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MARIANA UCZAY

ANÁLISES DE QUALIDADE DA ÁGUA DO SISTEMA DO AQUÍFERO GUARANI E

BIOMARCADORES DE GENOTOXICIDADE E ESTRESSE OXIDATIVO EM

Danio rerio

Dissertação apresentada ao Programa Multicêntrico

de Pós Graduação em Bioquímica e Biologia

Molecular, da Universidade do Estado de Santa

Catarina como requisito parcial para obtenção do

grau de Mestre em Bioquímica e Biologia

Molecular.

Orientadora: Carla Ivane Ganz Vogel

LAGES

2018

MARIANA UCZAY

ANÁLISES DE QUALIDADE DA ÁGUA DO SISTEMA DO AQUÍFERO GUARANI E

BIOMARCADORES DE GENOTOXICIDADE E ESTRESSE OXIDATIVO EM

Danio rerio

Dissertação apresentada ao Programa Multicêntrico de Pós Graduação em Bioquímica e

Biologia Molecular, da Universidade do Estado de Santa Catarina como requisito parcial para

obtenção do grau de Mestre em Bioquímica e Biologia Molecular.

Banca examinadora:

________________________________________

Professora Doutora Carla Ivane Ganz Vogel

Universidade do Estado de Santa Catarina

_______________________________________

Professora Doutora Dinara Jaqueline Moura

Universidade Federal de Ciências da Saúde de Porto Alegre

_______________________________________

Professora Doutora Karim Hanh Luckmann


______________________________________

Suplente: Professor Doutor Luiz Cláudio Miletti


LAGES, 09/08/2018.

AGRADECIMENTOS

À minha querida orientadora professora Dra. Carla Ivane Ganz Vogel que sempre se

mostrou prestativa, desde a primeira vez que conversamos! Obrigada por acreditar em mim,

por todos os ensinamentos, por ter paciência comigo durante os experimentos e no processo

de escrita da dissertação, e por sempre se preocupar comigo em todos os aspectos da minha

vida.

Ao meu pai Sérgio e mãe Diolisete que sempre me apoiaram durante a minha

caminhada acadêmica!

Ao meu irmão Juliano e cunhada Charlene, pela infinita paciência pra ler tudo o que

eu escrevi desde o início do meu mestrado, pela ajuda com as análises e por estarem sempre

do meu lado.

Ao meu namorado Rômulo cuja ajuda e apoio foram imprescindíveis para a realização

deste trabalho, obrigada por ficar do meu lado até (principalmente) nos piores momentos, pela

compreensão, carinho e amizade.

A todos os meus colegas de laboratório, embora trabalhássemos em áreas totalmente

diferentes sempre me deram apoio durante os experimentos e me ajudaram, muito obrigada

pelo convívio, amizade e parceria, levo no coração todos vocês.

Aos meus queridos amigos: Lina, Mari, Carol, Leo, Anderson, Gabi, Fran e Rê, que

foram minha família nos dois anos que passei em Lages.

Ao querido estagiário Lucas, que nunca mediu esforços para me ajudar durante a

realização dos experimentos, muito obrigada.

Aos professores do PMBqBM Luiz Cláudio Miletti, Gustavo Felippe da Silva, Maria

de Lourdes Magalhães e Karim Hahn Lüchmann por todos os ensinamentos passados.

Ao laboratório de Psicultura da UDESC, principalmente ao professor Thiago El Hadi

Fabregat pelo espaço cedido no laboratório para a realização dos experimentos.

Ao pessoal do Laboratório de Genética Toxicológica da Universidade de Ciências da

Saúde de Porto Alegre (UFCSPA) pela ajuda com as análises das enzimas;

À Universidade do Estado de Santa Catarina por abrir suas portas para meus estudos e

a todo pessoal da pela boa disposição e ajuda em cada momento.

À CAPES, FAPESC, ANA e Caixa Econômica Federal que proporcionaram recursos

que financiaram minha bolsa e as análises presentes neste trabalho.

Aos peixes que deram a sua vida pelo pequeno progresso científico que este trabalho

proporcionou!

A todas as mulheres da ciência, que dentro de seus laboratórios e salas de aula mesmo

sem recursos, sem equipamentos, sem incentivo e sem reconhecimento, ainda lutam para que

a pesquisa prospere e possa trazer um pouco de avanço técnico-cientifico em nosso país!

“Cada pessoa deve trabalhar para o seu aperfeiçoamento e,

ao mesmo tempo, participar da responsabilidade coletiva

por toda a humanidade.”

― Marie Curie

RESUMO

Atividades antrópicas geram uma quantidade significativa de poluentes que são lançados

diariamente ao ambiente. Entre os xenobiontes presentes nos ecossistemas aquáticos,

inúmeros compostos químicos e orgânicos possuem um potencial oxidativo e genotóxico. As

quantificações de danos celulares e defesas antioxidantes podem ser usadas como

biomarcadores de contaminação aquática. Neste trabalho utilizou-se uma abordagem ampla de

biomonitoramento da qualidade da água em dois locais da região serrana de Santa Catarina

pertencentes ao Sistema do Aquífero Guarani. Um local de água subterrânea localizado no

interior do município de Ponte Alta, SC; e outro de água superficial coletada no Rio Caveiras,

em Lages, SC. Foram realizadas análises físico-químicas de qualidade da água e bioensaios

com Danio rerio para avaliação de genotoxicidade e estresse oxidativo. Realizaram-se quatro

experimentos de 28 dias cada, dois realizados com água subterrânea coletada em agosto e

dezembro de 2017; e dois com água superficial coletada em outubro de 2017 e fevereiro de

2018. O grupo controle foi mantido em água proveniente do laboratório de psicultura. As

análises de água foram realizadas no início de cada experimento. A cada sete dias do período

experimental 18 peixes, nove por tratamento (exposto e controle), foram eutanasiados para

coleta de sangue e músculo lateral. O sangue foi utilizado para realizaçãos do ensaio cometa

padrão e modificado com as enzimas Foraminopirimidina glicosilase (FPG) e Endonuclease

III (ENDO III) e teste do micronúcleo; enquanto o músculo lateral foi utilizado para

quantificar as enzimas catalase (CAT), superóxido dismutase (SOD), e analisar níveis de

Peroxidação lipídica (LPO). Em todos os experimentos observou-se baixa qualidade da água

coletada, Ponte Alta apresentou níveis acima dos permitidos de manganês e fósforo. Já a água

do Rio Caveiras apresentou ferro e manganês em concentrações aumentadas em relação ao

prevista na regulamentação. Nos bioensaios, observou-se um aumento na indução de danos ao

DNA nos animais expostos a essas amostras de água, apontando para um potencial efeito

genotóxico da água. O ensaio cometa modificado com as enzimas de restrição indicou baixo

dano oxidativo ao DNA, induzido pela água coletada. Não se observaram diferença entre os

grupos com relação à enzima SOD, porém CAT apresentou diferenças em relação ao grupo

controle. Os níveis de Peroxidação lipídica dos animais expostos não diferiram em relação ao

grupo contole em nenhum dos bioensaios realizados. A baixa qualidade hidrológica observada

pode ter levado a alterações na atividade da CAT, e potenciais danos ao DNA, observados nos

bioensaios com zebrafish.

Palavras chave: Zebrafish. Qualidade da Água. Sistema do Aquífero Guarani. Ensaio

Cometa. Estresse Oxidativo.

ABSTRACT

Antropic activities generate a significant amount of pollutants that are released daily into the

environment. Among the xenobionts present in aquatic ecosystems, numerous chemical and

organic compounds have an oxidative and genotoxic potential. Quantifications of cell damage

and antioxidant defenses can be used as biomarkers of aquatic contamination. In this work a

wide approach of water quality biomonitoring was used in two sites of the Santa Catarina

region belonging to the Guarani Aquifer System. A groundwater site located in Ponte Alta,

SC; and another of surface water collected in Caveiras River, in Lages, SC. Physico-chemical

analyzes of water quality and bioassays were carried out with Danio rerio for evaluation of

genotoxicity and oxidative stress. Four experiments of 28 days each were performed, two with

groundwater collected in August and December 2017; and two with surface water collected in

October 2017 and February 2018. The control group was kept in water from the pisciculture

laboratory. Water analysis was performed at the beginning of each experiment. Every seven

days of the experimental period, 18 fish, nine per treatment (exposed and control), were

euthanized for blood and lateral muscle collection. The blood was used to perform the

standard and modified comet assay with the enzymes Foraminopyrimidine glycosylase (FPG)

and Endonuclease III (ENDO III) and micronucleus test; while the lateral muscle was used to

quantify the catalase (CAT), superoxide dismutase (SOD) enzymes, and to analyze lipid

peroxidation (LPO) levels. In all the experiments, it was observed low quality of the water

collected, Ponte Alta presented levels above those of manganese and phosphorus. Water from

Caveiras River presented iron and manganese in concentrations increased in relation to the

one foreseen in the regulation. In the bioassays, an increase in the induction of DNA damage

was observed in the animals exposed to these water samples, pointing to a potential genotoxic

effect of the water. The comet assay modified with the restriction enzymes indicated low

oxidative DNA damage, induced by the collected water. No difference was observed between

the groups with respect to the SOD enzyme, but CAT presented differences in relation to the

control group. The levels of lipid peroxidation in exposed animals did not differ in relation to

the contole group in any of the bioassays performed. The observed low hydrological quality

may have led to changes in CAT activity, and potential DNA damage, observed in zebrafish

bioassays.

Key words: Zebrafish. Water Quality. Guarani Aquifer System. Comet Assay. Oxidative

Stress.

LISTA DE FIGURAS

Figura 1 - Abrangência do Sistema do Aquífero Guarani (SAG) .......................................... 23

Figura 2 - Esquema representativo da Bacia hidrográfica do Rio Caveiras. .......................... 25

Figura 3 - O teleósteo zebrafish (Danio rerio). ...................................................................... 27

Figura 4 - Representação dos danos às principais biomoléculas causados, ou não por

xenobiontes. ........................................................................................................... 32

Figura 5 - Esquema do processo de lipoperoxidação ............................................................. 33

Figura 6 - Caracterização do ponto de coleta de água subterrânea proveniente do Aquífero

Guarani, localizado no interior do município de Ponte Alta, SC, Brasil. .............. 40

Figura 7 - Caracterização do ponto de coleta de água superficial no ponto BR-2, localizado

no Rio Caveiras, em Lages, SC, Brasil. ................................................................. 41

Figura 8 - Esquema da forma de coleta de músculo lateral em zebrafish. ............................. 43

Figura 9 - Atividade de SOD/mg de proteína encontrados em músculos de zebrafish

expostos à água de Ponte Alta coletada em agosto de 2017. ................................. 51

Figura 10 - Atividade de CAT/mg de proteína encontrados em músculos de zebrafish

expostos à água de Ponte Alta. .............................................................................. 52

Figura 11 - Níveis de dano ao DNA encontrados em eritrócitos de zebrafish expostos à água

proveniente do Aquífero Guarani, dado pelo Software Comet Imager 2.2 da

Metasystem ®. ....................................................................................................... 53

Figura 12 - Efeito genotóxico em eritrócitos de zebrafish expostos à água de Ponte Alta,

medido por ensaio cometa padrão. ........................................................................ 54

Figura 13 - Níveis de oxidação de purinas encontrados em eritrócitos de zebrafish expostos à

água de Ponte Alta ................................................................................................. 55

Figura 14 - Níveis de oxidação de pirimidinas encontrados em eritrócitos de zebrafish

expostos à água Ponte Alta coletada em dezembro de 2017. ................................ 55

Figura 15 - Frequência de micronúcleos encontrados em eritrócitos de zebrafish expostos á

água coletada em Ponte Alta, SC, Brasil. .............................................................. 56

Figura 16 - Nmol de MDA/mg de proteína em músculos de zebrafish exposto a água coletada

em Ponte Alta em agosto e dezembro de 2017. ..................................................... 57

Figura 17 - Atividade de SOD/mg de proteína encontrados em zebrafish expostos à água do

Rio Caveiras coletada em fevereiro de 2018. ....................................................... 60

Figura 18 - Atividade de CAT/mg de proteína encontrados em zebrafish expostos à água do

Rio Caveiras........................................................................................................ 61

Figura 19 - Efeito genotóxico da exposição de zebrafish à água do Rio Caveiras medido por

ensaio cometa padrão. ............................................................................................ 62

Figura 20 - Níveis de purinas oxidadas encontrados em eritrócitos de zebrafish expostos à

água do Rio Caveiras. ............................................................................................ 63


expostos à água do Rio Caveiras. .......................................................................... 64

Figura 22 - Frequência de micronúcleos encontradas em eritrócitos de zebrafish expostos á

água coletada no Ponto Br-2 do Rio Caveiras em Lages, SC, Brasil. ................... 65

Figura 23 - Lâmina de eritrócitos de Danio rerio, a seta indicando célula com micronúcleo.

............................................................................................................................... 65

Figura 24 - Nmol de MDA/mg de proteína em músculos de zebrafish expostos a água

coletada em Ponte Alta em outubro de 2017 e fevereiro de 2018. ........................ 66

LISTA DE TABELAS

Tabela 1- Delineamento dos experimentos realizados........................................................... 42

Tabela 2 - Resultados das análises de água referentes à água subterrânea coletada no ponto

localizado no interior do município de Ponte Alta, SC, Brasil. ............................. 50

Tabela 3 - Correlação de Pearson. Experimento realizado com água coletada em Ponte Alta,

SC, Brasil em agosto de 2017. ............................................................................... 57

Tabela 4 - Correlação de Pearson Experimento realizado com água coletada em Ponte Alta,

SC, Brasil em dezembro de 2017. ......................................................................... 58

Tabela 5.- Resultados das análises de água referentes ao ponto de coleta Ponto BR - 2,

localizado no Rio Caveiras, em Lages, SC, Brasil. ............................................... 59

Tabela 6 - Correlação de Pearson. Experimento realizado com água coletada no Rio

Caveiras, em Lages, SC, Brasil em outubro de 2017. ........................................... 67


Caveiras, em Lages, SC, Brasil em fevereiro de 2018. ......................................... 67

LISTA DE ABREVIATURAS

8-oxoG 8-oxo-7,8-diidro-2'-deoxiguanosina

AG Aquífero Guarani

BER Reparo por excisão de bases

BSA Soroalbumina bovina

CAT Catalase

CT Coliformes termotolerantes

DNA Ácido desoxirribonucleico

DTT Dithiothreitol

EC Ensaio cometa

EDTA Ácido etilenodiamino tetra-acético

ENDO III Endonuclease III

EROs Espécies reativas de oxigênio

FPG Foramino pirimidina glicosilase

G6PDH Glicose 6-fosfato desidrogenase

GR Glutationa reduzida

LMP Baixo ponto de fusão

LPO Lipoperoxidação

KCl Cloreto de Potássio

MDA Malondialdeído

MN Micronúcleo

NaCl Cloreto de Sódio

NaOH Hidróxido de Potássio

NER Reparo por Excisão de nucleotídeo

NMP Ponto de fusão normal

SAG Sistema do Aquífero Guarani

SOD Superóxido Dismutase

SST Sólidos Suspensos totais

STD Sólidos dissolvidos totais

SFB Soro fetal bovino

pH Potencial hidrogeniônico

PMSF Phenilmetilsulfonil fluoride

SUMÁRIO

1 INTRODUÇÃO ........................................................................................................... 21

2 REFERENCIAL TEÓRICO ..................................................................................... 23

2.1 O AQUÍFERO GUARANI ........................................................................................... 23

2.2 O RIO CAVEIRAS ....................................................................................................... 25

2.3 ZEBRAFISH (Danio rerio) ........................................................................................... 26

2.4 BIOMARCADORES DE CONTAMINAÇÃO AQUÁTICA ..................................... 28

2.5 DANOS OXIDATIVOS ............................................................................................... 29

2.6 SISTEMAS ANTIOXIDANTES EM PEIXES ............................................................ 30

2.7 PEROXIDAÇÃO LIPÍDICA ....................................................................................... 32

2.8 DANOS AO DNA ........................................................................................................ 34

3 OBJETIVO GERAL .................................................................................................. 37

3.1 OBJETIVOS ESPECÍFICOS ....................................................................................... 37

4 MATERIAIS E MÉTODOS ...................................................................................... 38

4.1 ANÁLISES DE ÁGUA ................................................................................................ 39

4.2 PONTOS DE COLETA DE ÁGUA PARA OS BIOENSAIOS COM ZEBRAFISH .. 39

4.3 MANUTENÇÃO DOS PEIXES UTILIZADOS NOS EXPERIMENTOS ................. 41

4.4 CONDIÇÕES EXPERIMENTAIS E DELINEAMENTO ........................................... 42

4.5 COLETAS DE AMOSTRAS PARA ANÁLISES LABORATORIAIS ...................... 43

4.6.1 Catalase ........................................................................................................................ 44

4.6.2 Superóxido Dismutase ................................................................................................ 44

4.6.3 Determinação de proteínas ........................................................................................ 45

4.7 BIOMARCADOR DE DANO LIPÍDICO ................................................................... 45

4.7.1 TBARS ......................................................................................................................... 45

4.8 BIOMARCADORES DE GENOTOXICIDADE ........................................................ 46

4.8.1 Ensaio cometa .............................................................................................................. 46

4.8.2 Teste do micronúcleo .................................................................................................. 47

4.9 ANÁLISES ESTATÍSTICAS ...................................................................................... 47

5 RESULTADOS ........................................................................................................... 48

5.1 PONTE ALTA – ÁGUA SUBTERRÂNEA ................................................................ 49

5.1.1 Análises de água .......................................................................................................... 49

5.1.2 Superóxido dismutase ................................................................................................. 51

5.1.3 Catalase ........................................................................................................................ 51

5.1.4 Ensaio cometa .............................................................................................................. 52


5.1.6 TBARS ......................................................................................................................... 56

5.1.7 Análises de correlação ................................................................................................ 57

5.2 RIO CAVEIRAS – ÁGUA SUPERFICIAL ................................................................. 58

5.2.1 Análises de água – Rio Caveiras ................................................................................ 58

5.2.2 Superóxido dismutase ................................................................................................. 60

5.2.3 Catalase ........................................................................................................................ 60

5.2.4 Ensaio cometa .............................................................................................................. 61


5.2.6 TBARS ......................................................................................................................... 66

5.2.7 Análises de correlação ................................................................................................ 66

6 DISCUSSÃO ............................................................................................................... 69

6.1 PONTE ALTA – ÁGUA SUBTERRÂNEA ............................................................... 69

5.2 RIO CAVEIRAS – ÁGUA SUPERFICIAL ................................................................ 71

5.3 ANÁLISES DE CORRELAÇÃO ................................................................................. 75

7 CONCLUSÕES ........................................................................................................... 77

REFERÊNCIAS .......................................................................................................... 79

ANEXO A – Certificado da Comissão de Ética no Uso de Animais .................................. 93

ANEXO B – Concentrações de metais encontrados em três pontos de coleta pertencentes

ao estudo .................................................................................................................. 94

ANEXO C – Artigo com as análises prévias de qualidade de água ................................... 95

21

1 INTRODUÇÃO

Os ecossistemas de água doce estão sob intensa pressão antropogênica e, como

consequência, a disponibilidade de água potável está diminuindo e o equilíbrio do ecossistema

também está se deteriorando (JOVANOVIĆ et al., 2018). Unindo o rápido crescimento

populacional, com as falhas na construção de grandes cidades, observam-se muitos problemas

de poluição, em destaque estão os ambientes aquáticos próximos aos grandes centros urbanos

(OSÓRIO et al., 2013), dos quais provêm os recursos hídricos distribuídos para a população.

