 bar
Poroshell 120 EC-C18 30 x 100 mm 27 um
min 25 5 75 10 125
mAU
0
200
400
600
06
49
0
86
5
12
75
17
56
24
18
27
05
34
94
52
81
82
18
13
04
1
larr N = 27295 Presioacuten = 386 bar
Eclipse Plus C18 30 x 100 mm 18 um
gt90 de la Eficacia de una 18um
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 46
iquestEn queacute tipos de instrumentos puede usar
Columnas Poroshell 120 HPLCrsquos y UHPLCrsquos
Consideraciones en UHPLC
bull Las columnas Poroshell 120 tienen un liacutemite de presioacuten de 600 bar
bull Los UHPLC estaacuten ajustados para columnas de bajo volumen por lo tanto las
Poroshell pueden usarse en todos los UHPLC
Consideraciones en HPLC
bull Las Columnas Poroshell 120 trabajan bien por debajo de 400 bar
bull Minimize los volumenes extra columna para las columnas 21 y 30mm ID ndash
siga las instrucciones dadas para las columnas RRHT (18um 600 bar)
bull Use en el detector velocidades adecuadas de adquisicioacuten para picos
estrechos de alta eficacia
Page 46
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 47
Con una frita de 2 um Poroshell 120 no se bloquea
Muestras Complejas- Plasma
Diflusinal in Plasma
0
20
40
60
80
100
120
140
160
180
200
220
240
260
280
300
320
340
360
380
400
1 501 1001 1501 2001 2501
Injections
Pre
ssu
re
0
20000
40000
60000
80000
100000
120000
140000
160000
180000
200000
Eff
icie
ncy (
N)
End Press
Plates
Columna Poroshell 120 EC-C18 30 x 50mm 27um LC Agilent 1200 RRLC (SL)
Muestra Plasma Precipitado 2 partes Plasma 7 Partes 2080 Agua-MeCN w01 Aacutecido Foacutermico con 1 Parte de Diflusinal en
5050 Agua-MeCN 10 ugml (Concentracion Final Diflusinal 1 ugml) Agitado y dejado reposar 10 minutos
No Centrifugado No Filtrado
Volumen de Inyeccioacuten 1ul
Solvente A Agua w01 TFA
Solvente B MeCN w008 TFA
Flujo 1 mlmin 1 ul inyeccioacuten
Tiempo B
0 20
05 90
06 90
11 20
25 20
Page 47
Diflusinal es un anti-inflamatorio no esteroidal anaacutelogo
a la aspirina desarrollado por Merck Sharp amp Dohme
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 48
Las Columnas Superficialmente Porosas Pueden
Usarse cumpliendo los Requirimientos USP
De la lista USP de empaquetamientos de columnas LC 42009
Page 48
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 49
Criterios de Ajuste de Meacutetodos USP y FDA Criterios de Ajuste de Meacutetodos de Dimensiones de Columna
Paraacutemetro Especificaciones Maacuteximas ComentariosEjemplos
Longitud de Columna 70 250mm 75mm
150mm 50mm
Diaacutemetro Interno de
Columna
25 (FDA ORA-LAB 545)
USP ndash 25 ID Columna puede ajustarse si la
velocidad lineal es constante
46 mm 30 mm (-35)
46 mm 21 mm (-54)
30 mm 21 mm (-30)
Flow Rate 50
Volumen de Inyeccioacuten
Reducir tanto como se necesitendash
debe cumplir los liacutemites de
deteccioacuten y precisioacuten
Si cambia a una columna maacutes
corta haga el cambio apropiado
en el volumen de inyeccioacuten
Tamantildeo de Partiacutecula Reducir hasta el 50
(no se puede aumentar)
Puede cambiar la longitud de columna y el
tamantildeo de partiacutecula para mantener la misma
Rs
5um 35um (-30)
5um 27um (-46) Cambiado en 22409 ndash Para la copia oficial y actual ir a
httpwwwfdagovScienceResearchFieldSciencedefaulthtm
USP 30 Second Supplement Revisions PF34(5) en proceso
Ver ldquo Stimuli articlerdquo en Pharmacopeial Forum 2009 35(6)
Page 49
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 50
Comparacioacuten de 46 x 250 mm 5 um con Poroshell
120 EC-C18 46 x 100 mm 27um
min 5 10 15 20 25 30
mAU
0
20
40
60
80
100
97
12
111
16
115
96
126
74
152
48
161
51
164
35
206
87
230
76
292
90
min 5 10 15 20 25 30
mAU
0
50
100
150
200
250
17
19
21
89
23
11
26
06
38
67
44
37 45
58
54
50
59
20
70
37
Anaacutelisis maacutes raacutepido(columna maacutes corta flujo maacutes alto)
Mayor sensibilidad(partiacutecula maacutes pequentildeapico maacutes estrecho)
Maacutes optimizado (un anaacutelisis maacutes raacutepido permite ajustar mejor)
Ambos anaacutelisis en Agilent 1100 G1315B DAD (bajo 400 bar)
No se requiere cambio en la preparacioacuten de muestra frita de entrada
de 2 micras en ambas columnas
325 bar
110 bar
Sulfadiazina
Sulfatiazol
Sulfapiridina
Sulfamerazina
Sulfametazina
Sulfametazol
Sulfametoxipiridazina
Sulfacloropiridazina
Sulfametoxazol
Sulfadimetoxina
Tiempo B
0 8
33 33
34 33
Columna Eclipse Plus C18
46 x 250mm 5um
Flujo 1 mLmin
Fase Moacutevil
A 01 Aacutecido Foacutermico en Agua
B 01 Aacutecido Foacutermico en ACN
Tiempo B
0 8
12 33
132 33
Columna 46 x 100mm
Poroshell 120 EC-C18
27um
Flujo 185 mLmin
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Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 51
Comparacioacuten de 46 x 250 mm 5 um con Poroshell
120 EC-C18 46 x 100 mm 27um
min 5 10 15 20 25 30
mAU
0
20
40
60
80
100
97
12
111
16
115
96
126
74
152
48
161
51
164
35
206
87
230
76
292
90
110 bar
5
mAU
0
50
100
150
200
250
17
19
21
89
23
11
26
06
38
67
44
37 45
58
54
50
59
20
70
37
325 bar
min
Ver condiciones en diapositiva anterior
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Mejor Resolucioacuten
linea base
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 52
Anaacutelisis maacutes raacutepido del meacutetodo USP para pastillas de
Simvastatina en Columnas Poroshell 120ndash Ajuste del meacutetodo
46 x 250 mm 5-um
Agilent ZORBAX Eclipse Plus C18
46 x 75 mm 27-um
Agilent Poroshell 120 EC-C18
65 CH3CN 35 39 gL NaH2PO4 (pH 45) 45 oC Sig = 238 8 Ref = 360 100 nm
Flujos 15 mLmin para la columna de 5-um 28 mLmin para la columna Poroshell 120 27um
Requerimiento
USP
5-um
(15 mLmin)
27-um
(28 mLmin)
TR na 9907 1457
krsquo gt 30 5962 5122
N gt 4500 16939 14439
Tf lt 20 109 110
min 2 4 6 8 10
mAU
0
5
10
15
20
25
30
35
40
min 2
mAU
0
5
10
15
20
25
30
35
40
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 53
Ajustes de los parametros cromatograficos en la
transferencia de meacutetodos Escalado del volume de inyeccioacuten
v1 x [(r22 x L2)(r1
2 x L1)] = V2
O bien
v2 = V1 x [(d22 x L2)(d1
2 x L1)]
v volume de inyeccioacuten
r radio de la columna
L longitud de la columna
Ajuste del flujo
F2= F1 x (L2L1 ) x (r2r1 )2
L longitud de la columna
F Flujo
r radio de la columna
Ajuste de la longitud del gradiente
En funcioacuten de la longitud de la columna
L2L1= tg2tg1
En funcioacuten del volumen muerto de columna y del flujo
tG2= tG1 x (V2V1) x (F1F2) t tiempos de gradiente
V volumen muerto de columna
F flujo
Columna ID Volumen muerto aprox
por mm longitud
46mm 100uL
30mm 425uL
21mm 208uL
10mm 047uL
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 54
Notas de Aplicacioacuten en Poroshell 120 y QuEChERS
Determination of Hormones in Shrimp by Agilent 1290 Infinity LC with
Agilent Poroshell 120 LC Column and Agilent QuEChERS for Sample
Preparation (publication 5990-6589EN)
Analysis of Pesticide Residues in Green Tea Using Agilent SampliQ
QuEChERS EN Kit by LCMSMS Detection (publication 5990-
6400EN)
Analysis of Pesticide Residues in Rice Using Agilent Bond Elut
QuEChERS AOAC Kit (publication 5990-8034EN)
Poroshell 120 for pharmaceutical analysis
Poroshell 120 Resources
QuEChERS Applications
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 55
Sumario
bull La columna Poroshell 120 es una nueva alternativa para LC de Alta
Resolucioacuten y Alta Velocidad que puede usarse en cualquier HPLC o UHPLC
bull Con la Poroshell 120 se pueden lograr separaciones de alta eficacia a baja
presioacuten
bull Puede usarse con muestras sucias sin ver una elevacioacuten anormal de la
presioacuten
bull Puede usarse en un meacutetodo USP sin comprometer los Criterios de Ajustes de
Meacutetodo
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Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 56
Soporte Teacutecnico Agilent
Teleacutefono de Atencioacuten al Cliente
901 11 68 90
email customercare_spainagilentcom
wwwagilentcomchem
![Page 27: Análisis de compuestos farmacéuticos en sangre total · PDF fileReducción en el procesamiento, el envío de la muestra, y los ... Gas flow: 10 L/min Nebulizer: 10 psi Sheath gas](https://reader031.vdocuments.site/reader031/viewer/2022030405/5a7a81727f8b9a0a668b45aa/html5/thumbnails/27.jpg)
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 27
Caminos paralelos en la preparacioacuten de muestra
Fluidos Bioloacutegicos
Matrices complejas
Rotura de la arquitectura celular
bull Lisis agitacioacuten solvente orgaacutenico
hidroacutelisis
Analitos con un amplio rango de
polaridades
Retirar analito o matriz
Anaacutelisis por LCMSMS GCMS o
GCMSMS
Frutas y Vegetales
Matrices complejas
Rotura de la arquitectura celular
bull Trituracioacuten agitacioacuten solvente
orgaacutenico hidroacutelisis
Analitos con un amplio rango de
polaridades
Retirar analito o matriz
Anaacutelisis por LCMSMS GCMS o
GCMSMS
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 28
Procedimiento baacutesico por SPE para muestras de sangre
El pretratamiento de la sangre total implica la dilucioacuten con una
solucioacuten aacutecida un tampoacuten fosfato o aguaFA
Sonicar 15 minutos rotura de membranas celulares
Centrifugacioacuten
bull Procedimiento de SPE
ndash Acondicionado del cartucho metanol agua
ndash Carga del cartucho muestra
ndash Lavado del cartucho agua con metanol o tampoacuten metanol
ndash Elucioacuten del cartucho eluyente para el anaacutelisis
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 29
Procedimiento Baacutesico QuEChERS
15 g muestra homogeneizada (fortificada)
Antildeadir 15 mL ACN (1 AA) vortex
Antildeadir Sales de Extraccioacuten AOAC agitar
Centrifugar
Transferir 1 u 8 mL a un tubo d-SPE AOAC vortex centrifugar
Transferir al vial de Anaacutelisis
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 30
Ventajas y desventajas del Procedimiento QuEChERS
Ventajas
Extraccioacuten tipo liacutequidoliacutequido
Uso de aacutecido para interrumpir el ligado de proteinas
Exceso de sal para lisar los componentes celulares
Uso de acetonitrilo para facilitar la precipitacioacuten proteacuteica
Uso de SPE dispersiva para adsorber las interferencias de la matriz
Plossl etat J Chrom A 1135 (2006) 19-26
Desventajas
La cantidad de solvente y de muestra requeridos en el meacutetodo no
son ldquobioloacutegicamente adecuadosrdquo
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 31
Propoacutesito de la propuesta mini-Q
Ofrecer un enfoque maacutes adecuado biologicamente
Requirimientos de menores volumenes y tamantildeos de
muestra
Rango de faacutermacos varias polaridades y pKa
Evaluaciacuteoacuten de las interferencias de fondo
Extraccioacuten y datos de recuperacioacuten en un rango
aceptable
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 32
Faacutermacos en sangre Procedimiento mini-QuEChERS
mini-Q
Procedimiento
1 Antildeadir 2 homogeneizadores ceraacutemicos
2 Antildeadir 1 o 2 mL de sangre entera a un tubo de centriacutefuga con tapoacuten de rosca
3 Antildeadir estandar interno vortex
4 Antildeadir 2 mL de ACN acidificado ( 04 FA) vortex 30 seg
5 Antildeadir 500 mg de sales de extraccioacuten agitar vigorsamente 1 minuto centrifugar 5000 rpm 1 min
6 Transferir 1 mL del extraccto al material de d-SPE en tubo de centrifuga vortex centrifugar
7 Antildeadir 200 uL a 800 uL de agua en un vial LC vortex y analizar
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 33
Refinamiento del Procedimiento mini-Q
Paraacutemetros evaluados en la teacutecnica mini-Q
Muestra de sangre total
bull La matriz bioloacutegica maacutes complicada
Adicioacuten de aacutecido tipo y cantidad
bull Efecto en la particioacuten y extraccioacuten
Adicioacuten de las sales de QuEChERS no-tamponadas o
tamponadas con NaAcetato o Citrato
bull Efecto en el extracto inspeccioacuten visual
SPE Dispersiva
bull Limpieza de la matriz y recuperaciones de los compuestos
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 34
Conclusiones del estudio
El ACN con 4 de FA como solvente de extraccioacuten muestra
una lisis maacutes completa de la muestra frente a otros solventes
de extraccioacuten que mostraron una masa soacutelida
Las sales tamponadas AOAC de acetato Soacutedico generan el
extracto maacutes liacutempio y fueron elegidas para la d-SPE
El paso de dSPE no ofrece un clean up adicional para los
meacutetodos de extraccioacuten con sales EN y no tamponadas
principalmente
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 35
Datos de Adquisicoacuten LCMSMS
Compuestos Canales MRM
(mz) Fragmentador
(V) CE (V) RT (min) Delta RT
Lidocaina 1) 23518 gt 861
2) 23518 gt 581
97 11
35
137 04
Tramadol 1) 2642 gt 581
2) 2642 gt 2461
97 15
3
120 04
Amitriptilina 1) 2782 gt 117
2) 2782 gt 105
112 19
19
425 04
Biperidena 1)31223 gt 981
2) 31223 gt 551
123 19
60
423 07
Oxazepam 1) 28706 gt 2409
2) 28706 gt 2689
112 19
7
399 04
Lorazepam 1) 32102 gt 2749
2) 32102 gt 3029
113 15
7
409 04
Clorpromazina 1) 31911 gt 861
2) 31911 gt 581
112 15
43
463 04
Diltiazem 1) 41517 gt 1779
2) 41517 gt 1499
128 19
43
373 04
Naloxona 1) 32816 gt 310
2) 32816 gt 212
123 15
39
082 04
Nortriptilina (IS) 1) 26418 gt 233
2) 26418 gt 91
97 7
19
417 04
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 36
7 x10
0125
015
0175
02
0225
025
0275
03
0325
035
0375
04
0425
045
0475
05
0525
055
0575
06
0625
065
0675
07
0725
075
0775
08
0825
085
0875
09
0925
095
0975
1
1025
105
1075
11
1125
115
1175
12
1225
125
1275
13
1325
135
1375
+ESI TIC Scan Frag=800V AOAC_BLANK_110228bd
1 1
Counts vs Acquisition Time (min)
05 1 15 2 25
3 35 4 45 5 55 6 65 7 75 8 85 9 95 10
Columna Poroshell 120 EC-C18 27
micro 21 x 100 mm PN 695775-902
Fase Moacutevil
A 5 mM Acetato Amoacutenico pH 5
2080 MeOHagua
B 5 mM Acetato amoacutencio en ACN
Flujo 04mLmin
Inyeccioacuten 10uL
GT (ordmC) 300
GF (lmin) 7
Nebulizador (psi) 40
SGT (ordmC) 400
SFG (lmin) 12
Capilar (V) 3500
NV (V) 500
Condiciones LCMS
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 37
3 x10
01
02
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06
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1
11
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2
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27
28
29
3
31
32
33
34
35
36
37
38
39
4
41
42
43
44
45
46
47
48
49
5
51
+ESI MRM Frag=1120V CID190 (2782000 -gt 1170000) HQC_6d
1 1
Counts vs Acquisition Time (min) 01 02 03 04 05 06 07 08 09 1 11 12 13 14 15 16 17 18 19 2 21 22 23 24 25 26 27 28 29 3 31 32 33 34 35 36 37 38 39 4 41 42 43 44 45 46
Nalo
xo
ne
Lid
oc
ain
e
Tra
mad
ol
Oxazep
am
Lo
razep
am
Bip
eri
de
n
Am
itri
pty
lin
e
Dil
tiazem
Ch
lorp
rom
azin
e
No
rtri
pty
lin
e (
IS)
Cromatograma LCMSMS de 10 ngmL de sangre total fortificada despueacutes
de extraccioacuten mini-QuEChERS AOAC (NaAc) y d-SPE (50mg PSA y
150mg MgSO4)
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 38
3 x10
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02
03
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11
12
13
14
15
16
17
18
19
2
21
22
23
24
25
26
27
28
29
3
31
32
33
34
35
36
37
38
39
4
41
42
43
44
45
46
47
48
49
5
51
+ESI MRM Frag=1120V CID190 (2782000 -gt 1170000) HQC_6d
1 1
Counts vs Acquisition Time (min) 01 02 03 04 05 06 07 08 09 1 11 12 13 14 15 16 17 18 19 2 21 22 23 24 25 26 27 28 29 3 31 32 33 34 35 36 37 38 39 4 41 42 43 44 45 46
1 x10
415 42 425 43 435 44 445 45 455 46 465 47 475 48 485 49 495 5
505 51 515 52 525 53 535 54 545 55 555 56 565 57
+ESI MRM Frag=1120V CID190 (2871000 -gt 2409000) RE_L_1d 1
Counts vs Acquisition Time (min) 305 31 315 32 325 33 335 34 345 35 355 36 365 37 375 38 385 39 395 4 405 41 415 42 425 43 435 44 445 45 455 46 465 47 475
Relacioacuten sentildealruido para el Oxazepam y Lorazepam a
10 ngmL (10 ppb)
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 39
La Naloxone muestra esta curva de linealidad de10-250 ngmL (ppb) con una R2
= 0991
Las curvas de calibracioacuten se generaron con la respuestra relativa (area pico
analitoarea pico IS) frente a la concentracioacuten relativa (concentracion de
analitoconcentracioacuten de IS)
Ejemplo de curva de linealidad para Naloxona extraido
con mini-QuEChERS
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 40
Recuperacioacuten y Reproducibilidad
Compuesto 50 ngmL Spiked
Recuperacioacuten RSD
100 ngmL Spiked
Recuperacioacuten RSD
Lidocaine 987 157 100 118
Tramadol 105 30 104 82
Amitriptyline 104 21 104 82
Biperidene 97 45 99 82
Oxazepam 770 92 78 86
Lorazepam 819 68 818 86
Chlorpromazine 110 103 105 63
Diltiazem 881 27 917 83
Naloxone 806 90 755 77
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 41
Conclusioacutenes y trabajo posterior
El meacutetodo mini-QuEChERS para la extraccioacuten de compuestos farmaceacuteuticos en
sangre total ofrece una alternativa a otras teacutecnicas de preparacioacuten de muestras
La preparacioacuten de muestras mini-QuEChERS es un enfoque simple facil y
barato que requiere una miacutenima experiencia en preparacioacuten de muestras y
miacutenimo equipamiento
Es un punto de partida para ampliar el numero y las clasificaciones evaluadas
en otras matrices bioloacutegicas y en sangre postmortem
El trabajo futuro incluira combinaciones adecuadas tanto de las sales de
extraccioacuten como de los sorbentes de d-SPE por el meacutetodo mini-QuEChERS
La columna Poroshell 120 ofrece una selectividad diferente y excelentes formas
de pico a lo largo del amplio rango de compuestos farmaceacuteuticos usados en este
estudio
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 42
Referencias
(1) M Anastassiades SJ Lehotay D Štajnbaher and FJ Schenk J AOAC Int 86 4121 (2003)
(2) G Stubbings and T Bigwood Anal Chim Acta 637 68 (2009)
(3) RR Rasmussen IMLD Storm PZH Rasmussen J Smedsgaard and KF Nielsen Anal Bioanal Chem 397 765 (2010)
(4) D Smith and K Lynam GCμECD analysis and confirmation of PCBs in fish tissue with Agilent JampW DB-35ms and DB-XLB GC columns Agilent Technologies 5990-6236EN (2010)
(5) F Ploumlssl M Giera and F Bracher J Chrom A 1135 19 (2006)
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 43
MEJORAR LA PRODUCTIVIDAD EN
HPLC ESTAacuteNDAR CON COLUMNAS
POROSHELL
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Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 44
Columnas Poroshell 120 para HPLC y UHPLC
bull 80-90 de eficacia de las sub 2um
bull A presiones un ~40-50 maacutes bajas
bull Con un tamantildeo de partiacutecula de 27um
bull Con una frita de entrada de 2um
bull Con el doble de resolucioacuten de una
columna de 35um
bull Con un liacutemite de presioacuten de 600 bar
bull La partiacutecula tiene un nuacutecleo soacutelido
(17um) y una cubierta exterior porosa
de 05um como zona de difusioacuten
Las Columnas Poroshell 120 tienen
Page 44
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 45
Poroshell 120 proporciona Eficacia Suficiente
Page 45
Flujo 0582 mLmin AcetonitriloAgua (6040)
Volumen de Inyeccioacuten 4 microL
TCC 26 oC
DAD Sig=2544nm Ref=360100nm
Muestra Muestra de test RRLC
(PN 5188-6529) inoculada con
50 microL 2 mgmL Tiourea en
aguaacetonitrilo (6535)
25 5 75 10
mAU
0
200
400
600
06
46
0
82
6
11
48
15
18
20
16
2
22
3
28
16
41
32
62
73
97
53
larr N = 25053 Presioacuten = 182 bar
Poroshell 120 EC-C18 30 x 100 mm 27 um
min 25 5 75 10 125
mAU
0
200
400
600
06
49
0
86
5
12
75
17
56
24
18
27
05
34
94
52
81
82
18
13
04
1
larr N = 27295 Presioacuten = 386 bar
Eclipse Plus C18 30 x 100 mm 18 um
gt90 de la Eficacia de una 18um
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 46
iquestEn queacute tipos de instrumentos puede usar
Columnas Poroshell 120 HPLCrsquos y UHPLCrsquos
Consideraciones en UHPLC
bull Las columnas Poroshell 120 tienen un liacutemite de presioacuten de 600 bar
bull Los UHPLC estaacuten ajustados para columnas de bajo volumen por lo tanto las
Poroshell pueden usarse en todos los UHPLC
Consideraciones en HPLC
bull Las Columnas Poroshell 120 trabajan bien por debajo de 400 bar
bull Minimize los volumenes extra columna para las columnas 21 y 30mm ID ndash
siga las instrucciones dadas para las columnas RRHT (18um 600 bar)
bull Use en el detector velocidades adecuadas de adquisicioacuten para picos
estrechos de alta eficacia
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Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 47
Con una frita de 2 um Poroshell 120 no se bloquea
Muestras Complejas- Plasma
Diflusinal in Plasma
0
20
40
60
80
100
120
140
160
180
200
220
240
260
280
300
320
340
360
380
400
1 501 1001 1501 2001 2501
Injections
Pre
ssu
re
0
20000
40000
60000
80000
100000
120000
140000
160000
180000
200000
Eff
icie
ncy (
N)
End Press
Plates
Columna Poroshell 120 EC-C18 30 x 50mm 27um LC Agilent 1200 RRLC (SL)
Muestra Plasma Precipitado 2 partes Plasma 7 Partes 2080 Agua-MeCN w01 Aacutecido Foacutermico con 1 Parte de Diflusinal en
5050 Agua-MeCN 10 ugml (Concentracion Final Diflusinal 1 ugml) Agitado y dejado reposar 10 minutos
No Centrifugado No Filtrado
Volumen de Inyeccioacuten 1ul
Solvente A Agua w01 TFA
Solvente B MeCN w008 TFA
Flujo 1 mlmin 1 ul inyeccioacuten
Tiempo B
0 20
05 90
06 90
11 20
25 20
Page 47
Diflusinal es un anti-inflamatorio no esteroidal anaacutelogo
a la aspirina desarrollado por Merck Sharp amp Dohme
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 48
Las Columnas Superficialmente Porosas Pueden
Usarse cumpliendo los Requirimientos USP
De la lista USP de empaquetamientos de columnas LC 42009
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Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 49
Criterios de Ajuste de Meacutetodos USP y FDA Criterios de Ajuste de Meacutetodos de Dimensiones de Columna
Paraacutemetro Especificaciones Maacuteximas ComentariosEjemplos
Longitud de Columna 70 250mm 75mm
150mm 50mm
Diaacutemetro Interno de
Columna
25 (FDA ORA-LAB 545)
USP ndash 25 ID Columna puede ajustarse si la
velocidad lineal es constante
46 mm 30 mm (-35)
46 mm 21 mm (-54)
30 mm 21 mm (-30)
Flow Rate 50
Volumen de Inyeccioacuten
Reducir tanto como se necesitendash
debe cumplir los liacutemites de
deteccioacuten y precisioacuten
Si cambia a una columna maacutes
corta haga el cambio apropiado
en el volumen de inyeccioacuten
Tamantildeo de Partiacutecula Reducir hasta el 50
(no se puede aumentar)
Puede cambiar la longitud de columna y el
tamantildeo de partiacutecula para mantener la misma
Rs
5um 35um (-30)
5um 27um (-46) Cambiado en 22409 ndash Para la copia oficial y actual ir a
httpwwwfdagovScienceResearchFieldSciencedefaulthtm
USP 30 Second Supplement Revisions PF34(5) en proceso
Ver ldquo Stimuli articlerdquo en Pharmacopeial Forum 2009 35(6)
Page 49
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 50
Comparacioacuten de 46 x 250 mm 5 um con Poroshell
120 EC-C18 46 x 100 mm 27um
min 5 10 15 20 25 30
mAU
0
20
40
60
80
100
97
12
111
16
115
96
126
74
152
48
161
51
164
35
206
87
230
76
292
90
min 5 10 15 20 25 30
mAU
0
50
100
150
200
250
17
19
21
89
23
11
26
06
38
67
44
37 45
58
54
50
59
20
70
37
Anaacutelisis maacutes raacutepido(columna maacutes corta flujo maacutes alto)
Mayor sensibilidad(partiacutecula maacutes pequentildeapico maacutes estrecho)
Maacutes optimizado (un anaacutelisis maacutes raacutepido permite ajustar mejor)
Ambos anaacutelisis en Agilent 1100 G1315B DAD (bajo 400 bar)
No se requiere cambio en la preparacioacuten de muestra frita de entrada
de 2 micras en ambas columnas
325 bar
110 bar
Sulfadiazina
Sulfatiazol
Sulfapiridina
Sulfamerazina
Sulfametazina
Sulfametazol
Sulfametoxipiridazina
Sulfacloropiridazina
Sulfametoxazol
Sulfadimetoxina
Tiempo B
0 8
33 33
34 33
Columna Eclipse Plus C18
46 x 250mm 5um
Flujo 1 mLmin
Fase Moacutevil
A 01 Aacutecido Foacutermico en Agua
B 01 Aacutecido Foacutermico en ACN
Tiempo B
0 8
12 33
132 33
Columna 46 x 100mm
Poroshell 120 EC-C18
27um
Flujo 185 mLmin
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Comparacioacuten de 46 x 250 mm 5 um con Poroshell
120 EC-C18 46 x 100 mm 27um
min 5 10 15 20 25 30
mAU
0
20
40
60
80
100
97
12
111
16
115
96
126
74
152
48
161
51
164
35
206
87
230
76
292
90
110 bar
5
mAU
0
50
100
150
200
250
17
19
21
89
23
11
26
06
38
67
44
37 45
58
54
50
59
20
70
37
325 bar
min
Ver condiciones en diapositiva anterior
Page 51
Mejor Resolucioacuten
linea base
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 52
Anaacutelisis maacutes raacutepido del meacutetodo USP para pastillas de
Simvastatina en Columnas Poroshell 120ndash Ajuste del meacutetodo
46 x 250 mm 5-um
Agilent ZORBAX Eclipse Plus C18
46 x 75 mm 27-um
Agilent Poroshell 120 EC-C18
65 CH3CN 35 39 gL NaH2PO4 (pH 45) 45 oC Sig = 238 8 Ref = 360 100 nm
Flujos 15 mLmin para la columna de 5-um 28 mLmin para la columna Poroshell 120 27um
Requerimiento
USP
5-um
(15 mLmin)
27-um
(28 mLmin)
TR na 9907 1457
krsquo gt 30 5962 5122
N gt 4500 16939 14439
Tf lt 20 109 110
min 2 4 6 8 10
mAU
0
5
10
15
20
25
30
35
40
min 2
mAU
0
5
10
15
20
25
30
35
40
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 53
Ajustes de los parametros cromatograficos en la
transferencia de meacutetodos Escalado del volume de inyeccioacuten
v1 x [(r22 x L2)(r1
2 x L1)] = V2
O bien
v2 = V1 x [(d22 x L2)(d1
2 x L1)]
v volume de inyeccioacuten
r radio de la columna
L longitud de la columna
Ajuste del flujo
F2= F1 x (L2L1 ) x (r2r1 )2
L longitud de la columna
F Flujo
r radio de la columna
Ajuste de la longitud del gradiente
En funcioacuten de la longitud de la columna
L2L1= tg2tg1
En funcioacuten del volumen muerto de columna y del flujo
tG2= tG1 x (V2V1) x (F1F2) t tiempos de gradiente
V volumen muerto de columna
F flujo
Columna ID Volumen muerto aprox
por mm longitud
46mm 100uL
30mm 425uL
21mm 208uL
10mm 047uL
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 54
Notas de Aplicacioacuten en Poroshell 120 y QuEChERS
Determination of Hormones in Shrimp by Agilent 1290 Infinity LC with
Agilent Poroshell 120 LC Column and Agilent QuEChERS for Sample
Preparation (publication 5990-6589EN)
Analysis of Pesticide Residues in Green Tea Using Agilent SampliQ
QuEChERS EN Kit by LCMSMS Detection (publication 5990-
6400EN)
Analysis of Pesticide Residues in Rice Using Agilent Bond Elut
QuEChERS AOAC Kit (publication 5990-8034EN)
Poroshell 120 for pharmaceutical analysis
Poroshell 120 Resources
QuEChERS Applications
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 55
Sumario
bull La columna Poroshell 120 es una nueva alternativa para LC de Alta
Resolucioacuten y Alta Velocidad que puede usarse en cualquier HPLC o UHPLC
bull Con la Poroshell 120 se pueden lograr separaciones de alta eficacia a baja
presioacuten
bull Puede usarse con muestras sucias sin ver una elevacioacuten anormal de la
presioacuten
bull Puede usarse en un meacutetodo USP sin comprometer los Criterios de Ajustes de
Meacutetodo
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Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 56
Soporte Teacutecnico Agilent
Teleacutefono de Atencioacuten al Cliente
901 11 68 90
email customercare_spainagilentcom
wwwagilentcomchem
![Page 28: Análisis de compuestos farmacéuticos en sangre total · PDF fileReducción en el procesamiento, el envío de la muestra, y los ... Gas flow: 10 L/min Nebulizer: 10 psi Sheath gas](https://reader031.vdocuments.site/reader031/viewer/2022030405/5a7a81727f8b9a0a668b45aa/html5/thumbnails/28.jpg)
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 28
Procedimiento baacutesico por SPE para muestras de sangre
El pretratamiento de la sangre total implica la dilucioacuten con una
solucioacuten aacutecida un tampoacuten fosfato o aguaFA
Sonicar 15 minutos rotura de membranas celulares
Centrifugacioacuten
bull Procedimiento de SPE
ndash Acondicionado del cartucho metanol agua
ndash Carga del cartucho muestra
ndash Lavado del cartucho agua con metanol o tampoacuten metanol
ndash Elucioacuten del cartucho eluyente para el anaacutelisis
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 29
Procedimiento Baacutesico QuEChERS
15 g muestra homogeneizada (fortificada)
Antildeadir 15 mL ACN (1 AA) vortex
Antildeadir Sales de Extraccioacuten AOAC agitar
Centrifugar
Transferir 1 u 8 mL a un tubo d-SPE AOAC vortex centrifugar
Transferir al vial de Anaacutelisis
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 30
Ventajas y desventajas del Procedimiento QuEChERS
Ventajas
Extraccioacuten tipo liacutequidoliacutequido
Uso de aacutecido para interrumpir el ligado de proteinas
Exceso de sal para lisar los componentes celulares
Uso de acetonitrilo para facilitar la precipitacioacuten proteacuteica
Uso de SPE dispersiva para adsorber las interferencias de la matriz
Plossl etat J Chrom A 1135 (2006) 19-26
Desventajas
La cantidad de solvente y de muestra requeridos en el meacutetodo no
son ldquobioloacutegicamente adecuadosrdquo
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 31
Propoacutesito de la propuesta mini-Q
Ofrecer un enfoque maacutes adecuado biologicamente
Requirimientos de menores volumenes y tamantildeos de
muestra
Rango de faacutermacos varias polaridades y pKa
Evaluaciacuteoacuten de las interferencias de fondo
Extraccioacuten y datos de recuperacioacuten en un rango
aceptable
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 32
Faacutermacos en sangre Procedimiento mini-QuEChERS
mini-Q
Procedimiento
1 Antildeadir 2 homogeneizadores ceraacutemicos
2 Antildeadir 1 o 2 mL de sangre entera a un tubo de centriacutefuga con tapoacuten de rosca
3 Antildeadir estandar interno vortex
4 Antildeadir 2 mL de ACN acidificado ( 04 FA) vortex 30 seg
5 Antildeadir 500 mg de sales de extraccioacuten agitar vigorsamente 1 minuto centrifugar 5000 rpm 1 min
6 Transferir 1 mL del extraccto al material de d-SPE en tubo de centrifuga vortex centrifugar
7 Antildeadir 200 uL a 800 uL de agua en un vial LC vortex y analizar
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 33
Refinamiento del Procedimiento mini-Q
Paraacutemetros evaluados en la teacutecnica mini-Q
Muestra de sangre total
bull La matriz bioloacutegica maacutes complicada
Adicioacuten de aacutecido tipo y cantidad
bull Efecto en la particioacuten y extraccioacuten
Adicioacuten de las sales de QuEChERS no-tamponadas o
tamponadas con NaAcetato o Citrato
bull Efecto en el extracto inspeccioacuten visual
SPE Dispersiva
bull Limpieza de la matriz y recuperaciones de los compuestos
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 34
Conclusiones del estudio
El ACN con 4 de FA como solvente de extraccioacuten muestra
una lisis maacutes completa de la muestra frente a otros solventes
de extraccioacuten que mostraron una masa soacutelida
Las sales tamponadas AOAC de acetato Soacutedico generan el
extracto maacutes liacutempio y fueron elegidas para la d-SPE
El paso de dSPE no ofrece un clean up adicional para los
meacutetodos de extraccioacuten con sales EN y no tamponadas
principalmente
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 35
Datos de Adquisicoacuten LCMSMS
Compuestos Canales MRM
(mz) Fragmentador
(V) CE (V) RT (min) Delta RT
Lidocaina 1) 23518 gt 861
2) 23518 gt 581
97 11
35
137 04
Tramadol 1) 2642 gt 581
2) 2642 gt 2461
97 15
3
120 04
Amitriptilina 1) 2782 gt 117
2) 2782 gt 105
112 19
19
425 04
Biperidena 1)31223 gt 981
2) 31223 gt 551
123 19
60
423 07
Oxazepam 1) 28706 gt 2409
2) 28706 gt 2689
112 19
7
399 04
Lorazepam 1) 32102 gt 2749
2) 32102 gt 3029
113 15
7
409 04
Clorpromazina 1) 31911 gt 861
2) 31911 gt 581
112 15
43
463 04
Diltiazem 1) 41517 gt 1779
2) 41517 gt 1499
128 19
43
373 04
Naloxona 1) 32816 gt 310
2) 32816 gt 212
123 15
39
082 04
Nortriptilina (IS) 1) 26418 gt 233
2) 26418 gt 91
97 7
19
417 04
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 36
7 x10
0125
015
0175
02
0225
025
0275
03
0325
035
0375
04
0425
045
0475
05
0525
055
0575
06
0625
065
0675
07
0725
075
0775
08
0825
085
0875
09
0925
095
0975
1
1025
105
1075
11
1125
115
1175
12
1225
125
1275
13
1325
135
1375
+ESI TIC Scan Frag=800V AOAC_BLANK_110228bd
1 1
Counts vs Acquisition Time (min)
05 1 15 2 25
3 35 4 45 5 55 6 65 7 75 8 85 9 95 10
Columna Poroshell 120 EC-C18 27
micro 21 x 100 mm PN 695775-902
Fase Moacutevil
A 5 mM Acetato Amoacutenico pH 5
2080 MeOHagua
B 5 mM Acetato amoacutencio en ACN
Flujo 04mLmin
Inyeccioacuten 10uL
GT (ordmC) 300
GF (lmin) 7
Nebulizador (psi) 40
SGT (ordmC) 400
SFG (lmin) 12
Capilar (V) 3500
NV (V) 500
Condiciones LCMS
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 37
3 x10
01
02
03
04
05
06
07
08
09
1
11
12
13
14
15
16
17
18
19
2
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29
3
31
32
33
34
35
36
37
38
39
4
41
42
43
44
45
46
47
48
49
5
51
+ESI MRM Frag=1120V CID190 (2782000 -gt 1170000) HQC_6d
1 1
Counts vs Acquisition Time (min) 01 02 03 04 05 06 07 08 09 1 11 12 13 14 15 16 17 18 19 2 21 22 23 24 25 26 27 28 29 3 31 32 33 34 35 36 37 38 39 4 41 42 43 44 45 46
Nalo
xo
ne
Lid
oc
ain
e
Tra
mad
ol
Oxazep
am
Lo
razep
am
Bip
eri
de
n
Am
itri
pty
lin
e
Dil
tiazem
Ch
lorp
rom
azin
e
No
rtri
pty
lin
e (
IS)
Cromatograma LCMSMS de 10 ngmL de sangre total fortificada despueacutes
de extraccioacuten mini-QuEChERS AOAC (NaAc) y d-SPE (50mg PSA y
150mg MgSO4)
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 38
3 x10
01
02
03
04
05
06
07
08
09
1
11
12
13
14
15
16
17
18
19
2
21
22
23
24
25
26
27
28
29
3
31
32
33
34
35
36
37
38
39
4
41
42
43
44
45
46
47
48
49
5
51
+ESI MRM Frag=1120V CID190 (2782000 -gt 1170000) HQC_6d
1 1
Counts vs Acquisition Time (min) 01 02 03 04 05 06 07 08 09 1 11 12 13 14 15 16 17 18 19 2 21 22 23 24 25 26 27 28 29 3 31 32 33 34 35 36 37 38 39 4 41 42 43 44 45 46
1 x10
415 42 425 43 435 44 445 45 455 46 465 47 475 48 485 49 495 5
505 51 515 52 525 53 535 54 545 55 555 56 565 57
+ESI MRM Frag=1120V CID190 (2871000 -gt 2409000) RE_L_1d 1
Counts vs Acquisition Time (min) 305 31 315 32 325 33 335 34 345 35 355 36 365 37 375 38 385 39 395 4 405 41 415 42 425 43 435 44 445 45 455 46 465 47 475
Relacioacuten sentildealruido para el Oxazepam y Lorazepam a
10 ngmL (10 ppb)
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 39
La Naloxone muestra esta curva de linealidad de10-250 ngmL (ppb) con una R2
= 0991
Las curvas de calibracioacuten se generaron con la respuestra relativa (area pico
analitoarea pico IS) frente a la concentracioacuten relativa (concentracion de
analitoconcentracioacuten de IS)
Ejemplo de curva de linealidad para Naloxona extraido
con mini-QuEChERS
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 40
Recuperacioacuten y Reproducibilidad
Compuesto 50 ngmL Spiked
Recuperacioacuten RSD
100 ngmL Spiked
Recuperacioacuten RSD
Lidocaine 987 157 100 118
Tramadol 105 30 104 82
Amitriptyline 104 21 104 82
Biperidene 97 45 99 82
Oxazepam 770 92 78 86
Lorazepam 819 68 818 86
Chlorpromazine 110 103 105 63
Diltiazem 881 27 917 83
Naloxone 806 90 755 77
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 41
Conclusioacutenes y trabajo posterior
El meacutetodo mini-QuEChERS para la extraccioacuten de compuestos farmaceacuteuticos en
sangre total ofrece una alternativa a otras teacutecnicas de preparacioacuten de muestras
La preparacioacuten de muestras mini-QuEChERS es un enfoque simple facil y
barato que requiere una miacutenima experiencia en preparacioacuten de muestras y
miacutenimo equipamiento
Es un punto de partida para ampliar el numero y las clasificaciones evaluadas
en otras matrices bioloacutegicas y en sangre postmortem
El trabajo futuro incluira combinaciones adecuadas tanto de las sales de
extraccioacuten como de los sorbentes de d-SPE por el meacutetodo mini-QuEChERS
La columna Poroshell 120 ofrece una selectividad diferente y excelentes formas
de pico a lo largo del amplio rango de compuestos farmaceacuteuticos usados en este
estudio
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 42
Referencias
(1) M Anastassiades SJ Lehotay D Štajnbaher and FJ Schenk J AOAC Int 86 4121 (2003)
(2) G Stubbings and T Bigwood Anal Chim Acta 637 68 (2009)
(3) RR Rasmussen IMLD Storm PZH Rasmussen J Smedsgaard and KF Nielsen Anal Bioanal Chem 397 765 (2010)
(4) D Smith and K Lynam GCμECD analysis and confirmation of PCBs in fish tissue with Agilent JampW DB-35ms and DB-XLB GC columns Agilent Technologies 5990-6236EN (2010)
(5) F Ploumlssl M Giera and F Bracher J Chrom A 1135 19 (2006)
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 43
MEJORAR LA PRODUCTIVIDAD EN
HPLC ESTAacuteNDAR CON COLUMNAS
POROSHELL
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Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 44
Columnas Poroshell 120 para HPLC y UHPLC
bull 80-90 de eficacia de las sub 2um
bull A presiones un ~40-50 maacutes bajas
bull Con un tamantildeo de partiacutecula de 27um
bull Con una frita de entrada de 2um
bull Con el doble de resolucioacuten de una
columna de 35um
bull Con un liacutemite de presioacuten de 600 bar
bull La partiacutecula tiene un nuacutecleo soacutelido
(17um) y una cubierta exterior porosa
de 05um como zona de difusioacuten
Las Columnas Poroshell 120 tienen
Page 44
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 45
Poroshell 120 proporciona Eficacia Suficiente
Page 45
Flujo 0582 mLmin AcetonitriloAgua (6040)
Volumen de Inyeccioacuten 4 microL
TCC 26 oC
DAD Sig=2544nm Ref=360100nm
Muestra Muestra de test RRLC
(PN 5188-6529) inoculada con
50 microL 2 mgmL Tiourea en
aguaacetonitrilo (6535)
25 5 75 10
mAU
0
200
400
600
06
46
0
82
6
11
48
15
18
20
16
2
22
3
28
16
41
32
62
73
97
53
larr N = 25053 Presioacuten = 182 bar
Poroshell 120 EC-C18 30 x 100 mm 27 um
min 25 5 75 10 125
mAU
0
200
400
600
06
49
0
86
5
12
75
17
56
24
18
27
05
34
94
52
81
82
18
13
04
1
larr N = 27295 Presioacuten = 386 bar
Eclipse Plus C18 30 x 100 mm 18 um
gt90 de la Eficacia de una 18um
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 46
iquestEn queacute tipos de instrumentos puede usar
Columnas Poroshell 120 HPLCrsquos y UHPLCrsquos
Consideraciones en UHPLC
bull Las columnas Poroshell 120 tienen un liacutemite de presioacuten de 600 bar
bull Los UHPLC estaacuten ajustados para columnas de bajo volumen por lo tanto las
Poroshell pueden usarse en todos los UHPLC
Consideraciones en HPLC
bull Las Columnas Poroshell 120 trabajan bien por debajo de 400 bar
bull Minimize los volumenes extra columna para las columnas 21 y 30mm ID ndash
siga las instrucciones dadas para las columnas RRHT (18um 600 bar)
bull Use en el detector velocidades adecuadas de adquisicioacuten para picos
estrechos de alta eficacia
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Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 47
