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Análise das alterações metabólicas de
Canavalia ensiformis durante germinação e
desenvolvimento pós-germinativo em resposta a
insulina e compostos relacionados
Simone Cayres de Souza
Universidade Estadual do Norte Fluminense Darcy Ribeiro – UENF
Campos dos Goytacazes - RJ
Março - 2010
II
Análise das alterações metabólicas de
Canavalia ensiformis durante germinação e
desenvolvimento pós-germinativo em resposta a
insulina e compostos relacionados
Simone Cayres de Souza
Orientadora: Dra. Antônia Elenir Amâncio Oliveira
Este trabalho foi desenvolvido no Laboratório de Química e Função de Proteínas e
Peptídeos do Centro de Biociências e Biotecnologia (LQFPP/CBB) - UENF, com
financiamento da FAPERJ.
Campos dos Goytacazes - RJ
Março - 2010
Dissertação apresentada ao Centro de
Biociências e Biotecnologia da Universidade
Estadual do Norte Fluminense Darcy Ribeiro,
como parte das exigências para obtenção do
Grau de Mestre em Biociências e Biotecnologia
com ênfase em Biologia Celular.
III
Análise das alterações metabólicas de
Canavalia ensiformis durante germinação e
desenvolvimento pós-germinativo em resposta a
insulina e compostos relacionados
Simone Cayres de Souza
Dissertação apresentada ao Centro de Biociências e Biotecnologia da Universidade
Estadual do Norte Fluminense Darcy Ribeiro, como parte das exigências para obtenção do
Grau de Mestre em Biociências e Biotecnologia com ênfase em Biologia Celular.
Aprovada em 11 de março de 2010
Comissão Examinadora:
_____________________________________________________ Dra. Valdirene Moreira Gomes (LFBM/CBB/UENF)
_____________________________________________________ Dra. Maura Da Cunha (LBCT/CBB/UENF)
________________________________________________
Dr. Marco Antônio Lopes Cruz (UFRJ)
_______________________________________________________________ Orientadora: Dra. Antônia Elenir Amâncio Oliveira (LQFPP/CBB/UENF)
IV
A Deus eterno, imortal, invisível, mas real,
Que “com sabedoria fundou a Terra,
E com inteligência preparou os céus”.
(Provérbios 3:19).
À minha amada família,
Por grande amor e cuidado.
A Felipe R. P. Salim,
Por todo companheirismo e amor.
“Ó profundidade das riquezas, tanto da sabedoria
como da ciência de Deus!
Quão insondáveis são os seus juízos,
e quão inescrutáveis os seus caminhos!
Quem compreendeu a mente do Senhor?
Ou quem foi o seu conselheiro?
Ou quem lhe deu primeiro a Ele, para que lhe seja recompensado?
Porque Dele (Jesus) e por Ele e para Ele são todas as coisas.
Glória, pois, a Ele eternamente. Amém.”
(Romanos 11:33-36)
V
AGRADECIMENTOS
À minha orientadora, professora Elenir por toda amizade e atenção durante a
realização deste trabalho. Por acreditar que eu conseguiria chegar ao fim, apesar de
muitas circunstâncias dizerem que não. Obrigada por todos os ensinamentos
científicos e de vida, por ser um exemplo de orientadora, de ser humano.
Aos professores Dra Valdirene Moreira Gomes, Dra Maura Da Cunha e Dr. Marco
Antônio Lopes Cruz pela participação na banca examinadora.
Em especial à professora Dra Kátia V. Sales Fernandes pela gentileza da revisão
deste trabalho.
Ao Dr. Selwyn York por ter cedido o composto D-pinitol, tão importante para a
realização desse trabalho.
À FAPERJ pelo apoio financeiro.
Aos colegas do grupo Elane, Amanda, Mariana, Tierry, Diego, e Daniel pelo convívio
tão agradável e por todos os ensinamentos compartilhados.
Especialmente a Elane, Amandinha e Mariana, não só por dividirem o ambiente
científico, mas suas vidas. Obrigada pela amizade tão especial de vocês.
Aos colegas do LQFPP Nathália Lima, Lucilene, Nathália Deus, Gustavo, Nádia e
Flávia pela agradável convivência.
Aos funcionários Cristóvão, Rogério e Dona Isabela por contribuírem para o bom
andamento deste trabalho.
Às amigas Juliana Barreto, Antônia, Raquel, Andréia, Eliliane (Lili), Elisângela,
Clarissa, Keity, Caroline, Juliana Sobreira, Barbara, Marianna, Marília e Luciane.
VI
Obrigada pela amizade e companheirismo que nasceram durante estes anos, desde
a graduação. Sentirei muitas saudades.
A todos que participaram de alguma maneira para realização deste trabalho.
VII
ÍNDICE pág.
LISTA DE FIGURAS................................... ............................................................... X
LISTA DE ABREVIATURAS E DEFINIÇÕES ................. ...................................... XIIII
RESUMO ................................................................................................................XIV
ABSTRACT ........................................... ..................................................................XV
1 - INTRODUÇÃO.......................................................................................................1
1.1 - Sementes ........................................................................................................1
1.2 - Germinação e desenvolvimento pós-germinativo............................................1
1.2.1 - Emergência da radícula e o término da germinação.................................4
1.2.2 - Mobilização e degradação de reservas durante a germinação e o
desenvolvimento pós-germinativo........................................................................5
1.2.2.1 - Mobilização de proteínas....................................................................6
1.2.2.2 - Mobilização de polissacarídeos..........................................................7
1.3 - Insulina e suas vias de sinalização .................................................................9
1.3.1 - Compostos relacionados à insulina em plantas ......................................12
1.3.1.1 - Moléculas do tipo insulina.................................................................12
1.3.1.2 - D-pinitol ............................................................................................13
1.3.1.3 - Vanadil sulfato ..................................................................................17
1.4 - Canavalia ensiformis .....................................................................................19
2 - OBJETIVOS...................................... ...................................................................22
2.1 - Objetivo geral ................................................................................................22
2.2 - Objetivos específicos....................................................................................22
3 - MATERIAIS E MÉTODOS............................ .......................................................23
3.1 - Material botânico ...........................................................................................23
3.2 - Experimentos de germinação ........................................................................23
VIII
3.3 - Extração e dosagem de proteínas totais solúveis..........................................24
3.4 - Eletroforese em gel de poliacrilamida na presença de SDS (SDS-PAGE)
................................................................................................................................24
3.5 - Western blotting.............................................................................................25
3.6 - Dosagem de vicilinas e detecção de proteínas MAPK pelo método de ELISA
...............................................................................................................................26
3.7 - Determinação da atividade de proteinases do tipo cisteínicas do tipo papaína
...............................................................................................................................27
3.8 - Determinação da atividade de α-amilases.....................................................28
3.8.1 - Ensaio da atividade de α-amilases pelo método de DNS........................28
3.8.2 - Ensaio da atividade de α-amilases em PAGE-nativo..............................30
3.9 - Dosagem de D-pinitol, sacarose, rafinose e myo-inositol por Cromatografia
Gasosa acoplada a Espectrometria de Massas (CG-MS) .....................................30
3.10 - Análise estastística .....................................................................................31
4 - RESULTADOS ..................................... ...............................................................32
4.1 - Perfil de embebição de sementes de Canavalia ensiformis: Influência de
insulina e compostos relacionados sobre o ganho de massa de cotilédones........32
4.2 - Teores de proteínas totais solúveis de cotilédones: Influência de insulina e
compostos relacionados ........................................................................................34
4.3 - Visualização do perfil protéico por SDS-PAGE e detecção de vicilinas por
Western blotting em cotilédones germinados em ausência e presença de insulina e
compostos relacionados ........................................................................................36
4.4 - Dosagem de proteínas imunorrelacionadas à vicilina em cotilédones
germinados em ausência e presença de insulina e compostos relacionados .......39
4.5 - Perfil de atividade de proteinases cisteínicas em cotilédones germinantes de
C. ensiformis: Influência de insulina e compostos relacionados............................41
IX
4.6 - Perfil de atividade de α-amilases de cotilédones germinantes de
C. ensiformis: Influência de insulina e compostos relacionados ................43
4.7 - Detecção de proteínas imunorrelacionadas à MAP quinase (MAPK) em
cotilédones germinantes de C. ensiformis: Influência de insulina e compostos
relacionados ..........................................................................................................46
4.8 - Dosagem de D-pinitol em cotilédones durante a germinação .......................48
4.9 - Detecção de myo-inositol, sacarose e rafinose em cotilédones durante a
germinação............................................................................................................50
5 - DISCUSSÃO........................................................................................................52
6 - CONCLUSÕES....................................................................................................61
7 - REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS.................... ...............................................63
X
LISTA DE FIGURAS
FIGURA 1
Conversão bioquímica de myo-inositol para D-pinitol................................................15
FIGURA 2
Vias propostas para síntese de ciclitóis, ciclitóis galactosídeos e RFO (α-
galactosídeos de sacarose).......................................................................................16
FIGURA 3
Canavalia ensiformis......................................... ........................................................19
FIGURAS 4A e 4B
Flores e vagem imatura de C. ensiformis .................................................................20
FIGURAS 5A e 5B
Vagem e sementes maduras de C. ensiformis.........................................................21
FIGURAS 6A, 6B e 6C
Teores de massa fresca e seca (gramas) de sementes de C. ensiformis germinadas
na presença de (A) insulina (0,36 µg/mL), (B) D-pinitol (1,44 µg/mL), (C) vanadil
sulfato (1,809 µM) ou em água (experimento controle) em intervalos de 0
(quiescente) a 72 horas de embebição......................................................................33
FIGURAS 7A, 7B e 7C
Concentração de proteínas totais solúveis por mg de tecido (massa seca) de
cotilédones de plântulas de C. ensiformis germinadas na presença de (A) insulina
(0,36 µg/mL), (B) D-pinitol (1,44 µg/mL), (C) vanadil sulfato (1,809 µM) ou água
(controle) por até 72 horas de embebição.................................................................35
FIGURAS 8A e 8B
Perfil protéico, em SDS-PAGE (A), e detecção de vicilinas, por Western blotting (B),
de cotilédones de plântulas de C. ensiformis germinadas na presença de insulina
(0,36 µg/mL), D-pinitol (1,44 µg/mL), vanadil sulfato (1,809 µM) ou água (controle)
por até 30 horas de embebição e semente quiescente ............................................37
XI
FIGURAS 9A e 9B
Perfil protéico, em SDS-PAGE (A), e detecção de vicilinas, por Western blotting (B),
de cotilédones de plântulas de C. ensiformis germinadas na presença de insulina
(0,36 µg/mL), D-pinitol (1,44 µg/mL), vanadil sulfato (1,809 µM) ou água (controle) de
42 por até 66 horas de embebição e semente quiescente .......................................38
FIGURAS 10A, 10B e 10C
Quantificação de proteínas imunorrelacionadas à vicilina por mg de tecido (matéria
seca) de cotilédones de sementes de C. ensiformis germinadas na presença de (A)
insulina (0,36 µg/mL), (B) D-pinitol (1,44 µg/mL), (C) vanadil sulfato (1,809 µM) ou
água (controle) por até 72 horas de embebição e quiescente...................................40
FIGURAS 11A , 11B e 11C
Atividade de proteinases cisteínicas em cotilédones de plântulas de C. ensiformis
germinadas na presença de (A) insulina (0,36 µg/mL), (B) D-pinitol (1,44 µg/mL), (C)
vanadil sulfato (1,809 µM) ou água (controle) por até 72 horas de embebição.........42
FIGURAS 12A , 12B e 12C
Atividade da enzima α-amilase em cotilédones de plântulas de C. ensiformis
germinadas na presença de (A) insulina (0,36 µg/mL), (B) D-pinitol (1,44 µg/mL), (C)
vanadil sulfato (1,809 µM) ou água (controle) por até 72 horas de embebição.........44
FIGURAS 13A e 13B
Atividade da enzima α-amilase em cotilédones de plântulas de C. ensiformis
germinadas na presença de D-pinitol (1,44 µg/mL) durante as primeiras horas de
embebição. (A) Visualização zimográfica das bandas de α-amilase de cotilédones
embebidos por 6 a 24 horas e semente quiescente. (B) Análise da intensidade da
atividade das bandas pelo programa Image J...........................................................45
XII
FIGURAS 14A , 14B e 14C
Quantificação de proteínas imunorrelacionadas à MAPK por mg de tecido (matéria
seca) de cotilédones de sementes de C. ensiformis germinadas na presença de (A)
insulina (0,36 µg/mL), (B) D-pinitol (1,44 µg/mL), (C) vanadil sulfato (1,809 µM) ou
água (controle) por até 72 horas de embebição e quiescente...................................47
FIGURAS 15A e 5B
Quantificação de D-pinitol em cotilédones de sementes de C. ensiformis
quiescentes ou durante a germinação em água ou na presença de D-pinitol (1,44
µg/mL) por 24, 48 e 72 horas. As dosagens foram feitas por cromatografia gasosa
acoplada a espectrômetro de massas (CG-MS) ......................................................49
FIGURAS 16A, 16B e 16C
Detecção de myo-inositol (A), rafinose (B) e sacarose (C) em cotilédones de
sementes de C. ensiformis quiescentes ou durante a germinação em água ou na
presença de D-pinitol (1,44 µg/mL) por 24, 48 e 72 h. As detecções foram feitas por
cromatografia gasosa acoplada a espectrômetro de massas (CG-MS) ...................51
XIII
LISTA DE ABREVIATURAS E DEFINIÇÕES Abs 440 nm Absorbância em comprimento de onda de 440 nm
Abs 492 nm Absorbância em comprimento de onda de 492 nm
Abs 540 nm
CG-MS
Absorbância em comprimento de onda de 540 nm
Cromatografia gasosa acoplada a espectrometria de
massas
DAB Diaminobenzeno
DNS Ácido 3,5-dinitrossalicílico
DTT Ditiotreitol
ELISA Enzime Linked Imuno Assay
EPACE-10 Genótipo de Vigna unguiculata
HCl Ácido Clorídico
H2O2 Peróxido de hidrogênio
IgG
MAPK
MPK4
Imunoglobulina G
Proteína-quinase ativada por mitógenos
Gene que codifica para MAPK4
NaCl Cloreto de Sódio
NaOH Hidróxido de Sódio
OPD Orto-fenil-diamina
PAGE Eletroforese em gel de poliacrilamida
PBS Tampão fosfato salino
SDS Dodecil Sulfato de Sódio
TCA Ácido tricloroacético
TEMED N’Tetrametiletilenodiamina
TRIS
Tris-hidroximetilaminometano
XIV
RESUMO
A insulina é um hormônio peptídico que ativa diversos processos metabólicos
e crescimento celular. Este hormônio e compostos relacionados foram capazes de
influenciar a germinação e o desenvolvimento pós-germinativo de Canavalia
ensiformis. O objetivo desse trabalho foi, com base nas observações, verificar a
hipótese das moléculas insulina, D-pinitol e vanadil sulfato estarem envolvidas na
regulação de vias metabólicas de plantas. Sementes de C. ensiformis foram
germinadas em presença de soluções contendo insulina bovina, D-pinitol, vanadil
sulfato ou água (controle), em estufa incubadora sob ciclos de luz/escuro. Em
intervalos de 6h, até 72h, cotilédones foram separados, liofilizados e macerados. Os
resultados mostraram que cotilédones de C. ensiformis, embebidos por até 72h, não
apresentaram diminuições significativas de proteínas totais ou vicilinas, indicando
que nesse intervalo não houve mobilização dessas moléculas. Os tratamentos com
insulina, D-pinitol e vanadil sulfato acarretaram um aumento nas concentrações de
proteínas totais solúveis. A atividade de proteinases cisteínicas foi detectada em
sementes quiescentes e aumentou com a embebição durante a germinação, e os
tratamentos com insulina e D-pinitol promoveram aumentos nessa atividade. A
atividade da enzima α-amilase em cotilédones de C. ensiformis aumentou nas
primeiras horas de embebição e se manteve constante até 72h, e foi elevada em
cotilédones tratados com D-pinitol em quase todos os intervalos de tempo
estudados. Proteínas imunorrelacionadas a MAPK foram detectadas nos
cotilédones, e seus níveis foram diminuídos pelos tratamentos com insulina, D-pinitol
e vanadil sulfato. D-pinitol endógeno foi detectado em todas as amostras, e seus
níveis aumentaram em cotilédones embebidos por 48 e 72h. Os níveis de myo-
inositol foram maiores em cotilédones embebidos com D-pinitol por 24 e 48h. As
concentrações de rafinose diminuíram significativamente ao longo da germinação. O
tratamento com D-pinitol promoveu um aumento de rafinose nos cotilédones após
48h de embebição, porém as concentrações de sacarose não variaram
significativamente durante a germinação e nem entre os tratamentos. Esses dados
sugerem que insulina e compostos relacionados interferem no desenvolvimento de
plântulas de Canavalia ensiformis.