Na água, a interação entre contaminantes pode ocorrer e o impacto de tais sistemas

complexos sobre os organismos pode ter efeito diferente de um único contaminante. Muitos

poluentes químicos estão presentes no meio aquático em baixas concentrações, no entanto,

isso não significa que esses compostos não poderão interagir com os outros (JOVANOVIĆ et

al., 2018), causando aumento em sua toxicidade. Alguns desses poluentes podem alterar os

níveis de defesas antioxidantes e/ou interagir com a molécula de DNA, levando a danos no

DNA que podem levar a mutações (MACCUBIN; ERSING; FRANK, 1991). Efeitos

genotóxicos podem ocorrer frente à exposição de concentrações muito baixas de diferentes

substâncias, podendo afetar a reprodução, a vida embrionária, desenvolvimento, crescimento

e sobrevivência de organismos, ter relação com a carcinogênese, defeitos hereditários,

mutações e patologias de fundo genético (AL-SABTI; METCALFE, 1995).

Considerando a contaminação das águas superficiais, e em consequência das águas

subterrâneas, torna-se necessário um maior conhecimento das características físico-químicas

das águas, bem como seu potencial genotóxico e de indução de estresse oxidativo, visando à

certificação da segurança em seu consumo, e possibilitar, num segundo momento,

intervenções diretas no sentido de recuperação dessas áreas.

23

2 REFERENCIAL TEÓRICO

2.1 O AQUÍFERO GUARANI

O Sistema do Aquífero Guarani (SAG) (Figura 1) é um dos principais sistemas

aquíferos do mundo e a maior reserva subterrânea de água doce da América do Sul

(SCHEIBE; HIRATA, 2008). Ocupa uma área de 1,2 milhões de km² na Bacia do Paraná e

parte da Bacia do Chaco-Paraná. Estende-se por quatro países: Brasil (840.000 km²), Paraguai

(58.500 km²), Uruguai (58.500 km²) e Argentina (255.000 km²) (QUEIROZ et al., 2009). Sua

maior ocorrência se dá em território brasileiro (2/3 da área total) abrangendo os estados de

Goiás, Mato Grosso do Sul, Minas Gerais, São Paulo, Paraná, Santa Catarina e Rio Grande do

Sul (OLIVEIRA; VIEIRA, 2010).

Figura 1- Abrangência do Sistema do Aquífero Guarani (SAG)

Fonte: Síntese Hidrogeológica do Sistema Aquífero Guarani (2009).

24

As formações geológicas que constituem o SAG datam de cerca de 130 milhões de

anos e no Brasil compreendem a Formação Piramboia, correspondendo à porção basal, e a

Formação Botucatu, o topo (GOMES, 2008). A característica de confinamento do SAG se dá

devido à presença de camadas constituídas por rochas basálticas, da Formação Serra Geral,

que ocorrem superpondo as camadas que compõem o Sistema e, também, de rochas

sedimentares de baixa permeabilidade (BARBOSA et al., 2011).

A utilização de águas subterrâneas tem sido uma alternativa viável e crescente,

principalmente em regiões onde as águas superficiais têm sofrido com poluição ou escassez

(BARBOSA et al., 2011). A viabilidade da utilização desse recurso é decorrente de algumas

de suas características, tais como a abundância das águas subterrâneas, sendo cerca de 100

vezes mais abundantes que águas superficiais, além de que as águas subterrâneas apresentam

a vantagem de não necessitarem de graus elevados de tratamento prévio para o consumo

(GOMES, 2008).

As áreas de afloramento (ou de recarga) do aquífero no Brasil compreendem mais de

100.000 km2 e são áreas onde a água das chuvas infiltra para as camadas profundas do solo,

atingindo a zona saturada (QUEIROZ et al., 2009), segundo Sheibe e Hirata (2008) a zona de

recarga, apresenta maior vulnerabilidade a contaminações antrópicas que sua porção

subterrânea. Os principais fatores de risco, que podem comprometer a qualidade das águas

subterrâneas são a ocupação antrópica desordenada das áreas de afloramento, por meio da

utilização indiscriminada de defensivos agrícolas e efluentes industriais (MAZZOLLI;

EHRHARDT-BROCARDO, 2013).

Uma vez que as áreas de afloramento do SAG constituem-se de terrenos naturalmente

vulneráveis à eventual infiltração de contaminantes e que existe uma crescente utilização

dessas áreas para as atividades agrícolas, faz-se necessário uma avaliação regional do perigo

de contaminação do SAG relacionado ao desenvolvimento dessas atividades.

No Estado de Santa Catarina o SAG surge como uma importante alternativa de

abastecimento público. Nesse Estado o Aquífero encontra-se recoberto, em quase toda sua

extensão, por rochas da Formação Serra Geral e pequenas faixas aflorantes, na borda da Serra

Geral, que constituem áreas de alta vulnerabilidade à contaminação, necessitando de

monitoramento e controle (ZANATA; COITINHO, 2002).

O município de Lages tem seu território inteiramente inserido na Região Hidrográfica

4 - Planalto de Lages, que é a maior Região Hidrográfica em extensão do Estado de Santa

Catarina com 22.787 km², constituída pelas bacias hidrográficas do Rio Canoas, que

25

corresponde à maior bacia hidrográfica estadual (15.510 km²) e do Rio Pelotas (7.277 km²).

Os corpos d´água que cortam o seu território são o Rio Carahá, Rio Caveiras, Rio Lava Tudo,

Rio Pelotinhas, Rio Pelotas e Rio Canoas (SDS, 2006).

2.2 O RIO CAVEIRAS

Com uma área aproximada de 2400 km2 e 130 km de extensão a Bacia Hidrográfica

do Rio Caveiras (Figura 2) está situada na região serrana de Santa Catarina, sendo a segunda

maior sub-bacia da Bacia Hidrográfica do Rio Canoas. O rio recebe os efluentes industriais de

uma cervejaria e efluentes urbanos da cidade Lages, principalmente através dos rios Ponte

Grande (24km2) e Carahá (30 km

2) (RAFAELI NETO, 1994).

Figura 2 - Esquema representativo da Bacia hidrográfica do Rio Caveiras.

Fonte: Rafaeli Neto et al (2013).

Segundo Rafaeli Neto et al. (2013), a qualidade das águas na bacia hidrográfica do Rio

Caveiras está mais comprometida em um trecho de 70 km, o qual se inicia com o ponto de

captação de água que abastece a cidade de Lages. Poluentes, como os despejados pelos Rios

26

Carahá e Ponte Grande no Rio Caveiras, se estiverem presentes na água de superfície podem

atingir o Aquífero Guarani, visto que são áreas de afloramento e recarga do SAG, onde, dado

as reduzidas velocidades de reação e deslocamento, podem permanecer por longos períodos

(MARTINS, 2004).

A água dos rios pode conter misturas de poluentes de várias fontes e segundo Nunes et

al. (2011) a ação tóxica de cada amostra pode variar de acordo com a sensibilidade do ensaio

realizado, portanto, o uso de diferentes bioensaios permite a detecção de um espectro mais

amplo de substâncias que podem ter efeitos negativos sobre a biota. Tendo em vista que o Rio

Caveiras faz parte do SAG, e a intensa vulnerabilidade das áreas de recarga do Aquífero,

percebe-se a importância do monitoramento da qualidade da água desse local, e da

necessidade de se intensificar os estudos ecotoxicológicos da área.

2.3 ZEBRAFISH (Danio rerio)

Grande parte da bibliografia encontrada coloca os peixes como excelentes

bioindicadores de genotoxicidade ambiental, pois respondem aos agentes xenobióticos de

forma similar aos mamíferos e podem ser usados para avaliar a presença de substâncias que

são prejudiciais aos seres humanos (PARLAK, 2018). Além disso, podem ser utilizados em

testes a campo, ou em experimentos conduzidos em laboratório, dessa forma, uma infinidade

de compostos pode ser testada quanto ao potencial teratogênico ou carcinogênico (BRITO;

DA LUZ, 2015).

Peixes são organismos bioconcentradores, pois diversos contaminantes mesmo em

baixas concentrações podem afetar sua fisiologia e capacidade de sobrevivência (GRISOLIA

et al., 2009). Os peixes também podem ser utilizados para indicar o potencial de exposição

das populações humanas a genotóxicos químicos, sendo considerado um dos maiores vetores

de transferência de contaminantes para humanos (AL-SABTI; METCALFE, 1995). Recentes

estudos demonstram a importância da utilização de peixes como bioindicadores (BÜCKER;

CONCEIÇÃO, 2012; HUSSAIN et al., 2017), muitos deles utilizando zebrafish

(FAßBENDER; BRAUNBECK, 2013; GÜLSOY; YAVAŞ; MUTLU, 2015; SATHYA et al.,

2015), consequentemente, esses são organismos de grande confiabilidade para testes de

ecotoxicidade.

O zebrafish (Danio rerio) (Figura 3) é um pequeno peixe de água doce tropical

vertebrado, que pertence à família Cyprinidae e é originalmente do continente asiático

27

(SPENCE et al., 2008). O surgimento deste novo modelo animal e seu crescente uso em

pesquisa é devido às várias características vantajosas do zebrafish em relação a outros

modelos de vertebrados (WILSON; BUNTE; CARTY, 2009). São várias as vantagens

atribuídas à espécie, entre elas, a alta fecundidade, o rápido desenvolvimento, transparência

óptica durante a embriogênese, baixo custo, facilidade de manutenção no laboratório, sua

capacidade de absorver compostos dissolvidos em água. Além disso, possui extensa

homologia de seu genoma com de outras espécies de vertebrados, como os humanos, que

apresentam cerca de 70% dos genes em comum com o zebrafish (HOWE et al., 2013). A

utilização do zebrafish é justificada em função de recentes descobertas que o tornaram modelo

para estudos em biossegurança (GOLDSMITH; JOBIN, 2012).

O zebrafish vem sendo o modelo utilizado em pesquisas com vários compostos, testes

de segurança com fármacos, avaliação de riscos ambientais e toxicidade durante o

desenvolvimento (ALI; AALDERS; RICHARDSON, 2014). Desta maneira, as características

do zebrafish tornam a espécie em um modelo experimental interessante para a avaliação da

toxidade de ambientes aquáticos, podendo ser utilizado na avaliação da qualidade de água do

presente estudo.

Figura 3 - O teleósteo zebrafish (Danio rerio).

Fonte: Elaborado pela autora, 2017.

28

2.4 BIOMARCADORES DE CONTAMINAÇÃO AQUÁTICA

É praticamente impossível o monitoramento de todos os contaminantes aquáticos

sejam eles de origem humana ou natural. No entanto, é possível submeter de diferentes

formas plantas, animais e outros seres vivos a xenobióticos tóxicos e analisar suas respostas

metabólicas com o uso de diferentes tipos de biomarcadores. Segundo Peakall (1994)

biomarcadores podem ser definidos como uma resposta biológica a um, ou vários produtos

químicos, que dá uma medida de exposição e, às vezes, também, de efeito tóxico. Forbes;

Palmqvist; Bach (2006) consideram biomarcadores como indicadores bioquímicos,

fisiológicos ou histológicos de exposição ou efeitos de produtos químicos xenobióticos.

Os objetivos da utilização de biomarcadores são de utilizá-los para indicar que os

organismos foram ou estão sendo expostos a certos produtos químicos ou que os organismos

estão sofrendo ou provavelmente sofrerão futuros danos de relevância ecológica. No contexto

da avaliação de risco ecológico, um papel para os biomarcadores foi identificado tanto em

avaliações específicas do local quanto em programas regionais de biomonitoramento

(RODRIGUES, 2015).

São conhecidos dois tipos de biomarcadores: de efeito e de exposição. Os

biomarcadores de exposição são aqueles que indicam que ocorreu a exposição e que o

poluente está biodisponível (AMORIM, 2003). A resposta pode ser devida aos poluentes ou

aos metabolitos resultantes da interação dos poluentes com compostos endógenos nos órgãos

do organismo. Por outro lado, os biomarcadores de efeitos indicam alterações em níveis

bioquímicos, fisiológicos ou genéticos e dependendo da magnitude podem provocar danos ou

enfermidades, estes biomarcadores podem revelar o sitio alvo dos poluentes. Portanto, os

biomarcadores de exposição e efeito são uma parte fundamental nas análises das relações

entre os poluentes no meio ambiente, na incorporação pelos organismos e na ação tóxica ou

efeito sobre eles mesmos. Biomarcadores de exposição, e efeito são necessários para ligar a

presença de poluentes no ambiente com a sua ação em um organismo (JHA, 2008).

A contaminação por metais, e agrotóxicos é comum em ambientes aquáticos. Os níveis

desses agentes tóxicos nos ecossistemas aquáticos geralmente são monitorados por métodos

químicos, como espectrometria de massa, por exemplo. Embora essas técnicas permitam

medições diretas e precisas de concentrações de substâncias tóxicas no meio ambiente, elas

não podem revelar muito sobre a toxicidade dos contaminantes em organismos vivos

(REDEKER; BERVOETS; BLUST, 2004), especialmente em relação aos efeitos combinados

29

quando organismos aquáticos são expostos a múltiplos agentes tóxicos simultaneamente

(ZHU et al., 2006).

Efluentes podem possuir uma vasta variedade de poluentes, como hidrocarbonetos

aromáticos policíclicos, bifenis policlorados, pesticidas organoclorados e organofosforados,

metais entre outros (MARTINEZ-ALVAREZ; MORALES; SANZ, 2005). A maioria desses

compostos possuem potencial oxidante, tornando as células suscetíveis a danos por espécies

reativas de oxigênio (EROs) (WINSTON; DI GIULIO, 1991), logo, a quantificação de danos

oxidativos e os níveis de defesas contra danos celulares, têm o potencial de serem usados

como biomarcadores de contaminação aquática (AHMAD; PACHECO; SANTOS, 2006;

FUNES et al., 2006).

2.5 DANOS OXIDATIVOS

O oxigênio é uma molécula utilizada tanto na produção de energia através da cadeia

transportadora de elétrons na mitocôndria e em inúmeras vias metabólicas fundamentais. Ao

mesmo tempo, o consumo de oxigênio é capaz de gerar substâncias tóxicas a nível intracelular e

extracelular, criando então o chamado “paradigma do oxigênio”, devido ao balanço existente entre

suas vantagens e desvantagens (PRUCHNIAK; ARAZNA; DEMKOW, 2015).

O oxigênio pode levar à formação de espécies altamente reativas, as quais são

chamadas de espécies reativas de oxigênio (EROs) (HALLIWELL; GUTTERIDGE, 2007),

são exemplos o ânion superóxido e o radical hidroxil. A produção de EROs é estimulada pelo

organismo, em condições de estresse, sendo a poluição aquática o maior contribuinte ao

estresse oxidativo em peixes (AHMAD; PACHECO; SANTOS, 2006). O estresse oxidativo é

definido como um desbalanço entre a produção de EROs e os níveis das defesas antioxidantes

(HALLIWELL; GUTTERIDGE, 2007). O desequilíbrio entre essas duas frações pode

potencialmente levar a danos celulares no nível molecular, uma vez que os oxidantes são

formados em uma taxa diferente como um produto normal do metabolismo aeróbico,

mecanismos bioquímicos complexos são necessários para regular todo esse processo

fundamental (PRUCHNIAK; ARAZNA; DEMKOW, 2015).