Con una frita de 2 um Poroshell 120 no se bloquea
Muestras Complejas- Plasma
Diflusinal in Plasma
0
20
40
60
80
100
120
140
160
180
200
220
240
260
280
300
320
340
360
380
400
1 501 1001 1501 2001 2501
Injections
Pre
ssu
re
0
20000
40000
60000
80000
100000
120000
140000
160000
180000
200000
Eff
icie
ncy (
N)
End Press
Plates
Columna Poroshell 120 EC-C18 30 x 50mm 27um LC Agilent 1200 RRLC (SL)
Muestra Plasma Precipitado 2 partes Plasma 7 Partes 2080 Agua-MeCN w01 Aacutecido Foacutermico con 1 Parte de Diflusinal en
5050 Agua-MeCN 10 ugml (Concentracion Final Diflusinal 1 ugml) Agitado y dejado reposar 10 minutos
No Centrifugado No Filtrado
Volumen de Inyeccioacuten 1ul
Solvente A Agua w01 TFA
Solvente B MeCN w008 TFA
Flujo 1 mlmin 1 ul inyeccioacuten
Tiempo B
0 20
05 90
06 90
11 20
25 20
Page 47
Diflusinal es un anti-inflamatorio no esteroidal anaacutelogo
a la aspirina desarrollado por Merck Sharp amp Dohme
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 48
Las Columnas Superficialmente Porosas Pueden
Usarse cumpliendo los Requirimientos USP
De la lista USP de empaquetamientos de columnas LC 42009
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Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 49
Criterios de Ajuste de Meacutetodos USP y FDA Criterios de Ajuste de Meacutetodos de Dimensiones de Columna
Paraacutemetro Especificaciones Maacuteximas ComentariosEjemplos
Longitud de Columna 70 250mm 75mm
150mm 50mm
Diaacutemetro Interno de
Columna
25 (FDA ORA-LAB 545)
USP ndash 25 ID Columna puede ajustarse si la
velocidad lineal es constante
46 mm 30 mm (-35)
46 mm 21 mm (-54)
30 mm 21 mm (-30)
Flow Rate 50
Volumen de Inyeccioacuten
Reducir tanto como se necesitendash
debe cumplir los liacutemites de
deteccioacuten y precisioacuten
Si cambia a una columna maacutes
corta haga el cambio apropiado
en el volumen de inyeccioacuten
Tamantildeo de Partiacutecula Reducir hasta el 50
(no se puede aumentar)
Puede cambiar la longitud de columna y el
tamantildeo de partiacutecula para mantener la misma
Rs
5um 35um (-30)
5um 27um (-46) Cambiado en 22409 ndash Para la copia oficial y actual ir a
httpwwwfdagovScienceResearchFieldSciencedefaulthtm
USP 30 Second Supplement Revisions PF34(5) en proceso
Ver ldquo Stimuli articlerdquo en Pharmacopeial Forum 2009 35(6)
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Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 50
Comparacioacuten de 46 x 250 mm 5 um con Poroshell
120 EC-C18 46 x 100 mm 27um
min 5 10 15 20 25 30
mAU
0
20
40
60
80
100
97
12
111
16
115
96
126
74
152
48
161
51
164
35
206
87
230
76
292
90
min 5 10 15 20 25 30
mAU
0
50
100
150
200
250
17
19
21
89
23
11
26
06
38
67
44
37 45
58
54
50
59
20
70
37
Anaacutelisis maacutes raacutepido(columna maacutes corta flujo maacutes alto)
Mayor sensibilidad(partiacutecula maacutes pequentildeapico maacutes estrecho)
Maacutes optimizado (un anaacutelisis maacutes raacutepido permite ajustar mejor)
Ambos anaacutelisis en Agilent 1100 G1315B DAD (bajo 400 bar)
No se requiere cambio en la preparacioacuten de muestra frita de entrada
de 2 micras en ambas columnas
325 bar
110 bar
Sulfadiazina
Sulfatiazol
Sulfapiridina
Sulfamerazina
Sulfametazina
Sulfametazol
Sulfametoxipiridazina
Sulfacloropiridazina
Sulfametoxazol
Sulfadimetoxina
Tiempo B
0 8
33 33
34 33
Columna Eclipse Plus C18
46 x 250mm 5um
Flujo 1 mLmin
Fase Moacutevil
A 01 Aacutecido Foacutermico en Agua
B 01 Aacutecido Foacutermico en ACN
Tiempo B
0 8
12 33
132 33
Columna 46 x 100mm
Poroshell 120 EC-C18
27um
Flujo 185 mLmin
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Comparacioacuten de 46 x 250 mm 5 um con Poroshell
120 EC-C18 46 x 100 mm 27um
min 5 10 15 20 25 30
mAU
0
20
40
60
80
100
97
12
111
16
115
96
126
74
152
48
161
51
164
35
206
87
230
76
292
90
110 bar
5
mAU
0
50
100
150
200
250
17
19
21
89
23
11
26
06
38
67
44
37 45
58
54
50
59
20
70
37
325 bar
min
Ver condiciones en diapositiva anterior
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Mejor Resolucioacuten
linea base
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 52
Anaacutelisis maacutes raacutepido del meacutetodo USP para pastillas de
Simvastatina en Columnas Poroshell 120ndash Ajuste del meacutetodo
46 x 250 mm 5-um
Agilent ZORBAX Eclipse Plus C18
46 x 75 mm 27-um
Agilent Poroshell 120 EC-C18
65 CH3CN 35 39 gL NaH2PO4 (pH 45) 45 oC Sig = 238 8 Ref = 360 100 nm
Flujos 15 mLmin para la columna de 5-um 28 mLmin para la columna Poroshell 120 27um
Requerimiento
USP
5-um
(15 mLmin)
27-um
(28 mLmin)
TR na 9907 1457
krsquo gt 30 5962 5122
N gt 4500 16939 14439
Tf lt 20 109 110
min 2 4 6 8 10
mAU
0
5
10
15
20
25
30
35
40
min 2
mAU
0
5
10
15
20
25
30
35
40
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Ajustes de los parametros cromatograficos en la
transferencia de meacutetodos Escalado del volume de inyeccioacuten
v1 x [(r22 x L2)(r1
2 x L1)] = V2
O bien
v2 = V1 x [(d22 x L2)(d1
2 x L1)]
v volume de inyeccioacuten
r radio de la columna
L longitud de la columna
Ajuste del flujo
F2= F1 x (L2L1 ) x (r2r1 )2
L longitud de la columna
F Flujo
r radio de la columna
Ajuste de la longitud del gradiente
En funcioacuten de la longitud de la columna
L2L1= tg2tg1
En funcioacuten del volumen muerto de columna y del flujo
tG2= tG1 x (V2V1) x (F1F2) t tiempos de gradiente
V volumen muerto de columna
F flujo
Columna ID Volumen muerto aprox
por mm longitud
46mm 100uL
30mm 425uL
21mm 208uL
10mm 047uL
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 54
Notas de Aplicacioacuten en Poroshell 120 y QuEChERS
Determination of Hormones in Shrimp by Agilent 1290 Infinity LC with
Agilent Poroshell 120 LC Column and Agilent QuEChERS for Sample
Preparation (publication 5990-6589EN)
Analysis of Pesticide Residues in Green Tea Using Agilent SampliQ
QuEChERS EN Kit by LCMSMS Detection (publication 5990-
6400EN)
Analysis of Pesticide Residues in Rice Using Agilent Bond Elut
QuEChERS AOAC Kit (publication 5990-8034EN)
Poroshell 120 for pharmaceutical analysis
Poroshell 120 Resources
QuEChERS Applications
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 55
Sumario
bull La columna Poroshell 120 es una nueva alternativa para LC de Alta
Resolucioacuten y Alta Velocidad que puede usarse en cualquier HPLC o UHPLC
bull Con la Poroshell 120 se pueden lograr separaciones de alta eficacia a baja
presioacuten
bull Puede usarse con muestras sucias sin ver una elevacioacuten anormal de la
presioacuten
bull Puede usarse en un meacutetodo USP sin comprometer los Criterios de Ajustes de
Meacutetodo
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Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 56
Soporte Teacutecnico Agilent
Teleacutefono de Atencioacuten al Cliente
901 11 68 90
email customercare_spainagilentcom
wwwagilentcomchem
![Page 29: Análisis de compuestos farmacéuticos en sangre total · PDF fileReducción en el procesamiento, el envío de la muestra, y los ... Gas flow: 10 L/min Nebulizer: 10 psi Sheath gas](https://reader031.vdocuments.site/reader031/viewer/2022030405/5a7a81727f8b9a0a668b45aa/html5/thumbnails/29.jpg)
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 29
Procedimiento Baacutesico QuEChERS
15 g muestra homogeneizada (fortificada)
Antildeadir 15 mL ACN (1 AA) vortex
Antildeadir Sales de Extraccioacuten AOAC agitar
Centrifugar
Transferir 1 u 8 mL a un tubo d-SPE AOAC vortex centrifugar
Transferir al vial de Anaacutelisis
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 30
Ventajas y desventajas del Procedimiento QuEChERS
Ventajas
Extraccioacuten tipo liacutequidoliacutequido
Uso de aacutecido para interrumpir el ligado de proteinas
Exceso de sal para lisar los componentes celulares
Uso de acetonitrilo para facilitar la precipitacioacuten proteacuteica
Uso de SPE dispersiva para adsorber las interferencias de la matriz
Plossl etat J Chrom A 1135 (2006) 19-26
Desventajas
La cantidad de solvente y de muestra requeridos en el meacutetodo no
son ldquobioloacutegicamente adecuadosrdquo
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 31
Propoacutesito de la propuesta mini-Q
Ofrecer un enfoque maacutes adecuado biologicamente
Requirimientos de menores volumenes y tamantildeos de
muestra
Rango de faacutermacos varias polaridades y pKa
Evaluaciacuteoacuten de las interferencias de fondo
Extraccioacuten y datos de recuperacioacuten en un rango
aceptable
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 32
Faacutermacos en sangre Procedimiento mini-QuEChERS
mini-Q
Procedimiento
1 Antildeadir 2 homogeneizadores ceraacutemicos
2 Antildeadir 1 o 2 mL de sangre entera a un tubo de centriacutefuga con tapoacuten de rosca
3 Antildeadir estandar interno vortex
4 Antildeadir 2 mL de ACN acidificado ( 04 FA) vortex 30 seg
5 Antildeadir 500 mg de sales de extraccioacuten agitar vigorsamente 1 minuto centrifugar 5000 rpm 1 min
6 Transferir 1 mL del extraccto al material de d-SPE en tubo de centrifuga vortex centrifugar
7 Antildeadir 200 uL a 800 uL de agua en un vial LC vortex y analizar
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 33
Refinamiento del Procedimiento mini-Q
Paraacutemetros evaluados en la teacutecnica mini-Q
Muestra de sangre total
bull La matriz bioloacutegica maacutes complicada
Adicioacuten de aacutecido tipo y cantidad
bull Efecto en la particioacuten y extraccioacuten
Adicioacuten de las sales de QuEChERS no-tamponadas o
tamponadas con NaAcetato o Citrato
bull Efecto en el extracto inspeccioacuten visual
SPE Dispersiva
bull Limpieza de la matriz y recuperaciones de los compuestos
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 34
Conclusiones del estudio
El ACN con 4 de FA como solvente de extraccioacuten muestra
una lisis maacutes completa de la muestra frente a otros solventes
de extraccioacuten que mostraron una masa soacutelida
Las sales tamponadas AOAC de acetato Soacutedico generan el
extracto maacutes liacutempio y fueron elegidas para la d-SPE
El paso de dSPE no ofrece un clean up adicional para los
meacutetodos de extraccioacuten con sales EN y no tamponadas
principalmente
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 35
Datos de Adquisicoacuten LCMSMS
Compuestos Canales MRM
(mz) Fragmentador
(V) CE (V) RT (min) Delta RT
Lidocaina 1) 23518 gt 861
2) 23518 gt 581
97 11
35
137 04
Tramadol 1) 2642 gt 581
2) 2642 gt 2461
97 15
3
120 04
Amitriptilina 1) 2782 gt 117
2) 2782 gt 105
112 19
19
425 04
Biperidena 1)31223 gt 981
2) 31223 gt 551
123 19
60
423 07
Oxazepam 1) 28706 gt 2409
2) 28706 gt 2689
112 19
7
399 04
Lorazepam 1) 32102 gt 2749
2) 32102 gt 3029
113 15
7
409 04
Clorpromazina 1) 31911 gt 861
2) 31911 gt 581
112 15
43
463 04
Diltiazem 1) 41517 gt 1779
2) 41517 gt 1499
128 19
43
373 04
Naloxona 1) 32816 gt 310
2) 32816 gt 212
123 15
39
082 04
Nortriptilina (IS) 1) 26418 gt 233
2) 26418 gt 91
97 7
19
417 04
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0125
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045
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055
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06
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1
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105
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11
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115
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12
1225
125
1275
13
1325
135
1375
+ESI TIC Scan Frag=800V AOAC_BLANK_110228bd
1 1
Counts vs Acquisition Time (min)
05 1 15 2 25
3 35 4 45 5 55 6 65 7 75 8 85 9 95 10
Columna Poroshell 120 EC-C18 27
micro 21 x 100 mm PN 695775-902
Fase Moacutevil
A 5 mM Acetato Amoacutenico pH 5
2080 MeOHagua
B 5 mM Acetato amoacutencio en ACN
Flujo 04mLmin
Inyeccioacuten 10uL
GT (ordmC) 300
GF (lmin) 7
Nebulizador (psi) 40
SGT (ordmC) 400
SFG (lmin) 12
Capilar (V) 3500
NV (V) 500
Condiciones LCMS
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48
49
5
51
+ESI MRM Frag=1120V CID190 (2782000 -gt 1170000) HQC_6d
1 1
Counts vs Acquisition Time (min) 01 02 03 04 05 06 07 08 09 1 11 12 13 14 15 16 17 18 19 2 21 22 23 24 25 26 27 28 29 3 31 32 33 34 35 36 37 38 39 4 41 42 43 44 45 46
Nalo
xo
ne
Lid
oc
ain
e
Tra
mad
ol
Oxazep
am
Lo
razep
am
Bip
eri
de
n
Am
itri
pty
lin
e
Dil
tiazem
Ch
lorp
rom
azin
e
No
rtri
pty
lin
e (
IS)
Cromatograma LCMSMS de 10 ngmL de sangre total fortificada despueacutes
de extraccioacuten mini-QuEChERS AOAC (NaAc) y d-SPE (50mg PSA y
150mg MgSO4)
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2
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51
+ESI MRM Frag=1120V CID190 (2782000 -gt 1170000) HQC_6d
1 1
Counts vs Acquisition Time (min) 01 02 03 04 05 06 07 08 09 1 11 12 13 14 15 16 17 18 19 2 21 22 23 24 25 26 27 28 29 3 31 32 33 34 35 36 37 38 39 4 41 42 43 44 45 46
1 x10
415 42 425 43 435 44 445 45 455 46 465 47 475 48 485 49 495 5
505 51 515 52 525 53 535 54 545 55 555 56 565 57
+ESI MRM Frag=1120V CID190 (2871000 -gt 2409000) RE_L_1d 1
Counts vs Acquisition Time (min) 305 31 315 32 325 33 335 34 345 35 355 36 365 37 375 38 385 39 395 4 405 41 415 42 425 43 435 44 445 45 455 46 465 47 475
Relacioacuten sentildealruido para el Oxazepam y Lorazepam a
10 ngmL (10 ppb)
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 39
La Naloxone muestra esta curva de linealidad de10-250 ngmL (ppb) con una R2
= 0991
Las curvas de calibracioacuten se generaron con la respuestra relativa (area pico
analitoarea pico IS) frente a la concentracioacuten relativa (concentracion de
analitoconcentracioacuten de IS)
Ejemplo de curva de linealidad para Naloxona extraido
con mini-QuEChERS
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 40
Recuperacioacuten y Reproducibilidad
Compuesto 50 ngmL Spiked
Recuperacioacuten RSD
100 ngmL Spiked
Recuperacioacuten RSD
Lidocaine 987 157 100 118
Tramadol 105 30 104 82
Amitriptyline 104 21 104 82
Biperidene 97 45 99 82
Oxazepam 770 92 78 86
Lorazepam 819 68 818 86
Chlorpromazine 110 103 105 63
Diltiazem 881 27 917 83
Naloxone 806 90 755 77
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 41
Conclusioacutenes y trabajo posterior
El meacutetodo mini-QuEChERS para la extraccioacuten de compuestos farmaceacuteuticos en
sangre total ofrece una alternativa a otras teacutecnicas de preparacioacuten de muestras
La preparacioacuten de muestras mini-QuEChERS es un enfoque simple facil y
barato que requiere una miacutenima experiencia en preparacioacuten de muestras y
miacutenimo equipamiento
Es un punto de partida para ampliar el numero y las clasificaciones evaluadas
en otras matrices bioloacutegicas y en sangre postmortem
El trabajo futuro incluira combinaciones adecuadas tanto de las sales de
extraccioacuten como de los sorbentes de d-SPE por el meacutetodo mini-QuEChERS
La columna Poroshell 120 ofrece una selectividad diferente y excelentes formas
de pico a lo largo del amplio rango de compuestos farmaceacuteuticos usados en este
estudio
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 42
Referencias
(1) M Anastassiades SJ Lehotay D Štajnbaher and FJ Schenk J AOAC Int 86 4121 (2003)
(2) G Stubbings and T Bigwood Anal Chim Acta 637 68 (2009)
(3) RR Rasmussen IMLD Storm PZH Rasmussen J Smedsgaard and KF Nielsen Anal Bioanal Chem 397 765 (2010)
(4) D Smith and K Lynam GCμECD analysis and confirmation of PCBs in fish tissue with Agilent JampW DB-35ms and DB-XLB GC columns Agilent Technologies 5990-6236EN (2010)
(5) F Ploumlssl M Giera and F Bracher J Chrom A 1135 19 (2006)
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 43
MEJORAR LA PRODUCTIVIDAD EN
HPLC ESTAacuteNDAR CON COLUMNAS
POROSHELL
Page 43
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 44
Columnas Poroshell 120 para HPLC y UHPLC
bull 80-90 de eficacia de las sub 2um
bull A presiones un ~40-50 maacutes bajas
bull Con un tamantildeo de partiacutecula de 27um
bull Con una frita de entrada de 2um
bull Con el doble de resolucioacuten de una
columna de 35um
bull Con un liacutemite de presioacuten de 600 bar
bull La partiacutecula tiene un nuacutecleo soacutelido
(17um) y una cubierta exterior porosa
de 05um como zona de difusioacuten
Las Columnas Poroshell 120 tienen
Page 44
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 45
Poroshell 120 proporciona Eficacia Suficiente
Page 45
Flujo 0582 mLmin AcetonitriloAgua (6040)
Volumen de Inyeccioacuten 4 microL
TCC 26 oC
DAD Sig=2544nm Ref=360100nm
Muestra Muestra de test RRLC
(PN 5188-6529) inoculada con
50 microL 2 mgmL Tiourea en
aguaacetonitrilo (6535)
25 5 75 10
mAU
0
200
400
600
06
46
0
82
6
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48
15
18
20
16
2
22
3
28
16
41
32
62
73
97
53
larr N = 25053 Presioacuten = 182 bar
Poroshell 120 EC-C18 30 x 100 mm 27 um
min 25 5 75 10 125
mAU
0
200
400
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0
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27
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34
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52
81
82
18
13
04
1
larr N = 27295 Presioacuten = 386 bar
Eclipse Plus C18 30 x 100 mm 18 um
gt90 de la Eficacia de una 18um
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 46
iquestEn queacute tipos de instrumentos puede usar
Columnas Poroshell 120 HPLCrsquos y UHPLCrsquos
Consideraciones en UHPLC
bull Las columnas Poroshell 120 tienen un liacutemite de presioacuten de 600 bar
bull Los UHPLC estaacuten ajustados para columnas de bajo volumen por lo tanto las
Poroshell pueden usarse en todos los UHPLC
Consideraciones en HPLC
bull Las Columnas Poroshell 120 trabajan bien por debajo de 400 bar
bull Minimize los volumenes extra columna para las columnas 21 y 30mm ID ndash
siga las instrucciones dadas para las columnas RRHT (18um 600 bar)
bull Use en el detector velocidades adecuadas de adquisicioacuten para picos
estrechos de alta eficacia
Page 46
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 47
Con una frita de 2 um Poroshell 120 no se bloquea
Muestras Complejas- Plasma
Diflusinal in Plasma
0
20
40
60
80
100
120
140
160
180
200
220
240
260
280
300
320
340
360
380
400
1 501 1001 1501 2001 2501
Injections
Pre
ssu
re
0
20000
40000
60000
80000
100000
120000
140000
160000
180000
200000
Eff
icie
ncy (
N)
End Press
Plates
Columna Poroshell 120 EC-C18 30 x 50mm 27um LC Agilent 1200 RRLC (SL)
Muestra Plasma Precipitado 2 partes Plasma 7 Partes 2080 Agua-MeCN w01 Aacutecido Foacutermico con 1 Parte de Diflusinal en
5050 Agua-MeCN 10 ugml (Concentracion Final Diflusinal 1 ugml) Agitado y dejado reposar 10 minutos
No Centrifugado No Filtrado
Volumen de Inyeccioacuten 1ul
Solvente A Agua w01 TFA
Solvente B MeCN w008 TFA
Flujo 1 mlmin 1 ul inyeccioacuten
Tiempo B
0 20
05 90
06 90
11 20
25 20
Page 47
Diflusinal es un anti-inflamatorio no esteroidal anaacutelogo
a la aspirina desarrollado por Merck Sharp amp Dohme
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 48
Las Columnas Superficialmente Porosas Pueden
Usarse cumpliendo los Requirimientos USP
De la lista USP de empaquetamientos de columnas LC 42009
Page 48
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 49
Criterios de Ajuste de Meacutetodos USP y FDA Criterios de Ajuste de Meacutetodos de Dimensiones de Columna
Paraacutemetro Especificaciones Maacuteximas ComentariosEjemplos
Longitud de Columna 70 250mm 75mm
150mm 50mm
Diaacutemetro Interno de
Columna
25 (FDA ORA-LAB 545)
USP ndash 25 ID Columna puede ajustarse si la
velocidad lineal es constante
46 mm 30 mm (-35)
46 mm 21 mm (-54)
30 mm 21 mm (-30)
Flow Rate 50
Volumen de Inyeccioacuten
Reducir tanto como se necesitendash
debe cumplir los liacutemites de
deteccioacuten y precisioacuten
Si cambia a una columna maacutes
corta haga el cambio apropiado
en el volumen de inyeccioacuten
Tamantildeo de Partiacutecula Reducir hasta el 50
(no se puede aumentar)
Puede cambiar la longitud de columna y el
tamantildeo de partiacutecula para mantener la misma
Rs
5um 35um (-30)
5um 27um (-46) Cambiado en 22409 ndash Para la copia oficial y actual ir a
httpwwwfdagovScienceResearchFieldSciencedefaulthtm
USP 30 Second Supplement Revisions PF34(5) en proceso
Ver ldquo Stimuli articlerdquo en Pharmacopeial Forum 2009 35(6)
Page 49
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 50
Comparacioacuten de 46 x 250 mm 5 um con Poroshell
120 EC-C18 46 x 100 mm 27um
min 5 10 15 20 25 30
mAU
0
20
40
60
80
100
97
12
111
16
115
96
126
74
152
48
161
51
164
35
206
87
230
76
292
90
min 5 10 15 20 25 30
mAU
0
50
100
150
200
250
17
19
21
89
23
11
26
06
38
67
44
37 45
58
54
50
59
20
70
37
Anaacutelisis maacutes raacutepido(columna maacutes corta flujo maacutes alto)
Mayor sensibilidad(partiacutecula maacutes pequentildeapico maacutes estrecho)
Maacutes optimizado (un anaacutelisis maacutes raacutepido permite ajustar mejor)
Ambos anaacutelisis en Agilent 1100 G1315B DAD (bajo 400 bar)
No se requiere cambio en la preparacioacuten de muestra frita de entrada
de 2 micras en ambas columnas
325 bar
110 bar
Sulfadiazina
Sulfatiazol
Sulfapiridina
Sulfamerazina
Sulfametazina
Sulfametazol
Sulfametoxipiridazina
Sulfacloropiridazina
Sulfametoxazol
Sulfadimetoxina
Tiempo B
0 8
33 33
34 33
Columna Eclipse Plus C18
46 x 250mm 5um
Flujo 1 mLmin
Fase Moacutevil
A 01 Aacutecido Foacutermico en Agua
B 01 Aacutecido Foacutermico en ACN
Tiempo B
0 8
12 33
132 33
Columna 46 x 100mm
Poroshell 120 EC-C18
27um
Flujo 185 mLmin
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Comparacioacuten de 46 x 250 mm 5 um con Poroshell
120 EC-C18 46 x 100 mm 27um
min 5 10 15 20 25 30
mAU
0
20
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97
12
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161
51
164
35
206
87
230
76
292
90
110 bar
5
mAU
0
50
100
150
200
250
17
19
21
89
23
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26
06
38
67
44
37 45
58
54
50
59
20
70
37
325 bar
min
Ver condiciones en diapositiva anterior
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Mejor Resolucioacuten
linea base
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 52
Anaacutelisis maacutes raacutepido del meacutetodo USP para pastillas de
Simvastatina en Columnas Poroshell 120ndash Ajuste del meacutetodo
46 x 250 mm 5-um
Agilent ZORBAX Eclipse Plus C18
46 x 75 mm 27-um
Agilent Poroshell 120 EC-C18
65 CH3CN 35 39 gL NaH2PO4 (pH 45) 45 oC Sig = 238 8 Ref = 360 100 nm
Flujos 15 mLmin para la columna de 5-um 28 mLmin para la columna Poroshell 120 27um
Requerimiento
USP
5-um
(15 mLmin)
27-um
(28 mLmin)
TR na 9907 1457
krsquo gt 30 5962 5122
N gt 4500 16939 14439
Tf lt 20 109 110
min 2 4 6 8 10
mAU
0
5
10
15
20
25
30
35
40
min 2
mAU
0
5
10
15
20
25
30
35
40
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 53
Ajustes de los parametros cromatograficos en la
transferencia de meacutetodos Escalado del volume de inyeccioacuten
v1 x [(r22 x L2)(r1
2 x L1)] = V2
O bien
v2 = V1 x [(d22 x L2)(d1
2 x L1)]
v volume de inyeccioacuten
r radio de la columna
L longitud de la columna
Ajuste del flujo
F2= F1 x (L2L1 ) x (r2r1 )2
L longitud de la columna
F Flujo
r radio de la columna
Ajuste de la longitud del gradiente
En funcioacuten de la longitud de la columna
L2L1= tg2tg1
En funcioacuten del volumen muerto de columna y del flujo
tG2= tG1 x (V2V1) x (F1F2) t tiempos de gradiente
V volumen muerto de columna
F flujo
Columna ID Volumen muerto aprox
por mm longitud
46mm 100uL
30mm 425uL
21mm 208uL
10mm 047uL
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 54
Notas de Aplicacioacuten en Poroshell 120 y QuEChERS
Determination of Hormones in Shrimp by Agilent 1290 Infinity LC with
Agilent Poroshell 120 LC Column and Agilent QuEChERS for Sample
Preparation (publication 5990-6589EN)
Analysis of Pesticide Residues in Green Tea Using Agilent SampliQ
QuEChERS EN Kit by LCMSMS Detection (publication 5990-
6400EN)
Analysis of Pesticide Residues in Rice Using Agilent Bond Elut
QuEChERS AOAC Kit (publication 5990-8034EN)
Poroshell 120 for pharmaceutical analysis
Poroshell 120 Resources
QuEChERS Applications
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 55
Sumario
bull La columna Poroshell 120 es una nueva alternativa para LC de Alta
Resolucioacuten y Alta Velocidad que puede usarse en cualquier HPLC o UHPLC
bull Con la Poroshell 120 se pueden lograr separaciones de alta eficacia a baja
presioacuten
bull Puede usarse con muestras sucias sin ver una elevacioacuten anormal de la
presioacuten
bull Puede usarse en un meacutetodo USP sin comprometer los Criterios de Ajustes de
Meacutetodo
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Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 56
Soporte Teacutecnico Agilent
Teleacutefono de Atencioacuten al Cliente
901 11 68 90
email customercare_spainagilentcom
wwwagilentcomchem
![Page 30: Análisis de compuestos farmacéuticos en sangre total · PDF fileReducción en el procesamiento, el envío de la muestra, y los ... Gas flow: 10 L/min Nebulizer: 10 psi Sheath gas](https://reader031.vdocuments.site/reader031/viewer/2022030405/5a7a81727f8b9a0a668b45aa/html5/thumbnails/30.jpg)
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 30
Ventajas y desventajas del Procedimiento QuEChERS
Ventajas
Extraccioacuten tipo liacutequidoliacutequido
Uso de aacutecido para interrumpir el ligado de proteinas
Exceso de sal para lisar los componentes celulares
Uso de acetonitrilo para facilitar la precipitacioacuten proteacuteica
Uso de SPE dispersiva para adsorber las interferencias de la matriz
Plossl etat J Chrom A 1135 (2006) 19-26
Desventajas
La cantidad de solvente y de muestra requeridos en el meacutetodo no
son ldquobioloacutegicamente adecuadosrdquo
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 31
Propoacutesito de la propuesta mini-Q
Ofrecer un enfoque maacutes adecuado biologicamente
Requirimientos de menores volumenes y tamantildeos de
muestra
Rango de faacutermacos varias polaridades y pKa
Evaluaciacuteoacuten de las interferencias de fondo
Extraccioacuten y datos de recuperacioacuten en un rango
aceptable
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 32
Faacutermacos en sangre Procedimiento mini-QuEChERS
mini-Q
Procedimiento
1 Antildeadir 2 homogeneizadores ceraacutemicos
2 Antildeadir 1 o 2 mL de sangre entera a un tubo de centriacutefuga con tapoacuten de rosca
3 Antildeadir estandar interno vortex
4 Antildeadir 2 mL de ACN acidificado ( 04 FA) vortex 30 seg
5 Antildeadir 500 mg de sales de extraccioacuten agitar vigorsamente 1 minuto centrifugar 5000 rpm 1 min
6 Transferir 1 mL del extraccto al material de d-SPE en tubo de centrifuga vortex centrifugar
7 Antildeadir 200 uL a 800 uL de agua en un vial LC vortex y analizar
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 33
Refinamiento del Procedimiento mini-Q
Paraacutemetros evaluados en la teacutecnica mini-Q
Muestra de sangre total
bull La matriz bioloacutegica maacutes complicada
Adicioacuten de aacutecido tipo y cantidad
bull Efecto en la particioacuten y extraccioacuten
Adicioacuten de las sales de QuEChERS no-tamponadas o
tamponadas con NaAcetato o Citrato
bull Efecto en el extracto inspeccioacuten visual
SPE Dispersiva
bull Limpieza de la matriz y recuperaciones de los compuestos
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 34
Conclusiones del estudio
El ACN con 4 de FA como solvente de extraccioacuten muestra
una lisis maacutes completa de la muestra frente a otros solventes
de extraccioacuten que mostraron una masa soacutelida
Las sales tamponadas AOAC de acetato Soacutedico generan el
extracto maacutes liacutempio y fueron elegidas para la d-SPE
El paso de dSPE no ofrece un clean up adicional para los
meacutetodos de extraccioacuten con sales EN y no tamponadas
principalmente
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 35
Datos de Adquisicoacuten LCMSMS
Compuestos Canales MRM
(mz) Fragmentador
(V) CE (V) RT (min) Delta RT
Lidocaina 1) 23518 gt 861
2) 23518 gt 581
97 11
35
137 04
Tramadol 1) 2642 gt 581
2) 2642 gt 2461
97 15
3
120 04
Amitriptilina 1) 2782 gt 117
2) 2782 gt 105
112 19
19
425 04
Biperidena 1)31223 gt 981
2) 31223 gt 551
123 19
60
423 07
Oxazepam 1) 28706 gt 2409
2) 28706 gt 2689
112 19
7
399 04
Lorazepam 1) 32102 gt 2749
2) 32102 gt 3029
113 15
7
409 04
Clorpromazina 1) 31911 gt 861
2) 31911 gt 581
112 15
43
463 04
Diltiazem 1) 41517 gt 1779
2) 41517 gt 1499
128 19
43
373 04
Naloxona 1) 32816 gt 310
2) 32816 gt 212
123 15
39
082 04
Nortriptilina (IS) 1) 26418 gt 233
2) 26418 gt 91
97 7
19
417 04
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045
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05
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055
0575
06
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065
0675
07
0725
075
0775
08
0825
085
0875
09
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095
0975
1
1025
105
1075
11
1125
115
1175
12
1225
125
1275
13
1325
135
1375
+ESI TIC Scan Frag=800V AOAC_BLANK_110228bd
1 1
Counts vs Acquisition Time (min)
05 1 15 2 25
3 35 4 45 5 55 6 65 7 75 8 85 9 95 10
Columna Poroshell 120 EC-C18 27
micro 21 x 100 mm PN 695775-902
Fase Moacutevil
A 5 mM Acetato Amoacutenico pH 5
2080 MeOHagua
B 5 mM Acetato amoacutencio en ACN
Flujo 04mLmin
Inyeccioacuten 10uL
GT (ordmC) 300
GF (lmin) 7
Nebulizador (psi) 40
SGT (ordmC) 400
SFG (lmin) 12
Capilar (V) 3500
NV (V) 500
Condiciones LCMS
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48
49
5
51
+ESI MRM Frag=1120V CID190 (2782000 -gt 1170000) HQC_6d
1 1
Counts vs Acquisition Time (min) 01 02 03 04 05 06 07 08 09 1 11 12 13 14 15 16 17 18 19 2 21 22 23 24 25 26 27 28 29 3 31 32 33 34 35 36 37 38 39 4 41 42 43 44 45 46
Nalo
xo
ne
Lid
oc
ain
e
Tra
mad
ol
Oxazep
am
Lo
razep
am
Bip
eri
de
n
Am
itri
pty
lin
e
Dil
tiazem
Ch
lorp
rom
azin
e
No
rtri
pty
lin
e (
IS)
Cromatograma LCMSMS de 10 ngmL de sangre total fortificada despueacutes
de extraccioacuten mini-QuEChERS AOAC (NaAc) y d-SPE (50mg PSA y
150mg MgSO4)
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2
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4
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48
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5
51
+ESI MRM Frag=1120V CID190 (2782000 -gt 1170000) HQC_6d
1 1
Counts vs Acquisition Time (min) 01 02 03 04 05 06 07 08 09 1 11 12 13 14 15 16 17 18 19 2 21 22 23 24 25 26 27 28 29 3 31 32 33 34 35 36 37 38 39 4 41 42 43 44 45 46
1 x10
415 42 425 43 435 44 445 45 455 46 465 47 475 48 485 49 495 5
505 51 515 52 525 53 535 54 545 55 555 56 565 57
+ESI MRM Frag=1120V CID190 (2871000 -gt 2409000) RE_L_1d 1
Counts vs Acquisition Time (min) 305 31 315 32 325 33 335 34 345 35 355 36 365 37 375 38 385 39 395 4 405 41 415 42 425 43 435 44 445 45 455 46 465 47 475
Relacioacuten sentildealruido para el Oxazepam y Lorazepam a
10 ngmL (10 ppb)
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 39
La Naloxone muestra esta curva de linealidad de10-250 ngmL (ppb) con una R2
= 0991
Las curvas de calibracioacuten se generaron con la respuestra relativa (area pico
analitoarea pico IS) frente a la concentracioacuten relativa (concentracion de
analitoconcentracioacuten de IS)
Ejemplo de curva de linealidad para Naloxona extraido
con mini-QuEChERS
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 40
Recuperacioacuten y Reproducibilidad
Compuesto 50 ngmL Spiked
Recuperacioacuten RSD
100 ngmL Spiked
Recuperacioacuten RSD
Lidocaine 987 157 100 118
Tramadol 105 30 104 82
Amitriptyline 104 21 104 82
Biperidene 97 45 99 82
Oxazepam 770 92 78 86
Lorazepam 819 68 818 86
Chlorpromazine 110 103 105 63
Diltiazem 881 27 917 83
Naloxone 806 90 755 77
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 41
Conclusioacutenes y trabajo posterior
El meacutetodo mini-QuEChERS para la extraccioacuten de compuestos farmaceacuteuticos en
sangre total ofrece una alternativa a otras teacutecnicas de preparacioacuten de muestras
La preparacioacuten de muestras mini-QuEChERS es un enfoque simple facil y
barato que requiere una miacutenima experiencia en preparacioacuten de muestras y
miacutenimo equipamiento
Es un punto de partida para ampliar el numero y las clasificaciones evaluadas
en otras matrices bioloacutegicas y en sangre postmortem
El trabajo futuro incluira combinaciones adecuadas tanto de las sales de
extraccioacuten como de los sorbentes de d-SPE por el meacutetodo mini-QuEChERS
La columna Poroshell 120 ofrece una selectividad diferente y excelentes formas
de pico a lo largo del amplio rango de compuestos farmaceacuteuticos usados en este
estudio
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 42
Referencias
(1) M Anastassiades SJ Lehotay D Štajnbaher and FJ Schenk J AOAC Int 86 4121 (2003)
(2) G Stubbings and T Bigwood Anal Chim Acta 637 68 (2009)
(3) RR Rasmussen IMLD Storm PZH Rasmussen J Smedsgaard and KF Nielsen Anal Bioanal Chem 397 765 (2010)
(4) D Smith and K Lynam GCμECD analysis and confirmation of PCBs in fish tissue with Agilent JampW DB-35ms and DB-XLB GC columns Agilent Technologies 5990-6236EN (2010)
(5) F Ploumlssl M Giera and F Bracher J Chrom A 1135 19 (2006)
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 43
MEJORAR LA PRODUCTIVIDAD EN
HPLC ESTAacuteNDAR CON COLUMNAS
POROSHELL
Page 43
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 44
Columnas Poroshell 120 para HPLC y UHPLC
bull 80-90 de eficacia de las sub 2um
bull A presiones un ~40-50 maacutes bajas
bull Con un tamantildeo de partiacutecula de 27um
bull Con una frita de entrada de 2um
bull Con el doble de resolucioacuten de una
columna de 35um
bull Con un liacutemite de presioacuten de 600 bar
bull La partiacutecula tiene un nuacutecleo soacutelido
(17um) y una cubierta exterior porosa
de 05um como zona de difusioacuten
Las Columnas Poroshell 120 tienen
Page 44
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 45
Poroshell 120 proporciona Eficacia Suficiente
Page 45
Flujo 0582 mLmin AcetonitriloAgua (6040)
Volumen de Inyeccioacuten 4 microL
TCC 26 oC
DAD Sig=2544nm Ref=360100nm
Muestra Muestra de test RRLC
(PN 5188-6529) inoculada con
50 microL 2 mgmL Tiourea en
aguaacetonitrilo (6535)
25 5 75 10
mAU
0
200
400
600
06
46
0
82
6
11
48
15
18
20
16
2
22
3
28
16
41
32
62
73
97
53
larr N = 25053 Presioacuten = 182 bar
Poroshell 120 EC-C18 30 x 100 mm 27 um
min 25 5 75 10 125
mAU
0
200
400
600
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0
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5
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24
18
27
05
34
94
52
81
82
18
13
04
1
larr N = 27295 Presioacuten = 386 bar
Eclipse Plus C18 30 x 100 mm 18 um
gt90 de la Eficacia de una 18um
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 46
iquestEn queacute tipos de instrumentos puede usar
Columnas Poroshell 120 HPLCrsquos y UHPLCrsquos
Consideraciones en UHPLC
bull Las columnas Poroshell 120 tienen un liacutemite de presioacuten de 600 bar
bull Los UHPLC estaacuten ajustados para columnas de bajo volumen por lo tanto las
Poroshell pueden usarse en todos los UHPLC
Consideraciones en HPLC
bull Las Columnas Poroshell 120 trabajan bien por debajo de 400 bar
bull Minimize los volumenes extra columna para las columnas 21 y 30mm ID ndash
siga las instrucciones dadas para las columnas RRHT (18um 600 bar)
bull Use en el detector velocidades adecuadas de adquisicioacuten para picos
estrechos de alta eficacia
Page 46
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 47
Con una frita de 2 um Poroshell 120 no se bloquea
Muestras Complejas- Plasma
Diflusinal in Plasma
0
20
40
60
80
100
120
140
160
180
200
220
240
260
280
300
320
340
360
380
400
1 501 1001 1501 2001 2501
Injections
Pre
ssu
re
0
20000
40000
60000
80000
100000
120000
140000
160000
180000
200000
Eff
icie
ncy (
N)
End Press
Plates
Columna Poroshell 120 EC-C18 30 x 50mm 27um LC Agilent 1200 RRLC (SL)
Muestra Plasma Precipitado 2 partes Plasma 7 Partes 2080 Agua-MeCN w01 Aacutecido Foacutermico con 1 Parte de Diflusinal en
5050 Agua-MeCN 10 ugml (Concentracion Final Diflusinal 1 ugml) Agitado y dejado reposar 10 minutos
No Centrifugado No Filtrado
Volumen de Inyeccioacuten 1ul
Solvente A Agua w01 TFA
Solvente B MeCN w008 TFA
Flujo 1 mlmin 1 ul inyeccioacuten
Tiempo B
0 20
05 90
06 90
11 20
25 20
Page 47
Diflusinal es un anti-inflamatorio no esteroidal anaacutelogo
a la aspirina desarrollado por Merck Sharp amp Dohme
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 48
Las Columnas Superficialmente Porosas Pueden
Usarse cumpliendo los Requirimientos USP
De la lista USP de empaquetamientos de columnas LC 42009
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Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 49
Criterios de Ajuste de Meacutetodos USP y FDA Criterios de Ajuste de Meacutetodos de Dimensiones de Columna
Paraacutemetro Especificaciones Maacuteximas ComentariosEjemplos
Longitud de Columna 70 250mm 75mm
150mm 50mm
Diaacutemetro Interno de
Columna
25 (FDA ORA-LAB 545)
USP ndash 25 ID Columna puede ajustarse si la
velocidad lineal es constante
46 mm 30 mm (-35)
46 mm 21 mm (-54)
30 mm 21 mm (-30)
Flow Rate 50
Volumen de Inyeccioacuten
Reducir tanto como se necesitendash
debe cumplir los liacutemites de
deteccioacuten y precisioacuten
Si cambia a una columna maacutes
corta haga el cambio apropiado
en el volumen de inyeccioacuten
Tamantildeo de Partiacutecula Reducir hasta el 50
(no se puede aumentar)
Puede cambiar la longitud de columna y el
tamantildeo de partiacutecula para mantener la misma
Rs
5um 35um (-30)
5um 27um (-46) Cambiado en 22409 ndash Para la copia oficial y actual ir a
httpwwwfdagovScienceResearchFieldSciencedefaulthtm
USP 30 Second Supplement Revisions PF34(5) en proceso
Ver ldquo Stimuli articlerdquo en Pharmacopeial Forum 2009 35(6)
Page 49
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 50
Comparacioacuten de 46 x 250 mm 5 um con Poroshell
120 EC-C18 46 x 100 mm 27um
min 5 10 15 20 25 30
mAU
0
20
40
60
80
100
97
12
111
16
115
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126
74
152
48
161
51
164
35
206
87
230
76
292
90
min 5 10 15 20 25 30
mAU
0
50
100
150
200
250
17
19
21
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26
06
38
67
44
37 45
58
54
50
59
20
70
37
Anaacutelisis maacutes raacutepido(columna maacutes corta flujo maacutes alto)
Mayor sensibilidad(partiacutecula maacutes pequentildeapico maacutes estrecho)
