anÁlise do conteÚdo bacteriano de infecÇÕes...
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UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS
FACULDADE DE ODONTOLOGIA DE PIRACICABA
AUGUSTO RODRIGUES LIMA
ANÁLISE DO CONTEÚDO BACTERIANO DE INFECÇÕES
ENDODÔNTICAS PRIMÁRIAS SINTOMÁTICAS E ASSINTOMÁTICAS E
SUSCETIBILIDADE DE BACTÉRIAS ESPECÍFICAS A AGENTES
ANTIMICROBIANOS
Piracicaba
2017
AUGUSTO RODRIGUES LIMA
ANÁLISE DO CONTEÚDO BACTERIANO DE INFECÇÕES
ENDODÔNTICAS PRIMÁRIAS SINTOMÁTICAS E ASSINTOMÁTICAS E
SUSCETIBILIDADE DE BACTÉRIAS ESPECÍFICAS A AGENTES
ANTIMICROBIANOS
Dissertação apresentada à Faculdade de Odontologia
de Piracicaba da Universidade Estadual de Campinas
como parte dos requisitos exigidos para a obtenção do
título de Mestre em Clínica Odontológica, na área de
Endodontia.
Orientadora: Profa Dra. Brenda Paula Figueiredo de Almeida Gomes
ESTE EXEMPLAR CORRESPONDE À VERSÃO
FINAL DA DISSERTAÇÃO DEFENDIDA PELO
ALUNO AUGUSTO RODRIGUES LIMA, E
ORIENTADA PELA PROFA. DRA. BRENDA
PAULA FIGUEIREDO DE ALMEIDA GOMES.
Piracicaba
2017
DEDICATÓRIA
Dedico este trabalho a ti, Senhor. Sem a tua permissão nada seria
concretizado. Agradeço por me proteger e por me conceber tantas alegrias.
Aos meus pais Luciana Herculina de Lima Lopes e Nelson Rodrigues
Soares Filho e ao meu segundo pai Tonismar Batista Lopes. O apoio incondicional
de vocês é a ponte para a minha felicidade. Todas as minhas conquistas são pautadas
na formação que eu obtive de vocês e, por isso, são também suas. Mais uma etapa
concluída graças ao suporte que a minha família me dá. Obrigado pela paciência,
dedicação, carinho e comprometimento com nossa família.
A meus irmãos Murillo Lima Rodrigues e Pedro Lima Lopes. O apoio de
vocês é essencial para que eu possa seguir minha jornada. Muito obrigado pela
compreensão e pela ajuda.
À minha namorada, Andrea Cardoso Pereira. Agradeço por ser minha
grande companheira. Você me acompanhou desde a prova de seleção para o
mestrado e sempre me incentivou a seguir nesta jornada. Eu sou muito grato pelo seu
respeito, carinho, cuidado e admiração. Este período foi composto por diversas
realizações de sonhos e você fez questão de participar de todos os momentos.
À minha orientadora, Profa. Dra. Brenda Paula Figueiredo de Almeida
Gomes. Agradeço por confiar em meu potencial e por todas as oportunidades que a
senhora me proporciona. Mais que orientadora, a senhora é uma formadora, isto é ser
verdadeiramente mestre. A senhora contribuiu muito para a minha formação
profissional e pessoal. Eu sou grato por seus ensinamentos e cuidados, pois eu sei
que é sempre pensando no meu bem. Este período foi muito importante em minha
vida e fico feliz por tê-la como referência.
AGRADECIMENTOS
À direção da Faculdade de Odontologia de Piracicaba, da Universidade
Estadual de Campinas, na pessoa do seu diretor, o Prof Dr. Guilherme Elias
Pessanha Henriques.
À Fundação de Amparo a Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP)
pela concessão da bolsa de mestrado, processo nº 2014/27366-8 e pela concessão
da bolsa de estágio no exterior BEPE – Mestrado, processo nº 2016/18512-6.
À Profa. Dra. Cínthia Pereira Machado Tabchoury, coordenadora do
Programa de Pós-Graduação da FOP/UNICAMP e à Profa Dra. Karina Gonzales
Silvério Ruiz, coordenadora do curso de Pós-Graduação em Clínica Odontológica.
Aos professores da área de Endodontia, Profa. Dra. Adriana de Jesus
Soares, Prof. Dr. Alexandre Augusto Zaia, Profa. Dra. Brenda Paula Figueiredo
de Almeida Gomes, Prof. Dr. Caio Cezar Randi Ferraz e Prof. Dr. José Flávio
Affonso de Almeida.
Aos professores que participaram de minha banca de qualificação, Prof.
Dr. Carlos Augusto Moraes Souto Pantoja, Prof. Dr. Rafael Nóbrega Stipp e Prof.
Dr. Daniel Rodrigo Herrera Morante. Vocês contribuíram muito na correção de
minha dissertação. Todas as considerações foram pertinentes e ajudaram a
enriquecer meu trabalho.
Aos professores membros da banca de dissertação de mestrado, Profa.
Dra. Brenda Paula Figueiredo de Almeida Gomes, Prof. Dr. Alexandre Augusto
Zaia e Prof. Dr. Francisco Montagner, pelas inestimáveis contribuições e
considerações dadas a este trabalho.
Aos professores Profa. Dra. Jacqueline Abranches e Prof. José Lemos,
e a todos os colegas que fiz durante o estágio na Universidade da Flórida. Vocês
proporcionaram um estágio muito proveitoso e muito importante para mim.
Ao Prof. Dr. Ricardo Della Coletta e Fabio Haach Téo, pela
disponibilidade em me ajudar e contribuir para a realização desta pesquisa. Todas as
vezes que eu precisei sempre fui muito bem recebido. Agradeço por todos os
ensinamentos.
As funcionárias Ana Cristina Godoy, Maria Helídia Neves Pereira e
Tifanny Abreu.
Ao meu grande amigo Maicon Ricardo Zieberg Passini que possui uma
personalidade ímpar e é referência de caráter e humildade. Muito obrigado por ter
extrapolado a relação de funcionário/aluno e de ter me dado a oportunidade de ser
seu amigo.
Aos colegas de mestrado Bruna Alves Taveira Ueno, Bruna Milaré
Angelieri, Eloá Cristina Bícego Pereira, Rafaela Casadei Chapola e Rodrigo
Arruda.
Aos meus dois grandes amigos do mestrado Diogo Henrique da Silva e
Priscila Amanda Franscisco pela grande parceria nessa jornada. A gente passou
por muitas coisas juntos e entre momentos difíceis, e outros muito agradáveis,
conseguimos fortalecer uma bela amizade. Tenho a certeza que a pós-graduação não
teria sido a mesma sem vocês. Obrigado pelo carinho, paciência, companheirismo e
amizade sincera.
As minhas amigas Flavia Saavedra e Jaqueline Lazzari pelo
companheirismo e apoio ao longo destes dois anos. Tive a sorte de poder contar com
cada uma de vocês e espero ter retribuído de alguma maneira tudo que vocês me
ajudaram.
Aos colegas de doutorado Aline Cristine Gomes, Ana Carolina Correia
Neto, Ariane Marinho, Erika Manuela Clavijo, Maria Cristina Carvalho, Mario Luis
Zuolo, Thais Mageste, Tiago Pereira Rosa.
Ao meu amigo Felipe Nogueira Anacleto que possui uma generosidade
incrível. Sua amizade é muito importante para mim e espero poder correspondê-la
sempre. Tenho certeza que nossa amizade se fortalecerá cada vez mais.
Ao meu amigo Marlos Barbosa Ribeiro que aceitou o desafio de me co-
orientar durante o meu estágio no laboratório e com muita dedicação me preparou
para o mestrado. Fico feliz por contar com sua parceria e, sobretudo, com a sua
amizade durante todo este período.
As minhas amigas Ana Carolina Pimentel, Aniele Carvalho Lacerda e
Daniela Cristina Miyagaki que me acompanham desde a graduação. Vocês são
importantes na minha trajetória profissional e com o tempo de convivência se
mostraram minhas amigas. Podem ter certeza que vocês fazem muita falta em
Piracicaba.
Ao meu amigo Daniel Rodrigo Herrera que também me acompanha desde
o período de graduação. Obrigada pelo carinho, atenção, pelos ensinamentos
transmitidos e por todos os momentos de alegria e diversão em churrascos, viagens
e congressos.
Ao meu amigo Carlos Augusto Pantoja por todo o incentivo e
oportunidade oferecidos na evolução da minha prática clínica e por todos os
ensinamentos. Tenho a certeza que vamos ter muitos mais momentos bacanas nesta
jornada.
Ao meu amigo Bruno Vilela Muniz. Obrigado pela agradável convivência,
pelos conhecimentos compartilhados e bons momentos vividos durante esses dois
anos.
A aluna da iniciação científica Ana Beatriz Safady Lopes por confiar em
mim. A cada dia eu aprendo mais com você e me esforço para poder corresponder às
suas expectativas.
Aos meus amigos de Goiânia, por me mostrarem que o tempo e a
distância não são capazes de acabar com uma amizade verdadeira. Vocês estão
presentes nas minhas melhores histórias e lembranças e são pessoas indispensáveis
na minha vida.
A minha avó Maria Madalena de Lima. Obrigada por todo o amor que
sempre dedicou a mim. E a toda minha família, que mesmo distante, sempre me
incentivou e vibrou com minhas conquistas.
A todos os pacientes que participaram da minha pesquisa, obrigado pela
confiança em mim. Vocês foram essenciais para a concretização deste sonho e dedico
esta vitória a cada um de vocês.
A todos que participaram direta ou indiretamente, contribuindo para
realização deste trabalho.
RESUMO
Dentes com necrose pulpar, sintomatologia dolorosa e destruição óssea
periapical tendem a ser colonizados por uma microbiota anaeróbica mais complexa
quando comparada aos casos assintomáticos. Bactérias de pigmento negro (BPN)
incluindo as espécies Prevotella e Porphyromonas e Fusobacterium ssp. têm sido
frequentemente isoladas/detectadas de casos sintomáticos. Entretanto, devido ao uso
indiscriminado de agentes antimicrobianos, elas têm desenvolvido resistência aos
mesmos. Assim, o presente estudo teve como objetivos: a) estudar a composição da
microbiota de dentes com necrose pulpar sintomáticos (i.e. com presença de
abscesso periapical) e assintomáticos através da técnica de checkerboard; b)
determinar a suscetibilidade das BPN e Fusobacterium ssp identificados através do
sequenciamento genético, frente aos antimicrobianos mais empregados na clínica
odontológica e c) correlacionar achados clínicos com o conteúdo microbiológico.
Foram selecionados pacientes com necessidade de intervenção endodôntica
apresentando ou não sintomatologia dolorosa. Amostras microbiológicas foram
coletadas de 20 canais radiculares e também do abscesso periapical (n=10). Parte
das amostras microbiológicas foi processada através do checkerboard, e outra parte
foi diluída, plaqueada e incubada, e os microrganismos isolados e identificados
através do sequenciamento genético. A suscetibilidade antimicrobiana das bactérias
BPN e Fusobacterium ssp foi determinada através do método E-test, utilizando os
antibióticos: benzilpenicilina, amoxicilina, amoxicilina + ácido clavulânico, eritromicina,
azitromicina, metronidazol e clindamicina. A microbiota dos três sítios investigados
revelou uma grande diversidade de espécies, incluindo bactérias do gênero Prevotella
e Porphyromonas, com associações positivas e negativas (p<0,05). Não houve
associações estatisticamente signficantes entre microrganismos e sinais e sintomas
clínicos observados (p> 0,05). Em relação ao E-test, todas as cepas isoladas se
mostraram sensíveis a amoxicilina associada ao ácido clavulânico. Azitromicina foi o
antibiótico menos efetivo. Concluiu-se que a microbiota presente nos casos
sintomáticos é mais complexa que a dos casos assintomáticos com lesão periapical,
com um maior número de associações positivas e negativas entre os microrganismos.
A maioria das espécies bacterianas demonstrou algum grau de resistência a todos os
agentes antimicrobianos testados.
Palavras-chaves: Endodontia. Abscesso. Microbiologia. Antibacterianos.
ABSTRACT
Teeth with pulp necrosis presenting symptomatology and periapical bone destruction
tend to be colonized by a more complex anaerobic microbiota compared to the
asymptomatic cases. Black pigmented bacteria (BPB), including Prevotella and
Porphyromonas ssp, and Fusobacterium ssp. have been frequently isolated/ detected
in symptomatic cases. However, due to the indiscrimated use of antimicrobial agents,
resistance to them has been developed. Thus, the aims of this study were: a) to
investigate the composition of the microbiota of symptomatic (ie the presence of
periapical abscess) and asymptomatic teeth with pulp necrosis by checkerboard; b) to
determine the antimicrobial susceptibility of BPB and Fusobacterium ssp., identified by
sequencing, in front of the most commonly used antimicrobial agents in the dental
clinics; and c) to correlate the clinical findings with the microbial date. Patients in need
of endodontic therapy due to pulp necrosis with the presence of symptomatology (n =
10) or asymptomatic (n = 10), were selected. Samples for microbiological analysis
were collected from 20 root canals, as well as from the dental abscess (n = 10). Part
of the microbial samples were processed by checkerboard, and another part was
diluted, plated and incubated, and the isolated microorganisms identified by genetic
sequencing. The antimicrobial susceptibility of BPB and Fusobacterium ssp was
determined by the E-test method using the antibiotics: benzylpenicillin, amoxicillin,
amoxicillin + clavulanic acid, erythromycin, azithromycin, clindamycin and
metronidazole. The microbiota of the three sites investigated revealed a great diversity
of species, including bacteria of the genus Prevotella and Porphyromonas, with
positive and negative associations (p <0.05). There was no statistically significance
diferences in the association between microorganisms and clinical signs and
symptoms (p> 0.05). The results of the E-test showed that all strains isolated were
sensitive to amoxicillin associated with clavulanic acid. Azithromycin was the least
effective antibiotic. In conclusion, the microbiota of symptomatic cases is more
complex than the asymptomatic cases with apical periododontitis, with a greater
number of positive and negative associations between the microorganisms. The
majority of the selected bacteria showed some resistance to all antimicrobial agents
tested.
Key words: Endodontics. Abscess. Microbiology. Anti-bacterial agents.
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO ................................................................................................................................. 14
2 REVISÃO DA LITERATURA ......................................................................................................... 17
2.1 Microbiota da infecção endodôntica primária ...................................................................... 17
2.2 A utilização da técnica do checkerboard DNA-DNA Hybridization em endodontia ....... 22
2.3 Suscetibilidade antimicrobiana (E-test) em endodontia ..................................................... 28
3 PROPOSIÇÃO ................................................................................................................................. 31
3.1 Objetivo: .................................................................................................................................... 31
3.2 Objetivos Específicos: ............................................................................................................. 31
4 MATERIAL E MÉTODOS .............................................................................................................. 32
4.1 Local da pesquisa .................................................................................................................... 32
4.2 Seleção dos participantes da pesquisa ................................................................................ 32
4.3 Grupos experimentais ............................................................................................................. 32
4.4 Critérios de inclusão e exclusão, aspectos clínicos e radiográficos ................................ 32
4.5 Coleta de amostras ................................................................................................................. 33
4.6 Procedimentos Laboratoriais ................................................................................................. 35
4.6.1 Checkerboard DNA-DNA Hibridization ......................................................................... 35
4.6.2 Sequenciamento genético do gene 16S rRNA ............................................................ 39
4.6.3 Suscetibilidade antimicrobiana (E-test) ......................................................................... 40
4.7 Análise de dados ..................................................................................................................... 41
5 RESULTADOS ................................................................................................................................ 42
5.1 Caracterização da microbiota presente em canais radiculares de dentes com
necessidade de intervenção endodôntica, com lesão periapical e sem sintomatología ..... 42
5.2 Caracterização da microbiota presente em canais radiculares e abscessos apicais de
dentes com necessidade de intervenção endodôntica com necrose pulpar associado a
abscesso apical e sintomatologia dolorosa ................................................................................ 47
5.3 Suscetibilidade aos agentes antimicrobianos (E-test) ....................................................... 60
6 DISCUSSÃO .................................................................................................................................... 66
6.1 Caracterização da microbiota presente em canais radiculares de dentes com
necessidade de intervenção endodôntica, com lesão periapical e sem sintomatologia ..... 66
6.2 Caracterização da microbiota presente em canais radiculares e abscessos apicais de
dentes com necessidade de intervenção endodôntica com necrose pulpar associado a
abscesso apical e sintomatologia dolorosa ................................................................................ 68
6.3 Suscetibilidade aos agentes antimicrobianos (E-test) ....................................................... 69
7 CONCLUSÃO .................................................................................................................................. 74
REFERÊNCIAS .................................................................................................................................. 75
Apêndice 1 – Termo de Consentimento Livre e Esclarecido ................................................... 84
Apêndice 2 – Tabelas das Bacterias pelo Checkerboard em casos sintomáticos e
assintomáticos asociados a abscesos apicais .......................................................................... 87
Quadro 1. Bactérias identificadas pelo Checkerboard em canais radiculares de dentes
com necessidade de intervenção endodôntica, com lesão periapical e sem
sintomatologia ................................................................................................................................. 87
Quadro 2. Bactérias identificadas pelo Checkerboard em canais radiculares e abscessos
apicais de dentes com necessidade de intervenção endodôntica com necrose pulpar
associado a abscesso apical e sintomatologia dolorosa ......................................................... 90
Anexo 1 - Certificado do Comitê de Ética em Pesquisa da FOP-UNICAMP ........................ 97
14
1 INTRODUÇÃO
Uma vez que a maioria das bactérias capazes de infectar os canais
radiculares é proveniente da cavidade oral (Gomes et al., 1994a), esses
microrganismos representam um importante papel no desenvolvimento e manutenção
de patologias pulpares e periapicais (Kakehashi et al., 1965); sendo sua sobrevivência
intra-radicular e suas propriedades patogênicas influenciadas por uma combinação de
fatores, incluindo: interação sinérgica entre espécies, capacidade de interferir e evadir
a resposta do hospedeiro e os fatores de virulência (Nair, 2004). Entretanto, os canais
radiculares formam um ambiente seletivo aos microrganismos, permitindo que apenas
algumas espécies sejam capazes de colonizar este sistema (Sundqvist, 1992; Gomes
et al., 1994b)
Em artigo de revisão da literatura, Sundqvist (1994) observou que cerca de
300 grupos bacterianos eram capazes de colonizar a cavidade oral. No entanto,
devido às restrições nutricionais e ambientais, apenas um seleto grupo de
microrganismos era capaz de se adaptar às condições impostas pelo ecossistema que
se desenvolve no canal radicular com necrose pulpar. Hoje em dia sabemos que o
número de bactérias é mais alto, com cerca de 916 espécies (Santos et al., 2011).