XV
ABSTRACT
Insulin is a peptide hormone that activates several metabolic processes and
cell growth. This hormone and related compounds were able to influence the
germination and the post-germination of Canavalia ensiformis. The objective of this
study, based on such observations, was to verify the hypothesis of the possible
involvement of the molecules insulin, D-pinitol and vanadyl sulfate in the regulation of
metabolic pathways of plants. Seeds of C. ensiformis were germinated in the
presence of solutions containing bovine insulin, D-pinitol, vanadyl sulfate or water
(control), inside a germination chamber under a light / dark photoperiod. At every 6
hours, during 72 hours, cotyledons were separated, dried and ground. The results
showed that cotyledons of C. ensiformis, imbibed for up to 72h did not show
significant decreases in the amounts of total proteins and vicilins, indicating that
during this interval there was no mobilization of such molecules. Treatments with
insulin, D-pinitol and vanadyl sulfate led to an increase in the concentrations of total
soluble proteins. The activity of cysteine proteinases was detected in quiescent
seeds and it increased with imbibition time, and treatments with insulin and D-pinitol
promoted increases in these activities. The activity of the α-amylase enzyme in
cotyledons of C. ensiformis increased after the first hours of imbibition, remained
constant until 72 hours, and was enlarged in cotyledons treated with D-pinitol in
almost all studied time intervals. Immunorelated MAPK proteins were detected in the
cotyledons, and their levels were decreased by treatment with insulin, D-pinitol and
vanadyl sulfate. D-pinitol endogenous was detected in all samples, and its level
increased in cotyledons imbibed for 48 and 72h. The amounts of myo-inositol were
higher in cotyledons imbibed with D-pinitol for 24 and 48h. Raffinose concentrations
decreased significantly during germination. Treatment with D-pinitol promoted an
increase in raffinose in the cotyledons after 48 hours of soaking, but the
concentrations of sucrose did not vary significantly during germination and not
between treatments. These data suggest that insulin and related compounds
interfere with the development of Canavalia ensiformis seedlings.
Introdução
Souza, S. C. (2010) 1
1 - INTRODUÇÃO
1.1 - Sementes
A semente é um dos órgãos reprodutores das plantas responsável pela
perpetuação da espécie e carrega por isso toda a informação genética necessária
para a formação de um novo indivíduo. Um dos principais fatores para o sucesso das
sementes no ambiente, é a presença de reservas nutritivas (para a maioria das
sementes), as quais são responsáveis por sustentarem uma planta jovem (plântula)
nos seus primeiros estágios de desenvolvimento, até que esta seja capaz de tornar-
se auto-sustentável, utilizando a luz solar para realização da fotossíntese (Bewley,
1997).
As sementes são formadas basicamente por três tecidos: o eixo embrionário, o
tegumento e o tecido de reserva. O eixo embrionário ou tecido meristemático
promove o desenvolvimento dos eixos no sentido da raiz e do caule. O tegumento,
comumente chamado de testa, corresponde ao tecido de revestimento cuja função
primordial é a de proteger o embrião em relação ao seu ambiente externo. E o tecido
de reserva, que pode ser representado pelo endosperma, pelo (s) cotilédone (s) e
em alguns casos pelo perisperma, é caracterizado por ser especialmente rico em
três grupos de macromoléculas: proteínas, lipídeos e carboidratos (citado em
Oliveira, 2001).
O conhecimento da composição química das sementes é relevante por vários
motivos, dentre os quais podemos citar a importância nutricional para animais e
humanos e como matéria-prima para a farmacologia e medicina (Carvalho &
Nakagawa, 2000). Porém, enquanto muitas espécies de sementes são
extensivamente estudadas dadas à importância de suas reservas, outras o são para
aumentar o conhecimento da fisiologia de sua germinação e desenvolvimento
(Ferreira & Borghetti, 2004).
1.2 - Germinação e desenvolvimento pós-germinativo de plântulas
Embora muito do interesse humano por sementes esteja associado, do ponto
de vista nutricional, à sua composição, a finalidade biológica de uma semente é
germinar e estabelecer uma nova planta (Ferreira & Borghetti, 2004).
Introdução
Souza, S. C. (2010) 2
A germinação das sementes começa com a captação de água por embebição
pela semente quiescente, seguida pela expansão do embrião. A captação de água é
trifásica com uma absorção rápida inicial (fase I, ou seja, embebição) seguido por
uma fase de estabilização (fase II). Um novo aumento na absorção de água (fase III)
ocorre quando o eixo do embrião alonga e rompe as camadas do tegumento para
completar a germinação. O alongamento celular é necessário e é geralmente aceito
como suficiente para o elongamento da radícula (germinação visível) (revisado por
Holdsworth et al., 2008).
Em 1997, Bewley resumiu o que ocorre após a embebição: a semente
quiescente rapidamente reassume seu metabolismo, e isto se deve ao fato das
estruturas e enzimas necessárias para essa retomada inicial de atividade já estarem
presentes dentro da semente, exceto os polissomos. No início do processo de
embebição o número de ribossomos livres diminui, pois eles passam a formar
complexos sintetizadores de proteínas, os polissomos, antes ausentes. A síntese
protéica inicial depende então de ribossomos pré-existentes. À medida que ocorre a
embebição e as células da semente tornam-se hidratadas, novos ribossomos são
sintetizados e usados para formar os polissomos, que por sua vez, passam a ser
responsáveis pela síntese protéica.
A retomada da atividade respiratória é um dos primeiros eventos após a
embebição, podendo ser detectada em poucos minutos, posteriormente inicia-se um
declínio nessa atividade até que a radícula penetre nas estruturas ao redor, quando
ocorre um novo aumento da atividade respiratória (Botha et al., 1992). A ativação da
via glicolítica, da via das pentoses fosfato, bem como a ativação das enzimas do
ciclo de Krebs ocorrem na primeira fase de absorção de água (Nicolas & Aldasoro,
1979; Salon et al., 1988). As mitocôndrias das células do embrião de sementes
quiescentes, embora sejam pobremente diferenciadas em conseqüência da
maturação e secagem, possuem enzimas do ciclo de Krebs e oxidases que
providenciam uma quantidade de ATP suficiente para sustentar o metabolismo por
várias horas após o início da embebição (Attucci et al., 1991).
O controle da germinação é um processo-modelo, chave para a compreensão
da integração da sinalização ambiental em plantas. Moléculas sinalizadoras
clássicas como auxinas, citocininas, giberelinas, ácido abscísico e, mais
recentemente brassinosteróides, têm sido amplamente estudadas no âmbito do seu
papel nos processos morfogenéticos vegetais. Nos últimos anos, tornou-se claro que
Introdução
Souza, S. C. (2010) 3
existem novas moléculas sinalizadoras, como N-aciletianolamidas, alcamidas,
glutamato e óxido nítrico, que podem desempenhar um papel importante na
regulação de processos de desenvolvimento, que vão desde a germinação das
sementes à modificação da arquitetura vegetal (revisado por López-Bucio et al.,
2006).
Outros estudos apresentaram uma visão integrada da evolução, genética
molecular, fisiologia, bioquímica, ecologia e modelagem de mecanismos de
dormência das sementes e controle da germinação. A dormência da semente é uma
propriedade inata da semente que define as condições ambientais em que a
semente é capaz de germinar. É determinada pela genética com uma influência
ambiental substancial que é mediada, pelo menos em parte, pelos fitormônios ácido
abscísico (ABA) e giberelina (GA) (revisado por Finch-Savage & Leubner-Metzger,
2006). Mais recentemente um modelo tem sido descrito para algumas conhecidas
características do equilíbrio hormonal. A particularidade central desse modelo é que
existe um complexo protéico heterodimérico que promove a germinação, e que a
abundância de um dos monômeros é influenciada por ABA e do outro por GA. Esse
complexo também regula o metabolismo de GA e ABA nas sementes, e isso cria um
“feedback” necessário para estabilizar os estados de dormência e germinação. Os
fatores mais importantes conhecidos por acionarem a sinalização em plantas
compreendem a qualidade da luz (sentida principalmente pelos fitocromos),
temperatura, disponibilidade de nutrientes e secagem pós-amadurecimento. Pós-
amadurecimento é o processo através do qual a dormência é perdida através do
aumento da duração de armazenamento de sementes em um estado de baixa
hidratação, através de um mecanismo que permanece ainda desconhecido. É
essencialmente uma resposta à desidratação que promove a germinação, logo que a
água esteja disponível (revisado por Penfield & King, 2009).
Vários estudos já evidenciaram a influência das condições ambientais nos
processos de dormência e germinação. Estes mostraram que o nitrato exógeno pode
afetar a exigência da luz para promover a germinação das sementes de Arabidopsis
thaliana, e que o nível inicial de dormência destas sementes é influenciado pelo
regime alimentar de nitrato da planta-mãe. Portanto, o nitrato afeta os requisitos para
a germinação e pode-se dizer que afeta diretamente a dormência em vez de apenas
promover a germinação. É amplamente aceito, também, que a temperatura regula
ambos, dormência e germinação e que a luz regula a germinação; no entanto, é uma
Introdução
Souza, S. C. (2010) 4
questão em discussão se a luz é também um regulador de dormência. A luz tem sido
considerada tanto por estimular a germinação como por quebrar a dormência
(revisado por Finch-Savage & Leubner-Metzger, 2006).
Estudos da expressão do genoma de sementes de A. thaliana também
forneceram informações importantes sobre novos mecanismos que controlam a
germinação e sugeriram novos caminhos para explorar. Há evidências de que as
alterações fisiológicas observadas durante a dormência e germinação são
submetidas a controle transcricional e pós-transcricional. Esses níveis de controle
são temporalmente coordenados e distribuídos a partir da maturação das sementes
através da dormência para a germinação. Parece que o controle em ambos os níveis
é essencial para a adaptação das sementes ao seu ambiente. Mudanças no
transcriptoma após a embebição pelas sementes sugeriram uma relação dinâmica
entre RNAs 'armazenados' nas sementes quiescentes, e síntese de novos RNAs
relacionados com estados de pós-embebição, germinação ou dormência de
sementes. Essas recentes abordagens pós-genômica sugerem que a tradução ou
pós-tradução do RNA são os principais níveis de controle para a realização da
germinação e que as mudanças no transcriptoma podem refletir alteração no status
de dormência ou aperfeiçoamento do vigor da germinação e efeitos sobre funções
pós-germinativas que se relacionam com o crescimento das plântulas (revisado de
Holdsworth et al., 2008).
1.2.1 - Emergência da radícula e o término da germi nação
A emergência e a extensão da radícula através das estruturas ao redor do
eixo embrião é o evento que caracteriza o término da germinação e marca o início do
desenvolvimento pós-germinativo, sendo que esta extensão pode ou não ser
acompanhada por divisões celulares (Osborne & Boubriak, 1994; Bewley, 1997).
Três possíveis mecanismos podem estar envolvidos no elongamento e no
crescimento da radícula. O primeiro deles está ligado aos eventos tardios da
germinação, e consiste no aumento do potencial osmótico das células radiculares
devido à acumulação de solutos, talvez como resultado da hidrólise de reservas
poliméricas presentes dentro das próprias células da radícula. A subsequente
diminuição do potencial osmótico leva ao aumento da tomada de água o que resulta
no aumento do turgor, levando a extensão celular. No entanto, não há evidências
Introdução
Souza, S. C. (2010) 5
consistentes para esta mudança no potencial osmótico durante a germinação. O
segundo mecanismo relaciona-se à flexibilidade da parede celular da radícula que
permite o seu crescimento, resultando no prolongamento da radícula. O
afrouxamento da parede celular pode ser resultado da clivagem e rearranjo de
moléculas de xiloglucanas, que são moléculas que mantêm microfibrilas de celulose
adjacentes ligadas, não permitindo sua separação, e com isso, a não expansão das
células da radícula. A enzima xiloglucano endotransglicosilase (XET) pode ser
responsável pelo afrouxamento da parede celular, pois é capaz de reverter a
clivagem de moléculas de xiloglucanas. O terceiro mecanismo baseia-se no
enfraquecimento dos tecidos da extremidade ao redor da radícula. A redução da
resistência destes tecidos é necessária para o término da germinação, e
provavelmente ocorre devido à ação de enzimas da parede celular, como hidrolases
(Bewley, 1997).
1.2.2 - Mobilização e degradação de reservas durant e a germinação e o
desenvolvimento pós-germinativo
Em sementes de leguminosas, a mais abundante reserva energética é
constituída de proteínas. A principal fase de mobilização das reservas das sementes
se inicia após o alongamento e emissão da radícula, sendo, portanto um evento pós-
germinativo. No entanto, a degradação dessas reservas se inicia nas primeiras horas
de embebição, antes da germinação estar completa (revisado por Lehmann &
Ratajczak, 2008). Concomitante com a degradação das reservas insolúveis de alto
peso molecular, ocorre a sua conversão a formas solúveis, que são rapidamente
transportadas aos tecidos em crescimento e utilizadas para diferentes propósitos,
tais como a geração de energia e a produção de matérias primas (proteínas, ácido
nucléicos, carboidratos e lipídeos) para a construção de novos tecidos e células
(Mayer & Poljakoff-Mayber, 1985, apud Dantas 2002). As modificações metabólicas
que ocorrem nesses estágios são resultados da atividade de várias enzimas (Bewley
& Black, 1994). Segundo Mayer & Poljakoff-Mayber (1985; apud Dantas, 2002), as
enzimas de degradação de reservas podem ou não estar presentes nas sementes
quiescentes. As enzimas pré-existentes são detectadas em baixa atividade nessas
sementes e, durante a embebição da semente, são ativadas e secretadas para as
células onde ocorrerá a degradação das reservas. Por outro lado, ainda durante a
Introdução
Souza, S. C. (2010) 6
embebição, acredita-se que seja induzida a síntese de novo de enzimas que não são
detectadas nas sementes quiescentes, a partir dos aminoácidos disponíveis (Varner
et al., 1965, apud Dantas, 2002).
1.2.2.1 - Mobilização de proteínas
As sementes das plantas superiores acumulam grandes quantidades de
proteínas de reserva durante o desenvolvimento e maturação, que são mobilizadas
para fornecer matéria-prima e energia necessárias para a germinação e crescimento
das plântulas. Em sementes de leguminosas, aminoácidos liberados durante a
mobilização de proteínas de reserva são parcialmente utilizados para a síntese de
proteínas no desenvolvimento do eixo (revisado por Bewley & Black, 1994; Lehmann
& Ratajczak, 2008). A maior parte das reservas protéicas em sementes consiste em
proteínas de reserva específicas (Shewry & Casey, 1999, apud Müntz et al., 2001),
como as globulinas, que predominam nas sementes de dicotiledôneas, ou as
prolaminas que são as principais proteínas de armazenamento em cereais. Há dois
tipos de globulinas nas sementes: as vicilinas e as leguminas com coeficientes de
sedimentação em ultracentrifugação de 7S e 11S, respectivamente (Miége, 1982).
As vicilinas (globulinas 7S) formam uma classe bem conhecida de proteínas de
reserva de sementes, e em feijão-de-corda constituem a maior parte das proteínas
presentes (Carasco et al., 1978; Khan et al., 1980). São moléculas oligoméricas,
classificadas como globulinas 7S de acordo com seu grau de sedimentação (Shutov
et al., 1995), apresentam uma composição de aminoácidos com altas concentrações
de ácido aspártico, ácido glutâmico, arginina, fenilalanina e leucina (Carasco et al.,
1978; Macedo et al, 1995). As vicilinas são solúveis em soluções salinas (Fernandes
& Xavier-Filho, 1998), não apresentam ligação dissulfeto em suas cadeias
polipeptídicas, apresentam grande heterogeneidade (Sales et al., 2000), massa
molecular em torno de 150 kDa e se agregam para formar trímeros de subunidades
com massas moleculares variando entre 45-70 kDa (Fernandes & Xavier-Filho,
1998). Estas proteínas de reserva parecem ser multifuncionais, atuando como uma
fonte de aminoácidos durante a germinação da planta e ao mesmo tempo podendo
participar dos mecanismos de defesa das sementes, sendo tóxicas a insetos e a
fungos fitopatogênicos (Shutov et al., 1995; Gomes et al., 1997; Sales et al., 2000).
O acúmulo de proteínas de reserva inicia-se durante os períodos medianos e tardios
Introdução
Souza, S. C. (2010) 7
dos estágios de maturação, quando o preenchimento da semente é responsável pelo
declínio dos níveis de nitrogênio da planta mãe (Müntz et al., 2001). Essas reservas
são depositadas em compartimentos membranosos denominados corpos protéicos
(CP), que são originados ou diretamente do retículo endoplasmático, como ocorre
em milho, ou de vacúolos armazenadores de proteínas, como ocorre na maioria das
espécies (Müntz, 1998). Durante esse período de deposição, a degradação e a
renovação protéicas são insignificantes, indicando que as proteínas estão protegidas
contra o ataque proteolítico prematuro (Madison et al., 1981). Proteínas são
armazenadas para posterior mobilização não só em tecidos de reserva específicos
como cotilédones e endosperma, mas também no eixo embrionário (Tiedemann et
al., 2000). A mobilização protéica nesses tecidos não é iniciada em todas as regiões
simultaneamente, pequenas quantidades dessas proteínas armazenadas são
mobilizadas em regiões limitadas durante a germinação (Smith, 1981 apud Müntz et
al., 2001).