Maacutes optimizado (un anaacutelisis maacutes raacutepido permite ajustar mejor)
Ambos anaacutelisis en Agilent 1100 G1315B DAD (bajo 400 bar)
No se requiere cambio en la preparacioacuten de muestra frita de entrada
de 2 micras en ambas columnas
325 bar
110 bar
Sulfadiazina
Sulfatiazol
Sulfapiridina
Sulfamerazina
Sulfametazina
Sulfametazol
Sulfametoxipiridazina
Sulfacloropiridazina
Sulfametoxazol
Sulfadimetoxina
Tiempo B
0 8
33 33
34 33
Columna Eclipse Plus C18
46 x 250mm 5um
Flujo 1 mLmin
Fase Moacutevil
A 01 Aacutecido Foacutermico en Agua
B 01 Aacutecido Foacutermico en ACN
Tiempo B
0 8
12 33
132 33
Columna 46 x 100mm
Poroshell 120 EC-C18
27um
Flujo 185 mLmin
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Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 51
Comparacioacuten de 46 x 250 mm 5 um con Poroshell
120 EC-C18 46 x 100 mm 27um
min 5 10 15 20 25 30
mAU
0
20
40
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97
12
111
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51
164
35
206
87
230
76
292
90
110 bar
5
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0
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21
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67
44
37 45
58
54
50
59
20
70
37
325 bar
min
Ver condiciones en diapositiva anterior
Page 51
Mejor Resolucioacuten
linea base
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 52
Anaacutelisis maacutes raacutepido del meacutetodo USP para pastillas de
Simvastatina en Columnas Poroshell 120ndash Ajuste del meacutetodo
46 x 250 mm 5-um
Agilent ZORBAX Eclipse Plus C18
46 x 75 mm 27-um
Agilent Poroshell 120 EC-C18
65 CH3CN 35 39 gL NaH2PO4 (pH 45) 45 oC Sig = 238 8 Ref = 360 100 nm
Flujos 15 mLmin para la columna de 5-um 28 mLmin para la columna Poroshell 120 27um
Requerimiento
USP
5-um
(15 mLmin)
27-um
(28 mLmin)
TR na 9907 1457
krsquo gt 30 5962 5122
N gt 4500 16939 14439
Tf lt 20 109 110
min 2 4 6 8 10
mAU
0
5
10
15
20
25
30
35
40
min 2
mAU
0
5
10
15
20
25
30
35
40
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 53
Ajustes de los parametros cromatograficos en la
transferencia de meacutetodos Escalado del volume de inyeccioacuten
v1 x [(r22 x L2)(r1
2 x L1)] = V2
O bien
v2 = V1 x [(d22 x L2)(d1
2 x L1)]
v volume de inyeccioacuten
r radio de la columna
L longitud de la columna
Ajuste del flujo
F2= F1 x (L2L1 ) x (r2r1 )2
L longitud de la columna
F Flujo
r radio de la columna
Ajuste de la longitud del gradiente
En funcioacuten de la longitud de la columna
L2L1= tg2tg1
En funcioacuten del volumen muerto de columna y del flujo
tG2= tG1 x (V2V1) x (F1F2) t tiempos de gradiente
V volumen muerto de columna
F flujo
Columna ID Volumen muerto aprox
por mm longitud
46mm 100uL
30mm 425uL
21mm 208uL
10mm 047uL
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 54
Notas de Aplicacioacuten en Poroshell 120 y QuEChERS
Determination of Hormones in Shrimp by Agilent 1290 Infinity LC with
Agilent Poroshell 120 LC Column and Agilent QuEChERS for Sample
Preparation (publication 5990-6589EN)
Analysis of Pesticide Residues in Green Tea Using Agilent SampliQ
QuEChERS EN Kit by LCMSMS Detection (publication 5990-
6400EN)
Analysis of Pesticide Residues in Rice Using Agilent Bond Elut
QuEChERS AOAC Kit (publication 5990-8034EN)
Poroshell 120 for pharmaceutical analysis
Poroshell 120 Resources
QuEChERS Applications
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 55
Sumario
bull La columna Poroshell 120 es una nueva alternativa para LC de Alta
Resolucioacuten y Alta Velocidad que puede usarse en cualquier HPLC o UHPLC
bull Con la Poroshell 120 se pueden lograr separaciones de alta eficacia a baja
presioacuten
bull Puede usarse con muestras sucias sin ver una elevacioacuten anormal de la
presioacuten
bull Puede usarse en un meacutetodo USP sin comprometer los Criterios de Ajustes de
Meacutetodo
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Soporte Teacutecnico Agilent
Teleacutefono de Atencioacuten al Cliente
901 11 68 90
email customercare_spainagilentcom
wwwagilentcomchem
![Page 31: Análisis de compuestos farmacéuticos en sangre total · PDF fileReducción en el procesamiento, el envío de la muestra, y los ... Gas flow: 10 L/min Nebulizer: 10 psi Sheath gas](https://reader031.vdocuments.site/reader031/viewer/2022030405/5a7a81727f8b9a0a668b45aa/html5/thumbnails/31.jpg)
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Propoacutesito de la propuesta mini-Q
Ofrecer un enfoque maacutes adecuado biologicamente
Requirimientos de menores volumenes y tamantildeos de
muestra
Rango de faacutermacos varias polaridades y pKa
Evaluaciacuteoacuten de las interferencias de fondo
Extraccioacuten y datos de recuperacioacuten en un rango
aceptable
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 32
Faacutermacos en sangre Procedimiento mini-QuEChERS
mini-Q
Procedimiento
1 Antildeadir 2 homogeneizadores ceraacutemicos
2 Antildeadir 1 o 2 mL de sangre entera a un tubo de centriacutefuga con tapoacuten de rosca
3 Antildeadir estandar interno vortex
4 Antildeadir 2 mL de ACN acidificado ( 04 FA) vortex 30 seg
5 Antildeadir 500 mg de sales de extraccioacuten agitar vigorsamente 1 minuto centrifugar 5000 rpm 1 min
6 Transferir 1 mL del extraccto al material de d-SPE en tubo de centrifuga vortex centrifugar
7 Antildeadir 200 uL a 800 uL de agua en un vial LC vortex y analizar
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 33
Refinamiento del Procedimiento mini-Q
Paraacutemetros evaluados en la teacutecnica mini-Q
Muestra de sangre total
bull La matriz bioloacutegica maacutes complicada
Adicioacuten de aacutecido tipo y cantidad
bull Efecto en la particioacuten y extraccioacuten
Adicioacuten de las sales de QuEChERS no-tamponadas o
tamponadas con NaAcetato o Citrato
bull Efecto en el extracto inspeccioacuten visual
SPE Dispersiva
bull Limpieza de la matriz y recuperaciones de los compuestos
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 34
Conclusiones del estudio
El ACN con 4 de FA como solvente de extraccioacuten muestra
una lisis maacutes completa de la muestra frente a otros solventes
de extraccioacuten que mostraron una masa soacutelida
Las sales tamponadas AOAC de acetato Soacutedico generan el
extracto maacutes liacutempio y fueron elegidas para la d-SPE
El paso de dSPE no ofrece un clean up adicional para los
meacutetodos de extraccioacuten con sales EN y no tamponadas
principalmente
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 35
Datos de Adquisicoacuten LCMSMS
Compuestos Canales MRM
(mz) Fragmentador
(V) CE (V) RT (min) Delta RT
Lidocaina 1) 23518 gt 861
2) 23518 gt 581
97 11
35
137 04
Tramadol 1) 2642 gt 581
2) 2642 gt 2461
97 15
3
120 04
Amitriptilina 1) 2782 gt 117
2) 2782 gt 105
112 19
19
425 04
Biperidena 1)31223 gt 981
2) 31223 gt 551
123 19
60
423 07
Oxazepam 1) 28706 gt 2409
2) 28706 gt 2689
112 19
7
399 04
Lorazepam 1) 32102 gt 2749
2) 32102 gt 3029
113 15
7
409 04
Clorpromazina 1) 31911 gt 861
2) 31911 gt 581
112 15
43
463 04
Diltiazem 1) 41517 gt 1779
2) 41517 gt 1499
128 19
43
373 04
Naloxona 1) 32816 gt 310
2) 32816 gt 212
123 15
39
082 04
Nortriptilina (IS) 1) 26418 gt 233
2) 26418 gt 91
97 7
19
417 04
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06
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075
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095
0975
1
1025
105
1075
11
1125
115
1175
12
1225
125
1275
13
1325
135
1375
+ESI TIC Scan Frag=800V AOAC_BLANK_110228bd
1 1
Counts vs Acquisition Time (min)
05 1 15 2 25
3 35 4 45 5 55 6 65 7 75 8 85 9 95 10
Columna Poroshell 120 EC-C18 27
micro 21 x 100 mm PN 695775-902
Fase Moacutevil
A 5 mM Acetato Amoacutenico pH 5
2080 MeOHagua
B 5 mM Acetato amoacutencio en ACN
Flujo 04mLmin
Inyeccioacuten 10uL
GT (ordmC) 300
GF (lmin) 7
Nebulizador (psi) 40
SGT (ordmC) 400
SFG (lmin) 12
Capilar (V) 3500
NV (V) 500
Condiciones LCMS
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4
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48
49
5
51
+ESI MRM Frag=1120V CID190 (2782000 -gt 1170000) HQC_6d
1 1
Counts vs Acquisition Time (min) 01 02 03 04 05 06 07 08 09 1 11 12 13 14 15 16 17 18 19 2 21 22 23 24 25 26 27 28 29 3 31 32 33 34 35 36 37 38 39 4 41 42 43 44 45 46
Nalo
xo
ne
Lid
oc
ain
e
Tra
mad
ol
Oxazep
am
Lo
razep
am
Bip
eri
de
n
Am
itri
pty
lin
e
Dil
tiazem
Ch
lorp
rom
azin
e
No
rtri
pty
lin
e (
IS)
Cromatograma LCMSMS de 10 ngmL de sangre total fortificada despueacutes
de extraccioacuten mini-QuEChERS AOAC (NaAc) y d-SPE (50mg PSA y
150mg MgSO4)
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2
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4
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48
49
5
51
+ESI MRM Frag=1120V CID190 (2782000 -gt 1170000) HQC_6d
1 1
Counts vs Acquisition Time (min) 01 02 03 04 05 06 07 08 09 1 11 12 13 14 15 16 17 18 19 2 21 22 23 24 25 26 27 28 29 3 31 32 33 34 35 36 37 38 39 4 41 42 43 44 45 46
1 x10
415 42 425 43 435 44 445 45 455 46 465 47 475 48 485 49 495 5
505 51 515 52 525 53 535 54 545 55 555 56 565 57
+ESI MRM Frag=1120V CID190 (2871000 -gt 2409000) RE_L_1d 1
Counts vs Acquisition Time (min) 305 31 315 32 325 33 335 34 345 35 355 36 365 37 375 38 385 39 395 4 405 41 415 42 425 43 435 44 445 45 455 46 465 47 475
Relacioacuten sentildealruido para el Oxazepam y Lorazepam a
10 ngmL (10 ppb)
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 39
La Naloxone muestra esta curva de linealidad de10-250 ngmL (ppb) con una R2
= 0991
Las curvas de calibracioacuten se generaron con la respuestra relativa (area pico
analitoarea pico IS) frente a la concentracioacuten relativa (concentracion de
analitoconcentracioacuten de IS)
Ejemplo de curva de linealidad para Naloxona extraido
con mini-QuEChERS
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 40
Recuperacioacuten y Reproducibilidad
Compuesto 50 ngmL Spiked
Recuperacioacuten RSD
100 ngmL Spiked
Recuperacioacuten RSD
Lidocaine 987 157 100 118
Tramadol 105 30 104 82
Amitriptyline 104 21 104 82
Biperidene 97 45 99 82
Oxazepam 770 92 78 86
Lorazepam 819 68 818 86
Chlorpromazine 110 103 105 63
Diltiazem 881 27 917 83
Naloxone 806 90 755 77
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 41
Conclusioacutenes y trabajo posterior
El meacutetodo mini-QuEChERS para la extraccioacuten de compuestos farmaceacuteuticos en
sangre total ofrece una alternativa a otras teacutecnicas de preparacioacuten de muestras
La preparacioacuten de muestras mini-QuEChERS es un enfoque simple facil y
barato que requiere una miacutenima experiencia en preparacioacuten de muestras y
miacutenimo equipamiento
Es un punto de partida para ampliar el numero y las clasificaciones evaluadas
en otras matrices bioloacutegicas y en sangre postmortem
El trabajo futuro incluira combinaciones adecuadas tanto de las sales de
extraccioacuten como de los sorbentes de d-SPE por el meacutetodo mini-QuEChERS
La columna Poroshell 120 ofrece una selectividad diferente y excelentes formas
de pico a lo largo del amplio rango de compuestos farmaceacuteuticos usados en este
estudio
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 42
Referencias
(1) M Anastassiades SJ Lehotay D Štajnbaher and FJ Schenk J AOAC Int 86 4121 (2003)
(2) G Stubbings and T Bigwood Anal Chim Acta 637 68 (2009)
(3) RR Rasmussen IMLD Storm PZH Rasmussen J Smedsgaard and KF Nielsen Anal Bioanal Chem 397 765 (2010)
(4) D Smith and K Lynam GCμECD analysis and confirmation of PCBs in fish tissue with Agilent JampW DB-35ms and DB-XLB GC columns Agilent Technologies 5990-6236EN (2010)
(5) F Ploumlssl M Giera and F Bracher J Chrom A 1135 19 (2006)
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 43
MEJORAR LA PRODUCTIVIDAD EN
HPLC ESTAacuteNDAR CON COLUMNAS
POROSHELL
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Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 44
Columnas Poroshell 120 para HPLC y UHPLC
bull 80-90 de eficacia de las sub 2um
bull A presiones un ~40-50 maacutes bajas
bull Con un tamantildeo de partiacutecula de 27um
bull Con una frita de entrada de 2um
bull Con el doble de resolucioacuten de una
columna de 35um
bull Con un liacutemite de presioacuten de 600 bar
bull La partiacutecula tiene un nuacutecleo soacutelido
(17um) y una cubierta exterior porosa
de 05um como zona de difusioacuten
Las Columnas Poroshell 120 tienen
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Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 45
Poroshell 120 proporciona Eficacia Suficiente
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Flujo 0582 mLmin AcetonitriloAgua (6040)
Volumen de Inyeccioacuten 4 microL
TCC 26 oC
DAD Sig=2544nm Ref=360100nm
Muestra Muestra de test RRLC
(PN 5188-6529) inoculada con
50 microL 2 mgmL Tiourea en
aguaacetonitrilo (6535)
25 5 75 10
mAU
0
200
400
600
06
46
0
82
6
11
48
15
18
20
16
2
22
3
28
16
41
32
62
73
97
53
larr N = 25053 Presioacuten = 182 bar
Poroshell 120 EC-C18 30 x 100 mm 27 um
min 25 5 75 10 125
mAU
0
200
400
600
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49
0
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5
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18
27
05
34
94
52
81
82
18
13
04
1
larr N = 27295 Presioacuten = 386 bar
Eclipse Plus C18 30 x 100 mm 18 um
gt90 de la Eficacia de una 18um
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 46
iquestEn queacute tipos de instrumentos puede usar
Columnas Poroshell 120 HPLCrsquos y UHPLCrsquos
Consideraciones en UHPLC
bull Las columnas Poroshell 120 tienen un liacutemite de presioacuten de 600 bar
bull Los UHPLC estaacuten ajustados para columnas de bajo volumen por lo tanto las
Poroshell pueden usarse en todos los UHPLC
Consideraciones en HPLC
bull Las Columnas Poroshell 120 trabajan bien por debajo de 400 bar
bull Minimize los volumenes extra columna para las columnas 21 y 30mm ID ndash
siga las instrucciones dadas para las columnas RRHT (18um 600 bar)
bull Use en el detector velocidades adecuadas de adquisicioacuten para picos
estrechos de alta eficacia
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Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 47
Con una frita de 2 um Poroshell 120 no se bloquea
Muestras Complejas- Plasma
Diflusinal in Plasma
0
20
40
60
80
100
120
140
160
180
200
220
240
260
280
300
320
340
360
380
400
1 501 1001 1501 2001 2501
Injections
Pre
ssu
re
0
20000
40000
60000
80000
100000
120000
140000
160000
180000
200000
Eff
icie
ncy (
N)
End Press
Plates
Columna Poroshell 120 EC-C18 30 x 50mm 27um LC Agilent 1200 RRLC (SL)
Muestra Plasma Precipitado 2 partes Plasma 7 Partes 2080 Agua-MeCN w01 Aacutecido Foacutermico con 1 Parte de Diflusinal en
5050 Agua-MeCN 10 ugml (Concentracion Final Diflusinal 1 ugml) Agitado y dejado reposar 10 minutos
No Centrifugado No Filtrado
Volumen de Inyeccioacuten 1ul
Solvente A Agua w01 TFA
Solvente B MeCN w008 TFA
Flujo 1 mlmin 1 ul inyeccioacuten
Tiempo B
0 20
05 90
06 90
11 20
25 20
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Diflusinal es un anti-inflamatorio no esteroidal anaacutelogo
a la aspirina desarrollado por Merck Sharp amp Dohme
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 48
Las Columnas Superficialmente Porosas Pueden
Usarse cumpliendo los Requirimientos USP
De la lista USP de empaquetamientos de columnas LC 42009
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Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 49
Criterios de Ajuste de Meacutetodos USP y FDA Criterios de Ajuste de Meacutetodos de Dimensiones de Columna
Paraacutemetro Especificaciones Maacuteximas ComentariosEjemplos
Longitud de Columna 70 250mm 75mm
150mm 50mm
Diaacutemetro Interno de
Columna
25 (FDA ORA-LAB 545)
USP ndash 25 ID Columna puede ajustarse si la
velocidad lineal es constante
46 mm 30 mm (-35)
46 mm 21 mm (-54)
30 mm 21 mm (-30)
Flow Rate 50
Volumen de Inyeccioacuten
Reducir tanto como se necesitendash
debe cumplir los liacutemites de
deteccioacuten y precisioacuten
Si cambia a una columna maacutes
corta haga el cambio apropiado
en el volumen de inyeccioacuten
Tamantildeo de Partiacutecula Reducir hasta el 50
(no se puede aumentar)
Puede cambiar la longitud de columna y el
tamantildeo de partiacutecula para mantener la misma
Rs
5um 35um (-30)
5um 27um (-46) Cambiado en 22409 ndash Para la copia oficial y actual ir a
httpwwwfdagovScienceResearchFieldSciencedefaulthtm
USP 30 Second Supplement Revisions PF34(5) en proceso
Ver ldquo Stimuli articlerdquo en Pharmacopeial Forum 2009 35(6)
Page 49
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 50
Comparacioacuten de 46 x 250 mm 5 um con Poroshell
120 EC-C18 46 x 100 mm 27um
min 5 10 15 20 25 30
mAU
0
20
40
60
80
100
97
12
111
16
115
96
126
74
152
48
161
51
164
35
206
87
230
76
292
90
min 5 10 15 20 25 30
mAU
0
50
100
150
200
250
17
19
21
89
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11
26
06
38
67
44
37 45
58
54
50
59
20
70
37
Anaacutelisis maacutes raacutepido(columna maacutes corta flujo maacutes alto)
Mayor sensibilidad(partiacutecula maacutes pequentildeapico maacutes estrecho)
Maacutes optimizado (un anaacutelisis maacutes raacutepido permite ajustar mejor)
Ambos anaacutelisis en Agilent 1100 G1315B DAD (bajo 400 bar)
No se requiere cambio en la preparacioacuten de muestra frita de entrada
de 2 micras en ambas columnas
325 bar
110 bar
Sulfadiazina
Sulfatiazol
Sulfapiridina
Sulfamerazina
Sulfametazina
Sulfametazol
Sulfametoxipiridazina
Sulfacloropiridazina
Sulfametoxazol
Sulfadimetoxina
Tiempo B
0 8
33 33
34 33
Columna Eclipse Plus C18
46 x 250mm 5um
Flujo 1 mLmin
Fase Moacutevil
A 01 Aacutecido Foacutermico en Agua
B 01 Aacutecido Foacutermico en ACN
Tiempo B
0 8
12 33
132 33
Columna 46 x 100mm
Poroshell 120 EC-C18
27um
Flujo 185 mLmin
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Comparacioacuten de 46 x 250 mm 5 um con Poroshell
120 EC-C18 46 x 100 mm 27um
min 5 10 15 20 25 30
mAU
0
20
40
60
80
100
97
12
111
16
115
96
126
74
152
48
161
51
164
35
206
87
230
76
292
90
110 bar
5
mAU
0
50
100
150
200
250
17
19
21
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26
06
38
67
44
37 45
58
54
50
59
20
70
37
325 bar
min
Ver condiciones en diapositiva anterior
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Mejor Resolucioacuten
linea base
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 52
Anaacutelisis maacutes raacutepido del meacutetodo USP para pastillas de
Simvastatina en Columnas Poroshell 120ndash Ajuste del meacutetodo
46 x 250 mm 5-um
Agilent ZORBAX Eclipse Plus C18
46 x 75 mm 27-um
Agilent Poroshell 120 EC-C18
65 CH3CN 35 39 gL NaH2PO4 (pH 45) 45 oC Sig = 238 8 Ref = 360 100 nm
Flujos 15 mLmin para la columna de 5-um 28 mLmin para la columna Poroshell 120 27um
Requerimiento
USP
5-um
(15 mLmin)
27-um
(28 mLmin)
TR na 9907 1457
krsquo gt 30 5962 5122
N gt 4500 16939 14439
Tf lt 20 109 110
min 2 4 6 8 10
mAU
0
5
10
15
20
25
30
35
40
min 2
mAU
0
5
10
15
20
25
30
35
40
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Ajustes de los parametros cromatograficos en la
transferencia de meacutetodos Escalado del volume de inyeccioacuten
v1 x [(r22 x L2)(r1
2 x L1)] = V2
O bien
v2 = V1 x [(d22 x L2)(d1
2 x L1)]
v volume de inyeccioacuten
r radio de la columna
L longitud de la columna
Ajuste del flujo
F2= F1 x (L2L1 ) x (r2r1 )2
L longitud de la columna
F Flujo
r radio de la columna
Ajuste de la longitud del gradiente
En funcioacuten de la longitud de la columna
L2L1= tg2tg1
En funcioacuten del volumen muerto de columna y del flujo
tG2= tG1 x (V2V1) x (F1F2) t tiempos de gradiente
V volumen muerto de columna
F flujo
Columna ID Volumen muerto aprox
por mm longitud
46mm 100uL
30mm 425uL
21mm 208uL
10mm 047uL
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 54
Notas de Aplicacioacuten en Poroshell 120 y QuEChERS
Determination of Hormones in Shrimp by Agilent 1290 Infinity LC with
Agilent Poroshell 120 LC Column and Agilent QuEChERS for Sample
Preparation (publication 5990-6589EN)
Analysis of Pesticide Residues in Green Tea Using Agilent SampliQ
QuEChERS EN Kit by LCMSMS Detection (publication 5990-
6400EN)
Analysis of Pesticide Residues in Rice Using Agilent Bond Elut
QuEChERS AOAC Kit (publication 5990-8034EN)
Poroshell 120 for pharmaceutical analysis
Poroshell 120 Resources
QuEChERS Applications
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 55
Sumario
bull La columna Poroshell 120 es una nueva alternativa para LC de Alta
Resolucioacuten y Alta Velocidad que puede usarse en cualquier HPLC o UHPLC
bull Con la Poroshell 120 se pueden lograr separaciones de alta eficacia a baja
presioacuten
bull Puede usarse con muestras sucias sin ver una elevacioacuten anormal de la
presioacuten
bull Puede usarse en un meacutetodo USP sin comprometer los Criterios de Ajustes de
Meacutetodo
Page 55
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 56
Soporte Teacutecnico Agilent
Teleacutefono de Atencioacuten al Cliente
901 11 68 90
email customercare_spainagilentcom
wwwagilentcomchem
![Page 32: Análisis de compuestos farmacéuticos en sangre total · PDF fileReducción en el procesamiento, el envío de la muestra, y los ... Gas flow: 10 L/min Nebulizer: 10 psi Sheath gas](https://reader031.vdocuments.site/reader031/viewer/2022030405/5a7a81727f8b9a0a668b45aa/html5/thumbnails/32.jpg)
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 32
Faacutermacos en sangre Procedimiento mini-QuEChERS
mini-Q
Procedimiento
1 Antildeadir 2 homogeneizadores ceraacutemicos
2 Antildeadir 1 o 2 mL de sangre entera a un tubo de centriacutefuga con tapoacuten de rosca
3 Antildeadir estandar interno vortex
4 Antildeadir 2 mL de ACN acidificado ( 04 FA) vortex 30 seg
5 Antildeadir 500 mg de sales de extraccioacuten agitar vigorsamente 1 minuto centrifugar 5000 rpm 1 min
6 Transferir 1 mL del extraccto al material de d-SPE en tubo de centrifuga vortex centrifugar
7 Antildeadir 200 uL a 800 uL de agua en un vial LC vortex y analizar
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 33
Refinamiento del Procedimiento mini-Q
Paraacutemetros evaluados en la teacutecnica mini-Q
Muestra de sangre total
bull La matriz bioloacutegica maacutes complicada
Adicioacuten de aacutecido tipo y cantidad
bull Efecto en la particioacuten y extraccioacuten
Adicioacuten de las sales de QuEChERS no-tamponadas o
tamponadas con NaAcetato o Citrato
bull Efecto en el extracto inspeccioacuten visual
SPE Dispersiva
bull Limpieza de la matriz y recuperaciones de los compuestos
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 34
Conclusiones del estudio
El ACN con 4 de FA como solvente de extraccioacuten muestra
una lisis maacutes completa de la muestra frente a otros solventes
de extraccioacuten que mostraron una masa soacutelida
Las sales tamponadas AOAC de acetato Soacutedico generan el
extracto maacutes liacutempio y fueron elegidas para la d-SPE
El paso de dSPE no ofrece un clean up adicional para los
meacutetodos de extraccioacuten con sales EN y no tamponadas
principalmente
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 35
Datos de Adquisicoacuten LCMSMS
Compuestos Canales MRM
(mz) Fragmentador
(V) CE (V) RT (min) Delta RT
Lidocaina 1) 23518 gt 861
2) 23518 gt 581
97 11
35
137 04
Tramadol 1) 2642 gt 581
2) 2642 gt 2461
97 15
3
120 04
Amitriptilina 1) 2782 gt 117
2) 2782 gt 105
112 19
19
425 04
Biperidena 1)31223 gt 981
2) 31223 gt 551
123 19
60
423 07
Oxazepam 1) 28706 gt 2409
2) 28706 gt 2689
112 19
7
399 04
Lorazepam 1) 32102 gt 2749
2) 32102 gt 3029
113 15
7
409 04
Clorpromazina 1) 31911 gt 861
2) 31911 gt 581
112 15
43
463 04
Diltiazem 1) 41517 gt 1779
2) 41517 gt 1499
128 19
43
373 04
Naloxona 1) 32816 gt 310
2) 32816 gt 212
123 15
39
082 04
Nortriptilina (IS) 1) 26418 gt 233
2) 26418 gt 91
97 7
19
417 04
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04
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05
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0575
06
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065
0675
07
0725
075
0775
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0825
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0875
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095
0975
1
1025
105
1075
11
1125
115
1175
12
1225
125
1275
13
1325
135
1375
+ESI TIC Scan Frag=800V AOAC_BLANK_110228bd
1 1
Counts vs Acquisition Time (min)
05 1 15 2 25
3 35 4 45 5 55 6 65 7 75 8 85 9 95 10
Columna Poroshell 120 EC-C18 27
micro 21 x 100 mm PN 695775-902
Fase Moacutevil
A 5 mM Acetato Amoacutenico pH 5
2080 MeOHagua
B 5 mM Acetato amoacutencio en ACN
Flujo 04mLmin
Inyeccioacuten 10uL
GT (ordmC) 300
GF (lmin) 7
Nebulizador (psi) 40
SGT (ordmC) 400
SFG (lmin) 12
Capilar (V) 3500
NV (V) 500
Condiciones LCMS
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2
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3
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32
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37
38
39
4
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45
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47
48
49
5
51
+ESI MRM Frag=1120V CID190 (2782000 -gt 1170000) HQC_6d
1 1
Counts vs Acquisition Time (min) 01 02 03 04 05 06 07 08 09 1 11 12 13 14 15 16 17 18 19 2 21 22 23 24 25 26 27 28 29 3 31 32 33 34 35 36 37 38 39 4 41 42 43 44 45 46
Nalo
xo
ne
Lid
oc
ain
e
Tra
mad
ol
Oxazep
am
Lo
razep
am
Bip
eri
de
n
Am
itri
pty
lin
e
Dil
tiazem
Ch
lorp
rom
azin
e
No
rtri
pty
lin
e (
IS)
Cromatograma LCMSMS de 10 ngmL de sangre total fortificada despueacutes
de extraccioacuten mini-QuEChERS AOAC (NaAc) y d-SPE (50mg PSA y
150mg MgSO4)
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18
19
2
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22
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25
26
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28
29
3
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34
35
36
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39
4
41
42
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46
47
48
49
5
51
+ESI MRM Frag=1120V CID190 (2782000 -gt 1170000) HQC_6d
1 1
Counts vs Acquisition Time (min) 01 02 03 04 05 06 07 08 09 1 11 12 13 14 15 16 17 18 19 2 21 22 23 24 25 26 27 28 29 3 31 32 33 34 35 36 37 38 39 4 41 42 43 44 45 46
1 x10
415 42 425 43 435 44 445 45 455 46 465 47 475 48 485 49 495 5
505 51 515 52 525 53 535 54 545 55 555 56 565 57
+ESI MRM Frag=1120V CID190 (2871000 -gt 2409000) RE_L_1d 1
Counts vs Acquisition Time (min) 305 31 315 32 325 33 335 34 345 35 355 36 365 37 375 38 385 39 395 4 405 41 415 42 425 43 435 44 445 45 455 46 465 47 475
Relacioacuten sentildealruido para el Oxazepam y Lorazepam a
10 ngmL (10 ppb)
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 39
La Naloxone muestra esta curva de linealidad de10-250 ngmL (ppb) con una R2
= 0991
Las curvas de calibracioacuten se generaron con la respuestra relativa (area pico
analitoarea pico IS) frente a la concentracioacuten relativa (concentracion de
analitoconcentracioacuten de IS)
Ejemplo de curva de linealidad para Naloxona extraido
con mini-QuEChERS
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 40
Recuperacioacuten y Reproducibilidad
Compuesto 50 ngmL Spiked
Recuperacioacuten RSD
100 ngmL Spiked
Recuperacioacuten RSD
Lidocaine 987 157 100 118
Tramadol 105 30 104 82
Amitriptyline 104 21 104 82
Biperidene 97 45 99 82
Oxazepam 770 92 78 86
Lorazepam 819 68 818 86
Chlorpromazine 110 103 105 63
Diltiazem 881 27 917 83
Naloxone 806 90 755 77
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 41
Conclusioacutenes y trabajo posterior
El meacutetodo mini-QuEChERS para la extraccioacuten de compuestos farmaceacuteuticos en
sangre total ofrece una alternativa a otras teacutecnicas de preparacioacuten de muestras
La preparacioacuten de muestras mini-QuEChERS es un enfoque simple facil y
barato que requiere una miacutenima experiencia en preparacioacuten de muestras y
miacutenimo equipamiento
Es un punto de partida para ampliar el numero y las clasificaciones evaluadas
en otras matrices bioloacutegicas y en sangre postmortem
El trabajo futuro incluira combinaciones adecuadas tanto de las sales de
extraccioacuten como de los sorbentes de d-SPE por el meacutetodo mini-QuEChERS
La columna Poroshell 120 ofrece una selectividad diferente y excelentes formas
de pico a lo largo del amplio rango de compuestos farmaceacuteuticos usados en este
estudio
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 42
Referencias
(1) M Anastassiades SJ Lehotay D Štajnbaher and FJ Schenk J AOAC Int 86 4121 (2003)
(2) G Stubbings and T Bigwood Anal Chim Acta 637 68 (2009)
(3) RR Rasmussen IMLD Storm PZH Rasmussen J Smedsgaard and KF Nielsen Anal Bioanal Chem 397 765 (2010)
(4) D Smith and K Lynam GCμECD analysis and confirmation of PCBs in fish tissue with Agilent JampW DB-35ms and DB-XLB GC columns Agilent Technologies 5990-6236EN (2010)
(5) F Ploumlssl M Giera and F Bracher J Chrom A 1135 19 (2006)
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 43
MEJORAR LA PRODUCTIVIDAD EN
HPLC ESTAacuteNDAR CON COLUMNAS
POROSHELL
Page 43
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 44
Columnas Poroshell 120 para HPLC y UHPLC
bull 80-90 de eficacia de las sub 2um
bull A presiones un ~40-50 maacutes bajas
bull Con un tamantildeo de partiacutecula de 27um
bull Con una frita de entrada de 2um
bull Con el doble de resolucioacuten de una
columna de 35um
bull Con un liacutemite de presioacuten de 600 bar
bull La partiacutecula tiene un nuacutecleo soacutelido
(17um) y una cubierta exterior porosa
de 05um como zona de difusioacuten
Las Columnas Poroshell 120 tienen
Page 44
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 45
Poroshell 120 proporciona Eficacia Suficiente
Page 45
Flujo 0582 mLmin AcetonitriloAgua (6040)
Volumen de Inyeccioacuten 4 microL
TCC 26 oC
DAD Sig=2544nm Ref=360100nm
Muestra Muestra de test RRLC
(PN 5188-6529) inoculada con
50 microL 2 mgmL Tiourea en
aguaacetonitrilo (6535)
25 5 75 10
mAU
0
200
400
600
06
46
0
82
6
11
48
15
18
20
16
2
22
3
28
16
41
32
62
73
97
53
larr N = 25053 Presioacuten = 182 bar
Poroshell 120 EC-C18 30 x 100 mm 27 um
min 25 5 75 10 125
mAU
0
200
400
600
06
49
0
86
5
12
75
17
56
24
18
27
05
34
94
52
81
82
18
13
04
1
larr N = 27295 Presioacuten = 386 bar
Eclipse Plus C18 30 x 100 mm 18 um
gt90 de la Eficacia de una 18um
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 46
iquestEn queacute tipos de instrumentos puede usar
Columnas Poroshell 120 HPLCrsquos y UHPLCrsquos
Consideraciones en UHPLC
bull Las columnas Poroshell 120 tienen un liacutemite de presioacuten de 600 bar
bull Los UHPLC estaacuten ajustados para columnas de bajo volumen por lo tanto las
Poroshell pueden usarse en todos los UHPLC
Consideraciones en HPLC
bull Las Columnas Poroshell 120 trabajan bien por debajo de 400 bar
bull Minimize los volumenes extra columna para las columnas 21 y 30mm ID ndash
siga las instrucciones dadas para las columnas RRHT (18um 600 bar)
bull Use en el detector velocidades adecuadas de adquisicioacuten para picos
estrechos de alta eficacia
Page 46
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 47
Con una frita de 2 um Poroshell 120 no se bloquea
Muestras Complejas- Plasma
Diflusinal in Plasma
0
20
40
60
80
100
120
140
160
180
200
220
240
260
280
300
320
340
360
380
400
1 501 1001 1501 2001 2501
Injections
Pre
ssu
re
0
20000
40000
60000
80000
100000
120000
140000
160000
180000
200000
Eff
icie
ncy (
N)
End Press
Plates
Columna Poroshell 120 EC-C18 30 x 50mm 27um LC Agilent 1200 RRLC (SL)
Muestra Plasma Precipitado 2 partes Plasma 7 Partes 2080 Agua-MeCN w01 Aacutecido Foacutermico con 1 Parte de Diflusinal en
5050 Agua-MeCN 10 ugml (Concentracion Final Diflusinal 1 ugml) Agitado y dejado reposar 10 minutos
No Centrifugado No Filtrado
Volumen de Inyeccioacuten 1ul
Solvente A Agua w01 TFA
Solvente B MeCN w008 TFA
Flujo 1 mlmin 1 ul inyeccioacuten
Tiempo B
0 20
05 90
06 90
11 20
25 20
Page 47
Diflusinal es un anti-inflamatorio no esteroidal anaacutelogo
a la aspirina desarrollado por Merck Sharp amp Dohme
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 48
Las Columnas Superficialmente Porosas Pueden
Usarse cumpliendo los Requirimientos USP
De la lista USP de empaquetamientos de columnas LC 42009
Page 48
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 49
Criterios de Ajuste de Meacutetodos USP y FDA Criterios de Ajuste de Meacutetodos de Dimensiones de Columna
Paraacutemetro Especificaciones Maacuteximas ComentariosEjemplos
Longitud de Columna 70 250mm 75mm
150mm 50mm
Diaacutemetro Interno de
Columna
25 (FDA ORA-LAB 545)
USP ndash 25 ID Columna puede ajustarse si la
velocidad lineal es constante
46 mm 30 mm (-35)
46 mm 21 mm (-54)
30 mm 21 mm (-30)
Flow Rate 50
Volumen de Inyeccioacuten
Reducir tanto como se necesitendash
debe cumplir los liacutemites de
deteccioacuten y precisioacuten
Si cambia a una columna maacutes
corta haga el cambio apropiado
en el volumen de inyeccioacuten
Tamantildeo de Partiacutecula Reducir hasta el 50
(no se puede aumentar)
Puede cambiar la longitud de columna y el
tamantildeo de partiacutecula para mantener la misma
Rs
5um 35um (-30)
5um 27um (-46) Cambiado en 22409 ndash Para la copia oficial y actual ir a
httpwwwfdagovScienceResearchFieldSciencedefaulthtm
USP 30 Second Supplement Revisions PF34(5) en proceso
Ver ldquo Stimuli articlerdquo en Pharmacopeial Forum 2009 35(6)
Page 49
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 50
Comparacioacuten de 46 x 250 mm 5 um con Poroshell
120 EC-C18 46 x 100 mm 27um
min 5 10 15 20 25 30
mAU
0
20
40
60
80
100
97
12
111
16
115
96
126
74
152
48
161
51
164
35
206
87
230
76
292
90
min 5 10 15 20 25 30
mAU
0
50
100
150
200
250
17
19
21
89
23
11
26
06
38
67
44
37 45
58
54
50
59
20
70
37
Anaacutelisis maacutes raacutepido(columna maacutes corta flujo maacutes alto)
Mayor sensibilidad(partiacutecula maacutes pequentildeapico maacutes estrecho)
Maacutes optimizado (un anaacutelisis maacutes raacutepido permite ajustar mejor)
Ambos anaacutelisis en Agilent 1100 G1315B DAD (bajo 400 bar)
No se requiere cambio en la preparacioacuten de muestra frita de entrada
de 2 micras en ambas columnas
325 bar
110 bar
Sulfadiazina
Sulfatiazol
Sulfapiridina
Sulfamerazina
Sulfametazina
Sulfametazol
Sulfametoxipiridazina
Sulfacloropiridazina
Sulfametoxazol
Sulfadimetoxina
Tiempo B
0 8
33 33
34 33
Columna Eclipse Plus C18
46 x 250mm 5um
Flujo 1 mLmin
Fase Moacutevil
A 01 Aacutecido Foacutermico en Agua
B 01 Aacutecido Foacutermico en ACN
Tiempo B
0 8
12 33
132 33
Columna 46 x 100mm
Poroshell 120 EC-C18
27um
Flujo 185 mLmin
Page 50
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 51
Comparacioacuten de 46 x 250 mm 5 um con Poroshell
120 EC-C18 46 x 100 mm 27um
min 5 10 15 20 25 30
mAU
0
20
40
60
80
100
97
12
111
16
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37 45
58
54
50
59
20
70
37
325 bar
min
Ver condiciones en diapositiva anterior
Page 51
Mejor Resolucioacuten
linea base
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 52
Anaacutelisis maacutes raacutepido del meacutetodo USP para pastillas de
Simvastatina en Columnas Poroshell 120ndash Ajuste del meacutetodo
46 x 250 mm 5-um
Agilent ZORBAX Eclipse Plus C18
46 x 75 mm 27-um
Agilent Poroshell 120 EC-C18
65 CH3CN 35 39 gL NaH2PO4 (pH 45) 45 oC Sig = 238 8 Ref = 360 100 nm
Flujos 15 mLmin para la columna de 5-um 28 mLmin para la columna Poroshell 120 27um
Requerimiento
USP
5-um
(15 mLmin)
27-um
(28 mLmin)
TR na 9907 1457
krsquo gt 30 5962 5122
N gt 4500 16939 14439
Tf lt 20 109 110
min 2 4 6 8 10
mAU
0
5
10
15
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30
35
40
min 2
mAU
0
5
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15
20
25
30
35
40
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 53
Ajustes de los parametros cromatograficos en la
transferencia de meacutetodos Escalado del volume de inyeccioacuten
v1 x [(r22 x L2)(r1
2 x L1)] = V2
O bien
v2 = V1 x [(d22 x L2)(d1
2 x L1)]
v volume de inyeccioacuten
r radio de la columna
L longitud de la columna
Ajuste del flujo
F2= F1 x (L2L1 ) x (r2r1 )2
L longitud de la columna
F Flujo
r radio de la columna
Ajuste de la longitud del gradiente
En funcioacuten de la longitud de la columna
L2L1= tg2tg1
En funcioacuten del volumen muerto de columna y del flujo
tG2= tG1 x (V2V1) x (F1F2) t tiempos de gradiente
V volumen muerto de columna
F flujo
Columna ID Volumen muerto aprox
por mm longitud
46mm 100uL
30mm 425uL
21mm 208uL
10mm 047uL
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 54
Notas de Aplicacioacuten en Poroshell 120 y QuEChERS
Determination of Hormones in Shrimp by Agilent 1290 Infinity LC with
Agilent Poroshell 120 LC Column and Agilent QuEChERS for Sample
Preparation (publication 5990-6589EN)
Analysis of Pesticide Residues in Green Tea Using Agilent SampliQ
QuEChERS EN Kit by LCMSMS Detection (publication 5990-
6400EN)
Analysis of Pesticide Residues in Rice Using Agilent Bond Elut
QuEChERS AOAC Kit (publication 5990-8034EN)
Poroshell 120 for pharmaceutical analysis
Poroshell 120 Resources
QuEChERS Applications
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 55
Sumario
bull La columna Poroshell 120 es una nueva alternativa para LC de Alta
Resolucioacuten y Alta Velocidad que puede usarse en cualquier HPLC o UHPLC
bull Con la Poroshell 120 se pueden lograr separaciones de alta eficacia a baja
presioacuten
bull Puede usarse con muestras sucias sin ver una elevacioacuten anormal de la
presioacuten
bull Puede usarse en un meacutetodo USP sin comprometer los Criterios de Ajustes de
Meacutetodo
Page 55
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 56
Soporte Teacutecnico Agilent
Teleacutefono de Atencioacuten al Cliente
901 11 68 90
email customercare_spainagilentcom
wwwagilentcomchem
![Page 33: Análisis de compuestos farmacéuticos en sangre total · PDF fileReducción en el procesamiento, el envío de la muestra, y los ... Gas flow: 10 L/min Nebulizer: 10 psi Sheath gas](https://reader031.vdocuments.site/reader031/viewer/2022030405/5a7a81727f8b9a0a668b45aa/html5/thumbnails/33.jpg)
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 33
Refinamiento del Procedimiento mini-Q
Paraacutemetros evaluados en la teacutecnica mini-Q
Muestra de sangre total
bull La matriz bioloacutegica maacutes complicada