O terço apical dos canais radiculares é considerado uma área estratégica
com complexas características anatômicas onde o sistema imune não é capaz de
atuar durante a necrose e infecção pulpar. Se a agressão causada por bactérias
provenientes do canal radicular e protruindo pelo forame apical é de alta intensidade,
há uma resposta inflamatória aguda. Quando a resposta inflamatória não consegue
eliminar o agente agressor ou reduzir a intensidade da injúria, há uma exacerbação
caracterizada pela formação de uma inflamação com liquefação tecidual, gerando o
pus. Forma-se então um abscesso periapical agudo (Siqueira et al., 2004). Se o
abcesso não for tratado adequadamente, pode levar a perda dentária e ter
consequencias mais sérias tais como septicemia, em que há disseminação dos
microorganismos nocivos através dos sistemas linfático e arterial, quadro este que
pode levar o paciente à morte (Hsiao et al., 2012).
Estudos usando métodos de cultura ou métodos moleculares que não
dependem da cultura indicam que infecções endodônticas primárias são
polimicrobianas, dominadas por bactérias anaeróbias estritas (Gomes et al., 1994a;
15
Siqueira et al., 2001; Jacinto et al., 2003; Gomes et al., 2004, 2007; Sousa et al., 2013;
Sakamoto et al., 2006; Montagner et al., 2012). Achados indicam que nem todas as
espécies bacterianas anaeróbias estritas tais como Porphyromonas, Prevotella,
Fusobacterium e “Peptostreptococcus” estão envolvidas com sintomas clínicos, como
a dor, e exercem um papel significativo na patogênese das lesões inflamatórias
periapicais (Griffee et al., 1980; Gomes et al., 1994a, 1996; Baumgartner et al., 1999;
Siqueira et al., 2001; Jacinto et al., 2003; Sakamoto et al., 2006). No entanto acredita-
se que grande parte destes microrganismos ainda não tenha sido identificada, sendo
que têm surgido na literatura espécies bacterianas apontadas como possíveis
patógenos endodônticos, podendo ou não estar associados aos sinais e sintomas
endodônticos.
Bacilos produtores de pigmento negro (BPPN) são anaeróbios gram-
negativos, que colonizam as mucosas e são microrganismos indígenas da cavidade
oral. Quando cultivados em ágar, apresentam a capacidade de produzir pigmento
negro, caracterizado quimicamente como protohemina e protoporfirina (Shah e
Gharbia, 1993). Espécies pertencentes ao gênero Prevotella podem não ser
pigmentadas, tais como Prevotella bivia, Prevotella disiens, Prevotella buccae,
Prevotella bucalis, Prevotella oralis e Prevotella oris. Inicialmente, as espécies
estavam agrupadas em um único gênero, Bacteroides. Shah e Collins (1990)
propuseram sua divisão, baseando-se em características nutricionais, análises
químicas e bioquímicas. As espécies sacarolíticas foram agrupadas no gênero
Prevotella, enquanto que espécies assacarolíticas pertencem ao gênero
Porphyromonas. BPPN têm sido encontrados frequentemente em dentes com
sintomatologia dolorosa (Jacinto et al., 2003; Gomes et al., 2004; Sousa et al., 2013;
Montagner et al., 2012).
Estudos envolvendo métodos moleculares para diagnóstico, como PCR,
checkerboard DNA-DNA hybridization (Siqueira et al., 2002) e Denaturing gradient gel
eletrophoresis (DGGE) (Siqueira et al., 2004) têm permitido uma melhor compreensão
da composição da microbiota pulpar e periapical. A técnica do checkerboard DNA-
DNA hybridization ou hibridização DNA-DNA foi descrita inicialmente em 1994ª por
Socransky e colaboradores. Caracteriza-se por ser rápida, sensibilidade adequada e
relativamente barata, superando várias limitações de abordagens que empregam
cultura microbiana para o estudo das comunidades presentes em amostras clínicas
(Sakamoto et al., 2006). Socransky et al., (2004) relatam ainda que a amostra, em sua
16
totalidade, pode ser empregada, não havendo necessidade de amplificação prévia por
PCR. Este método permite a hibridização, em um mesmo momento, de 28 amostras
frente a 43 diferentes sondas de DNA. Ao permitir a detecção da ocorrência de várias
espécies em uma mesma reação, seu emprego torna-se interessante em estudos
epidemiológicos (Siqueira et al., 2004)
Finalmente, o uso indiscriminado dos antibióticos tem levado à seleção de
bactérias resistentes aos antimicrobianos principalmente as isoladas de abscesos
periapicais, incluindo as BPN (Gomes et al., 2011).
Testes de suscetibilidade antimicrobiana verificam a concentração de um
antibiótico necessária para inibir o crescimento microbiano in vitro (CLSI 2007, 2013).
O método E-test consiste em uma fita com gradientes de concentração de um
determinado antibiótico utilizado para teste de difusão em placas de ágar. Esse teste
tem a vantagem de determinar a CIM (concentração inibitória mínima), além de ser
um teste adequado para as bactérias anaeróbias estritas. Vários estudos (Sousa et
al., 2003, 2013; Gomes et al., 2011; Montagner et al., 2014) têm empregado esta
metodologia.
Baseados na literatura pesquisada, observamos que são poucos os
estudos que comparam simultaneamente a microbiota de dentes com necrose pulpar
e sintomatologia dolorosa (abscesso periapical), com a microbiota de dentes
assintomáticos com necrose pulpar e presença de lesão periapical. Nossa
contribuição nesta área foi de identificar possíveis candidatos a patógenos
endodônticos e também suscetibilidade de algumas bactérias anaeróbicas isoladas
dos canais radicularaes e dos abscessos periapicais a agentes antimicrobianos
frequentemente prescritos em endodontia, principalmente nos casos de abscessos.
Tal monitoramento é importante devido ao aumento de resistência das bactérias a
estes antibióticos.
17
2 REVISÃO DA LITERATURA
2.1 Microbiota da infecção endodôntica primária
Bacterias e seus subprodutos são os principais fatores etiológicos da
infecção endodôntica. Em 1976, Sundqvist utilizou métodos de cultura em
anaerobiose, com o objetivo de avaliar a microbiota de 32 dentes traumatizados e que
apresentavam necrose pulpar e coroas íntegras. A seleção criteriosa dos pacientes
permitiu a exclusão de fatores que pudessem gerar contaminações nas amostras.
Microrganismos anaeróbios estritos foram isolados em 90% dos casos, valor nunca
antes obtido em estudos empregando cultura de bactérias fastidiosas.
A microbiota encontrada nos canais radiculares infectados é geralmente
mista e constituída principalmente por espécies anaeróbias estritas, variando de
acordo com a via que os microrganismos chegaram ao sistema de canais radiculares
(Gomes et al., 1994a).
Fabricius et al. (1982) contaminaram dentes de macacos através da
exposição da polpa à cavidade oral e observaram que a microbiota presente nos
canais radiculares após 7, 90, 180 e 1060 dias sofreu alterações qualitativas e
quantitativas. Estabeleceu-se que a proporção de microrganismos anaeróbios
aumentou com o passar do tempo, e no final de 1060 dias, cerca de 50% das bactérias
isoladas eram anaeróbias estritas. Os autores sugeriram ainda que uma ampla
variedade de fenômenos interativos ocorrem na luz do canal radicular, favorecendo a
evolução para uma microbiota cada vez mais mais complexa. Ainda, houve
predominância de microrganismos fastidiosos na porção apical do canal radicular,
enquanto que nas porções mais coronárias microrganismos facultativos eram
isolados, principalmente nos períodos iniciais.
Finegold (1993), em revisão de literatura, descreve os fatores do organismo
hospedeiro que favorecem o desenvolvimento de uma infecção por patógenos
anaeróbios. Segundo o autor, estas infecções originam-se da flora indígena do corpo
humano, pois os microrganismos anaeróbios são abundantes nas mucosas e superam
em número as espécies aeróbias e facultativas em proporção similar a 10-1000:1.
18
Estruturalmente, a população microbiana encontra-se suspensa no lúmen
do canal radicular, com uma variedade imensa de tipos morfológicos consistindo em
cocos, bacilos e formas filamentosas, além de serem observados também densos
agregados bacterianos aderidos às paredes do canal radicular (Nair, 1987). As
bactérias podem ser encontradas também penetrando os túbulos dentinários,
atingindo profundidades próximas a 300 µm (Siqueira et al., 2002).
As populações microbianas raramente existem no ambiente em completo
isolamento. O confinamento de uma população por fatores químicos e físicos e as
ações das populações vizinhas afetam a dinâmica de desenvolvimento e o
comportamento fisiológico de um grupo de microrganismos (Gharbia e Shah, 1993).
Esse fato pode ser constatado também em estudo de Gomes et al. (1999), onde
demonstraram que em um mesmo indivíduo, quando diferentes elementos dentais são
afetados por infecções endodônticas, as características da microbiota são similares,
mas não totalmente iguais, sugerindo o desenvolvimento de nichos ecológicos
distintos.
Em algumas situações, os organismos comensais podem multiplicar-se,
atingindo número elevado de indivíduos, tornando impossível a atuação do sistema
de defesas (Sundqvist, 1992). A comunidade médica reconhece atualmente a
importância das doenças polimicrobianas e os principais tipos de interações
microbianas associadas com as condições humanas de saúde ou doença (Brogden et
al., 2005).
Para que os microrganismos superem as defesas do hospedeiro, eles
devem sofrer contínuas alterações com o objetivo de se adaptarem às mudanças no
meio onde se estabelecem (Ziembuhr et al., 1999). O canal radicular que contém uma
polpa necrótica é facilmente infectável, pois a defesa do hospedeiro passa a atuar
somente em uma pequena área restrita à região apical, o que faz com que as bactérias
estejam protegidas do sistema imune (Haapasalo, 1993).
A virulência dos microrganismos pode ser afetada pelas relações de
sinergismo que se estabelecem entre as bactérias, quando em infecções mistas
(Gomes et al., 1994b). van Dalen et al. (1998) inocularam no dorso de cobaias as
bactérias Peptostreptococcus micros e diferentes espécies de Prevotella ssp
19
isoladamente ou em associação. Observaram que a área média dos abscessos
induzidos pelos inóculos mistos foi maior que aqueles obtidos por monoinóculos.
A presença de bactérias aeróbias diminui a concentração local de oxigênio
e o potencial de óxido-redução resultando na criação de um ambiente físico
apropriado para a proliferação dos microrganismos anaeróbios estritos (Gharbia e
Shah, 1993; Finegold, 1993).
A ampla gama de relações nutricionais que existem entre as espécies pode
influenciar associações específicas, o que explica o fato de que bactérias
fermentadoras de aminoácidos e peptídeos são mais freqüentemente encontradas
nos canais radiculares do que bactérias sacarolíticas, devido às características de
restrição de nutrientes em seu interior (Sundqvist, 1992).
ter Steeg e van der Hoeven (1989), utilizando a cultura, estudaram a
sucessão de espécies presentes na placa bacteriana sub-gengival durante a adição
de nutrientes específicos em plasma. Inicialmente, o baixo conteúdo de carboidratos
do meio foi consumido por espécies sacarolíticas, originando ácidos fórmico e lático.
Em uma segunda etapa, ocorreu a hidrólise de proteínas, favorecendo a fermentação
de aminoácidos e utilização dos carboidratos restantes. As bactérias que se
desenvolveram nesse período foram Bacteroides intermedius, Veillonella parvula,
Eubacterium ssp e Fusobacterium nucleatum. Na fase final ocorreu um aumento
progressivo na degradação protéica e aumento da fermentação de aminoácidos. As
espécies predominantes nessa fase foram Peptostreptococcus micros, Fusobacterium
nucleatum, e Eubacterium ssp.
Shah e Gharbia (1993) demonstraram que as espécies sacarolíticas
Prevotella melaninogenica, Prevotella denticola, Prevotella loescheii e Prevotella
intermedia são associadas freqüentemente à placa bacteriana supra-gengival,
enquanto que as espécies assacarolíticas Porphyromonas gingivalis e
Porphyromonas endodontalis colonizam preferencialmente sítios onde não há
presença de carboidratos.
Em 2002, Munson et al. empregaram simultaneamente técnicas de cultura
microbiana e técnicas moleculares para estudar a microbiota do canal radicular de
dentes associados a abscessos, sugerindo uma maior diversidade em sua
20
composição. Os autores destacaram que uma média de 20,2 espécies foi detectada
através dos métodos moleculares, enquanto que apenas 12,6 foram isoladas.
Gomes et al. (2004), utilizando a cultura, relataram que existe uma
diferença das características da composição da microbiota dos canais radiculares de
dentes com necrose pulpar (infecção primária) e de dentes tratados
endodonticamente que apresentam insucesso (infecção secundária/persistente). A
presença de uma microbiota mista formada por microrganismos Gram-negativos e
Gram-positivos, principalmente anaeróbios, com no máximo dez espécies diferentes
por canal radicular é encontrada em infecções primárias. Já nos casos de insucesso
do tratamento endodôntico, os autores observaram a predominância de
microrganismos anaeróbios facultativos e Gram-positivos, com uma média de uma ou
duas espécies por canal radicular. Os autores sugerem que as interações entre
diferentes grupos bacterianos permitem o estabelecimento de uma patologia,
dificilmente encontrada quando os mesmos microrganismos estão isolados.
A introdução de métodos moleculares de diagnóstico representou uma
ferramenta importante para a identificação de patógenos, para o estudo da relação
parasita-hospedeiro e para determinação da posição taxonômica dos microrganismos
envolvidos no processo de doença. Entre estes métodos, “polymerase chain reaction”
(PCR), Reação em Cadeia da Polimerase, é o que apresenta maior sensibilidade para
detecção de microrganismos. PCR é um método in vitro para replicação de
seqüências específicas de DNA. Começando com uma pequena quantidade de DNA,
cerca de uma célula bacteriana, PCR amplia a um bilhão de vezes uma seqüência
específica conhecida do DNA microbiano e permite sua detecção por eletroforese em
gel de agarose. Por sua alta sensibilidade e habilidade de detectar microrganismos de
difícil cultivo, vários autores têm preferido este método (Dix et al., 1990). Siqueira e
Roças (2005a) relatam as vantagens das técnicas moleculares, tais como: detecção
de espécies cultiváveis e de espécies difíceis de serem cultivadas; alta especificidade
na detecção de espécies com fenótipos similares; detecção direta de espécies sem a
necessidade de cultivo laboratorial; alta sensibilidade; maior rapidez; fornece
diagnósticos rápidos, necessários principalmente em doenças ou infecções que
podem causar morte ou detecção de espécies de lento crescimento; as técnicas de
coleta e transporte são menos críticas quanto à manutenção da anaerobiose.
21
Em Endodontia, os resultados fornecidos pelos métodos de cultura foram
confirmados e significantemente complementados pelas técnicas moleculares. Dessa
maneira, ocorreu uma redefinição da composição da microbiota dos canais radiculares
(Siqueira e Roças, 2005b).
A partir da análise comparativa de seqüências de RNA ribossomal, três
linhagens celulares filogeneticamente distintas foram identificadas. Essas linhagens,
denominadas domínios evolutivos, foram estratificadas nos grupos Bacteria, Archea e
Eukarya (Woese et al., 1990). Paster et al. (2001) relataram que cerca de 700
diferentes espécies, pertencendo a 11 filos do domínio Bacteria, foram detectadas na
cavidade oral de humanos e cerca de 50% destas bactérias não foram ainda isoladas,
sendo somente conhecidas através de suas sequências de 16S rRNA.
Aas et al. (2005), empregando avaliação do 16S rRNA através de
metodologia de clonagem e seqüenciamento gênico, determinou a divisão das
espécies microbianas presentes na cavidade oral em 6 filotipos: Firmicutes
(Streptococcus, Gemella, Eubacterium, Selenomonas, Veillonella), Actinobacteria
(Atopobium, Rothia), Proteobacteria (Neisseria, Eikenella, Campylobacter),
Bacteroidetes (Porphyromonas, Prevotella, Capnocytophaga), Fusobacteria
(Fusobacterium, Leptotrichia) e Filo TM7 de microrganismos ainda não cultiváveis.
Aproximadamente 13 novos filotipos foram detectados pela primeira vez no estudo,
mesmo não se estabelecendo ainda sua real importância clínica.
Montagner et al. (2010) estudaram a presença de espécies de treponemas
em casos de abscessos apicais agudos. Amostras de 20 pacientes foram coletadas e
analisadas através de Nested PCR. Os autores concluíram que existe uma alta
incidência de espécies de Treponema em amostras dos canais radiculares e dos
abscessos apicais agudos do mesmo dente, indicando que os treponemas são
patógenos importantes em infecções endodônticas agudas.
Nobrega et al. (2016a) estudaram a microbiota de infecções endodônticas
primárias agudas através de clonagem. Um total de 689 clones foram analisados e 76
filotipos identificados, dos quais 47 (61,84%) eram espécies diferentes e 29 (38,15%)
eram táxons reportados como ainda incultiváveis ou ainda não caracterizados.
Prevotella ssp., Fusobacterium nucleatum, Filifactor alocis e Peptostreptococcus
stomatis foram as espécies mais freqüentemente detectadas, seguindo-se Dialister
22
invisus, Phocaeicola abscessus, o clone oral não caracterizado Lachnospiraceae,
Porphyromonas ssp., e Parvimonas micra. Oito filos foram detectados e os táxons
mais freqüentemente identificados pertenciam ao filo Firmicutes (43,5%), seguido por
Bacteroidetes (22,5%) e Proteobacteria (13,2%). Concluiu-se que a infecção
endodôntica primária aguda é caracterizada por ampla diversidade bacteriana e
observou-se alta variabilidade intersubjetiva. As bactérias Gram-negativas
anaeróbicas pertencentes ao filo Firmicutes, seguidas por Bacteroidetes, foram os
microrganismos mais freqüentemente detectados.
Nobrega et al. (2016b) caracterizaram a microbiota presente em canais
radiculares associados a abscesso apical agudo através de sequenciamento do gene
16S rRNA. Alem disso, associações de achados microbiológicos com características
clínicas e associação entre espécies microbianas também foram investigadas.