Mudanças celulares que precedem e acompanham a proteólise têm sido
estudadas nos cotilédones de Vigna radiata, onde a principal proteína de reserva é a
vicilina, compreendendo mais de 70-80% do total, sendo a enzima responsável por
sua hidrólise uma endopeptidase cisteínica. O retículo endoplasmático (RE) é o sítio
de síntese desta enzima, e associado com esta síntese, o RE passa por várias
modificações. Cotilédones secos e recém embebidos contêm RE tubular, que é
desestruturado cerca de 12 a 14 horas após começar a embebição (Bewley & Black,
1994). Harris & Chrispeels (1975) demonstraram a atividade de uma endopeptidase
cisteínica nos cotilédones em germinação de sementes de Vigna radiata e em um
recente trabalho, Wang et al. (2007) relataram a síntese de novo de enzimas
hidrolíticas na mobilização protéica durante a germinação dessas sementes.
Para muitas sementes, a principal classe de globulinas degradadas é a das
vicilinas (globulinas 7S). Essa mobilização é provavelmente mediada por um
diferente complexo de proteinases cisteínicas (CPRs). Já foi anteriomente mostrado
que para sementes de Vicia sativa L., proteinases cisteínas do tipo papaína são as
principais responsáveis pela mobilização de proteínas do tipo globulinas (Schlereth
et al., 2000). Proteinases cisteínicas também foram identificadas em sementes de
Phaseolus vulgaris L. como responsáveis pela degradação das proteínas de reserva
do tipo globulinas 7S presentes no eixo embrionário e nos cotilédones dessas
sementes (Tiedemann et al., 2000).
Introdução
Souza, S. C. (2010) 8
1.2.2.2 - Mobilização de polissacarídeos
O amido é um glucano insolúvel composto de dois polímeros de glicose,
amilose e amilopectina. Como principal carboidrato de armazenamento, o amido
desempenha importante papel durante o ciclo de vida da planta. Em plantas
superiores, o amido é sintetizado nos plastídeos em ambas células fotossintética e
não fotossintética. Nos órgãos não fotossintéticos (por exemplo, caules, raízes,
tubérculos e sementes), a sacarose pode ser convertida em amido para
armazenamento a longo prazo, muitas vezes em níveis elevados, em plastídeos
especializados denominados amiloplastos. Este amido de armazenamento é
remobilizado para manter as fases de crescimento, como no estabelecimento das
plântulas após a germinação ou localmente, para atender a alta demanda de
carbono para processos específicos, como na secreção de néctar (revisado por
Zeeman et al., 2010).
Como o carboidrato de reserva mais abundante produzido em plantas, o
amido é considerado a mais importante fonte de energia na dieta humana (Tetlow,
2006). Como principal reserva polissacarídica de sementes, contribui, por exemplo,
com cerca de 60% da massa de algumas espécies sul-americanas de Araucária
(Cardemil & Varner, 1984). Em razão disso, sua mobilização tem sido avaliada em
diversas sementes, principalmente em cereais, onde o endosperma é composto por
dois tecidos distintos: o endosperma, principal tecido de reserva, constituído por
amido, e ao seu redor a camada de aleurona (Morrison et al., 1978 apud Mrva et al.,
2006). Destes, somente a camada de aleurona permanece no grão maduro
(Bradbury et al., 1956 apud Mrva et al., 2006).
A degradação enzimática do amido em plantas superiores é devida
principalmente à ação de fosforilases e amilases. As amilases têm sido
extensivamente estudadas e desde 1976 elas são descritas como responsáveis pela
decomposição química das reservas de polissacarídeos, particularmente em
sementes de lentilha (Tárrago & Nicolas, 1976). Após 40 anos desse relato já se
sabia que durante o processo germinativo, ou em resposta à giberelina (GA)
exógena, as enzimas do tipo α-amilase, principalmente, são sintetizadas e
secretadas para participarem da mobilização do amido presente no endosperma do
trigo (Mrva et al., 2006).
Introdução
Souza, S. C. (2010) 9
Estudos bioquímicos mais recentes estabeleceram a presença das enzimas α-
amilase (α-1,4-glucano glucanohidrolase; EC: 3.2.1.1), β-amilase (α-1,4-glucano
maltohidrolase; EC: 3.2.1.2), enzima desramificadora do amido (EC: 3.2.1.41) e α-
glucosidase (maltase; EC: 3.2.1.3) na degradação do amido no endosperma de
sementes. No entanto, relativamente pouco é conhecido sobre a importância de
cada uma dessas enzimas no processo de degradação. É geralmente aceito que a
α-amilase desempenha um papel central na degradação do amido do endosperma,
onde, após a germinação, há uma síntese maciça no aleurona e escutelo, seguido
por sua secreção no endosperma (revisado por Zeeman et al., 2010).
Para que o amido de reserva seja degradado e passível de utilização pelo
metabolismo, é necessário que os grânulos de amido sejam desmembrados em
estruturas menores, como a maltose e a glicose. Nesse processo, destacam-se as
enzimas α-amilase, β-amilase e amido fosforilase. Destas, somente a α-amilase é
capaz de atacar diretamente os grânulos de amido, o que a caracteriza como a
primeira enzima no processo de degradação do amido. A α-amilase é uma
endoenzima que hidrolisa aleatoriamente as ligações α-(1,4), ao longo dos polímeros
de amilose e amilopectina, liberando maltose e moléculas maiores contendo ligações
α-(1,6), as dextrinas. A β-amilase é uma exoglucanase que ataca somente os
terminais não-redutores dos constituintes do amido, liberando moléculas de maltose.
São capazes de hidrolisar completamente os polímeros ou fragmentos de amilose
(Ferreira & Borghetti, 2004). Foi visto, em sementes de ervilhas, que a partir da
quebra dessas ligações α-1,4, há liberação das unidades de glicose que serão
requeridas durante o processo germinativo (Zhu et al., 1998). Foi descrito ainda que
alguns cultivares de cevada originários do Tibet com quase completa ausência de β-
amilase no endosperma, apresentavam plântulas com crescimeto normal, apesar da
hidrólise das cadeias lineares ser catalisada primeiramente por essas enzimas. Além
do mais, maltose e oligossacarídeos curtos produzidos no endosperma são
degradadas a partir da glicose por α-glucosidase (maltase) e há evidências de que a
α-glucosidase também pode agir sinergicamente com a α-amilase na remoção da
glicose diretamente da superfície dos grânulos (revisado por Zeeman et al., 2010).
Introdução
Souza, S. C. (2010) 10
1.3 - Insulina e suas vias de sinalização
A insulina foi descoberta em 1921 por Frederick Banting e colaboradores
(Banting et al., 1922), como uma proteína secretada pelas ilhotas de Langerhans no
pâncreas, que restaurava a glicemia para níveis normais quando administrada a
cães pancreatectomizados. Este peptídeo de massa molecular de 5.700 Da formado
por duas cadeias (cadeias α e β com 21 e 30 resíduos de aminoácidos,
respectivamente) unidas entre si por duas pontes dissulfetos.
Em animais, a insulina exerce múltiplas ações sobre o metabolismo e
crescimento celular, que se iniciam sempre pela ligação da insulina com receptores
situados na membrana plasmática (Guyton & Hall, 2002). De maneira geral, a
insulina estimula processos endergônicos de síntese e armazenamento de reservas
energéticas isto é, promove a síntese de glicogênio, lipídeos e proteínas, possuindo
sua ação principalmente nos músculos, no tecido adiposo e no fígado (Sperelakis,
1994; Aires, 1999). A insulina partilha com os chamados fatores de crescimento
(IGF-I e II, dentre outros) a capacidade de aumentar a síntese de mRNA e a síntese
protéica, estimulando assim o crescimento celular (Guyton & Hall, 2002).
Todas as ações da insulina se iniciam pela sua ligação a um receptor
específico. O receptor da insulina humana, um receptor do tipo quinase, é uma
glicoproteína com quatro subunidades. Duas subunidades α idênticas (135 kDa) são
voltadas para o exterior da membrana, onde se localizam os sítios de
reconhecimento e ligação da insulina. Duas subunidades β (95 kDa) são de
localização trans-membranar, e parecem ser responsáveis pela transcrição dos
sinais que irão desencadear as ações hormonais. Uma conseqüência imediata da
formação do complexo entre a insulina e o receptor, que se comporta como uma
auto quinase tirosina específica, é a autofosforilação de resíduos de tirosina das
subunidades β. Esse parece ser o evento inicial que desencadeia as ações do
hormônio (Sperelakis, 1994).
Após a fosforilação do receptor de insulina, uma série de proteínas chamadas
substratos do receptor de insulina (IRS) também são fosforiladas e acredita-se que
essas fosforilações ativem diretamente a fosfoinositol quinase (PI3K) disparando a
produção de fosfoinositol tri-fosfatos (PI 3,4,5P3), os quais agem como segundos
mensageiros. Os PI (3,4,5) P3 funcionam ativando direta ou indiretamente enzimas
da classe das fosfoquinases (PKs) e proteíno-quinase dependente de
Introdução
Souza, S. C. (2010) 11
fosfatidilinositol (PDK). A ativação da fosfoquinase C (PKC) leva a um aumento da
captação de glicose pelas células por aumentar o número de transportadores GLUT4
ancorados nas membranas celulares. A PDK, por sua vez, ativa a fosfoquinase D
(PKD) também chamada de AKT que leva à regulação clássica do metabolismo
energético em direção ao aumento da síntese do glicogênio, proteínas e lipídeos
(revisado por Vanhaesebroeck & Alessi, 2000).
Outras duas grandes vias de sinalização desencadeadas por insulina e fatores
de crescimento como IGFs I e II também já são bem estudadas em animais. Na via
de ativação da PDK (AKT) ocorre o disparo da via TOR “Target Of Rapamycin” que
atua na regulação do crescimento celular devido a ativação do sistema traducional. A
ativação da via TOR inicia-se pela ligação da TOR-quinase a RAPTOR “Regulatory
Associated Protein of TOR” e é a formação desse complexo que é inibida pelo
antibiótico rapamicina. O próximo passo da via TOR é a ativação da proteína
ribossomal quinase S6 (S6K) que age ativando posteriomente a proteína ribossomal
S6, enzima chave na regulação da síntese protéica (revisado por Wang & Proud,
2006).
A via da MAP-quinase/MAPK (proteína-quinase ativada por mitógenos)
também tem sido estudada como alvo da insulina. Essa via é uma cascata linear que
envolve três proteínas quinases atuando consecutivamente em reações de
fosforilação. O último componente nesta série é MAP quinase (MAPK). Esta é
ativada pela fosforilação de resíduos de treonina e tirosina pela MAP quinase
quinase (MAPK quinase ou MAPKK ou MAP2K) que por sua vez é regulada pela
fosforilação de dois resíduos serina/treonina pela MAP quinase quinase quinase
(MAPKKK) (revisado por Pearson et al., 2001). Estas três quinases estão
funcionalmente ligadas (Samaj et al., 2004) e exercem um papel fundamental nos
mecanismos de transdução de sinal de muitos organismos eucarióticos diferentes,
incluindo leveduras, Dictyostelium, Drosofila, Caenorhabditis, e mamíferos. De fato, a
importância e complexidade destas vias de sinalização são mais bem estudadas em
leveduras e mamíferos (Schwartz & Madhani, 2004; Bardwell, 2005; Ikner &
Shinozaki, 2005). O sucesso da proliferação celular depende do bom funcionamento
das vias TOR e da MAPK.
Em plantas, diversas quinases têm sido identificadas e classificadas em
diferentes grupos, sendo que uma das maiores e mais importantes categorias é a
MAPK. Várias descobertas sobre as vias MAPK em plantas refletem a importância e
Introdução
Souza, S. C. (2010) 12
complexidade dos mecanismos de sinalização vegetal (Tena et al., 2001; Nakagami
et al., 2005).
Genes que codificam para as MAPKs foram identificados em Arabidopsis
thaliana (Asai et al., 2002) e três genes para MAPKs também foram identificadas em
arroz (OsMAPKs) (Yeh et al., 2007). Genes para MAPK fosfatases-MKPs
(reguladores negativos da MAPK) foram reportados em tabaco (NtMKP1), arroz
(OsMKP1) e Arabidopsis thaliana (AtMKP1) (Yamakawa et al., 2004; Lee et al.,
2008).
As MAPKs atualmente representam a mais abundante família de quinases
serina-treonina de plantas superiores. Os componentes da cascata MAPK estão
envolvidos em uma grande variedade de funções nas vias de transdução de sinais
em plantas tais como osmorregulação, sinalização hormonal incluindo proliferação
celular auxina-induzida ou processos etileno-responsivos, biossíntese da parede
celular, e crescimento e diferenciação celulares. É descrita a participação de MAPK
na divisão celular, na sinalização via hormônios auxina, ácido abscísico, ácido
giberélico, etileno e citocinina e também em respostas a estresses abióticos e
bióticos (revisado por Mishra et al., 2006).
1.3.1 - Compostos relacionados à insulina em planta s
1.3.1.1 - Moléculas do tipo insulina
Em plantas, a presença de insulina ainda não é amplamente aceita pela
sociedade cientifica, considerando que plantas realizam o transporte de sacarose e
não de glicose (Xavier-Filho et al., 2003). Porém, estudos de compostos vegetais
relacionados à insulina datam de quase 100 anos atrás. Pesquisadores envolvidos
na descoberta de insulina animal em 1921 (Banting et al., 1922), foram os primeiros
a indicar a presença de moléculas do tipo insulina em plantas. Trabalho realizado por
Collip (1923), estudando o efeito de extratos vegetais (folhas de cebola, cevada,
alface, trigo e feijão verde; raízes de cebola e cevada e caules de feijão verde) sobre
a glicemia em coelhos normais e cães sem pâncreas, observou que todos os
extratos promoviam a redução dos níveis de glicose do sangue de ambos os grupos
de animais. Outro pesquisador envolvido com a descoberta de insulina animal, Best,
observou que os níveis de glicose do sangue de cães diabéticos retornavam a níveis
Introdução
Souza, S. C. (2010) 13
normais após tratamento com extratos de beterraba (Best, 1924). Apesar da grande
importância dessas observações, os compostos presentes nesses extratos vegetais
não foram isolados ou caracterizados. Somente na década de 70 um peptídeo com
massa molecular de aproximadamente 6,0 kDa que reagia com anticorpos contra
insulina humana foi isolado de frutos e de sementes de Momordica charantia
(Khanna et al., 1976). Collier et al. (1987) relataram também o isolamento de
peptídeos de folhas de espinafre e plantas de Lemna gibba G3 que apresentaram
massas moleculares semelhantes aos da insulina, reagiram com anticorpos anti-
insulina suína e apresentaram a propriedade de ligação ao receptor de insulina
humana.
Trabalhos realizados pelo nosso grupo isolaram do tegumento de sementes
de Canavalia ensiformis, uma proteína de 6 kDa com seqüência de aminoácidos
homóloga à insulina bovina (Oliveira et al., 1999b). Experimentos de microscopia
mostraram que esse peptídeo está localizado na última camada de células do
tegumento dessas sementes (Oliveira et al., 2004). A presença de proteínas
homólogas à insulina também foi observada em vagens verdes de feijão-de-corda
Vigna unguiculata (Venâncio et al., 2003), e em folhas de Bauhinia variegata
(Azevedo et al., 2006).
Proteínas que reagiram com anticorpos anti-insulina humana também foram
observadas em folhas de Phaseolus vulgaris, das gimnospermas Cupressus
sempervirens, Pinus ponderosa, Cycas revolut, Cycadaceae zamia e Selaginella sp,
na parte aérea das pteridófitas Psilotaceae sp e Equisetoceae sp, na levedura
Saccharomyces cerevisiae, na alga Rhodophyta sp, na torta de filtro e caldo de cana
de Saccharum officinarum e em mais 27 espécies de dicotiledôneas (Silva et al.,
2002; Xavier-Filho et al., 2003).
Um polipeptídio com atividade hipoglicêmica também foi isolado de sementes
de Momordica charantia e com base na sua análise de aminoácidos mostrou-se
semelhante à insulina (Sheng et al., 2004).
1.3.1.2 - D-pinitol
O inositol é um poliálcool cíclico contendo um anel de seis átomos de carbono
e seis grupos OH (cicloexanopoliol), sendo um importante constituinte celular pois
está envolvido em diferentes processos bioquímicos. Em mamíferos o inositol existe
Introdução
Souza, S. C. (2010) 14
principalmente sob a forma de derivados fosforilados, participando na comunicação
celular como segundos mensageiros em vias de sinalização. Os inositóis podem ser
arranjados em nove estereoisômeros: scilo, myo, neo, epi, D e L quiro, cis, muco e
allo. Entre esses isômeros os myo-inositóis (myo-inositol - MI) são os mais
abundantes na natureza, sendo produzidos a partir da glicose (Almeida et al., 2003).