Adicioacuten de aacutecido tipo y cantidad
bull Efecto en la particioacuten y extraccioacuten
Adicioacuten de las sales de QuEChERS no-tamponadas o
tamponadas con NaAcetato o Citrato
bull Efecto en el extracto inspeccioacuten visual
SPE Dispersiva
bull Limpieza de la matriz y recuperaciones de los compuestos
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 34
Conclusiones del estudio
El ACN con 4 de FA como solvente de extraccioacuten muestra
una lisis maacutes completa de la muestra frente a otros solventes
de extraccioacuten que mostraron una masa soacutelida
Las sales tamponadas AOAC de acetato Soacutedico generan el
extracto maacutes liacutempio y fueron elegidas para la d-SPE
El paso de dSPE no ofrece un clean up adicional para los
meacutetodos de extraccioacuten con sales EN y no tamponadas
principalmente
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 35
Datos de Adquisicoacuten LCMSMS
Compuestos Canales MRM
(mz) Fragmentador
(V) CE (V) RT (min) Delta RT
Lidocaina 1) 23518 gt 861
2) 23518 gt 581
97 11
35
137 04
Tramadol 1) 2642 gt 581
2) 2642 gt 2461
97 15
3
120 04
Amitriptilina 1) 2782 gt 117
2) 2782 gt 105
112 19
19
425 04
Biperidena 1)31223 gt 981
2) 31223 gt 551
123 19
60
423 07
Oxazepam 1) 28706 gt 2409
2) 28706 gt 2689
112 19
7
399 04
Lorazepam 1) 32102 gt 2749
2) 32102 gt 3029
113 15
7
409 04
Clorpromazina 1) 31911 gt 861
2) 31911 gt 581
112 15
43
463 04
Diltiazem 1) 41517 gt 1779
2) 41517 gt 1499
128 19
43
373 04
Naloxona 1) 32816 gt 310
2) 32816 gt 212
123 15
39
082 04
Nortriptilina (IS) 1) 26418 gt 233
2) 26418 gt 91
97 7
19
417 04
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06
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065
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075
0775
08
0825
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095
0975
1
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105
1075
11
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115
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12
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125
1275
13
1325
135
1375
+ESI TIC Scan Frag=800V AOAC_BLANK_110228bd
1 1
Counts vs Acquisition Time (min)
05 1 15 2 25
3 35 4 45 5 55 6 65 7 75 8 85 9 95 10
Columna Poroshell 120 EC-C18 27
micro 21 x 100 mm PN 695775-902
Fase Moacutevil
A 5 mM Acetato Amoacutenico pH 5
2080 MeOHagua
B 5 mM Acetato amoacutencio en ACN
Flujo 04mLmin
Inyeccioacuten 10uL
GT (ordmC) 300
GF (lmin) 7
Nebulizador (psi) 40
SGT (ordmC) 400
SFG (lmin) 12
Capilar (V) 3500
NV (V) 500
Condiciones LCMS
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5
51
+ESI MRM Frag=1120V CID190 (2782000 -gt 1170000) HQC_6d
1 1
Counts vs Acquisition Time (min) 01 02 03 04 05 06 07 08 09 1 11 12 13 14 15 16 17 18 19 2 21 22 23 24 25 26 27 28 29 3 31 32 33 34 35 36 37 38 39 4 41 42 43 44 45 46
Nalo
xo
ne
Lid
oc
ain
e
Tra
mad
ol
Oxazep
am
Lo
razep
am
Bip
eri
de
n
Am
itri
pty
lin
e
Dil
tiazem
Ch
lorp
rom
azin
e
No
rtri
pty
lin
e (
IS)
Cromatograma LCMSMS de 10 ngmL de sangre total fortificada despueacutes
de extraccioacuten mini-QuEChERS AOAC (NaAc) y d-SPE (50mg PSA y
150mg MgSO4)
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 38
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4
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5
51
+ESI MRM Frag=1120V CID190 (2782000 -gt 1170000) HQC_6d
1 1
Counts vs Acquisition Time (min) 01 02 03 04 05 06 07 08 09 1 11 12 13 14 15 16 17 18 19 2 21 22 23 24 25 26 27 28 29 3 31 32 33 34 35 36 37 38 39 4 41 42 43 44 45 46
1 x10
415 42 425 43 435 44 445 45 455 46 465 47 475 48 485 49 495 5
505 51 515 52 525 53 535 54 545 55 555 56 565 57
+ESI MRM Frag=1120V CID190 (2871000 -gt 2409000) RE_L_1d 1
Counts vs Acquisition Time (min) 305 31 315 32 325 33 335 34 345 35 355 36 365 37 375 38 385 39 395 4 405 41 415 42 425 43 435 44 445 45 455 46 465 47 475
Relacioacuten sentildealruido para el Oxazepam y Lorazepam a
10 ngmL (10 ppb)
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 39
La Naloxone muestra esta curva de linealidad de10-250 ngmL (ppb) con una R2
= 0991
Las curvas de calibracioacuten se generaron con la respuestra relativa (area pico
analitoarea pico IS) frente a la concentracioacuten relativa (concentracion de
analitoconcentracioacuten de IS)
Ejemplo de curva de linealidad para Naloxona extraido
con mini-QuEChERS
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 40
Recuperacioacuten y Reproducibilidad
Compuesto 50 ngmL Spiked
Recuperacioacuten RSD
100 ngmL Spiked
Recuperacioacuten RSD
Lidocaine 987 157 100 118
Tramadol 105 30 104 82
Amitriptyline 104 21 104 82
Biperidene 97 45 99 82
Oxazepam 770 92 78 86
Lorazepam 819 68 818 86
Chlorpromazine 110 103 105 63
Diltiazem 881 27 917 83
Naloxone 806 90 755 77
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 41
Conclusioacutenes y trabajo posterior
El meacutetodo mini-QuEChERS para la extraccioacuten de compuestos farmaceacuteuticos en
sangre total ofrece una alternativa a otras teacutecnicas de preparacioacuten de muestras
La preparacioacuten de muestras mini-QuEChERS es un enfoque simple facil y
barato que requiere una miacutenima experiencia en preparacioacuten de muestras y
miacutenimo equipamiento
Es un punto de partida para ampliar el numero y las clasificaciones evaluadas
en otras matrices bioloacutegicas y en sangre postmortem
El trabajo futuro incluira combinaciones adecuadas tanto de las sales de
extraccioacuten como de los sorbentes de d-SPE por el meacutetodo mini-QuEChERS
La columna Poroshell 120 ofrece una selectividad diferente y excelentes formas
de pico a lo largo del amplio rango de compuestos farmaceacuteuticos usados en este
estudio
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 42
Referencias
(1) M Anastassiades SJ Lehotay D Štajnbaher and FJ Schenk J AOAC Int 86 4121 (2003)
(2) G Stubbings and T Bigwood Anal Chim Acta 637 68 (2009)
(3) RR Rasmussen IMLD Storm PZH Rasmussen J Smedsgaard and KF Nielsen Anal Bioanal Chem 397 765 (2010)
(4) D Smith and K Lynam GCμECD analysis and confirmation of PCBs in fish tissue with Agilent JampW DB-35ms and DB-XLB GC columns Agilent Technologies 5990-6236EN (2010)
(5) F Ploumlssl M Giera and F Bracher J Chrom A 1135 19 (2006)
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 43
MEJORAR LA PRODUCTIVIDAD EN
HPLC ESTAacuteNDAR CON COLUMNAS
POROSHELL
Page 43
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 44
Columnas Poroshell 120 para HPLC y UHPLC
bull 80-90 de eficacia de las sub 2um
bull A presiones un ~40-50 maacutes bajas
bull Con un tamantildeo de partiacutecula de 27um
bull Con una frita de entrada de 2um
bull Con el doble de resolucioacuten de una
columna de 35um
bull Con un liacutemite de presioacuten de 600 bar
bull La partiacutecula tiene un nuacutecleo soacutelido
(17um) y una cubierta exterior porosa
de 05um como zona de difusioacuten
Las Columnas Poroshell 120 tienen
Page 44
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 45
Poroshell 120 proporciona Eficacia Suficiente
Page 45
Flujo 0582 mLmin AcetonitriloAgua (6040)
Volumen de Inyeccioacuten 4 microL
TCC 26 oC
DAD Sig=2544nm Ref=360100nm
Muestra Muestra de test RRLC
(PN 5188-6529) inoculada con
50 microL 2 mgmL Tiourea en
aguaacetonitrilo (6535)
25 5 75 10
mAU
0
200
400
600
06
46
0
82
6
11
48
15
18
20
16
2
22
3
28
16
41
32
62
73
97
53
larr N = 25053 Presioacuten = 182 bar
Poroshell 120 EC-C18 30 x 100 mm 27 um
min 25 5 75 10 125
mAU
0
200
400
600
06
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0
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5
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17
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24
18
27
05
34
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52
81
82
18
13
04
1
larr N = 27295 Presioacuten = 386 bar
Eclipse Plus C18 30 x 100 mm 18 um
gt90 de la Eficacia de una 18um
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 46
iquestEn queacute tipos de instrumentos puede usar
Columnas Poroshell 120 HPLCrsquos y UHPLCrsquos
Consideraciones en UHPLC
bull Las columnas Poroshell 120 tienen un liacutemite de presioacuten de 600 bar
bull Los UHPLC estaacuten ajustados para columnas de bajo volumen por lo tanto las
Poroshell pueden usarse en todos los UHPLC
Consideraciones en HPLC
bull Las Columnas Poroshell 120 trabajan bien por debajo de 400 bar
bull Minimize los volumenes extra columna para las columnas 21 y 30mm ID ndash
siga las instrucciones dadas para las columnas RRHT (18um 600 bar)
bull Use en el detector velocidades adecuadas de adquisicioacuten para picos
estrechos de alta eficacia
Page 46
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 47
Con una frita de 2 um Poroshell 120 no se bloquea
Muestras Complejas- Plasma
Diflusinal in Plasma
0
20
40
60
80
100
120
140
160
180
200
220
240
260
280
300
320
340
360
380
400
1 501 1001 1501 2001 2501
Injections
Pre
ssu
re
0
20000
40000
60000
80000
100000
120000
140000
160000
180000
200000
Eff
icie
ncy (
N)
End Press
Plates
Columna Poroshell 120 EC-C18 30 x 50mm 27um LC Agilent 1200 RRLC (SL)
Muestra Plasma Precipitado 2 partes Plasma 7 Partes 2080 Agua-MeCN w01 Aacutecido Foacutermico con 1 Parte de Diflusinal en
5050 Agua-MeCN 10 ugml (Concentracion Final Diflusinal 1 ugml) Agitado y dejado reposar 10 minutos
No Centrifugado No Filtrado
Volumen de Inyeccioacuten 1ul
Solvente A Agua w01 TFA
Solvente B MeCN w008 TFA
Flujo 1 mlmin 1 ul inyeccioacuten
Tiempo B
0 20
05 90
06 90
11 20
25 20
Page 47
Diflusinal es un anti-inflamatorio no esteroidal anaacutelogo
a la aspirina desarrollado por Merck Sharp amp Dohme
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 48
Las Columnas Superficialmente Porosas Pueden
Usarse cumpliendo los Requirimientos USP
De la lista USP de empaquetamientos de columnas LC 42009
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Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 49
Criterios de Ajuste de Meacutetodos USP y FDA Criterios de Ajuste de Meacutetodos de Dimensiones de Columna
Paraacutemetro Especificaciones Maacuteximas ComentariosEjemplos
Longitud de Columna 70 250mm 75mm
150mm 50mm
Diaacutemetro Interno de
Columna
25 (FDA ORA-LAB 545)
USP ndash 25 ID Columna puede ajustarse si la
velocidad lineal es constante
46 mm 30 mm (-35)
46 mm 21 mm (-54)
30 mm 21 mm (-30)
Flow Rate 50
Volumen de Inyeccioacuten
Reducir tanto como se necesitendash
debe cumplir los liacutemites de
deteccioacuten y precisioacuten
Si cambia a una columna maacutes
corta haga el cambio apropiado
en el volumen de inyeccioacuten
Tamantildeo de Partiacutecula Reducir hasta el 50
(no se puede aumentar)
Puede cambiar la longitud de columna y el
tamantildeo de partiacutecula para mantener la misma
Rs
5um 35um (-30)
5um 27um (-46) Cambiado en 22409 ndash Para la copia oficial y actual ir a
httpwwwfdagovScienceResearchFieldSciencedefaulthtm
USP 30 Second Supplement Revisions PF34(5) en proceso
Ver ldquo Stimuli articlerdquo en Pharmacopeial Forum 2009 35(6)
Page 49
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 50
Comparacioacuten de 46 x 250 mm 5 um con Poroshell
120 EC-C18 46 x 100 mm 27um
min 5 10 15 20 25 30
mAU
0
20
40
60
80
100
97
12
111
16
115
96
126
74
152
48
161
51
164
35
206
87
230
76
292
90
min 5 10 15 20 25 30
mAU
0
50
100
150
200
250
17
19
21
89
23
11
26
06
38
67
44
37 45
58
54
50
59
20
70
37
Anaacutelisis maacutes raacutepido(columna maacutes corta flujo maacutes alto)
Mayor sensibilidad(partiacutecula maacutes pequentildeapico maacutes estrecho)
Maacutes optimizado (un anaacutelisis maacutes raacutepido permite ajustar mejor)
Ambos anaacutelisis en Agilent 1100 G1315B DAD (bajo 400 bar)
No se requiere cambio en la preparacioacuten de muestra frita de entrada
de 2 micras en ambas columnas
325 bar
110 bar
Sulfadiazina
Sulfatiazol
Sulfapiridina
Sulfamerazina
Sulfametazina
Sulfametazol
Sulfametoxipiridazina
Sulfacloropiridazina
Sulfametoxazol
Sulfadimetoxina
Tiempo B
0 8
33 33
34 33
Columna Eclipse Plus C18
46 x 250mm 5um
Flujo 1 mLmin
Fase Moacutevil
A 01 Aacutecido Foacutermico en Agua
B 01 Aacutecido Foacutermico en ACN
Tiempo B
0 8
12 33
132 33
Columna 46 x 100mm
Poroshell 120 EC-C18
27um
Flujo 185 mLmin
Page 50
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 51
Comparacioacuten de 46 x 250 mm 5 um con Poroshell
120 EC-C18 46 x 100 mm 27um
min 5 10 15 20 25 30
mAU
0
20
40
60
80
100
97
12
111
16
115
96
126
74
152
48
161
51
164
35
206
87
230
76
292
90
110 bar
5
mAU
0
50
100
150
200
250
17
19
21
89
23
11
26
06
38
67
44
37 45
58
54
50
59
20
70
37
325 bar
min
Ver condiciones en diapositiva anterior
Page 51
Mejor Resolucioacuten
linea base
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 52
Anaacutelisis maacutes raacutepido del meacutetodo USP para pastillas de
Simvastatina en Columnas Poroshell 120ndash Ajuste del meacutetodo
46 x 250 mm 5-um
Agilent ZORBAX Eclipse Plus C18
46 x 75 mm 27-um
Agilent Poroshell 120 EC-C18
65 CH3CN 35 39 gL NaH2PO4 (pH 45) 45 oC Sig = 238 8 Ref = 360 100 nm
Flujos 15 mLmin para la columna de 5-um 28 mLmin para la columna Poroshell 120 27um
Requerimiento
USP
5-um
(15 mLmin)
27-um
(28 mLmin)
TR na 9907 1457
krsquo gt 30 5962 5122
N gt 4500 16939 14439
Tf lt 20 109 110
min 2 4 6 8 10
mAU
0
5
10
15
20
25
30
35
40
min 2
mAU
0
5
10
15
20
25
30
35
40
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 53
Ajustes de los parametros cromatograficos en la
transferencia de meacutetodos Escalado del volume de inyeccioacuten
v1 x [(r22 x L2)(r1
2 x L1)] = V2
O bien
v2 = V1 x [(d22 x L2)(d1
2 x L1)]
v volume de inyeccioacuten
r radio de la columna
L longitud de la columna
Ajuste del flujo
F2= F1 x (L2L1 ) x (r2r1 )2
L longitud de la columna
F Flujo
r radio de la columna
Ajuste de la longitud del gradiente
En funcioacuten de la longitud de la columna
L2L1= tg2tg1
En funcioacuten del volumen muerto de columna y del flujo
tG2= tG1 x (V2V1) x (F1F2) t tiempos de gradiente
V volumen muerto de columna
F flujo
Columna ID Volumen muerto aprox
por mm longitud
46mm 100uL
30mm 425uL
21mm 208uL
10mm 047uL
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 54
Notas de Aplicacioacuten en Poroshell 120 y QuEChERS
Determination of Hormones in Shrimp by Agilent 1290 Infinity LC with
Agilent Poroshell 120 LC Column and Agilent QuEChERS for Sample
Preparation (publication 5990-6589EN)
Analysis of Pesticide Residues in Green Tea Using Agilent SampliQ
QuEChERS EN Kit by LCMSMS Detection (publication 5990-
6400EN)
Analysis of Pesticide Residues in Rice Using Agilent Bond Elut
QuEChERS AOAC Kit (publication 5990-8034EN)
Poroshell 120 for pharmaceutical analysis
Poroshell 120 Resources
QuEChERS Applications
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 55
Sumario
bull La columna Poroshell 120 es una nueva alternativa para LC de Alta
Resolucioacuten y Alta Velocidad que puede usarse en cualquier HPLC o UHPLC
bull Con la Poroshell 120 se pueden lograr separaciones de alta eficacia a baja
presioacuten
bull Puede usarse con muestras sucias sin ver una elevacioacuten anormal de la
presioacuten
bull Puede usarse en un meacutetodo USP sin comprometer los Criterios de Ajustes de
Meacutetodo
Page 55
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 56
Soporte Teacutecnico Agilent
Teleacutefono de Atencioacuten al Cliente
901 11 68 90
email customercare_spainagilentcom
wwwagilentcomchem
![Page 34: Análisis de compuestos farmacéuticos en sangre total · PDF fileReducción en el procesamiento, el envío de la muestra, y los ... Gas flow: 10 L/min Nebulizer: 10 psi Sheath gas](https://reader031.vdocuments.site/reader031/viewer/2022030405/5a7a81727f8b9a0a668b45aa/html5/thumbnails/34.jpg)
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 34
Conclusiones del estudio
El ACN con 4 de FA como solvente de extraccioacuten muestra
una lisis maacutes completa de la muestra frente a otros solventes
de extraccioacuten que mostraron una masa soacutelida
Las sales tamponadas AOAC de acetato Soacutedico generan el
extracto maacutes liacutempio y fueron elegidas para la d-SPE
El paso de dSPE no ofrece un clean up adicional para los
meacutetodos de extraccioacuten con sales EN y no tamponadas
principalmente
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 35
Datos de Adquisicoacuten LCMSMS
Compuestos Canales MRM
(mz) Fragmentador
(V) CE (V) RT (min) Delta RT
Lidocaina 1) 23518 gt 861
2) 23518 gt 581
97 11
35
137 04
Tramadol 1) 2642 gt 581
2) 2642 gt 2461
97 15
3
120 04
Amitriptilina 1) 2782 gt 117
2) 2782 gt 105
112 19
19
425 04
Biperidena 1)31223 gt 981
2) 31223 gt 551
123 19
60
423 07
Oxazepam 1) 28706 gt 2409
2) 28706 gt 2689
112 19
7
399 04
Lorazepam 1) 32102 gt 2749
2) 32102 gt 3029
113 15
7
409 04
Clorpromazina 1) 31911 gt 861
2) 31911 gt 581
112 15
43
463 04
Diltiazem 1) 41517 gt 1779
2) 41517 gt 1499
128 19
43
373 04
Naloxona 1) 32816 gt 310
2) 32816 gt 212
123 15
39
082 04
Nortriptilina (IS) 1) 26418 gt 233
2) 26418 gt 91
97 7
19
417 04
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 36
7 x10
0125
015
0175
02
0225
025
0275
03
0325
035
0375
04
0425
045
0475
05
0525
055
0575
06
0625
065
0675
07
0725
075
0775
08
0825
085
0875
09
0925
095
0975
1
1025
105
1075
11
1125
115
1175
12
1225
125
1275
13
1325
135
1375
+ESI TIC Scan Frag=800V AOAC_BLANK_110228bd
1 1
Counts vs Acquisition Time (min)
05 1 15 2 25
3 35 4 45 5 55 6 65 7 75 8 85 9 95 10
Columna Poroshell 120 EC-C18 27
micro 21 x 100 mm PN 695775-902
Fase Moacutevil
A 5 mM Acetato Amoacutenico pH 5
2080 MeOHagua
B 5 mM Acetato amoacutencio en ACN
Flujo 04mLmin
Inyeccioacuten 10uL
GT (ordmC) 300
GF (lmin) 7
Nebulizador (psi) 40
SGT (ordmC) 400
SFG (lmin) 12
Capilar (V) 3500
NV (V) 500
Condiciones LCMS
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3 x10
01
02
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1
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3
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38
39
4
41
42
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45
46
47
48
49
5
51
+ESI MRM Frag=1120V CID190 (2782000 -gt 1170000) HQC_6d
1 1
Counts vs Acquisition Time (min) 01 02 03 04 05 06 07 08 09 1 11 12 13 14 15 16 17 18 19 2 21 22 23 24 25 26 27 28 29 3 31 32 33 34 35 36 37 38 39 4 41 42 43 44 45 46
Nalo
xo
ne
Lid
oc
ain
e
Tra
mad
ol
Oxazep
am
Lo
razep
am
Bip
eri
de
n
Am
itri
pty
lin
e
Dil
tiazem
Ch
lorp
rom
azin
e
No
rtri
pty
lin
e (
IS)
Cromatograma LCMSMS de 10 ngmL de sangre total fortificada despueacutes
de extraccioacuten mini-QuEChERS AOAC (NaAc) y d-SPE (50mg PSA y
150mg MgSO4)
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 38
3 x10
01
02
03
04
05
06
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08
09
1
11
12
13
14
15
16
17
18
19
2
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22
23
24
25
26
27
28
29
3
31
32
33
34
35
36
37
38
39
4
41
42
43
44
45
46
47
48
49
5
51
+ESI MRM Frag=1120V CID190 (2782000 -gt 1170000) HQC_6d
1 1
Counts vs Acquisition Time (min) 01 02 03 04 05 06 07 08 09 1 11 12 13 14 15 16 17 18 19 2 21 22 23 24 25 26 27 28 29 3 31 32 33 34 35 36 37 38 39 4 41 42 43 44 45 46
1 x10
415 42 425 43 435 44 445 45 455 46 465 47 475 48 485 49 495 5
505 51 515 52 525 53 535 54 545 55 555 56 565 57
+ESI MRM Frag=1120V CID190 (2871000 -gt 2409000) RE_L_1d 1
Counts vs Acquisition Time (min) 305 31 315 32 325 33 335 34 345 35 355 36 365 37 375 38 385 39 395 4 405 41 415 42 425 43 435 44 445 45 455 46 465 47 475
Relacioacuten sentildealruido para el Oxazepam y Lorazepam a
10 ngmL (10 ppb)
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 39
La Naloxone muestra esta curva de linealidad de10-250 ngmL (ppb) con una R2
= 0991
Las curvas de calibracioacuten se generaron con la respuestra relativa (area pico
analitoarea pico IS) frente a la concentracioacuten relativa (concentracion de
analitoconcentracioacuten de IS)
Ejemplo de curva de linealidad para Naloxona extraido
con mini-QuEChERS
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 40
Recuperacioacuten y Reproducibilidad
Compuesto 50 ngmL Spiked
Recuperacioacuten RSD
100 ngmL Spiked
Recuperacioacuten RSD
Lidocaine 987 157 100 118
Tramadol 105 30 104 82
Amitriptyline 104 21 104 82
Biperidene 97 45 99 82
Oxazepam 770 92 78 86
Lorazepam 819 68 818 86
Chlorpromazine 110 103 105 63
Diltiazem 881 27 917 83
Naloxone 806 90 755 77
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 41
Conclusioacutenes y trabajo posterior
El meacutetodo mini-QuEChERS para la extraccioacuten de compuestos farmaceacuteuticos en
sangre total ofrece una alternativa a otras teacutecnicas de preparacioacuten de muestras
La preparacioacuten de muestras mini-QuEChERS es un enfoque simple facil y
barato que requiere una miacutenima experiencia en preparacioacuten de muestras y
miacutenimo equipamiento
Es un punto de partida para ampliar el numero y las clasificaciones evaluadas
en otras matrices bioloacutegicas y en sangre postmortem
El trabajo futuro incluira combinaciones adecuadas tanto de las sales de
extraccioacuten como de los sorbentes de d-SPE por el meacutetodo mini-QuEChERS
La columna Poroshell 120 ofrece una selectividad diferente y excelentes formas
de pico a lo largo del amplio rango de compuestos farmaceacuteuticos usados en este
estudio
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 42
Referencias
(1) M Anastassiades SJ Lehotay D Štajnbaher and FJ Schenk J AOAC Int 86 4121 (2003)
(2) G Stubbings and T Bigwood Anal Chim Acta 637 68 (2009)
(3) RR Rasmussen IMLD Storm PZH Rasmussen J Smedsgaard and KF Nielsen Anal Bioanal Chem 397 765 (2010)
(4) D Smith and K Lynam GCμECD analysis and confirmation of PCBs in fish tissue with Agilent JampW DB-35ms and DB-XLB GC columns Agilent Technologies 5990-6236EN (2010)
(5) F Ploumlssl M Giera and F Bracher J Chrom A 1135 19 (2006)
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 43
MEJORAR LA PRODUCTIVIDAD EN
HPLC ESTAacuteNDAR CON COLUMNAS
POROSHELL
Page 43
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 44
Columnas Poroshell 120 para HPLC y UHPLC
bull 80-90 de eficacia de las sub 2um
bull A presiones un ~40-50 maacutes bajas
bull Con un tamantildeo de partiacutecula de 27um
bull Con una frita de entrada de 2um
bull Con el doble de resolucioacuten de una
columna de 35um
bull Con un liacutemite de presioacuten de 600 bar
bull La partiacutecula tiene un nuacutecleo soacutelido
(17um) y una cubierta exterior porosa
de 05um como zona de difusioacuten
Las Columnas Poroshell 120 tienen
Page 44
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 45
Poroshell 120 proporciona Eficacia Suficiente
Page 45
Flujo 0582 mLmin AcetonitriloAgua (6040)
Volumen de Inyeccioacuten 4 microL
TCC 26 oC
DAD Sig=2544nm Ref=360100nm
Muestra Muestra de test RRLC
(PN 5188-6529) inoculada con
50 microL 2 mgmL Tiourea en
aguaacetonitrilo (6535)
25 5 75 10
mAU
0
200
400
600
06
46
0
82
6
11
48
15
18
20
16
2
22
3
28
16
41
32
62
73
97
53
larr N = 25053 Presioacuten = 182 bar
Poroshell 120 EC-C18 30 x 100 mm 27 um
min 25 5 75 10 125
mAU
0
200
400
600
06
49
0
86
5
12
75
17
56
24
18
27
05
34
94
52
81
82
18
13
04
1
larr N = 27295 Presioacuten = 386 bar
Eclipse Plus C18 30 x 100 mm 18 um
gt90 de la Eficacia de una 18um
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 46
iquestEn queacute tipos de instrumentos puede usar
Columnas Poroshell 120 HPLCrsquos y UHPLCrsquos
Consideraciones en UHPLC
bull Las columnas Poroshell 120 tienen un liacutemite de presioacuten de 600 bar
bull Los UHPLC estaacuten ajustados para columnas de bajo volumen por lo tanto las
Poroshell pueden usarse en todos los UHPLC
Consideraciones en HPLC
bull Las Columnas Poroshell 120 trabajan bien por debajo de 400 bar
bull Minimize los volumenes extra columna para las columnas 21 y 30mm ID ndash
siga las instrucciones dadas para las columnas RRHT (18um 600 bar)
bull Use en el detector velocidades adecuadas de adquisicioacuten para picos
estrechos de alta eficacia
Page 46
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 47
Con una frita de 2 um Poroshell 120 no se bloquea
Muestras Complejas- Plasma
Diflusinal in Plasma
0
20
40
60
80
100
120
140
160
180
200
220
240
260
280
300
320
340
360
380
400
1 501 1001 1501 2001 2501
Injections
Pre
ssu
re
0
20000
40000
60000
80000
100000
120000
140000
160000
180000
200000
Eff
icie
ncy (
N)
End Press
Plates
Columna Poroshell 120 EC-C18 30 x 50mm 27um LC Agilent 1200 RRLC (SL)
Muestra Plasma Precipitado 2 partes Plasma 7 Partes 2080 Agua-MeCN w01 Aacutecido Foacutermico con 1 Parte de Diflusinal en
5050 Agua-MeCN 10 ugml (Concentracion Final Diflusinal 1 ugml) Agitado y dejado reposar 10 minutos
No Centrifugado No Filtrado
Volumen de Inyeccioacuten 1ul
Solvente A Agua w01 TFA
Solvente B MeCN w008 TFA
Flujo 1 mlmin 1 ul inyeccioacuten
Tiempo B
0 20
05 90
06 90
11 20
25 20
Page 47
Diflusinal es un anti-inflamatorio no esteroidal anaacutelogo
a la aspirina desarrollado por Merck Sharp amp Dohme
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 48
Las Columnas Superficialmente Porosas Pueden
Usarse cumpliendo los Requirimientos USP
De la lista USP de empaquetamientos de columnas LC 42009
Page 48
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 49
Criterios de Ajuste de Meacutetodos USP y FDA Criterios de Ajuste de Meacutetodos de Dimensiones de Columna
Paraacutemetro Especificaciones Maacuteximas ComentariosEjemplos
Longitud de Columna 70 250mm 75mm
150mm 50mm
Diaacutemetro Interno de
Columna
25 (FDA ORA-LAB 545)
USP ndash 25 ID Columna puede ajustarse si la
velocidad lineal es constante
46 mm 30 mm (-35)
46 mm 21 mm (-54)
30 mm 21 mm (-30)
Flow Rate 50
Volumen de Inyeccioacuten
Reducir tanto como se necesitendash
debe cumplir los liacutemites de
deteccioacuten y precisioacuten
Si cambia a una columna maacutes
corta haga el cambio apropiado
en el volumen de inyeccioacuten
Tamantildeo de Partiacutecula Reducir hasta el 50
(no se puede aumentar)
Puede cambiar la longitud de columna y el
tamantildeo de partiacutecula para mantener la misma
Rs
5um 35um (-30)
5um 27um (-46) Cambiado en 22409 ndash Para la copia oficial y actual ir a
httpwwwfdagovScienceResearchFieldSciencedefaulthtm
USP 30 Second Supplement Revisions PF34(5) en proceso
Ver ldquo Stimuli articlerdquo en Pharmacopeial Forum 2009 35(6)
Page 49
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 50
Comparacioacuten de 46 x 250 mm 5 um con Poroshell
120 EC-C18 46 x 100 mm 27um
min 5 10 15 20 25 30
mAU
0
20
40
60
80
100
97
12
111
16
115
96
126
74
152
48
161
51
164
35
206
87
230
76
292
90
min 5 10 15 20 25 30
mAU
0
50
100
150
200
250
17
19
21
89
23
11
26
06
38
67
44
37 45
58
54
50
59
20
70
37
Anaacutelisis maacutes raacutepido(columna maacutes corta flujo maacutes alto)
Mayor sensibilidad(partiacutecula maacutes pequentildeapico maacutes estrecho)
Maacutes optimizado (un anaacutelisis maacutes raacutepido permite ajustar mejor)
Ambos anaacutelisis en Agilent 1100 G1315B DAD (bajo 400 bar)
No se requiere cambio en la preparacioacuten de muestra frita de entrada
de 2 micras en ambas columnas
325 bar
110 bar
Sulfadiazina
Sulfatiazol
Sulfapiridina
Sulfamerazina
Sulfametazina
Sulfametazol
Sulfametoxipiridazina
Sulfacloropiridazina
Sulfametoxazol
Sulfadimetoxina
Tiempo B
0 8
33 33
34 33
Columna Eclipse Plus C18
46 x 250mm 5um
Flujo 1 mLmin
Fase Moacutevil
A 01 Aacutecido Foacutermico en Agua
B 01 Aacutecido Foacutermico en ACN
Tiempo B
0 8
12 33
132 33
Columna 46 x 100mm
Poroshell 120 EC-C18
27um
Flujo 185 mLmin
Page 50
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 51
Comparacioacuten de 46 x 250 mm 5 um con Poroshell
120 EC-C18 46 x 100 mm 27um
min 5 10 15 20 25 30
mAU
0
20
40
60
80
100
97
12
111
16
115
96
126
74
152
48
161
51
164
35
206
87
230
76
292
90
110 bar
5
mAU
0
50
100
150
200
250
17
19
21
89
23
11
26
06
38
67
44
37 45
58
54
50
59
20
70
37
325 bar
min
Ver condiciones en diapositiva anterior
Page 51
Mejor Resolucioacuten
linea base
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 52
Anaacutelisis maacutes raacutepido del meacutetodo USP para pastillas de
Simvastatina en Columnas Poroshell 120ndash Ajuste del meacutetodo
46 x 250 mm 5-um
Agilent ZORBAX Eclipse Plus C18
46 x 75 mm 27-um
Agilent Poroshell 120 EC-C18
65 CH3CN 35 39 gL NaH2PO4 (pH 45) 45 oC Sig = 238 8 Ref = 360 100 nm
Flujos 15 mLmin para la columna de 5-um 28 mLmin para la columna Poroshell 120 27um
Requerimiento
USP
5-um
(15 mLmin)
27-um
(28 mLmin)
TR na 9907 1457
krsquo gt 30 5962 5122
N gt 4500 16939 14439
Tf lt 20 109 110
min 2 4 6 8 10
mAU
0
5
10
15
20
25
30
35
40
min 2
mAU
0
5
10
15
20
25
30
35
40
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 53
Ajustes de los parametros cromatograficos en la
transferencia de meacutetodos Escalado del volume de inyeccioacuten
v1 x [(r22 x L2)(r1
2 x L1)] = V2
O bien
v2 = V1 x [(d22 x L2)(d1
2 x L1)]
v volume de inyeccioacuten
r radio de la columna
L longitud de la columna
Ajuste del flujo
F2= F1 x (L2L1 ) x (r2r1 )2
L longitud de la columna
F Flujo
r radio de la columna
Ajuste de la longitud del gradiente
En funcioacuten de la longitud de la columna
L2L1= tg2tg1
En funcioacuten del volumen muerto de columna y del flujo
tG2= tG1 x (V2V1) x (F1F2) t tiempos de gradiente
V volumen muerto de columna
F flujo
Columna ID Volumen muerto aprox
por mm longitud
46mm 100uL
30mm 425uL
21mm 208uL
10mm 047uL
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 54
Notas de Aplicacioacuten en Poroshell 120 y QuEChERS
Determination of Hormones in Shrimp by Agilent 1290 Infinity LC with
Agilent Poroshell 120 LC Column and Agilent QuEChERS for Sample
Preparation (publication 5990-6589EN)
Analysis of Pesticide Residues in Green Tea Using Agilent SampliQ
QuEChERS EN Kit by LCMSMS Detection (publication 5990-
6400EN)
Analysis of Pesticide Residues in Rice Using Agilent Bond Elut
QuEChERS AOAC Kit (publication 5990-8034EN)
Poroshell 120 for pharmaceutical analysis
Poroshell 120 Resources
QuEChERS Applications
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 55
Sumario
bull La columna Poroshell 120 es una nueva alternativa para LC de Alta
Resolucioacuten y Alta Velocidad que puede usarse en cualquier HPLC o UHPLC
bull Con la Poroshell 120 se pueden lograr separaciones de alta eficacia a baja
presioacuten
bull Puede usarse con muestras sucias sin ver una elevacioacuten anormal de la
presioacuten
bull Puede usarse en un meacutetodo USP sin comprometer los Criterios de Ajustes de
Meacutetodo
Page 55
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 56
Soporte Teacutecnico Agilent
Teleacutefono de Atencioacuten al Cliente
901 11 68 90
email customercare_spainagilentcom
wwwagilentcomchem
![Page 35: Análisis de compuestos farmacéuticos en sangre total · PDF fileReducción en el procesamiento, el envío de la muestra, y los ... Gas flow: 10 L/min Nebulizer: 10 psi Sheath gas](https://reader031.vdocuments.site/reader031/viewer/2022030405/5a7a81727f8b9a0a668b45aa/html5/thumbnails/35.jpg)
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 35
Datos de Adquisicoacuten LCMSMS
Compuestos Canales MRM
(mz) Fragmentador
(V) CE (V) RT (min) Delta RT
Lidocaina 1) 23518 gt 861
2) 23518 gt 581
97 11
35
137 04
Tramadol 1) 2642 gt 581
2) 2642 gt 2461
97 15
3
120 04
Amitriptilina 1) 2782 gt 117
2) 2782 gt 105
112 19
19
425 04
Biperidena 1)31223 gt 981
2) 31223 gt 551
123 19
60
423 07
Oxazepam 1) 28706 gt 2409
2) 28706 gt 2689
112 19
7
399 04
Lorazepam 1) 32102 gt 2749
2) 32102 gt 3029
113 15
7
409 04
Clorpromazina 1) 31911 gt 861
2) 31911 gt 581
112 15
43
463 04
Diltiazem 1) 41517 gt 1779
2) 41517 gt 1499
128 19
43
373 04
Naloxona 1) 32816 gt 310
2) 32816 gt 212
123 15
39
082 04
Nortriptilina (IS) 1) 26418 gt 233
2) 26418 gt 91
97 7
19
417 04
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7 x10
0125
015
0175
02
0225
025
0275
03
0325
035
0375
04
0425
045
0475
05
0525
055
0575
06
0625
065
0675
07
0725
075
0775
08
0825
085
0875
09
0925
095
0975
1
1025
105
1075
11
1125
115
1175
12
1225
125
1275
13
1325
135
1375
+ESI TIC Scan Frag=800V AOAC_BLANK_110228bd
1 1
Counts vs Acquisition Time (min)
05 1 15 2 25
3 35 4 45 5 55 6 65 7 75 8 85 9 95 10
Columna Poroshell 120 EC-C18 27
micro 21 x 100 mm PN 695775-902
Fase Moacutevil
A 5 mM Acetato Amoacutenico pH 5
2080 MeOHagua
B 5 mM Acetato amoacutencio en ACN
Flujo 04mLmin
Inyeccioacuten 10uL
GT (ordmC) 300
GF (lmin) 7
Nebulizador (psi) 40
SGT (ordmC) 400
SFG (lmin) 12
Capilar (V) 3500
NV (V) 500
Condiciones LCMS
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 37
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01
02
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1
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2
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29
3
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36
37
38
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4
41
42
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45
46
47
48
49
5
51
+ESI MRM Frag=1120V CID190 (2782000 -gt 1170000) HQC_6d
1 1
Counts vs Acquisition Time (min) 01 02 03 04 05 06 07 08 09 1 11 12 13 14 15 16 17 18 19 2 21 22 23 24 25 26 27 28 29 3 31 32 33 34 35 36 37 38 39 4 41 42 43 44 45 46
Nalo
xo
ne
Lid
oc
ain
e
Tra
mad
ol
Oxazep
am
Lo
razep
am
Bip
eri
de
n
Am
itri
pty
lin
e
Dil
tiazem
Ch
lorp
rom
azin
e
No
rtri
pty
lin
e (
IS)
Cromatograma LCMSMS de 10 ngmL de sangre total fortificada despueacutes
de extraccioacuten mini-QuEChERS AOAC (NaAc) y d-SPE (50mg PSA y
150mg MgSO4)
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 38
3 x10
01
02
03
04
05
06
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09
1
11
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14
15
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2
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26
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28
29
3
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33
34
35
36
37
38
39
4
41
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45
46
47
48
49
5
51
+ESI MRM Frag=1120V CID190 (2782000 -gt 1170000) HQC_6d
1 1
Counts vs Acquisition Time (min) 01 02 03 04 05 06 07 08 09 1 11 12 13 14 15 16 17 18 19 2 21 22 23 24 25 26 27 28 29 3 31 32 33 34 35 36 37 38 39 4 41 42 43 44 45 46
1 x10
415 42 425 43 435 44 445 45 455 46 465 47 475 48 485 49 495 5
505 51 515 52 525 53 535 54 545 55 555 56 565 57
+ESI MRM Frag=1120V CID190 (2871000 -gt 2409000) RE_L_1d 1
Counts vs Acquisition Time (min) 305 31 315 32 325 33 335 34 345 35 355 36 365 37 375 38 385 39 395 4 405 41 415 42 425 43 435 44 445 45 455 46 465 47 475
Relacioacuten sentildealruido para el Oxazepam y Lorazepam a
10 ngmL (10 ppb)
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 39
La Naloxone muestra esta curva de linealidad de10-250 ngmL (ppb) con una R2
= 0991
Las curvas de calibracioacuten se generaron con la respuestra relativa (area pico
analitoarea pico IS) frente a la concentracioacuten relativa (concentracion de
analitoconcentracioacuten de IS)
Ejemplo de curva de linealidad para Naloxona extraido
con mini-QuEChERS
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 40
Recuperacioacuten y Reproducibilidad
Compuesto 50 ngmL Spiked
Recuperacioacuten RSD
100 ngmL Spiked
Recuperacioacuten RSD
Lidocaine 987 157 100 118
Tramadol 105 30 104 82
Amitriptyline 104 21 104 82
Biperidene 97 45 99 82
Oxazepam 770 92 78 86
Lorazepam 819 68 818 86
Chlorpromazine 110 103 105 63
Diltiazem 881 27 917 83
Naloxone 806 90 755 77
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 41
Conclusioacutenes y trabajo posterior
El meacutetodo mini-QuEChERS para la extraccioacuten de compuestos farmaceacuteuticos en
sangre total ofrece una alternativa a otras teacutecnicas de preparacioacuten de muestras
La preparacioacuten de muestras mini-QuEChERS es un enfoque simple facil y
barato que requiere una miacutenima experiencia en preparacioacuten de muestras y
miacutenimo equipamiento
Es un punto de partida para ampliar el numero y las clasificaciones evaluadas
en otras matrices bioloacutegicas y en sangre postmortem
El trabajo futuro incluira combinaciones adecuadas tanto de las sales de
extraccioacuten como de los sorbentes de d-SPE por el meacutetodo mini-QuEChERS
La columna Poroshell 120 ofrece una selectividad diferente y excelentes formas
de pico a lo largo del amplio rango de compuestos farmaceacuteuticos usados en este
estudio
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 42
Referencias
(1) M Anastassiades SJ Lehotay D Štajnbaher and FJ Schenk J AOAC Int 86 4121 (2003)
(2) G Stubbings and T Bigwood Anal Chim Acta 637 68 (2009)
(3) RR Rasmussen IMLD Storm PZH Rasmussen J Smedsgaard and KF Nielsen Anal Bioanal Chem 397 765 (2010)
(4) D Smith and K Lynam GCμECD analysis and confirmation of PCBs in fish tissue with Agilent JampW DB-35ms and DB-XLB GC columns Agilent Technologies 5990-6236EN (2010)
(5) F Ploumlssl M Giera and F Bracher J Chrom A 1135 19 (2006)
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 43
MEJORAR LA PRODUCTIVIDAD EN
HPLC ESTAacuteNDAR CON COLUMNAS
POROSHELL
Page 43
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 44
Columnas Poroshell 120 para HPLC y UHPLC
bull 80-90 de eficacia de las sub 2um
bull A presiones un ~40-50 maacutes bajas
bull Con un tamantildeo de partiacutecula de 27um
bull Con una frita de entrada de 2um
bull Con el doble de resolucioacuten de una
columna de 35um
bull Con un liacutemite de presioacuten de 600 bar
bull La partiacutecula tiene un nuacutecleo soacutelido
(17um) y una cubierta exterior porosa
de 05um como zona de difusioacuten
Las Columnas Poroshell 120 tienen
Page 44
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 45
Poroshell 120 proporciona Eficacia Suficiente
Page 45
Flujo 0582 mLmin AcetonitriloAgua (6040)
Volumen de Inyeccioacuten 4 microL
TCC 26 oC
DAD Sig=2544nm Ref=360100nm
Muestra Muestra de test RRLC
(PN 5188-6529) inoculada con
50 microL 2 mgmL Tiourea en
aguaacetonitrilo (6535)
25 5 75 10
mAU
0
200
400
600
06
46
0
82
6
11
48
15
18
20
16
2
22
3
28
16
41
32
62
73
97
53
larr N = 25053 Presioacuten = 182 bar
Poroshell 120 EC-C18 30 x 100 mm 27 um
min 25 5 75 10 125
mAU
0
200
400
600
06
49
0
86
5
12
75
17
56
24
18
27
05
34
94
52
81
82
18
13
04
1
larr N = 27295 Presioacuten = 386 bar
Eclipse Plus C18 30 x 100 mm 18 um
gt90 de la Eficacia de una 18um
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 46
iquestEn queacute tipos de instrumentos puede usar