Cinquenta e nove diferentes bactérias cultiváveis foram identificadas por
sequenciamento do gene 16S rRNA, pertencente a 6 filos, com um número médio de
6 espécies por canal radicular. Abordagens moleculares permitiram a identificação de
99% dos isolados. As bactérias mais frequentemente identificadas foram Prevotella
ssp., Pseudoramibacter alactolyticus, Parvimonas micra, Dialis invisus, Filifactor alocis
e Peptostreptococcus stomatis. Foi encontrada associação positiva entre Prevotella
buccae e Pseudoramibacter alactolyticus e entre Parvimonas micra e Prevotella
nigrescens (ambos p <0,05). Concluiu-se que a microbiota de canais radiculares
infectados associados ao abscesso apical agudo é diversa e heterogênea, composta
principalmente de bactérias Gram-negativas anaeróbicas, sendo a grande maioria
pertencente às linhagens Firmicutes e Bacteroidetes.
2.2 A utilização da técnica do checkerboard DNA-DNA Hybridization em
endodontia
Considerando o fundamental papel das bactérias e seus subprodutos
particularmente na infecção endodôntica, torna-se importante conhecer o perfil da
comunidade microbiana e seus fatores de virulência através da identificação das
espécies mais frequentemente detectadas, para melhor entendimento da
patogenicidade do conteúdo infeccioso e das manifestações clínicas da infecção.
Desde as últimas décadas, métodos moleculares têm sido utilizados para identificação
23
bacteriana em espécimes clínicos, sem a necessidade de cultura. Com a aplicação
dessas metodologias houve uma expansão do conhecimento da microbiologia
endodôntica, avançando com segurança em termos de diagnóstico, prognóstico e
tratamento de doenças infecciosas.
Socransky et al. em 1994a introduziram um método para hibridizar um
grande número de amostras de DNA contra um grande número de sondas de DNA
numa única membrana de suporte. O DNA desnaturado de até 43 amostras foi fixado
em pistas separadas numa única membrana montada num Miniblotter 45. A
membrana foi então rodada 90 graus no mesmo dispositivo, o que permitiu a
hibridação simultânea com 43 sondas de DNA diferentes. As hibridizações foram
também realizadas em lisados de células bacterianas transferidas para membranas.
Um dispositivo MiniSlot permitiu que os lisados carregados em canais paralelos
fossem aspirados através da membrana, depositando pistas horizontais na superfície
da membrana. As hibridizações foram realizadas em pistas verticais com sondas
genômicas inteiras marcadas com digoxigenina ou sondas oligonucleotídicas
baseadas em rRNA 16S diretamente conjugadas com fosfatase alcalina. O método
permitiu a determinação simultânea da presença de múltiplas espécies bacterianas
em amostras de placas dentárias simples ou múltiplas, sugerindo assim a sua utilidade
para uma gama de amostras clínicas ou ambientais.
Siqueira et al. em 2000 foram os primeiros a utilizar a metodologia
molecular do Checkerboard para caracterizar a microbiota endodôntica. Foram
coletadas amostras microbiológicas de 28 canais unirradiculares necrosados e com
presença de lesão periapical radiográfica. Os resultados mostraram que 22 sondas
foram positivas com uma ou mais amostras. As espécies mais encontradas foram:
Bacteroides forsythus (39. 3% of the cases); Haemophilus aphrophilus (25%);
Corynebacterium matruchotii (21.4%); Porphyromonas gingivalis (17.9%); and
Treponema denticola (17.9%). Os autores concluíram que os dados microbiológicos
indicaram que os métodos genéticos moleculares podem fornecer conhecimento
adicional significativo sobre a microbiota endodôntica através da detecção de
espécies bacterianas que são difíceis ou impossíveis de cultivar. Além disso, suportam
o conceito de que as infecções endodônticas primárias são infecções mistas de
etiologia polimicrobiana.
24
Sunde et al. também em 2000 estudaram através de Checkerboard a
microbiota presente em lesão endodôntica periapical de dentes tratados
endodonticamente. Foram selecionados 34 casos de dentes obturados e presença de
lesão periapical que foram divididos em 2 grupos de acordo com o tipo de incisão de
terapia endodôntica cirúrgica (marginal e submarginal) que foi realizada. A maioria das
bactérias detectada pela sonda estava presente em mais lesões do Grupo 1 do que
no Grupo 2. As diferenças foram mais notáveis para Campylobacter gracilis,
Porphyromonas endodontalis, Propionibacterium acnes, Capnocytophaga gingivalis,
Fusobacterium nucleatum ssp. Nucleatum, Fusobacterium nucleatum ssp. Foram
detectadas espécies bacterianas como Actinobacillus actinomycetemcomitans e
Bacteroides forsythus em mais de 60% das lesões de ambos os grupos. Os resultados
apoiaram a idéia de que, após uma incisão marginal, as bactérias da bolsa periodontal
poderiam atingir os tecidos subjacentes pela bacteremia liberada pelo cirurgião. O
estudo forneceu evidências sólidas de que as bactérias invadem o tecido periapical
de dentes assintomáticos com periodontite apical.
Em 2001, Zehnder relatou um caso clínico raro de lesão endodôntica
induzida periodontalmente em paciente saudável de 28 anos. O paciente apresentava
perda grave de inserção nas faces palatina e distal do segundo pré-molar superior
direito, e o caso foi diagnosticado como uma periodontite agressiva localizada. O
paciente nunca tinha recebido tratamento periodontal, o dente se encontrava
necrosado e com a coroa clínica hígida. Todos os achados clínicos sugeriram
claramente que o problema endodôntico foi causado pela doença periodontal
agressiva. Foram coletadas amostras da bolsa periodontal e do canal radicular, que
foram analisadas microbiologicamente através da hibridização DNA-DNA
checkerboard. Os resultados revelaram diversidade microbiológica nos dois sítios. A
amostra obtida do canal radicular exibiu um número limitado de espécies, incluindo
anaeróbias pigmentadas de preto. Todas as bactérias encontradas no canal foram
encontradas na bolsa periodontal. O autor concluiu que a periodontite agressiva foi
capaz de causar a necrose do canal radicular.
Vianna et al. (2008) utilizaram o método de hibridização Checkerboard e a
cultura microbiana para investigar a microbiota de canais radiculares de 24 dentes que
receberam 3 tipos de medicação intracanal. As espécies mais freqüentemente
identificadas pelo Checkerboard nas amostras iniciais (S1) foram: Fusobacterium
25
nucleatum ssp. polymorphum, Treponema socranskii ssp. socranskii, Parvimonas
micra e Enterococcus faecalis. Nas amostras após o preparo químico-mecânico (S2)
e após a medicação intracanal (S3) um total de oito espécies diferentes foram
identificadas, sendo apenas um Gram-positivo (E. faecalis). Não foram identificados
microrganismos no grupo em que a clorexidina 2% gel foi utilizada como medicação
intracanal. A quantificação obtida em placas de ágar variou de 4x 105 a 2,6x106 S1,
a UFC média foi reduzida em 99,96% em S2, e não houve diferença estatística entre
a UFC em S2 e S3. Os autores puderam concluir que as duas técnicas testadas são
capazes de detectar a diminuição do conteúdo infeccioso em canais radiculares e que
as infecções endodônticas primárias são caracterizadas por uma grande variedade de
espécies bacterianas.
Roças et al. (2008) estudaram através do checkerboard lesões periapicais
de infecções persistentes/secundárias. Foram analisadas amostras de 17 dentes de
13 pacientes diferentes que apresentavam lesão periapical radiográfica associado a
um dente tratado endodonticamente. Os autores concluíram que as infecções
persistentes/secundárias são mistas e que o E. faecalis, quando presente, não é a
espécie mais dominante.
Em 2009, Siqueira e colaboradores caracterizaram a microbiota presente
em lesões periapicais de infecções primárias. Foram coletadas amostras de 20 dentes
extraídos por diversas razões que estavam necrosados e que tinham lesão periapical
associada. Com o auxilio de um bisturi, a lesão periapical e outros tecidos moles
ligados a porção apical foram removidos. Swabs estéreis foram utilizados para a
coleta, evitando o forame apical. Essas amostras foram analisadas através do
checkerboard, e as espécies encontradas foram Pseudoramibacter alactolyticus
(32%), Bacteroidetes clone X083 (26%), Streptococcus species (21%), Olsenella uli
(10.5%), Synergistes clone BA121 (10.5%), Fusobacterium nucleatum (10.5%),
Porphyromonas endodontalis (10.5%), Dialister clone BS016 (5%), Filifactor alocis
(5%), Parvimonas micra (5%), e Treponema denticola (5%). Os autores concluíram
que a presença dessas bactérias na região periapical dos canais radiculares
infectados indica seu potencial papel patogênico na etiologia da periodontite apical.
Em 2011, Roças e Siqueira, compararam o efeito de duas soluções
irrigadoras (Hipoclorito de sódio 2,5% e Clorexidina 0,12%) através da técnica de
26
hibridização DNA-DNA Checkerboard. Foram selecionados 47 dentes assintomáticos
e que apresentavam lesão periapical radiograficamente. Amostras biológicas foram
coletadas antes do preparo químico-mecânico (S1) e após do preparo químico-
mecânico (S2) utilizando duas soluções irrigadoras diferentes. Os autores
encontraram bactérias em 100% das amostras iniciais (S1) e após o preparo químico-
mecânico as bactérias mais encontradas no grupo do NaOCl foram Propionibacterium
acnes, Streptococcus species, Porphyromonas endodontalis e Selenomonas
sputigena. No grupo da clorexidina, as bactérias mais prevalentes foram Dialister
invisus, Actinomyces israelii, Prevotella baroniae, Propionibacterium acidifaciens e
Streptococcus species. A conclusão do estudo foi que as duas soluções irrigadoras
são capazes de reduzir o conteúdo infeccioso dos canais radiculares, sem diferença
significante entre elas.
Também em 2011, com o objetivo de avaliar o efeito da terapia
fotodinâmica (PDT) em canais infectados de humanos, Ng e colaboradores
selecionaram 22 dentes recém-extraídos com polpa necrosada e evidencia
radiográfica de lesão periapical. As amostras iniciais e após a utilização de PDT com
os dentes já instrumentados foram avaliadas através do checkerboard. Os autores
concluíram que a PDT reduz significantemente as bactérias residuais dentro do
sistema de canais radiculares.
Ito et al. (2011) lançaram mão da técnica de Hibridização DNA-DNA
Checkerboard para avaliar o efeito da pasta de hidróxido de cálcio com clorexidina em
canais radiculares de dentes decíduos. Das 35 sondas utilizadas para hibridização
DNA-DNA Checkerboard, 31 (88,57%) estavam presentes nas amostras iniciais. Após
o curativo do canal radicular, o número de sondas positivas reduziu para 13 (37,14%).
Os autores puderam concluir que a periodontite apical é causada por uma infecção
polimicrobiana e que a pasta de hidróxido de cálcio com clorexidina é eficaz na
redução do número de bactérias dentro dos canais radiculares quando aplicada como
medicação intracanal.
Roças et al. (2011), utilizando o checkerboard, investigaram as amostras
microbiológicas de canais radiculares radiculares de dentes necrosados com
periodontite apical sintomática (n = 13) ou assintomática (n = 21); de abscesso apical
crônico (n = 9), em pacientes noruegueses. Microrganismos estavam presentes em
27
todos os dentes com periodontite apical assintomática. As bactérias mais frequentes
foram Dialister invisus (71%), Fusobacterium nucleatum (62%) e Porphyromonas
endodontalis (62%). Nos abscessos apicais crônicos, as bactérias mais prevalentes
foram P. endodontalis (100%), D. invisus (89%), Parvimonas micra (78%) e
Solobacterium moorei (78%). Em dentes com periodontite apical sintomática, as
bactérias mais prevalentes foram D. invisus, P. endodontalis, S. moorei,
Propionibacterium acnes e Streptococcus (todos em 69%). Os autores concluíram que
embora as mesmas espécies fossem altamente prevalentes nas diferentes condições
examinadas, e que nenhuma bactéria teve associação com a sintomatologia, os
resultados revelaram que as espécies formaram diferentes associações em amostras
de dentes com ou sem dor. Portanto, é possível que comunidades mais virulentas
multiespécies possam se formar como resultado de combinações bacterianas globais
e dar origem a uma inflamação aguda.
Em 2012, Roças e colaboradores avaliaram a microbiota de canais
radiculares submetidos ao retratamento. As bactérias mais prevalentes detectados
pelo Checkerboard foram Propionibacterium, Fusobacterium nucleatum, streptococci,
e Pseudoramibacter alactolyticus. PCR quantitativa em tempo real detectou
Enterococcus faecalis e Streptococos em 38% e 41% dos casos, representando
9,76% e 65,78% das contagens bacterianas, respectivamente. Os achados põem em
questão o status do E. faecalis como o principal patógeno e sugerem que outras
espécies podem ser patógenos candidatos associados com infecções endodônticas
persistentes / secundárias.
Neves et al. (2014) avaliaram a efetividade do sistema de limas Self-
Adaptive File através do checkerboard. Os resultados mostraram que não só os
estreptococos, mas também algumas bactérias anaeróbias e até mesmo ainda não
cultivadas podem resistir aos efeitos do preparo químico mecânico realizados com
este tipo de lima.
Martinho e colaboladores também estudaram em 2014, o conteúdo
infecioso e endotóxico de infecções endodônticas primárias através do Checkerboard
e encontraram uma maior prevalência de Parvimonas micra (16/21), Fusobacterium
nucleatum ssp. nucleatum (15/21) e Porphyromonas endodontalis (14/21).
28
2.3 Suscetibilidade antimicrobiana (E-test) em endodontia
Citron et al. (1991) avaliaram a suscetibilidade antimicrobiana de 105
espécies de bactérias anaeróbias isoladas de amostras clínicas contra cefoxitina,
cefotaxima, imipenem, pencilina, metronidazol e clindamicina comparando o método
de E-test e o método de diluição em ágar. Os resultados mostraram que os dois
métodos apresentaram correlação positiva em 78% e 86% entre uma diluíção e em
89% e 97% entre duas diluições, após 24 horas e 48 horas de incubação
respectivamente. Os autores afirmaram que o E-test é um método fácil de se utilizar
e interpretar, pode ser utilziado para isolados individuais de pacientes, além de ser um
método confiável realizado em laboratório para testar a suscetibilidade de bactérias
anaeróbias.
Sousa et al. (2003) avaliaram a suscetibilidade antimicrobiana de
Peptostreptococcus prevotii e Fusobacterium necrophorum isolados de abscessos
periapicais através do método de E-test frente aos antibóticos penicilina G,
amoxicilina, amoxicilina + ácido clavulânico, metronidazol e clindamicina. Todas as
cepas testadas foram suscetíveis ao antibióticos testados.
Chan e Chan (2003) constataram que a microbiota das infecções
odontogênicas é constituída principalmente por anaeróbios facultativos Gram-
positivos e anaeróbios estritos Gram-negativos. Foram testadas diversas
concentrações de antibióticos presentes nas fitas de E-test frente aos isolados clínicos
e observaram-se altas taxas de suscetibilidade à clindamicina para os microrganismos
anaeróbios, exceto Eikenella corrodens. A amoxicilina e a associação
amoxicilina/ácido clavulânico foram bastante efetivas frente a Fusobacterium
nucleatum (88,6% e 91,4%), Prevotella intermedia (86,2% e 96,6%) e Porphyromonas
gingivalis (95,7% e 95,7%). Dentre os antibióticos com maiores taxas de resistência
encontra-se a eritromicina, com valores de 48,6% para Fusobacterium nucleatum;
55,2% para Prevotella intermedia; 55,6% para Peptostreptococcus micros; e, 43,4%
para Porphyromonas gingivalis. Concluiu-se que a atividade dos antimicrobianos
empregados freqüentemente em Odontologia teve sua ação diminuída frente aos
patógenos endodônticos em Taiwan.
29
Jacinto et al. (2006) avaliaram a suscetibilidade antimicrobiana de P.
gingivalis isoladas de 20 canais radiculares de dentes com abscesso frente aos
antibióticos: Amoxicilina, Amoxicilina + ácido clavulânico, azitromincina,
benzilpenicilina, cefaclor, clindamicina, ertitromicina, metronidazol e tetraciclina
utilizando o método do E-test. Todas as cepas foram sensíveis a amoxicilina,
amoxicilina + ácido clavulânico, cefaclor, clindamicina, benzilpenicilina, metronidazol
e tetraciclina. Os valores mais baixos referentes as concentração inibitória mínima
variaram entre 0,026-0,123 µg mL-1 para amoxicilina + ácido clavulânico e
clindamicina. Os menores valores de MIC 90 foram observados para clindamicina
(0,0064 µg mL-1 ). Uma cepa mostrou resistência à eritromicina e 8 foram resistentes
a azitromicina. Os autores concluíram que a amoxicilina assim como amoxicilina +
ácido clavulânico e benzilpenicilina foram eficazes contra P. gingivalis.
Gomes et al. (2011) estudaram a suscetibilidade de espécies anaeróbias
isoladas de uma população brasileira em diferentes períodos de tempo, determinando
o padrão de desenvolvimento de resistência aos antibióticos freqüentemente
prescritos em endodontia. Amoxicilina e amoxicilina + clavulanato foram eficazes
contra a maioria das espécies nos diferentes períodos de estudo. Em geral, houve
baixas diferenças estatísticas quanto à suscetibilidade microbiana entre os períodos
experimentais. Contudo, os autores observaram um aumento na resistência
anaeróbica à penicilina G e à clindamicina. A resistência à eritromicina foi observada
em todas as espécies e houve diferenças estatisticamente significativas entre os
períodos de 2000-2002 e 2003-2005 para F. nucleatum (P <0,05) e entre os períodos
de 2003-2005 e 2007-2008 para P. intermedia / nigrescens e P. oralis (P <0,05). Com
esse estudo os autores concluíram que a resistência antimicrobiana de anaeróbios
isolados de infecções endodônticas primárias apresentou aumento ao longo de um
período de tempo em relação a uma população brasileira específica.
Montagner et al. (2014) estudaram a resistência de Prevotella disiens,
Prevotella oralis, Porphyromonas gingivalis e Parvimonas micra aos seguintes
agentes antimicrobianos benzilpenicilina, amoxicilina e amoxicilina+acido clavulânico
utilizando a metodologia do E-test. Todas as cepas do estudo foram suscetíveis aos
agentes antimicrobianos testados.
30
Desta forma, revendo a literatura, podemos observar que são poucos os
estudos que comparam simultaneamente a microbiota de dentes com necrose pulpar,
sintomatologia dolorosa e abscesso periapical com a microbiota de dentes com
necrose pulpar e presença de lesão periapical sem sintomatologia dolorosa. Alem
disso, devido ao uso indiscriminado de antibióticos, tem ocorrido o desenvolvimento
de resistencia bacteriana e esta deve ser constantemente monitorada.