Os myo-inositóis (MI) e seus derivados são componentes importantes para o
crescimento e desenvolvimento das plantas. Além da reserva de fosfato os myo-
inositóis fosfatos estão envolvidos em muitos processos de rotas celulares como,
transdução e regulação de sinal, regulação da síntese de ATP, transporte e
estocagem de auxina, biossíntese de parede celular, endocitose e tráfico de
vesículas (Saiardi et al., 2004) e produção de moléculas relacionadas ao estresse
(Loewus & Murthy, 2000). Participam, ainda, do remodelamento da cromatina, reparo
e recombinação de DNA, expressão de genes e exportação de mRNA (Chun et al.,
2003).
A descoberta de que os MI funcionavam como fatores de crescimento para
certos microrganismos e como uma exigência para o desenvolvimento de certas
formas mutantes de levedura, motivou o interesse por novas características
bioquímicas e biológicas dessas moléculas. Logo tornou-se aparente que MI
possuíam um papel central no crescimento e desenvolvimento (Loewus & Loewus,
1983), especialmente para plantas, onde os MI estão associados à estrutura e
função de moléculas das quais eles fazem parte ou que os utilizam. Exemplos dessa
importância são os inositóis e seus ésteres de O-metil, como o D-pinitol, que atuam
na regulação osmótica de plantas constantemente expostas a condições de
estresse, como Mesembryanthemum crystallinum, também conhecida como planta
do gelo, sendo adaptada ao crescimento em altos níveis de sódio, sob seca e baixas
temperaturas (Yamada et al., 1995), e que chega a acumular D-pinitol, considerado
seu principal osmorregulador (Loewus & Murthy, 2000).
D-Pinitol (1D-3 O-metil-quiro-inositol) é um inositol formado diretamente pela
metilação de myo-inositol (Figura 1) e subseqüente epimerização de sequovitol ou D-
inositol e é um dos inositóis mais freqüentemente encontrados em tecidos vegetais
como sementes, raízes, folhas, etc. (Loewus & Murthy, 2000). Duas funções principais
têm sido propostas para a presença de myo-inositóis em plantas superiores (Bieleski,
1982; Drew 1983; Loescher, 1987). A primeira é como forma de transporte e
armazenamento de açúcares fotossinteticamente derivados e a segunda é o fato
Introdução
Souza, S. C. (2010) 15
desses compostos atuarem como solutos compatíveis com o ajuste osmótico em
tecidos de plantas em resposta a déficit de água ou alta salinidade (Loescher, 1987;
Bieleski et al., 1997). Dentro desta última função, o D-pinitol se destaca como
principal carboidrato envolvido nesse mecanismo de resposta em plantas (Bieleski,
1994a). Trabalhos mostraram que plantas que se desenvolveram em ambientes com
alta salinidade acumularam altos níveis de D-pinitol em suas folhas (Drew, 1983;
Bieleski, 1994b). O D-pinitol foi identificado como um significante componente no
“pool” de carboidratos totais em folhas e raízes de Limonium gmelini (Murakeozy et
al., 2002). Durante o desenvolvimento da soja, D-pinitol tem sido encontrado em
vários tecidos, incluindo folhas, pecíolos, raízes, caules e sementes que chegam a
conter até 0,9% (Kuo et al., 1997).
FIGURA 1 - Conversão bioquímica de myo-inositol para D-pinitol (Loewus & Murthy, 2000)
Em 2008, Obendorf e colaboradores demostraram como myo-inositóis, dentre
eles o D-pinitol, podem atuar na síntese de ciclitóis como sacarose, rafinose e
estaquiose a partir da glicose, em sementes de soja [Glycine max L. (Merrill)] (Figura
2). No esquema apresentado por eles glicose-6-P gera 1L-myo-inositol-1-P, através
da myo-inositol-fosfato sintase (MIPS), e na sequência, é formado myo-inositol pela
ação da myo-inositol-fosfato monofosfatase (IMP). Um dos produtos formados pela
degradação do myo-inositol através da myo-inositol 4-metiltransferase (IMT) é o D-
ononitol. D-pinitol é um produto obtido diretamente do D-ononitol através de um
mecanismo ainda desconhecido. Mas se sabe que estaquiose sintase (STS) pode
sintetizar galactopinitóis e ciceritol (di-galactosil pinitol A) com D-pinitol como
receptor de galactosil e galactinol como doador de galactose, e, possivelmente
Introdução
Souza, S. C. (2010) 16
também di-e tri-galactosídeos de myo-inositol (DGMI, TGMI), D-pinitol (ciceritol,
trigalactosilpinitol A) e D-chiro-inositol (fagopiritol B2, fagopiritol B3). Acredita-se que
essa enzima também esteja envolvida no metabolismo da sacarose, atuando após a
formação da rafinose (pela rafinose sintase - RFS) a partir da sacarose, na formação
de estaquiose, a partir de rafinose e de verbascose, a partir de estaquiose.
FIGURA 2 - Vias propostas para síntese de ciclitóis, ciclitóis galactosídeos e RFO (α-
galactosídeos de sacarose) (adaptado de Obendorf et al., 2008). Parenteses () com setas
indicam uma reação de catálise enzimática não identificada. Algumas reações podem ser
reversíveis. DP: grau de polimerização; DGMI, digalactosil myo-inositol; gol, galactinol; GolS,
galactinol sintase (EC 2.4.1.123); IMP, myo-inositol-fosfato monofosfatase (EC3.1.3.25); IMT,
myo-inositol 4-metiltransferase (EC 2.1.1.129); MIPS, myo-inositol-fosfato sintase (EC
5.5.1.4); myo, myo-inositol; RFS, rafinose sintase (EC 2.4.1.82); STS, estaquiose sintase
(EC 2.4.1.67); TGMI, trigalactosil myo-inositol; UDP, uridina difosfato; UDP-gal, uridina
difosfato galactosideo;VBS, verbascose sintase.
Trabalhos realizados por nosso grupo de pesquisa mostraram que D-pinitol
isolado de folhas de Bougainvillea spectabilis estimulou o aumento de tamanho e
ganho de massa do eixo hipocótilo-radícula e dos epicótilos de C. ensiformis
(Oliveira et al., 2004). Resultados semelhantes foram observados para Phaseolus
Introdução
Souza, S. C. (2010) 17
vulgaris, onde a aplicação exógena de D-pinitol promoveu um aumento no tamanho
e no ganho de massa das radículas e epicótilos dessas plântulas (Silva, 2006).
Fornaciari (2006) observou um acúmulo de proteínas totais solúveis nos cotilédones
e radículas de C. ensiformis tratadas com D-pinitol, sugerindo que esse composto
pode ter estimulado a síntese dessas proteínas. Souza, em 2007, estudando os
efeitos de D-pinitol durante as primeiras horas de germinação de C. ensiformis
percebeu que os cotilédones tratados apresentaram maior atividade de α-amilases
em quase todos os intervalos de tempo. E ainda, nosso mais recente trabalho
mostrou aumentos da atividade e dos níveis de expressão do gene da enzima α-
amilase em cotilédones de V. unguiculata e P. vulgaris tratados com D-pinitol
(Ribeiro et al., 2010).
Além disso, o D-pinitol é conhecido por exercer efeitos do tipo insulina em
animais, sendo utilizado para o tratamento alternativo do diabetes (Bates et al.,
2000). A atividade insulina-like do D-pinitol pode ser explicada por esse composto
ser análogo ao inositol - um segundo mensageiro presente em cascatas de
sinalização, como a desencadeada por insulina em animais. Acredita-se que D-
pinitol seja capaz de desencadear essa cascata, provocando ações ao nível de
membrana plasmática, citoplasma e núcleo. Ao nível de membrana, ocorrem
alterações no transporte de glicose, aminoácidos e íons; no citoplasma, há inibição
ou ativação de enzimas e no núcleo ocorre a regulação da síntese de DNA e RNA,
efeitos esses bem descritos para o hormônio insulina (Sperelakis, 1994).
Apesar da vasta distribuição e acúmulo de MI, inclusive de D-pinitol, em
vegetais durante a germinação e o desenvolvimento pós-germinativo, pouco se sabe
sobre possíveis rotas de sinalização e/ou moléculas alvo envolvendo esses
compostos e as funções que desempenham nesses sistemas.
1.3.1.3 - Vanadil sulfato
Vanadil sulfato (VOSO4) é um elemento ultratraço, distribuído amplamente na
natureza, importante para a modulação da atividade das enzimas das vias
metabólicas celulares. O papel aparente do vanádio está na regulação da
sinalização intracelular, como um co-fator das enzimas essenciais no metabolismo
energético. Também é considerado um agente terapêutico do tratamento do diabetes
(Thompson, 1999). Clark et al. (1985) demonstraram que o vanádio (V), no músculo
Introdução
Souza, S. C. (2010) 18
esquelético, altera o metabolismo de glicose de modo semelhante ao da insulina.
Esse elemento promoveu um aumento da entrada de glicose, síntese de glicogênio e
glicólise, em amplitude menor que a insulina. Resultados mais expressivos,
envolvendo compostos de vanádio, foram relatados com a utilização do composto
vanadil sulfato (VOSO4), onde foram demonstrados seus mecanismos de ação do
tipo insulina, possivelmente pelo fato do vanadil ser a forma intracelular ativa do
vanádio (Thompson, 1999; Shaver et al., 1995; Nakai et al., 1995; Goldwaser, et al.,
2000). De fato, o vanadil sulfato é a forma oxidativa do vanádio que in vitro e em
modelos animais de diabetes promoveu uma redução na hiperglicemia e na
resistência à insulina (Cusi et al., 2001). Recentemente, um trabalho de Thompson &
Orvig (2006) relatou que os compostos de vanádio para o tratamento do diabetes
são um tanto enigmáticos: o potencial terapêutico é claro, mas os mecanismos, e um
controle consistente de dosagem, são difíceis de fixar.
Apesar de relatos desde a década de 50 afirmarem que vanádio seria
essencial para plantas (Arnon & Wessel, 1953), encontramos trabalhos que mostram
os efeitos nocivos desse elemento no crescimento, produção e composição química
do milho e também no crescimento de plântulas de soja (Singh, 1971; Wang & Liu,
1999). Porém, já se sabe que vanádio e seus compostos derivados são ubíquos nas
plantas, a nível traço. Alguns relatos mais recentes mostram, por exemplo, que uma
quantidade traço de vanadato é benéfica ao crescimento vegetal, visto que
concentrações elevadas são tóxicas, chegando a inibir o movimento e
desenvolvimento foliar e a condutância estomática (Lin et al., 2009).
Vanadil sulfato em níveis traço, concentrações cerca de 10-2 M, também
mostrou ser um composto relacionado ao metabolismo vegetal. Singh & Wort (1969)
apresentaram efeitos do vanadil no crescimento, composição química e processos
metabólicos da beterraba madura (Beta vulgaris, L.), relacionando as mudanças no
crescimento e na composição química à estimulação ou inibição de diversas enzimas
pelo vanadil. Hattori & Ohta (1985) relataram que vanadil estimulou a acumulação de
isoflavonóides glicosídeos em culturas de célula em suspensão de Vigna angularis.
E mais tarde, Smith et al.,1987 relataram um rápido aumento na acumulação de
alcalóides por algumas linhagens de Catharanthus roseus em resposta à adição de
vanadil sulfato.
Introdução
Souza, S. C. (2010) 19
1.4 - Canavalia ensiformis
Canavalia ensiformis (L.) Dc. (Leguminosae) (Figuras 3 e 4), comumente
conhecida em inglês, como “jack bean” ou, em português, como feijão-de-porco, é
uma dicotiledônea anual originária da Índia e América Central, sendo atualmente
cultivada na maioria das regiões tropicais e subtropicais, apesar de poucos serem os
países que a cultivem em grande escala (Braga, 1960). Esta cresce facilmente em
regiões de baixa altitude, altas temperaturas e umidade relativa, condições
inadequadas para o crescimento de outros legumes utilizados na alimentação, tais
como Phaseolus vulgaris (feijão-comum). Desta forma, o feijão-de-porco tem elevado
potencial em regiões de climas e alturas variáveis como a América Central, onde não
competiria com o feijão-comum podendo ser uma fonte adicional de proteína (Molina
et al., 1974). Sua utilização como cultivo de cobertura tem uma grande importância
em uma variedade de sistemas agrícolas, onde se aproveita sua cobertura verde
durante temporadas de secas (Alemàn & Flores, 1993).
FIGURA 3 - Canavalia ensiformis
(Fonte: http://pt.wikipedia.org/wiki/Canavalia)
Introdução
Souza, S. C. (2010) 20
FIGURA 4 - Flores (A) e vagem imatura (B) de Canavalia ensiformis
(Fonte: http://plantsdatabase.com/members/Horseshoe/)
Normalmente, as sementes maduras são obtidas de 180 a 300 dias após o
plantio, dependendo do genótipo e das condições climáticas do local. Suas
sementes são geralmente brancas ou mais raramente podem apresentar uma cor
amarelada (Figura 5). Possuem dimensões aproximadas de 2,5 x 1,25 cm e pesam
cerca de 1,5 g (Braga, 1960). Algumas linhagens, dentro da mesma espécie,
apresentam características trepadoras, mas a maior parte possui características
arbustivas (Alemàn & Flores, 1993). Esta planta apresenta-se bastante tolerante a
sombra e a condições adversas de temperatura, sendo bastante resistente a seca e
adaptando-se bem a condições úmidas (Alemàn & Flores, 1993). Devido ao fato de,
quando dispersas da planta-mãe, apresentam baixo conteúdo de água, em torno de
5 a 10% de seu peso fresco, são consideradas sementes ortodoxas (Ferreira &
Borghetti, 2004).
A B
Introdução
Souza, S. C. (2010) 21
FIGURA 5 - Vagem madura (A) e sementes (B) de Canavalia ensiformis
(Fonte: http://plantsdatabase.com/members/Horseshoe/)
Sementes de Canavalia ensiformis têm sido objeto de estudo do nosso grupo
há muitos anos. Trabalhos realizados em 1999, identificaram proteínas envolvidas
com o mecanismo de defesa dessas sementes contra o ataque de Callosobruchus
maculatus (Oliveira et al., 1999c) e fungos fitopatogênicos (Oliveira et al., 1999a) nos
cotilédones e tegumentos das sementes quiescentes, sendo relevantes as proteínas
com sequência de aminoácidos homóloga a vicilinas (proteínas de reserva do tipo
7S) presentes nos cotilédones (Oliveira et al., 1999c). Além disso, Oliveira et al.
(1999b) demonstraram a presença de uma proteína homóloga à insulina nos
tegumentos de sementes quiescentes de C. ensiformis. Em 2004, um trabalho do
grupo também mostrou que insulina exógena (bovina) e D-pinitol foram capazes de
acelerar o desenvolvimento de radículas e epicótilos de plântulas de C. ensiformis
embebidas por 120 horas (Oliveira et al., 2004). Fornaciari (2006) constatou que
esses tratamentos estimularam a síntese protéica em todos os tecidos de C.
ensiformis (tegumentos, cotilédones, radículas e epicótilos) embebidos por 120
horas, exceto nos epicótilos, onde somente a insulina teve efeito.
O objetivo desse trabalho foi, com base nas observações, verificar a hipótese
das moléculas insulina, D-pinitol e vanadil sulfato estarem envolvidas na regulação
de vias metabólicas de plantas.
A B
Objetivos
Souza, S. C. (2010) 22
2 - OBJETIVO GERAL
Acompanhar o perfil metabólico de cotilédones de Canavalia ensiformis
durante a germinação e o desenvolvimento pós-germinativo, monitorando alterações
provocadas por insulina e compostos relacionados, como os mediadores miméticos
da sua ação, D-pinitol e vanadil sulfato.
2.1 - OBJETIVOS ESPECÍFICOS
• Investigar os perfis de proteínas totais em cotilédones submetidos aos
diferentes tratamentos com os compostos relacionados à insulina;
• Investigar os perfis de proteínas imunorrelacionadas à vicilinas em
cotilédones submetidos aos diferentes tratamentos com os compostos
relacionados à insulina;
• Investigar os perfis de atividade das enzimas α-amilase e proteinases
cisteínicas em cotilédones submetidos aos diferentes tratamentos com os
compostos relacionados à insulina;
• Detectar proteínas imunorrelacionadas a MAP-quinases em cotilédones
submetidos aos diferentes tratamentos com os compostos relacionados à
insulina;
• Avaliar os níveis endógenos de D-pinitol, myo-inositol, sacarose e rafinose
em cotilédones de C. ensiformis durante a germinação e o
desenvolvimento pós-germinativo.