Columnas Poroshell 120 HPLCrsquos y UHPLCrsquos
Consideraciones en UHPLC
bull Las columnas Poroshell 120 tienen un liacutemite de presioacuten de 600 bar
bull Los UHPLC estaacuten ajustados para columnas de bajo volumen por lo tanto las
Poroshell pueden usarse en todos los UHPLC
Consideraciones en HPLC
bull Las Columnas Poroshell 120 trabajan bien por debajo de 400 bar
bull Minimize los volumenes extra columna para las columnas 21 y 30mm ID ndash
siga las instrucciones dadas para las columnas RRHT (18um 600 bar)
bull Use en el detector velocidades adecuadas de adquisicioacuten para picos
estrechos de alta eficacia
Page 46
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 47
Con una frita de 2 um Poroshell 120 no se bloquea
Muestras Complejas- Plasma
Diflusinal in Plasma
0
20
40
60
80
100
120
140
160
180
200
220
240
260
280
300
320
340
360
380
400
1 501 1001 1501 2001 2501
Injections
Pre
ssu
re
0
20000
40000
60000
80000
100000
120000
140000
160000
180000
200000
Eff
icie
ncy (
N)
End Press
Plates
Columna Poroshell 120 EC-C18 30 x 50mm 27um LC Agilent 1200 RRLC (SL)
Muestra Plasma Precipitado 2 partes Plasma 7 Partes 2080 Agua-MeCN w01 Aacutecido Foacutermico con 1 Parte de Diflusinal en
5050 Agua-MeCN 10 ugml (Concentracion Final Diflusinal 1 ugml) Agitado y dejado reposar 10 minutos
No Centrifugado No Filtrado
Volumen de Inyeccioacuten 1ul
Solvente A Agua w01 TFA
Solvente B MeCN w008 TFA
Flujo 1 mlmin 1 ul inyeccioacuten
Tiempo B
0 20
05 90
06 90
11 20
25 20
Page 47
Diflusinal es un anti-inflamatorio no esteroidal anaacutelogo
a la aspirina desarrollado por Merck Sharp amp Dohme
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 48
Las Columnas Superficialmente Porosas Pueden
Usarse cumpliendo los Requirimientos USP
De la lista USP de empaquetamientos de columnas LC 42009
Page 48
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 49
Criterios de Ajuste de Meacutetodos USP y FDA Criterios de Ajuste de Meacutetodos de Dimensiones de Columna
Paraacutemetro Especificaciones Maacuteximas ComentariosEjemplos
Longitud de Columna 70 250mm 75mm
150mm 50mm
Diaacutemetro Interno de
Columna
25 (FDA ORA-LAB 545)
USP ndash 25 ID Columna puede ajustarse si la
velocidad lineal es constante
46 mm 30 mm (-35)
46 mm 21 mm (-54)
30 mm 21 mm (-30)
Flow Rate 50
Volumen de Inyeccioacuten
Reducir tanto como se necesitendash
debe cumplir los liacutemites de
deteccioacuten y precisioacuten
Si cambia a una columna maacutes
corta haga el cambio apropiado
en el volumen de inyeccioacuten
Tamantildeo de Partiacutecula Reducir hasta el 50
(no se puede aumentar)
Puede cambiar la longitud de columna y el
tamantildeo de partiacutecula para mantener la misma
Rs
5um 35um (-30)
5um 27um (-46) Cambiado en 22409 ndash Para la copia oficial y actual ir a
httpwwwfdagovScienceResearchFieldSciencedefaulthtm
USP 30 Second Supplement Revisions PF34(5) en proceso
Ver ldquo Stimuli articlerdquo en Pharmacopeial Forum 2009 35(6)
Page 49
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 50
Comparacioacuten de 46 x 250 mm 5 um con Poroshell
120 EC-C18 46 x 100 mm 27um
min 5 10 15 20 25 30
mAU
0
20
40
60
80
100
97
12
111
16
115
96
126
74
152
48
161
51
164
35
206
87
230
76
292
90
min 5 10 15 20 25 30
mAU
0
50
100
150
200
250
17
19
21
89
23
11
26
06
38
67
44
37 45
58
54
50
59
20
70
37
Anaacutelisis maacutes raacutepido(columna maacutes corta flujo maacutes alto)
Mayor sensibilidad(partiacutecula maacutes pequentildeapico maacutes estrecho)
Maacutes optimizado (un anaacutelisis maacutes raacutepido permite ajustar mejor)
Ambos anaacutelisis en Agilent 1100 G1315B DAD (bajo 400 bar)
No se requiere cambio en la preparacioacuten de muestra frita de entrada
de 2 micras en ambas columnas
325 bar
110 bar
Sulfadiazina
Sulfatiazol
Sulfapiridina
Sulfamerazina
Sulfametazina
Sulfametazol
Sulfametoxipiridazina
Sulfacloropiridazina
Sulfametoxazol
Sulfadimetoxina
Tiempo B
0 8
33 33
34 33
Columna Eclipse Plus C18
46 x 250mm 5um
Flujo 1 mLmin
Fase Moacutevil
A 01 Aacutecido Foacutermico en Agua
B 01 Aacutecido Foacutermico en ACN
Tiempo B
0 8
12 33
132 33
Columna 46 x 100mm
Poroshell 120 EC-C18
27um
Flujo 185 mLmin
Page 50
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 51
Comparacioacuten de 46 x 250 mm 5 um con Poroshell
120 EC-C18 46 x 100 mm 27um
min 5 10 15 20 25 30
mAU
0
20
40
60
80
100
97
12
111
16
115
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126
74
152
48
161
51
164
35
206
87
230
76
292
90
110 bar
5
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100
150
200
250
17
19
21
89
23
11
26
06
38
67
44
37 45
58
54
50
59
20
70
37
325 bar
min
Ver condiciones en diapositiva anterior
Page 51
Mejor Resolucioacuten
linea base
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 52
Anaacutelisis maacutes raacutepido del meacutetodo USP para pastillas de
Simvastatina en Columnas Poroshell 120ndash Ajuste del meacutetodo
46 x 250 mm 5-um
Agilent ZORBAX Eclipse Plus C18
46 x 75 mm 27-um
Agilent Poroshell 120 EC-C18
65 CH3CN 35 39 gL NaH2PO4 (pH 45) 45 oC Sig = 238 8 Ref = 360 100 nm
Flujos 15 mLmin para la columna de 5-um 28 mLmin para la columna Poroshell 120 27um
Requerimiento
USP
5-um
(15 mLmin)
27-um
(28 mLmin)
TR na 9907 1457
krsquo gt 30 5962 5122
N gt 4500 16939 14439
Tf lt 20 109 110
min 2 4 6 8 10
mAU
0
5
10
15
20
25
30
35
40
min 2
mAU
0
5
10
15
20
25
30
35
40
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 53
Ajustes de los parametros cromatograficos en la
transferencia de meacutetodos Escalado del volume de inyeccioacuten
v1 x [(r22 x L2)(r1
2 x L1)] = V2
O bien
v2 = V1 x [(d22 x L2)(d1
2 x L1)]
v volume de inyeccioacuten
r radio de la columna
L longitud de la columna
Ajuste del flujo
F2= F1 x (L2L1 ) x (r2r1 )2
L longitud de la columna
F Flujo
r radio de la columna
Ajuste de la longitud del gradiente
En funcioacuten de la longitud de la columna
L2L1= tg2tg1
En funcioacuten del volumen muerto de columna y del flujo
tG2= tG1 x (V2V1) x (F1F2) t tiempos de gradiente
V volumen muerto de columna
F flujo
Columna ID Volumen muerto aprox
por mm longitud
46mm 100uL
30mm 425uL
21mm 208uL
10mm 047uL
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 54
Notas de Aplicacioacuten en Poroshell 120 y QuEChERS
Determination of Hormones in Shrimp by Agilent 1290 Infinity LC with
Agilent Poroshell 120 LC Column and Agilent QuEChERS for Sample
Preparation (publication 5990-6589EN)
Analysis of Pesticide Residues in Green Tea Using Agilent SampliQ
QuEChERS EN Kit by LCMSMS Detection (publication 5990-
6400EN)
Analysis of Pesticide Residues in Rice Using Agilent Bond Elut
QuEChERS AOAC Kit (publication 5990-8034EN)
Poroshell 120 for pharmaceutical analysis
Poroshell 120 Resources
QuEChERS Applications
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 55
Sumario
bull La columna Poroshell 120 es una nueva alternativa para LC de Alta
Resolucioacuten y Alta Velocidad que puede usarse en cualquier HPLC o UHPLC
bull Con la Poroshell 120 se pueden lograr separaciones de alta eficacia a baja
presioacuten
bull Puede usarse con muestras sucias sin ver una elevacioacuten anormal de la
presioacuten
bull Puede usarse en un meacutetodo USP sin comprometer los Criterios de Ajustes de
Meacutetodo
Page 55
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 56
Soporte Teacutecnico Agilent
Teleacutefono de Atencioacuten al Cliente
901 11 68 90
email customercare_spainagilentcom
wwwagilentcomchem
![Page 36: Análisis de compuestos farmacéuticos en sangre total · PDF fileReducción en el procesamiento, el envío de la muestra, y los ... Gas flow: 10 L/min Nebulizer: 10 psi Sheath gas](https://reader031.vdocuments.site/reader031/viewer/2022030405/5a7a81727f8b9a0a668b45aa/html5/thumbnails/36.jpg)
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02
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03
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035
0375
04
0425
045
0475
05
0525
055
0575
06
0625
065
0675
07
0725
075
0775
08
0825
085
0875
09
0925
095
0975
1
1025
105
1075
11
1125
115
1175
12
1225
125
1275
13
1325
135
1375
+ESI TIC Scan Frag=800V AOAC_BLANK_110228bd
1 1
Counts vs Acquisition Time (min)
05 1 15 2 25
3 35 4 45 5 55 6 65 7 75 8 85 9 95 10
Columna Poroshell 120 EC-C18 27
micro 21 x 100 mm PN 695775-902
Fase Moacutevil
A 5 mM Acetato Amoacutenico pH 5
2080 MeOHagua
B 5 mM Acetato amoacutencio en ACN
Flujo 04mLmin
Inyeccioacuten 10uL
GT (ordmC) 300
GF (lmin) 7
Nebulizador (psi) 40
SGT (ordmC) 400
SFG (lmin) 12
Capilar (V) 3500
NV (V) 500
Condiciones LCMS
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1
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2
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29
3
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36
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38
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4
41
42
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46
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48
49
5
51
+ESI MRM Frag=1120V CID190 (2782000 -gt 1170000) HQC_6d
1 1
Counts vs Acquisition Time (min) 01 02 03 04 05 06 07 08 09 1 11 12 13 14 15 16 17 18 19 2 21 22 23 24 25 26 27 28 29 3 31 32 33 34 35 36 37 38 39 4 41 42 43 44 45 46
Nalo
xo
ne
Lid
oc
ain
e
Tra
mad
ol
Oxazep
am
Lo
razep
am
Bip
eri
de
n
Am
itri
pty
lin
e
Dil
tiazem
Ch
lorp
rom
azin
e
No
rtri
pty
lin
e (
IS)
Cromatograma LCMSMS de 10 ngmL de sangre total fortificada despueacutes
de extraccioacuten mini-QuEChERS AOAC (NaAc) y d-SPE (50mg PSA y
150mg MgSO4)
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 38
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4
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5
51
+ESI MRM Frag=1120V CID190 (2782000 -gt 1170000) HQC_6d
1 1
Counts vs Acquisition Time (min) 01 02 03 04 05 06 07 08 09 1 11 12 13 14 15 16 17 18 19 2 21 22 23 24 25 26 27 28 29 3 31 32 33 34 35 36 37 38 39 4 41 42 43 44 45 46
1 x10
415 42 425 43 435 44 445 45 455 46 465 47 475 48 485 49 495 5
505 51 515 52 525 53 535 54 545 55 555 56 565 57
+ESI MRM Frag=1120V CID190 (2871000 -gt 2409000) RE_L_1d 1
Counts vs Acquisition Time (min) 305 31 315 32 325 33 335 34 345 35 355 36 365 37 375 38 385 39 395 4 405 41 415 42 425 43 435 44 445 45 455 46 465 47 475
Relacioacuten sentildealruido para el Oxazepam y Lorazepam a
10 ngmL (10 ppb)
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 39
La Naloxone muestra esta curva de linealidad de10-250 ngmL (ppb) con una R2
= 0991
Las curvas de calibracioacuten se generaron con la respuestra relativa (area pico
analitoarea pico IS) frente a la concentracioacuten relativa (concentracion de
analitoconcentracioacuten de IS)
Ejemplo de curva de linealidad para Naloxona extraido
con mini-QuEChERS
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 40
Recuperacioacuten y Reproducibilidad
Compuesto 50 ngmL Spiked
Recuperacioacuten RSD
100 ngmL Spiked
Recuperacioacuten RSD
Lidocaine 987 157 100 118
Tramadol 105 30 104 82
Amitriptyline 104 21 104 82
Biperidene 97 45 99 82
Oxazepam 770 92 78 86
Lorazepam 819 68 818 86
Chlorpromazine 110 103 105 63
Diltiazem 881 27 917 83
Naloxone 806 90 755 77
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 41
Conclusioacutenes y trabajo posterior
El meacutetodo mini-QuEChERS para la extraccioacuten de compuestos farmaceacuteuticos en
sangre total ofrece una alternativa a otras teacutecnicas de preparacioacuten de muestras
La preparacioacuten de muestras mini-QuEChERS es un enfoque simple facil y
barato que requiere una miacutenima experiencia en preparacioacuten de muestras y
miacutenimo equipamiento
Es un punto de partida para ampliar el numero y las clasificaciones evaluadas
en otras matrices bioloacutegicas y en sangre postmortem
El trabajo futuro incluira combinaciones adecuadas tanto de las sales de
extraccioacuten como de los sorbentes de d-SPE por el meacutetodo mini-QuEChERS
La columna Poroshell 120 ofrece una selectividad diferente y excelentes formas
de pico a lo largo del amplio rango de compuestos farmaceacuteuticos usados en este
estudio
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 42
Referencias
(1) M Anastassiades SJ Lehotay D Štajnbaher and FJ Schenk J AOAC Int 86 4121 (2003)
(2) G Stubbings and T Bigwood Anal Chim Acta 637 68 (2009)
(3) RR Rasmussen IMLD Storm PZH Rasmussen J Smedsgaard and KF Nielsen Anal Bioanal Chem 397 765 (2010)
(4) D Smith and K Lynam GCμECD analysis and confirmation of PCBs in fish tissue with Agilent JampW DB-35ms and DB-XLB GC columns Agilent Technologies 5990-6236EN (2010)
(5) F Ploumlssl M Giera and F Bracher J Chrom A 1135 19 (2006)
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 43
MEJORAR LA PRODUCTIVIDAD EN
HPLC ESTAacuteNDAR CON COLUMNAS
POROSHELL
Page 43
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 44
Columnas Poroshell 120 para HPLC y UHPLC
bull 80-90 de eficacia de las sub 2um
bull A presiones un ~40-50 maacutes bajas
bull Con un tamantildeo de partiacutecula de 27um
bull Con una frita de entrada de 2um
bull Con el doble de resolucioacuten de una
columna de 35um
bull Con un liacutemite de presioacuten de 600 bar
bull La partiacutecula tiene un nuacutecleo soacutelido
(17um) y una cubierta exterior porosa
de 05um como zona de difusioacuten
Las Columnas Poroshell 120 tienen
Page 44
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 45
Poroshell 120 proporciona Eficacia Suficiente
Page 45
Flujo 0582 mLmin AcetonitriloAgua (6040)
Volumen de Inyeccioacuten 4 microL
TCC 26 oC
DAD Sig=2544nm Ref=360100nm
Muestra Muestra de test RRLC
(PN 5188-6529) inoculada con
50 microL 2 mgmL Tiourea en
aguaacetonitrilo (6535)
25 5 75 10
mAU
0
200
400
600
06
46
0
82
6
11
48
15
18
20
16
2
22
3
28
16
41
32
62
73
97
53
larr N = 25053 Presioacuten = 182 bar
Poroshell 120 EC-C18 30 x 100 mm 27 um
min 25 5 75 10 125
mAU
0
200
400
600
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0
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5
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17
56
24
18
27
05
34
94
52
81
82
18
13
04
1
larr N = 27295 Presioacuten = 386 bar
Eclipse Plus C18 30 x 100 mm 18 um
gt90 de la Eficacia de una 18um
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 46
iquestEn queacute tipos de instrumentos puede usar
Columnas Poroshell 120 HPLCrsquos y UHPLCrsquos
Consideraciones en UHPLC
bull Las columnas Poroshell 120 tienen un liacutemite de presioacuten de 600 bar
bull Los UHPLC estaacuten ajustados para columnas de bajo volumen por lo tanto las
Poroshell pueden usarse en todos los UHPLC
Consideraciones en HPLC
bull Las Columnas Poroshell 120 trabajan bien por debajo de 400 bar
bull Minimize los volumenes extra columna para las columnas 21 y 30mm ID ndash
siga las instrucciones dadas para las columnas RRHT (18um 600 bar)
bull Use en el detector velocidades adecuadas de adquisicioacuten para picos
estrechos de alta eficacia
Page 46
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 47
Con una frita de 2 um Poroshell 120 no se bloquea
Muestras Complejas- Plasma
Diflusinal in Plasma
0
20
40
60
80
100
120
140
160
180
200
220
240
260
280
300
320
340
360
380
400
1 501 1001 1501 2001 2501
Injections
Pre
ssu
re
0
20000
40000
60000
80000
100000
120000
140000
160000
180000
200000
Eff
icie
ncy (
N)
End Press
Plates
Columna Poroshell 120 EC-C18 30 x 50mm 27um LC Agilent 1200 RRLC (SL)
Muestra Plasma Precipitado 2 partes Plasma 7 Partes 2080 Agua-MeCN w01 Aacutecido Foacutermico con 1 Parte de Diflusinal en
5050 Agua-MeCN 10 ugml (Concentracion Final Diflusinal 1 ugml) Agitado y dejado reposar 10 minutos
No Centrifugado No Filtrado
Volumen de Inyeccioacuten 1ul
Solvente A Agua w01 TFA
Solvente B MeCN w008 TFA
Flujo 1 mlmin 1 ul inyeccioacuten
Tiempo B
0 20
05 90
06 90
11 20
25 20
Page 47
Diflusinal es un anti-inflamatorio no esteroidal anaacutelogo
a la aspirina desarrollado por Merck Sharp amp Dohme
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 48
Las Columnas Superficialmente Porosas Pueden
Usarse cumpliendo los Requirimientos USP
De la lista USP de empaquetamientos de columnas LC 42009
Page 48
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 49
Criterios de Ajuste de Meacutetodos USP y FDA Criterios de Ajuste de Meacutetodos de Dimensiones de Columna
Paraacutemetro Especificaciones Maacuteximas ComentariosEjemplos
Longitud de Columna 70 250mm 75mm
150mm 50mm
Diaacutemetro Interno de
Columna
25 (FDA ORA-LAB 545)
USP ndash 25 ID Columna puede ajustarse si la
velocidad lineal es constante
46 mm 30 mm (-35)
46 mm 21 mm (-54)
30 mm 21 mm (-30)
Flow Rate 50
Volumen de Inyeccioacuten
Reducir tanto como se necesitendash
debe cumplir los liacutemites de
deteccioacuten y precisioacuten
Si cambia a una columna maacutes
corta haga el cambio apropiado
en el volumen de inyeccioacuten
Tamantildeo de Partiacutecula Reducir hasta el 50
(no se puede aumentar)
Puede cambiar la longitud de columna y el
tamantildeo de partiacutecula para mantener la misma
Rs
5um 35um (-30)
5um 27um (-46) Cambiado en 22409 ndash Para la copia oficial y actual ir a
httpwwwfdagovScienceResearchFieldSciencedefaulthtm
USP 30 Second Supplement Revisions PF34(5) en proceso
Ver ldquo Stimuli articlerdquo en Pharmacopeial Forum 2009 35(6)
Page 49
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 50
Comparacioacuten de 46 x 250 mm 5 um con Poroshell
120 EC-C18 46 x 100 mm 27um
min 5 10 15 20 25 30
mAU
0
20
40
60
80
100
97
12
111
16
115
96
126
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48
161
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164
35
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90
min 5 10 15 20 25 30
mAU
0
50
100
150
200
250
17
19
21
89
23
11
26
06
38
67
44
37 45
58
54
50
59
20
70
37
Anaacutelisis maacutes raacutepido(columna maacutes corta flujo maacutes alto)
Mayor sensibilidad(partiacutecula maacutes pequentildeapico maacutes estrecho)
Maacutes optimizado (un anaacutelisis maacutes raacutepido permite ajustar mejor)
Ambos anaacutelisis en Agilent 1100 G1315B DAD (bajo 400 bar)
No se requiere cambio en la preparacioacuten de muestra frita de entrada
de 2 micras en ambas columnas
325 bar
110 bar
Sulfadiazina
Sulfatiazol
Sulfapiridina
Sulfamerazina
Sulfametazina
Sulfametazol
Sulfametoxipiridazina
Sulfacloropiridazina
Sulfametoxazol
Sulfadimetoxina
Tiempo B
0 8
33 33
34 33
Columna Eclipse Plus C18
46 x 250mm 5um
Flujo 1 mLmin
Fase Moacutevil
A 01 Aacutecido Foacutermico en Agua
B 01 Aacutecido Foacutermico en ACN
Tiempo B
0 8
12 33
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Columna 46 x 100mm
Poroshell 120 EC-C18
27um
Flujo 185 mLmin
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Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 51
Comparacioacuten de 46 x 250 mm 5 um con Poroshell
120 EC-C18 46 x 100 mm 27um
min 5 10 15 20 25 30
mAU
0
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min
Ver condiciones en diapositiva anterior
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Mejor Resolucioacuten
linea base
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Anaacutelisis maacutes raacutepido del meacutetodo USP para pastillas de
Simvastatina en Columnas Poroshell 120ndash Ajuste del meacutetodo
46 x 250 mm 5-um
Agilent ZORBAX Eclipse Plus C18
46 x 75 mm 27-um
Agilent Poroshell 120 EC-C18
65 CH3CN 35 39 gL NaH2PO4 (pH 45) 45 oC Sig = 238 8 Ref = 360 100 nm
Flujos 15 mLmin para la columna de 5-um 28 mLmin para la columna Poroshell 120 27um
Requerimiento
USP
5-um
(15 mLmin)
27-um
(28 mLmin)
TR na 9907 1457
krsquo gt 30 5962 5122
N gt 4500 16939 14439
Tf lt 20 109 110
min 2 4 6 8 10
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min 2
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Ajustes de los parametros cromatograficos en la
transferencia de meacutetodos Escalado del volume de inyeccioacuten
v1 x [(r22 x L2)(r1
2 x L1)] = V2
O bien
v2 = V1 x [(d22 x L2)(d1
2 x L1)]
v volume de inyeccioacuten
r radio de la columna
L longitud de la columna
Ajuste del flujo
F2= F1 x (L2L1 ) x (r2r1 )2
L longitud de la columna
F Flujo
r radio de la columna
Ajuste de la longitud del gradiente
En funcioacuten de la longitud de la columna
L2L1= tg2tg1
En funcioacuten del volumen muerto de columna y del flujo
tG2= tG1 x (V2V1) x (F1F2) t tiempos de gradiente
V volumen muerto de columna
F flujo
Columna ID Volumen muerto aprox
por mm longitud
46mm 100uL
30mm 425uL
21mm 208uL
10mm 047uL
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 54
Notas de Aplicacioacuten en Poroshell 120 y QuEChERS
Determination of Hormones in Shrimp by Agilent 1290 Infinity LC with
Agilent Poroshell 120 LC Column and Agilent QuEChERS for Sample
Preparation (publication 5990-6589EN)
Analysis of Pesticide Residues in Green Tea Using Agilent SampliQ
QuEChERS EN Kit by LCMSMS Detection (publication 5990-
6400EN)
Analysis of Pesticide Residues in Rice Using Agilent Bond Elut
QuEChERS AOAC Kit (publication 5990-8034EN)
Poroshell 120 for pharmaceutical analysis
Poroshell 120 Resources
QuEChERS Applications
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 55
Sumario
bull La columna Poroshell 120 es una nueva alternativa para LC de Alta
Resolucioacuten y Alta Velocidad que puede usarse en cualquier HPLC o UHPLC
bull Con la Poroshell 120 se pueden lograr separaciones de alta eficacia a baja
presioacuten
bull Puede usarse con muestras sucias sin ver una elevacioacuten anormal de la
presioacuten
bull Puede usarse en un meacutetodo USP sin comprometer los Criterios de Ajustes de
Meacutetodo
Page 55
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 56
Soporte Teacutecnico Agilent
Teleacutefono de Atencioacuten al Cliente
901 11 68 90
email customercare_spainagilentcom
wwwagilentcomchem
![Page 37: Análisis de compuestos farmacéuticos en sangre total · PDF fileReducción en el procesamiento, el envío de la muestra, y los ... Gas flow: 10 L/min Nebulizer: 10 psi Sheath gas](https://reader031.vdocuments.site/reader031/viewer/2022030405/5a7a81727f8b9a0a668b45aa/html5/thumbnails/37.jpg)
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+ESI MRM Frag=1120V CID190 (2782000 -gt 1170000) HQC_6d
1 1
Counts vs Acquisition Time (min) 01 02 03 04 05 06 07 08 09 1 11 12 13 14 15 16 17 18 19 2 21 22 23 24 25 26 27 28 29 3 31 32 33 34 35 36 37 38 39 4 41 42 43 44 45 46
Nalo
xo
ne
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oc
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e
Tra
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ol
Oxazep
am
Lo
razep
am
Bip
eri
de
n
Am
itri
pty
lin
e
Dil
tiazem
Ch
lorp
rom
azin
e
No
rtri
pty
lin
e (
IS)
Cromatograma LCMSMS de 10 ngmL de sangre total fortificada despueacutes
de extraccioacuten mini-QuEChERS AOAC (NaAc) y d-SPE (50mg PSA y
150mg MgSO4)
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+ESI MRM Frag=1120V CID190 (2782000 -gt 1170000) HQC_6d
1 1
Counts vs Acquisition Time (min) 01 02 03 04 05 06 07 08 09 1 11 12 13 14 15 16 17 18 19 2 21 22 23 24 25 26 27 28 29 3 31 32 33 34 35 36 37 38 39 4 41 42 43 44 45 46
1 x10
415 42 425 43 435 44 445 45 455 46 465 47 475 48 485 49 495 5
505 51 515 52 525 53 535 54 545 55 555 56 565 57
+ESI MRM Frag=1120V CID190 (2871000 -gt 2409000) RE_L_1d 1
Counts vs Acquisition Time (min) 305 31 315 32 325 33 335 34 345 35 355 36 365 37 375 38 385 39 395 4 405 41 415 42 425 43 435 44 445 45 455 46 465 47 475
Relacioacuten sentildealruido para el Oxazepam y Lorazepam a
10 ngmL (10 ppb)
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 39
La Naloxone muestra esta curva de linealidad de10-250 ngmL (ppb) con una R2
= 0991
Las curvas de calibracioacuten se generaron con la respuestra relativa (area pico
analitoarea pico IS) frente a la concentracioacuten relativa (concentracion de
analitoconcentracioacuten de IS)
Ejemplo de curva de linealidad para Naloxona extraido
con mini-QuEChERS
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 40
Recuperacioacuten y Reproducibilidad
Compuesto 50 ngmL Spiked
Recuperacioacuten RSD
100 ngmL Spiked
Recuperacioacuten RSD
Lidocaine 987 157 100 118
Tramadol 105 30 104 82
Amitriptyline 104 21 104 82
Biperidene 97 45 99 82
Oxazepam 770 92 78 86
Lorazepam 819 68 818 86
Chlorpromazine 110 103 105 63
Diltiazem 881 27 917 83
Naloxone 806 90 755 77
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 41
Conclusioacutenes y trabajo posterior
El meacutetodo mini-QuEChERS para la extraccioacuten de compuestos farmaceacuteuticos en
sangre total ofrece una alternativa a otras teacutecnicas de preparacioacuten de muestras
La preparacioacuten de muestras mini-QuEChERS es un enfoque simple facil y
barato que requiere una miacutenima experiencia en preparacioacuten de muestras y
miacutenimo equipamiento
Es un punto de partida para ampliar el numero y las clasificaciones evaluadas
en otras matrices bioloacutegicas y en sangre postmortem
El trabajo futuro incluira combinaciones adecuadas tanto de las sales de
extraccioacuten como de los sorbentes de d-SPE por el meacutetodo mini-QuEChERS
La columna Poroshell 120 ofrece una selectividad diferente y excelentes formas
de pico a lo largo del amplio rango de compuestos farmaceacuteuticos usados en este
estudio
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 42
Referencias
(1) M Anastassiades SJ Lehotay D Štajnbaher and FJ Schenk J AOAC Int 86 4121 (2003)
(2) G Stubbings and T Bigwood Anal Chim Acta 637 68 (2009)
(3) RR Rasmussen IMLD Storm PZH Rasmussen J Smedsgaard and KF Nielsen Anal Bioanal Chem 397 765 (2010)
(4) D Smith and K Lynam GCμECD analysis and confirmation of PCBs in fish tissue with Agilent JampW DB-35ms and DB-XLB GC columns Agilent Technologies 5990-6236EN (2010)
(5) F Ploumlssl M Giera and F Bracher J Chrom A 1135 19 (2006)
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 43
MEJORAR LA PRODUCTIVIDAD EN
HPLC ESTAacuteNDAR CON COLUMNAS
POROSHELL
Page 43
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 44
Columnas Poroshell 120 para HPLC y UHPLC
bull 80-90 de eficacia de las sub 2um
bull A presiones un ~40-50 maacutes bajas
bull Con un tamantildeo de partiacutecula de 27um
bull Con una frita de entrada de 2um
bull Con el doble de resolucioacuten de una
columna de 35um
bull Con un liacutemite de presioacuten de 600 bar
bull La partiacutecula tiene un nuacutecleo soacutelido
(17um) y una cubierta exterior porosa
de 05um como zona de difusioacuten
Las Columnas Poroshell 120 tienen
Page 44
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 45
Poroshell 120 proporciona Eficacia Suficiente
Page 45
Flujo 0582 mLmin AcetonitriloAgua (6040)
Volumen de Inyeccioacuten 4 microL
TCC 26 oC
DAD Sig=2544nm Ref=360100nm
Muestra Muestra de test RRLC
(PN 5188-6529) inoculada con
50 microL 2 mgmL Tiourea en
aguaacetonitrilo (6535)
25 5 75 10
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larr N = 25053 Presioacuten = 182 bar
Poroshell 120 EC-C18 30 x 100 mm 27 um
min 25 5 75 10 125
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82
18
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04
1
larr N = 27295 Presioacuten = 386 bar
Eclipse Plus C18 30 x 100 mm 18 um
gt90 de la Eficacia de una 18um
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 46
iquestEn queacute tipos de instrumentos puede usar
Columnas Poroshell 120 HPLCrsquos y UHPLCrsquos
Consideraciones en UHPLC
bull Las columnas Poroshell 120 tienen un liacutemite de presioacuten de 600 bar
bull Los UHPLC estaacuten ajustados para columnas de bajo volumen por lo tanto las
Poroshell pueden usarse en todos los UHPLC
Consideraciones en HPLC
bull Las Columnas Poroshell 120 trabajan bien por debajo de 400 bar
bull Minimize los volumenes extra columna para las columnas 21 y 30mm ID ndash
siga las instrucciones dadas para las columnas RRHT (18um 600 bar)
bull Use en el detector velocidades adecuadas de adquisicioacuten para picos
estrechos de alta eficacia
Page 46
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 47
Con una frita de 2 um Poroshell 120 no se bloquea
Muestras Complejas- Plasma
Diflusinal in Plasma
0
20
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80
100
120
140
160
180
200
220
240
260
280
300
320
340
360
380
400
1 501 1001 1501 2001 2501
Injections
Pre
ssu
re
0
20000
40000
60000
80000
100000
120000
140000
160000
180000
200000
Eff
icie
ncy (
N)
End Press
Plates
Columna Poroshell 120 EC-C18 30 x 50mm 27um LC Agilent 1200 RRLC (SL)
Muestra Plasma Precipitado 2 partes Plasma 7 Partes 2080 Agua-MeCN w01 Aacutecido Foacutermico con 1 Parte de Diflusinal en
5050 Agua-MeCN 10 ugml (Concentracion Final Diflusinal 1 ugml) Agitado y dejado reposar 10 minutos
No Centrifugado No Filtrado
Volumen de Inyeccioacuten 1ul
Solvente A Agua w01 TFA
Solvente B MeCN w008 TFA
Flujo 1 mlmin 1 ul inyeccioacuten
Tiempo B
0 20
05 90
06 90
11 20
25 20
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Diflusinal es un anti-inflamatorio no esteroidal anaacutelogo
a la aspirina desarrollado por Merck Sharp amp Dohme
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 48
Las Columnas Superficialmente Porosas Pueden
Usarse cumpliendo los Requirimientos USP
De la lista USP de empaquetamientos de columnas LC 42009
Page 48
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 49
Criterios de Ajuste de Meacutetodos USP y FDA Criterios de Ajuste de Meacutetodos de Dimensiones de Columna
Paraacutemetro Especificaciones Maacuteximas ComentariosEjemplos
Longitud de Columna 70 250mm 75mm
150mm 50mm
Diaacutemetro Interno de
Columna
25 (FDA ORA-LAB 545)
USP ndash 25 ID Columna puede ajustarse si la
velocidad lineal es constante
46 mm 30 mm (-35)
46 mm 21 mm (-54)
30 mm 21 mm (-30)
Flow Rate 50
Volumen de Inyeccioacuten
Reducir tanto como se necesitendash
debe cumplir los liacutemites de
deteccioacuten y precisioacuten
Si cambia a una columna maacutes
corta haga el cambio apropiado
en el volumen de inyeccioacuten
Tamantildeo de Partiacutecula Reducir hasta el 50
(no se puede aumentar)
Puede cambiar la longitud de columna y el
tamantildeo de partiacutecula para mantener la misma
Rs
5um 35um (-30)
5um 27um (-46) Cambiado en 22409 ndash Para la copia oficial y actual ir a
httpwwwfdagovScienceResearchFieldSciencedefaulthtm
USP 30 Second Supplement Revisions PF34(5) en proceso
Ver ldquo Stimuli articlerdquo en Pharmacopeial Forum 2009 35(6)
Page 49
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 50
Comparacioacuten de 46 x 250 mm 5 um con Poroshell
120 EC-C18 46 x 100 mm 27um
min 5 10 15 20 25 30
mAU
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20
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37
Anaacutelisis maacutes raacutepido(columna maacutes corta flujo maacutes alto)
Mayor sensibilidad(partiacutecula maacutes pequentildeapico maacutes estrecho)
Maacutes optimizado (un anaacutelisis maacutes raacutepido permite ajustar mejor)
Ambos anaacutelisis en Agilent 1100 G1315B DAD (bajo 400 bar)
No se requiere cambio en la preparacioacuten de muestra frita de entrada
de 2 micras en ambas columnas
325 bar
110 bar
Sulfadiazina
Sulfatiazol
Sulfapiridina
Sulfamerazina
Sulfametazina
Sulfametazol
Sulfametoxipiridazina
Sulfacloropiridazina
Sulfametoxazol
Sulfadimetoxina
Tiempo B
0 8
33 33
34 33
Columna Eclipse Plus C18
46 x 250mm 5um
Flujo 1 mLmin
Fase Moacutevil
A 01 Aacutecido Foacutermico en Agua
B 01 Aacutecido Foacutermico en ACN
Tiempo B
0 8
12 33
132 33
Columna 46 x 100mm
Poroshell 120 EC-C18
27um
Flujo 185 mLmin
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Comparacioacuten de 46 x 250 mm 5 um con Poroshell
120 EC-C18 46 x 100 mm 27um
min 5 10 15 20 25 30
mAU
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5
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min
Ver condiciones en diapositiva anterior
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Mejor Resolucioacuten
linea base
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Anaacutelisis maacutes raacutepido del meacutetodo USP para pastillas de
Simvastatina en Columnas Poroshell 120ndash Ajuste del meacutetodo
46 x 250 mm 5-um
Agilent ZORBAX Eclipse Plus C18
46 x 75 mm 27-um
Agilent Poroshell 120 EC-C18
65 CH3CN 35 39 gL NaH2PO4 (pH 45) 45 oC Sig = 238 8 Ref = 360 100 nm
Flujos 15 mLmin para la columna de 5-um 28 mLmin para la columna Poroshell 120 27um
Requerimiento
USP
5-um
(15 mLmin)
27-um
(28 mLmin)
TR na 9907 1457
krsquo gt 30 5962 5122
N gt 4500 16939 14439
Tf lt 20 109 110
min 2 4 6 8 10
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Ajustes de los parametros cromatograficos en la
transferencia de meacutetodos Escalado del volume de inyeccioacuten
v1 x [(r22 x L2)(r1
2 x L1)] = V2
O bien
v2 = V1 x [(d22 x L2)(d1
2 x L1)]
v volume de inyeccioacuten
r radio de la columna
L longitud de la columna
Ajuste del flujo
F2= F1 x (L2L1 ) x (r2r1 )2
L longitud de la columna
F Flujo
r radio de la columna
Ajuste de la longitud del gradiente
En funcioacuten de la longitud de la columna
L2L1= tg2tg1
En funcioacuten del volumen muerto de columna y del flujo
tG2= tG1 x (V2V1) x (F1F2) t tiempos de gradiente
V volumen muerto de columna
F flujo
Columna ID Volumen muerto aprox
por mm longitud
46mm 100uL
30mm 425uL
21mm 208uL
10mm 047uL
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 54
Notas de Aplicacioacuten en Poroshell 120 y QuEChERS
Determination of Hormones in Shrimp by Agilent 1290 Infinity LC with
Agilent Poroshell 120 LC Column and Agilent QuEChERS for Sample
Preparation (publication 5990-6589EN)
Analysis of Pesticide Residues in Green Tea Using Agilent SampliQ
QuEChERS EN Kit by LCMSMS Detection (publication 5990-
6400EN)
Analysis of Pesticide Residues in Rice Using Agilent Bond Elut
QuEChERS AOAC Kit (publication 5990-8034EN)
Poroshell 120 for pharmaceutical analysis
Poroshell 120 Resources
QuEChERS Applications
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 55
Sumario
bull La columna Poroshell 120 es una nueva alternativa para LC de Alta
Resolucioacuten y Alta Velocidad que puede usarse en cualquier HPLC o UHPLC
bull Con la Poroshell 120 se pueden lograr separaciones de alta eficacia a baja
presioacuten
bull Puede usarse con muestras sucias sin ver una elevacioacuten anormal de la
presioacuten
bull Puede usarse en un meacutetodo USP sin comprometer los Criterios de Ajustes de
Meacutetodo
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Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 56
Soporte Teacutecnico Agilent
Teleacutefono de Atencioacuten al Cliente
901 11 68 90
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3 x10
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2
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46
47
48
49
5
51
+ESI MRM Frag=1120V CID190 (2782000 -gt 1170000) HQC_6d
1 1
Counts vs Acquisition Time (min) 01 02 03 04 05 06 07 08 09 1 11 12 13 14 15 16 17 18 19 2 21 22 23 24 25 26 27 28 29 3 31 32 33 34 35 36 37 38 39 4 41 42 43 44 45 46
1 x10
415 42 425 43 435 44 445 45 455 46 465 47 475 48 485 49 495 5
505 51 515 52 525 53 535 54 545 55 555 56 565 57
+ESI MRM Frag=1120V CID190 (2871000 -gt 2409000) RE_L_1d 1
Counts vs Acquisition Time (min) 305 31 315 32 325 33 335 34 345 35 355 36 365 37 375 38 385 39 395 4 405 41 415 42 425 43 435 44 445 45 455 46 465 47 475
Relacioacuten sentildealruido para el Oxazepam y Lorazepam a
10 ngmL (10 ppb)
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La Naloxone muestra esta curva de linealidad de10-250 ngmL (ppb) con una R2
= 0991
Las curvas de calibracioacuten se generaron con la respuestra relativa (area pico
analitoarea pico IS) frente a la concentracioacuten relativa (concentracion de
analitoconcentracioacuten de IS)
Ejemplo de curva de linealidad para Naloxona extraido
con mini-QuEChERS
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Recuperacioacuten y Reproducibilidad
Compuesto 50 ngmL Spiked
Recuperacioacuten RSD
100 ngmL Spiked
Recuperacioacuten RSD
Lidocaine 987 157 100 118
Tramadol 105 30 104 82
Amitriptyline 104 21 104 82
Biperidene 97 45 99 82
Oxazepam 770 92 78 86
Lorazepam 819 68 818 86
Chlorpromazine 110 103 105 63
Diltiazem 881 27 917 83
Naloxone 806 90 755 77
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 41
Conclusioacutenes y trabajo posterior
El meacutetodo mini-QuEChERS para la extraccioacuten de compuestos farmaceacuteuticos en
sangre total ofrece una alternativa a otras teacutecnicas de preparacioacuten de muestras
La preparacioacuten de muestras mini-QuEChERS es un enfoque simple facil y
barato que requiere una miacutenima experiencia en preparacioacuten de muestras y
miacutenimo equipamiento
Es un punto de partida para ampliar el numero y las clasificaciones evaluadas
en otras matrices bioloacutegicas y en sangre postmortem
El trabajo futuro incluira combinaciones adecuadas tanto de las sales de
extraccioacuten como de los sorbentes de d-SPE por el meacutetodo mini-QuEChERS
La columna Poroshell 120 ofrece una selectividad diferente y excelentes formas
de pico a lo largo del amplio rango de compuestos farmaceacuteuticos usados en este
estudio
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 42
Referencias
(1) M Anastassiades SJ Lehotay D Štajnbaher and FJ Schenk J AOAC Int 86 4121 (2003)
(2) G Stubbings and T Bigwood Anal Chim Acta 637 68 (2009)
(3) RR Rasmussen IMLD Storm PZH Rasmussen J Smedsgaard and KF Nielsen Anal Bioanal Chem 397 765 (2010)
(4) D Smith and K Lynam GCμECD analysis and confirmation of PCBs in fish tissue with Agilent JampW DB-35ms and DB-XLB GC columns Agilent Technologies 5990-6236EN (2010)
(5) F Ploumlssl M Giera and F Bracher J Chrom A 1135 19 (2006)
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 43
MEJORAR LA PRODUCTIVIDAD EN
HPLC ESTAacuteNDAR CON COLUMNAS
POROSHELL
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Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 44
Columnas Poroshell 120 para HPLC y UHPLC
bull 80-90 de eficacia de las sub 2um
bull A presiones un ~40-50 maacutes bajas
bull Con un tamantildeo de partiacutecula de 27um
bull Con una frita de entrada de 2um
bull Con el doble de resolucioacuten de una
columna de 35um
bull Con un liacutemite de presioacuten de 600 bar
bull La partiacutecula tiene un nuacutecleo soacutelido
(17um) y una cubierta exterior porosa
de 05um como zona de difusioacuten
Las Columnas Poroshell 120 tienen
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Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 45