31
3 PROPOSIÇÃO
Diante disto, são objetivos desta pesquisa:
3.1 Objetivo:
Analisar o conteúdo infeccioso de canais radiculares em casos
assintomáticos e sintomáticos, a microbiota do exsudato apical nos casos
sintomáticos e a suscetibilidade de bactérias específicas aos antimicrobianos mais
empregados na clínica odontológica.
3.2 Objetivos Específicos:
1. Estudar a composição da microbiota de canais radiculares infectados
sintomáticos e assintomáticos, e dos abscessos periapicais, por meio da
técnica de hibridização DNA-DNA.
2. Determinar a suscetibilidade antimicrobiana das bactérias produtoras de
pigmento negro (BPN), identificadas através do sequenciamento genético, por
meio do método E-test, utilizando os antibióticos: benzilpenicilina, amoxicilina,
amoxicilina + ácido clavulânico, eritromicina, azitromicina, metronidazol e
clindamicina.
3. Correlacionar estes achados com os sinais e sintomas clínicos
32
4 MATERIAL E MÉTODOS
4.1 Local da pesquisa
A pesquisa foi realizada na Clínica de Pós-Graduação, Laboratório de
Patologia Oral e Laboratório de Microbiologia da área de Endodontia da Faculdade de
Odontologia de Piracicaba, Universidade Estadual de Campinas (FOP/UNICAMP).
4.2 Seleção dos participantes da pesquisa
Foram selecionados pacientes com necessidade de intervenção
endodôntica por necrose do tecido pulpar e presença de lesão periapical que não
apresentavam sintomatologia dolorosa expontânea (n=10) e pacientes com
sintomatologia dolorosa e presença de abscesso periapical agudo (n=10), totalizando
20 pacientes. O trabalho segue a Resolução 466/12 do Conselho Nacional de Saúde
para pesquisa envolvendo seres humanos e foi submetido e aprovado pelo Comitê de
Ética em Pesquisa da Faculdade de Odontologia de Piracicaba – UNICAMP
(CEP/FOP-UNICAMP) (Anexo 1), sob o protocolo 119/2015. Todos os pacientes
assinaram o termo de consentimento elaborado de acordo com as normas (Apêndice
1).
4.3 Grupos experimentais
a) Necrose pulpar com sintomatología dolorosa e abscesso periapical
associado (n=10), de acordo com Sousa et al. 2013.
Ausência de resposta aos testes de sensibilidade pulpar (teste térmico ao
frio). Dor espontânea no momento do atendimento; dor à palpação/percussão;
presença de edema e ponto de flutuação.
b) Necrose pulpar e lesão periapical sem sintomatología espontânea
(n=10)
Ausência de resposta aos testes de sensibilidade pulpar (teste térmico ao
frio). Os dentes deverão apresentar evidência radiográfica de lesão periapical.
4.4 Critérios de inclusão e exclusão, aspectos clínicos e radiográficos
33
Critérios de inclusão: a) dentes necrosados, com sintomatologia dolorosa e
com abscesso periapical associado; b) dentes com necrose dentes assintomáticos
com necrose pulpar e presença de lesao periapical visível radiograficamente.
Critérios de exclusão: Serão descartados casos com antibioticoterapia
prévia nos últimos 3 meses, canais expostos a cavidade oral, casos onde o isolamento
absoluto não foi conseguido, casos com doença periodontal avançada; pacientes
jovens com histórico de traumatismos dentais recentes, dentes com rizogênese
incompleta, dentes com presença de curativos de demora na câmara pulpar e de
tratamentos endodônticos anteriores.
Aspectos clínicos e radiográficos: Para cada paciente foram anotados:
idade, sexo, estado pulpar, profundidade da bolsa periodontal, mobilidade dental,
presença de edema dos tecidos periodontais, história de medicação e os achados
radiográficos. Foram anotados os aspectos físicos do canal durante a coleta da
amostra, tais como canal seco, presença de exsudado claro, purulento ou
hemorrágico. Aspectos clínicos do abscesso também foram anotados (ex. coloração).
Os aspectos clínicos do dente envolvido, tais como presença ou não de cáries e
restaurações serão também anotados.
4.5 Coleta de amostras
O atendimento aos pacientes foi realizado na Clínica de Pós-Graduação da
FOP-UNICAMP e as amostras processadas no Laboratório de Microbiologia –
Endodontia.
Foram coletadas amostras iniciais dos canais radiculares assim como do
exsudato periapical associado aos casos de abscessos periapicais.
Coleta dos abscessos periapicais
Inicialmente foi realizada anestesia local por bloqueio regional e
desinfecção da mucosa oral adjacente ao dente com digluconato de clorexidina 2% e
neutralização da região com uma solução de tween 80 + lecitina de soja. Após, o
exsudato do abscesso periapical foi coletado através de aspiração utilizando uma
seringa estéril. A punção foi realizada no momento que precede a execução do
tratamento do abscesso, que constitui na realização de uma incisão com lâmina de
34
bisturi, divulsão dos tecidos e ordenha manual da coleção purulenta. Uma alíquota de
100µL do exsudato foi transferida para um microtubo estéril contendo 1,0 mL de Tris
Buffer para posterior processamento molecular, e outra alíquota de 100µL para
microtubo previamente esterilizado, contendo 1,0 mL do meio de transporte pré-
reduzido VMGA III (cultura), como descrito anteriormente por Montagner et al. 2012 e
Sousa et al. 2013.
Coleta dos canais radiculares
Inicialmente o dente envolvido recebeu polimento coronário com pedra-
pomes e isolado com lençol de borracha (isolamento absoluto). A seguir, foi realizado
o vedamento da interface coroa/lençol com cianocrilato (Super Bonder; Loctite, SP-
Brasil) e TopDam (FGM, Joinville, SC-Brasil), para evitar infiltração de saliva. A
antissepsia do campo operatório (superfície externa da coroa, grampo, lençol de
borracha e arco) foi realizada com swabs estéreis umedecidos primeiramente em
H2O2 a 30% e depois em NaOCl 5,25% por 30 segundos cada, subsequentemente
neutralizado com solução estéril de tiossulfato de sódio a 5% (Möller, 1966).
A fase de acesso coronário foi realizada em duas etapas operatórias. A
água proveniente do equipo é cessada, sendo a irrigação realizada manualmente com
solução salina estéril. São utilizadas brocas de alta rotação diamantadas estéreis. Na
primeira etapa operatória é realizada a remoção dos contaminantes coronários
(restaurações, tecido cariado). Na segunda etapa, na fase de confecção da cavidade
de acesso, uma nova broca estéril foi utilizada. Após a confecção da cavidade de
acesso, uma nova desinfecção foi realizada. Prosseguindo, com o completo acesso
ao canal radicular com uma nova broca esférica diamantada estéril.
Coleta microbiológica
`Para a coleta microbiológica, 5 cones de papel absorvente, um de cada
vez, foram introduzidos no interior dos canais. Três destes cones foram transferidos
para tubos do tipo eppendorfs previamente esterilizados, contendo 1,0 mL do meio de
transporte pré-reduzido VMGA III (cultura) e dois foram transferidos para um tubo
contendo 300 uL de Tris Buffer, o qual foi congelado em freezer -20°C para análise
molecular, como descrito por Gomes et al. 2011.
35
4.6 Procedimentos Laboratoriais
4.6.1 Checkerboard DNA-DNA Hibridization
A metodologia empregada para a Técnica de Checkerboard DNA-DNA
hybridization seguiu a descrição feita por Socransky et al. (1994a).
Extração do DNA microbiano
Tubos tipo Eppendorf com 150 uL de TE foram agitados no Vortex (Agitador
de Tubos). Após esse procedimento, os tubos foram centrifugados a 12.000 RPM por
5 minutos. O sobrenadante neles contido foi então descartado e o pellet
ressuspendido com 150 μL de solução TE e 100 μL de solução de hidróxido de sódio
(NaOH). As suspensões contendo as amostras coletadas foram aquecidas em banho-
maria por dez minutos e em seguida neutralizadas pela adição de 0,8 mL de 5 M de
acetato de amônia (C2H7NO2). Com isto, as células bacterianas foram lisadas e o DNA
ficou suspenso na solução.
Colocação das amostras na membrana de Nylon
Uma membrana de nylon (15 x15cm) com carga positiva (Amersham
Biosciences, Chicago, IL - USA) foi montada no Minislot 30® (Immunetics, Cambridge,
MA - USA). Cada suspensão de amostra contendo DNA livre foi depositada nas fendas
do Minislot 30® e o DNA concentrado permaneceu depositado na membrana de nylon.
A membrana foi removida do aparato e o DNA, previamente depositado na mesma,
foi fixado por intermédio de aquecimento em forno a 120°C, por 20 minutos. As duas
últimas canaletas do Minislot 30® foram reservadas para a colocação dos controles,
contendo uma mistura das espécies dos micro-organismos que foram investigados
pelas sondas de DNA, em duas concentrações, 105 e 106 células bacterianas.
Hibridização da membrana com as sondas de DNA
Após a fixação do DNA na membrana, esta foi pré-hibridizada a 42°C, por
uma hora, numa solução de 50% formamida, 1% caseína, 5 X SSC (Solução Salina
Citratada), 25 mM de fosfato de sódio (pH 6,5) e 0,5 mg/mL de RNA de levedura. A
membrana foi então colocada sob a placa acrílica do Miniblotter 45® (Immunetics,
36
Cambridge, MA - USA), rotacionada a 90° de sua posição original, com as linhas
contendo o DNA fixado, perpendiculares às canaletas do Miniblotter 45®. O Miniblotter
45® contém 45 canaletas que servem, cada uma, para a colocação de uma sonda de
DNA.
As sondas de DNA específicas para as espécies que foram usadas nesse
estudo (Tabela 1) foram confeccionadas usando o random primer digoxigenin labeling
Kit (Boehringer Mannheim, Indianápolis, IN - USA), como descrito por Feinberg e
Vogelstein (1983).
37
Tabela 1- Relação das cepas empregadas para o desenvolvimento das sondas de DNA
bacteriano.
* ATCC (American Type Culture Collection, Rockville, MD)
a Cepas do Instituto Forsyth
T Cepas padrão
Espécies Cepas Espécies Cepas
Aggregatibacter
actinomycetemcomitans A e B
ATCC 43718*
ATCC 29523*
Filifactor alocis ATCC 35896*T
Actinomyces israelii ATCC 12102* Fusobacterium periodonticum ATCC 33693*T
Actinomyces odontoloyticus I ATCC 17929* Neisseria mucosa ATCC 19696*T
Actinomyces oris ATCC 43146* Parvimonas micra ATCC 33270*T
Campylobacter showae ATCC 1146*T Porphyromonas endodontalis ATCC 35406*T
Campylobacter rectus ATCC 33238*T Porphyromonas gingivalis ATCC 33277*T
Capnocytophaga gingivalis ATCC 33624* Prevotella intermedia ATCC 25611*T
Capnocytophaga ochracea ATCC 33596*T Prevotella melaninogenica ATCC 25845*T
Capnocytophaga sputigena ATCC 33612*T Prevotella nigrescens ATCC 33563*T
Dialister pneumosintes ATCC 51894 Propionibacterium acnes (I +II) ATCC 11827*
ATCC 11828*
Gemella morbillorum ATCC 27829*T Staphylococcus epidermidis ATCC 43541*T
Eikenella corrodens ATCC 23834*T Streptococcus gordonii ATCC 10558*T
Enterococcus faecalis ATCC 29212* Streptococcus intermedius ATCC 27335*T
Enterococcus faeccium 6569 Treponema denticola B1a
Enterococcus hirae 10541 Streptococcus mitis ATCC 49456*T
Eubacterium nodatum ATCC 33099* Streptococcus mutans ATCC 25175
Fusobacterium periodonticum ATCC 33693*T Streptococcus oralis ATCC 35037
Eubacterium nodatum ATCC 33099*T Tannerella forsythia ATCC 43037
F.nucleatum ssp nucleatum ATCC 25586*T Treponema Socranskii S1 a
F.nucleatum ssp polymorphum ATCC 10953*T Eubacterium saburreum ATCC 33271*T
F nucleatum ssp vincentii ATCC 49256*T Veillonella parvula ATCC10790
38
Anteriormente ao seu uso, as sondas foram testadas com uma mistura
controle contendo as espécies investigadas, numa concentração de 104 células
bacterianas. Suas concentrações foram ajustadas de tal modo que a intensidade dos
sinais de todas as sondas fossem semelhantes.
Cada sonda de DNA contida numa solução de hibridização (45%
formamida, 5 X SSC, 20 mM de fosfato de sódio (pH 6,5), 0,2 mg/mL de RNA de
levedura, 10% de sulfato de dextrano, 1% caseína e 20 mg/mL de sonda de DNA) foi
removida com pipeta e colocada em canaleta do Miniblotter 45®. De modo que cada
canaleta do Miniblotter 45® seja preenchida com 135 μL de uma determinada sonda.
As sondas hibridizaram perpendicularmente às linhas contendo o DNA bacteriano
fixado, propiciando um formato de xadrez com as linhas de DNA na horizontal, e as
sondas na vertical. O aparato, contendo o Miniblotter 45® e a membrana com as
sondas, e o DNA das amostras bacterianas fixado, foram acondicionados de maneira
que pudessem manter umedecidos e evitar a desidratação das mesmas. O conjunto
foi incubado a 42° para que a hibridização ocorresse, o que aconteceu num período
mínimo de 12 horas (overnight).
Detecção das espécies
Após a hibridização com as sondas, as membranas foram removidas do
Miniblotter 45® e lavadas por 40 minutos a 65°C, numa solução adstringente de PO4
Buffer (tampão de fosfato), a fim de remover sondas que não hibridizaram
completamente. Em seguida, as membranas foram imersas por 1 hora, sob agitação,
numa solução bloqueadora contendo 0,1 M ácido maleico, 3 M NaCl, 0,2 M NaOH,
0,3% Tween 20, 0,5% caseína, pH 8,0 e por 30 minutos na mesma solução contendo
o anticorpo anti-digoxigenina (Anti-Digoxigenin-AP Fab fragments-Roche Diagnostics
GmbH, Manheim-Germany) conjugado à fosfatase alcalina numa diluição de
1/25.0008. As membranas foram lavadas com uma solução de 0,1 M ácido maleico, 3
M NaCl, 0,2 M NaOH, 0,3% Tween 20, pH 8,0, duas vezes por 20 minutos, e uma vez
por 5 minutos em 0,1 M Tris HCl, 0,1 NaCl, 50 mM MgCl2, pH 9,5. Em seguida, as
membranas foram incubadas em uma solução detectora, CDP-Star Detection
Reagent® (Amershan Biosciences UK Limited, Buckinghamshire - UK), por 60 minutos
a 37°C. Finalmente, as membranas foram colocadas num cassete sob um filme
radiográfico (Kodak® X-OMAT Kodak Brasileira Com. e Ind. Ltda, São José dos
Campos, SP) por aproximadamente 40 minutos, e os filmes revelados logo em
39
seguida. Cada sinal produzido por uma determinada sonda na amostra dos canais
radiculares foi comparado em intensidade ao sinal produzido pela mesma sonda nos
dois controles 105 e 106. Assim sendo, o número (0) foi registrado quando não houve
detecção de sinal; (1) quando houve um sinal menos intenso que o controle de 105
células; (2) a aproximadamente 105 células; (3) entre 105 e 106 células; (4) a
aproximadamente 106 células e (5) a mais que 106 células. Esses registros foram
utilizados para determinar os deferentes níveis das espécies investigadas em cada
amostra.
4.6.2 Sequenciamento genético do gene 16S rRNA
O DNA de cada bactéria previamente isolada foi extraído utilizando QIAamp
DNA Minikit (Qiagen, Valência, CA, EUA) de acordo com a instruções do fabricante.
Após a extração, a amplificação universal por reação em cadeia da polimerase (PCR)
foi realizada num volume total de 50 μl contendo: 5 μl de DNA da amostras, 5 μL de
tampão de PCR 10X, 1,5 μL de MgCl2 25 mmol / μL, 4,0 μl de DNTP Soluções (25
mmol / μL cada), 1 μL de 25 pmol do primer universal foward (D88-5
GAGAGTTTGATYMTGGCTCAG 3') e do primer universal reverse (E94-5'
GAAGGAGGTGWTCCARCCGCA 3 '), 0,5 μL de 5U / mL Platinum Taq Polymerase e
32 μL de água destilada estéril (23). Os reagentes foram sintetizados e fornecidos pela
Invitrogen (Carlsbad, CA, EUA). DNA de P. gingivalis (ATCC 3277) e água destilada
estéril foram utilizados como controlos positivos e negativos, respectivamente. A
reação foi realizada num termociclador de DNA (GenePro, BioerTechnology,
Hangzhou, China) ajustado para o passo de desnaturação inicial a 94ºC durante 4
Minutos seguidos por 30 ciclos a 94 ° C durante 45 segundos (desnaturação), 60 ° C
durante 45 segundos (anelamento), 72 ° C durante 90 segundos (extensão), e um
passo de extensão final A 72 ° C durante 15 minutos.
Foram realizados dois PCRs independentes para cada amostra e os
produtos dos PCRs foram submetidos à eletroforese em gel de agarose a 1% corado
com EZ-Vision® In-Gel Solution e utilizando uma escada de DNA de 1 kb como
marcador de tamanho molecular. As reações positivas foram determinadas pela
presença de bandas de tamanho apropriado (1500 pares de bases). Depois os
produtos de PCR foram purificados utilizando QIAquick Gel Extracção (Qiagen, Hiden,
Alemanha).
40
Os produtos de PCR purificados foram sequenciados utilizando o DNA ABI
3730 Analisador, com o BigDye Terminator Cycle Sequencing Kit (Applied
Biosystems, Carlsbad, CA, EUA) utilizando o primer 533R (5 'TKACCGCGGCTGCTG
3'). Seqüências de aproximadamente 600 bases foram obtidas, inspecionadas e
editadas usando o software BioEdit (www.mbio.ncsu.edu/BioEdit/bioedit.html), e a
identidade / aproximação filogenética foi obtida por comparação com as sequências
do gene 16S rRNA Da base de dados de GenBank do centro nacional da informação
da biotecnologia (www.ncbi.nlm.nih.gov) através da ferramenta básica de pesquisa de
alinhamento local (BLAST). Sequências com mais de 4 caracteres ambíguos ou
inferiores a 500 bases foram descartados, sendo considerada pelo menos 97% de
similaridade.
4.6.3 Suscetibilidade antimicrobiana (E-test)
O sistema do E-test consiste em uma fita plástica inerte e não porosa de
50 mm de comprimento e 5 mm de largura, que contém em um lado um gradiente de
concentração de antibiótico, e do outro, uma escala numérica que indica a
concentração do medicamento. A fita do E-test pode detectar uma concentração
inibitória mínima (CIM) que varia de 0.016 a 256 g/mL, com um total de 29 diferentes
CIMs, que são agrupadas de duas em duas, representando 15 níveis de diluição
(Bolmström 1993).