A maioria das EROs são espécies radicalares, ou seja, átomos, moléculas ou íons que

possuem um ou mais elétrons não pareados em seus orbitais externos, o que as torna reativas,

sendo capazes de se combinar inespecificamente com diversas moléculas integrantes das

estruturas celulares e derivadas de cada uma delas (HALLIWELL; GUTTERIDGE, 2007). As

EROs em geral são formadas por reações redox ou por processos de catálise enzimática

30

(SLATER, 1984). ERO é um termo frequentemente usado para incluir também espécies que

não são radicalares como, por exemplo, o peróxido de hidrogênio (H2O2) (HALLIWELL;

GUTTERIDGE, 2007).

As EROs podem reagir com macromoléculas biológicas (Figura 4) como lipídios e

produzir a peroxidação lipídica (LPO), danos ao DNA e oxidação de proteínas, resultando no

estresse oxidativo (MONTEIRO et al., 2006). A exposição a substâncias tóxicas ambientais,

como poluição, radiação e pesticidas, também pode contribuir para o estabelecimento dessa

condição em sistemas biológicos (XU et al., 2017; ZEPEDA-ARCE et al., 2017). O dano ao

DNA também é um efeito importante, resultante da exposição à xenobiontes, e pode estar

relacionado à sua capacidade de desregular as defesas antioxidantes e induzir estresse

oxidativo (CHAUFAN; COALOVA; RIOS DE MOLINA, 2014; DE CASTILHOS; GHISI;

CESTARI 2013).

2.6 SISTEMAS ANTIOXIDANTES EM PEIXES

A convivência harmoniosa dos seres aeróbicos com os efeitos deletérios do oxigênio

deve-se principalmente ao desenvolvimento de mecanismos de defesa antioxidantes altamente

especializados. Halliwell e Gutteridge (2007) definiram os antioxidantes como substâncias

capazes de, em concentrações relativamente baixas, competirem com outros substratos

oxidativos e assim evitar ou inibir a sua oxidação. Devido aos efeitos danosos das espécies

reativas de oxigênio (EROs), todas as células mantêm sistemas de defesas antioxidantes. As

EROs atuam como moléculas sinalizadoras, estimulando respostas de defesa nas células e

podendo desempenhar um papel fundamental no combate a uma ampla gama de doenças

(KRAVCUKOVA et al., 2009).

Enzimas em organismos vivos são as principais substâncias envolvidas no

metabolismo e na desintoxicação de compostos xenobióticos, sendo sensíveis a substâncias

estranhas. Uma vez que os agentes tóxicos entram em um organismo, eles frequentemente

aumentam ou diminuem imediatamente as atividades enzimáticas correspondentes. Portanto,

as enzimas têm sido utilizadas como um dos importantes biomarcadores da poluição

ambiental em estudos de toxicologia ecológica (MOORE et al., 2004).

Os peixes possuem os dois sistemas de defesa endógena: enzimático e não enzimático

(GUERRIERO; DI FINIZIO; GARCIA, 2002). O sistema enzimático é composto por

enzimas, como por exemplo, a superóxido dismutase (SOD), catalase (CAT) e glutationa

31

peroxidase (GPx), e por enzimas auxiliadoras, como a glutationa redutase (GR), a glicose-6-

fosfato desidrogenase (G6PDH) e a glutationa S-transferase (GsT).

Como uma metaloenzima presente em uma ampla gama de seres vivos (uma enzima

antioxidante de primeira ordem), a SOD reduz o dano oxidativo no tecido convertendo o O2−

(ânion superóxido) em H2O2 (peróxido de hidrogênio) (CHAKRABORTY et al., 2007). A

atividade da SOD nas células está diretamente envolvida na resposta a fatores estressores, e

também pode estar envolvida na adesão celular e sinalização molecular em plantas (PRICE et

al., 1994).

Como uma enzima tetramérica contendo um grupo heme (uma enzima antioxidante de

segunda ordem), a CAT realiza a decomposição de H2O2 em O2

(oxigênio molecular) e H2O

(água). Essas duas enzimas desempenham um papel central na proteção do tecido contra as

EROs (RAJESWARI; PALIWAL, 2008). A enzima CAT é amplamente distribuída em

tecidos biológicos e uma das enzimas mais importantes envolvidas na defesa contra o estresse

oxidativo em vertebrados e invertebrados (GOYAL; BASAK, 2010).

SOD e CAT são amplamente utilizadas como biomarcadores de poluição aquática. Os

programas de monitoramento aquático frequentemente empregam esses biomarcadores

bioquímicos como uma útil ferramenta para avaliação ecotoxicológica. As enzimas

antioxidantes são úteis na avaliação da resposta de um organismo à contaminação ambiental

devido à sua rápida taxa de resposta e sensibilidade na detecção de uma ampla gama de

contaminantes (FITZPATRICK et al., 1997)

32

Figura 4 - Representação dos danos às principais biomoléculas causados ou não por

xenobiontes.

Fonte: Adaptado de Nordberg; Arner (2001).

Os xenobiontes que estão presentes no ambiente aquático, podem induzir a formação de EROs, como por

exemplo o ânion superóxido. As enzimas antioxidantes, como a SOD, por sua vez tem função de neutralizar os

danos causados pelas EROs. Caso as enzimas sofram alterações em sua produção, e o aumento das espécies

reativas seja exacerbado, essas EROs podem vir a danificar as principais biomoléculas (lipídios, proteínas e

DNA).

2.7 PEROXIDAÇÃO LIPÍDICA

O processo de oxidação de lipídios é denominado peroxidação lipídica ou

lipoperoxidação (LPO), constitui o maior evento decorrente do estresse oxidativo de lipídios

poliinsaturados em membranas celulares. A peroxidação lipídica é um processo complexo que

envolve a formação e propagação de radicais lipídicos, a captação de oxigênio, um rearranjo

das ligações duplas em lipídios insaturados e a eventual destruição de lipídios de membrana,

produzindo uma variedade de produtos de degradação, incluindo álcoois, cetonas, aldeídos e

éteres (BUEGE; AUST, 1975). O processo geral da peroxidação lipídica consiste em três

estágios: iniciação, propagação e terminação (ESTERBAUER; SCHAUR; ZOLLNER, 1991)

(Figura 5).

33

Figura 5 - Esquema do processo de lipoperoxidação

Fonte: Halliwell; Gutteridge (2007).

A abstração de átomos de hidrogênio de um ácido graxo poliinsaturado (neste esquema representado por três

ligações duplas) leva à formação de um dieno conjugado (ligações simples intercaladas por ligações duplas) por

rearranjo molecular. Esta molécula pode sofrer o ataque de oxigênio, formando um radical peroxil. Este radical

pode continuar o ciclo de lipoperoxidação através da abstração de átomos de hidrogênio de cadeias

poliinsaturadas próximas, transformando-se em um peróxido lipídico.

O começo desta reação geralmente ocorre através da abstração de átomo hidrogênio de

um grupo metileno pelo ataque de uma molécula reativa, como ERO, metais, ou outros

radicais livres, formando um radical de carbono. Este, por sua vez, realizará um rearranjo

molecular, formando um dieno conjugado, o qual pode reagir com moléculas de oxigênio,

formando um radical peroxil (BUEGE; AUST, 1975).

A partir da formação deste radical ocorre a fase de propagação, devido à sua capacidade

de abstrair átomos de hidrogênio de outros grupos metilenos de cadeias adjacentes

(transformando-se em um peróxido lipídico). Estes sofrerão processos de rearranjo molecular,

formação de dienos conjugados e, posteriormente, ataque de moléculas de oxigênio, formando

um novo ROO•. Este novo ROO• reinicia o processo, gerando uma reação oxidativa em

cadeia (CATALÁ, 2006). A formação de endoperóxidos lipídicos, em ácidos graxos

insaturados, contendo pelo menos 3 ligações duplas interrompidas por metileno pode levar à

formação de malondialdeído (MDA) como um produto de decomposição (BUEGE; AUST,

1975).

O malondialdeído (MDA) é um dos vários produtos finais de baixo peso molecular

formado através da decomposição de produtos primários e secundários de peroxidação

lipídica. Em pH baixo e temperatura elavada, o MDA participa prontamente da reação de

34

adição nucleofílica com o ácido 2-tiobarbitúrico (TBA), gerando uma coloração vermelha.

Esses fatos, juntamente com a disponibilidade de métodos fáceis e sensíveis para quantificar o

MDA levaram ao uso rotineiro da determinação de MDA e, particularmente, o teste TBARS

(teste das substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico) para detectar e quantificar a

peroxidação lipídica em uma ampla variedade de tipos de amostra (JANERO, 1990).

2.8 DANOS AO DNA

O ácido desoxirribonucleico (DNA) é um importante alvo do dano causado pelo

aumento de EROs nas células. Os efeitos causados pelo dano ao DNA afetam o sinal da

transdução, a proliferação celular, apoptose e a comunicação intercelular. O DNA é uma

molécula muito estável, mas pode sofrer decomposição espontânea durante seu tempo de

vida, sendo que o estresse oxidativo pode acelerar o dano ao DNA, levando a quebra da fita

do DNA.

As EROs estão envolvidas com processos de envelhecimento, desenvolvimento de

câncer, mutações e morte celular, através de alterações químicas, tanto nas bases

nitrogenadas, na ribose do DNA e na quebra de suas ligações. A espécie reativa de oxigênio

com maior capacidade de causar danos ao DNA é o radical hidroxila (PRUCHNIAK;

ARAZNA; DEMKOW, 2015). Ele tem a capacidade de adicionar ligações duplas nas bases

heterocíclicas de DNA, assim como, de abstrair hidrogênio da base nitrogenada timina e de

cada um dos carbonos da desoxirribose.

São usadas diversas técnicas para medir os níveis de danos oxidativos no DNA,

desenvolvido inicialmente por Singh et al. (1988) o Ensaio Cometa (EC), “Single Cell Gel

Electrophoresis”, é uma técnica rápida e eficiente quando usada para quantificar as lesões e

detectar os efeitos do reparo no DNA em células individualizadas de mamíferos. Essa

metodologia apresenta algumas vantagens sobre os testes bioquímicos e citogenéticos, entre

as quais a utilização de um pequeno número de células que não necessariamente estejam em

divisão. Essa técnica permite também analisar o nível de dano no DNA de diferentes células

de um mesmo indivíduo, determinando quais órgãos/tecidos são mais afetados pelo agente

agressor (MUTHUSAMY et al., 2017).

O princípio da técnica é simples: as células são inclusas em gel sobre uma lâmina de

microscopia, faz-se passar uma corrente elétrica e, como o DNA tem carga negativa, se

estiver rompido, migra para fora do núcleo, ficando com a aparência de um cometa ou cauda.

35

O DNA que não estiver rompido ou quebrado fica armazenado no núcleo, sendo muito grande

para migrar. Quanto mais fragmentado estiver o DNA, maior será a cauda.

O ensaio de cometa em condições neutras permite a detecção de quebras de fita dupla

de DNA, o que é mais relevante para a exposição à radiação ionizante (WANG et al., 2013).

Na variante neutra, a molécula de DNA é preservada como uma estrutura de cadeia dupla que

leva à detecção de quebras de fita dupla no DNA (ZHAO et al., 2013). Na variante alcalina do

método, a etapa de desnaturação em pH 13 permite revelar, simultaneamente, quebras de

DNA de dupla e de fita única, bem como locais abásicos, o que leva à suposição de que o

ensaio alcalino é muito mais sensível em comparação com sua variante neutra na detecção de

danos no DNA (MUTHUSAMY et al., 2017).

Estudos mais recentes dizem respeito à adoção do ensaio cometa enzimático, com um

passo a mais após a lise de digestão com endonucleases reparadoras específicas. Modificações

no ensaio cometa alcalino usando endonucleases específicas podem detectar bases de DNA

com danos oxidativos (MUTHUSAMY et al., 2017). Quando associado à glicosilases de

reparo de DNA, como a Formamidopirimidina-DNA glicosilase (FPG) de Escherichia coli e a

endonuclease III de E. coli (ENDO III) que reconhecem purinas e pirimidinas modificadas,

respectivamente, o método permite a detecção de danos oxidativos nas bases (COLLINS et

al., 1996), e é possível usar o ensaio cometa modificado para medir níveis muito baixos de

danos no DNA.

Dentre os métodos para investigação de toxicidade genética in vivo, além do ensaio

cometa, o teste de micronúcleo (MN) tem sido amplamente empregado e aceito pelas agências

reguladoras e comunidade científica (MATEUCA et al., 2006). O teste do micronúcleo

detecta alterações genômicas ou/e dano ao aparato mitótico, sendo os micronúcleos

indicativos de perdas irreversíveis de DNA (VALADARES; CASTRO; CUNHA, 2007). Os

micronúcleos se formam pela extrusão de cromossomos inteiros ou seus fragmentos durante a

divisão celular, sendo uma porção de cromatina resultante de mitoses aberrantes.

Hooftman e De Raat (1982), tomando por base o teste do micronúcleo desenvolvido

por Schmid (1975) para células da medula óssea de camundongos, introduziram-no nos

estudos de células sanguíneas de peixes mantidos em laboratório. Esta modificação do teste

original passou a ser conhecida como Piscine Micronucleus Test (CARRASCO; TILBURY;

MYERS, 1990).

Hoje, tanto o teste do micronúcleo quanto o do cometa estão sendo extensivamente

usados em conjunto no monitoramento do ambiente aquático e com peixes como

bioindicadores (BÜCKER; CONCEIÇÃO, 2012; FAβBENDER; BRAUNBECK, 2013;

36

GÜLSOY; YAVAŞ; MUTLU, 2015; SATHYA et al., 2015). Enquanto o teste MN detecta

danos não reparáveis, como lesões clastogênicas e aneugênicas, o ensaio cometa detecta

lesões recentes que podem ser reparadas, como quebras e locais álcali-lábeis (MATSUMOTO

et al., 2006)

37

3 OBJETIVO GERAL

Realizar análises-físico químicas de qualidade da água subterrânea e superficial de

dois pontos de coleta pertencentes ao Sistema do Aquífero Guarani, verificando sua influência

sobre os biomarcadores de genotoxicidade e estresse oxidativo em zebrafish (Danio rerio).

3.1 OBJETIVOS ESPECÍFICOS

Os objetivos específicos do presente trabalho são:

a) verificar parâmetros físico-químicos e biológicos da qualidade da água nos dois

pontos de coleta;

b) verificar a fragmentação do DNA de Danio rerio submetidos a águas oriundas do

Aquífero Guarani pelo Ensaio Cometa;

b) quantificar oxidação de purinas e pirimidinas pelo ensaio cometa enzimático,

modificado com as enzimas ENDO III e FPG;

c) avaliar a taxa de micronúcleos em eritrócitos de Danio rerio submetidos à água

proveniente do Aquífero Guarani;

d) avaliar biomarcadores de estresse oxidativo em Danio rerio submetido à água

coletada, como CAT, SOD;

e) quantificar níveis de peroxidação lipídica em Danio rerio.

39

4 MATERIAIS E MÉTODOS

4.1 ANÁLISES DE ÁGUA

As análises de água foram realizadas no Laboratório de Tratamento de Água e

Resíduos (LABTRAT) da Universidade do Estado de Santa Catarina (UDESC). A

Universidade com o apoio do CISAMA (Consórcio Intermunicipal Serra Catarinense) elencou

seis propriedades rurais, que apresentam dificuldades com relação ao abastecimento de água,

situadas na região serrana de Santa Catarina: Pátria Livre, Rio Rufino, Cerro Baio, Anita

Garibaldi, Ponte Alta (Caravággio) e Urubici. Foram realizadas duas coletas de água prévias,

nessas propriedades, a fim de elencar as que apresentavam maiores inconformidades com a

Portaria MS nº 2.914/2011 que dispõe sobre os procedimentos de controle e de vigilância da

qualidade da água para consumo humano e seu padrão de potabilidade. As análises de

qualidade de água do Rio Caveiras começaram após essas análises preliminares.

As amostras foram coletadas seguindo as recomendações do guia nacional de coleta e

preservação de amostras da Agência Nacional de Águas (ANA, 2011). Os parâmetros físico-

químicos e biológicos utilizados para a avaliação da água foram selecionados em função do

uso e ocupação do solo no entorno da bacia, sendo estes: pH, cor, turbidez, sólidos suspensos

totais (SST), sólidos totais dissolvidos (STD), nitrato, nitrito, amônia, condutividade, sulfato,

cloro residual livre, ferro, alumínio, cloreto, dureza, alcalinidade, manganês, fósforo total, e

coliformes termotolerantes (CT).

Todos os parâmetros em questão foram mensurados em duplicatas, seguindo as

normas propostas pelo Standard Methods for the Examination of Water and Wastewater

(RICE et al., 2005) e utilizando-se os espectrofotômetros Nova 60 Merck e Pharo 300 Merck.

Coliformes termotolerantes foram identificados e medidos utilizando a técnica de filtragem

por membrana e posterior incubação a 44,5ºC em meio mFC (ágar coliformes fecais) água e

ácido rosólico como indicador. As análises de pH, sólidos totais dissolvidos e condutividade

foram realizadas em um pHmêtro da marca HOMIS.

4.2 PONTOS DE COLETA DE ÁGUA PARA OS BIOENSAIOS COM ZEBRAFISH

Para os experimentos com zebrafish, foram escolhidos dois pontos, o primeiro na

localidade de Caravaggio, localidade que apresentou grande desconformidade com a portaria

MS nº 2.914/2011, na cidade de Ponte Alta-SC (Latitute 27°24'22.5"S Longitude

40

50°22'52.7"W) onde foi coletada água subterrânea (Figura 6). O segundo local escolhido foi

no Rio Caveiras em um ponto denominado Ponte BR-2 (Latitude 27°52'48.40"S e Longitude

50°22'56.59"O), local onde há uma área de afloramento do Aquífero Guarani e que está a

jusante dos Rios Ponte Grande e Carahá, que despejam, no Rio Caveiras, esgotos e dejetos

oriundos da cidade de Lages-SC, onde coletou-se água superficial (Figura 7).