Materiais e Métodos
Souza, S. C. (2010) 23
3 - MATERIAIS E MÉTODOS
3.1 - Material botânico
Sementes de Canavalia ensiformis foram obtidas do Laboratório de Sementes
do Departamento de Fitotecnia, Centro de Ciências Agrárias da Universidade
Federal do Ceará, e foram plantadas e mantidas no Centro de Ciências e
Tecnologias Agropecuárias (CCTA) da Universidade Estadual do Norte Fluminense
Darcy Ribeiro.
3.2 - Experimentos de germinação
Sementes de C. ensiformis foram desinfectadas com uma solução de álcool
etílico 70 % por 1 minuto e hipoclorito de sódio 2 % por 30 segundos. Após estes
processos as sementes foram postas para germinar em placas de Petri (20
sementes em cada placa) contendo algodão umedecido com 30 mL de água
destilada (experimentos controle) ou com o mesmo volume de diferentes soluções de
tratamentos com insulina (0,36 µg/mL), D-pinitol (1,44 µg/mL) e vanadil sulfato (1,809
µM) (Oliveira et al., 2004 e Silva, 2006). Os compostos químicos utilizados nos
experimentos de germinação, insulina bovina e vanadil sulfato, foram obtidos
comercialmente por Sigma Chemical Company, e o composto D-pinitol, isolado de
folhas de Bougainvillea spectabilis, foi cedido pelo Dr. Selwyn Yorke (New Zealand
Pharmaceuticals LTD).
Os experimentos foram mantidos em estufa incubadora por até 72 horas (12 h
luz/12 h escuro) a 28 ºC e 60 % de umidade relativa. Após 60 horas de incubação, o
algodão foi umedecido novamente com mais 30 mL de água ou das soluções acima
citadas. As sementes foram coletadas em intervalos de 6 horas (5 sementes em
cada intervalo) e os cotilédones foram separados e pesados para determinação da
massa fresca (em gramas). A emergência da radícula de deu em 30 horas de
embebição. Esses tecidos foram, então, congelados em nitrogênio líquido e
liofilizados. Após a liofilização, foram novamente pesados para determinação da
massa seca (em gramas) e em seguida, triturados em um liquidificador até obtenção
de um pó (farinha) que foi conservado a - 20 oC e, posteriormente, utilizado para as
dosagens apresentadas neste trabalho.
Materiais e Métodos
Souza, S. C. (2010) 24
3.3 - Extração e dosagem de proteínas totais solúve is
Para realização das dosagens protéicas das amostras foi utilizado o método
de Bradford (1976). A extração das amostras se deu na proporção de 2 mg de tecido
para 1 mL de tampão PBS (fosfato de sódio 100 mM, NaCl 0,5 M, pH 7,6) por 30
minutos em temperatura ambiente. Após a extração as amostras foram centrifugadas
a 3000 x g por 5 minutos, o precipitado foi descartado e o sobrenadante foi utilizado
para a dosagem de proteínas. Para os cálculos finais da concentração para
determinação de proteínas foi utilizada uma curva padrão de ovalbumina.
3.4 - Eletroforese em gel de poliacrilamida na presença de SDS (SDS-PAGE)
As proteínas foram visualizadas através de eletroforese em gel de
poliacrilamida 12% contendo SDS segundo metodologia descrita por Laemmli,
(1970), com modificações.
A eletroforese foi constituída por um gel de empacotamento (SDS 0,1%;
acrilamida 5%; bis-acrilamida 0,25%; Tris-HCl 0,75 M, pH 6,8; TEMED 0,04% e
persulfato de amônio 0,08%) e um gel de separação (SDS 0,1%; acrilamida 12%;
bis-acrilamida 0,06%; Tris-HCl 0,375 M, pH 8,8; TEMED 0,02% e persulfato de
amônio 0,5%). A eletroforese foi efetuada em ambiente de tampão de corrida Tris-
glicina (Tris 25 mM, glicina 192 mM, SDS 0,1 %, pH 8,3) por aproximadamente 2
horas com uma voltagem de 50 V, enquanto as amostras estavam no gel de
empacotamento, e 80 V após as amostras terem passado para o gel de separação.
Para o cálculo da massa molecular aparente das proteínas, um padrão de massa
molecular (albumina sérica bovina (BSA) 66 kDa, ovalbumina 45 kDa, anidrase
carbônica 29 kDa, tripsinogênio 24 kDa, β-lactoglobulina 18,4 kDa e lisozima 14,3
kDa) foi submetido à eletroforese, juntamente com as amostras.
As amostras de cotilédones usadas na eletroforese foram extraídas por 30
minutos utilizando a seguinte proporção: 3 mg de tecido em 200 µL de tampão de
amostra (Tris-HCl 0,5 M, glicerol 10 %, SDS 10 %, Azul de bromofenol 1 %, pH 6,8).
Após extração, centrifugou-se a 3.000 x g por 5 minutos para retirar do sobrenadante
a alíquota de 30 µL de amostra, que foi aplicada no gel.
Após a eletroforese o gel foi corado com uma solução corante (0,8 g de Azul
Brilhante de Coomassie R, 320 mL de metanol, 80 mL de ácido acético e água
Materiais e Métodos
Souza, S. C. (2010) 25
destilada q.s.p. - volume final de 800 mL) e descorado por uma solução descorante
para Coomassie (35% de metanol e 10% de ácido acético em água destilada).
3.5 - Western Blotting
A presença de proteínas imunorrelacionadas a vicilina foi visualizada
utilizando-se o método de Western blotting, segundo metodologia descrita por
Towbin et al., (1979).
Um gel não corado, proveniente de uma SDS-PAGE feita de acordo com
metodologia descrita anteriomente, foi submetido à transferência para uma
membrana de nitrocelulose. O gel, 2 blocos de papel filtro e a membrana, de
medidas idênticas, foram embebidos no tampão de transferência (Tris 0,1 M, glicina
192 mM, metanol 20%) por aproximadamente 20 minutos. No sistema de
transferência Trans-blot semi seco foi colocado o papel de filtro e sobre ele foi
colocada a membrana. Sobre a membrana colocou-se cuidadosamente o gel, a fim
de evitarem-se espaços de ar que pudessem representar barreiras na passagem da
corrente elétrica, em seguida o papel de filtro restante foi colocado sobre o gel. O
“sanduíche” formado foi umedecido com tampão de transferência e o sistema foi
fechado. A transferência ocorreu usando-se uma voltagem calculada na razão de
1mA por cm2 do gel, por aproximadamente 2 horas, à temperatura ambiente.
Finalizada a transferência, a membrana foi “revelada” com Ponceau a fim de checar
se a transferência foi realizada. A membrana contendo as proteínas transferidas, foi
deixada por 16 horas em um tampão bloqueador (PBS contendo 2% de leite em pó
desnatado), à temperatura de 4 ºC. Após o bloqueio, a membrana foi lavada 5 vezes
com tampão PBS e então incubada com o primeiro anticorpo, anti-vicilina de
cotilédones de Vigna unguiculata (EPACE 10), diluído em tampão bloqueador
(diluição de 1:2000), por 2 horas, à temperatura ambiente. Em seguida, a membrana
foi novamente lavada com tampão PBS por 5 vezes e incubada com o segundo
anticorpo, anti-IgG de coelho complexado a peroxidase, diluído em tampão
bloqueador (1:2000), por 1 hora, à temperatura ambiente. A membrana foi lavada
com tampão PBS mais 5 vezes e então foi aplicada uma solução reveladora
composta de 5 mg de DAB (diaminobenzeno) dissolvidos em 5 mL de uma solução
composta de 100 µL de tampão Tris-HCl 2M (pH 7,5 , 300 µL de imidazol 0,1M, 4,9
mL de água destilada e 5 µL de peróxido de hidrogênio (H2O2), este último colocado
Materiais e Métodos
Souza, S. C. (2010) 26
imediatamente no momento da revelação. A solução reveladora foi deixada em
contato com a membrana, na ausência de luz, até o aparecimento das bandas. A
reação foi parada lavando-se a membrana com água destilada.
3.6 - Dosagem de vicilinas e detecção de proteínas MAPK pelo método de
ELISA
O ensaio de ELISA foi empregado neste trabalho segundo metodologia
descrita por Engvall & Perlman (1971) com modificações, para quantificação de
proteínas imunorrelacionadas a vicilina e a detecção de MAPK.
Os anticorpos utilizados para os ensaios anti-MPK4 de Arabidopsis thaliana,
produzido em coelhos, e anti-IgG de coelho complexado a peroxidase, foram obtidos
comercialmente de Sigma-Aldrich Chemical Company e o anticorpo anti-vicilina de
Vigna unguiculata, cv. EPACE 10, produzido em coelhos, foi cedido pela Dra Adriana
Ferreira Uchôa.
As proteínas das amostras submetidas ao teste foram extraídas em tampão
carbonato/bicarbonato 0,05 M, pH 9,6, durante 30 minutos, à temperatura ambiente.
Para extração dos cotilédones foram usados 2 mg de pó em 1 mL de tampão. Após
a extração, as amostras foram centrifugadas a 3.000 x g por 5 minutos e os
sobrenadantes obtidos foram submetidos à dosagem de proteínas pelo método de
Bradford (1976).
Para a realização dos ensaios de ELISA, cada poço da placa foi sensibilizado
com 20 µg de proteína em 100 µL de tampão carbonato/bicarbonato pH 9,6 e a placa
foi deixada em repouso a 4 °C por 16 horas. Após es se período, a placa foi lavada
10 vezes com tampão PBS-Tween (fosfato de sódio 0,1 M; cloreto de sódio 0,5 M,
pH 7,6; contendo 0,05 % do detergente Tween 20). Após essa lavagem inicial, foram
adicionados aos poços 300 µL de tampão bloqueador (tampão PBS-tween contendo
1 % de gelatina) por 2 horas, à temperatura ambiente. Passado esse tempo de
bloqueio os poços foram novamente lavados 10 vezes com tampão PBS-Tween e
então, colocados em cada poço 50 µL do primeiro anticorpo (anti-vicilina de Vigna
unguiculata, cv. EPACE 10, produzido em coelho ou anticorpo anti-MPK4 de
Arabidopsis thaliana, também produzido em coelho, diluídos 1:2000 em tampão
bloqueador) e deixou-se a placa em repouso durante 2 horas à temperatura
Materiais e Métodos
Souza, S. C. (2010) 27
ambiente. Após as 2 horas de incubação, a placa foi lavada 10 vezes com tampão
PBS-Tween; em seguida, foram adicionados a cada poço 50 µL do segundo
anticorpo (anti-IgG de coelho complexado a peroxidase, diluído 1:2000 em tampão
bloqueador). A placa foi então deixada em repouso durante 1 hora à temperatura
ambiente. Após a incubação, a placa foi mais uma vez lavada por 10 vezes com
tampão PBS-Tween e submetida à revelação. O tampão revelador foi composto por
ácido cítrico 0,1 M e fosfato de sódio 0,2 M, pH 5,0. A esta mistura, foram
adicionados, no momento da revelação, 10 mg de OPD (orto-fenil-diamina) e 10 µL
de peróxido de hidrogênio, e então 50 µL dessa mistura foram adicionados em cada
poço. A reação ocorreu na ausência de luz por aproximadamente 15 minutos e,
posteriormente, foi parada pela adição de 50 µL de ácido sulfúrico 3N. A absorbância
foi determinada em um leitor de microplacas no comprimento de onda de 492 nm.
Foram feitos brancos para cada amostra onde não foram acrescentados os
anticorpos. Para os cálculos das concentrações de vicilina, foi utilizada uma curva
padrão com vicilina pura de cotilédones de Vigna unguiculata de 0,002 a 5 µg
vicilina/100 µL de tampão carbonato/bicarbonato 0,05 M, pH 9,6. E para os cálculos
das concentrações de MAPK a análise foi representada dentro do total de proteínas
dos tecidos e foi relacionada baseada nas absorbâncias.
3.7 - Determinação da atividade de proteinases cist eínicas do tipo papaína
As amostras foram submetidas à extração de proteínas na proporção de 100
mg de pó para 1 mL de tampão citrato-fosfato (citrato de sódio 100 mM, fosfato de
sódio monobásico 100 mM, Triton X-100 0,1 %, DTT 1,5 mM, pH 5,6). A extração
ocorreu durante 2 horas, sob agitação a 4 ºC. Após esse período, as amostras foram
centrifugadas e o sobrenadante utilizado no experimento.
O ensaio de atividade papainásica foi baseado na metodologia desenvolvida
por Michaud et al., (1994), citado por Oliveira (2007), sendo feita uma curva padrão
de papaína, onde a azocaseína foi utilizada como substrato para a enzima. Para
obtenção da curva, papaína foi diluída na proporção de 1mg para 2mL de tampão
citrato-fosfato obtendo-se uma solução com uma concentração final de papaína de
500 µg/mL. Azocaseína foi preparada a uma concentração de 1% em tampão citrato-
fosfato. O ensaio foi preparado em microtubos e constou de quantidades crescentes
(1; 2; 4; 8; 10; 12; 14; 16; 18 e 20 µL) da solução estoque (500µg/mL) da papaína, 80
Materiais e Métodos
Souza, S. C. (2010) 28
µL da solução de azocaseína 1% e tampão citrato-fosfato para completar um volume
final de 120 µL. O período de incubação foi de 1 hora em banho-maria a 37 ºC. Em
seguida, a reação foi parada com 300 µL de ácido tricloroacético (TCA) 10%. Os
microtubos foram centrifugados por 2 minutos a 3000 x g. Transferiram-se 350 µL do
sobrenadante para tubos de ensaio, onde então foram adicionados 300 µL de NaOH
1 M. A leitura foi feita em comprimento de onda de 440 nm.
As atividades proteinásicas foram medidas através do uso do substrato
azocaseína em pH 5,6 (indicado para proteinases cisteínicas semelhantes à
papaína). A reação foi realizada incubando-se 80 µL da solução azocaseína 1% (que
deve ser previamente aquecida à temperatura de 37 ºC), com 30 µL da fonte de
enzimas (extratos dos tecidos das sementes) e 10 µL de tampão citrato-fosfato. Após
a incubação a 37 ºC em banho-maria por 1 hora, a reação foi parada pela adição de
300 µL de TCA 10%. Em seguida, a solução foi centrifugada por 2 minutos a 3000 x
g. Logo após foram retirados 350 µL do sobrenadante e adicionados 300 µL de
NaOH 1 M. As amostras finais foram avaliadas por leitura espectrofotométrica, em
comprimento de onda de 440 nm.
A concentração da atividade de proteinases cisteínicas nas amostras
foi calculada com base na curva padrão de papaína, mencionada anteriormente.
3.8 - Determinação da atividade de αααα-amilases
3.8.1 - Ensaio de atividade de αααα-amilases pelo método DNS
A determinação da atividade enzimática de α-amilases foi feita através da
dosagem de açúcares redutores, baseada na metodologia descrita por Miller (1959),
com modificações. O amido é clivado pela α-amilase, havendo liberação de maltose
(açúcar redutor) no meio. Na presença de açúcar redutor e NaOH, o ácido 3,5-
dinitrossalicílico (DNS) é reduzido ao ácido 3-amino-5-dinitrossalicílico (produto),
produzindo uma coloração vermelho-castanho, cuja formação pode ser
acompanhada a 540nm. Para a realização do ensaio foi preparado um reativo de
DNS como descrito abaixo:
- Solução 1 (volume 30 mL): 4,5% de hidróxido de sódio (NaOH)(1,35g em 30
mL de água destilada);
Materiais e Métodos
Souza, S. C. (2010) 29
- Solução 2 (volume 88 mL): 1% de ácido 3,5-dinitrossalicílico (DNS) + 25,5%
de tartarato duplo de sódio e potássio (0,88g de DNS + 22,5g de tartarato em 88 mL
de água destilada);
- Solução 3 (volume 10 mL):
• Solução A: NaOH 10% (1g de NaOH em 10 mL de água destilada)
• Em 2,2 mL da solução A acrescentou-se 1g de fenol cristalino e o
volume foi completado para 10 mL de água destilada.
O reativo de DNS é composto da soma das três soluções preparadas.
Para o preparo das amostras, os tecidos de C. ensiformis foram submetidos à
extração por 30 minutos à 4 °C, em tampão fosfato d e potássio 50 mM pH 6,8. As
amostras de cotilédones foram diluídas na proporção de 50 mg de pó para 1 mL de
tampão fosfato de potássio, e após a extração, foram centrifugadas a 3.000 x g por 5
minutos, para recuperação do sobrenadante usado na detecção da atividade de α-
amilases.
O ensaio foi constituído de 44 µL do extrato obtido na extração, adicionados
de 6 µL de uma solução de amido 1 %. Foram feitos três brancos: o branco do
reagente DNS (50 µL de tampão fosfato de potássio); o branco da solução de amido
1 % (44 µL de tampão fosfato de potássio, 6 µL da solução de amido 1 %) e os
brancos das amostras (50 µL de cada amostra). Os microtubos contendo essas
soluções foram incubados a 37 °C por 45 minutos. Ap ós esse período, aguardou-se
o resfriamento das soluções e foram, então, adicionados 100 µL do reativo de DNS.