As bactérias produtoras de pigmento negro do gênero Porphyromonas e
Prevotella, (bastonetes Gram-negativos anaeróbios estritos), espécies de Prevotella
não pigmentadas e espécies do grupo dos Fusobacterium (bastonetes Gram-
negativos anaeróbios estritos) que foram isoladas dos casos estudados, foram
submetidas ao método do E-test (AB BIODISK, Solna, Suécia). Os agentes
antimicrobianos testados foram: benzilpenicilina (PG), amoxicilina (AC), amoxicilina +
ácido clavulânico (XL), clindamicina (CM), eritromicina (EM), Metronidazol (MZ) e
azitromicina (AZ).
Placas contendo 4 mm de espessura de Brucella Agar (OXOID, Hampshire,
Inglaterra) + 5% de sangue de carneiro desfibrinado, 1% de vitamina K + 0,5% de
hemina foram utilizadas para o repique das cepas com inoculo de 24-48 hrs. Após a
secagem das placas (10 a 15 minutos), as fitas de E-test serão distribuídas nas placas
41
com o auxílio de pinça estéril. O experimento foi executado em duplicata e sempre em
fluxo laminar.
As placas contendo as bactérias anaeróbias estritas foram imediatamente
incubadas na câmara de anaerobiose, e a leitura realizada após 24-48 hrs de
incubação. Os valores das CIMs foram determinados pela leitura no ponto de
intersecção entre o halo de inibição e a fita, considerando o ponto de inibição completa
de crescimento. A interpretação dos valores das CIMs foi realizada seguindo o guia
de interpretação da Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI).
4.7 Análise de dados
Análise estatística foi realizada com auxilio do software SPSS for Windows,
considerando um nível de significância de 5%. O Teste Qui-quadrado de Pearson ou
Teste Exato de Fischer, quando apropriado, foi utilizado para testar a hipótese nula
de que não há associação entre sinais e sintomas clínicos e a presença de
determinada bactéria; e entre bactérias específicas.
Nos casos em que a hipótese foi descartada, ou seja, quando houve
diferenças entre as espécies (p< 0,05), o teste de Odds ratio foi realizado.
Associações positivas foram aquelas em que Odds ratio foi maior que 2 e para
associações negativas aquelas em que os valores de Odds ratio foram menores que
0,5.
42
5 RESULTADOS
5.1 Caracterização da microbiota presente em canais radiculares de dentes com
necessidade de intervenção endodôntica, com lesão periapical e sem
sintomatología
As características clínicas dos pacientes com necessidade de intervenção
endodôntica de dentes associados à lesão periapical visível radiograficamente que
participam do estudo estão apresentadas na Tabela 2. No momento do atendimento,
os pacientes não relataram presença de sintomatologia dolorosa (10/10). Ao teste de
sensibilidade térmica e palpação nenhum dos pacientes relatou sesnsibilidade no
dente em questão (00/10). Ao teste de percussão vertical, em dois casos os pacientes
relataram um desconforto (02/10). Os dentes apresentavam-se cariados (2/10) ou
restaurados (8/10). Nenhum dos pacientes apresentou gengivite ou mobilidade
associada ao elemento dental e os canais radiculares não apresentavam exsudato.
43
Tabela 2. Perfil amostral dos pacientes que participaram do estudo, pertencentes ao grupo
com necrose pulpar e presença de lesão periapical sem sintomatologia dolorosa.
Caso Idade Gênero Dente Sensibilidade Coroa Period. Canal Mobil.
SP PV P
1 43 M 45 - - - Cariado Saudável Seco Não
2 29 M 22 - - - Cariado Saudável Seco Não
3 58 F 21 - - - Restaurado Saudável Seco Não
4 21 M 12 - + - Restaurado Saudável Seco Não
5 37 M 44 - - - Restaurado Saudável Seco Não
6 37 M 12 - - - Restaurado Saudável Seco Não
7 46 F 24 - + - Restaurado Saudável Seco Não
8 41 M 25 - - - Restaurado Saudável Seco Não
9 58 M 25 - - - Restaurado Saudável Seco Não
10 58 M 23 - - - Restaurado Saudável Seco Não
Period. – Condição periodontal; Mobil. – Mobilidade dentária; SP – Suscetibilidade pulpar; PV
– Dor a percussão vertical; P – Dor a palpação
Bactérias foram detectadas em todas as amostras microbiológicas dos
pacientes com necessidade de intervenção endodôntica de dentes associados à lesão
periapical visível radiograficamente (10/10). Dentre as bactérias investigadas as mais
encontradas foram: Actinomyces oris (10/10), Prevotella nigrescens (10/10),
Actinomyces israelii (09/10), Campylobacter showae (09/10), Dialister pneumosintes
(09/10), Enterococcus faecium (09/10), Filifactor aloci (09/10), Fusobacterium
periodonticum (09/10), Streptococcus oralis (09/10) e Veillonella parvula (09/10), como
mostram os dados apresentados na Figura 1.
44
Figura 1. Bactérias detectadas nos canais radiculares de pacientes pertencentes ao grupo
com necrose pulpar e presença de lesão periapical que não apresentavam
sintomatologia dolorosa, por meio do checkerboard.
45
Com relação à morfologia bacteriana das espécies alvos investigadas
(Figura 2) pelo checkerboard, no grupo de pacientes com necrose pulpar associadas
a lesão periapical e sem sintomatologia, foi possível observar um maior número de
bactérias em forma de bastonetes, Gram-negativas e anaeróbias estritas.
Figura 2. Caracterização bacteriana (Gram, requerimento gasoso e forma) das bactérias
investigadas pelo Checkerboard de pacientes com necessidade de tratamento
endodôntico associados a lesão periapical e sem sintomatologia.
A distribuição do número de espécies bacterianas por casos (Figura 3)
possibilitou observar que os casos 9 e 6 foram os que apresentaram um maior número
de espécies diferentes e que os casos 4 e 1 foram os que apresentaram um menor
número de espécies diferentes comparados aos outros casos investigados.
46
Figura 3. Número de diferentes espécies por cada canal radicular coletado de dentes com
necessidade de intervenção endodôntica, com lesão periapical e sem
sintomatologia investigado pelo Checkerboard.
Com relação às associações entre as diferentes espécies bacterianas
investigadas no grupo de pacientes com necrose pulpar associadas a lesão periapical
e sem sintomatologia, observou-se associações positivas significantes (p<0,05) em
13 pares de espécies bacterianas (Tabela 3) no grupo com necessidade de
intervenção endodôntica, com lesão periapical e sem sintomatologia, todos com
valores de ODDS > 2.
Nenhuma associação negativa entre as diferentes espécies bacterianas
investigadas no grupo de pacientes com necrose pulpar associadas à lesão periapical
e sem sintomatologia foi encontrada.
47
Tabela 3. Associações positivas significantes (p<0,05) entre espécies bacterianas presentes
em canais radiculares de pacientes pertencentes ao grupo com necrose pulpar e
presença de lesão periapical que não apresentavam sintomatologia dolorosa.
Espécie Espécie
Significância
(valor de p)
Valor do
ODDS
Porphyromonas endodontalis Treponema denticola 0,033 7
Porphyromonas endodontalis Gemella morbillorum 0,033 7
Porphyromonas endodontalis Streptococcus gordonii 0,033 7
Porphyromonas endodontalis Tannerella forsythia 0,033 7
Porphyromonas endodontalis Staphylococcus epidermidis 0,033 7
Enterococcus faecalis Streptococcus intermedius 0,048 6
Enterococcus faecalis F.nucleatum sp. polymorphum 0,048 6
Eubacterium saburreum Parvimonas micra 0,048 6
Eubacterium saburreum Streptococcus intermedius 0,048 6
Streptococcus gordonii F.nucleatum sp. polymorphum 0,048 6
Treponema denticola F.nucleatum sp. polymorphum 0,048 6
F. nucleatum sp. nucleatum Prevotella melaninogenica 0,048 5
F. nucleatum sp. nucleatum Streptococcus mitis 0,048 5
Não houve diferença estatística na associação entre espécies bacterianas
investigadas e sinais e sintomas clínicos observados no grupo com necrose pulpar e
presença de lesão periapical que não apresentavam sintomatologia dolorosa (p>
0,05).
5.2 Caracterização da microbiota presente em canais radiculares e abscessos
apicais de dentes com necessidade de intervenção endodôntica com necrose
pulpar associado a abscesso apical e sintomatologia dolorosa
As características clínicas dos pacientes com necrose pulpar associada a
abscesso periapical estão representadas na Tabela 4. No momento do atendimento,
os pacientes relataram presença de sintomatologia dolorosa (10/10). Ao teste de
sensibilidade térmica nenhum dos pacientes relatou sensibilidade no dente em
questão. Ao teste de percussão vertical todos os pacientes relataram desconforto
(10/10) durante a realização do teste. Ao teste de palpação todos os pacientes
relataram desconforto (10/10) no momento da palpação na região do periápice do
48
dente envolvido. Os dentes apresentavam-se cariados (4/10) ou restaurados (6/10).
Os dentes coletados apresentavam secos (1/10) ou com presença de exsudato (9/10).
Nenhum dos pacientes apresentou gengivite associada ao elemento dental.
Tabela 4. Perfil amostral dos pacientes que participam do estudo pertencentes ao grupo com
necrose pulpar associados a abscesso apical e sintomatologia dolorosa.
Caso Idade Gênero Dente Sensibilidade Coroa Period. Canal Mobil.
SP PV P
1 29 M 16 - + + Cariado Saudável Seco Não
2 48 F 26 - + + Restaurado Saudável Pus Não
3 18 M 46 - + + Restaurado Saudável Sangue/Pus Não
4 56 F 34 - + + Restaurado Saudável Sangue/Pus Não
5 28 M 46 - + + Cariado Saudável Pus Não
6 32 M 26 - + + Restaurado Saudável Pus Não
7 18 M 12 - + + Restaurado Saudável Pus Não
8 63 M 12 - + + Restaurado Saudável Pus Não
9 54 F 12 - + + Cariado Saudável Sangue/Pus Não
10 42 F 11 - + + Cariado Saudável Sangue/Pus Não
Period. – Condição periodontal; Mobil. – Mobilidade dentária; SP – Sensibilidade pulpar; PV –
Dor a percussão vertical; P – Dor a palpação
Bactérias foram detectadas em todas as coletas microbiológicas dos
abscessos apicais dos pacientes com necrose pulpar associados a abscesso apical e
sintomatologia dolorosa. Dentre as bactérias investigadas as mais encontradas foram:
Prevotella intermedia (9/10), Streptococcus mutans (9/10), Prevotella melaninogenica
(09/10), Veillonella parvula (09/10), Prevotella nicrescens (08/10), Dialister
pneumosintes (08/10), Enterococcus faecalis (08/10), Fusobacterium nucleatum (sp
vincentii) (09/10) e Enterococcus hirae (08/10). Como mostram os dados
apresentados na Figura 4.
49
Figura 4. Bactérias detectadas nos abscessos apicais de pacientes pertencentes ao grupo
com necrose pulpar associados a abscesso apical e sintomatologia dolorosa, por
meio do Checkerboard.
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
Fusobacterium nucleatum sp. polymorphum
Gemella morbillorum
Propionibacterium acnes
Campylobacter showae
Eikenella corrodens
Capnocytophaga ochracea
Fusobacterium nucleatum sp. nucleatum
Eubacterium nodatum
A actinomycetencomytans
Eubacterium saburreum
Parvimonas micra
Actinomyces oris
Actinomyces odontolyticus I
Fusobacterium periodonticum
Neisseria mucosa
Tannerella forsythia
Enterococcus faecium
Porphyromonas gingivalis
Campylobater rectus
Streptococcus oralis
Actinomyces israelii
Streptococcus intermedius
Staphylococcus epidermidis
Streptococcus mitis
Capnocytophaga sputigena
Leptotrichia buccalis
Treponema Socranskii
Porphyromonas endodontalis
Treponema denticola
Capnocytophaga gingivalis
Streptococcus gordonii
Enterococcus hirae
Fusobacterium nucleatum sp. vincentii
Enterococcus faecalis
Dialister pneumosintes
Prevotella nigrescens
Veillonella parvula
Prevotella melaninogenica
Streptococcus mutans
Prevotella intermedia
1
2
3
4
5
50
Bactérias foram detectadas em todas as coletas microbiológicas dos canais
radiculares dos pacientes com necrose pulpar associados a abscesso apical e
sintomatologia dolorosa. Dentre as bactérias investigadas as mais encontradas foram:
Streptococcus gordonii (07/10), Capnocytophaga gingivalis (07/10), Actinomyces oris
(07/10), Enterococcus hirae (07/10). Como mostram os dados apresentados na Figura
5.
51
Figura 5. Bactérias detectadas nos canais radiculares de pacientes pertencentes ao grupo
com necrose pulpar associados a abscesso apical e sintomatologia dolorosa, por meio do
Checkerboard.
52
Com relação à morfologia bacteriana das espécies alvos investigadas
(Figura 6) pelo checkerboard no grupo de pacientes com necrose pulpar associados
a abscesso apical e sintomatologia dolorosa, foi possível observar um maior número
de bactérias em forma de bastonetes, Gram-negativas e anaeróbias estritas nas
coletas dos abscessos apicais quando comparados com as coletas dos canais
radiculares.
Figura 6. Caracterização bacteriana (Gram, requerimento gasoso e forma) das bactérias
investigadas pelo Checkerboard de pacientes com necrose pulpar associados a
abscesso apical e sintomatologia dolorosa das coletas dos canais radiculares e
abscesos apicais.
A distribuição do número de espécies bacteriana por casos no grupo de
pacientes com necrose pulpar associados a abscesso apical e sintomatologia
dolorosa (Figura 7) possibilitou observar que os casos 2 e 9 foram os que
apresentaram um maior número de espécies diferentes nas coletas dos abscessos
apicais e os casos 2 e 10 foram os que apresentaram um maior número de espécies
diferentes nas coletas dos canais radiculares. É possivel observar também e que o
caso 3 foi o que apresentou um menor número de espécies diferentes das coletas dos
53
abscessos apicais e os casos 5 e 6 foram os que apresentaram um menor número de
espécies diferentes das coletas dos canais radiculares comparados aos outros casos
investigados.
Figura 7. Número de diferentes espécies bacterianas presentes nas coletas de abscessos
apicais e canais radiculares de dentes com necessidade de intervenção
endodôntica com necrose pulpar associados a abscesso apical e sintomatologia
dolorosa.
Com relação às associações entre as diferentes espécies bacterianas
investigadas das coletas dos abscessos apicais no grupo de pacientes com
necessidade de intervenção endodôntica com necrose pulpar associado a abscesso
apical e sintomatologia dolorosa, observou-se associações positivas significantes
(p<0,05) em 28 pares de espécies bacterianas (Tabela 5), todos com valores de
ODDS > 2.
54
Tabela 5. Associações positivas significantes (p<0,05) entre espécies bacterianas presentes
nos abscessos apicais de dentes com necessidade de intervenção endodôntica
com necrose pulpar associado a abscesso apical e sintomatologia dolorosa.
Espécie Espécie
Significância
(valor de p)
Valor do
ODDS
Streptococcus gordonii Porphyromonas gingivalis 0,033 7
Streptococcus gordonii Campylobater rectus 0,033 7
Streptococcus gordonii Streptococcus oralis 0,033 7
Porphyromonas endodontalis Porphyromonas gingivalis 0,033 7
Porphyromonas endodontalis Campylobater rectus 0,033 7
Porphyromonas endodontalis Streptococcus oralis 0,033 7
Treponema Socranskii Campylobater rectus 0,033 7
Treponema denticola Streptococcus intermedius 0,033 7
Enterococcus faecium Eubacterium nodatum 0,048 6
Enterococcus faecium Actinomyces odontolyticus 0,048 6
Porphyromonas gingivalis Tannerella forsythia 0,048 6
Campylobater rectus Eubacterium saburreum 0,048 6
Campylobater rectus Parvimonas micra 0,048 6
Campylobater rectus Actinomyces oris 0,048 6
Streptococcus oralis Tannerella forsythia 0,048 6
Actinomyces israelii Actinomyces oris 0,048 6
Actinomyces israelii F. periodonticum 0,048 6
Streptococcus intermedius F. periodonticum 0,048 6
Streptococcus mitis A actinomycetencomytans 0,048 6
Capnocytophaga sputigena A actinomycetencomytans 0,048 6
Capnocytophaga sputigena Tannerella forsythia 0,048 6
Leptotrichia buccalis A actinomycetencomytans 0,048 6
Eubacterium saburreum F.nucleatum sp. nucleatum 0,048 5
Parvimonas micra F.nucleatum sp. nucleatum 0,048 5
Actinomyces oris F.nucleatum sp. nucleatum 0,048 5
A actinomycetencomytans Capnocytophaga ochracea 0,048 5
Fusobacterium periodonticum Capnocytophaga ochracea 0,048 5
Fusobacterium periodonticum Campylobacter showae 0,033 4
55
Com relação às associações negativas entre as diferentes espécies
bacterianas investigadas das coletas dos abscessos apicais no grupo de pacientes
com necessidade de intervenção endodôntica com necrose pulpar associado a
abscesso apical e sintomatologia dolorosa, observou-se associações negativas
significantes (p<0,05) em 6 pares de espécies bacterianas (Tabela 6) , todos com
valores de ODDS < 0,2.
Tabela 6. Associações negativas significantes (p<0,05) entre espécies bacterianas presentes
nos abscessos apicais de dentes com necessidade de intervenção endodôntica
com necrose pulpar associados a abscesso apical e sintomatologia dolorosa.
Espécie Espécie
Significância
(valor de p)
Valor do
ODDS
Capnocytophaga ochracea A actinomycetencomytans 0,048 0,167
Capnocytophaga ochracea F. periodonticum 0,048 0,167
F. nucleatum sp. nucleatum Eubacterium saburreum 0,048 0,167
F. nucleatum sp. nucleatum Parvimonas micra 0,048 0,167
F. nucleatum sp. nucleatum Actinomyces oris 0,048 0,167
Campylobacter showae F.nucleatum sp. nucleatum 0,033 0,143
Com relação às associações entre as diferentes espécies bacterianas
investigadas nas coletas dos canais radiculares no grupo de pacientes com
necessidade de intervenção endodôntica com necrose pulpar associado a abscesso
apical e sintomatologia dolorosa, observou-se associações positivas significantes
(p<0,05) em 45 pares de espécies bacterianas (Tabela 7), todos com valores de
ODDS > 2.