Figura 6 - Caracterização do ponto de coleta de água subterrânea proveniente do Aquífero

Guarani, localizado no interior do município de Ponte Alta, SC, Brasil.

Fonte: Google maps. https://www.google.com.br/maps/place/Pte.+Alta+-+SC/@-27.4163499,-50.5644484,10z

/data=!3m1!4b1!4m5!3m4!1s0x94e068be4378ce1f:0xb158e7e9161f33cc!8m2!3d-27.4844293!4d-50.3779495

41

Figura 7 - Caracterização do ponto de coleta de água superficial no ponto BR-2, localizado

no Rio Caveiras, em Lages, SC, Brasil.


4.3 MANUTENÇÃO DOS PEIXES UTILIZADOS NOS EXPERIMENTOS

Os experimentos com zebrafish foram desenvolvidos no laboratório de piscicultura nas

instalações do Centro de Ciências Agroveterinárias da Universidade do Estado de Santa

Catarina, em Lages, Santa Catarina, Brasil. O presente trabalho foi aprovado pela Comissão

de Ética no Uso de Animais da Universidade do Estado de Santa Catarina (CEUA/UDESC),

sob nº 8337300816 (ANEXO 1).

Os exemplares de zebrafish (Danio rerio) utilizados na pesquisa foram adquiridos de

empresa local especializada, sendo de sexo misto, com idade de seis a doze meses. Os peixes

foram mantidos no laboratório de piscicultura em uma densidade de dois peixes por litro de

água, em um fotoperíodo de 12 horas luz e 12 horas escuro, em aquários de vidro, contendo

aeração constante e termostato para controle de temperatura. Os animais foram alimentados

duas vezes ao dia, com ração comercial, marca Alcon. Foi realizada a limpeza e remoção de

sujidades (fezes e resto de ração) por meio de sifonagem diariamente, com renovação de água

de aproximadamente 5-10% do volume total do aquário, para manutenção dos parâmetros de

qualidade de água.

42

4.4 CONDIÇÕES EXPERIMENTAIS E DELINEAMENTO

Ao todo foram realizados quatro experimentos, utilizando noventa peixes (Tabela 1),

que foram divididos em dois aquários, sendo um de água controle, e outro de água coletada

nos pontos pré-estabelecidos, onde coletou-se aproximadamente 100 litros de água em

bombonas de polipropileno que foram levadas até o laboratório de pisicultura para realizar a

exposição dos peixes. No Rio Caveiras, a água superficial foi coletada com ajuda de baldes,

cerca de dois metros da margem do Rio. A água de Ponte Alta foi coletada em bombonas de

prolipropileno, direto da caixa d’água onde é armazenada para distribuição. Os experimentos

foram realizados em quatro períodos distintos (Agosto de 2017; Setembro de 2017; Dezembro

de 2017 e Março de 2018).

Os peixes inicialmente foram mantidos por quinze dias em período de aclimatação e

em seguida por vinte e oito dias em período experimental. Os peixes tanto do grupo controle

quanto do grupo teste, foram mantidos em temperatura de 27,10 º C (±1,4º), com aeração

mecânica constante. Os níveis de amônia (0 ppm) e pH (7,8 ± 0,3) mantiveram-se

semelhantes nos dois grupos. Os animais do grupo controle foram mantidos em água

proveniente do laboratório de piscicultura, que têm seus parâmetros de qualidade da água

avaliados mensalmente. Os animais do tratamento exposto foram mantidos por vinte e um

dias na água coletada nos diferentes pontos analisados e em seguida, no vigésimo segundo

dia, colocados na água controle, para avaliação de sua recuperação após os efeitos da água.

Tabela 1- Delineamento dos experimentos realizados.

AGO/2017 SET/2017 DEZ/2017 MAR/2018

Dias

Controle

(n)

AG (n)

Controle

(n)

Rio

Caveiras

(n)

Controle

(n) AG (n)

Controle

(n)

Rio

Caveiras (n)

0 9 9 9 9 9 9 9 9

7 9 9 9 9 9 9 9 9

14 9 9 9 9 9 9 9 9

21 9 9 9 9 9 9 9 9

28 9 9 9 9 9 9 9 9


43

4.5 COLETAS DE AMOSTRAS PARA ANÁLISES LABORATORIAIS

Os procedimentos de coleta ocorreram a cada sete dias (0, 7, 14, 21, 28), onde nove

peixes por tratamento foram anestesiados em solução tamponada com tricaína (168 mg/L; pH

7,0) e eutanasiados em dose letal de tricaína metano sulfato (0,6 mg/mL; 27°C ±0,5; pH 7,0 a

7,4) (MATTHEWS; VARGA, 2012), para posterior coleta de amostras de sangue e do

músculo dorso-lateral. O sangue foi coletado através de uma incisão entre a nadadeira caudal

e anal, e aspirado com uma micropipeta com ponteira contendo EDTA. Foram realizados três

pools de sangue por tratamento, cada pool foi composto pelo sangue de três peixes, 5 μL de

cada pool foram diluídos em 495 μL de soro fetal bovino (SFB) em microtubos, totalizando

três pools analisados por tratamento.

Após a coleta de sangue foi realizado um teste de viabilidade celular com azul de

trypan, esse método baseia-se na observação de que células viáveis são impermeáveis ao

referido corante, ao passo que as células não viáveis apresentam permeabilidade, devido à

formação de poros na membrana, o que permite a penetração do corante e assim as células

não viáveis exibem coloração azul após tratamento (STROBER, 2001), só foram utilizadas

amostras com mais de 80% de viabilidade celular contadas em câmara de Neubauer.

Imediatamente após a coleta foram realizados o ensaio cometa e teste do micronúcleo. Para

coleta de músculo inicialmente a pele foi retirada (Figura 8), em seguida com o auxílio de um

bisturi o músculo lateral foi removido. O ensaio cometa, teste do micronúcleo e teste de

substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico (TBARS) foram realizados no laboratório de

Bioquímica e Biologia Molecular (CAV-UDESC). Já os experimentos para medir os níveis

das enzimas CAT e SOD foram realizados no Laboratório de Genética Toxicológica da

Universidade Federal de Ciências da saúde de Porto Alegre.

Figura 8 - Esquema da forma de coleta de músculo lateral em zebrafish.

Fonte: Gupta & Mullins, 2010.

44

4.6 DEFESAS ANTIOXIDANTES ENZIMÁTICAS

As amostras de músculos foram pesadas e separou-se 100 mg de músculo para as

análises, homogeneizadas com 500 µL de tampão de homogeneização, contendo TRIS (50

mM), KCl (0,15 M), PMSF (1 M) e DTT (1mM). Em seguida as amostras foram

centrifugadas a 9000 g por trinta minutos a 4º C, o sobranadante foi pipetado e alicotado em

três microtubos, e armazenado em ultrafreezer até o momento da análise.

4.6.1 Catalase

A alta velocidade de reação desta enzima, associada a uma baixa afinidade, permite a

determinação de sua atividade com concentrações elevadas de H2O2 (10 mM). A atividade da

enzima catalase foi determinada pela velocidade de consumo da H2O2 no primeiro minuto da

reação, 240nm (AEBI, 1984). Foi descontado o desaparecimento do peróxido de hidrogênio

sem a presença da amostra. O ensaio enzimático de 60 segundos foi realizado em tampão

fosfato de potássio (KPi) 50 mM, EDTA 0,5 mM, pH 7,0 contendo 0,012% de Triton X-100.

Como substrato iniciador foi utilizado 10 mM de H2O2. A absorbância basal foi descontada a

partir da leitura da reação do ensaio na ausência da amostra.

4.6.2 Superóxido Dismutase

Para a quantificação da SOD por meio do método baseado na inibição da auto-

oxidação da adrenalina, as amostras foram diluídas em tampão de homogeneização, na

proporção 1:10 (v/v), e quantidades crescentes do diluído (10, 15, 20, 25 e 30 ul) acrescidas

de tampão glicina pH 10,2 a 32°C, solução de catalase e solução ácida de adrenalina; foram

lidas no comprimento de onda de 480 nm durante 180 segundos, com intervalo de leitura de

dez segundos, de acordo com a metodologia descrita por Misra e Fridovich (1972). A curva

resultante desta leitura foi comparada com a curva de oxidação da adrenalina obtida no

mesmo dia da análise, sob as mesmas condições da amostra através de uma planilha do

Microsoft Excel. O resultado final foi expresso em g SOD/g proteína.

45

4.6.3 Determinação de proteínas

A concentração de proteínas totais foi determinada através do método de Lowry

modificado (PETERSON, 1977), com soro albumina bovina como padrão.

4.7 BIOMARCADOR DE DANO LIPÍDICO

4.7.1 TBARS

O teste de substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico (TBA) foi realizado com base

no protocolo de Buege e Aust (1975), com algumas modificações, esse teste leva em

consideração a reação de duas moléculas de TBA com uma de ácido tricloroacético (TCA)

que gera uma cor rosa que pode ser lida em espectrofotômetro em comprimento de onda de

495 nm. As amostras de músculos de peixe foram pesadas e em seguida homogeneizadas com

tampão de NaCl (150mM), centrifugadas por trinta minutos a 13500 rpm (4ºC). 400 µL da

amostra foram reagidos com 100 µL de TBA (0,67%) e 500 µL de TCA (10%), essa mistura

foi aquecida até 96º por trinta minutos, resfriada em gelo por cinco minutos, em seguida

centrifugada novamente por trinta minutos a 13500 rpm (4ºC), e lida em espectofotômetro em

595 nm. Os resultados são apresentados em nmol de malondialdeido (MDA) por grama de

tecido. Juntamente com as amostras foi realizada uma curva de calibração com concentrações

conhecidas de MDA (0,75, 1,5, 3, 6 e 12 nmol) para estimativa do fator de correção.

Para determinação de proteínas totais das amostras para o TBARS foi realizada a

dosagem de proteínas pelo método de Bradford. Este método baseia-se na ligação do corante

(Coomassie Brilliant Blue /G-250) com moléculas de proteínas da amostra, formando um

complexo de cor azul. A concentração de proteína nas amostras foi determinada com base em

curva de calibração obtida de concentrações conhecidas de BSA (soro albumina bovina) e em

leitura espectrofotométrica a 595nm.

46

4.8 BIOMARCADORES DE GENOTOXICIDADE

4.8.1 Ensaio cometa

Para a técnica de ensaio cometa alcalino foi utilizado o método previamente descrito

por Singh et al. (1988) com algumas adaptações, já para o ensaio cometa modificado com

FPG foi utilizado o protocolo de Dunsiska e Collins, (1996) com modificações, e o ensaio

modificado com Endonuclease III foi baseado no protocolo de Collins; Duthie; Dobson,

(1993) com adaptações.

As amostras de sangue coletadas foram dividas em três tipos de tratamentos diferentes:

espontâneo: somente o sangue dos animais controle e expostos; Enzimático com FPG- sangue

dos animais exposto à enzima FPG; Enzimático ENDO - sangue dos animais com a enzima

ENDO III; Induzido - sangue dos animais mais peróxido de hidrogênio. Todas as lâminas

foram feitas em triplicatas.

Primeiramente, lâminas histológicas foram lavadas com detergente, secas em estufa e

limpas com etanol, em seguida recobertas com uma camada de agarose (1,5%) com ponto de

fusão normal (NMP). As células sanguíneas diluídas em soro fetal bovino (SFB) (5 µL) foram

misturadas com 110 µL de agarose com baixo ponto de fusão (LMP) e depositadas sobre as

lâminas pré-recobertas com agarose NMP. Após as lâminas foram deixadas em solução de

lise (NaCl 2,5 M, EDTA 100 mM, TRIS 10 mM) over night. Para o controle positivo foi

utilizado 10μL de peróxido de hidrogênio (100 µM) em 190 µL da amostra de sangue,

incubado a 4ºC por 5 minutos.

As lâminas com tratamento enzimático passaram por tratamento em tampão de

reação, sendo realizadas três lavagens de cinco minutos cada, com tampão de HEPES (40

mM), KCl (0,1M), EDTA (0.5 mM) e BSA (0.2 mg/ml), pH 8,0. Em seguida passaram por

um período de trinta minutos de incubação com a enzima específica em câmera úmida à 37º

C.

Em seguida tanto as lâminas que não sofreram tratamento enzimático, quanto as

tratadas com enzimas passaram por uma etapa de vinte minutos de desenrolamento alcalino,

com solução de NaOH (0,3 M) e EDTA (1 mM), pH 10. Após essas lâminas foram

submetidas à eletroforese por vinte minutos, em 1V/cm e 300mA. Em seguida houve uma

etapa de neutralização das lâminas com TRIS (0,4 M), pH 7,5, e uma etapa de fixação das

lâminas com etanol 100%. Em seguida as lâminas foram armazenadas até o momento da

47

análise, onde foram coradas com solução de brometo de etídeo, e analisadas em microscópio

de epi-fluorescência Zeiss Axio Imager.A2 com filtro de 605 nm, com o software Comet

Imager 2.2 da Metasystem ®.

4.8.2 Teste do micronúcleo

Para o teste do micronúcleo realizaram-se esfregaços com o sangue total em

triplicatas. Após secagem do esfregaço, as lâminas foram fixadas em etanol absoluto por 20

minutos. O material foi corado com solução Giemsa 10% diluído em tampão fosfato (pH 6,8)

por 20 minutos. Decorrido este tempo as lâminas foram lavadas suavemente sob uma torneira

para retirada do excesso de Giemsa e deixadas à temperatura ambiente para secagem. As

lâminas foram analisadas em microscópio óptico em aumento de 1000 X, em teste cego

contando-se 1000 células/lâmina. Apenas foram consideradas para análise hemácias

nucleadas com membrana citoplasmática intacta (HOOFTMAN; DE RAAT, 1982).

4.9 ANÁLISES ESTATÍSTICAS

Os dados obtidos nas variáveis de genotoxicidade e estresse oxidativo, foram

submetidos a teste de homogeneidade de Levene e de normalidade de Kolmogorov-Smirnov

para verificação dos pressupostos estatísticos. Posteriormente aplicou-se análise de variância

de duas vias (Two-way ANOVA), levando em consideração tempo, tratamento e a interação

entre eles. Quando observado diferenças significativas as médias foram comparadas por meio

do teste de Tukey e de Bonferroni. Avaliou-se a correlação entre as variáveis analisadas em

cada experimento por meio da análise de correlação de Pearson. Foi considerada uma

significância de % (P<0,05) para todas as análises. As análises estatísticas e a confecção dos

gráficos foram realizados com auxilio dos softwares estatísticos Statistical Analysis System

9.4 (SAS) e GraphPad Prism 7.0.

49

5 RESULTADOS

Para investigar a qualidade da água coletada no bairro Caravággio, localizado no

interior do município de Ponte Alta, SC, Brasil, e no Rio Caveiras, ponto Br-2 localizado em

Lages, SC, utilizamos uma abordagem ampla, com testes físico-químicos de qualidade de

água, durante aproximadamente dois anos, e utilização de biomarcadores de genotoxicidade

(ensaio cometa alcalino e teste do micronúcleo) e de estresse oxidativo (ensaio cometa

modificado, catalase e superóxido dismutase).

Nas análises prévias (Anexo C) observamos os resultados das análises de qualidade da

água realizadas em agosto e setembro de 2016. Onde observamos valores alterados de amônia

e fósforo na localidade de Caravágio, bem como a presença de coliformes fecais.

Foram realizados quatro bioensaios, de vinte e oito dias cada, utilizando o zebrafish

como modelo experimental, sendo dois com água subterrânea coletada no bairro Caravággio,

localizado no interior do município de Ponte Alta, SC, Brasil, desenvolvidos em agosto e

dezembro de 2017; e outros dois com água superficial coletada no Ponto Br-2 do Rio

Caveiras em Lages, SC, Brasil, realizados em outubro de 2017 e fevereiro/março de 2018.

5.1 PONTE ALTA – ÁGUA SUBTERRÂNEA

5.1.1 Análises de água

Os resultados de qualidade da água do interior de Ponte Alta (Tabela 2) foram

comparados com os índices propostos pela Portaria MS nº 2.914/2011 que dispõe sobre os

procedimentos de controle e de vigilância da qualidade da água para consumo humano e seu

padrão de potabilidade, e mostraram um índice maior do que o permitido de manganês na

primeira coleta e de fósforo nas duas primeiras coletas.

50

Tabela 2 - Resultados das análises de água referentes à água subterrânea coletada no ponto

localizado no interior do município de Ponte Alta, SC, Brasil.