Em seguida, as soluções foram fervidas durante 5 minutos e mais 100 µL de água
destilada foram acrescentados a cada amostra. Um volume de 200 µL das amostras
foi transferido para uma placa de micropoços para leitura em um leitor de
microplacas, sob um comprimento de onda de 540 nm.
Para quantificar a atividade de α-amilases nas amostras, foi feita uma curva
padrão utilizando maltose como açúcar redutor. Foi preparada uma solução de
maltose 0,25 % e quantidades crescentes desta solução (1,25; 2,50; 3,75; 5,00; 6,25;
7,50; 8,75; 10,0 e 11,25 µL) foram pipetadas em microtubos, aos quais foi adicionada
água para completar um volume final de 50 µL Em cada tubo adicionaram-se 100 µL
de DNS e a seguir ferveram-se as soluções por 5 minutos. Adicionaram-se, então,
100 µL de água destilada e 200 µL de cada solução foram transferidos para uma
Materiais e Métodos
Souza, S. C. (2010) 30
microplaca, para que a absorbância pudesse ser lida em um leitor de microplacas a
540 nm.
3.8.2 - Ensaio de atividade de αααα-amilases em PAGE-nativo
A determinação da atividade enzimática de α-amilases também foi feita
através de zimografia, uma técnica eletroforética pela qual a atividade enzimática
pode ser diretamente visualizada em um gel de poliacrilamida como bandas distintas,
segundo a metodologia de Upadhyay (2005), com modificações.
Para o preparo das amostras, os tecidos foram submetidos à extração por 30
minutos à 4 °C, em tampão PBS. As amostras foram di luídas na proporção de 12
mg/mL de tampão, e após a extração, foram centrifugadas a 3.000 x g por 5 minutos,
para recuperação do sobrenadante usado na detecção da atividade da α-amilase.
A amostra aplicada no gel de PAGE-nativo 10% foi constituída de 18 µL da
amostra extraída e de 12 µL de tampão de amostra nativo (sem SDS). Após a
corrida, o gel foi transferido para uma solução substrato/tampão (acetato de sódio
20mM, cloreto de sódio 0,2mM, cloreto de cálcio 100mM, pH5,5) contendo1% amido
solúvel (m/v). O gel foi incubado por 3 horas a 4 oC, à temperatura ambiente. Após
incubação, o gel foi rapidamente lavado com água destilada e revelado com uma
solução de revelação Lugol (Sigma) 1:50, em água destilada.
3.9 - Dosagem de D-pinitol, sacarose, rafinose e myo -inositol por
Cromatografia Gasosa acoplada a Espectrometria de M assas (CG-MS)
Estes experimentos foram realizados em colaboração com a professora Drª Rita de
Cássia Leone Figueiredo Ribeiro e do Dr. Danilo Centeno do Núcleo de Fisiologia e
Bioquímica de Plantas - Instituto de Botânica da USP, com participação da doutoranda Elane
da Silva Ribeiro, do LQFPP/UENF.
Cotilédones de sementes de C. ensiformis germinadas em 24, 48 e 72 horas,
e sementes quiescentes foram extraídos na proporção de 50 mg de pó seco para
500 µL de solução contendo metanol/clorofórmio/água (12:5:1). As amostras foram
colocadas em agitador (“vortex”) para homogeneização e posteriormente postas em
banho seco por 30 mim a 60 °C, sendo que todos os t ubos foram agitados a
Materiais e Métodos
Souza, S. C. (2010) 31
intervalos de 10 em 10 minutos. Após extração das amostras, os tubos foram
centrifugados em microcentrífuga durante 2 minutos, a 13000 rpm e temperatura
ambiente. Após centrifugação, o sedimento foi descartado e do sobrenadante foram
retiradas alíquotas de 350 µL, as quais foram transferidas para novos tubos de 1,5
mL e acrescentados, a estas, 350 µL de água destilada. Esses tubos foram
novamente agitados e centrifugados por 5 minutos a 13000 rpm em temperatura
ambiente. Foram então retirados 300 µL do sobrenadante, os quais foram secos por
2 horas em rotoevaporador (“speed vac”). Após serem secas, estas amostras foram
utilizadas para o processo de derivatização, o qual permite que a amostra se
volatilize. Para isso, foram colocados 150 µL do reagente piridina e 50 µL de
BSTFA/TMSC (trimetil fluoracetamida/ trimetilcloro silano). Estes foram deixados em
banho seco, sob temperatura de 75 °C durante 1 hora , sob agitação em vortex de 10
em 10 minutos. Após, o resfriamento das amostras em temperatura ambiente, um
volume de 200 µL foi transferido para frascos do tipo “crimp vial”. Estes frascos com
as amostras foram postos no equipamento CG-MS, para análise e detecção de
alguns compostos metabólicos. Solução padrão de D-pinitol foi usada para o cálculo
das concentrações finais desse composto nas amostras.
3.10 - Análise estatística
A maioria dos resultados foi analisada através do teste t de Student, e as
diferenças significativas foram consideradas quando valores de p < 0,05 (Bridge &
Sawilowsky, 1999).
Resultados
Souza, S. C. (2010) 32
4 - RESULTADOS
4.1 - Perfil de embebição de sementes de Canavalia ensiformis : Influência de
insulina e compostos relacionados sobre o ganho de massa de cotilédones
A figura 6 mostra os teores de massa fresca e seca durante a embebição de
sementes de Canavalia ensiformis. Foi possível observar que houve uma rápida
tomada de água durante as 6 primeiras horas de embebição, seguida por uma fase
de estabilização e com um novo aumento da absorção de água a partir de 54 horas.
Nos experimentos controle e tratamentos com insulina (6A), D-pinitol (6B) e vanadil
sulfato (6C) a emergência da radícula se iniciou em 30 horas de embebição. Não
foram observadas diferenças significativas nas massas seca e fresca entre os
experimentos controle e os tratamentos.
Resultados
Souza, S. C. (2010) 33
0
0,5
1
1,5
2
2,5
3
Embe b iç ã o ( hor a s)
Cont role- f resca Cont role-seca Insulina-f resca Insulina-seca
A
0
0,5
1
1,5
2
2,5
3
Emb eb ição ( ho ras)
Controle-fresca Controle-seca D-pinitol-f resca D-pinitol-seca
B
0
0,5
1
1,5
2
2,5
3
Emb eb ição ( ho ras)
Controle-f resca Controle-seca Vanadil-fresca Vanadil-seca
C
FIGURA 6 - Teores de massa fresca e seca (gramas) de sementes de Canavalia ensiformis
germinadas na presença de insulina (6A), D-pinitol (6B), vanadil sulfato (6C) ou em água (experimento
controle) em intervalos de 0 (quiescente) a 72 horas de embebição.
Resultados
Souza, S. C. (2010) 34
4.2 - Teores de proteínas totais solúveis de cotilé dones: Influência de insulina
e compostos relacionados
Na figura 7 são mostradas as concentrações de proteínas totais solúveis em
cotilédones de sementes de C. ensiformis quiescentes e germinadas em intervalos
de 6 a 72 horas. É possível ver que após as primeiras horas de embebição em água
(próximas a 12 horas) há um aumento na quantidade de proteínas totais, seguida por
alguns picos de aumento, isolados, ao longo dos tempos de germinação. Até 72
horas não foram observadas diminuições significativas de proteínas, com relação ao
teor das sementes quiescentes, que indicassem uma possível mobilização (Figuras
7A, B e C).
Quando analisados os níveis protéicos de cotilédones que foram submetidos
aos tratamentos, observa-se que todos os tratamentos influenciaram nos níveis de
proteínas em algum momento da embebição. O tratamento com insulina teve um
efeito positivo nos níveis de proteínas totais solúveis em alguns intervalos de tempo
principalmente em 6 e 36 horas de embebição (Figura 7A). Esse efeito também foi
observado para o tratamento com D-pinitol nas primeiras horas de embebição,
principalmente em 6 e 12 horas (Figura 7B).
Quando avaliados os efeitos do tratamento com vanadil sulfato, notou-se um
aumento nos níveis de proteínas totais em quase todos os intervalos de tempo de
embebição (Figura 7C).
Resultados
Souza, S. C. (2010) 35
90
110
130
150
170
190
210
Qui 6 12 18 24 30 36 42 48 54 60 66 72
Embebição (horas)
µg P
rote
ína/
m
g M
assa
sec
a
Controle Insulina
A
90
110
130
150
170
190
210
Qui 6 12 18 24 30 36 42 48 54 60 66 72
Embebição (horas)
µg P
rote
ína/
m
g M
assa
sec
a
Controle D-pinitol
B
90
110
130
150
170
190
Qui 6 12 18 24 30 36 42 48 54 60 66 72
Embebição (horas)
µg P
rote
ína/
mg
Mas
sa s
eca
Controle Vanadil
C
FIGURA 7 - Concentração de proteínas totais solúveis por mg de tecido (massa seca) de cotilédones
de plântulas de C. ensiformis germinadas na presença de (A) insulina (0,36 µg/mL), (B) D-pinitol (1,44
µg/mL), (C) vanadil sulfato (1,809 µM) ou água (controle) por até 72 horas de embebição. Os
resultados representam a média de 3 repetições.
*
* *
*
Resultados
Souza, S. C. (2010) 36
4.3 - Visualização do perfil protéico por SDS-PAGE e detecção de vicilinas por
Western blotting em cotilédones germinados em ausência e presença de
insulina e compostos relacionados
Com o objetivo de analisar o perfil protéico total, o perfil das vicilinas
(principais proteínas de reserva) e as possíveis mudanças induzidas pelos
tratamentos, proteínas foram extraídas dos cotilédones de C. ensiformis e
visualizadas por eletroforese em gel de poliacrilamida 12 %, na presença de SDS.
Para a análise do perfil de vicilinas, proteínas separadas em gel foram transferidas
para membrana de nitrocelulose e analisadas por Western blotting.
Observa-se que os cotilédones apresentam uma riqueza de bandas protéicas
com massas moleculares variadas desde superiores a 66 kDa até inferiores a 14 kDa
(Figuras 8A e 9A). Diversas bandas imunorreativas ao anticorpo anti-vicilina de Vigna
unguiculata também foram reveladas (Figuras 8B, e 9B).
As amostras dos tratamentos com insulina, D-pinitol e vanadil sulfato não
apresentaram diferenças no perfil protéico total quando comparados com os
respectivos controles (Figuras 8A e 9A). Na análise das vicilinas foi possível notar a
diminuição de intensidade de algumas bandas imunorrelacionadas a vicilinas nas
amostras tratadas com D-pinitol (setas) em todos os intervalos de tempo analisados
(Figuras 8B e 9B).
Resultados
Souza, S. C. (2010) 37
FIGURA 8 - Perfil protéico, em SDS-PAGE (A), e detecção de vicilinas, por Western blotting (B), de
cotilédones de plântulas de C. ensiformis germinadas na presença de insulina (0,36 µg/mL), D-pinitol
(1,44 µg/mL), vanadil sulfato (1,809 µM) ou água (controle) por até 30 horas de embebição e semente
quiescente. M: marcador de massa molecular; MV: marcador vicilina; Q: quiescente; C: Tecidos
controle; I, P e V: Tecidos tratados com insulina, D-pinitol e vanadil sulfato (respectivamente).
MV Q 6C 6I 6P 6V 18C 18I 18P 18V 30C 30I 30P 30V
B
M Q 6C 6I 6P 6V 18C 18I 18P 18V 30C 30I 30P 30V
A
66 kDa 45 kDa
29 kDa 24 kDa
18 kDa 14 kDa
Resultados
Souza, S. C. (2010) 38
FIGURA 9 - Perfil protéico, em SDS-PAGE (A), e detecção de vicilinas, por Western blotting (B), de
cotilédones de plântulas de C. ensiformis germinadas na presença de insulina (0,36 µg/mL), D-pinitol
(1,44 µg/mL), vanadil sulfato (1,809 µM) ou água (controle) de 42 por até 66 horas de embebição e
semente quiescente. M: marcador de massa molecular; Q: quiescente; C: Tecidos controle; I, P e V:
Tecidos tratados com insulina, D-pinitol e vanadil sulfato (respectivamente).
Q 42C 42I 42P 42V 54C 54I 54P 54V 66C 66I 66P 66V
B
M Q 42C 42I 42P 42V 54C 54I 54P 54V 66C 66I 66P 66V
A
66 kDa 45 kDa
29 kDa 24 kDa
18 kDa 14 kDa
Resultados
Souza, S. C. (2010) 39
4.4 - Dosagem de proteínas imunorrelacionadas à vic ilina em cotilédones
germinados em ausência e presença de insulina e com postos relacionados
Com o intuito de investigar variações nas concentrações de vicilinas, foi feita
uma dosagem de vicilinas, através do método de ELISA utilizando-se anticorpo anti
vicilina de V. unguiculata (cv. EPACE 10).
A concentração de vicilinas durante a germinação de sementes de C.
ensiformis apresentou um padrão semelhante ao encontrado para proteínas totais
solúveis onde após as primeiras horas de embebição há um aumento na quantidade
de vicilinas, seguido por alguns picos em tempos específicos. Aparentemente não
houve mobilização significativa de vicilinas até 72 horas de embebição.
Com relação aos tratamentos foi observado que a quantidade de vicilina não
variou significativamente com o tratamento com insulina (Figura 10A). Nos
tratamentos com D-pinitol (Figura 10B) apenas nos intervalos de tempo de 24 e 42
horas houve um pequeno aumento na concentração de vicilinas. Para vanadil sulfato
(Figura 10C), observamos um aumento apenas em 66 horas de embebição.
Resultados
Souza, S. C. (2010) 40
3
5
7
9
11
13
Qui 6 12 18 24 30 36 42 48 54 60 66 72
Embebição (horas)
Vic
ilina
(u
g/m
g m
assa
sec
a)
Controle Insulina
A
4
6
8
10
12
Qui 6 12 18 24 30 36 42 48 54 60 66 72
Embebição (horas)
Vic
ilina
(u
g/m
g m
assa
sec
a)
Controle D-pinitol
B
3
6
9
12
15
Qui 6 12 18 24 30 36 42 48 54 60 66 72
Embebição (horas)
Vic
ilina
(u
g/m
g m
assa
sec
a)
Controle Vanadil
C
FIGURA 10 - Quantificação de proteínas imunorrelacionadas à vicilina por mg de tecido (matéria
seca) de cotilédones de sementes de C. ensiformis germinadas na presença de (A) insulina (0,36
µg/mL), (B) D-pinitol (1,44 µg/mL), (C) vanadil sulfato (1,809 µM) ou água (controle) por até 72 horas
de embebição e quiescente. Os resultados representam a média de 3 repetições.
* *
*
Resultados
Souza, S. C. (2010) 41
4.5 - Perfil de atividade de proteinases cisteínica s em cotilédones germinantes
de C. ensiformis : Influência de insulina e compostos relacionados
Apesar das poucas variações nas quantidades de vicilinas durante o período
de embebição estudado, avaliou-se a atividade de proteinases cisteínicas. Os
resultados mostraram que o aumento da concentração de vicilinas durante as horas
iniciais de germinação com subseqüentes picos de aumentos protéicos foi
acompanhado por um aumento da atividade de proteinases cisteínicas também
durante as primeiras horas de embebição e posteriores aumentos durante os
intervalos posteriores de embebição (Figura 11).
Com relação aos tratamentos observamos que insulina e D-pinitol mostraram
efeitos positivos na atividade das proteinases cisteínicas. No tratamento com D-
pinitol (Figura 11B) foram observados efeitos positivos em todos os intervalos de
tempo, alcançando valores cerca de duas vezes maior do que os do controle.
Para os tratamentos com vanadil sulfato (Figura 11C) não foram observadas
variações muito significativas.
Resultados
Souza, S. C. (2010) 42
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
Qui 6 12 18 24 30 36 42 48 54 60 66 72
Embebição (horas)
Pro
tein
ase
cist
eíni
ca
(µg/
mg
mas
sa s
eca)
Controle Insulina
A
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
1,2
Qui 6 12 18 24 30 36 42 48 54 60 66 72
Embebição (horas)
Pro
tein
ase
cist
eíni
ca
(µg/
mg
mas
sa s
eca)
Controle D-pinitol
B
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
Qui 6 12 18 24 30 36 42 48 54 60 66 72
Embebição (horas)
Pro
tein
ase
cist
eíni
ca
(µg/
mg
mas
sa s
eca)
Controle Vanadil
C
FIGURA 11 - Atividade de proteinases cisteínicas em cotilédones de plântulas de C. ensiformis
germinadas na presença de (A) insulina (0,36 µg/mL), (B) D-pinitol (1,44 µg/mL), (C) vanadil sulfato
(1,809 µM) ou água (controle) por até 72 horas de embebição. Os resultados representam a média de
3 repetições.