Poroshell 120 proporciona Eficacia Suficiente
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Flujo 0582 mLmin AcetonitriloAgua (6040)
Volumen de Inyeccioacuten 4 microL
TCC 26 oC
DAD Sig=2544nm Ref=360100nm
Muestra Muestra de test RRLC
(PN 5188-6529) inoculada con
50 microL 2 mgmL Tiourea en
aguaacetonitrilo (6535)
25 5 75 10
mAU
0
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larr N = 25053 Presioacuten = 182 bar
Poroshell 120 EC-C18 30 x 100 mm 27 um
min 25 5 75 10 125
mAU
0
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81
82
18
13
04
1
larr N = 27295 Presioacuten = 386 bar
Eclipse Plus C18 30 x 100 mm 18 um
gt90 de la Eficacia de una 18um
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 46
iquestEn queacute tipos de instrumentos puede usar
Columnas Poroshell 120 HPLCrsquos y UHPLCrsquos
Consideraciones en UHPLC
bull Las columnas Poroshell 120 tienen un liacutemite de presioacuten de 600 bar
bull Los UHPLC estaacuten ajustados para columnas de bajo volumen por lo tanto las
Poroshell pueden usarse en todos los UHPLC
Consideraciones en HPLC
bull Las Columnas Poroshell 120 trabajan bien por debajo de 400 bar
bull Minimize los volumenes extra columna para las columnas 21 y 30mm ID ndash
siga las instrucciones dadas para las columnas RRHT (18um 600 bar)
bull Use en el detector velocidades adecuadas de adquisicioacuten para picos
estrechos de alta eficacia
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Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 47
Con una frita de 2 um Poroshell 120 no se bloquea
Muestras Complejas- Plasma
Diflusinal in Plasma
0
20
40
60
80
100
120
140
160
180
200
220
240
260
280
300
320
340
360
380
400
1 501 1001 1501 2001 2501
Injections
Pre
ssu
re
0
20000
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60000
80000
100000
120000
140000
160000
180000
200000
Eff
icie
ncy (
N)
End Press
Plates
Columna Poroshell 120 EC-C18 30 x 50mm 27um LC Agilent 1200 RRLC (SL)
Muestra Plasma Precipitado 2 partes Plasma 7 Partes 2080 Agua-MeCN w01 Aacutecido Foacutermico con 1 Parte de Diflusinal en
5050 Agua-MeCN 10 ugml (Concentracion Final Diflusinal 1 ugml) Agitado y dejado reposar 10 minutos
No Centrifugado No Filtrado
Volumen de Inyeccioacuten 1ul
Solvente A Agua w01 TFA
Solvente B MeCN w008 TFA
Flujo 1 mlmin 1 ul inyeccioacuten
Tiempo B
0 20
05 90
06 90
11 20
25 20
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Diflusinal es un anti-inflamatorio no esteroidal anaacutelogo
a la aspirina desarrollado por Merck Sharp amp Dohme
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 48
Las Columnas Superficialmente Porosas Pueden
Usarse cumpliendo los Requirimientos USP
De la lista USP de empaquetamientos de columnas LC 42009
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Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 49
Criterios de Ajuste de Meacutetodos USP y FDA Criterios de Ajuste de Meacutetodos de Dimensiones de Columna
Paraacutemetro Especificaciones Maacuteximas ComentariosEjemplos
Longitud de Columna 70 250mm 75mm
150mm 50mm
Diaacutemetro Interno de
Columna
25 (FDA ORA-LAB 545)
USP ndash 25 ID Columna puede ajustarse si la
velocidad lineal es constante
46 mm 30 mm (-35)
46 mm 21 mm (-54)
30 mm 21 mm (-30)
Flow Rate 50
Volumen de Inyeccioacuten
Reducir tanto como se necesitendash
debe cumplir los liacutemites de
deteccioacuten y precisioacuten
Si cambia a una columna maacutes
corta haga el cambio apropiado
en el volumen de inyeccioacuten
Tamantildeo de Partiacutecula Reducir hasta el 50
(no se puede aumentar)
Puede cambiar la longitud de columna y el
tamantildeo de partiacutecula para mantener la misma
Rs
5um 35um (-30)
5um 27um (-46) Cambiado en 22409 ndash Para la copia oficial y actual ir a
httpwwwfdagovScienceResearchFieldSciencedefaulthtm
USP 30 Second Supplement Revisions PF34(5) en proceso
Ver ldquo Stimuli articlerdquo en Pharmacopeial Forum 2009 35(6)
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Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 50
Comparacioacuten de 46 x 250 mm 5 um con Poroshell
120 EC-C18 46 x 100 mm 27um
min 5 10 15 20 25 30
mAU
0
20
40
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97
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min 5 10 15 20 25 30
mAU
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100
150
200
250
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06
38
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44
37 45
58
54
50
59
20
70
37
Anaacutelisis maacutes raacutepido(columna maacutes corta flujo maacutes alto)
Mayor sensibilidad(partiacutecula maacutes pequentildeapico maacutes estrecho)
Maacutes optimizado (un anaacutelisis maacutes raacutepido permite ajustar mejor)
Ambos anaacutelisis en Agilent 1100 G1315B DAD (bajo 400 bar)
No se requiere cambio en la preparacioacuten de muestra frita de entrada
de 2 micras en ambas columnas
325 bar
110 bar
Sulfadiazina
Sulfatiazol
Sulfapiridina
Sulfamerazina
Sulfametazina
Sulfametazol
Sulfametoxipiridazina
Sulfacloropiridazina
Sulfametoxazol
Sulfadimetoxina
Tiempo B
0 8
33 33
34 33
Columna Eclipse Plus C18
46 x 250mm 5um
Flujo 1 mLmin
Fase Moacutevil
A 01 Aacutecido Foacutermico en Agua
B 01 Aacutecido Foacutermico en ACN
Tiempo B
0 8
12 33
132 33
Columna 46 x 100mm
Poroshell 120 EC-C18
27um
Flujo 185 mLmin
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Comparacioacuten de 46 x 250 mm 5 um con Poroshell
120 EC-C18 46 x 100 mm 27um
min 5 10 15 20 25 30
mAU
0
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5
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20
70
37
325 bar
min
Ver condiciones en diapositiva anterior
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Mejor Resolucioacuten
linea base
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 52
Anaacutelisis maacutes raacutepido del meacutetodo USP para pastillas de
Simvastatina en Columnas Poroshell 120ndash Ajuste del meacutetodo
46 x 250 mm 5-um
Agilent ZORBAX Eclipse Plus C18
46 x 75 mm 27-um
Agilent Poroshell 120 EC-C18
65 CH3CN 35 39 gL NaH2PO4 (pH 45) 45 oC Sig = 238 8 Ref = 360 100 nm
Flujos 15 mLmin para la columna de 5-um 28 mLmin para la columna Poroshell 120 27um
Requerimiento
USP
5-um
(15 mLmin)
27-um
(28 mLmin)
TR na 9907 1457
krsquo gt 30 5962 5122
N gt 4500 16939 14439
Tf lt 20 109 110
min 2 4 6 8 10
mAU
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min 2
mAU
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Ajustes de los parametros cromatograficos en la
transferencia de meacutetodos Escalado del volume de inyeccioacuten
v1 x [(r22 x L2)(r1
2 x L1)] = V2
O bien
v2 = V1 x [(d22 x L2)(d1
2 x L1)]
v volume de inyeccioacuten
r radio de la columna
L longitud de la columna
Ajuste del flujo
F2= F1 x (L2L1 ) x (r2r1 )2
L longitud de la columna
F Flujo
r radio de la columna
Ajuste de la longitud del gradiente
En funcioacuten de la longitud de la columna
L2L1= tg2tg1
En funcioacuten del volumen muerto de columna y del flujo
tG2= tG1 x (V2V1) x (F1F2) t tiempos de gradiente
V volumen muerto de columna
F flujo
Columna ID Volumen muerto aprox
por mm longitud
46mm 100uL
30mm 425uL
21mm 208uL
10mm 047uL
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 54
Notas de Aplicacioacuten en Poroshell 120 y QuEChERS
Determination of Hormones in Shrimp by Agilent 1290 Infinity LC with
Agilent Poroshell 120 LC Column and Agilent QuEChERS for Sample
Preparation (publication 5990-6589EN)
Analysis of Pesticide Residues in Green Tea Using Agilent SampliQ
QuEChERS EN Kit by LCMSMS Detection (publication 5990-
6400EN)
Analysis of Pesticide Residues in Rice Using Agilent Bond Elut
QuEChERS AOAC Kit (publication 5990-8034EN)
Poroshell 120 for pharmaceutical analysis
Poroshell 120 Resources
QuEChERS Applications
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 55
Sumario
bull La columna Poroshell 120 es una nueva alternativa para LC de Alta
Resolucioacuten y Alta Velocidad que puede usarse en cualquier HPLC o UHPLC
bull Con la Poroshell 120 se pueden lograr separaciones de alta eficacia a baja
presioacuten
bull Puede usarse con muestras sucias sin ver una elevacioacuten anormal de la
presioacuten
bull Puede usarse en un meacutetodo USP sin comprometer los Criterios de Ajustes de
Meacutetodo
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Soporte Teacutecnico Agilent
Teleacutefono de Atencioacuten al Cliente
901 11 68 90
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La Naloxone muestra esta curva de linealidad de10-250 ngmL (ppb) con una R2
= 0991
Las curvas de calibracioacuten se generaron con la respuestra relativa (area pico
analitoarea pico IS) frente a la concentracioacuten relativa (concentracion de
analitoconcentracioacuten de IS)
Ejemplo de curva de linealidad para Naloxona extraido
con mini-QuEChERS
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Recuperacioacuten y Reproducibilidad
Compuesto 50 ngmL Spiked
Recuperacioacuten RSD
100 ngmL Spiked
Recuperacioacuten RSD
Lidocaine 987 157 100 118
Tramadol 105 30 104 82
Amitriptyline 104 21 104 82
Biperidene 97 45 99 82
Oxazepam 770 92 78 86
Lorazepam 819 68 818 86
Chlorpromazine 110 103 105 63
Diltiazem 881 27 917 83
Naloxone 806 90 755 77
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Conclusioacutenes y trabajo posterior
El meacutetodo mini-QuEChERS para la extraccioacuten de compuestos farmaceacuteuticos en
sangre total ofrece una alternativa a otras teacutecnicas de preparacioacuten de muestras
La preparacioacuten de muestras mini-QuEChERS es un enfoque simple facil y
barato que requiere una miacutenima experiencia en preparacioacuten de muestras y
miacutenimo equipamiento
Es un punto de partida para ampliar el numero y las clasificaciones evaluadas
en otras matrices bioloacutegicas y en sangre postmortem
El trabajo futuro incluira combinaciones adecuadas tanto de las sales de
extraccioacuten como de los sorbentes de d-SPE por el meacutetodo mini-QuEChERS
La columna Poroshell 120 ofrece una selectividad diferente y excelentes formas
de pico a lo largo del amplio rango de compuestos farmaceacuteuticos usados en este
estudio
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Referencias
(1) M Anastassiades SJ Lehotay D Štajnbaher and FJ Schenk J AOAC Int 86 4121 (2003)
(2) G Stubbings and T Bigwood Anal Chim Acta 637 68 (2009)
(3) RR Rasmussen IMLD Storm PZH Rasmussen J Smedsgaard and KF Nielsen Anal Bioanal Chem 397 765 (2010)
(4) D Smith and K Lynam GCμECD analysis and confirmation of PCBs in fish tissue with Agilent JampW DB-35ms and DB-XLB GC columns Agilent Technologies 5990-6236EN (2010)
(5) F Ploumlssl M Giera and F Bracher J Chrom A 1135 19 (2006)
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MEJORAR LA PRODUCTIVIDAD EN
HPLC ESTAacuteNDAR CON COLUMNAS
POROSHELL
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Columnas Poroshell 120 para HPLC y UHPLC
bull 80-90 de eficacia de las sub 2um
bull A presiones un ~40-50 maacutes bajas
bull Con un tamantildeo de partiacutecula de 27um
bull Con una frita de entrada de 2um
bull Con el doble de resolucioacuten de una
columna de 35um
bull Con un liacutemite de presioacuten de 600 bar
bull La partiacutecula tiene un nuacutecleo soacutelido
(17um) y una cubierta exterior porosa
de 05um como zona de difusioacuten
Las Columnas Poroshell 120 tienen
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Poroshell 120 proporciona Eficacia Suficiente
Page 45
Flujo 0582 mLmin AcetonitriloAgua (6040)
Volumen de Inyeccioacuten 4 microL
TCC 26 oC
DAD Sig=2544nm Ref=360100nm
Muestra Muestra de test RRLC
(PN 5188-6529) inoculada con
50 microL 2 mgmL Tiourea en
aguaacetonitrilo (6535)
25 5 75 10
mAU
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larr N = 25053 Presioacuten = 182 bar
Poroshell 120 EC-C18 30 x 100 mm 27 um
min 25 5 75 10 125
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larr N = 27295 Presioacuten = 386 bar
Eclipse Plus C18 30 x 100 mm 18 um
gt90 de la Eficacia de una 18um
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 46
iquestEn queacute tipos de instrumentos puede usar
Columnas Poroshell 120 HPLCrsquos y UHPLCrsquos
Consideraciones en UHPLC
bull Las columnas Poroshell 120 tienen un liacutemite de presioacuten de 600 bar
bull Los UHPLC estaacuten ajustados para columnas de bajo volumen por lo tanto las
Poroshell pueden usarse en todos los UHPLC
Consideraciones en HPLC
bull Las Columnas Poroshell 120 trabajan bien por debajo de 400 bar
bull Minimize los volumenes extra columna para las columnas 21 y 30mm ID ndash
siga las instrucciones dadas para las columnas RRHT (18um 600 bar)
bull Use en el detector velocidades adecuadas de adquisicioacuten para picos
estrechos de alta eficacia
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Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 47
Con una frita de 2 um Poroshell 120 no se bloquea
Muestras Complejas- Plasma
Diflusinal in Plasma
0
20
40
60
80
100
120
140
160
180
200
220
240
260
280
300
320
340
360
380
400
1 501 1001 1501 2001 2501
Injections
Pre
ssu
re
0
20000
40000
60000
80000
100000
120000
140000
160000
180000
200000
Eff
icie
ncy (
N)
End Press
Plates
Columna Poroshell 120 EC-C18 30 x 50mm 27um LC Agilent 1200 RRLC (SL)
Muestra Plasma Precipitado 2 partes Plasma 7 Partes 2080 Agua-MeCN w01 Aacutecido Foacutermico con 1 Parte de Diflusinal en
5050 Agua-MeCN 10 ugml (Concentracion Final Diflusinal 1 ugml) Agitado y dejado reposar 10 minutos
No Centrifugado No Filtrado
Volumen de Inyeccioacuten 1ul
Solvente A Agua w01 TFA
Solvente B MeCN w008 TFA
Flujo 1 mlmin 1 ul inyeccioacuten
Tiempo B
0 20
05 90
06 90
11 20
25 20
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Diflusinal es un anti-inflamatorio no esteroidal anaacutelogo
a la aspirina desarrollado por Merck Sharp amp Dohme
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 48
Las Columnas Superficialmente Porosas Pueden
Usarse cumpliendo los Requirimientos USP
De la lista USP de empaquetamientos de columnas LC 42009
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Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 49
Criterios de Ajuste de Meacutetodos USP y FDA Criterios de Ajuste de Meacutetodos de Dimensiones de Columna
Paraacutemetro Especificaciones Maacuteximas ComentariosEjemplos
Longitud de Columna 70 250mm 75mm
150mm 50mm
Diaacutemetro Interno de
Columna
25 (FDA ORA-LAB 545)
USP ndash 25 ID Columna puede ajustarse si la
velocidad lineal es constante
46 mm 30 mm (-35)
46 mm 21 mm (-54)
30 mm 21 mm (-30)
Flow Rate 50
Volumen de Inyeccioacuten
Reducir tanto como se necesitendash
debe cumplir los liacutemites de
deteccioacuten y precisioacuten
Si cambia a una columna maacutes
corta haga el cambio apropiado
en el volumen de inyeccioacuten
Tamantildeo de Partiacutecula Reducir hasta el 50
(no se puede aumentar)
Puede cambiar la longitud de columna y el
tamantildeo de partiacutecula para mantener la misma
Rs
5um 35um (-30)
5um 27um (-46) Cambiado en 22409 ndash Para la copia oficial y actual ir a
httpwwwfdagovScienceResearchFieldSciencedefaulthtm
USP 30 Second Supplement Revisions PF34(5) en proceso
Ver ldquo Stimuli articlerdquo en Pharmacopeial Forum 2009 35(6)
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Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 50
Comparacioacuten de 46 x 250 mm 5 um con Poroshell
120 EC-C18 46 x 100 mm 27um
min 5 10 15 20 25 30
mAU
0
20
40
60
80
100
97
12
111
16
115
96
126
74
152
48
161
51
164
35
206
87
230
76
292
90
min 5 10 15 20 25 30
mAU
0
50
100
150
200
250
17
19
21
89
23
11
26
06
38
67
44
37 45
58
54
50
59
20
70
37
Anaacutelisis maacutes raacutepido(columna maacutes corta flujo maacutes alto)
Mayor sensibilidad(partiacutecula maacutes pequentildeapico maacutes estrecho)
Maacutes optimizado (un anaacutelisis maacutes raacutepido permite ajustar mejor)
Ambos anaacutelisis en Agilent 1100 G1315B DAD (bajo 400 bar)
No se requiere cambio en la preparacioacuten de muestra frita de entrada
de 2 micras en ambas columnas
325 bar
110 bar
Sulfadiazina
Sulfatiazol
Sulfapiridina
Sulfamerazina
Sulfametazina
Sulfametazol
Sulfametoxipiridazina
Sulfacloropiridazina
Sulfametoxazol
Sulfadimetoxina
Tiempo B
0 8
33 33
34 33
Columna Eclipse Plus C18
46 x 250mm 5um
Flujo 1 mLmin
Fase Moacutevil
A 01 Aacutecido Foacutermico en Agua
B 01 Aacutecido Foacutermico en ACN
Tiempo B
0 8
12 33
132 33
Columna 46 x 100mm
Poroshell 120 EC-C18
27um
Flujo 185 mLmin
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Comparacioacuten de 46 x 250 mm 5 um con Poroshell
120 EC-C18 46 x 100 mm 27um
min 5 10 15 20 25 30
mAU
0
20
40
60
80
100
97
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16
115
96
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152
48
161
51
164
35
206
87
230
76
292
90
110 bar
5
mAU
0
50
100
150
200
250
17
19
21
89
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06
38
67
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37 45
58
54
50
59
20
70
37
325 bar
min
Ver condiciones en diapositiva anterior
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Mejor Resolucioacuten
linea base
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Anaacutelisis maacutes raacutepido del meacutetodo USP para pastillas de
Simvastatina en Columnas Poroshell 120ndash Ajuste del meacutetodo
46 x 250 mm 5-um
Agilent ZORBAX Eclipse Plus C18
46 x 75 mm 27-um
Agilent Poroshell 120 EC-C18
65 CH3CN 35 39 gL NaH2PO4 (pH 45) 45 oC Sig = 238 8 Ref = 360 100 nm
Flujos 15 mLmin para la columna de 5-um 28 mLmin para la columna Poroshell 120 27um
Requerimiento
USP
5-um
(15 mLmin)
27-um
(28 mLmin)
TR na 9907 1457
krsquo gt 30 5962 5122
N gt 4500 16939 14439
Tf lt 20 109 110
min 2 4 6 8 10
mAU
0
5
10
15
20
25
30
35
40
min 2
mAU
0
5
10
15
20
25
30
35
40
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 53
Ajustes de los parametros cromatograficos en la
transferencia de meacutetodos Escalado del volume de inyeccioacuten
v1 x [(r22 x L2)(r1
2 x L1)] = V2
O bien
v2 = V1 x [(d22 x L2)(d1
2 x L1)]
v volume de inyeccioacuten
r radio de la columna
L longitud de la columna
Ajuste del flujo
F2= F1 x (L2L1 ) x (r2r1 )2
L longitud de la columna
F Flujo
r radio de la columna
Ajuste de la longitud del gradiente
En funcioacuten de la longitud de la columna
L2L1= tg2tg1
En funcioacuten del volumen muerto de columna y del flujo
tG2= tG1 x (V2V1) x (F1F2) t tiempos de gradiente
V volumen muerto de columna
F flujo
Columna ID Volumen muerto aprox
por mm longitud
46mm 100uL
30mm 425uL
21mm 208uL
10mm 047uL
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 54
Notas de Aplicacioacuten en Poroshell 120 y QuEChERS
Determination of Hormones in Shrimp by Agilent 1290 Infinity LC with
Agilent Poroshell 120 LC Column and Agilent QuEChERS for Sample
Preparation (publication 5990-6589EN)
Analysis of Pesticide Residues in Green Tea Using Agilent SampliQ
QuEChERS EN Kit by LCMSMS Detection (publication 5990-
6400EN)
Analysis of Pesticide Residues in Rice Using Agilent Bond Elut
QuEChERS AOAC Kit (publication 5990-8034EN)
Poroshell 120 for pharmaceutical analysis
Poroshell 120 Resources
QuEChERS Applications
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 55
Sumario
bull La columna Poroshell 120 es una nueva alternativa para LC de Alta
Resolucioacuten y Alta Velocidad que puede usarse en cualquier HPLC o UHPLC
bull Con la Poroshell 120 se pueden lograr separaciones de alta eficacia a baja
presioacuten
bull Puede usarse con muestras sucias sin ver una elevacioacuten anormal de la
presioacuten
bull Puede usarse en un meacutetodo USP sin comprometer los Criterios de Ajustes de
Meacutetodo
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Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 56
Soporte Teacutecnico Agilent
Teleacutefono de Atencioacuten al Cliente
901 11 68 90
email customercare_spainagilentcom
wwwagilentcomchem
![Page 40: Análisis de compuestos farmacéuticos en sangre total · PDF fileReducción en el procesamiento, el envío de la muestra, y los ... Gas flow: 10 L/min Nebulizer: 10 psi Sheath gas](https://reader031.vdocuments.site/reader031/viewer/2022030405/5a7a81727f8b9a0a668b45aa/html5/thumbnails/40.jpg)
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 40
Recuperacioacuten y Reproducibilidad
Compuesto 50 ngmL Spiked
Recuperacioacuten RSD
100 ngmL Spiked
Recuperacioacuten RSD
Lidocaine 987 157 100 118
Tramadol 105 30 104 82
Amitriptyline 104 21 104 82
Biperidene 97 45 99 82
Oxazepam 770 92 78 86
Lorazepam 819 68 818 86
Chlorpromazine 110 103 105 63
Diltiazem 881 27 917 83
Naloxone 806 90 755 77
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 41
Conclusioacutenes y trabajo posterior
El meacutetodo mini-QuEChERS para la extraccioacuten de compuestos farmaceacuteuticos en
sangre total ofrece una alternativa a otras teacutecnicas de preparacioacuten de muestras
La preparacioacuten de muestras mini-QuEChERS es un enfoque simple facil y
barato que requiere una miacutenima experiencia en preparacioacuten de muestras y
miacutenimo equipamiento
Es un punto de partida para ampliar el numero y las clasificaciones evaluadas
en otras matrices bioloacutegicas y en sangre postmortem
El trabajo futuro incluira combinaciones adecuadas tanto de las sales de
extraccioacuten como de los sorbentes de d-SPE por el meacutetodo mini-QuEChERS
La columna Poroshell 120 ofrece una selectividad diferente y excelentes formas
de pico a lo largo del amplio rango de compuestos farmaceacuteuticos usados en este
estudio
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 42
Referencias
(1) M Anastassiades SJ Lehotay D Štajnbaher and FJ Schenk J AOAC Int 86 4121 (2003)
(2) G Stubbings and T Bigwood Anal Chim Acta 637 68 (2009)
(3) RR Rasmussen IMLD Storm PZH Rasmussen J Smedsgaard and KF Nielsen Anal Bioanal Chem 397 765 (2010)
(4) D Smith and K Lynam GCμECD analysis and confirmation of PCBs in fish tissue with Agilent JampW DB-35ms and DB-XLB GC columns Agilent Technologies 5990-6236EN (2010)
(5) F Ploumlssl M Giera and F Bracher J Chrom A 1135 19 (2006)
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 43
MEJORAR LA PRODUCTIVIDAD EN
HPLC ESTAacuteNDAR CON COLUMNAS
POROSHELL
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Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 44
Columnas Poroshell 120 para HPLC y UHPLC
bull 80-90 de eficacia de las sub 2um
bull A presiones un ~40-50 maacutes bajas
bull Con un tamantildeo de partiacutecula de 27um
bull Con una frita de entrada de 2um
bull Con el doble de resolucioacuten de una
columna de 35um
bull Con un liacutemite de presioacuten de 600 bar
bull La partiacutecula tiene un nuacutecleo soacutelido
(17um) y una cubierta exterior porosa
de 05um como zona de difusioacuten
Las Columnas Poroshell 120 tienen
Page 44
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 45
Poroshell 120 proporciona Eficacia Suficiente
Page 45
Flujo 0582 mLmin AcetonitriloAgua (6040)
Volumen de Inyeccioacuten 4 microL
TCC 26 oC
DAD Sig=2544nm Ref=360100nm
Muestra Muestra de test RRLC
(PN 5188-6529) inoculada con
50 microL 2 mgmL Tiourea en
aguaacetonitrilo (6535)
25 5 75 10
mAU
0
200
400
600
06
46
0
82
6
11
48
15
18
20
16
2
22
3
28
16
41
32
62
73
97
53
larr N = 25053 Presioacuten = 182 bar
Poroshell 120 EC-C18 30 x 100 mm 27 um
min 25 5 75 10 125
mAU
0
200
400
600
06
49
0
86
5
12
75
17
56
24
18
27
05
34
94
52
81
82
18
13
04
1
larr N = 27295 Presioacuten = 386 bar
Eclipse Plus C18 30 x 100 mm 18 um
gt90 de la Eficacia de una 18um
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 46
iquestEn queacute tipos de instrumentos puede usar
Columnas Poroshell 120 HPLCrsquos y UHPLCrsquos
Consideraciones en UHPLC
bull Las columnas Poroshell 120 tienen un liacutemite de presioacuten de 600 bar
bull Los UHPLC estaacuten ajustados para columnas de bajo volumen por lo tanto las
Poroshell pueden usarse en todos los UHPLC
Consideraciones en HPLC
bull Las Columnas Poroshell 120 trabajan bien por debajo de 400 bar
bull Minimize los volumenes extra columna para las columnas 21 y 30mm ID ndash
siga las instrucciones dadas para las columnas RRHT (18um 600 bar)
bull Use en el detector velocidades adecuadas de adquisicioacuten para picos
estrechos de alta eficacia
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Con una frita de 2 um Poroshell 120 no se bloquea
Muestras Complejas- Plasma
Diflusinal in Plasma
0
20
40
60
80
100
120
140
160
180
200
220
240
260
280
300
320
340
360
380
400
1 501 1001 1501 2001 2501
Injections
Pre
ssu
re
0
20000
40000
60000
80000
100000
120000
140000
160000
180000
200000
Eff
icie
ncy (
N)
End Press
Plates
Columna Poroshell 120 EC-C18 30 x 50mm 27um LC Agilent 1200 RRLC (SL)
Muestra Plasma Precipitado 2 partes Plasma 7 Partes 2080 Agua-MeCN w01 Aacutecido Foacutermico con 1 Parte de Diflusinal en
5050 Agua-MeCN 10 ugml (Concentracion Final Diflusinal 1 ugml) Agitado y dejado reposar 10 minutos
No Centrifugado No Filtrado
Volumen de Inyeccioacuten 1ul
Solvente A Agua w01 TFA
Solvente B MeCN w008 TFA
Flujo 1 mlmin 1 ul inyeccioacuten
Tiempo B
0 20
05 90
06 90
11 20
25 20
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Diflusinal es un anti-inflamatorio no esteroidal anaacutelogo
a la aspirina desarrollado por Merck Sharp amp Dohme
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 48
Las Columnas Superficialmente Porosas Pueden
Usarse cumpliendo los Requirimientos USP
De la lista USP de empaquetamientos de columnas LC 42009
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Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 49
Criterios de Ajuste de Meacutetodos USP y FDA Criterios de Ajuste de Meacutetodos de Dimensiones de Columna
Paraacutemetro Especificaciones Maacuteximas ComentariosEjemplos
Longitud de Columna 70 250mm 75mm
150mm 50mm
Diaacutemetro Interno de
Columna
25 (FDA ORA-LAB 545)
USP ndash 25 ID Columna puede ajustarse si la
velocidad lineal es constante
46 mm 30 mm (-35)
46 mm 21 mm (-54)
30 mm 21 mm (-30)
Flow Rate 50
Volumen de Inyeccioacuten
Reducir tanto como se necesitendash
debe cumplir los liacutemites de
deteccioacuten y precisioacuten
Si cambia a una columna maacutes
corta haga el cambio apropiado
en el volumen de inyeccioacuten
Tamantildeo de Partiacutecula Reducir hasta el 50
(no se puede aumentar)
Puede cambiar la longitud de columna y el
tamantildeo de partiacutecula para mantener la misma
Rs
5um 35um (-30)
5um 27um (-46) Cambiado en 22409 ndash Para la copia oficial y actual ir a
httpwwwfdagovScienceResearchFieldSciencedefaulthtm
USP 30 Second Supplement Revisions PF34(5) en proceso
Ver ldquo Stimuli articlerdquo en Pharmacopeial Forum 2009 35(6)
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Comparacioacuten de 46 x 250 mm 5 um con Poroshell
120 EC-C18 46 x 100 mm 27um
min 5 10 15 20 25 30
mAU
0
20
40
60
80
100
97
12
111
16
115
96
126
74
152
48
161
51
164
35
206
87
230
76
292
90
min 5 10 15 20 25 30
mAU
0
50
100
150
200
250
17
19
21
89
23
11
26
06
38
67
44
37 45
58
54
50
59
20
70
37
Anaacutelisis maacutes raacutepido(columna maacutes corta flujo maacutes alto)
Mayor sensibilidad(partiacutecula maacutes pequentildeapico maacutes estrecho)
Maacutes optimizado (un anaacutelisis maacutes raacutepido permite ajustar mejor)
Ambos anaacutelisis en Agilent 1100 G1315B DAD (bajo 400 bar)
No se requiere cambio en la preparacioacuten de muestra frita de entrada
de 2 micras en ambas columnas
325 bar
110 bar
Sulfadiazina
Sulfatiazol
Sulfapiridina
Sulfamerazina
Sulfametazina
Sulfametazol
Sulfametoxipiridazina
Sulfacloropiridazina
Sulfametoxazol
Sulfadimetoxina
Tiempo B
0 8
33 33
34 33
Columna Eclipse Plus C18
46 x 250mm 5um
Flujo 1 mLmin
Fase Moacutevil
A 01 Aacutecido Foacutermico en Agua
B 01 Aacutecido Foacutermico en ACN
Tiempo B
0 8
12 33
132 33
Columna 46 x 100mm
Poroshell 120 EC-C18
27um
Flujo 185 mLmin
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Comparacioacuten de 46 x 250 mm 5 um con Poroshell
120 EC-C18 46 x 100 mm 27um
min 5 10 15 20 25 30
mAU
0
20
40
60
80
100
97
12
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90
110 bar
5
mAU
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06
38
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37 45
58
54
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37
325 bar
min
Ver condiciones en diapositiva anterior
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Mejor Resolucioacuten
linea base
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Anaacutelisis maacutes raacutepido del meacutetodo USP para pastillas de
Simvastatina en Columnas Poroshell 120ndash Ajuste del meacutetodo
46 x 250 mm 5-um
Agilent ZORBAX Eclipse Plus C18
46 x 75 mm 27-um
Agilent Poroshell 120 EC-C18
65 CH3CN 35 39 gL NaH2PO4 (pH 45) 45 oC Sig = 238 8 Ref = 360 100 nm
Flujos 15 mLmin para la columna de 5-um 28 mLmin para la columna Poroshell 120 27um
Requerimiento
USP
5-um
(15 mLmin)
27-um
(28 mLmin)
TR na 9907 1457
krsquo gt 30 5962 5122
N gt 4500 16939 14439
Tf lt 20 109 110
min 2 4 6 8 10
mAU
0
5
10
15
20
25
30
35
40
min 2
mAU
0
5
10
15
20
25
30
35
40
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Ajustes de los parametros cromatograficos en la
transferencia de meacutetodos Escalado del volume de inyeccioacuten
v1 x [(r22 x L2)(r1
2 x L1)] = V2
O bien
v2 = V1 x [(d22 x L2)(d1
2 x L1)]
v volume de inyeccioacuten
r radio de la columna
L longitud de la columna
Ajuste del flujo
F2= F1 x (L2L1 ) x (r2r1 )2
L longitud de la columna
F Flujo
r radio de la columna
Ajuste de la longitud del gradiente
En funcioacuten de la longitud de la columna
L2L1= tg2tg1
En funcioacuten del volumen muerto de columna y del flujo
tG2= tG1 x (V2V1) x (F1F2) t tiempos de gradiente
V volumen muerto de columna
F flujo
Columna ID Volumen muerto aprox
por mm longitud
46mm 100uL
30mm 425uL
21mm 208uL
10mm 047uL
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 54
Notas de Aplicacioacuten en Poroshell 120 y QuEChERS
Determination of Hormones in Shrimp by Agilent 1290 Infinity LC with
Agilent Poroshell 120 LC Column and Agilent QuEChERS for Sample
Preparation (publication 5990-6589EN)
Analysis of Pesticide Residues in Green Tea Using Agilent SampliQ
QuEChERS EN Kit by LCMSMS Detection (publication 5990-
6400EN)
Analysis of Pesticide Residues in Rice Using Agilent Bond Elut
QuEChERS AOAC Kit (publication 5990-8034EN)
Poroshell 120 for pharmaceutical analysis
Poroshell 120 Resources
QuEChERS Applications
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 55
Sumario
bull La columna Poroshell 120 es una nueva alternativa para LC de Alta
Resolucioacuten y Alta Velocidad que puede usarse en cualquier HPLC o UHPLC
bull Con la Poroshell 120 se pueden lograr separaciones de alta eficacia a baja
presioacuten
bull Puede usarse con muestras sucias sin ver una elevacioacuten anormal de la
presioacuten
bull Puede usarse en un meacutetodo USP sin comprometer los Criterios de Ajustes de
Meacutetodo
Page 55
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 56
Soporte Teacutecnico Agilent
Teleacutefono de Atencioacuten al Cliente
901 11 68 90
email customercare_spainagilentcom
wwwagilentcomchem
![Page 41: Análisis de compuestos farmacéuticos en sangre total · PDF fileReducción en el procesamiento, el envío de la muestra, y los ... Gas flow: 10 L/min Nebulizer: 10 psi Sheath gas](https://reader031.vdocuments.site/reader031/viewer/2022030405/5a7a81727f8b9a0a668b45aa/html5/thumbnails/41.jpg)
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 41
Conclusioacutenes y trabajo posterior
El meacutetodo mini-QuEChERS para la extraccioacuten de compuestos farmaceacuteuticos en
sangre total ofrece una alternativa a otras teacutecnicas de preparacioacuten de muestras
La preparacioacuten de muestras mini-QuEChERS es un enfoque simple facil y
barato que requiere una miacutenima experiencia en preparacioacuten de muestras y
miacutenimo equipamiento
Es un punto de partida para ampliar el numero y las clasificaciones evaluadas
en otras matrices bioloacutegicas y en sangre postmortem
El trabajo futuro incluira combinaciones adecuadas tanto de las sales de
extraccioacuten como de los sorbentes de d-SPE por el meacutetodo mini-QuEChERS
La columna Poroshell 120 ofrece una selectividad diferente y excelentes formas
de pico a lo largo del amplio rango de compuestos farmaceacuteuticos usados en este
estudio
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 42
Referencias
(1) M Anastassiades SJ Lehotay D Štajnbaher and FJ Schenk J AOAC Int 86 4121 (2003)
(2) G Stubbings and T Bigwood Anal Chim Acta 637 68 (2009)
(3) RR Rasmussen IMLD Storm PZH Rasmussen J Smedsgaard and KF Nielsen Anal Bioanal Chem 397 765 (2010)
(4) D Smith and K Lynam GCμECD analysis and confirmation of PCBs in fish tissue with Agilent JampW DB-35ms and DB-XLB GC columns Agilent Technologies 5990-6236EN (2010)
(5) F Ploumlssl M Giera and F Bracher J Chrom A 1135 19 (2006)
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 43
MEJORAR LA PRODUCTIVIDAD EN
HPLC ESTAacuteNDAR CON COLUMNAS
POROSHELL
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Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 44
Columnas Poroshell 120 para HPLC y UHPLC
bull 80-90 de eficacia de las sub 2um
bull A presiones un ~40-50 maacutes bajas
bull Con un tamantildeo de partiacutecula de 27um
bull Con una frita de entrada de 2um
bull Con el doble de resolucioacuten de una
columna de 35um
bull Con un liacutemite de presioacuten de 600 bar
bull La partiacutecula tiene un nuacutecleo soacutelido
(17um) y una cubierta exterior porosa
de 05um como zona de difusioacuten
Las Columnas Poroshell 120 tienen
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Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 45
Poroshell 120 proporciona Eficacia Suficiente
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Flujo 0582 mLmin AcetonitriloAgua (6040)
Volumen de Inyeccioacuten 4 microL
TCC 26 oC
DAD Sig=2544nm Ref=360100nm
Muestra Muestra de test RRLC
(PN 5188-6529) inoculada con
50 microL 2 mgmL Tiourea en
aguaacetonitrilo (6535)
25 5 75 10
mAU
0
200
400
600
06
46
0
82
6
11
48
15
18
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2
22
3
28
16
41
32
62
73
97
53
larr N = 25053 Presioacuten = 182 bar
Poroshell 120 EC-C18 30 x 100 mm 27 um
min 25 5 75 10 125
mAU
0
200
400
600
06
49
0
86
5
12
75
17
56
24
18
27
05
34
94
52
81
82
18
13
04
1
larr N = 27295 Presioacuten = 386 bar
Eclipse Plus C18 30 x 100 mm 18 um
gt90 de la Eficacia de una 18um
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iquestEn queacute tipos de instrumentos puede usar
Columnas Poroshell 120 HPLCrsquos y UHPLCrsquos
Consideraciones en UHPLC
bull Las columnas Poroshell 120 tienen un liacutemite de presioacuten de 600 bar
bull Los UHPLC estaacuten ajustados para columnas de bajo volumen por lo tanto las
Poroshell pueden usarse en todos los UHPLC
Consideraciones en HPLC
bull Las Columnas Poroshell 120 trabajan bien por debajo de 400 bar
bull Minimize los volumenes extra columna para las columnas 21 y 30mm ID ndash
siga las instrucciones dadas para las columnas RRHT (18um 600 bar)
bull Use en el detector velocidades adecuadas de adquisicioacuten para picos
estrechos de alta eficacia
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Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 47
Con una frita de 2 um Poroshell 120 no se bloquea
Muestras Complejas- Plasma
Diflusinal in Plasma
0
20
40
60
80
100
120
140
160
180
200
220
240
260
280
300
320
340
360
380
400
1 501 1001 1501 2001 2501
Injections
Pre
ssu
re
0
20000
40000
60000
80000
100000
120000
140000
160000
180000
200000
Eff
icie
ncy (
N)
End Press
Plates
Columna Poroshell 120 EC-C18 30 x 50mm 27um LC Agilent 1200 RRLC (SL)
Muestra Plasma Precipitado 2 partes Plasma 7 Partes 2080 Agua-MeCN w01 Aacutecido Foacutermico con 1 Parte de Diflusinal en
5050 Agua-MeCN 10 ugml (Concentracion Final Diflusinal 1 ugml) Agitado y dejado reposar 10 minutos
No Centrifugado No Filtrado
Volumen de Inyeccioacuten 1ul
Solvente A Agua w01 TFA
Solvente B MeCN w008 TFA
Flujo 1 mlmin 1 ul inyeccioacuten
Tiempo B
0 20
05 90
06 90
11 20
25 20
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Diflusinal es un anti-inflamatorio no esteroidal anaacutelogo
a la aspirina desarrollado por Merck Sharp amp Dohme
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Las Columnas Superficialmente Porosas Pueden
Usarse cumpliendo los Requirimientos USP
De la lista USP de empaquetamientos de columnas LC 42009
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Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 49
Criterios de Ajuste de Meacutetodos USP y FDA Criterios de Ajuste de Meacutetodos de Dimensiones de Columna
Paraacutemetro Especificaciones Maacuteximas ComentariosEjemplos
Longitud de Columna 70 250mm 75mm
150mm 50mm
Diaacutemetro Interno de
Columna
25 (FDA ORA-LAB 545)
USP ndash 25 ID Columna puede ajustarse si la
velocidad lineal es constante
46 mm 30 mm (-35)
46 mm 21 mm (-54)
30 mm 21 mm (-30)
Flow Rate 50
Volumen de Inyeccioacuten
Reducir tanto como se necesitendash
debe cumplir los liacutemites de
deteccioacuten y precisioacuten
Si cambia a una columna maacutes
corta haga el cambio apropiado
en el volumen de inyeccioacuten
Tamantildeo de Partiacutecula Reducir hasta el 50
(no se puede aumentar)
Puede cambiar la longitud de columna y el
tamantildeo de partiacutecula para mantener la misma
Rs
5um 35um (-30)
5um 27um (-46) Cambiado en 22409 ndash Para la copia oficial y actual ir a
httpwwwfdagovScienceResearchFieldSciencedefaulthtm
USP 30 Second Supplement Revisions PF34(5) en proceso
Ver ldquo Stimuli articlerdquo en Pharmacopeial Forum 2009 35(6)
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Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 50
Comparacioacuten de 46 x 250 mm 5 um con Poroshell
120 EC-C18 46 x 100 mm 27um
min 5 10 15 20 25 30
mAU
0
20
40
60
80
100
97
12
111
16
115
96
126
74
152
48
161
51
164
35
206
87
230
76
292
90
min 5 10 15 20 25 30
mAU
0
50
100
150
200
250
17
19
21
89
23
11
26
06
38
67
44
37 45
58
54
50
59
20
70
37
Anaacutelisis maacutes raacutepido(columna maacutes corta flujo maacutes alto)
Mayor sensibilidad(partiacutecula maacutes pequentildeapico maacutes estrecho)
Maacutes optimizado (un anaacutelisis maacutes raacutepido permite ajustar mejor)