56
Tabela 7. Associações positivas significantes (p<0,05) entre espécies bacterianas presentes
em canais radiculares de dentes com necessidade de intervenção endodôntica com
necrose pulpar associado a abscesso apical e sintomatologia dolorosa.
(Continua)
Espécie Espécie Significância (valor de p)
Valor do ODDS
Enterococcus hirae Streptococcus intermedius 0,033 7
Enterococcus hirae Prevotella nigrescens 0,033 7
Capnocytophaga gingivalis Treponema socranskii 0,033 7
Capnocytophaga gingivalis Dialister pneumosintes 0,033 7
Capnocytophaga gingivalis Treponema denticola 0,033 7
Streptococcus gordonii Treponema socranskii 0,033 7
Streptococcus gordonii Streptococcus intermedius 0,033 7
Streptococcus gordonii Treponema denticola 0,033 7
Streptococcus gordonii Neisseria mucosa 0,033 7
Actinomyces oris Treponema socranskii 0,033 7
Actinomyces oris Streptococcus intermedius 0,033 7
Actinomyces oris Treponema denticola 0,033 7
Actinomyces oris Prevotella nigrescens 0,033 7
Actinomyces oris Neisseria mucosa 0,033 7
Neisseria mucosa F. nucleatum sp. vincentii 0,048 6
Neisseria mucosa Streptococcus mutans 0,048 6
Treponema socranskii Actinomyces israelii 0,048 6
Treponema socranskii Actinomyces odontolyticus 0,048 6
Dialister pneumosintes Porphyromonas endodontalis 0,048 6
Streptococcus intermedius F. nucleatum sp. vincentii 0,048 6
Streptococcus intermedius Streptococcus mutans 0,048 6
Treponema denticola Actinomyces israelii 0,048 6
Treponema denticola Actinomyces odontolyticus 0,048 6
Prevotella nigrescens F. nucleatum sp. vincentii 0,048 6
Prevotella nigrescens Streptococcus mutans 0,048 6
F. nucleatum sp. vincentii Campylobater rectus 0,048 5
F. nucleatum sp. vincentii Eubacterium saburreum 0,048 5
F. nucleatum sp. vincentii Propionibacterium acnes 0,048 5
Streptococcus mutans Eubacterium nodatum 0,048 5
Streptococcus mutans Campylobater rectus 0,048 5
Streptococcus mutans Eubacterium saburreum 0,048 5
Porphyromonas endodontalis Parvimonas micra 0,048 5
Actinomyces israelii Parvimonas micra 0,048 5
Streptococcus mutans Fusobacterium nucleatum sp.
nucleatum 0,048 5
Streptococcus mutans Propionibacterium acnes 0,048 5
Prevotella intermedia Eubacterium nodatum 0,048 5
57
Tabela 7. Associações positivas significantes (p<0,05) entre espécies bacterianas presentes
em canais radiculares de dentes com necessidade de intervenção endodôntica com
necrose pulpar associado a abscesso apical e sintomatologia dolorosa
(Conclusão)
Espécie Espécie Significância (valor de p)
Valor do ODDS
Prevotella intermedia Porphyromonas gingivalis 0,048 5
F. nucleatum sp. nucleatum Capnocytophaga ochracea 0,033 4
F. nucleatum sp. nucleatum Streptococcus mitis 0,033 4
Campylobater rectus Capnocytophaga ochracea 0,033 4
Campylobater rectus Streptococcus mitis 0,033 4
Parvimonas micra Enterococcus faecalis 0,033 4
Veillonella parvula Streptococcus mitis 0,033 4
Streptococcus oralis Enterococcus faecalis 0,033 4
Propionibacterium acnes F.nucleatum sp. polymorphum 0,033 4
Com relação às associações negativas entre as diferentes espécies
bacterianas investigadas das coletas dos canais radiculares no grupo de pacientes
com necessidade de intervenção endodôntica com necrose pulpar associado a
abscesso apical e sintomatologia dolorosa, tivemos associações positivas
significantes (p<0,05) em 26 pares de espécies bacterianas (Tabela 8) , todos com
valores de ODDS < 0,2.
58
Tabela 8. Associações negativas significantes (p<0,05) entre espécies bacterianas presentes
em canais radiculares de dentes com necessidade de intervenção endodôntica
com necrose pulpar associado a abscesso apical e sintomatologia dolorosa.
Espécie Espécie Significância (valor de p)
Valor do ODDS
Campylobater rectus Streptococcus mutans 0,048 0,167
F. nucleatum sp. nucleatum Streptococcus mutans 0,048 0,167
F. nucleatum sp nucleatum F.nucleatum sp. vincentii 0,048 0,167
Eubacterium saburreum Streptococcus mutans 0,048 0,167
Parvimonas micra Porphyromonas endodontalis 0,048 0,167
Parvimonas micra Actinomyces israelii 0,048 0,167
Streptococcus oralis Porphyromonas endodontalis 0,048 0,167
Propionibacterium acnes Streptococcus mutans 0,048 0,167
Eubacterium nodatum F. nucleatum sp. vincentii 0,048 0,167
Eubacterium nodatum Streptococcus mutans 0,048 0,167
Eubacterium nodatum Prevotella intermedia 0,048 0,167
Porphyromonas gingivalis Prevotella intermedia 0,048 0,167
Propionibacterium acnes F. nucleatum sp. vincentii 0,048 0,167
Campylobater rectus F. nucleatum sp. vincentii 0,048 0,167
Veillonella parvula Capnocytophaga ochracea 0,033 0,143
Enterococcus faecalis Streptococcus oralis 0,033 0,143
Capnocytophaga ochracea Eubacterium nodatum 0,033 0,143
Capnocytophaga ochracea Campylobater rectus 0,033 0,143
Capnocytophaga ochracea F. nucleatum sp. nucleatum 0,033 0,143
Streptococcus mitis Eubacterium nodatum 0,033 0,143
Streptococcus mitis Campylobater rectus 0,033 0,143
Streptococcus mitis Veillonella parvula 0,033 0,143
Streptococcus mitis F. nucleatum sp. nucleatum 0,033 0,143
F.nucleatum sp. polymorphum Eubacterium nodatum 0,033 0,143
F.nucleatum sp. polymorphum Eubacterium saburreum 0,033 0,143
F.nucleatum sp. polymorphum Propionibacterium acnes 0,033 0,143
Também foram encontradas associações positivas (p<0,05) entre as
diferentes espécies bacterianas investigadas das coletas dos canais radiculares e dos
abscessos apicais no grupo de pacientes com necessidade de intervenção
endodôntica com necrose pulpar associado a abscesso apical e sintomatologia
dolorosa, em 26 pares de espécies bacterianas (Tabela 9), todos com valores de
ODDS > 2.
59
Tabela 9. Associações positivas significantes (p<0,05) entre espécies bacterianas presentes
em abscessos apicais e canais radiculares de dentes com necessidade de
intervenção endodôntica com necrose pulpar associado a abscesso apical e
sintomatologia dolorosa.
Espécie CA Espécie CCR
Significância
(valor de p)
Valor do
ODDS
Treponema denticola Treponema denticola 0,033 7
Streptococcus gordonii Propionibacterium acnes 0,033 7
Streptococcus oralis Porphyromonas endodontalis 0,048 6
Streptococcus intermedius Actinomyces odontolyticus 0,048 6
Treponema denticola Streptococcus intermedius 0,033 5
Actinomyces odontolyticus I Streptococcus oralis 0,048 5
CA - Coleta Abscesso; CCR – Coleta canal radicular
Nenhuma associação negativa entre as diferentes espécies bacterianas
presentes em abscessos apicais e canais radiculares de dentes com necessidade de
intervenção endodôntica com necrose pulpar associado a abscesso apical e
sintomatologia foi encontrada.
Não houve diferença estatística na associação entre espécies bacterianas
investigadas e sinais e sintomas clínicos observados no grupo de dentes com
necessidade de intervenção endodôntica com necrose pulpar associado a abscesso
apical e sintomatologia dolorosa (p> 0,05).
60
5.3 Suscetibilidade aos agentes antimicrobianos (E-test)
Foram testadas as suscetibilidades antimicrobianas dos seguintes
microrganismos anaeróbios estritos isolados de diferentes coletas clínicas: BPN:
Prevotella nigrescens (n=5), Prevotella melaninogenica (n=4), Porphyromonas
endodontalis (n=3), Porphyromonas gingivalis (n=2). Fusobacterium nucleatum (n=4),
Prevotella buccae (n=4), Prevotella denticola (n=4), Propionibacterium propionicum
(n=1).
Os índices de suscetibilidade foram determinados de acordo com as
concentrações inibitórias mínimas reportadas por normas do Clinical and Laboratory
Standards Institute – CLSI (2015). Os resultados foram considerados em três
categorias: suscetível (S), intermediário (I) e resistente (R). Os valores de CIM50 e
CIM90 são relativos às concentrações inibitórias mínimas de cada agente
antimicrobiano para 50 e 90% das cepas isoladas, respectivamente.
Os valores da CIM50, CIM90, valores mínimo e máximo das concentrações
para cada espécie, além de sua suscetibilidade estão descritos nas Tabelas 10 a 18.
Tabela 10. Valores médios de CIM50 e CIM90 e da suscetibilidade das cepas de Prevotella
nigrescens (n=5) aos agentes antimicrobianos.
CIM (µg/mL) Suscetibilidade
CIM 50 CIM 90 Variação S I R
n % n % n %
AC 0,016 0,032 0,016-1,5 5 100 - - - -
AZ 0,094 0,19 0,016-32 3 60 1 20 1 20
CM 0,016 0,75 0,016-1,5 5 100 - - - -
EM 0,023 0,094 0,016-32 4 80 - - 1 20
MZ 0,032 0,032 0,016-0,125 5 100 - - - -
PG 0,016 0,016 0,016–192 4 80 - - 1 20
XL 0,016 0,032 0,016-0,25 5 100 - - - -
S = suscetível; I = intermediário; R = resistente; AC = amoxicilina; AZ = azitromicina; CM = clindamicina; EM = eritromicina; MZ = metronidazol; PG = benzilpenicilina; XL = amoxicilina + ácido clavulânico.
61
Tabela 11. Valores médios de CIM50 e CIM90 e da suscetibilidade das cepas de Fusobacterium nucleatum (n=4) aos agentes antimicrobianos.
CIM (µg/mL) Suscetibilidade
CIM 50 CIM 90 Variação S I R
n % n % n %
AC >256 >256 0,032- >256 1 50 - - 3 75
AZ >256 >256 0,032- >256 1 25 - - 3 75
CM >256 >256 0,016- >256 2 50 - - 2 50
EM >256 >256 0,75- >256 1 25 1 25 2 50
MZ 0,25 >256 0,032- >256 3 75 - - 1 25
PG >256 >256 0,016- >256 1 25 2 50 1 25
XL 0,016 0,032 0,016–0,75 4 100 - - - -
S = suscetível; I = intermediário; R = resistente; AC = amoxicilina; AZ = azitromicina; CM = clindamicina; EM = eritromicina; MZ = metronidazol; PG = benzilpenicilina; XL = amoxicilina + ácido clavulânico.
Tabela 12. Valores médios de CIM50 e CIM90 e da suscetibilidade das cepas de Prevotella
buccae (n=4) aos agentes antimicrobianos.
CIM (µg/mL) Suscetibilidade
CIM 50 CIM 90 Variação S I R
n % n % n %
AC 0,19 0,064 0,016-0,064 4 100 - - - -
AZ 0,19 16 0,016-16 3 75 - - 1 25
CM 0,75 2 0,016-2 4 100 - - - -
EM 0,5 0,5 0,016- >256 3 75 - - 1 25
MZ 0,064 1 0,016-1 4 100 - - - -
PG 0,016 0,016 0,016-0,064 4 100 - - - -
XL 0,023 0,094 0,016-0,094 4 100 - - - -
S = suscetível; I = intermediário; R = resistente; AC = amoxicilina; AZ = azitromicina; CM = clindamicina; EM = eritromicina; MZ = metronidazol; PG = benzilpenicilina ; XL = amoxicilina + ácido clavulânico.
62
Tabela 13. Valores médios de CIM50 e CIM90 e da suscetibilidade das cepas de Prevotella
denticola (n=4) aos agentes antimicrobianos.
CIM (µg/mL) Suscetibilidade
CIM 50 CIM 90 Variação S I R
N % n % n %
AC 0,016 0,016 0,016-0,023 4 100 - - - -
AZ 0,094 4 0,094-4 3 75 - - 1 25
CM 0,016 0,032 0,016-0,25 4 100 - - - -
EM 0,023 0,5 0,016- >256 3 75 - - 1 25
MZ 0,016 0,016 0,016-0,064 4 100 - - - -
PG 0,023 0,094 0,016-0,094 4 100 - - - -
XL 0,016 0,032 0,016-0,032 4 100 - - - -
S = suscetível; I = intermediário; R = resistente; AC = amoxicilina; AZ = azitromicina; CM = clindamicina; EM = eritromicina; MZ = metronidazol; PG = benzipenicilina; XL = amoxicilina + ácido clavulânico.
Tabela 14. Valores médios de CIM50 e CIM90 e da suscetibilidade das cepas de Prevotella
melaninogenica (n=4) aos agentes antimicrobianos.
CIM (µg/mL) Suscetibilidade
CIM 50 CIM 90 Variação S I R
n % n % n %
AC 0,032 0,032 0,016-0,032 4 100 - - - -
AZ 1 1,5 0,032-1,5 4 100 - - - -
CM 0,016 0,016 0,016-1 4 100 - - - -
EM 0,064 0,5 0,0064-0,5 4 100 - - - -
MZ 2 12 2-12 3 75 - - 1 25
PG 0,016 0,016 0,016-0,023 4 100 - - - -
XL 0,016 1 0,016-1 4 100 - - - -
S = suscetível; I = intermediário; R = resistente; AC = amoxicilina; AZ = azitromicina; CM = clindamicina; EM = eritromicina; MZ = metronidazol; PG = benzilpenicilina; XL = amoxicilina + ácido clavulânico.
63
Tabela 15. Valores médios de CIM50 e CIM90 e da suscetibilidade das cepas de
Porphyromonas endodontalis (n=3) aos agentes antimicrobianos.
CIM (µg/mL) Suscetibilidade
CIM 50 CIM 90 Variação S I R
n % n % N %
AC 0,016 0,032 0,016-0,032 3 100 - - - -
AZ 0,032 4 0,032-4 2 66 - - 1 33
CM 0,016 0,016 - 3 100 - - - -
EM 0,5 1 0,5-1 3 100 - - - -
MZ 2 4 2-4 3 100 - - - -
PG 0,75 3 0,75-3 2 66 - - 1 33
XL 0,016 0,016 - 3 100 - - - -
S = suscetível; I = intermediário; R = resistente; AC = amoxicilina; AZ = azitromicina; CM = clindamicina; EM = eritromicina; MZ = metronidazol; PG = benzilpenicilina; XL = amoxicilina + ácido clavulânico.
Tabela 16. Valores médios de CIM50 e CIM90 e da suscetibilidade das cepas de Prevotella
oralis (n=2) aos agentes antimicrobianos.
CIM (µg/mL) Suscetibilidade
CIM 50 CIM 90 Variação S I R
n % n % N %
AC 0,016 0,016 - 2 100 - - - -
AZ 0,016 0,016 - 2 100 - - - -
CM 0,016 3 0,016-3 1 50 1 50 - -
EM 0,016 0,016 - 2 100 - - - -
MZ 5 15 5-15 1 50 1 50 - -
PG 0,016 1 0,016-1 1 50 1 50 - -
XL 0,016 0,016 - 2 100 - - - -
S = suscetível; I = intermediário; R = resistente; AC = amoxicilina; AZ = azitromicina; CM = clindamicina; EM = eritromicina; MZ = metronidazol; PG = benzilpenicilina; XL = amoxicilina + ácido clavulânico.
64
Tabela 17. Valores médios de CIM50 e CIM90 e da suscetibilidade das cepas de
Porphyromonas gingivalis (n=2) aos agentes antimicrobianos.
CIM (µg/mL) Suscetibilidade
CIM 50 CIM 90 Variação S I R
n % n % N %
AC 0,064 0,064 - 2 100 - - - -
AZ 0,016 0.125 0,016-0,125 2 100 - - - -
CM 0,016 0,016 - 2 100 - - - -
EM 0,016 0,019 0,016-0,019 2 100 - - - -
MZ 4 6 4-6 2 100 - - - -
PG 0,023 0,023 - 2 100 - - - -
XL 0,016 0,016 - 2 100 - - - -
S = suscetível; I = intermediário; R = resistente; AC = amoxicilina; AZ = azitromicina; CM = clindamicina; EM = eritromicina; MZ = metronidazol; PG = benzilpenicilina; XL = amoxicilina + ácido clavulânico.
Tabela 18. Valores médios de CIM50 e CIM90 e da suscetibilidade das cepas de
Propionibacterium propionicum (n=1) aos agentes antimicrobianos.
CIM (µg/mL) Suscetibilidade
CIM 50 CIM 90 Variação S I R
N % n % N %
AC 0,016 0,016 - 1 100 - - - -
AZ 0,032 0,032 - 1 100 - - - -
CM 0,016 0,016 - 1 100 - - - -
EM 0,25 0,25 - 1 100 - - - -
MZ 0,25 0,25 - 1 100 - - - -
PG 0,016 0,016 - 1 100 - - - -
XL 0,094 0,094 - 1 100 - - - -
S = suscetível; I = intermediário; R = resistente; AC = amoxicilina; AZ = azitromicina; CM = clindamicina; EM = eritromicina; MZ = metronidazol; PG = benzilpenicilina; XL = amoxicilina + ácido clavulânico.
Dentre as cepas bacterianas testadas foram consideradas suscetível aos
seguintes antibióticos: amoxicilina + ácido clavulânico (29/29), metronidazol (26/29),
amoxicilina (26/29), clindamicina (26/29), eritomicina (24/29), benzilpenicilina (24/29)
e azitromicina (23/29). Foram consideradas intermédiario aos seguintes antibióticos:
benzilpenicilina (03/29), clindamicina (01/29), eritromicina (01/29) e metronidazol
(01/29). Foram consideradas resistentes aos seguintes antibióticos: azitromicina
(06/29), eritromicina (04/29), amoxicilina (03/29), clindamicina (02/29), benzilpenicilina
(02/29) e metronidazol (02/29). Como mostram os dados apresentados na Figura 8.