PARÂMETROS

Coleta

03/08/2017

Coleta

10/10/2017

Coleta

22/11/2017

Coleta

23/02/2018

MS

2914/11

pH

6,79

6,7

6,7

6,98

6 - 9,5

Temperatura da Água (°C) 15,2 22,1 22,4 29,2 -

Condutividade Elétrica (µS/cm) 87 78 70 91 -

Sólidos Totais Dissolvidos (mg/L) 41 37 34 43 ≤ 1000

Sólidos Totais (mg/L) 0,0082 0,01 - 0,0114 -

Dureza Total (mg/L de CaCO3) 46 148 100 60 ≤ 500

Alcalinidade Total (mg/L de

CaCO3)

70 26,86 23,7 30,6 -

DBO (DBO 5d, 20°C, mg/L de O2) 0 3 0 - -

Alumínio Total (mg/L de Al) 0 < 0,1 0,06 <0,1 ≤ 0,2

Cloreto Total (mg/L de Cl) 31,9 28,36 31,9 14,18 ≤ 250

Ferro Total (mg/L de Fe) 0,06 0,04 0,06 <0,05 ≤ 0,3

Fluoreto Total (mg/L de F) 0 0 0 <0,5 ≤ 1,4

Manganês Total (mg/L de Mn)

0,13 0,04 0,03 <0,05 ≤ 0,1

Nitrogênio Nitrato (mg/L de N) < 0,5 1,19 0 3,05 ≤ 10

Nitrogênio Nitrito (mg/L de N) 0 0 0 0 ≤ 1

Fósforo (mg/L de P) 0,2172 0,2364 - - 0,10

Sulfato Total (mg/L de SO4) 174 32 - 123 ≤ 250

Bactérias Heterotróficas (Contagem

Padrão)

0 0 - 0 Contagem

Coliformes Totais Ausência Ausência - Ausência Ausência


51

5.1.2 Superóxido dismutase

A atividade da enzima superóxido dismutase em músculos de zebrafish, não

demonstrou diferenças significativas entre os tratamentos e tempos avaliados no experimento

conduzido com água subterrânea coletada no interior do município de Ponte Alta em agosto

de 2017 (Figura 9). Os dados de dezembro não puderam ser analisados em função da pouca

amostra obtida.

Figura 9 - Atividade de SOD/mg de proteína encontrados em músculos de zebrafish expostos

à água de Ponte Alta coletada em agosto de 2017.


Na ANOVA de duas vias não houve efeito da interação “tratamento*tempo” (P = 0,2865), do tratamento (P =

0,1671), e efeito do tempo (P = 0,3743).

5.1.3 Catalase

Nos bioensaios realizados para quantificar a atividade da enzima catalase podemos

perceber que, no experimento conduzido em agosto de 2017 (Figura 10A), houveram

diferenças entre os grupos analisados nos dias sete e quatorze. A atividade de CAT no

tratamento controle diminuiu com o passar das semanas, apresentando o maior valor no dia

sete e o menor valor no dia vinte e oito, enquanto no grupo controle os valores aumentaram

durante o período experimental, apresentando o menor valor no dia sete e o maior valor no dia

vinte e oito. Os dados do dia 0 (basal) não puderam ser analisados em função da pouca

amostra obtida.

No experimento realizado em dezembro de 2017 (Figura 10B) não houveram

diferenças entre os tratamentos e entre os dias de avaliação para cada tratamento.

52

Figura 10 – Atividade de CAT/mg de proteína encontrados em músculos de zebrafish

expostos à água de Ponte Alta.


A: Água coletada em agosto de 2017 = Pela ANOVA de duas vias foi verificada interação “tratamento*tempo”

(P < 0,0001), e também efeito isolado do tratamento (P = 0,0084), mas não houve efeito do tempo (P = 0,2414).

B: Água coletada em dezembro de 2017 = Pela ANOVA de duas vias não houve efeito da interação

“tratamento*tempo” (P = 0,4786), do tratamento (P = 0,4269), e efeito do tempo (P = 0,6278) Letras maiúsculas

diferentes indicam diferença entre os tratamentos no tempo específico pelo teste de Bonferroni. Letras

minúsculas diferentes indicam diferença entre os tempos no tratamento especifico pelo teste de Tukey.

5.1.4 Ensaio cometa

Para avaliação dos danos no material genético em eritrócitos de zebrafish expostos à

água coletada em Ponte Alta, SC, utilizou-se o parâmetro % de DNA na cauda dos cometas

(dado pelo software Comet Imager 2.2) (Figura 11). No experimento conduzido em agosto

(Figura 12A), o ensaio cometa padrão mostrou um aumento na frequência de danos nos

animais expostos em todas as semanas avaliadas, em relação ao grupo controle.

No experimento conduzido em dezembro de 2017 (Figura 12B) houve diferença

significativa entre os grupos em todos os dias avaliados. A volta dos animais para a água

controle no vigésimo segundo dia não teve efeito na diminuição de danos nos animais

expostos, em ambos os experimentos houve um aumento na frequência de danos no vigésimo

oitavo dia.

53

Figura 11 - Níveis de dano ao DNA encontrados em eritrócitos de zebrafish expostos à água

proveniente do Aquífero Guarani, dado pelo Software Comet Imager 2.2 da

Metasystem ®.


54

Figura 12 - Efeito genotóxico em eritrócitos de zebrafish expostos à água de Ponte Alta,

medido por ensaio cometa padrão.



(P < 0,0001), e também efeito isolado do tratamento (P < 0,0001) e efeito do tempo (P < 0,0001). B: Água

coletada em dezembro de 2017 = Pela ANOVA de duas vias foi verificada interação “tratamento*tempo” (P <

0,0001), e também efeito isolado do tratamento (P < 0,0001) e efeito do tempo (P < 0,0001). Letras maiúsculas

diferentes indicam diferença entre os tratamentos no tempo específico pelo teste de Tukey, letras minúsculas

diferentes indicam diferença entre os tempos no tratamento especifico pelo teste de Tukey.

Os níveis de purinas oxidadas nos eritrócitos de peixes expostos a água coletada em

agosto em Ponte Alta (Figura 13A), foram estatisticamente diferentes do controle a partir do

décimo quarto dia de experimento até o vigésimo oitavo dia. No experimento com água

coletada em dezembro de 2017 (Figura 13B) podemos observar o aumento significativo da

frequência de purinas oxidadas nos animais expostos no sétimo e décimo quarto dia de

experimentação.

55

Figura 13 - Níveis de oxidação de purinas encontrados em eritrócitos de zebrafish expostos à

água de Ponte Alta



(P = 0,0159), e também efeito isolado do tratamento (P < 0,0001) e efeito do tempo (P < 0,0001). B: Água

coletada em dezembro de 2017 = Pela ANOVA de duas vias foi verificada interação “tratamento*tempo” (P <

0,0001), e também efeito isolado do tratamento (P < 0,0001) e efeito do tempo (P = 0,0028). Letras maiúsculas

diferentes indicam diferença entre os tratamentos no tempo específico pelo teste de Tukey, letras minúsculas

diferentes indicam diferença entre os tempos no tratamento especifico pelo teste de Tukey.

Os níveis de pirimidinas oxidadas avaliadas pelo ensaio cometa modificado com a

enzima ENDO III, nos animais expostos a água coletada em dezembro (Figura 14), mostram

um aumento na frequência de danos oxidativos a pirimidinas nos dias sete e quatorze do

período experimental. No primeiro experimento, realizado em agosto de 2017 não realizamos

ensaios com a enzima endonluclease III.


expostos à água Ponte Alta coletada em dezembro de 2017.


Pela ANOVA de duas vias Ffoi verificada interação “tratamento*tempo” (P < 0,0001), e também efeito isolado

do tratamento (P < 0,0001) e efeito do tempo (F4, 30 = 16,23; P < 0,0001). Letras maiúsculas diferentes indicam

diferença entre os tratamentos no tempo específico pelo teste de Tukey, letras minúsculas diferentes indicam

diferença entre os tempos no tratamento especifico pelo teste de Tukey.

56


No teste do micronúcleo podemos perceber um aumento significativo na frequência

dos micronúcleos encontrados nos animais expostos a água coletada em Ponte Alta, nos dias

sete e quatorze no experimento com água coletada em agosto de 2017 (Figura 15A), e nos

dias sete a vinte e oito no experimento de dezembro de 2017 (Figura 15B).

Figura 15 - Frequência de micronúcleos encontrados em eritrócitos de zebrafish expostos á

água coletada em Ponte Alta, SC, Brasil.



(P = 0,0130), e também efeito isolado do tratamento (P = 0,0001) e efeito do tempo (P = 0,0053). B: Água

coletada em dezembro de 2017 = Pela ANOVA de duas vias não foi verificada interação “tratamento*tempo” (P

= 0,1531), houve efeito isolado do tratamento (P = 0,0001) e não houve efeito isolado do tempo (P = 0,0704)..

Letras maiúsculas diferentes a indicam diferença entre os tratamentos no tempo específico pelo teste de

Bonferroni, letras minúsculas diferentes indicam diferença entre os tempos no tratamento especifico pelo teste de

Tukey.

5.1.6 TBARS

Nas análises realizadas para avaliar o índice de Peroxidação lipídica (Figura 16) em

músculos de zebrafish expostos a água de Ponte Alta, não foram observadas diferenças

significativas entre os grupos analisados.

57

Figura 16 - Nmol de MDA/mg de proteína em músculos de zebrafish exposto a água coletada

em Ponte Alta em agosto e dezembro de 2017.

Fonte: elaborado pela autora, 2018.

Pela ANOVA de duas vias não foi observado efeito da interação “tratamento*tempo” (P = 0,1542), e também

não houve efeito isolado do tratamento (P = 0,0854) e não houve efeito do tempo (P = 0,2436).

5.1.7 Análises de correlação

Realizamos análises de correlação para avaliar os dados obtidos nos experimentos

realizados com zebrafish. Na Tabela 3 podemos observar a correlação entre os dados do

primeiro experimento, conduzido com água subterrânea proveniente de Ponte Alta.

Observamos correlação positiva entre os dados do ensaio cometa alcalino e o teste do

micronúcleo, além de uma correlação negativa entre a enzima catalase e o teste do

micronúcleo.

Tabela 3- Correlação de Pearson. Experimento realizado com água coletada em Ponte Alta,

SC, Brasil em agosto de 2017.

Tratamentos EC FPG CAT Micro

EC -

FPG 0,14NS

-

CAT -0,13NS

-0,27NS

-

Micro 0,62* 0,26

NS -0,59

* -


EC: Ensaio cometa padrão; FPG: Ensaio cometa modificado com enzima FPG; CAT: catalase; Micro: teste do

micronúcleo. NS

Não significativo; *P<0,05;

**P<0,01;

***P<0,001

Na Tabela 4 observamos os resultados do experimento realizado com água subterrânea

coletada em Ponte Alta em dezembro de 2017, houve uma correlação positiva entre o ensaio

cometa padrão e o ensaio cometa modificado com as enzimas ENDO e FPG, além do teste do

58

micronúcleo, já a enzima catalase novamente mostrou uma correlação negativa com o ensaio

cometa alcalino e com a FPG. A enzima ENDO correlacionou-se positivamente com a FPG, e

com os resultados do micronúcleo. Os resultados do ensaio cometa modificado com a enzima

FPG também tiveram correlação positiva com os resultados do micronúcleo.

Tabela 4 - Correlação de Pearson Experimento realizado com água coletada em Ponte Alta,

SC, Brasil em dezembro de 2017.

Tratamentos EC Endo FPG CAT Micro

EC -

ENDO 0,45* -

FPG 0,65***

0,58**

-

CAT -0,34* -0,25

NS -0,44

* -

Micro 0,33* 0,41

* 0,41

* -0,06

NS -



micronúcleo. NS


**P<0,01;

***P<0,001

5.2 RIO CAVEIRAS – ÁGUA SUPERFICIAL

5.2.1 Análises de água – Rio Caveiras

Os resultados das análises físico-químicas de qualidade de água do Rio Caveiras

(Tabela 3) foram comparados com a resolução do CONAMA (2005), que dispõe sobre a

classificação dos corpos de água e diretrizes ambientais para o seu enquadramento, bem como

estabelece as condições e padrões de lançamento de efluentes, e dá outras providências.

Nossas análises evidenciaram uma concentração maior do que a permitida na portaria de ferro

e manganês nas duas coletas analisadas.

59

Tabela 5- Resultados das análises de água referentes ao ponto de coleta Ponto BR - 2,

localizado no Rio Caveiras, em Lages, SC, Brasil.

PARÂMETROS Coleta 1

(10/10/2017) Coleta 2

(23/02/2018) CONAMA

357/05

pH 7 7,34 6 - 9

Temperatura da Água (°C) 20,1 25 -

Temperatura do Ar (°C) 21,5 23,2 -

Condutividade Elétrica (µS/cm) 92 112 -

Sólidos Totais Dissolvidos (mg/L) 44 50 ≤ 500

Sólidos Totais (mg/L) 0,0116 0,0168 -

Dureza Total (mg/L de CaCO3) 0 45 -

Alcalinidade Total (mg/L de CaCO3) 17,38 24,04 -

DBO (DBO 5d, 20°C, mg/L de O2) 4 - ≤ 5

Alumínio Total (mg/L de Al) < 0,1 <0,1 ≤ 0,1

Cloreto Total (mg/L de Cl) 35,45 24,81 ≤ 250

Ferro Total (mg/L de Fe) 0,73 0,68 ≤ 0,3

Manganês Total (mg/L de Mn) 0,14 0,23

≤ 0,1

Fluoreto Total (mg/L de F) 0 0 ≤ 1,4

Nitrogênio Nitrato (mg/L de N) 5,62 3,15 ≤ 10

Nitrogênio Nitrito (mg/L de N) 0,37 <0,5 ≤ 1

Bactérias Heterotróficas (Contagem Padrão) 153 258 Contagem

Coliformes Totais Presença Presença Ausência

Fonte: elaborado pela autora, 2018.

60

5.2.2 Superóxido dismutase

A atividade da enzima superóxido dismutase, não demonstraram diferença

significativa entre os grupos estudados no experimento conduzido com água superficial

coletada no Rio Caveiras em fevereiro de 2017 (Figura 17). Os dados de outubro não puderam

ser analisados.

Figura 17 - Atividade de SOD/mg de proteína encontrados em zebrafish expostos à água do

Rio Caveiras coletada em fevereiro de 2018.


Pela ANOVA de duas vias não houve efeito da interação “tratamento*tempo” (P = 0,3937), do tratamento (P =

0,2343), e efeito do tempo (P = 0,4181).

5.2.3 Catalase

Nos experimentos em que medimos a atividade de catalase nos animais expostos à

água do rio Caveiras vimos que no experimento de outubro de 2017 (Figura 18A) não houve

diferença estatística entre os tratamentos nem entre os dias avaliados, mas observamos um

aumento gradual na atividade de CAT dos animais do grupo exposto a partir do sétimo dia até

o vigésimo primeiro dia. Os dados do vigésimo oitavo dia não são mostrados em função da

pouca amostra obtida.

No experimento conduzido em fevereiro de 2018 (Figura 18B) houve um aumento dos

níveis de CAT no sétimo dia de experimento, seguido de uma gradual diminuição nos dias

seguintes, porém não houve diferença estatística entre os tratamentos.

61

Figura 18 - Atividade de CAT/mg de proteína encontrados em zebrafish expostos à água do

Rio Caveiras.


A: Água coletada em Outubro de 2017 = Pela ANOVA de duas vias não foi verificada interação

“tratamento*tempo” (P = 0,3019), houve efeito isolado do tratamento (P = 0,0161), mas não houve efeito do

tempo (P = 0,5535). B: Água coletada em Fevereiro de 2018 = Pela ANOVA de duas vias foi verificada

interação “tratamento*tempo” (P = 0,0405), não houve efeito isolado do tratamento (P = 0,6876), e houve efeito

isolado do tempo (P < 0,0001) Letras maiúsculas diferentes indicam diferença entre os tratamentos no tempo

específico pelo teste de Bonferroni. Letras minúsculas diferentes indicam diferença entre os tempos no

tratamento especifico pelo teste de Tukey.

5.2.4 Ensaio cometa

No primeiro experimento realizado com água coletada no Ponto Br-2 no rio Caveiras

em outubro de 2017 podemos observar o dano genotóxico medido pelo ensaio cometa padrão.

Devido a falhas experimentais os dados do vigésimo oitavo dia não puderam ser avaliados.

Houve aumento significativo do percentual de DNA entre os animais e o controle apenas no

décimo quarto dia de avaliação (Figura 19A).

No experimento realizado em fevereiro de 2018 (Figura 19B) houve diferença

significativa entre os peixes mantidos na água do Rio Caveiras em relação aos peixes

mantidos na água do tratamento controle a partir do décimo quarto dia de avaliação. A troca

dos animais pra água controle no vigésimo segundo dia não tem efeito em diminuir os danos

causados ao material genético.

62

Figura 19 - Efeito genotóxico da exposição de zebrafish à água do Rio Caveiras medido por

ensaio cometa padrão.


A: Água coletada em Outubro de 2017 = Pela ANOVA de duas vias foi verificada interação “tratamento*tempo”

(P = 0,0195), houve efeito isolado do tratamento (P < 0,0001), mas não houve efeito do tempo (P = 0,8286). B:

Água coletada em Fevereiro de 2018 = Pela ANOVA de duas vias foi verificada interação “tratamento*tempo”

(P < 0,0001), houve efeito isolado do tratamento (P < 0,0001), e houve efeito isolado do tempo (P = 0,0002)

Letras maiúsculas diferentes indicam diferença entre os tratamentos no tempo específico pelo teste de Tukey.

Letras minúsculas diferentes indicam diferença entre os tempos no tratamento especifico pelo teste de Tukey.

Os níveis de purinas oxidadas, medidos pelo ensaio cometa modificado com a enzima

FPG, nos peixes expostos a água do rio Caveiras coletada em outubro de 2017 (Figura 20A),

foram diferentes (P<0,05) do dos peixes do tratamento controle no vigésimo primeiro dia de

exposição. O percentual de DNA tanto no tratamento controle, quanto no tratamento do rio

Caveiras foi maior (P<0,05) dos sete aos 21 dias, em relação ao dia 0. No experimento com

água coletada em fevereiro de 2018 (Figura 20B) podemos observar diferença na frequência

de purinas oxidadas encontradas nos animais expostos no vigésimo oitavo dia, em relação ao

grupo controle. Os maiores % de DNA na cauda no tratamento controle foram observados do

dia sete ao 21, enquanto no tratamento do Rio Caveiras, do dia sete ao 28.