Ambos anaacutelisis en Agilent 1100 G1315B DAD (bajo 400 bar)
No se requiere cambio en la preparacioacuten de muestra frita de entrada
de 2 micras en ambas columnas
325 bar
110 bar
Sulfadiazina
Sulfatiazol
Sulfapiridina
Sulfamerazina
Sulfametazina
Sulfametazol
Sulfametoxipiridazina
Sulfacloropiridazina
Sulfametoxazol
Sulfadimetoxina
Tiempo B
0 8
33 33
34 33
Columna Eclipse Plus C18
46 x 250mm 5um
Flujo 1 mLmin
Fase Moacutevil
A 01 Aacutecido Foacutermico en Agua
B 01 Aacutecido Foacutermico en ACN
Tiempo B
0 8
12 33
132 33
Columna 46 x 100mm
Poroshell 120 EC-C18
27um
Flujo 185 mLmin
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Comparacioacuten de 46 x 250 mm 5 um con Poroshell
120 EC-C18 46 x 100 mm 27um
min 5 10 15 20 25 30
mAU
0
20
40
60
80
100
97
12
111
16
115
96
126
74
152
48
161
51
164
35
206
87
230
76
292
90
110 bar
5
mAU
0
50
100
150
200
250
17
19
21
89
23
11
26
06
38
67
44
37 45
58
54
50
59
20
70
37
325 bar
min
Ver condiciones en diapositiva anterior
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Mejor Resolucioacuten
linea base
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 52
Anaacutelisis maacutes raacutepido del meacutetodo USP para pastillas de
Simvastatina en Columnas Poroshell 120ndash Ajuste del meacutetodo
46 x 250 mm 5-um
Agilent ZORBAX Eclipse Plus C18
46 x 75 mm 27-um
Agilent Poroshell 120 EC-C18
65 CH3CN 35 39 gL NaH2PO4 (pH 45) 45 oC Sig = 238 8 Ref = 360 100 nm
Flujos 15 mLmin para la columna de 5-um 28 mLmin para la columna Poroshell 120 27um
Requerimiento
USP
5-um
(15 mLmin)
27-um
(28 mLmin)
TR na 9907 1457
krsquo gt 30 5962 5122
N gt 4500 16939 14439
Tf lt 20 109 110
min 2 4 6 8 10
mAU
0
5
10
15
20
25
30
35
40
min 2
mAU
0
5
10
15
20
25
30
35
40
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Ajustes de los parametros cromatograficos en la
transferencia de meacutetodos Escalado del volume de inyeccioacuten
v1 x [(r22 x L2)(r1
2 x L1)] = V2
O bien
v2 = V1 x [(d22 x L2)(d1
2 x L1)]
v volume de inyeccioacuten
r radio de la columna
L longitud de la columna
Ajuste del flujo
F2= F1 x (L2L1 ) x (r2r1 )2
L longitud de la columna
F Flujo
r radio de la columna
Ajuste de la longitud del gradiente
En funcioacuten de la longitud de la columna
L2L1= tg2tg1
En funcioacuten del volumen muerto de columna y del flujo
tG2= tG1 x (V2V1) x (F1F2) t tiempos de gradiente
V volumen muerto de columna
F flujo
Columna ID Volumen muerto aprox
por mm longitud
46mm 100uL
30mm 425uL
21mm 208uL
10mm 047uL
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Notas de Aplicacioacuten en Poroshell 120 y QuEChERS
Determination of Hormones in Shrimp by Agilent 1290 Infinity LC with
Agilent Poroshell 120 LC Column and Agilent QuEChERS for Sample
Preparation (publication 5990-6589EN)
Analysis of Pesticide Residues in Green Tea Using Agilent SampliQ
QuEChERS EN Kit by LCMSMS Detection (publication 5990-
6400EN)
Analysis of Pesticide Residues in Rice Using Agilent Bond Elut
QuEChERS AOAC Kit (publication 5990-8034EN)
Poroshell 120 for pharmaceutical analysis
Poroshell 120 Resources
QuEChERS Applications
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Sumario
bull La columna Poroshell 120 es una nueva alternativa para LC de Alta
Resolucioacuten y Alta Velocidad que puede usarse en cualquier HPLC o UHPLC
bull Con la Poroshell 120 se pueden lograr separaciones de alta eficacia a baja
presioacuten
bull Puede usarse con muestras sucias sin ver una elevacioacuten anormal de la
presioacuten
bull Puede usarse en un meacutetodo USP sin comprometer los Criterios de Ajustes de
Meacutetodo
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Soporte Teacutecnico Agilent
Teleacutefono de Atencioacuten al Cliente
901 11 68 90
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wwwagilentcomchem
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Referencias
(1) M Anastassiades SJ Lehotay D Štajnbaher and FJ Schenk J AOAC Int 86 4121 (2003)
(2) G Stubbings and T Bigwood Anal Chim Acta 637 68 (2009)
(3) RR Rasmussen IMLD Storm PZH Rasmussen J Smedsgaard and KF Nielsen Anal Bioanal Chem 397 765 (2010)
(4) D Smith and K Lynam GCμECD analysis and confirmation of PCBs in fish tissue with Agilent JampW DB-35ms and DB-XLB GC columns Agilent Technologies 5990-6236EN (2010)
(5) F Ploumlssl M Giera and F Bracher J Chrom A 1135 19 (2006)
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MEJORAR LA PRODUCTIVIDAD EN
HPLC ESTAacuteNDAR CON COLUMNAS
POROSHELL
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Columnas Poroshell 120 para HPLC y UHPLC
bull 80-90 de eficacia de las sub 2um
bull A presiones un ~40-50 maacutes bajas
bull Con un tamantildeo de partiacutecula de 27um
bull Con una frita de entrada de 2um
bull Con el doble de resolucioacuten de una
columna de 35um
bull Con un liacutemite de presioacuten de 600 bar
bull La partiacutecula tiene un nuacutecleo soacutelido
(17um) y una cubierta exterior porosa
de 05um como zona de difusioacuten
Las Columnas Poroshell 120 tienen
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Poroshell 120 proporciona Eficacia Suficiente
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Flujo 0582 mLmin AcetonitriloAgua (6040)
Volumen de Inyeccioacuten 4 microL
TCC 26 oC
DAD Sig=2544nm Ref=360100nm
Muestra Muestra de test RRLC
(PN 5188-6529) inoculada con
50 microL 2 mgmL Tiourea en
aguaacetonitrilo (6535)
25 5 75 10
mAU
0
200
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06
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28
16
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73
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larr N = 25053 Presioacuten = 182 bar
Poroshell 120 EC-C18 30 x 100 mm 27 um
min 25 5 75 10 125
mAU
0
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13
04
1
larr N = 27295 Presioacuten = 386 bar
Eclipse Plus C18 30 x 100 mm 18 um
gt90 de la Eficacia de una 18um
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iquestEn queacute tipos de instrumentos puede usar
Columnas Poroshell 120 HPLCrsquos y UHPLCrsquos
Consideraciones en UHPLC
bull Las columnas Poroshell 120 tienen un liacutemite de presioacuten de 600 bar
bull Los UHPLC estaacuten ajustados para columnas de bajo volumen por lo tanto las
Poroshell pueden usarse en todos los UHPLC
Consideraciones en HPLC
bull Las Columnas Poroshell 120 trabajan bien por debajo de 400 bar
bull Minimize los volumenes extra columna para las columnas 21 y 30mm ID ndash
siga las instrucciones dadas para las columnas RRHT (18um 600 bar)
bull Use en el detector velocidades adecuadas de adquisicioacuten para picos
estrechos de alta eficacia
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Con una frita de 2 um Poroshell 120 no se bloquea
Muestras Complejas- Plasma
Diflusinal in Plasma
0
20
40
60
80
100
120
140
160
180
200
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240
260
280
300
320
340
360
380
400
1 501 1001 1501 2001 2501
Injections
Pre
ssu
re
0
20000
40000
60000
80000
100000
120000
140000
160000
180000
200000
Eff
icie
ncy (
N)
End Press
Plates
Columna Poroshell 120 EC-C18 30 x 50mm 27um LC Agilent 1200 RRLC (SL)
Muestra Plasma Precipitado 2 partes Plasma 7 Partes 2080 Agua-MeCN w01 Aacutecido Foacutermico con 1 Parte de Diflusinal en
5050 Agua-MeCN 10 ugml (Concentracion Final Diflusinal 1 ugml) Agitado y dejado reposar 10 minutos
No Centrifugado No Filtrado
Volumen de Inyeccioacuten 1ul
Solvente A Agua w01 TFA
Solvente B MeCN w008 TFA
Flujo 1 mlmin 1 ul inyeccioacuten
Tiempo B
0 20
05 90
06 90
11 20
25 20
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Diflusinal es un anti-inflamatorio no esteroidal anaacutelogo
a la aspirina desarrollado por Merck Sharp amp Dohme
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Las Columnas Superficialmente Porosas Pueden
Usarse cumpliendo los Requirimientos USP
De la lista USP de empaquetamientos de columnas LC 42009
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Criterios de Ajuste de Meacutetodos USP y FDA Criterios de Ajuste de Meacutetodos de Dimensiones de Columna
Paraacutemetro Especificaciones Maacuteximas ComentariosEjemplos
Longitud de Columna 70 250mm 75mm
150mm 50mm
Diaacutemetro Interno de
Columna
25 (FDA ORA-LAB 545)
USP ndash 25 ID Columna puede ajustarse si la
velocidad lineal es constante
46 mm 30 mm (-35)
46 mm 21 mm (-54)
30 mm 21 mm (-30)
Flow Rate 50
Volumen de Inyeccioacuten
Reducir tanto como se necesitendash
debe cumplir los liacutemites de
deteccioacuten y precisioacuten
Si cambia a una columna maacutes
corta haga el cambio apropiado
en el volumen de inyeccioacuten
Tamantildeo de Partiacutecula Reducir hasta el 50
(no se puede aumentar)
Puede cambiar la longitud de columna y el
tamantildeo de partiacutecula para mantener la misma
Rs
5um 35um (-30)
5um 27um (-46) Cambiado en 22409 ndash Para la copia oficial y actual ir a
httpwwwfdagovScienceResearchFieldSciencedefaulthtm
USP 30 Second Supplement Revisions PF34(5) en proceso
Ver ldquo Stimuli articlerdquo en Pharmacopeial Forum 2009 35(6)
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Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 50
Comparacioacuten de 46 x 250 mm 5 um con Poroshell
120 EC-C18 46 x 100 mm 27um
min 5 10 15 20 25 30
mAU
0
20
40
60
80
100
97
12
111
16
115
96
126
74
152
48
161
51
164
35
206
87
230
76
292
90
min 5 10 15 20 25 30
mAU
0
50
100
150
200
250
17
19
21
89
23
11
26
06
38
67
44
37 45
58
54
50
59
20
70
37
Anaacutelisis maacutes raacutepido(columna maacutes corta flujo maacutes alto)
Mayor sensibilidad(partiacutecula maacutes pequentildeapico maacutes estrecho)
Maacutes optimizado (un anaacutelisis maacutes raacutepido permite ajustar mejor)
Ambos anaacutelisis en Agilent 1100 G1315B DAD (bajo 400 bar)
No se requiere cambio en la preparacioacuten de muestra frita de entrada
de 2 micras en ambas columnas
325 bar
110 bar
Sulfadiazina
Sulfatiazol
Sulfapiridina
Sulfamerazina
Sulfametazina
Sulfametazol
Sulfametoxipiridazina
Sulfacloropiridazina
Sulfametoxazol
Sulfadimetoxina
Tiempo B
0 8
33 33
34 33
Columna Eclipse Plus C18
46 x 250mm 5um
Flujo 1 mLmin
Fase Moacutevil
A 01 Aacutecido Foacutermico en Agua
B 01 Aacutecido Foacutermico en ACN
Tiempo B
0 8
12 33
132 33
Columna 46 x 100mm
Poroshell 120 EC-C18
27um
Flujo 185 mLmin
Page 50
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 51
Comparacioacuten de 46 x 250 mm 5 um con Poroshell
120 EC-C18 46 x 100 mm 27um
min 5 10 15 20 25 30
mAU
0
20
40
60
80
100
97
12
111
16
115
96
126
74
152
48
161
51
164
35
206
87
230
76
292
90
110 bar
5
mAU
0
50
100
150
200
250
17
19
21
89
23
11
26
06
38
67
44
37 45
58
54
50
59
20
70
37
325 bar
min
Ver condiciones en diapositiva anterior
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Mejor Resolucioacuten
linea base
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 52
Anaacutelisis maacutes raacutepido del meacutetodo USP para pastillas de
Simvastatina en Columnas Poroshell 120ndash Ajuste del meacutetodo
46 x 250 mm 5-um
Agilent ZORBAX Eclipse Plus C18
46 x 75 mm 27-um
Agilent Poroshell 120 EC-C18
65 CH3CN 35 39 gL NaH2PO4 (pH 45) 45 oC Sig = 238 8 Ref = 360 100 nm
Flujos 15 mLmin para la columna de 5-um 28 mLmin para la columna Poroshell 120 27um
Requerimiento
USP
5-um
(15 mLmin)
27-um
(28 mLmin)
TR na 9907 1457
krsquo gt 30 5962 5122
N gt 4500 16939 14439
Tf lt 20 109 110
min 2 4 6 8 10
mAU
0
5
10
15
20
25
30
35
40
min 2
mAU
0
5
10
15
20
25
30
35
40
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 53
Ajustes de los parametros cromatograficos en la
transferencia de meacutetodos Escalado del volume de inyeccioacuten
v1 x [(r22 x L2)(r1
2 x L1)] = V2
O bien
v2 = V1 x [(d22 x L2)(d1
2 x L1)]
v volume de inyeccioacuten
r radio de la columna
L longitud de la columna
Ajuste del flujo
F2= F1 x (L2L1 ) x (r2r1 )2
L longitud de la columna
F Flujo
r radio de la columna
Ajuste de la longitud del gradiente
En funcioacuten de la longitud de la columna
L2L1= tg2tg1
En funcioacuten del volumen muerto de columna y del flujo
tG2= tG1 x (V2V1) x (F1F2) t tiempos de gradiente
V volumen muerto de columna
F flujo
Columna ID Volumen muerto aprox
por mm longitud
46mm 100uL
30mm 425uL
21mm 208uL
10mm 047uL
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 54
Notas de Aplicacioacuten en Poroshell 120 y QuEChERS
Determination of Hormones in Shrimp by Agilent 1290 Infinity LC with
Agilent Poroshell 120 LC Column and Agilent QuEChERS for Sample
Preparation (publication 5990-6589EN)
Analysis of Pesticide Residues in Green Tea Using Agilent SampliQ
QuEChERS EN Kit by LCMSMS Detection (publication 5990-
6400EN)
Analysis of Pesticide Residues in Rice Using Agilent Bond Elut
QuEChERS AOAC Kit (publication 5990-8034EN)
Poroshell 120 for pharmaceutical analysis
Poroshell 120 Resources
QuEChERS Applications
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 55
Sumario
bull La columna Poroshell 120 es una nueva alternativa para LC de Alta
Resolucioacuten y Alta Velocidad que puede usarse en cualquier HPLC o UHPLC
bull Con la Poroshell 120 se pueden lograr separaciones de alta eficacia a baja
presioacuten
bull Puede usarse con muestras sucias sin ver una elevacioacuten anormal de la
presioacuten
bull Puede usarse en un meacutetodo USP sin comprometer los Criterios de Ajustes de
Meacutetodo
Page 55
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 56
Soporte Teacutecnico Agilent
Teleacutefono de Atencioacuten al Cliente
901 11 68 90
email customercare_spainagilentcom
wwwagilentcomchem
![Page 43: Análisis de compuestos farmacéuticos en sangre total · PDF fileReducción en el procesamiento, el envío de la muestra, y los ... Gas flow: 10 L/min Nebulizer: 10 psi Sheath gas](https://reader031.vdocuments.site/reader031/viewer/2022030405/5a7a81727f8b9a0a668b45aa/html5/thumbnails/43.jpg)
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 43
MEJORAR LA PRODUCTIVIDAD EN
HPLC ESTAacuteNDAR CON COLUMNAS
POROSHELL
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Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 44
Columnas Poroshell 120 para HPLC y UHPLC
bull 80-90 de eficacia de las sub 2um
bull A presiones un ~40-50 maacutes bajas
bull Con un tamantildeo de partiacutecula de 27um
bull Con una frita de entrada de 2um
bull Con el doble de resolucioacuten de una
columna de 35um
bull Con un liacutemite de presioacuten de 600 bar
bull La partiacutecula tiene un nuacutecleo soacutelido
(17um) y una cubierta exterior porosa
de 05um como zona de difusioacuten
Las Columnas Poroshell 120 tienen
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Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 45
Poroshell 120 proporciona Eficacia Suficiente
Page 45
Flujo 0582 mLmin AcetonitriloAgua (6040)
Volumen de Inyeccioacuten 4 microL
TCC 26 oC
DAD Sig=2544nm Ref=360100nm
Muestra Muestra de test RRLC
(PN 5188-6529) inoculada con
50 microL 2 mgmL Tiourea en
aguaacetonitrilo (6535)
25 5 75 10
mAU
0
200
400
600
06
46
0
82
6
11
48
15
18
20
16
2
22
3
28
16
41
32
62
73
97
53
larr N = 25053 Presioacuten = 182 bar
Poroshell 120 EC-C18 30 x 100 mm 27 um
min 25 5 75 10 125
mAU
0
200
400
600
06
49
0
86
5
12
75
17
56
24
18
27
05
34
94
52
81
82
18
13
04
1
larr N = 27295 Presioacuten = 386 bar
Eclipse Plus C18 30 x 100 mm 18 um
gt90 de la Eficacia de una 18um
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 46
iquestEn queacute tipos de instrumentos puede usar
Columnas Poroshell 120 HPLCrsquos y UHPLCrsquos
Consideraciones en UHPLC
bull Las columnas Poroshell 120 tienen un liacutemite de presioacuten de 600 bar
bull Los UHPLC estaacuten ajustados para columnas de bajo volumen por lo tanto las
Poroshell pueden usarse en todos los UHPLC
Consideraciones en HPLC
bull Las Columnas Poroshell 120 trabajan bien por debajo de 400 bar
bull Minimize los volumenes extra columna para las columnas 21 y 30mm ID ndash
siga las instrucciones dadas para las columnas RRHT (18um 600 bar)
bull Use en el detector velocidades adecuadas de adquisicioacuten para picos
estrechos de alta eficacia
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Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 47
Con una frita de 2 um Poroshell 120 no se bloquea
Muestras Complejas- Plasma
Diflusinal in Plasma
0
20
40
60
80
100
120
140
160
180
200
220
240
260
280
300
320
340
360
380
400
1 501 1001 1501 2001 2501
Injections
Pre
ssu
re
0
20000
40000
60000
80000
100000
120000
140000
160000
180000
200000
Eff
icie
ncy (
N)
End Press
Plates
Columna Poroshell 120 EC-C18 30 x 50mm 27um LC Agilent 1200 RRLC (SL)
Muestra Plasma Precipitado 2 partes Plasma 7 Partes 2080 Agua-MeCN w01 Aacutecido Foacutermico con 1 Parte de Diflusinal en
5050 Agua-MeCN 10 ugml (Concentracion Final Diflusinal 1 ugml) Agitado y dejado reposar 10 minutos
No Centrifugado No Filtrado
Volumen de Inyeccioacuten 1ul
Solvente A Agua w01 TFA
Solvente B MeCN w008 TFA
Flujo 1 mlmin 1 ul inyeccioacuten
Tiempo B
0 20
05 90
06 90
11 20
25 20
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Diflusinal es un anti-inflamatorio no esteroidal anaacutelogo
a la aspirina desarrollado por Merck Sharp amp Dohme
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 48
Las Columnas Superficialmente Porosas Pueden
Usarse cumpliendo los Requirimientos USP
De la lista USP de empaquetamientos de columnas LC 42009
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Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 49
Criterios de Ajuste de Meacutetodos USP y FDA Criterios de Ajuste de Meacutetodos de Dimensiones de Columna
Paraacutemetro Especificaciones Maacuteximas ComentariosEjemplos
Longitud de Columna 70 250mm 75mm
150mm 50mm
Diaacutemetro Interno de
Columna
25 (FDA ORA-LAB 545)
USP ndash 25 ID Columna puede ajustarse si la
velocidad lineal es constante
46 mm 30 mm (-35)
46 mm 21 mm (-54)
30 mm 21 mm (-30)
Flow Rate 50
Volumen de Inyeccioacuten
Reducir tanto como se necesitendash
debe cumplir los liacutemites de
deteccioacuten y precisioacuten
Si cambia a una columna maacutes
corta haga el cambio apropiado
en el volumen de inyeccioacuten
Tamantildeo de Partiacutecula Reducir hasta el 50
(no se puede aumentar)
Puede cambiar la longitud de columna y el
tamantildeo de partiacutecula para mantener la misma
Rs
5um 35um (-30)
5um 27um (-46) Cambiado en 22409 ndash Para la copia oficial y actual ir a
httpwwwfdagovScienceResearchFieldSciencedefaulthtm
USP 30 Second Supplement Revisions PF34(5) en proceso
Ver ldquo Stimuli articlerdquo en Pharmacopeial Forum 2009 35(6)
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Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 50
Comparacioacuten de 46 x 250 mm 5 um con Poroshell
120 EC-C18 46 x 100 mm 27um
min 5 10 15 20 25 30
mAU
0
20
40
60
80
100
97
12
111
16
115
96
126
74
152
48
161
51
164
35
206
87
230
76
292
90
min 5 10 15 20 25 30
mAU
0
50
100
150
200
250
17
19
21
89
23
11
26
06
38
67
44
37 45
58
54
50
59
20
70
37
Anaacutelisis maacutes raacutepido(columna maacutes corta flujo maacutes alto)
Mayor sensibilidad(partiacutecula maacutes pequentildeapico maacutes estrecho)
Maacutes optimizado (un anaacutelisis maacutes raacutepido permite ajustar mejor)
Ambos anaacutelisis en Agilent 1100 G1315B DAD (bajo 400 bar)
No se requiere cambio en la preparacioacuten de muestra frita de entrada
de 2 micras en ambas columnas
325 bar
110 bar
Sulfadiazina
Sulfatiazol
Sulfapiridina
Sulfamerazina
Sulfametazina
Sulfametazol
Sulfametoxipiridazina
Sulfacloropiridazina
Sulfametoxazol
Sulfadimetoxina
Tiempo B
0 8
33 33
34 33
Columna Eclipse Plus C18
46 x 250mm 5um
Flujo 1 mLmin
Fase Moacutevil
A 01 Aacutecido Foacutermico en Agua
B 01 Aacutecido Foacutermico en ACN
Tiempo B
0 8
12 33
132 33
Columna 46 x 100mm
Poroshell 120 EC-C18
27um
Flujo 185 mLmin
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Comparacioacuten de 46 x 250 mm 5 um con Poroshell
120 EC-C18 46 x 100 mm 27um
min 5 10 15 20 25 30
mAU
0
20
40
60
80
100
97
12
111
16
115
96
126
74
152
48
161
51
164
35
206
87
230
76
292
90
110 bar
5
mAU
0
50
100
150
200
250
17
19
21
89
23
11
26
06
38
67
44
37 45
58
54
50
59
20
70
37
325 bar
min
Ver condiciones en diapositiva anterior
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Mejor Resolucioacuten
linea base
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Anaacutelisis maacutes raacutepido del meacutetodo USP para pastillas de
Simvastatina en Columnas Poroshell 120ndash Ajuste del meacutetodo
46 x 250 mm 5-um
Agilent ZORBAX Eclipse Plus C18
46 x 75 mm 27-um
Agilent Poroshell 120 EC-C18
65 CH3CN 35 39 gL NaH2PO4 (pH 45) 45 oC Sig = 238 8 Ref = 360 100 nm
Flujos 15 mLmin para la columna de 5-um 28 mLmin para la columna Poroshell 120 27um
Requerimiento
USP
5-um
(15 mLmin)
27-um
(28 mLmin)
TR na 9907 1457
krsquo gt 30 5962 5122
N gt 4500 16939 14439
Tf lt 20 109 110
min 2 4 6 8 10
mAU
0
5
10
15
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min 2
mAU
0
5
10
15
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25
30
35
40
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Ajustes de los parametros cromatograficos en la
transferencia de meacutetodos Escalado del volume de inyeccioacuten
v1 x [(r22 x L2)(r1
2 x L1)] = V2
O bien
v2 = V1 x [(d22 x L2)(d1
2 x L1)]
v volume de inyeccioacuten
r radio de la columna
L longitud de la columna
Ajuste del flujo
F2= F1 x (L2L1 ) x (r2r1 )2
L longitud de la columna
F Flujo
r radio de la columna
Ajuste de la longitud del gradiente
En funcioacuten de la longitud de la columna
L2L1= tg2tg1
En funcioacuten del volumen muerto de columna y del flujo
tG2= tG1 x (V2V1) x (F1F2) t tiempos de gradiente
V volumen muerto de columna
F flujo
Columna ID Volumen muerto aprox
por mm longitud
46mm 100uL
30mm 425uL
21mm 208uL
10mm 047uL
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 54
Notas de Aplicacioacuten en Poroshell 120 y QuEChERS
Determination of Hormones in Shrimp by Agilent 1290 Infinity LC with
Agilent Poroshell 120 LC Column and Agilent QuEChERS for Sample
Preparation (publication 5990-6589EN)
Analysis of Pesticide Residues in Green Tea Using Agilent SampliQ
QuEChERS EN Kit by LCMSMS Detection (publication 5990-
6400EN)
Analysis of Pesticide Residues in Rice Using Agilent Bond Elut
QuEChERS AOAC Kit (publication 5990-8034EN)
Poroshell 120 for pharmaceutical analysis
Poroshell 120 Resources
QuEChERS Applications
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Sumario
bull La columna Poroshell 120 es una nueva alternativa para LC de Alta
Resolucioacuten y Alta Velocidad que puede usarse en cualquier HPLC o UHPLC
bull Con la Poroshell 120 se pueden lograr separaciones de alta eficacia a baja
presioacuten
bull Puede usarse con muestras sucias sin ver una elevacioacuten anormal de la
presioacuten
bull Puede usarse en un meacutetodo USP sin comprometer los Criterios de Ajustes de
Meacutetodo
Page 55
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Soporte Teacutecnico Agilent
Teleacutefono de Atencioacuten al Cliente
901 11 68 90
email customercare_spainagilentcom
wwwagilentcomchem
![Page 44: Análisis de compuestos farmacéuticos en sangre total · PDF fileReducción en el procesamiento, el envío de la muestra, y los ... Gas flow: 10 L/min Nebulizer: 10 psi Sheath gas](https://reader031.vdocuments.site/reader031/viewer/2022030405/5a7a81727f8b9a0a668b45aa/html5/thumbnails/44.jpg)
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 44
Columnas Poroshell 120 para HPLC y UHPLC
bull 80-90 de eficacia de las sub 2um
bull A presiones un ~40-50 maacutes bajas
bull Con un tamantildeo de partiacutecula de 27um
bull Con una frita de entrada de 2um
bull Con el doble de resolucioacuten de una
columna de 35um
bull Con un liacutemite de presioacuten de 600 bar
bull La partiacutecula tiene un nuacutecleo soacutelido
(17um) y una cubierta exterior porosa
de 05um como zona de difusioacuten
Las Columnas Poroshell 120 tienen
Page 44
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 45
Poroshell 120 proporciona Eficacia Suficiente
Page 45
Flujo 0582 mLmin AcetonitriloAgua (6040)
Volumen de Inyeccioacuten 4 microL
TCC 26 oC
DAD Sig=2544nm Ref=360100nm
Muestra Muestra de test RRLC
(PN 5188-6529) inoculada con
50 microL 2 mgmL Tiourea en
aguaacetonitrilo (6535)
25 5 75 10
mAU
0
200
400
600
06
46
0
82
6
11
48
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2
22
3
28
16
41
32
62
73
97
53
larr N = 25053 Presioacuten = 182 bar
Poroshell 120 EC-C18 30 x 100 mm 27 um
min 25 5 75 10 125
mAU
0
200
400
600
06
49
0
86
5
12
75
17
56
24
18
27
05
34
94
52
81
82
18
13
04
1
larr N = 27295 Presioacuten = 386 bar
Eclipse Plus C18 30 x 100 mm 18 um
gt90 de la Eficacia de una 18um
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 46
iquestEn queacute tipos de instrumentos puede usar
Columnas Poroshell 120 HPLCrsquos y UHPLCrsquos
Consideraciones en UHPLC
bull Las columnas Poroshell 120 tienen un liacutemite de presioacuten de 600 bar
bull Los UHPLC estaacuten ajustados para columnas de bajo volumen por lo tanto las
Poroshell pueden usarse en todos los UHPLC
Consideraciones en HPLC
bull Las Columnas Poroshell 120 trabajan bien por debajo de 400 bar
bull Minimize los volumenes extra columna para las columnas 21 y 30mm ID ndash
siga las instrucciones dadas para las columnas RRHT (18um 600 bar)
bull Use en el detector velocidades adecuadas de adquisicioacuten para picos
estrechos de alta eficacia
Page 46
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 47
Con una frita de 2 um Poroshell 120 no se bloquea
Muestras Complejas- Plasma
Diflusinal in Plasma
0
20
40
60
80
100
120
140
160
180
200
220
240
260
280
300
320
340
360
380
400
1 501 1001 1501 2001 2501
Injections
Pre
ssu
re
0
20000
40000
60000
80000
100000
120000
140000
160000
180000
200000
Eff
icie
ncy (
N)
End Press
Plates
Columna Poroshell 120 EC-C18 30 x 50mm 27um LC Agilent 1200 RRLC (SL)
Muestra Plasma Precipitado 2 partes Plasma 7 Partes 2080 Agua-MeCN w01 Aacutecido Foacutermico con 1 Parte de Diflusinal en
5050 Agua-MeCN 10 ugml (Concentracion Final Diflusinal 1 ugml) Agitado y dejado reposar 10 minutos
No Centrifugado No Filtrado
Volumen de Inyeccioacuten 1ul
Solvente A Agua w01 TFA
Solvente B MeCN w008 TFA
Flujo 1 mlmin 1 ul inyeccioacuten
Tiempo B
0 20
05 90
06 90
11 20
25 20
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Diflusinal es un anti-inflamatorio no esteroidal anaacutelogo
a la aspirina desarrollado por Merck Sharp amp Dohme
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Las Columnas Superficialmente Porosas Pueden
Usarse cumpliendo los Requirimientos USP
De la lista USP de empaquetamientos de columnas LC 42009
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Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 49
Criterios de Ajuste de Meacutetodos USP y FDA Criterios de Ajuste de Meacutetodos de Dimensiones de Columna
Paraacutemetro Especificaciones Maacuteximas ComentariosEjemplos
Longitud de Columna 70 250mm 75mm
150mm 50mm
Diaacutemetro Interno de
Columna
25 (FDA ORA-LAB 545)
USP ndash 25 ID Columna puede ajustarse si la
velocidad lineal es constante
46 mm 30 mm (-35)
46 mm 21 mm (-54)
30 mm 21 mm (-30)
Flow Rate 50
Volumen de Inyeccioacuten
Reducir tanto como se necesitendash
debe cumplir los liacutemites de
deteccioacuten y precisioacuten
Si cambia a una columna maacutes
corta haga el cambio apropiado
en el volumen de inyeccioacuten
Tamantildeo de Partiacutecula Reducir hasta el 50
(no se puede aumentar)
Puede cambiar la longitud de columna y el
tamantildeo de partiacutecula para mantener la misma
Rs
5um 35um (-30)
5um 27um (-46) Cambiado en 22409 ndash Para la copia oficial y actual ir a
httpwwwfdagovScienceResearchFieldSciencedefaulthtm
USP 30 Second Supplement Revisions PF34(5) en proceso
Ver ldquo Stimuli articlerdquo en Pharmacopeial Forum 2009 35(6)
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Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 50
Comparacioacuten de 46 x 250 mm 5 um con Poroshell
120 EC-C18 46 x 100 mm 27um
min 5 10 15 20 25 30
mAU
0
20
40
60
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100
97
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152
48
161
51
164
35
206
87
230
76
292
90
min 5 10 15 20 25 30
mAU
0
50
100
150
200
250
17
19
21
89
23
11
26
06
38
67
44
37 45
58
54
50
59
20
70
37
Anaacutelisis maacutes raacutepido(columna maacutes corta flujo maacutes alto)
Mayor sensibilidad(partiacutecula maacutes pequentildeapico maacutes estrecho)
Maacutes optimizado (un anaacutelisis maacutes raacutepido permite ajustar mejor)
Ambos anaacutelisis en Agilent 1100 G1315B DAD (bajo 400 bar)
No se requiere cambio en la preparacioacuten de muestra frita de entrada
de 2 micras en ambas columnas
325 bar
110 bar
Sulfadiazina
Sulfatiazol
Sulfapiridina
Sulfamerazina
Sulfametazina
Sulfametazol
Sulfametoxipiridazina
Sulfacloropiridazina
Sulfametoxazol
Sulfadimetoxina
Tiempo B
0 8
33 33
34 33
Columna Eclipse Plus C18
46 x 250mm 5um
Flujo 1 mLmin
Fase Moacutevil
A 01 Aacutecido Foacutermico en Agua
B 01 Aacutecido Foacutermico en ACN
Tiempo B
0 8
12 33
132 33
Columna 46 x 100mm
Poroshell 120 EC-C18
27um
Flujo 185 mLmin
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Comparacioacuten de 46 x 250 mm 5 um con Poroshell
120 EC-C18 46 x 100 mm 27um
min 5 10 15 20 25 30
mAU
0
20
40
60
80
100
97
12
111
16
115
96
126
74
152
48
161
51
164
35
206
87
230
76
292
90
110 bar
5
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0
50
100
150
200
250
17
19
21
89
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26
06
38
67
44
37 45
58
54
50
59
20
70
37
325 bar
min
Ver condiciones en diapositiva anterior
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Mejor Resolucioacuten
linea base
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Anaacutelisis maacutes raacutepido del meacutetodo USP para pastillas de
Simvastatina en Columnas Poroshell 120ndash Ajuste del meacutetodo
46 x 250 mm 5-um
Agilent ZORBAX Eclipse Plus C18
46 x 75 mm 27-um
Agilent Poroshell 120 EC-C18
65 CH3CN 35 39 gL NaH2PO4 (pH 45) 45 oC Sig = 238 8 Ref = 360 100 nm
Flujos 15 mLmin para la columna de 5-um 28 mLmin para la columna Poroshell 120 27um
Requerimiento
USP
5-um
(15 mLmin)
27-um
(28 mLmin)
TR na 9907 1457
krsquo gt 30 5962 5122
N gt 4500 16939 14439
Tf lt 20 109 110
min 2 4 6 8 10
mAU
0
5
10
15
20
25
30
35
40
min 2
mAU
0
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10
15
20
25
30
35
40
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Ajustes de los parametros cromatograficos en la
transferencia de meacutetodos Escalado del volume de inyeccioacuten
v1 x [(r22 x L2)(r1
2 x L1)] = V2
O bien
v2 = V1 x [(d22 x L2)(d1
2 x L1)]
v volume de inyeccioacuten
r radio de la columna
L longitud de la columna
Ajuste del flujo
F2= F1 x (L2L1 ) x (r2r1 )2
L longitud de la columna
F Flujo
r radio de la columna
Ajuste de la longitud del gradiente
En funcioacuten de la longitud de la columna
L2L1= tg2tg1
En funcioacuten del volumen muerto de columna y del flujo
tG2= tG1 x (V2V1) x (F1F2) t tiempos de gradiente
V volumen muerto de columna
F flujo
Columna ID Volumen muerto aprox
por mm longitud
46mm 100uL
30mm 425uL
21mm 208uL
10mm 047uL
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 54
Notas de Aplicacioacuten en Poroshell 120 y QuEChERS
Determination of Hormones in Shrimp by Agilent 1290 Infinity LC with
Agilent Poroshell 120 LC Column and Agilent QuEChERS for Sample
Preparation (publication 5990-6589EN)
Analysis of Pesticide Residues in Green Tea Using Agilent SampliQ
QuEChERS EN Kit by LCMSMS Detection (publication 5990-
6400EN)
Analysis of Pesticide Residues in Rice Using Agilent Bond Elut
QuEChERS AOAC Kit (publication 5990-8034EN)
Poroshell 120 for pharmaceutical analysis
Poroshell 120 Resources
QuEChERS Applications
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 55
Sumario
bull La columna Poroshell 120 es una nueva alternativa para LC de Alta
Resolucioacuten y Alta Velocidad que puede usarse en cualquier HPLC o UHPLC
bull Con la Poroshell 120 se pueden lograr separaciones de alta eficacia a baja
presioacuten
bull Puede usarse con muestras sucias sin ver una elevacioacuten anormal de la
presioacuten
bull Puede usarse en un meacutetodo USP sin comprometer los Criterios de Ajustes de
Meacutetodo
Page 55
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 56
Soporte Teacutecnico Agilent
Teleacutefono de Atencioacuten al Cliente
901 11 68 90
email customercare_spainagilentcom
wwwagilentcomchem
![Page 45: Análisis de compuestos farmacéuticos en sangre total · PDF fileReducción en el procesamiento, el envío de la muestra, y los ... Gas flow: 10 L/min Nebulizer: 10 psi Sheath gas](https://reader031.vdocuments.site/reader031/viewer/2022030405/5a7a81727f8b9a0a668b45aa/html5/thumbnails/45.jpg)
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 45
Poroshell 120 proporciona Eficacia Suficiente
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Flujo 0582 mLmin AcetonitriloAgua (6040)
Volumen de Inyeccioacuten 4 microL
TCC 26 oC
DAD Sig=2544nm Ref=360100nm
Muestra Muestra de test RRLC
(PN 5188-6529) inoculada con
50 microL 2 mgmL Tiourea en
aguaacetonitrilo (6535)
25 5 75 10
mAU
0
200
400
600
06
46
0
82
6
11
48
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18
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16
2
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3
28
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32
62
73
97
53
larr N = 25053 Presioacuten = 182 bar
Poroshell 120 EC-C18 30 x 100 mm 27 um
min 25 5 75 10 125
mAU
0
200
400
600
06
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0
86
5
12
75
17
56
24
18
27
05
34
94
52
81
82
18
13
04
1
larr N = 27295 Presioacuten = 386 bar
Eclipse Plus C18 30 x 100 mm 18 um
gt90 de la Eficacia de una 18um
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 46
iquestEn queacute tipos de instrumentos puede usar
Columnas Poroshell 120 HPLCrsquos y UHPLCrsquos
Consideraciones en UHPLC
bull Las columnas Poroshell 120 tienen un liacutemite de presioacuten de 600 bar
bull Los UHPLC estaacuten ajustados para columnas de bajo volumen por lo tanto las
Poroshell pueden usarse en todos los UHPLC
Consideraciones en HPLC
bull Las Columnas Poroshell 120 trabajan bien por debajo de 400 bar
bull Minimize los volumenes extra columna para las columnas 21 y 30mm ID ndash
siga las instrucciones dadas para las columnas RRHT (18um 600 bar)
bull Use en el detector velocidades adecuadas de adquisicioacuten para picos
estrechos de alta eficacia
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Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 47
Con una frita de 2 um Poroshell 120 no se bloquea
Muestras Complejas- Plasma
Diflusinal in Plasma
0
20
40
60
80
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120
140
160
180
200
220
240
260
280
300
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340
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380
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1 501 1001 1501 2001 2501
Injections
Pre
ssu
re
0
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40000
60000
80000
100000
120000
140000
160000
180000
200000
Eff
icie
ncy (
N)
End Press
Plates
Columna Poroshell 120 EC-C18 30 x 50mm 27um LC Agilent 1200 RRLC (SL)
Muestra Plasma Precipitado 2 partes Plasma 7 Partes 2080 Agua-MeCN w01 Aacutecido Foacutermico con 1 Parte de Diflusinal en
5050 Agua-MeCN 10 ugml (Concentracion Final Diflusinal 1 ugml) Agitado y dejado reposar 10 minutos
No Centrifugado No Filtrado
Volumen de Inyeccioacuten 1ul
Solvente A Agua w01 TFA
Solvente B MeCN w008 TFA
Flujo 1 mlmin 1 ul inyeccioacuten
Tiempo B
0 20
05 90
06 90
11 20
25 20
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Diflusinal es un anti-inflamatorio no esteroidal anaacutelogo
a la aspirina desarrollado por Merck Sharp amp Dohme
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Las Columnas Superficialmente Porosas Pueden
Usarse cumpliendo los Requirimientos USP
De la lista USP de empaquetamientos de columnas LC 42009
Page 48
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Criterios de Ajuste de Meacutetodos USP y FDA Criterios de Ajuste de Meacutetodos de Dimensiones de Columna
Paraacutemetro Especificaciones Maacuteximas ComentariosEjemplos
Longitud de Columna 70 250mm 75mm
150mm 50mm
Diaacutemetro Interno de
Columna
25 (FDA ORA-LAB 545)
USP ndash 25 ID Columna puede ajustarse si la
velocidad lineal es constante
46 mm 30 mm (-35)
46 mm 21 mm (-54)
30 mm 21 mm (-30)
Flow Rate 50
Volumen de Inyeccioacuten
Reducir tanto como se necesitendash
debe cumplir los liacutemites de
deteccioacuten y precisioacuten
Si cambia a una columna maacutes
corta haga el cambio apropiado
en el volumen de inyeccioacuten
Tamantildeo de Partiacutecula Reducir hasta el 50
(no se puede aumentar)
Puede cambiar la longitud de columna y el
tamantildeo de partiacutecula para mantener la misma
Rs
5um 35um (-30)
5um 27um (-46) Cambiado en 22409 ndash Para la copia oficial y actual ir a
httpwwwfdagovScienceResearchFieldSciencedefaulthtm
USP 30 Second Supplement Revisions PF34(5) en proceso
Ver ldquo Stimuli articlerdquo en Pharmacopeial Forum 2009 35(6)
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Comparacioacuten de 46 x 250 mm 5 um con Poroshell
120 EC-C18 46 x 100 mm 27um
min 5 10 15 20 25 30
mAU
0
20
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97
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16
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164
35
206
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230
76
292
90
min 5 10 15 20 25 30
mAU
0
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150
200
250
17
19
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06
38
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37 45
58
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59
20
70
37
Anaacutelisis maacutes raacutepido(columna maacutes corta flujo maacutes alto)
Mayor sensibilidad(partiacutecula maacutes pequentildeapico maacutes estrecho)
Maacutes optimizado (un anaacutelisis maacutes raacutepido permite ajustar mejor)
Ambos anaacutelisis en Agilent 1100 G1315B DAD (bajo 400 bar)
No se requiere cambio en la preparacioacuten de muestra frita de entrada
de 2 micras en ambas columnas
325 bar
110 bar
Sulfadiazina
Sulfatiazol
Sulfapiridina
Sulfamerazina
Sulfametazina
Sulfametazol
Sulfametoxipiridazina
Sulfacloropiridazina