65
Figura 8. Porcentagem de cepas bacterianas avaliadas em suscetíveis (S), intermédiario (I) e
resistentes (R) aos agentes bacterianos testados amoxicilina (AC), azitromicina
(AZ), clindamicina (CM), eritromicina (EM), metronidazol (MZ), benzilpenicilina (PG)
e amoxicilina + acido clavulânico (XL).
66
6 DISCUSSÃO
6.1 Caracterização da microbiota presente em canais radiculares de dentes com
necessidade de intervenção endodôntica, com lesão periapical e sem
sintomatologia
O interior dos canais radiculares em dentes com necrose pulpar constitui
um nicho ecológico complexo que propicia condições adequadas para o
desenvolvimento da infecção endodôntica (Sundqvist, 1992). As interações
microbianas (Gharbia e Shah, 1993), as pressões exercidas pelo ambiente
(Haapasalo, 1993) e o contínuo desafio proporcionado pela ação do sistema imune
humano restringem o número de espécies capazes de colonizar o sistema de canais
radiculares.
A microbiota encontrada nas infecções endodônticas primárias é constituída
predominantemente por espécies anaeróbias estritas (Gomes et al., 1994a) e sua
composição está relacionada à presença ou não do desenvolvimento de
sintomatologia dolorosa (Yoshida et al., 1987). Estudos demonstram que espécies
pertencentes aos gêneros Prevotella ssp., Porphyromonas ssp., Fusobacterium ssp.,
Peptostreptococcus ssp. e Eubacterium ssp. são freqüentemente isoladas nessas
infecções (Yoshida et al., 1987; Hashioka et al., 1992; Gomes et al., 2004). Os
microrganismos estão envolvidos direta e indiretamente nos processos inflamatórios
e na sintomatologia dolorosa de origem endodôntica, pois componentes estruturais de
sua célula são capazes de ativar o sistema imune do hospedeiro (Jacinto et al., 2005;
Wadachi e Hargreaves. 2006).
No presente estudo foi possível observar que os casos de infecções primárias
associadas a lesões periapicais e sem sintomatologia apresentaram uma microbiota
polimicrobiana em 100% dos canais radiculares, com o predomínio de bactérias
Gram-negativas, anaeróbias e em forma de bastonetes. Sendo assim, o nosso estudo
corrobora com outros estudos recentes de composição microbiana em infecções
primárias que utilizaram a mesma metodologia (Roças IN e Siqueira JF, 2012;
Martinho FC et al., 2014).
Hashioka et al. (1992), ao estudarem a relação entre os achados clínicos e a
composição da microbiota de canais radiculares infectados, observaram que o número
de colônias em casos que apresentavam sintomatologia dolorosa espontânea foi
67
superior àqueles casos onde não havia sintomatologia. Uma correlação positiva foi
estabelecida entre a presença de dor à percussão e as espécies Peptococcus ssp.,
Peptostreptococcus ssp., Eubacterium ssp., P. gingivalis, P. endodontalis e
Bacteroides ssp., tornando estes microrganismos patógenos suspeitos de causarem
alterações periapicais. O odor desagradável ao acessar o sistema de canais
radiculares foi observado principalmente em casos onde Peptococcus ssp.,
Peptostreptococcus ssp., Eubacterium ssp. e Bacteroides ssp. foram encontrados.
Em nosso estudo não foi possível observar diferença estatística na associação
entre espécies bacterianas investigadas e sinais e sintomas clínicos observados (p>
0,05) no grupo de pacientes pertencentes ao grupo com necrose pulpar e presença
de lesão periapical. Acreditamos que não foi possível verificar tais associações devido
a uma amostra pequena e padronizada.
Em 1994b, Gomes et al. sugeriram que o desenvolvimento da patologia
endodôntica é dependente de associações entre as espécies. Ao avaliarem uma
extensa série de casos através do método de cultura bacteriana, os autores relatam o
isolamento de até 11 diferentes espécies nos canais radiculares. Associações
positivas foram observadas entre Peptostreptococcus ssp./Prevotella ssp., P.
micros/Prevotella ssp., Peptostreptococcus ssp./P. melaninogenica, Prevotella
ssp./Eubacterium ssp., P. micros/P. melaninogenica, dentre outras.
Com os resultados de nosso estudo foi possível observar associações positivas
em 13 pares bacterianos. As associações mais significantes (p=,033) foram as
associações com a espécie Porphyromonas endodontalis (bastonete, Gram-negativo
e anaeróbio) associado tanto a cocos Gram-positivos e facultativos (Gemella
morbillorum, Streptococcus gordonii, Staphylococcus epidermidis) quanto a bacilos
Gram-negativos e anaeróbios estritos (Treponema denticola e Tannerella forsythia).
Associações bacterianas podem ser importantes, agindo sinergicamente e
aumentando sua virulência, o que agrava os danos causados no hospedeiro.
68
6.2 Caracterização da microbiota presente em canais radiculares e abscessos
apicais de dentes com necessidade de intervenção endodôntica com necrose
pulpar associado a abscesso apical e sintomatologia dolorosa
As infecções endodônticas primárias são constituídas por interações
entre espécies de microrganismos. Estudos sugerem que a presença ou ausência
de sintomatologia está associada às características específicas da composição
microbiana, tanto qualitativa quanto quantitativamente (Sundqvist, 1976; Yoshida
et al., 1987; Hashioka et al., 1992).
No presente estudo foi possível observar que os casos de infecções primárias
associadas a abscesso apical agudo e sintomatologia dolorosa apresentaram uma
microbiota polimicrobiana em 100% dos canais radiculares e dos abscessos apicais,
com o predomínio de bactérias Gram-negativas, anaeróbias e em forma de
bastonetes. Sendo assim, o nosso estudo corrobora com outros estudos recentes de
composição microbiana em infecções primárias que utilizaram outras metodologias
(Montagner et al., 2010; Nobrega et al., 2016 a,b).
Para Gomes et al. (1994a), a presença de dor espontânea esteve associada
com as espécies Prevotella ssp., Prevotella intermedia, Prevotella melaninogenica e
Peptostreptococcus ssp. As espécies Prevotella ssp., Fusobacterium necrophorum,
Peptostreptococcus ssp. e Peptostreptococcus micros estiveram associadas à edema.
Correlações positivas foram observadas também entre presença de fístula e
Eubacterium lentum. Quando havia exsudato purulento no canal radicular, isolaram-
se os microrganismos Fusobacterium ssp., Fusobacterium necrophorum, Prevotella
buccae e Prevotella loescheii.
O emprego de testes estatísticos de correlação tais como o Chiquadrado de
Pearson ou o Exato de Fisher tem estabelecido associações positivas e negativas
entre a presença de sinais e sintomas de origem endodôntica e determinadas
espécies microbianas (Yoshida et al.,1987; Hashioka et al., 1992; Gomes et al., 1994
a,b; Jacinto et al., 2003; Gomes et al., 2004). Esta estratificação tem sido
extensivamente estudada em periodontia, onde a distribuição da microbiota em
complexos permite um melhor entendimento das sucessões ecológicas que
determinam o estabelecimento da patologia periodontal em suas diversas
modalidades (Socransky e Haffajee, 2005).
69
No presente estudo foram encontradas diversas associações positivas e
negativas entre as bactérias investigadas em cada um dos sítios coletados (canais
radiculares e abscessos apicais) e associações positivas entre bactérias investigadas
nos abscessos apicais e nos canais radiculares. Essas associações podem ser
importantes, agindo sinergicamente e aumentando sua virulência, o que agrava os
danos causados no hospedeiro.
Interações entre espécies bacterianas podem ser negativas ou
positivas, e dependendo do seu coeficiente estatístico indicam uma dependência
mais ou menos significante entre elas (Gomes et al., 1994b). No presente estudo,
associações positivas específicas foram constatadas entre os bacilos anaeróbios
estritos Gram-negativos Porphyromonas gingivalis e Bacteroides ureolyticus,
Fusobacterium nucleatum e Clostridium ssp., Prevotella disiens e Porphyromonas
gingivalis. Interações entre os bacilos anaeróbios estritos Gram-negativos
Clostridium butyricum e cocos anaeróbios Gram-positivos Peptostreptococcus
micros também foram observadas. Menos freqüentes foram as associações entre
os anaeróbios estritos Prevotella ssp. e Bifidobacterium bifidum e apenas uma
correlação positiva estatisticamente significante foi constatada entre os facultativos
Staphylococcus aureus e Staphylococcus xylosus.
Em nosso estudo não foi possível observar diferença estatística na associação
entre espécies bacterianas investigadas e sinais e sintomas clínicos observados (p>
0,05) no grupo de pacientes pertencentes ao grupo com necrose pulpar associada a
abscesso apical agudo e sintomatologia dolorosa em nenhum dos sítios coletados
(canais radiculares e abscessos apicais). Acreditamos que não foi possível verificar
tais associações por ser uma amostra padronizada.
6.3 Suscetibilidade aos agentes antimicrobianos (E-test)
Com o objetivo de determinar padrões de suscetibilidade antimicrobiana de
cepas isoladas no presente estudo foi utilizado o E-test. Este é um teste comercial,
baseado nos princípios de difusão de gradiente antimicrobiano em ágar, como forma
de determinação da concentração inibitória mínima. O E-test, por se tratar de um
método qualitativo e quantitativo, apresenta vantagens, por determinar a ação
70
antimicrobiana do antibiótico testado, além de determinar a concentração inibitória
mínima capaz de impedir o crescimento microbiano; uma vez que a fita utilizada
apresenta diferentes concentrações do antibiótico. Este método foi utilizado
anteriormente em diversos estudos (Citron et al., 1991; Nachnani et al., 1992;
Kuriyama et al., 2000; Jacinto et al., 2003; Sousa et al., 2003; Martinho 2007; Gomes
et al., 2011; Montagner et al., 2014).
Martinho (2007), investigando canais radiculares com infecção primária,
assintomáticos, avaliou a suscetibilidade aos agentes antimicrobianos em isolados
bacterianos e verificou que 100% das cepas de Prevotella buccae, Prevotella oralis e
Porphyromonas gingivalis foi suscetível à amoxicilina. Os resultados do presente
estudo estão de acordo com os apresentados por ele. No entanto em nosso trabalho
foi possível observar 75% de resistência ao antibiótico amoxicilina nas cepas de
Fusobacterium nucleatum, diferentente do apresentado por Martinho (25%) o que
também pode ser um resultado preocupante.
Os nossos resultados discordam parcialmente de um estudo realizado por
Montagner et al. (2014) que estudaram a resistência de Prevotella oralis e
Porphyromonas gingivalis aos seguintes agentes antimicrobianos: benzilpenicilina,
amoxicilina e amoxicilina+acido clavulânico utilizando a metodologia do E-test . Todas
as cepas do estudo foram suscetíveis aos agentes antimicrobianos testados. Foi
possível observar em nosso estudo que 50% das cepas de Prevotella oralis (n=2) foi
classificada em um nível intermediário ao ser testada com benzilpenicilina, o que pode
representar um resultado preocupante. No entanto com relação às cepas de
Porphyromonas gingivalis, o nosso estudo corrobora com o realizado por Montagner
e colaboradores. Não foi possível observar nenhum grau de resistência aos
antibióticos testados.
No Brasil, a amoxicilina tem sido rotineiramente prescrita como coadjuvante
para o tratamento de infecções orofaciais em pacientes que não apresentam reações
alérgicas a esse medicamento. Seu uso clínico está relacionado às suas
características de biodisponibilidade, tais como rápida absorção pelo organismo e
manutenção prolongada de níveis séricos, permitindo intervalos de administração
mais longos (Montgomery, 2000).
71
A associação da amoxicilina ao ácido clavulânico foi 100% eficaz contra
todas as cepas testadas, concordando com os achados de Jacinto et al. (2003),
Sousa et al. (2003), Matinho (2007), Montagner et al. (2014). Tal associação foi eficaz
mesmo contra cepas resistentes a amoxicilina, revelando ser um potente agente
antimicrobiano no tratamento de infecções dentoalveolares.
Eritromicina e a clindamicina têm sido prescritas para pacientes alérgicos à
penicilina (Gill e Scully et al., 1990; Sandor et al., 1998). A clindamicina, medicamento
de primeira escolha atualmente na odontologia para pacientes alérgicos as penicilinas,
apresenta efeito bacteriostático, exceto em altas doses, quando se torna bactericida,
apresentando excelente ação contra anaeróbios, inclusive os produtores de beta-
lactamases (Gill e Scully et al., 1990; Sandor et al., 1998). Devido à propensão dos
pacientes em desenvolverem colite associada ao uso da clindamicina, esse
medicamento por sua vez, não tem sido amplamente utilizada nas infecções com
intensidades baixas a moderadas. O uso limitado da clindamicina provavelmente se
dá em função da sua efetividade contra uma gama diversa de microrganismos (Sousa
et al., 2003; Jacinto et al., 2003).
Em nosso estudo foi possível observar resistência a clindamicina em 50%
das cepas de F. nucleatum. No ano de 2003, Sousa e Jacinto et al. verificaram 100%
de suscetibilidade da espécie F. nucleatum a clindamicina. Entretanto Vianna (2006)
relatou percentual de suscetibilidade de 56%, resultado semelhante ao encontrado em
nosso estudo.
A eritromicina apresenta um espectro similar ao das penicilinas G e V,
porém não atinge altas concentrações plasmáticas, além de ser menos efetiva contra
espécies anaeróbias (Moenning et al., 1989). Kuriyama et al. (2000) e Chan e Chan
(2003) relataram um aumento na incidência de resistência à eritromicina. Em nosso
estudo foi possível observar algum grau de resistência a eritromicina nas seguintes
espécies: Prevotella nigrescens, Fusobacterium nucleatum, Prevotella buccae e
prevotella denticola.
Modificações na estrutura química da eritromicina permitiram a síntese da
azitromicina, que apresenta um espectro de ação e meia-vida plasmática ampliados
(Kapusnik-Uner et al., 1996), sendo empregada como alternativa aos lactâmicos na
profilaxia para endocardite bacteriana em pacientes suscetíveis (Montgomery, 2000).
72
O perfil de suscetibilidade dos isolados de canais radiculares e abscessos periapicais
à eritromicina e azitromicina são variáveis. Porphyromonas endodontalis, Prevotella
denticola, Prevotella buccae, Fusobacterium nucleatum e Prevotella nigrescens foram
as espécies que se mostraram resistentes a azitromicina.
A efetiva ação do metronidazol frente a microrganismos anaeróbios tem
sido freqüentemente relatada (Kuriyama et al., 2000; Sousa et al., 2003; Jacinto et
al., 2007; Montagner et al., 2010; Gomes et al., 2011). Em nossas amostras Prevotella
oralis, Prevotella melaninogênica, Fusobacterium nucleatum foi possível observar
resistência ao metronidazol. Como as infecções endodônticas são mistas e abrigam
também microrganismos 162 facultativos, clinicamente o emprego isolado do
metronidazol não se mostra efetivo, necessitando associação com antibióticos β-
lactâmicos (Baumgartner e Xia, 2002; Jacinto et al., 2008).
A benzilpencilina (penicilina G), uma das penicilinas naturais mais
utilizadas, foi eficaz contra 82,75% das cepas analisadas; entretanto, ao considerar
sua via de administração parenteral, esta por sua vez, limita o uso. Desta forma, a
opção pelo medicamento no tratamento de infecções dentoalveolares está indicada
quando uma rápida concentração da mesma é necessária.
Segundo van Winkelhoff et al. (2005) e Hawkey (2008), variações entre os
resultados descritos em diferentes estudos podem estar relacionadas à metodologia
empregada, época de sua realização, localização geográfica ou o número de
amostras estudadas. Apesar do limitado número de cepas analisadas nessa pesquisa,
os resultados demonstram uma diferença nas características de suscetibilidade dos
isolados em amostras de canais radiculares e abscessos periapicais de um mesmo
paciente.
O uso indiscriminado de antibióticos para complementar tratamento
odontológico deve ser evitado por poder levar a sérias consequências, incluindo
reações alérgicas aos medicamentos usados, desenvolvimento de superinfecções
com espécies bacterianas resistentes e exposição desnecessária de pacientes a
certas toxicidades e efeitos colaterais dos medicamentos.
Em resumo, para melhor caracterização da microbiota presente nos canais
radiculares de dentes infectados sintomáticos e dos abscessos correspondentes,
73
assim como da microbiota dos canais radiculares de dentes assintomáticos, faz-se
necessário um maior número de casos. Além disso, seria interessante a utilização do
Next Generation Sequencing para detecção de espécies de difícil detecção, de
espécies não identificadas e de filotipos. Outro fato importante é a necessidade de um
monitoramento contínuo da suscetibilidade destes microrganismos aos antibióticos
mais utilizados na prática odontológica.
74
7 CONCLUSÃO
Baseado nos diversos métodos utilizados neste estudo e nos resultados obtidos
pode-se concluir que:
1. A microbiota dos canais radiculares de infecções primárias sintomáticas e
assintomáticas são polimicrobianas
2. A microbiota presente nos casos sintomáticos é mais complexa que a dos
casos assintomáticos com periododontite apical, com um maior numero de
associações positivas e negativas entre os microrganismos.
3. Os agentes antimicrobianos amoxicilina+acido clavulânico, metronidazol,
amoxicilina e clindamicina foram os que se mostraram mais efetivos, ou seja
apresentaram um maior numero de cepas suscetíveis, para as cepas
bacterianas testadas. A azitromicina foi o antibiótico testado menos efetivo.