63

Figura 20 - Níveis de purinas oxidadas encontrados em eritrócitos de zebrafish expostos à

água do Rio Caveiras.



(P = 0,0011), houve efeito isolado do tratamento (P < 0,0001), e houve efeito isolado do tempo (P = 0,0023). B:

Água coletada em Fevereiro de 2018 = Pela ANOVA de duas vias não foi verificada interação

“tratamento*tempo” (P = 0,0544), houve efeito isolado do tratamento (P < 0,0001), e houve efeito isolado do

tempo (P = 0,0004) Letras maiúsculas diferentes indicam diferença entre os tratamentos no tempo específico

pelo teste de Tukey. Letras minúsculas diferentes indicam diferença entre os tempos no tratamento especifico

pelo teste de Tukey.

Os níveis de pirimidinas oxidadas avaliados pelo ensaio cometa modificado com a

enzima ENDO III, nos animais expostos a água do rio Caveiras coletada em outubro de 2017

(Figura 21A), mostram um aumento na frequência de danos oxidativos a pirimidinas nos dias

sete e vinte e um do período experimental, no décimo quarto dia não há diferença entre

tratamentos, porém não houve diferença estatística. O percentual de DNA da cauda foi maior

dentro do tratamento controle apenas no dia 14 e 21, e no tratamento do Rio Caveiras do dia

sete ao dia vinte e um em relação ao dia zero.

No experimento conduzido em fevereiro de 2018 (Figura 21B), houve um aumento na

frequência de pirimidinas oxidadas no vigésimo primeiro dia do período experimental entre os

peixes do rio Caveiras e o tratamento controle.

64


expostos à água do Rio Caveiras.



(P = 0,0018), houve efeito isolado do tratamento (P < 0,0001), e houve efeito isolado do tempo (P = 0,0171). B:

Água coletada em Fevereiro de 2018 = Pela ANOVA de duas vias foi verificada interação “tratamento*tempo”

(P < 0,0001), houve efeito isolado do tratamento (P < 0,0001), e houve efeito isolado do tempo (P < 0,0001)

Letras maiúsculas diferentes indicam diferença entre os tratamentos no tempo específico pelo teste de Tukey.

Letras minúsculas diferentes indicam diferença entre os tempos no tratamento especifico pelo teste de Tukey.


Nas análises realizadas com a água do Rio Caveiras podemos observar um aumento

não significativo nas frequências de micronúcleos nos animais expostos nos dias sete,

quatorze e vinte e um, e uma diminuição a partir do vigésimo segundo dia no experimento

realizado em outubro de 2017 (Figura 22A). No experimento conduzido em fevereiro de 2018

(Figura 22B) observamos diferença significativa na frequência dos micronúcleos em animais

expostos nos dias sete e vinte e um, em relação ao tratamento controle. Não houve diferença

entre os dias dentro do tratamento controle, enquanto no tratamento do Rio Caveiras foi maior

no dia 21, não diferindo do dia sete e do dia 14.

65

Figura 22 - Frequência de micronúcleos encontradas em eritrócitos de zebrafish expostos á

água coletada no Ponto Br-2 do Rio Caveiras em Lages, SC, Brasil.


A: Água coletada em Outubro de 2017 = Pela ANOVA de duas vias não foi verificada interação

“tratamento*tempo” (P = 0,2258), houve efeito isolado do tratamento (P = 0,0043), e não houve efeito isolado

do tempo (P = 0,0929). B: Água coletada em Fevereiro de 2018 = Pela ANOVA de duas vias foi verificada

interação “tratamento*tempo” (P = 0,0142), houve efeito isolado do tratamento (P = 0,0012), e não houve efeito

isolado do tempo (P = 0,0748) Letras maiúsculas diferentes indicam diferença entre os tratamentos no tempo

específico pelo teste de Bonferroni. Letras minúsculas diferentes indicam diferença entre os tempos no

tratamento especifico pelo teste de Tukey.

Figura 23 - Lâmina de eritrócitos de Danio rerio, a seta indicando célula com micronúcleo.

Fonte: Elaborado pela autora. 2018.

66

5.2.6 TBARS

Nas análises realizadas para avaliar o índice de Peroxidação lipídica em músculos de

zebrafish (Figura 24), não foram observadas diferenças significativas entre os grupos

analisados.

Figura 24 - Nmol de MDA/mg de proteína em músculos de zebrafish expostos a água

coletada em Ponte Alta em outubro de 2017 e fevereiro de 2018.


Pela ANOVA de duas vias não foi observado efeito da interação “tratamento*tempo” (P = 0,5753), e também

não houve efeito isolado do tratamento (P = 0,3772) e não houve efeito do tempo (P = 0,3851).

5.2.7 Análises de correlação

Na Tabela 6 temos o resultado das correlações realizadas com os dados do

experimento realizado com água do Rio Caveiras, coletada em outubro de 2017, observamos

correlação entre os dados do ensaio cometa alcalino e o teste do micronúcleo. O ensaio

cometa modificado com a enzima endo correlacionou-se positivamente com o mesmo ensaio,

conduzido com a enzima FPG. O micronúcleo se correlacionou positivamente com todos os

ensaios.

67


Caveiras, em Lages, SC, Brasil em outubro de 2017.


EC -

ENDO 0,34NS

-

FPG 0,24NS

0,72***

-

CAT 0,18NS

0,11NS

0,15NS

-

Micro 0,39* 0,39

* 0,52

* 0,41

* -



micronúcleo . NS


**P<0,01;

***P<0,001

Na Tabela 7 observamos as análises de correlação do experimento conduzido com

água coletada no Rio Caveiras em fevereiro de 2018. Observamos correlação positiva entre o

ensaio cometa alcalino e o teste do micronúcleo. O EC modificado com a enzima ENDO

também correlacionou-se positivamente com o EC modificado com a enzima FPG, e com o

teste do micronúcleo.


Caveiras, em Lages, SC, Brasil em fevereiro de 2018.


EC -

ENDO 0,31* -

FPG 0,19NS

0,45* -

CAT 0,15NS

0,29NS

0,26NS

-

Micro 0,26NS

0,54**

0,22NS

0,02NS

-

Fonte: Elaborado pela autora, 2018. EC: Ensaio cometa padrão; FPG: Ensaio cometa modificado com enzima

FPG; CAT: catalase; Micro: teste do micronúcleo . NS


**P<0,01;

***P<0,001

69

6. DISCUSSÃO

6.1 PONTE ALTA – ÁGUA SUBTERRÂNEA

Nas coletas de água realizadas em Ponte Alta, podemos observar um valor maior do

que o permitido pela portaria MS 2914/11 de manganês na primeira coleta e de fósforo nas

duas primeiras coletas (Tabela 2). De acordo com Omar et al. (2012), metais, como o

manganês, são contaminantes ambientais estáveis e persistentes, causando um forte impacto

na estabilidade dos ecossistemas. O contato com metais, seja por meio da ingestão da água ou

de organismos aquáticos contaminados, pode causar danos permanentes ao ser humano,

disfunções no sistema nervoso e até mesmo câncer (LIU et al., 2008).

O aumento de fósforo possivelmente está relacionado com a falta de esgotamento

sanitário, uso de agrotóxicos e fertilizantes, que é intenso na região, geralmente o aumento de

fósforo nos recursos hídricos tem como principal causa à urbanização, seguida pelo uso

agrícola do solo.

Apesar de, na água analisada, a maioria dos metais estarem dentro do limite

estabelecido pela legislação (Anexo B), podem ocorrer interações entre os componentes

químicos e poluentes presentes na água tornando, por sinergismo, a mistura mais tóxica do

que cada um dos elementos avaliados separadamente. De fato, estudos comparando a

exposição a um único pesticida com mistura de pesticidas mostraram que misturas de

pesticidas causam efeitos sinérgicos ou efeitos de aditivos parciais (BRODEUR et al., 2014).

As enzimas superóxido dismutase e catalase são dois componentes importantes do

sistema de defesa antioxidante que eliminam ânions superóxido e o peróxido de hidrogênio

para proteger o organismo de danos oxidativos (KÖPRÜCÜ; YONAR; ŞEKER, 2010). No

ensaio para quantificar a enzima catalase (Figura10), observamos uma diminuição nos níveis

de CAT em relação ao grupo controle nos dias sete e quatorze do período experimental,

segundo Liu et al. (2015), a inibição da atividade da catalase confirma elevado grau de

contaminação da água. Além disso, vários outros estudos relatam a diminuição dos níveis de

CAT em peixes expostos a água contendo agrotóxicos ou metais (McRAE; GAW; GLOVER,

2018; NUNES et al., 2018). Após quinze dias a CAT permaneceu estável uma possível razão

é que o zebrafish tenha desenvolvido tolerância aos contaminantes, o que causou o

nivelamento da atividade enzimática após esse período.

O ensaio cometa é um método de quantificação de danos no DNA bem validado que

pode ser usado com confiabilidade elevada na avaliação de alguns organismos expostos a

70

efluentes (GRAZEFFE et al., 2008). Exposições a agentes genotóxicos, presentes no meio

aquático, podem levar a perda da integridade do DNA (ROJAS et al., 1999). Nos resultados

do ensaio cometa padrão dos experimentos realizados em agosto e dezembro (Figura 12),

podemos observar um aumento significativo no percentual de DNA na cauda dos cometas nos

peixes expostos á água de Ponte Alta ao longo do período experimental, o que indica que a

água coletada tem potencial de causar danos genotóxicos em zebrafish. Estudos relatam um

aumento na quebra de DNA em peixes expostos a diferentes concentrações de metais, como

por exemplo, cádmio e alumínio (PEREIRA et al., 2013), cobre e zinco (OMAR et al., 2012),

cromo, chumbo e níquel (MORAIS et al., 2016). Além disso, o manganês que foi encontrado

em níveis acima dos permitidos para água de consumo humano, já foi comprovado ter

potencial genotóxico e de alterações nos níveis de enzimas do estresse oxidativo em vários

estudos com peixes (LOUISE et al., 2017; OMAR et al., 2012).

A avaliação da recuperação de animais após exposição a efluentes é fundamental para

saber o grau de dano sofrido no organismo e suas consequências. Quando a recuperação é

mais rápida indica danos leves ocorridos e que o organismo foi capaz de se defender como

descrito por Amado et al. (2006). No entanto quando há lentidão na recuperação indica que

esse organismo foi seriamente afetado, podendo ter atingido não apenas os níveis mais baixos

da organização biológica (molecular e bioquímico), mas também os níveis fisiológicos e

morfológicos. Não houve diminuição dos danos com a volta dos animais pra água controle do

vigésimo segundo dia em nenhum dos experimentos (Figura 12), houve, inclusive, um

aumento significativo no % de DNA na cauda dos cometas do experimento de agosto, o que

pode ter relação com o estresse envolvido na troca dos animais de uma água para outra

(apesar de ter havido aclimatação dos peixes por duas horas antes da troca), e que os danos

causados pela exposição dos peixes a água testada, foram demasiados, afetando a capacidade

de reparo dos animais expostos.

As altas frequências de dano ao DNA observados são esperadas, tendo em vista a

baixa qualidade hidrológica observada. Muitos poluentes aumentam o dano ao DNA

formando espécies reativas de oxigênio, mais precisamente, pela oxidação de bases de DNA.

Usando o ensaio cometa modificado por FPG, o dano ao DNA causado pelo estresse

oxidativo pode ser detectado (COLLINS, 2004). Nos ensaio cometa modificado com a enzima

FPG (Figura 13), podemos observar uma diferença em relação ao grupo controle no décimo

quarto, e no vigésimo primeiro dia de exposição no experimento de agosto. No experimento

realizado em dezembro observamos um aumento significativo de 8-oxoG no sétimo e decimo

71

quarto dias de exposição. Sabe-se que as bases oxidadas, como a 8-oxoG, são potencialmente

mutagênicas, através de uma alteração nas propriedades de baseamento (8-oxoG tende a

emparelhar com a adenina). No que se refere ao ensaio cometa modificado com a enzima

ENDO III (Figura 14), observamos um aumento significativo nos dias sete e quatorze do

período experimental.

A frequência de micronúcleos vem sendo utilizada como indicação rápida e sensível

tanto de aberrações devido a quebras, como perdas que levam a anormalidades

cromossômicas numéricas (MOREIRA et al., 2010). As frequências basais de MN em

diferentes espécies de peixes variam de 0 a 1% (BOLOGNESI; HAYASHI, 2011). Segundo

Thellmann et al. (2017) uma frequência alta de MN pode ser um indicador de substâncias com

efeitos genotóxicos. Pois os danos causados as estruturas cromossômicas estão relacionadas à

exposição do DNA diretamente com o agente mutagênico, ou devido a defeitos intracelulares

durante a replicação, recombinação ou mecanismo de reparo do DNA. Entre as substâncias

capazes de induzir à formação de micronúcleos estão os agrotóxicos que compõem um grande

grupo de produtos químicos mutagênicos (GHISI, 2012). Nos bioensaios utilizando o teste do

micronúcleo (Figura 15), observamos um aumento significativo na frequência de

micronúcleos encontrados nas lâminas dos animais expostos nos dias sete e quatorze do

experimento realizado em agosto e no experimento de dezembro houve um amento em todos

os dias do período experimental (14, 21 e 28), exceto no basal (dia 0) e no dia sete, entretanto

em nenhum grupo analisado a frequência de MN encontrada foi maior que 1%.

Quanto à diminuição da frequência de células micronucleadas no grupo exposto a

partir do décimo quarto dia, acredita-se que esse fator esteja relacionado com a renovação dos

eritrócitos. As células sanguíneas são continuamente renovadas, e eritrócitos danificados

tendem a ser eliminados do organismo mais rapidamente do que aqueles que não estão

danificados (FLORA et al., 1993).

A peroxidação lipídica é o mecanismo mais importante envolvido em toxicidade

induzida por poluentes (NWANI et al., 2010). O aumento dos níveis de LPO (Figura 16) é

esperado, em função dos outros parâmetros analisados, porém em não houve diferenças

significativas ao longo do período experimental.

6.2 RIO CAVEIRAS – ÁGUA SUPERFICIAL

Observamos níveis alterados de ferro e manganês nas coletas realizadas no Rio

Caveiras (Tabela 6), a presença de metais nas águas devido a ações naturais ou antrópicas

72

(OLIVA et al., 2012) pode representar uma fonte significativa de contaminação ambiental e

humana, uma vez que os metais são potencialmente genotóxicos e carcinogênicos.

Concentrações de metais podem ser bioacumuláveis e biofragmentadas, levando a danos

oxidativos aos organismos expostos, resultando em mutagenicidade ambiental e ocorrência de

diversas doenças degenerativas, como o câncer (WASI; TABREZ; AHMAD, 2013; TABREZ

et al., 2014).

A citotoxicidade em sistemas animais e vegetais pode ser diretamente relacionada às

concentrações de ferro. Este metal pode ter origem em diferentes fontes, incluindo erosão

natural de rochas contendo minério de ferro, ações antrópicas como mineração, fundição,

soldagem, polimento de metais e mistura de combustíveis, ou por fertilizantes usados em

agricultura (SHARMA et al., 2000), bem como efluentes municipais e industriais de esgoto

(KLAUCK; RODRIGUES; SILVA, 2013). Os peixes absorvem ferro da água pelas brânquias

ou pela absorção de alimentos (BURY; WALKER; GLOVER, 2003), e esse metal é essencial

em muitos processos vitais. No entanto, devido à sua capacidade de sofrer redução e

oxidação, pode gerar espécies reativas de oxigênio (LUSHCHAK, 2011).

Normalmente, metais estão presentes em pequenas quantidades em ambientes

aquáticos, mas podem ser descartados em quantidades significativas por atividades humanas,

incluindo esgoto urbano, atividades industriais, agrícolas e de mineração (MARCON et al.,

2010; MANZANO et al., 2015). A alta incidência de metais está relacionada aos mecanismos

de formação de radical superóxido, radical hidroxila e, eventualmente, à produção de adutos

mutagênicos (JOMOVA; VALKO, 2011).

Oliveira, Rech e Klock (2012) caracterizaram a qualidade das águas no Rio Caveiras

em áreas de afloramento do Aquífero Guarani no município de Lages/SC, através de análises

físico-químicas e microbiológicas. Segundo os autores a área do ponto “Ponte BR-2”,

encontra-se em desacordo com a Resolução CONAMA 357/05 para águas doces, sendo

classificado como classe 4, segundo a mesma resolução, em uma escala de 0 a 4, onde 4 é o

mais deteriorado. Dentre outras evidências, o Rio apresentou neste mesmo ponto, baixa

oxigenação, nitrito acima dos valores toleráveis, valores alterados para demanda bioquímica

de oxigênio (DBO) e análises microbiológicas de coliformes totais e termotolerantes,

bastantes elevados. Nosso estudo não revelou valores alterados de nitrito nem baixa

oxigenação, mas pode-se observar nas análises microbiológicas valores alterados de

coliformes totais e contagem alta de coliformes. Os desacordos em relação às análises de água

realizadas em 2012 e 2017/2018 podem ter inúmeros fatores envolvidos, a forma e local de

73

coleta, os índices pluviométricos, a temperatura na hora da coleta, entre outros. Contudo,

apesar de ter sido observada uma diminuição do número de parâmetros que apresentaram

níveis acima do que a regulamentação permite, ainda assim, o ponto de coleta apresenta

valores acima do permitido em alguns parâmetros, demonstrando a baixa qualidade de água

do local.