Resultados
Souza, S. C. (2010) 43
4.6 - Perfil de atividade de αααα-amilases de cotilédones germinantes de C.
ensiformis: Influência de insulina e compostos relacionados
A atividade da enzima α-amilase em cotilédones de C. ensiformis,
representada por µg de maltose produzida por 1 mg de tecido/minuto está mostrada
na Figura 12.
Os resultados mostram que há um aumento na atividade da enzima α-amilase
nas primeiras horas de embebição e essa atividade tende a se manter constante nos
demais períodos. Com relação aos tratamentos apenas nos cotilédones tratados com
D-pinitol foi possível observar alterações significativas, com aumento de atividade de
α-amilase em quase todos os intervalos de tempos estudados (Figura 12B).
A atividade de α-amilases em cotilédones de C. ensiformis foi ainda
visualizada através da zimografia, técnica eletroforética pela qual a atividade
enzimática é diretamente visualizada em um gel de poliacrilamida (Figura 13A).
Apenas as amostras de cotilédones tratados com D-pinitol de 0 - 24 horas foram
analisadas por apresentarem maior atividade in vitro (ensaio enzimático). A
intensidade das bandas visualizadas foi analisada pelo programa Image J (Figura
13B).
Foi possível comprovar que a atividade da enzima α-amilase em cotilédones
de plântulas de C. ensiformis germinadas na presença de D-pinitol teve um aumento
durante as primeiras horas de embebição, principalmente no tempo de 18 horas de
embebição (Figura 13B).
Resultados
Souza, S. C. (2010) 44
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
Qui 6 12 18 24 30 36 42 48 54 60 66 72
Embebição (horas)
Mal
tose
(µg
/mg/
min
)
Controle Insulina
A
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
Qui 6 12 18 24 30 36 42 48 54 60 66 72
Embebição (horas)
Mal
tose
(µg
/mg/
min
)
controle D-pinitol
B
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
Qui 6 12 18 24 30 36 42 48 54 60 66 72
Embebição (horas)
Mal
tose
(µg
/mg/
min
)
Controle Vanadil
C
FIGURA 12 - Atividade da enzima α-amilase em cotilédones de plântulas de Canavalia ensiformis
germinadas na presença de (A) insulina (0,36 µg/mL), (B) D-pinitol (1,44 µg/mL), (C) vanadil sulfato
(1,809 µM) ou água (controle) por até 72 horas de embebição. Os resultados representam a média de
3 repetições.
Resultados
Souza, S. C. (2010) 45
FIGURA 13 - Atividade da enzima α-amilase em cotilédones de plântulas de C. ensiformis germinadas
na presença de D-pinitol (1,44 µg/mL) durante as primeiras horas de embebição. (A) Visualização
zimográfica das bandas de α-amilase de cotilédones embebidos por 6 a 24 horas e semente
quiescente. (B) Análise da intensidade da atividade das bandas pelo programa Image J.
C: Tecidos controle; T: Tecidos tratados com D-pinitol.
C T C T C T C T Q 6h 12h 18h 24h
C T C T C T C T Q
6h 12h 18h 24h Q
A
B
Resultados
Souza, S. C. (2010) 46
4.7 - Detecção de proteínas imunorrelacionadas à MA P quinase (MAPK) em
cotilédones germinantes de C. ensiformis: Influência de insulina e compostos
relacionados
Desde que as MAPKs, da via MAP-quinase/MAPK (proteína-quinase ativada
por mitógenos), representam a mais abundante família de quinases serina-treonina
em plantas superiores, analisaram-se possíveis alterações nos teores desse
componente durante a germinação de sementes de C. ensiformis utilizando o
método de ELISA e o anticorpo anti-AtMPK4.
O perfil de expressão da MAPK em cotilédones durante a germinação mostrou
um aumento até 18 horas, seguido por um declínio mais acentuado entre 36 e 42
horas e um novo aumento em 48 horas (Figura 14). A análise dos níveis de MAPK
em relação ao total de proteínas dos tecidos mostra uma diminuição nos tratamentos
com insulina, D-pinitol e vanadil sulfato em relação ao controle (Figura 14 A, B e C).
Nos tecidos submetidos a esses tratamentos observamos um perfil constante na
detecção dessa proteína.
Resultados
Souza, S. C. (2010) 47
0,05
0,1
0,15
0,2
0,25
Qui 6 12 18 24 30 36 42 48 54 60 66 72
Embebição (horas)
Abs
. (49
2 nm
)
Controle Insulina
A
0,05
0,1
0,15
0,2
0,25
Qui 6 12 18 24 30 36 42 48 54 60 66 72
Embebição (horas)
Abs
. (49
2 nm
)
Controle D-pinitol
B
0,05
0,1
0,15
0,2
0,25
Qui 6 12 18 24 30 36 42 48 54 60 66 72
Embebição (horas)
Abs
. (49
2 nm
)
Controle Vanadil
C
FIGURA 14 - Quantificação de proteínas imunorrelacionadas à MAPK por mg de tecido (matéria seca)
de cotilédones de sementes de C. ensiformis germinadas na presença de (A) insulina (0,36 µg/mL),
(B) D-pinitol (1,44 µg/mL), (C) vanadil sulfato (1,809 µM) ou água (controle) por até 72 horas de
embebição e quiescente. Os resultados representam a média de 3 repetições.
Resultados
Souza, S. C. (2010) 48
4.8 - Dosagem de D-pinitol em cotilédones durante a germinação
Cotilédones de sementes quiescentes ou embebidas por até 72 horas em
água ou D-pinitol foram submetidas a detecção e quantificação de D-pinitol. Os
resultados mostraram a presença de D-pinitol em todas as amostras analisadas,
entretanto as quantidades foram bastante variáveis (Figura 15). Em cotilédones
quiescentes (153,6 mg/kg) e embebidos por 24 horas (166,45 mg/kg) observaram-se
concentrações semelhantes de D-pinitol e essas quantidades não variaram
significativamente nos cotilédones tratados com o composto por 24 horas (153,4
mg/kg). A concentração de D-pinitol em cotilédones embebidos por 48 e 72 horas
aumentou consideravelmente alcançando os maiores níveis em cotilédones
embebidos em água por 72 horas (1303,72 mg/kg).
Resultados
Souza, S. C. (2010) 49
FIGURA 15 - Quantificação de D-pinitol em cotilédones de sementes de Canavalia ensiformis
quiescentes ou durante a germinação em água ou na presença de D-pinitol (1,44 µg/mL) por 24, 48 e
72 horas. As dosagens foram feitas por cromatografia gasosa acoplada a espectrômetro de massas
(CG-MS). Os valores estão expressos em mg/kg de massa seca e foram calculados a partir de uma
curva padrão com D-pinitol puro.
0200400600800
1000120014001600
Quiesc
ente
24 C
24 T
48 C
48 T
72C
72 T
Embebição (horas)
D-p
inito
l (m
g/K
g)
Resultados
Souza, S. C. (2010) 50
4.9 - Detecção de myo -inositol, sacarose e rafinose em cotilédones duran te a
germinação
Para essas detecções foram usados cotilédones de sementes quiescentes ou
embebidas por até 72 horas em água ou D-pinitol. Os resultados foram expressos
em unidade arbitrária levando-se em consideração a quantidade de cada um desses
compostos presentes em cotilédones quiescentes. A quantidade presente em
cotilédones quiescentes foi considerada igual a 1 e as concentrações dos compostos
durante os tempos de embebição foram grafadas em relação a essa quantidade. Os
resultados mostraram que as quantidades de myo-inositol encontradas em
cotilédones embebidos por 24 horas em água foram iguais aos encontrados nos
cotilédones quiescentes, entretanto em tecidos embebidos por 24 horas com D-
pinitol essas quantidades foram quase duplicadas (Figura 16A). Nos tempos de 48 e
72 horas as concentrações de myo-inositol foram maiores comparando-se a
cotilédones quiescentes e o tratamento com D-pinitol influenciou positivamente a
quantidade de myo-inositol no tempo de 48h. Em 72 h de embebição com D-pinitol
foi observada uma diminuição na concentração de myo-inositol em relação ao tecido
embebido em água (Figura 16A).
Com relação à dosagem de rafinose, observou-se uma diminuição significativa
desse composto ao longo da germinação, sendo que, em 72 horas, a concentração
desse composto já era cerca de 5 vezes menor quando comparada a de cotilédones
de sementes quiescentes.
Quando analisadas essas concentrações em relação ao tratamento, observa-
se que no tempo de 48 h há um aumento de rafinose nos cotilédones embebidos
com D-pinitol (Figura 16B).
As concentrações de sacarose não variaram significativamente nos
cotilédones de C. ensiformis durante a germinação e nem entre os tratamentos
(Figura 16C).
Resultados
Souza, S. C. (2010) 51
FIGURA 16 - Detecção de myo-inositol (A), rafinose (B) e sacarose (C) em cotilédones de sementes
de Canavalia ensiformis (1,44 µg/mL) quiescentes ou durante a germinação em água ou na presença
de D-pinitol por 24, 48 e 72 h. As detecções foram feitas por cromatografia gasosa acoplada a
espectrômetro de massas (CG-MS). Os valores estão expressos em unidade arbitrária em
comparação com os valores encontrados em cotilédones quiescentes (considerado = 1- linha
pontilhada).
0
0,5
1
1,5
2
2,5
3
24 C
24 T
48 C
48 T
72 C
72 T
Embebição (horas)
Uni
dade
arb
itrár
ia
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
1,2
24 C
24 T
48 C
48 T
72 C
72 T
Embebição (horas)
Uni
dade
arb
itrár
ia
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
1,2
1,4
24 C
24 T
48 C
48 T
72 C
72 T
Embebição (horas)
Uni
dade
arb
itrár
ia
A
B
C
Discussão
Souza, S. C. (2010) 52
5 – DISCUSSÃO
A insulina é descrita na literatura como um estimulador de metabolismo e
crescimento celular em diferentes organismos devido à modulação da síntese de
proteínas que regulam a tradução de mRNAs específicos. Desde 1923, a presença
de substâncias similares à insulina em plantas tem sido sugerida por diversos
trabalhos e em diversas plantas (Collip, 1923; Sanchéz de Gimenez et al., 1999).
Com base no que já se conhece sobre insulina em animais, muitos estudos já foram
desenvolvidos com o objetivo de verificar a hipótese de proteínas do tipo insulina
estarem envolvidas na regulação de vias metabólicas durante a germinação da
semente e o desenvolvimento da plântula. Trabalhos realizados por Ellis & Eyster
(1923) mostraram que insulina promovia um aumento do crescimento de plântulas de
milho, assim como um aumento do desenvolvimento de raízes primárias e
secundárias. Csaba & Pál (1982) observaram que insulina promovia o aumento do
tamanho e peso de raízes e coleóptilos de sementes de cevada. Goodman & Davis
(1993) mostraram que insulina humana, IGF I e IGF II promoveram o crescimento
das radículas de melancia (Citrullus vulgaris), girassol (Helianthus annuus) e pepino
(Cucumis sativus).
Nosso grupo vem trabalhando para elucidar os mecanismos pelos quais a
insulina é capaz de influenciar o crescimento e desenvolvimento de plântulas. Um
trabalho realizado pelo grupo (Oliveira et al., 2004), com plântulas de Canavalia
ensiformis, relatou que a insulina, D-pinitol e vanadil sulfato possuem um efeito
positivo sobre o crescimento de radículas e epicótilos, acelerando o desenvolvimento
dessas plântulas. Foi observado nesse estudo que, no período de 120 horas de
embebição, tanto o peso como o tamanho das radículas e dos epicótilos de plântulas
crescidas na presença desses compostos eram maiores do que de radículas e
epicótilos controles (desenvolvidos em água). Em 2006, Fornaciari ao estudar essas
plântulas de C. ensiformis observou que os tratamentos com insulina e D-pinitol
aumentaram os níveis de proteínas totais solúveis em todos os tecidos, exceto no
epicótilo tratado com D-pinitol, e que esse aumento na quantidade de proteínas
totais foi acompanhado pelo aumento de vicilinas. Entretanto esses experimentos
foram realizados apenas com tecidos de 120 horas de germinação, sendo
desconhecidos os efeitos do tratamento nos tecidos em intervalos de tempo
inferiores a 120 horas.
Discussão
Souza, S. C. (2010) 53
O D-pinitol constitui um princípio ativo encontrado em plantas anti-
glicemiantes e é conhecido por exercer efeitos do tipo insulina em animais e por isso
vem sendo utilizado para o tratamento alternativo do Diabetes. A atividade insulina-
símile do D-pinitol pode ser explicada pelo fato dele ser um composto análogo ao
inositol, que participa como um segundo mensageiro na cascata de sinalização
desencadeada por insulina em animais (Bates et al., 2000). O D-pinitol é originado a
partir do myo-inositol, o inositol mais abundante nas plantas e que é produzido a
partir da glicose (Almeida et al., 2003), e embora seja encontrado em várias partes
das plantas, como raízes, sementes e folhas (Kuo et al., 1997), principalmente de
plantas submetidas a estresses (Murakeözy et al., 2002), pouco se sabe sobre as
funções desempenhadas por esse composto em plantas.
Estudos mostram que as plantas usam açúcares como mensageiros
metabólicos ou moléculas sinalizadoras para coordenar atividades metabólicas entre
os tecidos fonte (onde há produção de açúcar) e os tecidos dreno (onde há
degradação ou armazenamento de açúcar), sinalizando para processos vitais que
estão envolvidos em todo ciclo de vida da planta, controlando o crescimento e
desenvolvimento (Rolland & Sheen, 2005). Tendo em vista o fato do D-pinitol ter
atividade do tipo insulina em animais e ser derivado da glicose, nosso grupo tem
desenvolvido estudos com o objetivo de verificar a hipótese dessas moléculas
estarem envolvidas na regulação de vias metabólicas de plantas. Como comparativo
também investigamos as ações do composto vanadil sulfato, que apresenta
mecanismos de ação do tipo insulina em animais (Goldwaser et al., 2002).
A partir dessas observações, o objetivo geral deste projeto foi analisar o perfil
metabólico de cotilédones de C. ensiformis durante a germinação e o
desenvolvimento pós-germinativo e as possíveis alterações provocadas pelo
tratamento com insulina, D-pinitol e vanadil sulfato. A identificação de algumas
alterações poderia justificar o maior desenvolvimento das plântulas tratadas com
alguns desses compostos. Uma hipótese para a promoção desse crescimento seria
a aceleração da mobilização de reservas, o que aumentaria a disponibilidade
energética e conseqüentemente poderia favorecer o crescimento.
Ao determinar a quantidade de proteínas totais solúveis nos tecidos tratados
com insulina observou-se que o tratamento teve um efeito positivo nos níveis dessas
proteínas em alguns tempos ao longo de todo o período analisado da germinação,
efeito esse que reforça a idéia de que este hormônio possa estar envolvido na
Discussão
Souza, S. C. (2010) 54
regulação da síntese protéica em plantas. Trabalhos anteriores mostram os efeitos
da insulina na síntese de proteínas ribossomais do eixo embrionário de sementes de
milho (Sánchez de Jiménez et al., 1999; Dinkova et al., 2000). Posteriormente García
Flores e colaboradores (2001) mostraram a purificação de uma proteína de peso
molecular de 20 kDa, que exerce uma função insulina-símile, promovendo uma
significativa diminuição no tempo de germinação de sementes de milho. Resultados
semelhantes também foram vistos para os tratamentos com D-pinitol e vanadil
sulfato.
Com a finalidade de analisar o perfil protéico e se houve aumento ou
aparecimento de proteínas induzidas pelos tratamentos, proteínas extraídas dos
cotilédones de C. ensiformis foram visualizadas por eletroforese em gel de
poliacrilamida e a presença de vicilinas foi analisada por Western blotting. Não foram
observadas mudanças significativas no perfil protéico das amostras oriundas dos
tratamentos com insulina, D-pinitol e vanadil sulfato. Já na análise específica de
vicilinas por Western blotting, foi possível notar o desaparecimento de bandas nas
amostras tratadas com D-pinitol em todos os intervalos de tempo analisados. Uma
possibilidade para esse desaparecimento seria a mobilização para o fornecimento de
aminoácidos para a síntese de proteínas envolvidas em eventos pós-germinativos,
ou fornecimento de energia, visto que D-pinitol estimulou o aumento de tamanho e
ganho de massa do eixo hipocótilo-radícula e de epicótilos de C. ensiformis (Oliveira
et al., 2004).