Sulfametoxazol
Sulfadimetoxina
Tiempo B
0 8
33 33
34 33
Columna Eclipse Plus C18
46 x 250mm 5um
Flujo 1 mLmin
Fase Moacutevil
A 01 Aacutecido Foacutermico en Agua
B 01 Aacutecido Foacutermico en ACN
Tiempo B
0 8
12 33
132 33
Columna 46 x 100mm
Poroshell 120 EC-C18
27um
Flujo 185 mLmin
Page 50
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Comparacioacuten de 46 x 250 mm 5 um con Poroshell
120 EC-C18 46 x 100 mm 27um
min 5 10 15 20 25 30
mAU
0
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80
100
97
12
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16
115
96
126
74
152
48
161
51
164
35
206
87
230
76
292
90
110 bar
5
mAU
0
50
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150
200
250
17
19
21
89
23
11
26
06
38
67
44
37 45
58
54
50
59
20
70
37
325 bar
min
Ver condiciones en diapositiva anterior
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Mejor Resolucioacuten
linea base
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Anaacutelisis maacutes raacutepido del meacutetodo USP para pastillas de
Simvastatina en Columnas Poroshell 120ndash Ajuste del meacutetodo
46 x 250 mm 5-um
Agilent ZORBAX Eclipse Plus C18
46 x 75 mm 27-um
Agilent Poroshell 120 EC-C18
65 CH3CN 35 39 gL NaH2PO4 (pH 45) 45 oC Sig = 238 8 Ref = 360 100 nm
Flujos 15 mLmin para la columna de 5-um 28 mLmin para la columna Poroshell 120 27um
Requerimiento
USP
5-um
(15 mLmin)
27-um
(28 mLmin)
TR na 9907 1457
krsquo gt 30 5962 5122
N gt 4500 16939 14439
Tf lt 20 109 110
min 2 4 6 8 10
mAU
0
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min 2
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35
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Ajustes de los parametros cromatograficos en la
transferencia de meacutetodos Escalado del volume de inyeccioacuten
v1 x [(r22 x L2)(r1
2 x L1)] = V2
O bien
v2 = V1 x [(d22 x L2)(d1
2 x L1)]
v volume de inyeccioacuten
r radio de la columna
L longitud de la columna
Ajuste del flujo
F2= F1 x (L2L1 ) x (r2r1 )2
L longitud de la columna
F Flujo
r radio de la columna
Ajuste de la longitud del gradiente
En funcioacuten de la longitud de la columna
L2L1= tg2tg1
En funcioacuten del volumen muerto de columna y del flujo
tG2= tG1 x (V2V1) x (F1F2) t tiempos de gradiente
V volumen muerto de columna
F flujo
Columna ID Volumen muerto aprox
por mm longitud
46mm 100uL
30mm 425uL
21mm 208uL
10mm 047uL
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Notas de Aplicacioacuten en Poroshell 120 y QuEChERS
Determination of Hormones in Shrimp by Agilent 1290 Infinity LC with
Agilent Poroshell 120 LC Column and Agilent QuEChERS for Sample
Preparation (publication 5990-6589EN)
Analysis of Pesticide Residues in Green Tea Using Agilent SampliQ
QuEChERS EN Kit by LCMSMS Detection (publication 5990-
6400EN)
Analysis of Pesticide Residues in Rice Using Agilent Bond Elut
QuEChERS AOAC Kit (publication 5990-8034EN)
Poroshell 120 for pharmaceutical analysis
Poroshell 120 Resources
QuEChERS Applications
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Sumario
bull La columna Poroshell 120 es una nueva alternativa para LC de Alta
Resolucioacuten y Alta Velocidad que puede usarse en cualquier HPLC o UHPLC
bull Con la Poroshell 120 se pueden lograr separaciones de alta eficacia a baja
presioacuten
bull Puede usarse con muestras sucias sin ver una elevacioacuten anormal de la
presioacuten
bull Puede usarse en un meacutetodo USP sin comprometer los Criterios de Ajustes de
Meacutetodo
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Soporte Teacutecnico Agilent
Teleacutefono de Atencioacuten al Cliente
901 11 68 90
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Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 46
iquestEn queacute tipos de instrumentos puede usar
Columnas Poroshell 120 HPLCrsquos y UHPLCrsquos
Consideraciones en UHPLC
bull Las columnas Poroshell 120 tienen un liacutemite de presioacuten de 600 bar
bull Los UHPLC estaacuten ajustados para columnas de bajo volumen por lo tanto las
Poroshell pueden usarse en todos los UHPLC
Consideraciones en HPLC
bull Las Columnas Poroshell 120 trabajan bien por debajo de 400 bar
bull Minimize los volumenes extra columna para las columnas 21 y 30mm ID ndash
siga las instrucciones dadas para las columnas RRHT (18um 600 bar)
bull Use en el detector velocidades adecuadas de adquisicioacuten para picos
estrechos de alta eficacia
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Con una frita de 2 um Poroshell 120 no se bloquea
Muestras Complejas- Plasma
Diflusinal in Plasma
0
20
40
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120
140
160
180
200
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240
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280
300
320
340
360
380
400
1 501 1001 1501 2001 2501
Injections
Pre
ssu
re
0
20000
40000
60000
80000
100000
120000
140000
160000
180000
200000
Eff
icie
ncy (
N)
End Press
Plates
Columna Poroshell 120 EC-C18 30 x 50mm 27um LC Agilent 1200 RRLC (SL)
Muestra Plasma Precipitado 2 partes Plasma 7 Partes 2080 Agua-MeCN w01 Aacutecido Foacutermico con 1 Parte de Diflusinal en
5050 Agua-MeCN 10 ugml (Concentracion Final Diflusinal 1 ugml) Agitado y dejado reposar 10 minutos
No Centrifugado No Filtrado
Volumen de Inyeccioacuten 1ul
Solvente A Agua w01 TFA
Solvente B MeCN w008 TFA
Flujo 1 mlmin 1 ul inyeccioacuten
Tiempo B
0 20
05 90
06 90
11 20
25 20
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Diflusinal es un anti-inflamatorio no esteroidal anaacutelogo
a la aspirina desarrollado por Merck Sharp amp Dohme
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Las Columnas Superficialmente Porosas Pueden
Usarse cumpliendo los Requirimientos USP
De la lista USP de empaquetamientos de columnas LC 42009
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Criterios de Ajuste de Meacutetodos USP y FDA Criterios de Ajuste de Meacutetodos de Dimensiones de Columna
Paraacutemetro Especificaciones Maacuteximas ComentariosEjemplos
Longitud de Columna 70 250mm 75mm
150mm 50mm
Diaacutemetro Interno de
Columna
25 (FDA ORA-LAB 545)
USP ndash 25 ID Columna puede ajustarse si la
velocidad lineal es constante
46 mm 30 mm (-35)
46 mm 21 mm (-54)
30 mm 21 mm (-30)
Flow Rate 50
Volumen de Inyeccioacuten
Reducir tanto como se necesitendash
debe cumplir los liacutemites de
deteccioacuten y precisioacuten
Si cambia a una columna maacutes
corta haga el cambio apropiado
en el volumen de inyeccioacuten
Tamantildeo de Partiacutecula Reducir hasta el 50
(no se puede aumentar)
Puede cambiar la longitud de columna y el
tamantildeo de partiacutecula para mantener la misma
Rs
5um 35um (-30)
5um 27um (-46) Cambiado en 22409 ndash Para la copia oficial y actual ir a
httpwwwfdagovScienceResearchFieldSciencedefaulthtm
USP 30 Second Supplement Revisions PF34(5) en proceso
Ver ldquo Stimuli articlerdquo en Pharmacopeial Forum 2009 35(6)
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Comparacioacuten de 46 x 250 mm 5 um con Poroshell
120 EC-C18 46 x 100 mm 27um
min 5 10 15 20 25 30
mAU
0
20
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min 5 10 15 20 25 30
mAU
0
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150
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06
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44
37 45
58
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50
59
20
70
37
Anaacutelisis maacutes raacutepido(columna maacutes corta flujo maacutes alto)
Mayor sensibilidad(partiacutecula maacutes pequentildeapico maacutes estrecho)
Maacutes optimizado (un anaacutelisis maacutes raacutepido permite ajustar mejor)
Ambos anaacutelisis en Agilent 1100 G1315B DAD (bajo 400 bar)
No se requiere cambio en la preparacioacuten de muestra frita de entrada
de 2 micras en ambas columnas
325 bar
110 bar
Sulfadiazina
Sulfatiazol
Sulfapiridina
Sulfamerazina
Sulfametazina
Sulfametazol
Sulfametoxipiridazina
Sulfacloropiridazina
Sulfametoxazol
Sulfadimetoxina
Tiempo B
0 8
33 33
34 33
Columna Eclipse Plus C18
46 x 250mm 5um
Flujo 1 mLmin
Fase Moacutevil
A 01 Aacutecido Foacutermico en Agua
B 01 Aacutecido Foacutermico en ACN
Tiempo B
0 8
12 33
132 33
Columna 46 x 100mm
Poroshell 120 EC-C18
27um
Flujo 185 mLmin
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Comparacioacuten de 46 x 250 mm 5 um con Poroshell
120 EC-C18 46 x 100 mm 27um
min 5 10 15 20 25 30
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37
325 bar
min
Ver condiciones en diapositiva anterior
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Mejor Resolucioacuten
linea base
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Anaacutelisis maacutes raacutepido del meacutetodo USP para pastillas de
Simvastatina en Columnas Poroshell 120ndash Ajuste del meacutetodo
46 x 250 mm 5-um
Agilent ZORBAX Eclipse Plus C18
46 x 75 mm 27-um
Agilent Poroshell 120 EC-C18
65 CH3CN 35 39 gL NaH2PO4 (pH 45) 45 oC Sig = 238 8 Ref = 360 100 nm
Flujos 15 mLmin para la columna de 5-um 28 mLmin para la columna Poroshell 120 27um
Requerimiento
USP
5-um
(15 mLmin)
27-um
(28 mLmin)
TR na 9907 1457
krsquo gt 30 5962 5122
N gt 4500 16939 14439
Tf lt 20 109 110
min 2 4 6 8 10
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min 2
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Ajustes de los parametros cromatograficos en la
transferencia de meacutetodos Escalado del volume de inyeccioacuten
v1 x [(r22 x L2)(r1
2 x L1)] = V2
O bien
v2 = V1 x [(d22 x L2)(d1
2 x L1)]
v volume de inyeccioacuten
r radio de la columna
L longitud de la columna
Ajuste del flujo
F2= F1 x (L2L1 ) x (r2r1 )2
L longitud de la columna
F Flujo
r radio de la columna
Ajuste de la longitud del gradiente
En funcioacuten de la longitud de la columna
L2L1= tg2tg1
En funcioacuten del volumen muerto de columna y del flujo
tG2= tG1 x (V2V1) x (F1F2) t tiempos de gradiente
V volumen muerto de columna
F flujo
Columna ID Volumen muerto aprox
por mm longitud
46mm 100uL
30mm 425uL
21mm 208uL
10mm 047uL
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 54
Notas de Aplicacioacuten en Poroshell 120 y QuEChERS
Determination of Hormones in Shrimp by Agilent 1290 Infinity LC with
Agilent Poroshell 120 LC Column and Agilent QuEChERS for Sample
Preparation (publication 5990-6589EN)
Analysis of Pesticide Residues in Green Tea Using Agilent SampliQ
QuEChERS EN Kit by LCMSMS Detection (publication 5990-
6400EN)
Analysis of Pesticide Residues in Rice Using Agilent Bond Elut
QuEChERS AOAC Kit (publication 5990-8034EN)
Poroshell 120 for pharmaceutical analysis
Poroshell 120 Resources
QuEChERS Applications
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 55
Sumario
bull La columna Poroshell 120 es una nueva alternativa para LC de Alta
Resolucioacuten y Alta Velocidad que puede usarse en cualquier HPLC o UHPLC
bull Con la Poroshell 120 se pueden lograr separaciones de alta eficacia a baja
presioacuten
bull Puede usarse con muestras sucias sin ver una elevacioacuten anormal de la
presioacuten
bull Puede usarse en un meacutetodo USP sin comprometer los Criterios de Ajustes de
Meacutetodo
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Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 56
Soporte Teacutecnico Agilent
Teleacutefono de Atencioacuten al Cliente
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Con una frita de 2 um Poroshell 120 no se bloquea
Muestras Complejas- Plasma
Diflusinal in Plasma
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Injections
Pre
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200000
Eff
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ncy (
N)
End Press
Plates
Columna Poroshell 120 EC-C18 30 x 50mm 27um LC Agilent 1200 RRLC (SL)
Muestra Plasma Precipitado 2 partes Plasma 7 Partes 2080 Agua-MeCN w01 Aacutecido Foacutermico con 1 Parte de Diflusinal en
5050 Agua-MeCN 10 ugml (Concentracion Final Diflusinal 1 ugml) Agitado y dejado reposar 10 minutos
No Centrifugado No Filtrado
Volumen de Inyeccioacuten 1ul
Solvente A Agua w01 TFA
Solvente B MeCN w008 TFA
Flujo 1 mlmin 1 ul inyeccioacuten
Tiempo B
0 20
05 90
06 90
11 20
25 20
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Diflusinal es un anti-inflamatorio no esteroidal anaacutelogo
a la aspirina desarrollado por Merck Sharp amp Dohme
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Las Columnas Superficialmente Porosas Pueden
Usarse cumpliendo los Requirimientos USP
De la lista USP de empaquetamientos de columnas LC 42009
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Criterios de Ajuste de Meacutetodos USP y FDA Criterios de Ajuste de Meacutetodos de Dimensiones de Columna
Paraacutemetro Especificaciones Maacuteximas ComentariosEjemplos
Longitud de Columna 70 250mm 75mm
150mm 50mm
Diaacutemetro Interno de
Columna
25 (FDA ORA-LAB 545)
USP ndash 25 ID Columna puede ajustarse si la
velocidad lineal es constante
46 mm 30 mm (-35)
46 mm 21 mm (-54)
30 mm 21 mm (-30)
Flow Rate 50
Volumen de Inyeccioacuten
Reducir tanto como se necesitendash
debe cumplir los liacutemites de
deteccioacuten y precisioacuten
Si cambia a una columna maacutes
corta haga el cambio apropiado
en el volumen de inyeccioacuten
Tamantildeo de Partiacutecula Reducir hasta el 50
(no se puede aumentar)
Puede cambiar la longitud de columna y el
tamantildeo de partiacutecula para mantener la misma
Rs
5um 35um (-30)
5um 27um (-46) Cambiado en 22409 ndash Para la copia oficial y actual ir a
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USP 30 Second Supplement Revisions PF34(5) en proceso
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Comparacioacuten de 46 x 250 mm 5 um con Poroshell
120 EC-C18 46 x 100 mm 27um
min 5 10 15 20 25 30
mAU
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min 5 10 15 20 25 30
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Anaacutelisis maacutes raacutepido(columna maacutes corta flujo maacutes alto)
Mayor sensibilidad(partiacutecula maacutes pequentildeapico maacutes estrecho)
Maacutes optimizado (un anaacutelisis maacutes raacutepido permite ajustar mejor)
Ambos anaacutelisis en Agilent 1100 G1315B DAD (bajo 400 bar)
No se requiere cambio en la preparacioacuten de muestra frita de entrada
de 2 micras en ambas columnas
325 bar
110 bar
Sulfadiazina
Sulfatiazol
Sulfapiridina
Sulfamerazina
Sulfametazina
Sulfametazol
Sulfametoxipiridazina
Sulfacloropiridazina
Sulfametoxazol
Sulfadimetoxina
Tiempo B
0 8
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Columna Eclipse Plus C18
46 x 250mm 5um
Flujo 1 mLmin
Fase Moacutevil
A 01 Aacutecido Foacutermico en Agua
B 01 Aacutecido Foacutermico en ACN
Tiempo B
0 8
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Columna 46 x 100mm
Poroshell 120 EC-C18
27um
Flujo 185 mLmin
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Comparacioacuten de 46 x 250 mm 5 um con Poroshell
120 EC-C18 46 x 100 mm 27um
min 5 10 15 20 25 30
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325 bar
min
Ver condiciones en diapositiva anterior
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Mejor Resolucioacuten
linea base
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Anaacutelisis maacutes raacutepido del meacutetodo USP para pastillas de
Simvastatina en Columnas Poroshell 120ndash Ajuste del meacutetodo
46 x 250 mm 5-um
Agilent ZORBAX Eclipse Plus C18
46 x 75 mm 27-um
Agilent Poroshell 120 EC-C18
65 CH3CN 35 39 gL NaH2PO4 (pH 45) 45 oC Sig = 238 8 Ref = 360 100 nm
Flujos 15 mLmin para la columna de 5-um 28 mLmin para la columna Poroshell 120 27um
Requerimiento
USP
5-um
(15 mLmin)
27-um
(28 mLmin)
TR na 9907 1457
krsquo gt 30 5962 5122
N gt 4500 16939 14439
Tf lt 20 109 110
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Ajustes de los parametros cromatograficos en la
transferencia de meacutetodos Escalado del volume de inyeccioacuten
v1 x [(r22 x L2)(r1
2 x L1)] = V2
O bien
v2 = V1 x [(d22 x L2)(d1
2 x L1)]
v volume de inyeccioacuten
r radio de la columna
L longitud de la columna
Ajuste del flujo
F2= F1 x (L2L1 ) x (r2r1 )2
L longitud de la columna
F Flujo
r radio de la columna
Ajuste de la longitud del gradiente
En funcioacuten de la longitud de la columna
L2L1= tg2tg1
En funcioacuten del volumen muerto de columna y del flujo
tG2= tG1 x (V2V1) x (F1F2) t tiempos de gradiente
V volumen muerto de columna
F flujo
Columna ID Volumen muerto aprox
por mm longitud
46mm 100uL
30mm 425uL
21mm 208uL
10mm 047uL
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Notas de Aplicacioacuten en Poroshell 120 y QuEChERS
Determination of Hormones in Shrimp by Agilent 1290 Infinity LC with
Agilent Poroshell 120 LC Column and Agilent QuEChERS for Sample
Preparation (publication 5990-6589EN)
Analysis of Pesticide Residues in Green Tea Using Agilent SampliQ
QuEChERS EN Kit by LCMSMS Detection (publication 5990-
6400EN)
Analysis of Pesticide Residues in Rice Using Agilent Bond Elut
QuEChERS AOAC Kit (publication 5990-8034EN)
Poroshell 120 for pharmaceutical analysis
Poroshell 120 Resources
QuEChERS Applications
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Sumario
bull La columna Poroshell 120 es una nueva alternativa para LC de Alta
Resolucioacuten y Alta Velocidad que puede usarse en cualquier HPLC o UHPLC
bull Con la Poroshell 120 se pueden lograr separaciones de alta eficacia a baja
presioacuten
bull Puede usarse con muestras sucias sin ver una elevacioacuten anormal de la
presioacuten
bull Puede usarse en un meacutetodo USP sin comprometer los Criterios de Ajustes de
Meacutetodo
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Teleacutefono de Atencioacuten al Cliente
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Las Columnas Superficialmente Porosas Pueden
Usarse cumpliendo los Requirimientos USP
De la lista USP de empaquetamientos de columnas LC 42009
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Criterios de Ajuste de Meacutetodos USP y FDA Criterios de Ajuste de Meacutetodos de Dimensiones de Columna
Paraacutemetro Especificaciones Maacuteximas ComentariosEjemplos
Longitud de Columna 70 250mm 75mm
150mm 50mm
Diaacutemetro Interno de
Columna
25 (FDA ORA-LAB 545)
USP ndash 25 ID Columna puede ajustarse si la
velocidad lineal es constante
46 mm 30 mm (-35)
46 mm 21 mm (-54)
30 mm 21 mm (-30)
Flow Rate 50
Volumen de Inyeccioacuten
Reducir tanto como se necesitendash
debe cumplir los liacutemites de
deteccioacuten y precisioacuten
Si cambia a una columna maacutes
corta haga el cambio apropiado
en el volumen de inyeccioacuten
Tamantildeo de Partiacutecula Reducir hasta el 50
(no se puede aumentar)
Puede cambiar la longitud de columna y el
tamantildeo de partiacutecula para mantener la misma
Rs
5um 35um (-30)
5um 27um (-46) Cambiado en 22409 ndash Para la copia oficial y actual ir a
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120 EC-C18 46 x 100 mm 27um
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Anaacutelisis maacutes raacutepido(columna maacutes corta flujo maacutes alto)
Mayor sensibilidad(partiacutecula maacutes pequentildeapico maacutes estrecho)
Maacutes optimizado (un anaacutelisis maacutes raacutepido permite ajustar mejor)
Ambos anaacutelisis en Agilent 1100 G1315B DAD (bajo 400 bar)
No se requiere cambio en la preparacioacuten de muestra frita de entrada
de 2 micras en ambas columnas
325 bar
110 bar
Sulfadiazina
Sulfatiazol
Sulfapiridina
Sulfamerazina
Sulfametazina
Sulfametazol
Sulfametoxipiridazina
Sulfacloropiridazina
Sulfametoxazol
Sulfadimetoxina
Tiempo B
0 8
33 33
34 33
Columna Eclipse Plus C18
46 x 250mm 5um
Flujo 1 mLmin
Fase Moacutevil
A 01 Aacutecido Foacutermico en Agua
B 01 Aacutecido Foacutermico en ACN
Tiempo B
0 8
12 33
132 33
Columna 46 x 100mm
Poroshell 120 EC-C18
27um
Flujo 185 mLmin
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Comparacioacuten de 46 x 250 mm 5 um con Poroshell
120 EC-C18 46 x 100 mm 27um
min 5 10 15 20 25 30
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110 bar
5
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17
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37 45
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min
Ver condiciones en diapositiva anterior
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Mejor Resolucioacuten
linea base
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Anaacutelisis maacutes raacutepido del meacutetodo USP para pastillas de
Simvastatina en Columnas Poroshell 120ndash Ajuste del meacutetodo
46 x 250 mm 5-um
Agilent ZORBAX Eclipse Plus C18
46 x 75 mm 27-um
Agilent Poroshell 120 EC-C18
65 CH3CN 35 39 gL NaH2PO4 (pH 45) 45 oC Sig = 238 8 Ref = 360 100 nm
Flujos 15 mLmin para la columna de 5-um 28 mLmin para la columna Poroshell 120 27um
Requerimiento
USP
5-um
(15 mLmin)
27-um
(28 mLmin)
TR na 9907 1457
krsquo gt 30 5962 5122
N gt 4500 16939 14439
Tf lt 20 109 110
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Ajustes de los parametros cromatograficos en la
transferencia de meacutetodos Escalado del volume de inyeccioacuten
v1 x [(r22 x L2)(r1
2 x L1)] = V2
O bien
v2 = V1 x [(d22 x L2)(d1
2 x L1)]
v volume de inyeccioacuten
r radio de la columna
L longitud de la columna
Ajuste del flujo
F2= F1 x (L2L1 ) x (r2r1 )2
L longitud de la columna
F Flujo
r radio de la columna
Ajuste de la longitud del gradiente
En funcioacuten de la longitud de la columna
L2L1= tg2tg1
En funcioacuten del volumen muerto de columna y del flujo
tG2= tG1 x (V2V1) x (F1F2) t tiempos de gradiente
V volumen muerto de columna
F flujo
Columna ID Volumen muerto aprox
por mm longitud
46mm 100uL
30mm 425uL
21mm 208uL
10mm 047uL
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Notas de Aplicacioacuten en Poroshell 120 y QuEChERS
Determination of Hormones in Shrimp by Agilent 1290 Infinity LC with
Agilent Poroshell 120 LC Column and Agilent QuEChERS for Sample
Preparation (publication 5990-6589EN)
Analysis of Pesticide Residues in Green Tea Using Agilent SampliQ
QuEChERS EN Kit by LCMSMS Detection (publication 5990-
6400EN)
Analysis of Pesticide Residues in Rice Using Agilent Bond Elut
QuEChERS AOAC Kit (publication 5990-8034EN)
Poroshell 120 for pharmaceutical analysis
Poroshell 120 Resources
QuEChERS Applications
Agilent Webinar| March 28th 2012 | Page 55
Sumario
bull La columna Poroshell 120 es una nueva alternativa para LC de Alta
Resolucioacuten y Alta Velocidad que puede usarse en cualquier HPLC o UHPLC
bull Con la Poroshell 120 se pueden lograr separaciones de alta eficacia a baja
presioacuten
bull Puede usarse con muestras sucias sin ver una elevacioacuten anormal de la
presioacuten
bull Puede usarse en un meacutetodo USP sin comprometer los Criterios de Ajustes de
Meacutetodo
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Soporte Teacutecnico Agilent
Teleacutefono de Atencioacuten al Cliente
901 11 68 90
email customercare_spainagilentcom
wwwagilentcomchem
![Page 49: Análisis de compuestos farmacéuticos en sangre total · PDF fileReducción en el procesamiento, el envío de la muestra, y los ... Gas flow: 10 L/min Nebulizer: 10 psi Sheath gas](https://reader031.vdocuments.site/reader031/viewer/2022030405/5a7a81727f8b9a0a668b45aa/html5/thumbnails/49.jpg)
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Criterios de Ajuste de Meacutetodos USP y FDA Criterios de Ajuste de Meacutetodos de Dimensiones de Columna
Paraacutemetro Especificaciones Maacuteximas ComentariosEjemplos
Longitud de Columna 70 250mm 75mm
150mm 50mm
Diaacutemetro Interno de
Columna
25 (FDA ORA-LAB 545)
USP ndash 25 ID Columna puede ajustarse si la
velocidad lineal es constante
46 mm 30 mm (-35)
46 mm 21 mm (-54)
30 mm 21 mm (-30)
Flow Rate 50
Volumen de Inyeccioacuten
Reducir tanto como se necesitendash
debe cumplir los liacutemites de
deteccioacuten y precisioacuten
Si cambia a una columna maacutes
corta haga el cambio apropiado
en el volumen de inyeccioacuten
Tamantildeo de Partiacutecula Reducir hasta el 50
(no se puede aumentar)
Puede cambiar la longitud de columna y el
tamantildeo de partiacutecula para mantener la misma
Rs
5um 35um (-30)
5um 27um (-46) Cambiado en 22409 ndash Para la copia oficial y actual ir a
httpwwwfdagovScienceResearchFieldSciencedefaulthtm
USP 30 Second Supplement Revisions PF34(5) en proceso
Ver ldquo Stimuli articlerdquo en Pharmacopeial Forum 2009 35(6)
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Comparacioacuten de 46 x 250 mm 5 um con Poroshell
120 EC-C18 46 x 100 mm 27um
min 5 10 15 20 25 30
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min 5 10 15 20 25 30
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Anaacutelisis maacutes raacutepido(columna maacutes corta flujo maacutes alto)
Mayor sensibilidad(partiacutecula maacutes pequentildeapico maacutes estrecho)
Maacutes optimizado (un anaacutelisis maacutes raacutepido permite ajustar mejor)
Ambos anaacutelisis en Agilent 1100 G1315B DAD (bajo 400 bar)
No se requiere cambio en la preparacioacuten de muestra frita de entrada
de 2 micras en ambas columnas
325 bar
110 bar
Sulfadiazina
Sulfatiazol
Sulfapiridina
Sulfamerazina
Sulfametazina
Sulfametazol
Sulfametoxipiridazina
Sulfacloropiridazina
Sulfametoxazol
Sulfadimetoxina
Tiempo B
0 8
33 33
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Columna Eclipse Plus C18
46 x 250mm 5um
Flujo 1 mLmin
Fase Moacutevil
A 01 Aacutecido Foacutermico en Agua
B 01 Aacutecido Foacutermico en ACN
Tiempo B
0 8
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Columna 46 x 100mm
Poroshell 120 EC-C18
27um
Flujo 185 mLmin
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Comparacioacuten de 46 x 250 mm 5 um con Poroshell
120 EC-C18 46 x 100 mm 27um
min 5 10 15 20 25 30
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min
Ver condiciones en diapositiva anterior
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Mejor Resolucioacuten
linea base
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Anaacutelisis maacutes raacutepido del meacutetodo USP para pastillas de
Simvastatina en Columnas Poroshell 120ndash Ajuste del meacutetodo
46 x 250 mm 5-um
Agilent ZORBAX Eclipse Plus C18
46 x 75 mm 27-um
Agilent Poroshell 120 EC-C18
65 CH3CN 35 39 gL NaH2PO4 (pH 45) 45 oC Sig = 238 8 Ref = 360 100 nm
Flujos 15 mLmin para la columna de 5-um 28 mLmin para la columna Poroshell 120 27um
Requerimiento
USP
5-um
(15 mLmin)
27-um
(28 mLmin)
TR na 9907 1457
krsquo gt 30 5962 5122
N gt 4500 16939 14439
Tf lt 20 109 110
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Ajustes de los parametros cromatograficos en la
transferencia de meacutetodos Escalado del volume de inyeccioacuten
v1 x [(r22 x L2)(r1
2 x L1)] = V2
O bien
v2 = V1 x [(d22 x L2)(d1
2 x L1)]
v volume de inyeccioacuten
r radio de la columna
L longitud de la columna
Ajuste del flujo
F2= F1 x (L2L1 ) x (r2r1 )2
L longitud de la columna
F Flujo
r radio de la columna
Ajuste de la longitud del gradiente
En funcioacuten de la longitud de la columna
L2L1= tg2tg1
En funcioacuten del volumen muerto de columna y del flujo
tG2= tG1 x (V2V1) x (F1F2) t tiempos de gradiente
V volumen muerto de columna
F flujo
Columna ID Volumen muerto aprox
por mm longitud
46mm 100uL
30mm 425uL
21mm 208uL
10mm 047uL
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Notas de Aplicacioacuten en Poroshell 120 y QuEChERS
Determination of Hormones in Shrimp by Agilent 1290 Infinity LC with
Agilent Poroshell 120 LC Column and Agilent QuEChERS for Sample
Preparation (publication 5990-6589EN)
Analysis of Pesticide Residues in Green Tea Using Agilent SampliQ
QuEChERS EN Kit by LCMSMS Detection (publication 5990-
6400EN)
Analysis of Pesticide Residues in Rice Using Agilent Bond Elut
QuEChERS AOAC Kit (publication 5990-8034EN)
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Sumario
bull La columna Poroshell 120 es una nueva alternativa para LC de Alta
Resolucioacuten y Alta Velocidad que puede usarse en cualquier HPLC o UHPLC
bull Con la Poroshell 120 se pueden lograr separaciones de alta eficacia a baja
presioacuten
bull Puede usarse con muestras sucias sin ver una elevacioacuten anormal de la
presioacuten
bull Puede usarse en un meacutetodo USP sin comprometer los Criterios de Ajustes de
Meacutetodo
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Comparacioacuten de 46 x 250 mm 5 um con Poroshell
120 EC-C18 46 x 100 mm 27um
min 5 10 15 20 25 30
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min 5 10 15 20 25 30
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Anaacutelisis maacutes raacutepido(columna maacutes corta flujo maacutes alto)
Mayor sensibilidad(partiacutecula maacutes pequentildeapico maacutes estrecho)
Maacutes optimizado (un anaacutelisis maacutes raacutepido permite ajustar mejor)
Ambos anaacutelisis en Agilent 1100 G1315B DAD (bajo 400 bar)
No se requiere cambio en la preparacioacuten de muestra frita de entrada
de 2 micras en ambas columnas
325 bar
110 bar
Sulfadiazina
Sulfatiazol
Sulfapiridina
Sulfamerazina
Sulfametazina
Sulfametazol
Sulfametoxipiridazina
Sulfacloropiridazina
Sulfametoxazol
Sulfadimetoxina
Tiempo B
0 8
33 33
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Columna Eclipse Plus C18
46 x 250mm 5um
Flujo 1 mLmin
Fase Moacutevil
A 01 Aacutecido Foacutermico en Agua
B 01 Aacutecido Foacutermico en ACN
Tiempo B
0 8
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Columna 46 x 100mm
Poroshell 120 EC-C18
27um
Flujo 185 mLmin
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Comparacioacuten de 46 x 250 mm 5 um con Poroshell
120 EC-C18 46 x 100 mm 27um
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Ver condiciones en diapositiva anterior
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Mejor Resolucioacuten
linea base
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Anaacutelisis maacutes raacutepido del meacutetodo USP para pastillas de
Simvastatina en Columnas Poroshell 120ndash Ajuste del meacutetodo
46 x 250 mm 5-um
Agilent ZORBAX Eclipse Plus C18
46 x 75 mm 27-um
Agilent Poroshell 120 EC-C18
65 CH3CN 35 39 gL NaH2PO4 (pH 45) 45 oC Sig = 238 8 Ref = 360 100 nm
Flujos 15 mLmin para la columna de 5-um 28 mLmin para la columna Poroshell 120 27um
Requerimiento
USP
5-um
(15 mLmin)
27-um
(28 mLmin)
TR na 9907 1457
krsquo gt 30 5962 5122
N gt 4500 16939 14439
Tf lt 20 109 110
min 2 4 6 8 10
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Ajustes de los parametros cromatograficos en la
transferencia de meacutetodos Escalado del volume de inyeccioacuten
v1 x [(r22 x L2)(r1
2 x L1)] = V2
O bien
v2 = V1 x [(d22 x L2)(d1
2 x L1)]
v volume de inyeccioacuten
r radio de la columna
L longitud de la columna
Ajuste del flujo
F2= F1 x (L2L1 ) x (r2r1 )2
L longitud de la columna
F Flujo
r radio de la columna
Ajuste de la longitud del gradiente
En funcioacuten de la longitud de la columna
L2L1= tg2tg1
En funcioacuten del volumen muerto de columna y del flujo
tG2= tG1 x (V2V1) x (F1F2) t tiempos de gradiente
V volumen muerto de columna
F flujo
Columna ID Volumen muerto aprox
por mm longitud
46mm 100uL
30mm 425uL
21mm 208uL
10mm 047uL
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Notas de Aplicacioacuten en Poroshell 120 y QuEChERS
Determination of Hormones in Shrimp by Agilent 1290 Infinity LC with
Agilent Poroshell 120 LC Column and Agilent QuEChERS for Sample
Preparation (publication 5990-6589EN)
Analysis of Pesticide Residues in Green Tea Using Agilent SampliQ
QuEChERS EN Kit by LCMSMS Detection (publication 5990-
6400EN)
Analysis of Pesticide Residues in Rice Using Agilent Bond Elut
QuEChERS AOAC Kit (publication 5990-8034EN)
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Sumario
bull La columna Poroshell 120 es una nueva alternativa para LC de Alta
Resolucioacuten y Alta Velocidad que puede usarse en cualquier HPLC o UHPLC
bull Con la Poroshell 120 se pueden lograr separaciones de alta eficacia a baja
presioacuten
bull Puede usarse con muestras sucias sin ver una elevacioacuten anormal de la
presioacuten
bull Puede usarse en un meacutetodo USP sin comprometer los Criterios de Ajustes de
Meacutetodo
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120 EC-C18 46 x 100 mm 27um
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Ver condiciones en diapositiva anterior
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linea base
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Anaacutelisis maacutes raacutepido del meacutetodo USP para pastillas de
Simvastatina en Columnas Poroshell 120ndash Ajuste del meacutetodo
46 x 250 mm 5-um
Agilent ZORBAX Eclipse Plus C18
46 x 75 mm 27-um
Agilent Poroshell 120 EC-C18
65 CH3CN 35 39 gL NaH2PO4 (pH 45) 45 oC Sig = 238 8 Ref = 360 100 nm
Flujos 15 mLmin para la columna de 5-um 28 mLmin para la columna Poroshell 120 27um
Requerimiento
USP
5-um
(15 mLmin)
27-um
(28 mLmin)
TR na 9907 1457
krsquo gt 30 5962 5122
N gt 4500 16939 14439
Tf lt 20 109 110
min 2 4 6 8 10
mAU
0
5
10
15
20
25
30
35
40
min 2
mAU
0
5
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25
30
35
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Ajustes de los parametros cromatograficos en la
transferencia de meacutetodos Escalado del volume de inyeccioacuten
v1 x [(r22 x L2)(r1
2 x L1)] = V2
O bien
v2 = V1 x [(d22 x L2)(d1
2 x L1)]
v volume de inyeccioacuten
r radio de la columna
L longitud de la columna
Ajuste del flujo
F2= F1 x (L2L1 ) x (r2r1 )2
L longitud de la columna
F Flujo
r radio de la columna
Ajuste de la longitud del gradiente
En funcioacuten de la longitud de la columna
L2L1= tg2tg1
En funcioacuten del volumen muerto de columna y del flujo
tG2= tG1 x (V2V1) x (F1F2) t tiempos de gradiente
V volumen muerto de columna
F flujo
Columna ID Volumen muerto aprox
por mm longitud
46mm 100uL
30mm 425uL
21mm 208uL
10mm 047uL
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Notas de Aplicacioacuten en Poroshell 120 y QuEChERS
Determination of Hormones in Shrimp by Agilent 1290 Infinity LC with
Agilent Poroshell 120 LC Column and Agilent QuEChERS for Sample
Preparation (publication 5990-6589EN)
Analysis of Pesticide Residues in Green Tea Using Agilent SampliQ
QuEChERS EN Kit by LCMSMS Detection (publication 5990-
6400EN)
Analysis of Pesticide Residues in Rice Using Agilent Bond Elut
QuEChERS AOAC Kit (publication 5990-8034EN)
Poroshell 120 for pharmaceutical analysis
Poroshell 120 Resources
QuEChERS Applications
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Sumario
bull La columna Poroshell 120 es una nueva alternativa para LC de Alta
Resolucioacuten y Alta Velocidad que puede usarse en cualquier HPLC o UHPLC
bull Con la Poroshell 120 se pueden lograr separaciones de alta eficacia a baja
presioacuten
bull Puede usarse con muestras sucias sin ver una elevacioacuten anormal de la
presioacuten
bull Puede usarse en un meacutetodo USP sin comprometer los Criterios de Ajustes de
Meacutetodo
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Soporte Teacutecnico Agilent
Teleacutefono de Atencioacuten al Cliente
901 11 68 90
email customercare_spainagilentcom
wwwagilentcomchem
![Page 52: Análisis de compuestos farmacéuticos en sangre total · PDF fileReducción en el procesamiento, el envío de la muestra, y los ... Gas flow: 10 L/min Nebulizer: 10 psi Sheath gas](https://reader031.vdocuments.site/reader031/viewer/2022030405/5a7a81727f8b9a0a668b45aa/html5/thumbnails/52.jpg)
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Simvastatina en Columnas Poroshell 120ndash Ajuste del meacutetodo
46 x 250 mm 5-um
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46 x 75 mm 27-um
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65 CH3CN 35 39 gL NaH2PO4 (pH 45) 45 oC Sig = 238 8 Ref = 360 100 nm
Flujos 15 mLmin para la columna de 5-um 28 mLmin para la columna Poroshell 120 27um
Requerimiento
USP
5-um
(15 mLmin)
27-um
(28 mLmin)
TR na 9907 1457
krsquo gt 30 5962 5122
N gt 4500 16939 14439
Tf lt 20 109 110
min 2 4 6 8 10
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0
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30
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0
5
10
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20
25
30
35
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transferencia de meacutetodos Escalado del volume de inyeccioacuten
v1 x [(r22 x L2)(r1
2 x L1)] = V2
O bien
v2 = V1 x [(d22 x L2)(d1
2 x L1)]
v volume de inyeccioacuten
r radio de la columna
L longitud de la columna
Ajuste del flujo
F2= F1 x (L2L1 ) x (r2r1 )2
L longitud de la columna
F Flujo
r radio de la columna
Ajuste de la longitud del gradiente
En funcioacuten de la longitud de la columna
L2L1= tg2tg1
En funcioacuten del volumen muerto de columna y del flujo
tG2= tG1 x (V2V1) x (F1F2) t tiempos de gradiente
V volumen muerto de columna
F flujo
Columna ID Volumen muerto aprox
por mm longitud
46mm 100uL
30mm 425uL
21mm 208uL
10mm 047uL
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Preparation (publication 5990-6589EN)
Analysis of Pesticide Residues in Green Tea Using Agilent SampliQ
QuEChERS EN Kit by LCMSMS Detection (publication 5990-
6400EN)
Analysis of Pesticide Residues in Rice Using Agilent Bond Elut
QuEChERS AOAC Kit (publication 5990-8034EN)
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Poroshell 120 Resources
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bull La columna Poroshell 120 es una nueva alternativa para LC de Alta
Resolucioacuten y Alta Velocidad que puede usarse en cualquier HPLC o UHPLC
bull Con la Poroshell 120 se pueden lograr separaciones de alta eficacia a baja
presioacuten
bull Puede usarse con muestras sucias sin ver una elevacioacuten anormal de la
presioacuten
bull Puede usarse en un meacutetodo USP sin comprometer los Criterios de Ajustes de
Meacutetodo
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L longitud de la columna
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L longitud de la columna
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r radio de la columna
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En funcioacuten de la longitud de la columna
L2L1= tg2tg1
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tG2= tG1 x (V2V1) x (F1F2) t tiempos de gradiente
V volumen muerto de columna
F flujo
Columna ID Volumen muerto aprox
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Preparation (publication 5990-6589EN)
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