Em um estudo realizado por Lopes et al. (2017) observou-se altos teores alumínio (Al)

em amostras de água do Rio Caveiras, e aponta que esse acréscimo pode estar associado ao

esgoto doméstico, uma vez que o Rio Caveiras recebe despejos químicos e orgânicos

provenientes da urbanização do município de Lages por meio do seu afluente, o Rio Carahá.

Durante as cheias do Rio Caveiras, pode haver o aumento de Al (SANTOS et al., 2013).

Segundo Mazzolli e Ehrhardt-Brocardo (2013) em seu estudo sobre a ocupação

irregular em áreas de recarga do aquífero Guarani e vegetação ripária em Lages-SC observou-

se que parte da Área de Preservação Permanente das nascentes do Rio Carahá encontra-se

ocupada por casas que lançam seus efluentes diretamente nos corpos d’água.

Observamos nas coletas realizadas no Rio Caveiras um aumento da condutividade

elétrica que é um sinal da presença de materiais dissolvidos. Segundo a Empresa de

Tecnologia de Saneamento Ambiental - CETESB (2005), valores de condutividade elétrica

superiores a 100 µS/cm têm impacto negativo nos ambientes.

Aguiar et al. (2016) revelaram em seu estudo que mesmo as concentrações de metais

apresentando-se abaixo dos limites permitidos pela legislação brasileira, elas podem ser a

causa do potencial mutagênico observado em vários estudos. Demostrando a importância de

analises toxicogenéticas para avaliar a qualidade de ambientes aquáticos, uma vez que nas

análises realizadas as amostras de água dos dois pontos coletados, mesmo a maioria dos

parâmetros apresentando níveis abaixo do preconizado pela legislação, resultaram em danos

significativos sobre o DNA.

Os níveis de SOD avaliados em fevereiro de 2018 (Figura 17) não diferiram no grupo

exposto, porém observamos um aumento nos níveis de SOD em relação ao grupo controle nos

dias sete e quatorze do período experimental. A superóxido dismutase já demonstrou em

vários estudos, ser excelente biomarcadora do estresse oxidativo. Company et al. (2004)

observaram, em brânquias de mexilhões Bathymodiolus azoricus expostos ao cádmio,

mercúrio e cobre inibição na atividade da superóxido dismutase. Letendre et al. (2008),

utilizaram a superóxido dismutase como medidor do estresse oxidativo causado pelo ciclo de

maré na espécie de molusco Mytilus edulis, os quais foram divididos em grupos e submetidos

74

a regiões marinhas profundas e superficiais. O resultado foi o aumento na atividade

enzimática naqueles grupos alocados em ambiente mais profundo.

Não houve diferença estatística entre os tratamentos nos ensaios avaliando a atividade

da catalase em zebrafish expostos a água do Rio Caveiras coletada em outubro e fevereiro de

2018 (Figura 18), porém observou-se uma tendência de aumento nos níveis de catalase no

grupo exposto nos dias sete, quatorze vinte e um do período experimental. Atli e Canli (2007)

utilizaram O. niloticus para exposição a concentrações de cádmio e chumbo, e o resultado foi

o aumento da atividade da catalase.

Observou-se um aumento no percentual de dano ao DNA alisado pelo ensaio cometa

padrão nos dois experimentos realizados (Figura 19). Sendo que no experimento realizado em

outubro o décimo quarto dia apresentou o maior percentual de dano, e no experimento

conduzido em fevereiro de 2017 o maior dano foi observado no vigésimo oitavo dia. Esse

aumento na frequência de danos é esperado, pois a água analisada apresenta baixa qualidade

hidrológica e contaminação por ferro e manganês.

Outra potencial causa para o aumento no percentual de dano ao DNA nos animais

expostos à água coletada são os agrotóxicos, que possivelmente estão presentes na água

analisada. De acordo com a Empresa de Pesquisa Agropecuária e Extenção (EPAGRI), no ano

de 2005 foram utilizados 2.187.500.000 g/ha de fertilizantes na cidade de Lages, e cerca de 5

Kg/ha de agrotóxicos, no mesmo ano.

O ensaio cometa foi empregado para detectar o dano ao DNA ocorrido recentemente,

este método é o mais comumente usado para avaliar a genotoxicidade relacionada à poluição

em organismos aquáticos (DIXON et al., 2002). Introduzimos o teste de cometa modificado

com FPG que detecta adicionalmente o dano ao DNA causado pelo estresse oxidativo em

amostras, pois o estresse oxidativo é identificado como o principal fator que causa dano ao

DNA na maioria dos estudos que lidam com ambientes aquáticos. Geralmente, o modo de

ação das substâncias poluidoras no ambiente é baseado na geração de espécies reativas de

oxigênio (MITCHELMORE et al., 1998). Nos ensaios realizados para quantificar ídices de

purinas e pirimidinas oxidadas, (Figuras 20 e 21) observamos aumentos na frequência de

purinas oxidadas no dia 21 do período experimental e nas pirimidinas oxidadas no vigésimo

oitavo dia.

Enquanto o teste MN detecta danos não reparáveis, como lesões clastogênicas e

aneugênicas, o ensaio cometa detecta lesões recentes que podem ser reparadas, como quebras

e locais álcali-lábeis (SILVA et al., 2002; MATSUMOTO et al., 2006; VILLELA et al.,

75

2007). Segundo Al-Sabti e Metcalfe (1995) a máxima indução de micronúcleos normalmente

ocorre de um a cinco dias de exposição, concordando com os resultados de Grisolia e

Cordeiro (2000), que observaram que a maior indução de micronúcleos ocorreu entre dois e

sete dias pós-tratamento. Segundo resultados observados por estes mesmos autores, há uma

tendência à diminuição da frequência de micronúcleos a partir do décimo quarto dia de

exposição a substâncias tóxicas. Diante disso, apesar do teste do MN ser reportado como um

biomarcador de genotoxicidade em peixes, alguns estudos de exposição crônica ou sub-

crônica a poluentes, demonstraram que a frequência de eritrócitos micronucleados tende a

diminuir após 15º ou 21º dia de exposição (ÇAVAS; ERGENE-GÖZÜKARA, 2005;

VANZELLA; MARTINEZ; CÓLUS, 2007).

No presente trabalho, as maiores frequências de micronúcleos foram observadas nos

dias sete, quatorze e vinte e um do período experimental, em ambos experimentos realizados

com a água do Rio Caveiras (Figuras 22). Isso demonstra que este período, nas condições em

que ocorreu o experimento, foi o mais adequado para a avaliação de mutação em D. rerio,

provavelmente devido ao fato de que até este intervalo de tempo, as lesões celulares que

ocorreram no núcleo não foram reparadas acuradamente antes de se iniciar o processo de

divisão celular, e dessa forma foram perpetuados para as células filhas, os danos

(micronúcleo) induzidos nas células parentais. A análise de MN como um índice de dano

genético acumulado durante a vida útil das células é uma das técnicas mais apropriadas para

identificar a resposta integrada ou sinergética decorrente da complexa mistura de

componentes encontrada nos rios (BOLOGNESI; HAYASHI, 2011).

6.3 ANÁLISES DE CORRELAÇÃO

Para a comparação dos dados usou-se teste de correlação entre todos os ensaios

realizados, uma correlação significativa foi observada (Tabelas 4, 5, 7 e 8) em relação aos

dados do ensaio cometa alcalino, com os dados do teste do micronúcleo, fato que enfatiza a

força e a plausibilidade dos conjuntos de dados individuais. Em estudos anteriores,

correlações entre EC e MN (em diferentes níveis de organização biológica) foram

comprovadas (ROCHA et al., 2009; SEITZ et al. 2008; BOETTCHER et al., 2010).

No entanto, apesar da comparabilidade de ambos os ensaios, as diferenças observadas

podem indicar diferenças nos tipos de dano ao DNA, potencial diferente para o reparo do

DNA ou impacto de diferentes poluentes. Por exemplo, danos no DNA que podem ser

revelados pelo ensaio do cometa podem potencialmente ser reparados por mecanismos de

76

reparo intracelular do DNA. Por outro lado, os eritrócitos periféricos subjacentes à ausência

de divisão celular e danos permanentes ao DNA observados no MN - incluindo fragmentos de

quebras duplas não reparadas, quebras no nível das cromátides e danos no aparato do fuso

(efeitos aneugênicos) - não podem ser reparados após sua fixação em fragmentos

extracromossômicos (BÜCKER; CONCEIÇÃO, 2012).

Nas análises do Rio Caveiras não observamos correlação entre o ensaio cometa padrão

e a frequência da 8-oxoG, podemos especular que o estresse oxidativo não é o único ou

principal contribuinte do potencial genotóxico detectado, resultado semelhante ao encontrado

por Kolarević et al. (2016), que também utilizou ambos ensaios cometa padrão e modificado

com FPG para avaliar o potencial genotóxico de amostras de água coletadas no Rio Sara, no

sudoeste da Europa, e não encontrou correlação entre o ensaio cometa padrão e o ensaio

modificado com FPG.

Em todos os experimentos o ensaio cometa enzimático com a enzima FPG

correlacionou-se positivamente a enzima ENDO III, mostrando que as lesões ao material

genético causado por estresse oxidativo atingiram tanto purinas (AG) quanto pirimidinas (CT)

uniformemente. A catalase correlacionou-se negativamente a maioria dos parâmetros

analisados, reforçando a ideia de que a água coletada tem baixa qualidade e influenciou no

equilíbrio da produção de enzimas antioxidantes em zebrafish expostos à água coletada.

77

7 CONCLUSÕES

As águas coletadas possuem baixa qualidade, sendo contaminadas com metais, fósforo

e matéria orgânica. Possivelmente essa baixa qualidade hidrológica levou ao desequilíbrio

entre a produção dos antioxidantes e a geração de EROs em zebrafish, levando a alterações

nos níveis de enzimas antioxidantes.

A água possui contaminantes com potencial genotóxico, observado pelo ensaio

cometa, além disso, o ensaio cometa modificado com as enzimas ENDO III e FPG

demonstrou aumento do dano genético decorrente de estresse oxidativo.

Dentro da bateria de bioensaios realizados, em todos os experimentos realizados o

ensaio cometa mostrou a maior sensibilidade para os efeitos da água coletada. Os resultados

do presente estudo mostram a importância de integrar um conjunto de biomarcadores para

identificar os efeitos da contaminação antropogênica.

79

REFERÊNCIAS

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93

ANEXO A – Certificado da Comissão de Ética no Uso de Animais

94

ANEXO B – Concentrações de metais encontrados em três pontos de coleta pertencentes

ao estudo

Valores de concentrações de metais presentes na água consumida nos bairros Anita Garibaldi

e Caravágio, em Ponte Alta e no SASB de Rio Rufino. Os valores são estabelecidos em mg/L.

Portaria 2.914 de 2011 do Ministério da Saúde do Brasil.

b Guidelines for Drinking-water Quality by World Health Organization, 2011.

c Resolução CONAMA 357 de 2005, para classificação de água em Classe I a qual exige

apenas tratamento simplificado para potabilidade.

d Não existem limites máximos estabelecidos por não apresentarem risco à saúde em função

das concentrações observadas em águas naturais

95

ANEXO C – Artigo com as análises prévias de qualidade de água

AVALIAÇÃO E CONTROLE DA POTABILIDADE DE ÁGUA CONSUMIDA EM

PROPRIEDADES RURAIS DA SERRA CATARINENSE.

Resumo – A descontinuidade no abastecimento de água é um problema em muitos

municípios brasileiros, e sua principal dificuldade se encontra na distribuição e

saneamento de regiões remotas e nas zonas rurais, que não contam com sistemas

convencionais de abastecimento de água e acabam buscando soluções alternativas,

como a utilização de águas subterrâneas e superficiais, muitas vezes desenvolvidas

pelos próprios moradores. Desta forma, o presente estudo objetiva a avaliação de

sistemas alternativos de abastecimento de água consumida em municípios

localizados na serra catarinense, incluindo Correia Pinto, Ponte Alta, Rio Rufino e

Urubici, observando e avaliando os parâmetros físico-químicos e microbiológicos da

água consumida. Experimentalmente foram analisados os seguintes parâmetros: pH,

cor, turbidez, sólidos suspensos totais (SST), sólidos totais dissolvidos (STD),

nitrato, nitrito, amônia, condutividade, sulfato, cloro residual livre, ferro, alumínio,

cloreto, dureza, alcalinidade, manganês, fósforo total, e coliformes termotolerantes

(C.T). Os resultados obtidos não apresentaram grandes variações dentre as coletas

e, apesar de as propriedades amostradas, excluindo-se o centro de Rio Rufino, não

possuírem um sistema eficaz de desinfecção da água, a maioria dos parâmetros

analisados encontra-se dentro dos limites estabelecidos pela Portaria nº 2.914/2011.

Deste modo, comparado às demais localidades, o centro do município de Rio Rufino

apresentou os melhores resultados com relação à potabilidade da água consumida

pela população.

Palavras-chave: Qualidade da água. Saneamento. Abastecimento.

Introdução

A preocupação com a quantidade, qualidade e preservação da água vem

crescendo dentro da sociedade contemporânea, sendo esta um recurso

indispensável para os seres vivos e para os ecossistemas. SANTOS (2008) destaca

que a agricultura, a industrialização, o crescimento da população e o

desenvolvimento social, são fatores que necessitam de maior uso e ocupação da

96

água, desta forma podendo ocasionar a contaminação desta, provocando danos ao

meio ambiente.

A crescente dificuldade de abastecimento de água com uma boa qualidade é

um fator preocupante e muito comentado na atualidade. No Brasil, existem muitos

casos de localidades que não usufruem de boas condições financeiras ou não

possuem informações suficientes sobre o assunto, o que acarreta tratamentos que

não são adequados para um determinado local (NASCIMENTO et al., 2012).

Como afirma d’Aguila et al. (2000), existem métodos que proporcionam esta

qualidade e fornecem uma base de desenvolvimento de ações, que devem ser

implementadas juntamente com a população, a fim de garantir segurança no

fornecimento de água com a eliminação dos constituintes presentes na água que

são perigosos a saúde.

Em diversos países, comunidades menores tendem a ter uma proporção

muito menor de população que são servidas por algum tipo de sistema de

distribuição de água potável e de saneamento. Para Magno (2000), as taxas de

serviços de redes de esgoto e coleta de resíduos domésticos são menores do que

em cidades grandes. Desta maneira, as populações que vivem em comunidades

menores não são servidas por serviços coletivos e tecnologias eficientes, sendo

forçadas a encontrar suas próprias soluções, como saneamento individual com

fossas e sumidouros, que são negativas para a saúde e para o meio ambiente.

A problemática de não conter soluções de abastecimento de água acarreta

mais danos ao meio ambiente do que a população local imagina, pois os esgotos e a

água servida são despejados diretamente nos recursos hídricos sem nenhum

tratamento, e isto afeta as comunidades que vivem à jusante destes. De acordo com

Magno (2000), muitas vezes a água poluída é utilizada para irrigação, incluindo

hortaliças e produtos comestíveis, os quais são comumente vistos em comunidades

rurais. Além disso, o aumento de doenças de veiculação hídrica está diretamente

associado à baixa qualidade da água utilizada para o consumo humano (MORAIS et

al., 2016).

Por todas estas condições, tem-se buscado alternativas com tecnologias que

possibilitem a garantia da qualidade da água produzida para abastecimento público.

Esta seleção de tecnologias de água tem possibilitado a criação de diversas

propostas de metodologias. Assim, o método de escolha para implantar obras

97

sanitárias eficientes depende de aspectos sociais, culturais, institucionais, técnicos,

econômicos, financeiros, ambientais e a disponibilidade de recursos locais. (DI

BERNARDO e PAZ, 2008).

Para Campos (2007), a análise de viabilidade econômica, além de possibilitar

a definição do tamanho mínimo do sistema, segundo o tamanho da comunidade,

estabelece critérios para eventuais políticas de tarifação.

No Brasil, aproximadamente 51% do abastecimento público e privados são

realizados por captação subterrânea, através de mais de 200.000 poços tubulares e

1 milhão de cacimbas escavadas (FOSTER, 2003). Em áreas rurais, as águas

subterrâneas também são amplamente exploradas e constituem o recurso mais

econômico; esses poços são perfurados sem controle, o que origina um

abastecimento não tratado e sem monitoramento ou proteção sanitária.

Desta forma, a descontinuidade na distribuição de água é um grande

problema em muitos municípios brasileiros, e a principal dificuldade se encontra na

distribuição e saneamento de regiões remotas e nas zonas rurais. Estas regiões,

além de possuírem uma população baixa, por sua vez encontram-se distantes dos

centros urbanos e não contam com sistemas convencionais de abastecimento de

água. Buscando assim, a utilização de águas subterrâneas e superficiais como

soluções alternativas para este problema, que normalmente são desenvolvidas pelos

próprios moradores dessas regiões.

Com isso o presente estudo visa a avaliação de sistemas alternativos de

abastecimento de água consumida em propriedades localizadas em municípios da

serra catarinense, incluindo Correia Pinto, Ponte Alta, Rio Rufino e Urubici,

observando e avaliando os parâmetros físico-químicos e microbiológicos da água

consumida.