75
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87
Apêndice 2 – Tabelas das Bacterias pelo Checkerboard em casos sintomáticos e assintomáticos asociados a abscessos
apicais
Quadro 1. Bactérias identificadas pelo Checkerboard em canais radiculares de dentes com necessidade de intervenção endodôntica, com lesão
periapical e sem sintomatologia
Casos Bacterias – Canais radiculares Total de
especies
1 Actinomyces odontolyticus, Actinomyces oris, Capnocytophaga gingivalis, Dialister pneumosintes, Enterococcus faecium,
Fusobacterium periodonticum, Prevotella nigrescens, Streptococcus oralis, Veillonella parvula 9
2
Actinomyces israelii, Actinomyces odontolyticus, Actinomyces oris, Campylobacter showae, Capnocytophaga gingivalis,
Capnocytophaga sputigena, Dialister pneumosintes, Eikenella corrodens, Enterococcus faecium, Enterococcus hirae,
Eubacterium saburreum, Fusobacterium nucleatum sp nucleatum , Fusobacterium nucleatum sp vincentii , Filifactor alocis,
Fusobacterium periodonticum, Porphyromonas gingivalis, Prevotella intermedia, Prevotella melaninogenica, Prevotella
nigrescens, Streptococcus mitis, Streptococcus mutans, Streptococcus oralis, Treponema socranskii, Veillonella parvula
24
3
Actinomyces israelii, Actinomyces odontolyticus, Actinomyces oris, Campylobacter showae, Campylobater rectus,
Capnocytophaga gingivalis, Capnocytophaga ochracea, Capnocytophaga sputigena, Dialister pneumosintes, Eikenella
corrodens, Enterococcus faecalis, Enterococcus faecium, Enterococcus hirae, Eubacterium saburreum, Fusobacterium
nucleatum sp nucleatum , Fusobacterium nucleatum sp polymorphum , Fusobacterium nucleatum sp vincentii , Filifactor
alocis, Fusobacterium periodonticum, Gemella morbillorum, Parvimonas micra, Porphyromonas endodontalis, Prevotella
intermedia, Prevotella melaninogenica, Prevotella nigrescens, Staphylococcus epidermidis, Streptococcus gordonii,
Streptococcus intermedius, Streptococcus mitis, Streptococcus mutans, Streptococcus oralis, Tannerella forsythia,
Treponema denticola, Veillonella parvula
34
4 Actinomyces israelii, Actinomyces oris, Campylobacter showae, Dialister pneumosintes, Enterococcus faecium,
Enterococcus hirae, Filifactor alocis, Prevotella nigrescens 8
88
5
A actinomycetencomytans, Actinomyces israelii, Actinomyces oris, Campylobacter showae, Capnocytophaga sputigena,
Enterococcus faecium, Enterococcus hirae, Eubacterium nodatum, Fusobacterium nucleatum sp vincentii , Filifactor alocis,
Fusobacterium periodonticum, Gemella morbillorum, Porphyromonas endodontalis, Porphyromonas gingivalis, Prevotella
intermedia, Prevotella nigrescens, Streptococcus mutans, Streptococcus oralis, Treponema socranskii, Veillonella parvula
20
6
A actinomycetencomytans, Actinomyces israelii, Actinomyces odontolyticus, Actinomyces oris, Campylobacter showae,
Campylobater rectus, Capnocytophaga gingivalis, Capnocytophaga ochracea, Capnocytophaga sputigena, Dialister
pneumosintes, Eikenella corrodens, Enterococcus faecalis, Enterococcus faecium, Enterococcus hirae, Eubacterium
nodatum, Eubacterium saburreum, Fusobacterium nucleatum sp nucleatum , Fusobacterium nucleatum sp polymorphum ,
Fusobacterium nucleatum sp vincentii , Filifactor alocis, Fusobacterium periodonticum, Gemella morbillorum, Parvimonas
micra, Porphyromonas endodontalis, Porphyromonas gingivalis, Prevotella intermedia, Prevotella melaninogenica, Prevotella
nigrescens, Staphylococcus epidermidis, Streptococcus gordonii, Streptococcus intermedius, Streptococcus mutans,
Streptococcus oralis, Tannerella forsythia, Treponema denticola, Treponema socranskii, Veillonella parvula
37
7
A actinomycetencomytans, Actinomyces israelii, Actinomyces odontolyticus, Actinomyces oris, Campylobacter showae,
Campylobater rectus, Capnocytophaga gingivalis, Dialister pneumosintes, Eikenella corrodens, Enterococcus faecalis,
Enterococcus faecium, Enterococcus hirae, Eubacterium nodatum, Eubacterium saburreum, Fusobacterium nucleatum sp
polymorphum , Fusobacterium nucleatum sp vincentii , Fusobacterium periodonticum, Gemella morbillorum, Neisseria
mucosa, Parvimonas micra, Porphyromonas endodontalis, Porphyromonas gingivalis, Prevotella nigrescens, Staphylococcus
epidermidis, Streptococcus gordonii, Streptococcus intermedius, Streptococcus oralis, Tannerella forsythia, Treponema
denticola, Treponema socranskii, Veillonella parvula, Capnocytophaga sputigena, Filifactor alocis, Streptococcus mutans,
Prevotella intermedia
35
8
A actinomycetencomytans, Actinomyces israelii, Actinomyces odontolyticus, Actinomyces oris, Campylobacter showae,
Campylobater rectus, Capnocytophaga gingivalis, Capnocytophaga sputigena, Dialister pneumosintes, Eikenella corrodens,
Enterococcus faecalis, Enterococcus faecium, Eubacterium saburreum, Fusobacterium nucleatum sp polymorphum ,
Fusobacterium nucleatum sp vincentii , Filifactor alocis, Fusobacterium periodonticum, Gemella morbillorum, Parvimonas
micra, Porphyromonas endodontalis, Prevotella intermedia, Prevotella nigrescens, Staphylococcus epidermidis,
Streptococcus gordonii, Streptococcus intermedius, Streptococcus mutans, Streptococcus oralis, Tannerella forsythia,
Treponema denticola, Treponema socranskii, Veillonella parvula
31
89
9
A actinomycetencomytans, Actinomyces israelii, Actinomyces odontolyticus, Actinomyces oris, Campylobacter showae,
Campylobater rectus, Capnocytophaga gingivalis, Capnocytophaga ochracea, Capnocytophaga sputigena, Dialister
pneumosintes, Eikenella corrodens, Enterococcus faecalis, Enterococcus faecium, Eubacterium nodatum, Eubacterium
saburreum, Fusobacterium nucleatum sp nucleatum , Fusobacterium nucleatum sp Polymorphum , Fusobacterium
nucleatum sp vincentii , Filifactor alocis, Fusobacterium periodonticum, Gemella morbillorum, Neisseria mucosa, Parvimonas
micra, Porphyromonas endodontalis, Porphyromonas gingivalis, Prevotella intermedia, Prevotella melaninogenica, Prevotella
nigrescens, Staphylococcus epidermidis, Streptococcus gordonii, Streptococcus intermedius, Streptococcus mitis,
Streptococcus mutans, Streptococcus oralis, Tannerella forsythia, Treponema denticola,Treponema socranskii, Veillonella
parvula
38
10
A actinomycetencomytans, Fusobacterium nucleatum sp vincentii , Treponema socranskii, Actinomyces oris, Enterococcus
faecalis, Dialister pneumosintes, Porphyromonas endodontalis, Streptococcus oralis, Capnocytophaga ochracea,
Actinomyces israelii, Treponema denticola, Prevotella nigrescens, Actinomyces odontolyticus, Campylobacter showae,
Fusobacterium periodonticum, Fusobacterium nucleatum sp nucleatum , Capnocytophaga gingivalis, Streptococcus
gordonii, Tannerella forsythia, Staphylococcus epidermidis, Streptococcus mitis, Capnocytophaga sputigena, Filifactor alocis,
Streptococcus mutans, Prevotella intermedia, Veillonella parvula
26
90
Quadro 2. Bactérias identificadas pelo Checkerboard em canais radiculares e abscessos apicais de dentes com necessidade de intervenção
endodôntica com necrose pulpar associado a abscesso apical e sintomatologia dolorosa
Casos Abscesso apical Total de
especies Canal Radicular
Total de
especies
1
A actinomycetencomytans, Actinomyces israelii,
Capnocytophaga ochracea, Capnocytophaga
sputigena, Dialister pneumosintes, Enterococcus
faecalis, Enterococcus hirae, Fusobacterium
nucleatum sp vincentii , Fusobacterium periodonticum,
Leptotrichia buccalis, Neisseria mucosa, Prevotella
intermedia, Prevotella melaninogenica, Prevotella
nigrescens, Staphylococcus epidermidis,
Streptococcus intermedius, Streptococcus mitis,
Streptococcus mutans, Treponema denticola,
Veillonella parvula
20
Actinomyces odontolyticus, Actinomyces oris,
Campylobacter showae, Campylobater rectus,
Capnocytophaga gingivalis, Capnocytophaga
ochracea, Capnocytophaga sputigena, Dialister
pneumosintes, Enterococcus faecium, Enterococcus
hirae, Eubacterium nodatum, Eubacterium
saburreum, Fusobacterium nucleatum sp
polymorphum , Fusobacterium nucleatum sp
vincentii , Fusobacterium nucleatum sp nucleatum ,
Neisseria mucosa, Porphyromonas gingivalis,
Prevotella intermedia, Prevotella nigrescens,
Propionibacterium acnes, Staphylococcus
epidermidis, Streptococcus gordonii, Streptococcus
intermedius, Streptococcus mitis, Streptococcus
mutans, Treponema denticola, Treponema
socranskii, Veillonella parvula
28
91
2
A actinomycetencomytans, Actinomyces israelii,
Actinomyces oris, Campylobacter showae,
Campylobater rectus, Capnocytophaga gingivalis,
Capnocytophaga ochracea, Capnocytophaga
sputigena, Dialister pneumosintes, Eikenella
corrodens, Enterococcus faecalis, Enterococcus hirae,
Eubacterium saburreum, Fusobacterium nucleatum sp
vincentii , Fusobacterium nucleatum sp nucleatum ,
Fusobacterium periodonticum, Gemella morbillorum,
Leptotrichia buccalis, Neisseria mucosa, Parvimonas
micra, Porphyromonas endodontalis, Porphyromonas
gingivalis, Prevotella intermedia, Prevotella
melaninogenica, Prevotella nigrescens,
Propionibacterium acnes, Staphylococcus epidermidis,
Streptococcus gordonii, Streptococcus intermedius,
Streptococcus mitis, Streptococcus mutans,
Streptococcus oralis, Tannerella forsythia, Treponema
denticola, Treponema socranskii, Veillonella parvula
36
A actinomycetencomytans, Actinomyces israelii,
Actinomyces oris, Campylobater rectus,
Capnocytophaga gingivalis, Capnocytophaga
ochracea, Capnocytophaga sputigena, Dialister
pneumosintes, Eikenella corrodens, Enterococcus
hirae, Eubacterium nodatum, Eubacterium
saburreum, Fusobacterium nucleatum sp
polymorphum , Fusobacterium nucleatum sp
vincentii , Fusobacterium nucleatum sp nucleatum ,
Fusobacterium periodonticum, Leptotrichia buccalis,
Neisseria mucosa, Parvimonas micra,
Porphyromonas endodontalis, Prevotella intermedia,
Prevotella nigrescens, Propionibacterium acnes,
Staphylococcus epidermidis, Streptococcus gordonii,
Streptococcus intermedius, Streptococcus mitis,
Streptococcus mutans, Tannerella forsythia,
Treponema denticola, Treponema socranskii,
Veillonella parvula
32
3
Enterococcus hirae, Prevotella nigrescens, Veillonella
parvula
3
Actinomyces oris, Campylobater rectus,
Enterococcus hirae, Eubacterium saburreum,
Fusobacterium nucleatum sp vincentii ,
Fusobacterium nucleatum sp nucleatum , Neisseria
mucosa, Prevotella nigrescens, Propionibacterium
acnes, Streptococcus gordonii, Streptococcus
intermedius, Streptococcus mutans
12
92
4
Actinomyces odontolyticus, Capnocytophaga
gingivalis, Enterococcus faecalis, Enterococcus
faecium, Enterococcus hirae, Eubacterium nodatum,
Fusobacterium nucleatum sp polymorphum ,
Fusobacterium nucleatum sp vincentii , Neisseria
mucosa, Prevotella intermedia, Prevotella
melaninogenica, Prevotella nigrescens, Streptococcus
intermedius, Streptococcus mutans, Treponema
denticola, Treponema socranskii, Veillonella parvula
17
Actinomyces israelii, Actinomyces odontolyticus,
Actinomyces oris, Campylobacter showae,
Capnocytophaga gingivalis, Enterococcus faecium,
Enterococcus hirae, Eubacterium nodatum,
Eubacterium saburreum, Fusobacterium nucleatum
sp polymorphum , Fusobacterium nucleatum sp
vincentii , Leptotrichia buccalis, Neisseria mucosa,
Porphyromonas gingivalis, Prevotella intermedia,
Prevotella nigrescens, Propionibacterium acnes,
Streptococcus gordonii, Streptococcus intermedius,
Streptococcus mutans, Treponema denticola,
Treponema socranskii
22
5
Campylobater rectus, Dialister pneumosintes,
Enterococcus faecium, Enterococcus hirae,
Eubacterium nodatum, Eubacterium saburreum,
Fusobacterium nucleatum sp vincentii , Leptotrichia
buccalis, Parvimonas micra, Porphyromonas
endodontalis, Porphyromonas gingivalis, Prevotella
intermedia, Prevotella melaninogenica, Prevotella
nigrescens, Streptococcus gordonii, Streptococcus
mitis, Streptococcus mutans, Streptococcus oralis,
Treponema denticola, Treponema socranskii,
Veillonella parvula
21 Prevotella melaninogenica, Veillonella parvula
2
93
6
Actinomyces israelii, Actinomyces oris, Campylobater
rectus, Capnocytophaga gingivalis, Dialister
pneumosintes, Enterococcus faecalis, Eubacterium
saburreum, Fusobacterium nucleatum sp nucleatum ,
Neisseria mucosa, Parvimonas micra, Porphyromonas
endodontalis, Prevotella intermedia, Prevotella
melaninogenica, Staphylococcus epidermidis,
Streptococcus gordonii, Streptococcus mutans,
Treponema socranskii, Veillonella parvula
18 Enterococcus faecium, Staphylococcus epidermidis
2
7
A actinomycetencomytans, Actinomyces odontolyticus,
Capnocytophaga gingivalis, Capnocytophaga
sputigena, Dialister pneumosintes, Eikenella
corrodens, Enterococcus faecalis, Enterococcus
faecium, Eubacterium nodatum, Fusobacterium
nucleatum sp vincentii , Leptotrichia buccalis,
Porphyromonas endodontalis, Porphyromonas
gingivalis, Prevotella intermedia, Prevotella
melaninogenica, Staphylococcus epidermidis,
Streptococcus gordonii, Streptococcus mitis,
Streptococcus mutans, Streptococcus oralis,Tannerella
forsythia
21
Capnocytophaga gingivalis, Dialister pneumosintes,
Enterococcus hirae, Porphyromonas endodontalis,
Porphyromonas gingivalis, Prevotella intermedia,
Prevotella melaninogenica, Staphylococcus
epidermidis, Streptococcus oralis
9
94
8
A actinomycetencomytans, Actinomyces israelii,
Actinomyces odontolyticus, Actinomyces oris,
Campylobater rectus, Capnocytophaga gingivalis,
Capnocytophaga ochracea, Capnocytophaga
sputigena, Dialister pneumosintes, Enterococcus
faecalis, Enterococcus faecium, Enterococcus hirae,
Eubacterium nodatum, Fusobacterium nucleatum sp
vincentii , Fusobacterium periodonticum, Leptotrichia
buccalis, Porphyromonas endodontalis,
Porphyromonas gingivalis, Prevotella intermedia,
Prevotella melaninogenica, Prevotella nigrescens,
Propionibacterium acnes, Staphylococcus epidermidis,
Streptococcus gordonii, Streptococcus intermedius,
Streptococcus mitis, Streptococcus mutans,
Streptococcus oralis, Tannerella forsythia, Treponema
denticola, Treponema socranskii, Veillonella parvula
32
Actinomyces israelii, Actinomyces odontolyticus,
Actinomyces oris, Capnocytophaga gingivalis,
Dialister pneumosintes, Enterococcus faecalis,
Enterococcus faecium, Enterococcus hirae,
Parvimonas micra, Porphyromonas endodontalis,
Prevotella melaninogenica, Prevotella nigrescens,
Staphylococcus epidermidis, Streptococcus gordonii,
Streptococcus intermedius, Streptococcus oralis,
Treponema denticola, Treponema socranskii
18
95
9
A actinomycetencomytans, Actinomyces israelii,
Actinomyces odontolyticus, Actinomyces oris,
Campylobacter showae, Campylobater rectus,
Capnocytophaga gingivalis, Capnocytophaga
ochracea, Capnocytophaga sputigena, Dialister
pneumosintes, Enterococcus faecalis, Enterococcus
faecium, Enterococcus hirae, Eubacterium saburreum,
Fusobacterium nucleatum sp vincentii , Fusobacterium
nucleatum sp nucleatum , Fusobacterium
periodonticum, Leptotrichia buccalis, Parvimonas
micra, Porphyromonas endodontalis, Porphyromonas
gingivalis, Prevotella intermedia, Prevotella
melaninogenica, Prevotella nigrescens, Streptococcus
gordonii, Streptococcus intermedius, Streptococcus
mitis, Streptococcus mutans, Streptococcus oralis,
Tannerella forsythia, Treponema denticola, Treponema
socranskii, Veillonella parvula
33
Actinomyces israelii, Actinomyces odontolyticus,
Actinomyces oris, Capnocytophaga gingivalis,
Dialister pneumosintes, Enterococcus faecalis,
Fusobacterium periodonticum, Neisseria mucosa,
Parvimonas micra, Porphyromonas endodontalis,
Streptococcus gordonii, Streptococcus
oralis,Treponema denticola,Treponema socranskii
14
96
10
Actinomyces israelii, Actinomyces odontolyticus,
Actinomyces oris, Campylobacter showae,
Campylobater rectus, Capnocytophaga gingivalis,
Capnocytophaga sputigena, Dialister pneumosintes,
Eikenella corrodens, Enterococcus faecalis,
Enterococcus faecium, Eubacterium nodatum,
Eubacterium saburreum, Fusobacterium nucleatum sp
vincentii , Fusobacterium nucleatum sp nucleatum ,
Fusobacterium periodonticum, Neisseria mucosa,
Parvimonas micra, Porphyromonas endodontalis,
Porphyromonas gingivalis, Prevotella intermedia,
Prevotella melaninogenica, Prevotella nigrescens,
Staphylococcus epidermidis, Streptococcus gordonii,
Streptococcus intermedius, Streptococcus mutans,
Streptococcus oralis, Tannerella forsythia, Treponema
denticola, Treponema socranskii, Veillonella parvula
32
A actinomycetencomytans, Actinomyces israelii,
Actinomyces odontolyticus, Actinomyces oris,
Campylobater rectus, Capnocytophaga gingivalis,
Capnocytophaga ochracea, Dialister pneumosintes,
Enterococcus faecalis, Enterococcus faecium,
Enterococcus hirae, Eubacterium nodatum,
Fusobacterium nucleatum sp vincentii ,
Fusobacterium nucleatum sp nucleatum , Neisseria
mucosa, Parvimonas micra, Porphyromonas
endodontalis, Porphyromonas gingivalis, Prevotella
intermedia, Prevotella melaninogenica, Prevotella
nigrescens, Staphylococcus epidermidis,
Streptococcus gordonii, Streptococcus intermedius,
Streptococcus mitis, Streptococcus mutans,
Streptococcus oralis,Tannerella forsythia, Treponema
denticola, Treponema socranskii, Veillonella parvula
30