Com base nos resultados das dosagens, perfis de proteínas e Western
blotting, permanecia a questão se as variações nas concentrações protéicas,
promovidas pelos tratamentos, estariam relacionadas a variações nas proteínas de
reserva do tipo vicilinas (globulinas 7S), que constituem as proteínas mais
abundantes de sementes (Carasco et al., 1978; Khan et al., 1980). Para isso, foram
realizadas dosagens de vicilinas pelo método de ELISA. Os resultados mostraram
não haver variação significativa com o tratamento com insulina. Resultados
semelhantes foram encontrados também para D-pinitol onde apenas nos intervalos
de tempo de 24 e 42 horas houve um pequeno aumento na concentração de
vicilinas. Para vanadil sulfato observou-se aumento apenas em 66 horas de
embebição. Acredita-se que a diferença entre os teores de vicilinas das sementes
quiescentes para as germinantes seja devido a um possível aumento da
solubilização nas sementes durante a germinação somado ao alto grau de hidrólise
Discussão
Souza, S. C. (2010) 55
em que estas encontram-se durante o processo. Essa hidrólise poderia estar
gerando peptídeos que estariam expondo epítopos reconhecidos pelo anticorpo,
dando uma idéia de aumento das vicilinas. Na literatura foram comprovadas
mudanças celulares que precedem e acompanham a proteólise em cotilédones
germinantes de Vigna radiata, onde a maior proteína de reserva é a vicilina, e a
enzima responsável pela hidrólise é uma endopeptidase cisteínica. Essas alterações
observadas podem estar relacionadas ao retículo endoplasmático (RE), sítio de
síntese desta enzima, que, associado a esta síntese, passa por várias modificações.
Os cotilédones quiescentes, recém embebidos, contêm RE tubular, também sofrem
alterações, sendo desestruturados cerca de 12-14 horas após começar a embebição
(Bewley & Black, 1994).
Embora os resultados do presente trabalho tenham mostrado que os
tratamentos com insulina e D-pinitol influenciaram positivamente a atividade de
proteinases cisteínicas em cotilédones, não pode-se atribuir o aumento de
crescimento promovido por esses compostos a uma aceleração da mobilização de
reservas protéicas de cotilédones, visto que a diminuição dessas proteínas durante
esse tempo foi pouco acentuada. Uma possibilidade é que essas enzimas possam
estar participando da mobilização de proteínas de reserva de eixos embrionários,
uma vez que Müntz et al., (1996) demostraram que durante os primeiros dias após a
embebição, a biossíntese de proteínas no eixo embrionário é fornecida
principalmente pela mobilização de proteínas de reserva do próprio eixo e só
posteriormente ocorre a mobilização das proteínas de reserva dos cotilédones. A
questão é que para esse acontecimento existem proteinases cisteínicas do próprio
eixo embrionário agindo sobre suas reservas.
As sementes quiescentes de Canavalia ensiformis apresentaram atividade
enzimática, confirmando o relato de trabalhos quanto à presença de peptidases
ativas em corpos protéicos (CP) de sementes quiescentes, como as proteinases
cisteínicas do tipo papaína (CPRs), encontradas em CP de cotilédones de pepino
(Müntz et al., 2001). As proteinases estocadas devem ter sido formadas durante o
final da embriogênese e podem estar presentes nos estágios medianos e/ou
posteriores de maturação. CPRs que foram formadas durante o desenvolvimento de
sementes podem iniciar a mobilização de globulinas em eixos embrionários e
cotilédones de sementes em germinação (Müntz et al., 2001). As CPRs são
consideradas as candidatas favoritas para inicialização e mediação da degradação
Discussão
Souza, S. C. (2010) 56
de proteínas de reserva em cereais (Bewley & Black, 1994) e dicotiledôneas (Wilson,
1986 apud Müntz et al., 2001). Dado o fato de que os níveis de vicilinas não sofreram
grandes variações, como aconteceu com as proteinases, acredita-se que essa
classe enzimática possa também participar de outras rotas, não apenas na
degradação de proteínas de reserva. Alguns trabalhos sobre esse assunto têm
mostrado a complexidade da regulação celular em plantas por proteólise, indicando
que proteinases cisteínicas, além de participarem da degradação de proteínas de
reserva, também atuam no turnover de proteínas em resposta a estresses abióticos
e bióticos, na morte celular programada em resposta de hipersensibilidade ao ataque
de patógenos e também na senescência de órgãos (revisado por Grudkowska &
Zagdańska, 2004).
Ou outros fatores poderiam ser levados em consideração. O fato do efeito
estimulatório dos compostos sobre a atividade de proteinases cisteínicas não ter
correspondência perfeita na mobilização das reservas pode envolver questões de
localização subcelular, pré processamento proteolítico por outras classes ou
subclasses de proteinases ou um efeito de retardo no tempo de proteólise.
Uma outra abordagem do presente trabalho foi a investigação de possíveis
alterações nas reservas de amido, visto que essas reservas também são importantes
para as plantas, especialmente para algumas sementes e raízes (Cardemil & Varner,
1984). A degradação enzimática do amido é devida principalmente às α-amilases
(Tárrago & Nicolas, 1976).
Os resultados mostraram que apenas nos cotilédones tratados com D-
pinitol foi possível observar alterações significativas, com aumento de atividade de α-
amilase. Uma complementação desses resultados com as dosagens de amido
nesses tecidos seria importante para uma melhor interpretação, quando só
posteriormente a essas dosagens poderemos constatar se os aumentos da atividade
da α-amilase estão realmente relacionados à mobilização de amido.
O total de carboidratos em sementes de leguminosas varia enormemente de
concentrações entre 24% até 68% (Hoover & Sosulski, 1991). Para muitas sementes
a energia inicial necessária para os primeiros eventos da germinação é fornecida
pela quebra do amido estocado (Van der Maarel et al., 2002), desta forma a
degradação do amido é vital para o sucesso da germinação. Em sementes de sorgo
os conteúdos de amido durante a germinação foram reduzidos de cerca de 70 %
Discussão
Souza, S. C. (2010) 57
para concentrações inferiores a 35% (Elmaki et al., 1999), mostrando uma acentuada
mobilização desse carboidrato nas primeiras horas de embebição. A degradação de
amido é uma via modulada por fatores metabólicos e hormonais e o hormônio
giberelina (GA) tem sido considerado o responsável pela indução da síntese de novo
das enzimas responsáveis por esse processo, principalmente da α-amilase (Jones &
Jacobsen, 1991; Perata et al., 1997). A quebra do amido envolve um grupo de
enzimas, como as α-amilases, β-amilases, enzima desramificadora do amido e α-
glucosidases (Dunn, 1974). Ambas α-glucosidase e α-amilase são capazes de
quebrar grânulos de amido, sendo a α-amilase considerada a principal enzima a
desempenhar essa função durante a germinação (Perata et al., 1997; Saman et al.,
2008).
As α-amilases (EC 3.2.1.1) são enzimas endoglicolíticas responsáveis pela
degradação de carboidratos, através da quebra das ligações do tipo 1,4-poliglicanos
durante a mobilização de reservas glicídicas armazenadas. A síntese de α-amilase é
acompanhada por um dramático aumento no nível do mRNA, e sua acumulação
pode ser regulada em resposta a fitormônios, sinais metabólicos e estresse hídrico.
Na germinação de sementes de cereais, o ácido giberélico (GA) é sintetizado em
embriões de sementes embebidas, difunde-se nas camadas do aleurona, e induz
diversas enzimas hidrolíticas, incluindo a α-amilase. Estudos mais detalhados da
abrangência das funções da α-amilase e de seus padrões de expressão gênica nas
dicotiledôneas são ainda limitados e pouco claros (Tangphatsornruang et al., 2005).
Os presentes resultados apontam para a possibilidade do tratamento
com D-pinitol estar estimulando a mobilização do amido, com base no aumento na
atividade da enzima α-amilase encontrada nos cotilédones de C. ensiformis.
Trabalhos anteriores do grupo mostraram aumentos da atividade e dos níveis de
expressão do gene da α-amilase em cotilédones de Vigna unguiculata e Phaseolus
vulgaris tratados com D-pinitol (Ribeiro et al., 2010). Compostos que apresentam
efeito GA-símile na atividade e expressão do gene das α-amilases têm sido descritos
na literatura. Um análogo do mastoparano Mas7, um peptídeo que estimula
mudanças na razão GTP/GDP, induziu atividade de α-amilases na camada de
aleurona de Avena fátua (Jones et al., 1998). Em Oryza sativa L., ácido sulfurico
induziu a produção de α-amilases na ausência de GA (Mitsunaga et al., 2007).
Discussão
Souza, S. C. (2010) 58
A primeira etapa da ação da insulina é a sua ligação ao receptor específico.
Essa ligação, por sua vez, dispara uma cascata de sinalização que poderá ativar
proteínas quinases ou fosfatases. Da ativação dessas proteínas dependerá o tipo de
efeito que a insulina irá desencadear (Lehninger, 2003). Em plantas, a sinalização
desencadeada por insulina leva a ativação de diversas quinases, que já têm sido
identificadas e classificadas em diferentes grupos, sendo que uma das maiores e
mais importantes categorias é a MAPK. Várias descobertas sobre as vias MAPK em
plantas refletem a importância e complexidade dos mecanismos de sinalização
vegetal (Jonak et al., 1994; Mizoguchi et al., 1997; Hirt, 2000; Ichimura et al., 2000;
Morris, 2001; Tena et al., 2001).
Baseados nisto, os níveis de MAPK foram estimados nos cotilédones tratados
com os compostos relacionados à insulina. Nossos resultados mostraram que
existem proteínas imunorrelacionadas a MAPK em cotilédones durante a
germinação, entretanto diferentemente do esperado observamos uma diminuição
nos níveis dessas proteínas nos tratamentos com insulina, D-pinitol e vanadil sulfato.
Alguns fatores podem ser considerados como causa para estes resultados, como a
extração não ter sido eficiente para essa classe de proteínas, pois talvez sua
atividade não tenha sido preservada. Outro fato relevante a ser levantado é sobre a
especificidade do anticorpo a MAPK de C. ensiformis, visto que foi usado um
anticorpo comercial contra MAPK de Arabidopsis thaliana.
Estudos de expressão gênica poderiam ser propostos para futuras
confirmações destes dados, visto que são muitos os papéis que têm sido atribuídos
aos componentes das vias da MAPK, desempenhando uma grande variedade de
funções nas vias de transdução de sinais em plantas tais como osmorregulação,
sinalização hormonal incluindo proliferação celular auxina-induzida ou processos
etileno-responsivos, biossíntese da parede celular, e crescimento e diferenciação
celulares (revisado por Mishra et al., 2006). Nossos resultados mostraram pouca
variação nos níveis dessas proteínas durante o decorrer da germinação.
Uma outra questão levantada, no presente trabalho foi a necessidade de se
avaliar os níveis endógenos de D-pinitol e de compostos relacionados direta ou
indiretamente a sua via metabólica como os myo-inositóis, a sacarose e a rafinose.
Através da dosagem do D-pinitol durante a germinação de sementes de
Canavalia ensiformis foi possível ver que a concentração deste composto em
cotilédones embebidos por 48 e 72 horas aumentou consideravelmente, alcançando
Discussão
Souza, S. C. (2010) 59
os maiores níveis em cotilédones embebidos em água por 72 horas (1303,72 mg/kg).
Além do mais, as quantidades de myo-inositóis encontradas em cotilédones
embebidos por 24 horas em água foram iguais aos encontrados nos cotilédones
quiescentes, entretanto em tecidos embebidos por 24 horas com D-pinitol essas
quantidades foram quase duplicadas. Estes dados demonstram a importância dos
myo-inositóis nos processos durante a germinação de sementes e evidenciam o fato
da rafinose e outros açúcares, como os da série dos ciclitóis, derivados dos myo-
inositóis serem sugeridos como importantes para a proteção durante a dessecação e
seu complexo enzimático essencial durante o desenvolvimento das sementes
(Obendorf, 1997; Abid et al., 2009).
Com relação a dosagem de rafinose, observamos uma diminuição dos níveis
desse composto ao longo da germinação, indicando que esse açúcar está sendo
mobilizado durante a germinação. Quando comparado aos cotilédones de sementes
quiescentes, em relação ao tratamento, no tempo de 48 horas há um aumento de
rafinose nos cotilédones embebidos com D-pinitol. Os açúcares da série da rafinose
bem como os ciclitóis derivados dos myo-inositóis têm sido relacionados com a
proteção das sementes a dessecação (Obendorf, 1997 apud Hitz et al., 2002). Essa
função tem sido atribuída principalmente à capacidade desses compostos em
proteger a estrutura das membranas biológicas durante a desidratação
(Croweetal,1987 apud Hitz et al., 2002).
Oligossacarídeos da família rafinose desempenham muitas outras funções
nas plantas. Participam do transporte de carboidratos no floema, como reservas de
armazenamento e crioprotetores de órgãos de plantas resistentes ao frio, e se
acumulam em sementes em maturação, tendo um papel na aquisição da tolerância à
dessecação e a capacidade de armazenamento. Em sementes, as principais funções
são proteger estruturas celulares durante a dessecação e constituição de reservas
de carbono durante a germinação inicial (citado em Karner et al., 2004). Rafinose
como constituinte de reservas de carbono durante a germinação inicial de sementes
pode explicar a diminuição de seus níveis ao longo do tempo de germinação
apresentados nesse trabalho.
Embora as funções clássicas dos derivados dos myo-inositós, como rafinose e
D-pinitol sejam descritas principalmente durante a desidratação da sementes,
trabalhos tentam entender as funções que esses compostos desempenham na
germinação, visto que altos níveis desses compostos podem estar presentes em
Discussão
Souza, S. C. (2010) 60
algumas sementes durante esse processo. Myo-inositol fosfato sintase (MIPS) é uma
enzima central na via de síntese dos myo-inositóis. A completa eliminação dessa
enzima através de mutações no gene da MIPs interrompeu processos bioquímicos
necessários para a germinação (Hitz et al., 2002). Além disso, myo-inositol fosfato
sintase (MIPS), que catalisa a primeira etapa na biossíntese do inositol e a sacarose
sintase (Susi), uma enzima envolvida na formação da UDP-glicose, o principal
nucleosídeo difosfato na reação de quebra da sacarose e na biossíntese da trealose,
além de estarem envolvidas no desenvolvimento da semente também o estão em
vários processos fisiológicos que incluem, além da resistência a estresses abióticos,
também a estresses bióticos (Abid et al., 2009).
As concentrações de sacarose não variaram significativamente nos
cotilédones de C. ensiformis durante a germinação e nem entre os tratamentos.
Como a sacarose é um substrato para a síntese de rafinose, a não síntese de
rafinose durante a germinação pode justificar os níveis constantes de sacarose
durante esse processo. Evidências para o papel de sacarose em sementes têm sido
relatadas pelo estudo de plantas transgênicas. Sementes oriundas de plantas
transgênicas de Vicia narbonensis, deficientes na transformação de sacarose em
amido, aumentaram os níveis de sacarose, o que conseqüentemente elevou os
conteúdo RFO (α-galactosídeos de sacarose), dentre eles rafinose (Rolletschek et
al., 2002, apud Karner et al., 2004).
Conclusões
Souza, S. C. (2010) 61
6 - CONCLUSÕES
1- Em cotilédones de Canavalia ensiformis embebidos por até 72 horas não foram
observadas diminuições significativas de proteínas totais ou vicilinas, indicando que
até esse tempo não houve mobilização dessas moléculas.
2- Os tratamentos com insulina, D-pinitol e vanadil sulfato acarretaram um aumento
nas concentrações de proteínas totais solúveis, em alguns intervalos de tempo após
embebição.
3- Atividade de proteinases cisteínicas foi detectada em sementes quiescentes e
aumentou com a embebição durante a germinação. Os tratamentos com insulina e
D-pinitol promoveram aumentos nessa atividade.
4- A atividade da enzima α-amilase em cotilédones de C. ensiformis aumentou nas
primeiras horas de embebição e se manteve constante até 72 horas. Essa atividade
foi aumentada em cotilédones tratados com D-pinitol em quase todos os intervalos
de tempo analisados.
5- Proteínas imurrelacionadas a MAPK estão presentes em cotilédones durante a
germinação. Seus níveis foram diminuídos pelos tratamentos com insulina, D-pinitol
e vanadil sulfato.
6- D-pinitol foi detectado em todas as amostras. Esses níveis aumentaram em
cotilédones embebidos por 48 e 72 horas.
7- Myo-inositol foi detectado nos cotilédones de sementes quiescentes e durante a
germinação. Esses níveis foram maiores em cotilédones embebidos com D-pinitol
por 24 e 48 horas.
8- As concentrações de rafinose diminuíram significativamente ao longo da
germinação. O tratamento com D-pinitol promoveu um aumento de rafinose nos
cotilédones após 48 horas de embebição.
Conclusões
Souza, S. C. (2010) 62
9- As concentrações de sacarose não variaram significativamente nos cotilédones de
C. ensiformis durante a germinação e nem entre os tratamentos.
10- Esses dados sugerem que insulina e compostos relacionados interferem no
desenvolvimento de plântulas de Canavalia ensiformis.
Referências bibliográficas
Souza, S. C. (2010) 63
7 - REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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