Material e métodos

O estudo foi realizado na região serrana de Santa Catarina, em propriedades

rurais que apresentam dificuldades com relação ao abastecimento de água. Até o

momento foram realizadas duas coletas com um intervalo de tempo de

aproximadamente um mês. A universidade com o apoio do CISAMA (Consórcio

Intermunicipal Serra Catarinense), o consórcio de municípios da região de estudo,

elencou 06 propriedades rurais, situadas nas comunidades de Pátria Livre,

98

localizada no município Correia Pinto, com 14.785 habitantes; no centro de Rio

Rufino e em Cerro Baio, também pertencente a Rio Rufino, com 2.436 habitantes;

em Anita Garibaldi e Caravággio, situadas no município de Ponte Alta, com 4.894

habitantes; e no município de Urubici, com 10.699 habitantes (IBGE,2010).

As amostras foram coletadas de poços dentro das propriedades, seguindo as

recomendações do guia nacional de coleta e preservação de amostras da Agência

Nacional de Águas (ANA, 2011). Os parâmetros físico-químicos e biológicos

utilizados para a avaliação da potabilidade da água foram selecionados em função

do uso e ocupação do solo no entorno da bacia, sendo estes: pH, cor, turbidez,

sólidos suspensos totais (SST), sólidos totais dissolvidos (STD), nitrato, nitrito,

amônia, condutividade, sulfato, cloro residual livre, ferro, alumínio, cloreto, dureza,

alcalinidade, manganês, fósforo total, e coliformes termotolerantes (C.T) (AGUIAR et

al.,2015).

Todos os parâmetros em questão foram mensurados em duplicatas, seguindo

as normas propostas pelo Standard Methods for the Examination of Water and

Wastewater (APHA, 2005) e utilizando-se os espectrofotômetros Nova 60 Merck e

Pharo 300 Merck. Coliformes termotolerantes foram identificados e medidos

utilizando a técnica de filtragem por membrana e posterior incubação a 44,5ºC em

meio mFC (ágar coliformes fecais) água e ácido rosólico como indicador. As análises

de pH, sólidos totais dissolvidos e condutividade foram realizadas em um pHmêtro

da marca HOMIS (AGUIAR et al.,2015).

Resultados e discussão

A região serrana de Santa Catarina é formada por 18 municípios que

constituem a associação dos municípios da região serrana (AMURES). Esta região

apresenta como peculiaridade a presença de municípios com população abaixo de

10.000 habitantes. Dados do IBGE de 2010 apontam que o município mais populoso

da região é Lages, com aproximadamente 160.000 habitantes. Os outros 17 somam

uma população em torno de 120.000 habitantes. Além da baixa população, grande

parte dos habitantes encontra-se na zona rural, distante dos centros urbanos que

contam com sistemas convencionais de abastecimento de água.

99

Diante desta problemática, os habitantes da zona rural utilizam soluções

alternativas de abastecimento que se constituem basicamente em águas

subterrâneas e também águas superficiais. Estas soluções alternativas normalmente

são aplicadas pelos próprios moradores e constam não envolver parâmetros

técnicos de projeto e tampouco é realizado um monitoramento da qualidade da água

que assegure os padrões de potabilidade exigidos pelo ministério da saúde, que são

expressos na portaria n° 2914 de 12 de dezembro de 2011.

A falta de controle da qualidade da água ocasiona diversas doenças de

veiculação hídrica que afetam a qualidade de vida das pessoas que consomem esta

água. Além da potabilidade, outros usos múltiplos como o preparo de alimentos

artesanais como queijo ou mesmo a piscicultura são afetados pela qualidade da

água. Dentre possíveis causas que possam comprometer a qualidade da água

consumida nas propriedades rurais destacam-se a falta de esgotamento sanitário e

a prática da silvicultura. Neste sentido, a presente proposta é justificada pela

necessidade dos moradores rurais conhecerem a qualidade da água consumida e

também dos mesmos receberem orientações sobre o tratamento da água que

condicione a mesma aos usos múltiplos nas propriedades rurais.

Práticas como estas justificam o papel da universidade enquanto instituição

pública responsável pelo desenvolvimento do conhecimento e aplicação do mesmo

na resolução de problemas da comunidade, especialmente através da realização de

atividades de extensão.

Após a realização das análises laboratoriais dos parâmetros previamente

citados obteve-se os seguintes resultados amostrados na Tabela 1.

100

Parâmetro Anita

Garibaldi Rio Rufino

Caravággio

Cerro Baio

*Urubici

Pátria

Livre

VMP Portaria

2.914/2011

pH 7,43 ±0,01 7,61 ±0,11 7,23 ±0,33 7,56 ±0,04

7,12 7,19

±0,35 6,0-9,0

Cor (uC) <0,2 ±0 4,05 ±1,05 0,5 5,15 ±0,15

<1 14 ±10 15

Turbidez (uT)

<1 ±0 1 ±0,5 1,5 ±0 1 ±0,5 <1 3 ±2 5

Amônia (mg/L)

0,26 ±0,06 0,24 ±0,2 0,36 ±0,17 0,52 ±0,18

0,31 0,48

±0,17 1,5

Nitrito (mg/L) 0,06 ±0,06 0,05 ±0,05 0,08 ±0,04 0,03 ±0,02

<0,1 0,08

±0,04 1

Nitrato (mg/L)

<1 ±0 <1 ±0,36 <1 ±0,52 5,03 ±1,67

0 1,99

±0,31 10

Sólidos Suspensos

(mg/L) 4 ±2 3 ±0 5 ±1 4 ±1 3

15 ±10 -

STD (mg/L) 110,65 ±77,35

30,15 ±8,85 136,18 ±1,35 22,25 ±0,55

34,94 39,35

±9,5 1000

Condutividade

65,21 ±1,4 49,95 ±7,95 90,45 ±2,1 42,35 ±3,25

68,75 78,72

±19,1 -

Sulfato (mg/L)

28,53 ±9,5 62 ±38 32 ±5 105,5 ±81,5

41 35 ±9 250

Cloro R.L (mg/L)

0,0 ±0,0 0,18 ±0,01 0,0 ±0,0 0,0 ±0,0 0,0 0,0 ±0,0 0,2-5,0

Ferro (mg/L) 0,09 ±0,06 0,03 ±0 0,03 ±0,1 0,03 ±0 0,05 0,07

±0,03 0,3

Alumínio (mg/L)

<0,1 ±0 <0,1 ±0 <0,1 ±0 <0,1 ±0 <0,1 <0,1 ±0 0,2

Cloreto (mg/L)

21,38 ±7,05 24,71 ±10,74

21,12 ±7,42 22,95 ±8,95

14,43 24,47

±10,57 250

Dureza (mgCaCO3/L

) 0 ±0 0 ±0 0,03 ±0,25

0,01 ±0,15

0 0,2 ±0

500

Alcalinidade (mg/L)

63,75 ±31,75

24 ±12 83 ±48 14 ±7 * 61 ±40 -

Manganês (mg/L)

0 ±0 0 ±0 0 ±0 0 ±0 0 0 ±0 0,1

101

Tabela 1: Médias e desvio padrão das comunidades amostradas. Nota *: Na localidade de Urubici foi efetuada apenas uma coleta, por

problemas logísticos. Assim como, na amostragem realizada o ensaio de alcalinidade não doi desenvolvido por falta de amostra.

Com base nos dados da Tabela 1, pode-se observar a constância no valor de

pH das amostras, todas em torno de 7,0, sem haver mudanças significativas entre

as amostragens. Desta forma, todas as localidades se encontram dentro dos limites

de pH estabelecidos pelo Ministério Público (6,0-9,0), da Portaria n° 2.914/2011

(6,0-9,0), que dispõe sobre os procedimentos de controle e de vigilância da

qualidade da água para consumo humano.

A cor é um parâmetro físico-químico exigido pela legislação em vigor, sendo

seu limite máximo de 15uC. Segundo Lucas (2007), este parâmetro está relacionado

com a quantidade de partículas (em sua maioria orgânicas) presentes nos corpos

hídricos. Observou-se nos dados analisados que os valores obtidos de cor

apresentaram uma moderada variação de uma amostra para outra. O assentamento

de Anita Garibaldi apresentou resultados abaixo do limite de quantificação inferior do

espectrofotômetro utilizado para a análise (0,2uC) (NOVA 60 MERK).

Já a comunidade de Pátria Livre obteve os maiores valores de cor, com uma

alta variação entre as análises, fato que pode estar relacionado com a mudança

climática, ocasionando chuvas e carreamento de sedimentos (carga orgânica) para

os poços de onde a água é coletada.

Segundo a definição de Sperling (2005), a turbidez representa o grau de

interferência da passagem de luz através da água devido à existência de sólidos em

suspensão. De acordo com a Portaria Portaria nº 2914/2011, o valor máximo

permitido é de 5,0 uT. Pode-se observar que Anita Garibaldi e Urubici novamente

registraram valores abaixo do limite de quantificação inferior do espectrofotômetro

(1uT) (NOVA 60, MERK). Contudo, na comunidade de Pátria Livre observa-se um

valor mais elevado (3uT), também observou-se a maior variação nesse ponto,

Fósforo (mg/L)

0,26 ±0,24 0,02 ±0 0,34 ±0,25 0,21 ±0,1

<0,05 0,54

±0,54 0,15

Coliformes fecais A/P

A A P P P P

Ausênci

a

102

possivelmente devido à chuva, com o aumento dos sólidos em suspensão na água,

tornando-a mais turva.

Em relação aos nitrogenados, observa-se pequenas concentrações e

variações sutis na forma de nitrito e amônia, tal fato se dá à instabilidade dos

compostos em questão. Já na forma de nitrato observa-se valores elevados em

Cerro Baio (5,0mg/L) e Pátria Livre (2mg/L), quando comparados aos demais locais,

isto é relacionado com a aplicação de fertilizantes nitrogenados em plantações,

cultivo do solo, esterco animal, e ainda esgoto humano depositado em sistemas

sépticos e deposição atmosférica (BAIRD; CANN, 2011.)

Quando as concentrações de nitrato na água ultrapassam os limites

estipulados pela Portaria nº 2.914/2011 (10mgNO3/L) acarretam uma série de danos

ao organismo humano, incluindo dores de cabeça, hipotensão postural (devido à

vasodilatação), câncer de estômago, entre outros.

Pode-se relacionar o grau de turbidez de um corpo hídrico com a

concentração de sólidos suspensos, visto que são parâmetros diretamente

proporcionais, observa-se nas análises que os locais com maior índice de turbidez

foram aqueles que possuíam uma elevada concentração de sólidos em suspensão

na água. Sendo assim, os locais com as maiores concentrações desses sólidos

foram Pátria Livre e Caravággio, tal fato está relacionado principalmente às chuvas,

que por sua vez lixiviam sedimentos para o corpo hídrico

A condutividade e os sólidos totais dissolvidos (STD) também são parâmetros

proporcionais, analisando-se os dados da Tabela 1, observa-se que as amostras

com maiores concentrações de STD foram as mesmas com maior condutividade

elétrica. Tal fato se dá pois estes sólidos estão relacionados com íons, logo quanto

maior a quantidade de STD mais íons estarão presentes, e assim terão uma

capacidade elevada de condução elétrica. A condutividade é um parâmetro que

necessita de um acompanhamento periódico, pois o seu aumento pode significar

sérios problemas na qualidade da água.

Nas localidades analisadas verificou-se concentrações não preocupantes de

íons de sulfato, sendo estes íons encontrados principalmente em minerais rochosos,

tais como mirabilita, tenardita, barita entre outros, desta forma se situando dentro

dos limites configurados pela Portaria nº 2.914/2011 (250mgSO4²/L).

103

Devido à falta de estrutura adequada e à falta de informação da população

envolvida sobre o funcionamento do sistema de abastecimento de água, dentro do

quadro de localidades amostradas apenas a região central de Rio Rufino conta com

um sistema eficaz de desinfecção da água, como já mencionado anteriormente, os

demais locais carecem de uma descontaminação eficiente, não há técnicos

responsáveis pela cloração, que por sua vez é realizada por pessoas não

qualificadas, já que nenhum tipo de fiscalização é exercida dentro destas

comunidades.

Em todos os municípios observou-se concentrações abaixo do limite inferior

regulamentados pela Portaria nº 2.914/2011 (0,2mg/L) de cloro residual livre, e

apenas Rio Rufino beirou o valor mínimo aceito (0,18mg/L), o que evidencia a falta

de suporte para estas comunidades. O restante dos locais apresentaram valores

abaixo da curva de quantificação inferior do espectrofotômetro utilizado para o

ensaio (PHARO 300 MERCK).

De acordo com Siega et al. (2002), metais pesados são contaminantes

ambientais estáveis e persistentes, uma vez que não podem ser degradados ou

destruídos. Portanto, o contato com metais pesados, seja por meio da ingestão da

água ou de organismos aquáticos contaminados, pode causar danos permanentes

ao ser humano, disfunções no sistema nervoso e até mesmo câncer. Todas as

regiões onde foram realizadas as amostragens revelaram baixas concentrações e

variações reduzidas dos elementos alumínio, ferro e manganês, visto que não há

contribuição antrópica para elevar os teores destes elementos, com isso respeitando

os limites propostos pela Portaria nº 2.914/2011.

Sendo um dos principais ânions inorgânicos em águas naturais e residuárias,

o cloro na forma de íon cloreto (Cl-) gera um sabor que varia em função da sua

concentração, como também da composição química da água. Com base na Tabela

1, é visto que os locais analisados possuem pequenas concentrações de cloro na

forma de íon cloreto (Cl-), apresentando variações elevadas de uma amostragem

para outra, isto pode estar relacionado à diluição das amostras pela água da chuva

ou pelo possível aumento de poluição gerada por esgotos domésticos. Mesmo assim

todos os níveis do elemento Cl- encontraram-se dentro dos valores permitidos pela

Portaria nº 2.914/2011 (250mg/L).

104

Quando encontrado nos ecossistemas aquáticos, o grupo dos fosfatos pode

ter origem de fontes naturais como rochas, bacia de drenagem, material particulado

presente na atmosfera, decomposição de organismos de origem alóctone, ou de

fontes artificiais como despejo de esgotos domésticos ou industriais (ESTEVES,

1998).

A partir da análise dos dados gerados na Tabela 1, nota-se que de todas as

localidades apenas as localidades de Urubici e Rio Rufino apresentaram valores que

se enquadram dentro do permitido pela legislação em questão (0,15mgP-/l).

Houve um aumento da primeira coleta para a segunda, e isto possivelmente

está relacionado com a falta de esgotamento sanitário, uso de agrotóxicos e

fertilizantes. Vale ressaltar que níveis elevados de fósforo no organismo humano

podem acarretar uma série de danos, tais como hipertensão, confusão mental, e

sensação de peso nas pernas.

Como pode-se observar todas as amostras apresentaram valores de dureza

próximos ou iguais a zero (0), com variações nulas entre as coletas. Fato que não se

repetiu quanto aos teores de alcalinidade nas amostras, variando de 24mg/L até

83mg/L. A Portaria n°2.914/2011 não estipula limites para tal parâmetro. Como

salienta AZEVEDO (1987) águas relativamente alcalinas e de dureza baixa,

possuem características de águas primárias, ou seja, águas que estiveram em

contato com rochas primárias da crosta terrestre: granitos, basaltos e gneisses.

Almeida et al., (1993) afirma que os coliformes fecais são apenas uma fração

do grupo coliformes totais, mas possuem uma maior relevância na avaliação da

qualidade sanitária do ambiente, sendo assim, o índice de coliformes fecais é um

excelente indicador de qualidade da água.

É visto que apenas as localidades de Anita Garibaldi e Rio Rufino não

apresentaram coliformes fecais. Sabe-se que somente Rio Rufino possui um sistema

eficaz de desinfecção da água, com isso pode-se explicar que mesmo com a

presença de cloro residual livre nas amostras, foi revelado coliformes fecais nas

propriedades de Caravággio, Ponte Alta, Cerro Baio e Urubici. Este resultado pode

estar diretamente relacionado à ausência de esgotamento sanitário adequado nas

regiões adjacentes, o que pode contribuir diretamente para a proliferação de

microrganismos e parasitas que podem causar doenças (Ferreira et al., 2017). Além

disso, segundo Fabregat (2015) a grande quantidade de animais de sangue quente

105

em volta da propriedade, tendo seus excrementos lixiviados para os corpos hídricos

em questão é mais um fator para a presença dos coliformes fecais nas regiões

estudadas.

Conclusão

Em virtude dos resultados obtidos pode-se concluir que apesar das

adversidades, de um modo geral as propriedades rurais avaliadas permaneceram

dentro dos limites impostos pela Portaria n° 2.914/2011.

No cenário decorrente o município de Rio Rufino se destaca, na região do

centro da cidade, obtendo os melhores resultados no quesito de potabilidade da

água, resultado este alcançado com a ajuda do Laboratório de Tratamento de Águas

e Efluentes (LABTRAT) em parceria com o órgão CISAMA, que ofereceram apoio,

cursos de capacitação para utilizar alguns equipamentos, e continua a realizar as

coletas e análises dos parâmetros físico-químicos e biológicos de qualidade da água

periodicamente.

Estudos como este mostram-se de suma importância para instruir e auxiliar as

populações rurais, que sofrem com a falta de saneamento adequado e água de

qualidade, e de certa forma são esquecidas pelos governantes.

Portanto, sugere-se a continuidade deste estudo para que se possa atender

melhor a população de todas as comunidades, e obter uma gama maior de valores

para um estudo mais aprofundado, tanto por meio das análises laboratoriais da

qualidade da água que abastece os habitantes quanto por meio de cursos e oficinas

de educação ambiental, a fim de instruir melhor a população quanto à importância

dos recursos hídricos, bem como garantir a eficácia do sistema alternativo de

tratamento de água.

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